NO315942B1 - Polisykliske forbindelser, fremgangsmåte for fremstilling av disse, anvendelse av forbindelsene for fremstilling av et preparat forbehandling av dyr infisert med parasitter, preparat som kan anvendes for behandling avparasittinfeksjon hos dyr, - Google Patents

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Vanlige antiparasittiske midler er vel kjent, slik som avermektiner angitt i US 4 310 519 og 4 199 569. Imidlertid er slike avermektinforbindelser, som er sterke midler mot interne og eksterne parasitter, strukturelt svært betydelig ulike fra de foreliggende forbindelser. Avermektinene, som er makrosykliske midler isolert fra en aktinomycet, er ikke bes-lektet med de foreliggende polysykliske soppmetabolitter. I de Jesus et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans I, s. 697-701 (1984) er det beskrevet soppmetabolitter identifisert som "janti-tremer" med en polysyklisk struktur som imidlertid mangler flere strukturelle elementer som er til stede i de foreliggende forbindelser.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører polysykliske forbindelser, fremgangsmåte for fremstilling av disse, anvendelse av forbindelsene for fremstilling av et preparat for behandling av dyr infisert med parasitter, preparat som kan anvendes for behandling av parasittinfeksjon hos dyr, fremgangsmåte for behandling av parasittinfeksjoner i planter eller planteavlinger, preparat som kan anvendes for behandling av parasittinfeksjoner i planter samt biologisk ren kultur.

Kort beskrivelse av figurene

Figurene 1, 2 og 3 er resonansspektra av negative protonkjerner til hhv. forbindelsene 1, 2 og 3. I figurene er flere av resonanstoppene merket med en "X". Disse toppene er resultat av tilstedeværelse av løsningsmiddel og er ikke signifikant med strukturen til forbindelsene. Figur 1 er et kjernemagnetisk resonansspektra av forbindelse 1 registrert ved 500 MHz i CD2C12 på en Varian Unity 500 NMR-spektrometer ved 25 °C. Kjemiske skift er angitt i ppu relativt til TMS ved null ppu ved anvendelse av løsningsmid-deltopp ved 5 5,32 som en intern standard. Kun diagnostiske topper er innført. Figur 2 er et kjernemagnetisk resonansspekter av forbindelse 2 registrert ved 400 MHz i CD2C12 på et Varian Unity 400 NMR-spekt rome ter ved 25 °C. Kjemiske skift er angitt i ppu relativt til TMS ved null ppu ved anvendelse av løsningsmid-deltoppen ved 5 5,32 som en intern standard. Kun diagnostiske topper er innført.

Figur 3 er et kjernemagnetisk resonansspekter av forbindelse 3 registrert ved 300 MHz i CDC13 på et Varian XL300 NMR-spektrometer ved omgivelsestemperatur. Kjemiske skift er angitt i ppu relativt til TMS ved null ppu ved anvendelse av løsningsmiddeltoppen ved 5 7,24 som en intern standard. Kun diagnostiske topper er innført.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye forbindelser med entydig struktur. Denne oppfinnelse vedrører også en ny fremgangsmåte for fremstilling av de foreliggende forbindelser i et fermenteringsmedium av Nodulisporium sp. eller en mutant av denne.

Forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse har følgende strukturer: Forbindelse 1

Forbindelse 2

Forbindelse 3

Strukturformlene over er vist uten en bestemt stereokjemi ved bestemte posisjoner og med en definert stereokjemi ved andre posisjoner, og foreliggende oppfinnelse bør tolkes til å omfatte alle slike stereoisomerer. Særlig kan stereoisomerene ved de ulike, asymmetriske"være sentre orien-tert enten i a- eller slik at de representerer slike grup-per som er hhv. under eller over hovedplanet til molekylet.

Forbindelsene ifølge"denne oppfinnelse kan primært anvendes som antiparasittiske midler ved behandling og/eller forebyggelse og behandling av sykdommer forårsaket av parasitter, f.eks. artropodparasitter, slik som blodmidd, lus, lopper og andre bitende insekter hos husdyr og fjærkre, slik som Tenophalid. es, Ixodes, Psoroptes, Lucilia og Hemotobia. De er også virksomme ved behandling av parasittsykdommer som opp-står hos andre dyr, deriblant mennesker. Den optimale mengde som anvendes for å oppnå de beste resultatene, vil selvfølge-lig avhenge av dyreart som behandles og type og alvorlighets-grad av parasittinfeksjon eller angrep av skadedyr. Gode resultater oppnås generelt med søkerens nye forbindelse ved oral administrering på fra omtrent 0,001 til omtrent 100 mg pr. kg av dyrets kroppsvekt, idet slik total dose gis enten én gang eller i oppdelte doser over en relativt kort periode slik som 1-5 dager. Med den nye forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse er utmerket kontroll av slike parasitter oppnådd hos dyr ved tilsetning fra omtrent 0,025 til omtrent 50 mg pr. kg kroppsvekt i en enkelt dose. Repeterte behandlinger er gjort der det er påkrevd å bekjempe nye infeksjoner og er avhengig av parasittart og hvilke husdyravlsmetoder som benyttes. Metodene for administrering av disse materialer til dyr er kj ent for fagfolk på veterinærområdet.

Foreliggende forbindelse er også aktiv mot hushold-ningsskadedyr, slik som kakerlakker, Blatella sp, maur, Solen-opsis-møll, Tineola sp., museumsbille, Attagenus sp. og hus-fluen Musea domestica.

Forbindelsen ifølge denne oppfinnelse kan også anvendes mot insektsplager i lagret korn, slik som TriJbolium sp., Tenebrio sp. og i landbruksplanter, slik som edderkopp-midd ( Tetranychus sp.), bladlus, Acyrthiosiphon "rettvinger som vandrer", slik som gresshoppe og umodne stadier av insekter som lever på plantevev. Forbindelsene er anvendbare som nematocider for kontrollering av jordnematoder og plantepara-sitter, slik som Meloidogyne sp., som kan være av betydning i landbruket.

Foreliggende forbindelser kan tildeles oralt i en enhetlig doseform, slik som en kapsel, stor pille eller

tablett, eller som flytende doser som normalt er en løsning, suspensjon eller dispersjon av den aktive bestanddel, vanligvis i vann sammen med et suspenderingsmiddel, slik som bento-nitt og et fuktemiddel eller en lignende eksipiens. Dosene inneholder generelt også et antiskummiddel. Preparatdosene inneholder generelt fra omtrent 0,001 til omtrent 1,0 vekt-% av de aktive forbindelser. Foretrukne dosepreparater kan inneholde fra omtrent 0,01 til omtrent 0,1 vekt-%. Kapslene og de store pillene består av den aktive bestanddel blandet med et bærervehikkel, slik som stivelse, talkum, magnesiumstearat eller dikalsiumfosfat.

Der det er ønsket å administrere forbindelsene ifølge denne oppfinnelse i en tørr, fast enhetsdoseform, anvendes vanligvis kapsler, store piller eller tabletter inneholdende den ønskede mengde av de foreliggende forbindelser. Disse doseformer fremstilles ved nøye og jevn blanding av den aktive bestanddel med passende fint oppdelte fortynnings-, fyllings-, desintegrasjons- og/eller bindemidler, slik som stivelse, laktose, talkum, magnesiumstearat, vegetabilske gummiarter og lignende. Slike enhetsdosepreparater kan varieres mye med hensyn til deres totale vekt og innhold av antiparasittmidlet, avhengig av slike faktorer som type vertsdyr som skal behandles, alvorlighetsgraden og typen infeksjon og vekten til ver-ten.

Når forbindelsene ifølge denne oppfinnelse skal administreres via dyref6r, må de spres nøye i foret eller anvendes som en "toppdressing", eller i form av pellets som så kan tilsettes til det endelige for, eller helst tilsettes separat. Alternativt kan antiparasittforbindelsene ifølge denne oppfinnelse administreres til dyr parenteralt, f.eks. ved intra-ruminal, intramuskulær, intratrakeal eller subkutan injeksjon, hvorved den aktive bestanddel er løst eller dispergert i et flytende bærervehikkel. Ved parenteral administrering er det aktive materialet passende blandet med en akseptabel bærer, fortrinnsvis i form av en vegetabilsk olje, slik som peanøt-tolje, bomullsfrøolje og lignende. Andre parenterale bærere, slik som organiske preparater som anvender solketal, glyserol, formal og vandige, parenterale preparater kan også anvendes. Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse løses eller oppslemmes i det parenterale preparat for administrering; idet slike preparater generelt inneholder fra omtrent 0,55 til omtrent 5 vekt-% av foreliggende forbindelse.

Når forbindelsene som er beskrevet her administreres som komponenter i fåret til dyr, eller løst eller oppslemmet i drikkevann, tilveiebringes preparater der de aktive forbindelser er nøye fordelt i en inert bærer eller fortynner. Med inert bærer menes én som ikke vil reagere med det antipara-sitt iske middel og én som sikkert kan tilføres til dyr. En bærer for f6rtilsetning er fortrinnsvis én som er, eller kan være, en bestanddel i dyrerasjonen.

Egnede preparater omfatter f6rforblandinger eller supplementer hvor de foreliggende forbindelser er til stede i relativt store mengder og som er egnet for direkte tilføring til dyret eller for tilsetning i f6ret, enten direkte eller etter et mellomfortynnings- eller blandingstrinn. Typiske bærere eller fortynnere egnet for slike preparater, innbe-fatter f.eks. tørket berme, maismel, sitrusmel, fermenterings-rester, oppmalte østersskjell, hvetekli, melasseoppløsninger, maiskolbemel, spiselig bønnepresseføde, soyagryn, oppmalt kalkstein og lignende. Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse dispergeres nøye i bæreren ved fremgangsmåter slik som oppmal-ing, røring, kverning eller blanding i trommel. Preparater som inneholder fra omtrent 0,005 til omtrent 2,0 vekt-% av den foreliggende forbindelse, er særlig egnet som f6rforbland-inger. Fortilsetninger, som tilføres direkte til dyret, inneholder fra omtrent 0,0002 til omtrent 0,3 vekt-% av den foreliggende forbindelse.

Slike tilsetninger tilsettes til dyreforet i en mengde som gir det ferdige for den konsentrasjon av aktiv forbindelse som er ønsket for behandling og kontroll av parasittsykdommer. Selv om den ønskede konsentrasjon av forbindelsene ifølge denne oppfinnelse kan variere avhengig av de tidligere nevnte faktorer, så vel som av den særlige forbindelse anvendt, tilføres forbindelsene ifølge denne oppfinnelse vanligvis ved konsentrasjoner på mellom omtrent 0,001 til omtrent 0,2 % i f6ret for å oppnå det ønskede antiparasittiske resultat .

I tillegg, der forbindelsen skal tilsettes til et dyrefor, er det mulig å anvende den tørkede mycelmassen fra fermenteringsvæsken. Mycelet inneholder en overvekt av aktiviteten og etter som aktivitetsnivået til mycel kan bestemmes, kan det tilsettes direkte til dyreforet.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse kan også anvendes ved bekjempelse av landbruksskadedyr som påfører skade på avlinger mens de gror eller mens de lagres. Forbindelsen kan benyttes ved å anvende teknikker, slik som sprayer, pul-ver, emulsjoner og lignende, på den voksende eller lagrede avling for å oppnå beskyttelse mot slike landbruksskadedyr.

Den antiparasittiske aktivitet av de foreliggende forbindelser kan bestemmes ved oral tilsetning via f6ret, av

en prøve av den individuelle forbindelse, en blanding av slike forbindelser, et konsentrert ekstrakt og lignende, til mus som har blitt infisert 3 dager tidligere med en passende parasitt. Etter 11, 12 og 13 dager etter igangsettingen av medisinerin-gen, undersøkes feces til mus for å finne egg og på den neste dag avlives musen og antall av tilstedeværende ormer i de proksimale deler av tynntarmen bestemmes. En aktiv forbindelse

er observert når det er en signifikant reduksjon av egg- og ormantall etter sammenligning med infiserte, umedisinerte kon-troller .

Nye forbindelser ifølge denne oppfinnelse fremstilles ved fermentering av en stamme av soppslekten JJdduIisporium. Én slik kultur er kalt MF-5954 i kultursamlingen til Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey. En produserende stamme av MF-5954 er deponert i den permanente "samlingen" i American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 og er gitt aksesjonsnr. 74245. Deponeringen ble gjort 21. september 1993 på bakgrunn av The Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure.

Oppfinnelsen omfatter også biologisk ren kultur kjennetegnet ved at den er av Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245 med evne til fremstilling av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Morfologi- og kulturkarakteristikaene til Nodulisporium sp MF-5954 er som følger: MF-5954 (produserer L-954,967) ble isolert som JP337, en endofytisk sopp fra skogplantevev ved overflate-sterilisering ifølge metoden til Bills og Polishook (1991). Ved den følgende beskrivelse er det anvendt fargenavn fra Ridgway (1912).

På maismelagar (Difco) ble det oppnådd en koloni med en diameter på 42 mm etter 6 dager ved 25 °C, 50 % relativ fuktighet og med en fotoperiodisitet på 12 t i fluorescerende lys. Kolonien vokste som en matte nedsenket i agar, med en tiltrykket, filtaktig, ufarget overflate; eksudat og løselig pigment var fraværende; reverserbart ufarget; med en søt, aromatisk odør.

I en havreagar (Difco) ble det oppnådd en koloni med en diameter på 42 mm etter 6 dager under de samme betingelser. Kolonimatten var tiltrykket til sprøtt bomullsaktig, koloni-sentrum gulbrunt (Mars Yellow, Raw Sienna) til lys, gulbrun (Light Orange Yellow, Antimony Yellow) midtveis til randen; rand helt hvit; eksudat, lukt og løselig pigment fraværende; revers lysebrun.

På potetsukroseagar (Singleton et al., 1992) ble det oppnådd en koloni med en diameter på 43 mm etter 6 dager under de samme betingelser. Kolonimatten var tilpresset og spredt bomullsaktig, rødlig brun (Light Russet-Vinaceous) i koloni-sentrum for å gå over til å være glassklar i randen, rand udistinkt; eksudat, lukt og løselig pigment fraværende; revers rødbrun (Dark Vinaceous).

Ved 37 °C på maismelagar og ved mørke, ble det oppnådd en koloni med diameter på 82 mm etter 6 dager; kolonimatten var bomullsaktig gjennom det hele bortsett fra i inoku-leringspunktet der matten var tiltrykket, hvit; hele randen hvit; eksudat og løselig pigment fraværende; revers ufarget; tilstedeværelse av søt, aromatisk odør.

Hyfer hyalin til lysebrunt, septarier, med glatte til delvis ujevne vegger, tykkvegget, 2,5-3,5 um bred. Konidiofor entrådet, reist, 150-400 x 3,0-4,0 um, penseIlignende delt, hyalin til lysebrun, skillevegg, tykkvegget, glatt til fint ru til vortet, noen ganger med olivenaktig, ru fremstilling

(2,5 um i diameter). "Konidiogene" celler holoblastiske, ender, 16-24 x 1,5-2,0 um, fint ru til vortet, sylinderaktige, irregulære ved apeks. Sporer omvendt eggformet til omvendt eggformet elliptisk med et trunkert festepunkt, 4,1-5,7 x 1,6-2,5 um, hyalin, aseptisk, tynnvegget, fremstilt sympodisk fra apeks av sporcellene, akkumulert som en apikal klynge på "tenner".

MF-5954 er plassert i soppslekten Nodulisporium (Hyphomycetes, Deuteromycotina). De hovedtaksonomiske karakteristika til denne slekt inkluderer entrådet konidioforer som vanligvis er forgrenet, og en "flerakset" fremstilling av konidier. I tillegg er de konidiebærende områder terminale eller innføyde og nodulære som følge av rikelig konidiefrem-stilling (Jong and Rogers, 1972). Disse karakteristika skiller slekten Nodulisporium fra andre lignende sopparter, slik som Geniculosporium, Xylocladium og Ustilina. Disse slekter er den aseksuelle tilstand (anamorf) av mange xylariaceous (Ascomyco-tina) sopper, slik som Hypoxylon, Xylaria, Rosellinia etc.

Ulikt de fleste isolater av Nodulisporium vokser MF-5954 gror godt ved 37 °C, men fremviser ikke noen andre dis-tinkte karakterer i kultur, slik at den kan forbindes med kjente arter. Derfor er den benevnt som Nodulisporium sp.

Referert litteratur

1. Bills, G. F. og Polishook, J. D. 1991. "Micro-fungi from Carpinus caroliniana", Can. J. Bot., 69 (7), 1477-1482 . 2. Jong, S. C. og Rogers, J. D. 1972. "Illustra-tions and descriptions of conidial states of some Hypoxylon species". Wash. State Agric. Exp. Sta. Tech. Bull. No. 71. 51 p. 3. Ridgway, R. 1912. Color standards and color nomenclature. Publ. by the author, Washington, D. C. 43 p. +

53 pl.

4. Singleton, L. L., Mihail, J. D. og Rush, C. M.

(utg.). 1992. Methods for research on soilborne phytopatho-genic fungi, appendix A, s. 247. APS Press, St. Paul, Minnesota.

Foreliggende forbindelser fremstilles under aerob fermentering av egnede faste eller flytende næringsmedier ved betingelser som beskrevet heretter, med en produserende stamme av Nodulisporium sp. Flytende og faste medier slik som anvendt for fremstilling av ulike antibiotiske stoffer, kan benyttes ved anvendelse i fremgangsmåten for fremstilling av foreliggende polysykliske forbindelser.

Slike næringsmedier inneholder karbon- og nitrogenkilder som er assimilerbare for mikroorganismen, og generelt små mengder av uorganiske salter. I tillegg kan fermenterings-mediene inneholde spor av metaller nødvendige for vekst av mikroorganismene og fremstilling av de ønskede forbindelser. Disse er vanligvis til stede i tilstrekkelige konsentrasjoner i de komplekse kilder for karbon og nitrogen, som kan anvendes som næringskilder, men kan selvfølgelig tilsettes separat til mediet dersom dette er ønskelig.

Generelt er karbohydrater, slik som sukker, f.eks. glukose, sukrose, maltose, laktose, dekstrin, cerelose, maismel, havremel og lignende, og stivelser, passende kilder for assimilerbart karbon i næringsmediet. Den eksakte mengde av karbonkilden som anvendes i mediet, vil delvis avhenge av de andre bestanddeler i mediet, men det er vanligvis funnet at en mengde av karbohydrat i mediet, mellom 1 og 150 g/l, er til-fredsstillende. Disse karbonkilder kan anvendes individuelt eller flere slike karbonkilder kan kombineres i det samme medium.

Ulike nitrogenkilder, slik som gjærhydrolysater, gjærautolysater, gjærceller, tomatmasse, maismel, havremel, soyabønnemel, kaseinhydrolysater, gjærekstrakter, maisstøpe-væsker, berme, bomullsfrømel, kjøttekstrakter og lignende, er lett assimilerbare av Nodulisporium sp. ved fremstillingen av foreliggende forbindelser. De ulike nitrogenkildene kan anvendes alene eller i kombinasjon i mengder varierende fra 1 til 5 g/l i mediet.

Blant de uorganiske næringssaltene som kan inkorpor-eres i kulturmediene, er de vanlige saltene med evnen til å avgi natrium, kalium, magnesium, ammonium, kalsium, fosfat, sulfat, klorid, karbonat og lignende ioner. Her er det også inkludert spormetaller, slik som jern, sink, mangan, kobber, bor, molybden og lignende.

Det bør bemerkes at de nedenfor og i eksemplene be-skrevne medier er kun illustrerende for de mange forskjellige sorter medier som kan anvendes, og er ikke ment å være begren-sende .

Det følgende er eksempler på medier egnet for dyrking av stammer av Nodulisporium sp MF-5954, ATCC 74245.

Sammensetning av skråmedium

Sammensetning av inokulasjons- og produksjonsmedier

Mediet ble fremstilt med destillert vann, pH justert til 7 før sterilisering og fordelt med 50 ml pr. 250 ml Erlenmeyerkolber uten ledeplater. Bomullskorker ble anvendt. Sterilisering ble gjort ved 121 °C i 20 min.

Produksjonsmedium A

1. Fast del:

1 250 cm<3> vermiculitt ble tilsatt til en 4 1 rulle-flaske. Det ble lukket med en latekskork, autoklavert i 60 min og i tillegg i pluss 30 min tørt.

2 . Flytende del:

Mediet ble laget med destillert vann (uten pH-justering). Det ble fordelt med 425 ml/l 1 Erlenmeyerkolber. Bomullskorker ble anvendt og mediet ble sterilisert ved 121 °C i 15 min.

Produksjonsmedium B

Mediet ble laget med destillert vann, justert til pH 7,0 før sterilisering. Mediet ble fordelt i 50 ml pr. 250 ml Erlenmeyerkolber uten ledeplater. Kolbene ble lukket med bomull og autoklavert ved 121 °C i 20 min.

Fermenteringen ved anvendelse av Nodulisporium sp. kan gjøres ved temperaturer varierende fra omtrent 20 °C til omtrent 40 °C. For best resultater er det passende å utføre disse fermenteringer ved temperaturer i området fra omtrent 22 °C til omtrent 36 °C. Temperaturer fra omtrent 22 °C til omtrent 27 °C er mest foretrukket. pH i næringsmediet passende for fremstilling av foreliggende forbindelser, kan variere fra omtrent 6,5 til omtrent 8,0 med et foretrukket nivå fra omtrent 6,8 til omtrent 7,3.

Fermenteringer i liten skala kan passende utføres ved å plassere egnede mengder av næringsmediet i en kolbe og anvende kjente sterilteknikker, inokulere kolbene med enten sporer eller vegetative celler av Nodulisporium sp., lukke kolbene løst med bomull og la fermenteringen foregå ved kon-stant romtemperatur på omtrent 25 °C på en roterende rister ved fra 95 til 300 rpm i omtrent 7 til 35 dager. Ved arbeid i større skala kan det foretrekkes å utføre fermenteringen i passende tanker utstyrt med en agitator og lufttilførsel til fermenteringsmediet. Næringsmediet tilsettes tanken etter sterilisering og inokuleres med vegetativt voksende celler i form av Nodulisporium sp. Fermenteringen får fortsette i fra 7 til 25 dager under omrøring og/eller lufttilførsel til mediet ved temperaturer i området fra omtrent 22 ° til 27 °C. Grad av lufting er avhengig av ulike faktorer, slik som størrelse til fermentoren, rørehastighet og lignende. Generelt er fermenteringer i større skala omrørt ved omtrent 95 til 300 rpm og til-ført omtrent 50 til 500 liter luft pr. min (LPM).

Separeringen av de foreliggende forbindelser fra hele fermenteringsvæsken og gjenvinning av forbindelsen, gjøres ved løsningsmiddelekstraksjon og tilsetning av kromatografiske fraksjoner med ulike kromatografiske teknikker og løsningsmid-delsystemer.

De foreliggende forbindelser er tungt løselige i vann, men er løselige i organiske løsningsmidler. Denne evnen kan passende utnyttes til å gjenvinne forbindelsen fra fermenteringsvæsken. Dette betyr at ved en gjenvinningsmetode kan hele fermenteringsvæsken blandes med omtrent et likt volum av et organisk løsningsmiddel. Ettersom ethvert organisk løs-ningsmiddel kan benyttes, er det å foretrekke å anvende et løsningsmiddel som ikke blandes med vann, slik som etylacetat, metylenklorid, kloroform og lignende. Generelt bør flere eks-traksjoner utføres for å oppnå maksimum utbytte. Løsningsmid-let fjerner de foreliggende forbindelser så vel som andre stoffer som mangler den antiparasittiske aktivitet til foreliggende forbindelse. Dersom løsningsmidlet er vannublandbart, separeres lagene og organisk løsningsmiddel konsentreres under redusert trykk. Resten plasseres i en kromatografisk kolonne fortrinnsvis inneholdende silikagel. Kolonnen holder tilbake det ønskede produkt og enkelte urenheter, men lar mange av urenhetene, særlig upolare urenheter, passere igjennom. Kolonnen vaskes med et middels polart, organisk løsningsmiddel, slik som metylenklorid eller kloroform, for videre fjerning av urenheter og vaskes så med en blanding av metylenklorid eller kloroform og et organisk løsningsmiddel, hvorved aceton, metanol og etanol og lignende foretrekkes anvendt. Løs-ningsmidlet fordampes og resten kromatograferes videre ved å anvende kolonnekromatografi, tynnsjiktskromatografi, preparativ tynnsjiktskromatografi, væskekromatografi ved høyt trykk og lignende, med silikagel, aluminiumoksid, ionebytter-resiner, dekstrangeler og lignende som kromatografisk medium med varierende løsningsmidler og kombinasjoner av løsningsmid-ler som eluent. Tynnsjikts-, høytrykks-, væske- og preparativ lag-kromatografi kan anvendes for å påvise tilstedeværelse av, og isolere den foreliggende forbindelse.

Anvendelse av forutgående teknikker så vel som andre kjente teknikker for en fagmann på området, vil resultere i rensede forbindelser som inneholder den foreliggende forbindelse. Tilstedeværelse av den bestemte forbindelse bestemmes ved analysering av de ulike kromatografiske fraksjoner med hensyn på biologisk aktivitet eller fysiokjemiske karakteristika. Begge forbindelser er bestemt ved detaljerte analyser av de ulike spekterkarakteristika for forbindelsene, særlig deres kjernemagnetiske resonans, masse, ultrafiolette og in-frarøde spektra.

Eksempel 1

1. Kultur: MF-5954 ble mottatt på en skråagar-plate og ble anvendt for å fremstille FVM-er (nedfryste vegetative myceler). En del av skråagaren ble aseptisk overført til inokulasjonsmedium A (50 ml, 250 ml kolber uten ledeplater). Dette ble inkubert i et 5,08 cm roterende risteappa-rat, 220 rpm i 3 dager ved 25 °C, 85 % relativ fuktighet (rh) , for å oppnå en biomasse. Deler av biomassen ble overført til sterile ampuller inneholdende glyserol og nedfryst (som FVM). Disse ble opprettholdt i en endelig konsentrasjon på 10-15 % glyserol ved -75 °C. Sekundære FVM-er ble fremstilt fra en primær-FVM ved overføring av 1,0 ml av den smeltede primær-FVM til inokulasjonsmedium og inkubering i 2-3 dager ved 25 °C, 220 rpm, og nedfryst som ovenfor. 2. Inokulum: En nedfryst ampulle (FVM) ble tint til romtemperatur og anvendt for å inokulere inokulasjonskulturer av MF-5954 med 0,5-1,0 ml pr. 50 ml inokulasjonsmedium A. Disse ble dyrket på en gyrorister (220 rpm) i 2-3 dager ved 25 °C, 85 % rh. Enkelte ganger ble et andre stadiumsinokulum anvendt. For å utvikle dette ble 1 ml av det første trinns inokulum beskrevet ovenfor fortynnet i 50 ml friskt inokulasjonsmedium A og inkubert 24-30 t ved 25 °C, 220 rpm, 85 % rh. 3. Produksjon: Sammensetningen av produksjonsmedium A er et fast substratfermenteringsmedium. En aliquot (18-24 ml) av inokulumet ble plassert i 425 ml av produksjonsmedium A. Denne kolben ble ristet kraftig for å spre biomassen. Innholdet ble fordelt ved uthelling i en 4 1 rullekultur-beholder som inneholdt 1 250 cm<3> med storpartiklet vermiculitt. Innholdet i rulleflasken ble ristet/blandet for å sikre en homogen inokulering og dekning. Rulleflaskene ble inkubert horisontalt, dreid ved omtrent 4 rpm på et Wheaton-rulleapparat ved 22-25 °C, 50-75 % rh i 19-28 dager, hvorved det ble oppnådd en sekundær metabolitt i fermenteringsmediet.

Flere flytende medier ble undersøkt for fremstilling av foreliggende forbindelser, slik at fermenteringen kunne lettere skaleres opp til store beholdere. Fremstilling ble påvist i kun få av de flytende mediene som ble testet. Et flytende produksjonsmedium B ble anvendt. Inokulasjonskulturer ble inokulert som beskrevet ovenfor, og dyrket ved 22 0 rpm på en roterende rister i 3 dager ved 25 °C, 85 % rh. En aliquot av inokulum (1 ml) ble anvendt for å inokulere hver produk-sjonskolbe som inneholdt 50 ml (2 % inokulum). Kolber ble inkubert på en roterende rister (220 rpm) i 21-28 dager ved 25 °C, 50 % rh.

De to fremstillingsmetoder var hovedsakelig ekviva-lente i mengden av fremstilt produkt. Den andre metoden (flytende produksjonsmedium B) har imidlertid den fordelen at den kan skaleres opp til beholdere med omrøring slik at større mengder kan fremstilles. Den faste produksjonsmetoden (rulleflasker med medium A) gjør det vanskelig med oppskalering.

Større beholdere (22 liters tanker) ble også anvendt for å fremstille foreliggende forbindelser fra denne kultur.

Eksempel 2

Rensing og foreløpig karakterisering

Tolv 2-liters rulleflasker inneholdende kulturen dyrket på medium i 21 dager, ble ekstrahert med 650 ml metyl-etylketon (MEK), hver i 4 t på en rullemaskin ved 100 rpm. Ekstraktene ble filtrert og blandet, og inndampet til tørrhet under vakuum, inntil en vekt på 8 g. Dette materialet ble løst i 20 ml metylenklorid og overført til en 800 ml silikagel(E. Merck)-kolonne i et forhold på 95:5 mellom metylenklorid og metanol. Ett kolonnevolum hver av de følgende løsningsmidler ble anvendt for eluering: 95:5, 9:1, 3:1, 1:1 metylenklorid:-metanol og metanol. 40 ml fraksjoner ble samlet med mestepar-ten av aktiviteten i fraksjonene 51-55 som bestemt ved bio-assay (Lucilia). Fraksjonene ble slått sammen og inndampet til tørrhet under vakuum og hadde en vekt på 200 mg. Denne prøve ble løst i 8,5 ml metanol og overført til en Sephadex LH20-kolonne (Pharmacia) i metanol og 13 ml fraksjoner ble samlet ved en strømningshastighet på 6,5 ml/min. Aktiviteten ble bestemt å være i fraksjonene 41-50, disse fraksjonene ble slått sammmen og tørket, og hadde en vekt på 90 mg. Dette materialet ble løst i 0,5 ml metanol og to injeksjoner gjort på en Eka Nobel C-18 HPLC-kolonne (9,6 mm x 250 mm) ved romtemperatur målt ved 270 nm ved en strømingshastighet på 4 ml/min. Løs-ningssystemet anvendt var acetonitril og vann i forholdet 70:30, med 0,1 % TFA, og aktivt materiale ble isolert i fraksjonene 26-27 ved den første isolering og 27-28 i den andre. Renhet til forbindelsen ble verifisert ved analytisk HPLC: Eka-Nobel-kolonne (4,6 x 250 mm C-18) med en strømnings-hastighet på 1 ml/min og 4 0 °C så vel som ved TLC ved flere løsningssystemer. Sammenslåtte fraksjoner ble konsentrert under vakuum og ekstrahert i metylenklorid, tørket, hvorved man fikk et utbytte på 4,8 mg ren forbindelse (forbindelse 1).

Senere fraksjoner fra silikakolonnen ovenfor var også bioaktive; de ble blandet og gjort tørre i vakuum, og hadde en vekt på 1,4 g. Det faste stoffet ble vasket med metanol flere ganger og inneholdt komponenter med like UV-spektra som det for forbindelse 1. Denne spektroskopiske egenskap ble anvendt for å overvåke videre rensingstrinn og bioaktivitet ble til sist verifisert på de rene forbindelser. Metanolløsningen som inneholdt en vekt på 500 mg, ble således fraksjonert på en 250 ml Sephadex LH-20-kolonne i metanol. Majoriteten av vekten var oppbevart i disse kombinerte fraksjoner. Materialet ble tørket og løst på ny i 3 ml metanol og 1 ml injeksjoner ble gjort på en preparativ Zorbax C-18-kolonne (22,5 mm x 250 mm) ved romtemperatur ved å anvende et acetonitril-vann-løsnings-middelsystem i forholdet 80:20 (0,1 % TFA) med en strømnings-hastighet på 8 ml pr. min med UV-bestemmelse ved 270 nm og innsamling av 8 ml fraksjoner. Fraksjon 29 fra hver av de tre fraksjoneringene ble kombinert, hvorved man fikk forbindelse 2, og fraksjonene 21-22 inneholdt forbindelse 3. Begge løs-ninger ble konsentrert og ekstrahert med etylacetat, vasket med vann og tørket. Forbindelse 2 hadde en vekt på 1,8 mg og forbindelse 3 var 1,0 mg. Begge forbindelser ble karakterisert som analoger til forbindelse 1 ved NMR- og MS-undersøkelser.

"Fast Atom Bombardment" (FAB) massespektra ble tatt opp på et JEOL HXllO-massespektrometer. FAB-spektrumet ble oppnådd ved å anvende en matriks av ditiotreitol:ditioerytri-tol (20/80). De eksakte massemålinger ble gjort med høy opp-løsning med "ultramark" 1960 (Fomblin) som referanseforbind-else. Viktige høyoppløsningsdata er angitt under.

Forbindelse 1

Forbindelse 2

<13>C NMR- data

<13>C NMR-spektra ble tatt opp på CD2C12 ved 100 og

125 MHz på Varian Unity 400 og 500 NMR-spektrometere, hhv. ved 25 °C. Kjemiske skift er gitt i ppm relativt til tetrametyl-silan (TMS) ved null ppm ved å anvende løsningstopp ved 53,8 ppm som en intern standard.

Forbindelse 1 (125 MHz): 198,0, 172,6, 162,0, 154,7, 154,6, 140,8, 140,0, 138,4, 135,9, 134,0, 125,9, 125,1, 122,7, 122.0, 121,8, 117,5<*>, 116,7, 113,1, 76,8, 76,4<*>, 75,3, 73,9, 72,6, 58,2, 56,1, 48,0, 47,8, 45,2, 39,1, 32,3, 32,0, 30,1, 29,9, 27,8, 26,0, 25,7, 24,7, 23,5, 19,6, 18,1<*>, 15,1, 12,6, 11,2 ppm.

Karbonatomantallet på 43 er i overensstemmelse med den molekylære formel C43H53NO6 utledet ved hjelp av HR FAB-MS.

Forbindelse 2 (100 MHz): 198,1, 172,0, 162,0, 154,8, 147.1, 140,1, 138,3, 135,9, 134,0, 126,8, 122,6, 122,0, 121,8, 117,8<*>, 116,7, 113,2, 106,9, 76,6<*>, 75,3, 73,9, 73,3, 72,7, 58,2, 55,5, 49,6, 48,1, 44,5, 41,3, 39,5, 32,0, 30,4, 30,1, 30,0, 29,9, 27,8, 26,0, 24,8, 23,4, 18,0<*>, 17,7, 16,7, 15,3, 12,5 ppm.

Karbonatomantallet på 43 er i overensstemmelse med den molekylære formel C43H53NO7 utledet ved hjelp av HR FAB-MS. <*>Karbonatomer markert med en stjerne ble observert som brede resonanser.

* H NMR- data

<X>H NMR-spektra ble tatt opp ved 3 00, 400 eller

500 MHz-spektrometere. Kjemiske skift er angitt i ppm relativt til TMS ved null ppm ved å anvende løsningsmiddeltoppene som interne standarder.

Forbindelse 1 (se fig. 1) (500 MHz): 5 0,96 (3 H, s), 1,07 (3 H, s) , 1,12 (3 H, S) , 1,14 (3 H, s) , 1,31 (3 H, s) , 1,33 (3 H, s), 1,42 (3 H, s), -1,46 (3 H, br.s), 1,96 (3 H, d, J = 1 Hz), 2,32 (1 H, dd, J = 11, 14 Hz), 2,75 (1 H, dd, J = 6,5, 14 Hz), 2,81 (1 H, dd, J = 3, 6,0 Hz), 2,85 (1 H, m), 3,43 (1 H, m), 4,96 (1 H, br.s), 5,09 (1 H, s), 5,20 (1 H, br.s), 5,22 (1 H, d, J = 6,0 Hz), 5,95 (1 H, d, J = 15 Hz), 6,06 (1 H, d, J = 3 Hz), 6,40 (1 H, dd, J = 11, 15 Hz), 7,33

(1 H, br.d, J - 11 Hz), 7,71 (1 H, s).

Forbindelse 2 (se fig. 2) (400 MHz): 5 0,95 (3 H, s), 1,07 (3 H, s), 1,122 (3 H, s), 1,126 (3 H, s), 1,31 (3 H, s), 1,34 (3 H, s), 1,42 (6 H, s), 1,73 (1 H, dd, J = 9,5, 12,5 Hz), 1,86 (3 H, d, J = 1,5 Hz), 2,34 (1 H, br.dd, J = 7,5, 12,5 Hz), 2,36 (1 H, dd, J = 11, 14 Hz), 2,78 (1 H, dd, J = 6,5, 14 Hz), 2,81 (1 H, dd, J = 3, 6,5 Hz), 2,93 (1 H, m), 4,88 (H, br.q, J-8 Hz), 5,00 (1 H, br.s), 5,10 (1 H, s), 5,20 (1 H, dq, J ~ 1 Hz), 5,21 (1 H, d, J = 6,5 Hz), 6,06 (1 H, d, J = 3 Hz), 6,93 (1 H, dq, J = 8, 1,5), 7,72 (1 H, s).

Forbindelse 3 (se fig. 3) (300 MHz): 5 0,91 (3 H, s), 1,05 (3 H, s), 1,09 (3 H, s), 1,11 (3 H, d, J - 7,5 Hz), 1,13 (3 H, s), 1,33 (3 H, s) , 1,34 (3 H, s), 1,47 (3 H, s) , 2,30

(1 H, dd, J = 10,5, 13,5 Hz), 2,72 (1 H, dd, J = 6,5,

13,5 Hz), 2,87 (1 H, dd, J = 3, 6,0 Hz), 4,00 (1 H, dd, J = 2,5, 10,5 Hz), 4,58 (1 H, m), 5,02 (1 H, br.s), 5,07 (1 H, s), 5,17 (1 H, br.s), 5,23 (1 H, d, J = 6,0 Hz), 6,02 (1 H, d, J = 3 Hz), 7,67 (1 H, s).

Forkortelser: s = singlett, d = dublett, q = kvar-tett, br = bred, m = multiplett, J = ^^H koplings kons tant i hertz (± 0,5 Hz, ~ = omtrentlig).

Claims (9)

1. Forbindelse, karakterisert ved_at den har formel:

2. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved fermentering i et medium med karbonkilder, nitrogenkilder og sporelementkilder, av en produserende stamme av Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245 og isolering av forbindelsene.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at stammen er Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245.

4. Anvendelse av en effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 1 for fremstilling av et preparat for behandling av dyr infisert med parasitter.

5. Preparat som kan anvendes for behandling av para-sittinf eks jon hos dyr, karakterisert ved en inert bærer og en forbindelse ifølge krav 1.

6. Fremgangsmåte for behandling av parasittinfeksjoner i planter eller planteavlinger, karakterisert ved anvendelse på planten eller jorden hvor den gror av en effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 1.

7. Preparat som kan anvendes for behandling av parasitt-inf eks joner i planter, karakterisert ved at det omfatter en inert bærer og en forbindelse ifølge krav 1.

8. Biologisk ren kultur, karakterisert ved at den er av Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245 med evne til fremstilling av forbindelsene ifølge krav 1.

9. Biologisk ren kultur ifølge krav 8, karakterisert ved at den er Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245.