NO315003B1 - Method for producing polypeptide as well as digested DNA sequence encoding - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører ifølge kravinnledningen en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid avledet fra hG-CSF-polypeptidet ved delesjon, samt DNA-sekvens som koder for dette polypeptid. According to the preamble of the claims, the present invention relates to a method for producing a polypeptide derived from the hG-CSF polypeptide by deletion, as well as the DNA sequence that codes for this polypeptide.

Den humane granulocytt-koloniststimulerende faktor (hG-CSF) The human granulocyte-colony stimulating factor (hG-CSF)

er en type polypeptid som er essensiell ved dannelse av forskjellige blodceller som et resultat av formering og differensiering av hemåtopoetiske stamceller. Dens vesentlige effekt er å fremme økningen i antallet granulocytter, særlig nøytrofiler. Nøytrofiler spiller en viktig rolle ved beskyttelse av den levende kropp mot infeksjon. is a type of polypeptide that is essential in the formation of various blood cells as a result of the proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells. Its main effect is to promote the increase in the number of granulocytes, especially neutrophils. Neutrophils play an important role in protecting the living body against infection.

Deres levetid er imidlertid kort og det kreves derfor However, their lifespan is short and therefore required

konstant supplering ved formering og differensiering av forløperceller. De terapier som i stor utstrekning har vært anvendt i de senere år for formerende tumorer inhiberer samtidig veksten av nøytrofil-forløpere og bevirker følgelig en alvorlig bivirkning, nemlig en reduksjon i den nøytrofile beskyttelse i kreftangrepne pasienter som gjør dem mer utsatt for infeksjon. hG-CSF ventes å være effektiv i å avhjelpe denne uønskede bivirkning ved å fremme økningen i antallet av nøytrofiler på den ene side og på den annen side ved fore-bygging og behandling av infeksiøse sykdommer. Videre er hG-CSF polypeptidderivatene som fremstilles ved den foreliggende oppfinnelse overlegne med hensyn til hG-CSF-aktivitet i forhold til de kjente hG-CSF og er ventet å være nyttig på constant supplementation during multiplication and differentiation of precursor cells. The therapies that have been used to a large extent in recent years for proliferating tumors simultaneously inhibit the growth of neutrophil precursors and consequently cause a serious side effect, namely a reduction in the neutrophilic protection in cancer patients which makes them more susceptible to infection. hG-CSF is expected to be effective in remedying this unwanted side effect by promoting the increase in the number of neutrophils on the one hand and on the other hand in the prevention and treatment of infectious diseases. Furthermore, the hG-CSF polypeptide derivatives produced by the present invention are superior in terms of hG-CSF activity compared to the known hG-CSF and are expected to be useful in

det medisinske område. the medical field.

Med den senere tids hurtige fremskritt i rekombinant DNA-tekhologi er i rekkefølge gener for proteiner involvert ved formering og differensiering av blodceller isolert. Slike faktorer er i produksjon ved hjelp av genetiske metoder under anvendelse av mikroorganismer eller dyreceller. With the rapid progress of recent times in recombinant DNA technology, genes for proteins involved in the multiplication and differentiation of blood cells have been successively isolated. Such factors are in production using genetic methods using microorganisms or animal cells.

Et cDNA for hG-CSF ble isolert fra den humane skvamøs celle-karsinom-cellelinje CHU-II, dets basesekvens ble bestemt og dets ekspresjon i COS-celler ble rapportert av Nagata et al. A cDNA for hG-CSF was isolated from the human squamous cell carcinoma cell line CHU-II, its base sequence was determined, and its expression in COS cells was reported by Nagata et al.

(Nagata et al.: Nature, 319, 415 (1986)}. Også Souza et al. (Nagata et al.: Nature, 319, 415 (1986)}. Also Souza et al.

isolerte et cDNA fra den humane urinblære-kreftcellelinje 5 637, bestemte dets basesekvens og rapporterte dets ekspresjon i Escherichia coli (E. coli) (Souza et al.: Science 232, 61 (1986)). isolated a cDNA from the human bladder cancer cell line 5637, determined its base sequence and reported its expression in Escherichia coli (E. coli) (Souza et al.: Science 232, 61 (1986)).

Aminosyresekvensen av det protein som kodes for av de ovennevnte to cDNA'er er i samsvar med aminosyre-sekvensen (tabell 1) av det protein som kodes for av det cDNA som isoleres fra normale makrofager fra humant perifert blod av oppfinnerne i foreliggende søknad. The amino acid sequence of the protein encoded by the above two cDNAs is consistent with the amino acid sequence (Table 1) of the protein encoded by the cDNA isolated from normal human peripheral blood macrophages by the inventors in the present application.

Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for, med lave omkostninger og i store mengder, å fremstille et polypeptid avledet fra hG-CSF-polypeptidet som har høy spesifikk aktivitet og høy stabilitet i blod. It is an object of the present invention to provide a method for, at low cost and in large quantities, to produce a polypeptide derived from the hG-CSF polypeptide which has high specific activity and high stability in blood.

I oppfinnelsens sammenheng ble det funnet at hG-CSF polypeptidderivater med høy spesifikk aktivitet kan fremstilles ved å modifisere det cDNA for hG-CSF som er .vist i tabell 1 og dyrke en stamme av.E. coli som rommer et plasmid med det modifiserte cDNA innskutt deri eller ved-hjelp av begrenset polypeptidspaltning under anvendelse av en protease, og dette førte til fullføring av den foreliggende, oppfinnelse. In the context of the invention, it was found that hG-CSF polypeptide derivatives with high specific activity can be prepared by modifying the cDNA for hG-CSF shown in Table 1 and growing a strain of E. coli harboring a plasmid with the modified cDNA inserted therein or by means of limited polypeptide cleavage using a protease, and this led to the completion of the present invention.

De fordeler som er beskrevet over oppnås med fremgangsmåten og DNA-sekvensen slik de er definert med de i kravene anførte trekk. The advantages described above are achieved with the method and the DNA sequence as defined by the features stated in the claims.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Fig. 1 viser et konstruksjonsskjerna for plasmidet pCfTAl. Fig. 2 viser et konstruksjonsskjema for plasmidet pCfTB20. Fig. 3 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfTL23, 38, 35 og 41. Fig. 4 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfTM14, 17 og 113. Fig. 5 viser et konstruksjonsskjema for plasmidet pCfWDl. Fig. 6 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene Fig. 1 shows a construction core for the plasmid pCfTAl. Fig. 2 shows a construction diagram for the plasmid pCfTB20. Fig. 3 shows construction diagrams for the plasmids pCfTL23, 38, 35 and 41. Fig. 4 shows construction diagrams for the plasmids pCfTM14, 17 and 113. Fig. 5 shows a construction diagram for the plasmid pCfWD1. Fig. 6 shows construction diagrams for the plasmids

pCfT95K19, pCfAAl og.pCfAB5. pCfT95K19, pCfAAl and .pCfAB5.

Fig. 7 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfBA3, Fig. 7 shows construction schemes for the plasmids pCfBA3,

pCfBBlOl, pCfBC52, 59, 42B1, 45, 76, 77, 93, 95, 97, pCfBD28, 56 og 82. pCfBBlOl, pCfBC52, 59, 42B1, 45, 76, 77, 93, 95, 97, pCfBD28, 56 and 82.

Fig. 8 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfCBlOl, Fig. 8 shows construction schemes for the plasmids pCfCBlOl,

pCfCC52, 59, pCfCD28 og 56. pCfCC52, 59, pCfCD28 and 56.

Fig. 9 (l) og (2) viser skjematisk de prosesser som er involvert i Okayama-Bergmetoden for cDNA-syntese og konstruksjon av et rekombinant plasmid inneholdende det syntetiserte DNA. Fig. 10 viser et konstruksjonsskjema for plasmidet pLAl. ■ Fig. 11 viser et konstruksjonsskjerna for plasmidet pCfTNSSOl. Fig. 13 viser et konstruksjonsskjema for plasmidet pTrS20. Fig. 14 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfTNS7 Fig. 9 (l) and (2) show schematically the processes involved in the Okayama-Berg method for cDNA synthesis and construction of a recombinant plasmid containing the synthesized DNA. Fig. 10 shows a construction diagram for the plasmid pLA1. ■ Fig. 11 shows a construction core for the plasmid pCfTNSSOl. Fig. 13 shows a construction diagram for the plasmid pTrS20. Fig. 14 shows construction diagrams for the plasmids pCfTNS7

og pCfTAArg4S. and pCfTAArg4S.

Fig. 15 viser konstruksjonsskjemaer for plasmidene pCfTN2 05 Fig. 15 shows construction schemes for the plasmids pCfTN2 05

og pCfTAArg4. and pCfTAArg4.

Fig. 16 viser konstruksjonsskjemaer for.plasmidene pCfTNS3 01 Fig. 16 shows construction schemes for the plasmids pCfTNS3 01

og pCfTNS401. and pCfTNS401.

Fig. 17 (1) og (2) viser konstruksjonsskjemaer for Fig. 17 (1) and (2) show construction diagrams for

plasmidene pCfBD2 8A17 og pCfBD2 8T17. plasmids pCfBD2 8A17 and pCfBD2 8T17.

hG-CSF-polypeptidderivatene som fremstilles i samsvar med oppfinnelsen er forskjellige med hensyn til aminosyre-sekvensen fra hG-CSF-polypeptidet med aminosyresekvensen vist i tabell 1 som et resultat av substitusjon og/eller delesjon. Aminosyren som substitueres er den syttende aminosyren cystein fra den N-terminale ende. De aminosyrer som utelates er aminosyrene ved eller i nærheten av den N-terminale ende. Foretrukket bør minst en aminosyre blant den 1. til den 11. aminosyre fra den N-terminale ende utelates. The hG-CSF polypeptide derivatives produced in accordance with the invention differ in amino acid sequence from the hG-CSF polypeptide with the amino acid sequence shown in Table 1 as a result of substitution and/or deletion. The amino acid that is substituted is the seventeenth amino acid cysteine from the N-terminal end. The amino acids that are omitted are the amino acids at or near the N-terminal end. Preferably, at least one amino acid among the 1st to the 11th amino acid from the N-terminal end should be omitted.

De rekombihante plasmider oppnås ved å innskyte et DNA-fragment som koder for hvilke som helst av de ovennevnte hG-CSF-polypeptidderivater i et passende plasmid med en DNA ekspresjonsfunksjon. The recombinant plasmids are obtained by inserting a DNA fragment encoding any of the above hG-CSF polypeptide derivatives into a suitable plasmid with a DNA expression function.

Foretrukket som de DNA-fragmenter som koder for de ved oppfinnelsen fremstillbare hG-CSF-polypeptider er dem som skriver seg fra substitusjon av i.det minste en base valgt blant 1. til 51. basene av basesekvensen vist i tabell 1 i det DNA som koder for hG-CSF. Preferred as the DNA fragments that code for the hG-CSF polypeptides that can be produced by the invention are those that result from the substitution of at least one base selected from the 1st to the 51st bases of the base sequence shown in Table 1 in the DNA which codes for hG-CSF.

Et cDNA {hG-CSF cDNA) oppnådd ved revers transkripsjon av et hG-CSF-kodende m-RNA ved rekombinant DNA-teknologi eller et hG-CSF-kodende DNA oppnådd fra kromosomalt DNA, f.eks., kan anvendes som det hG-CSF-kodende DNA vist i fig. l. A cDNA {hG-CSF cDNA) obtained by reverse transcription of an hG-CSF-encoding m-RNA by recombinant DNA technology or an hG-CSF-encoding DNA obtained from chromosomal DNA, for example, can be used as the hG -CSF-encoding DNA shown in fig. l.

Hvilket som helst hG-CSF cDNA kan anvendes forutsatt at det koder for hG-CSF. Som spesifikt eksempel kan pCSFl-2, et plasmid fremstilt av de foreliggende oppfinnere, anvendes. Fremgangsmåten for fremstilling av pCSFl-2 er beskrevet i undereksempel 1. Any hG-CSF cDNA can be used provided it encodes hG-CSF. As a specific example, pCSF1-2, a plasmid prepared by the present inventors, can be used. The procedure for the production of pCSF1-2 is described in sub-example 1.

Det hG-CSF cDNA som inneholdes i pCSFl-2 har basesekvensen vist i tabell 1 som bestemt ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av Ml3 fagen (J. Messing et al.. Gene, 19, 269 (1982)). The hG-CSF cDNA contained in pCSF1-2 has the base sequence shown in Table 1 as determined by the dideoxy sequencing method using the M13 phage (J. Messing et al.. Gene, 19, 269 (1982)).

pCSFl-2 er et plasmid med restriksjonsenzymkartet vist i fig. l og en E. coli-stamme inneholdende dette, E. coli ECSF 1t2, er blitt deponert i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRI) siden 27. november, 1986 under deponeringsnr. FERM BP-1220 i samsvar med Budapest-konvensjonen. pCSF1-2 is a plasmid with the restriction enzyme map shown in fig. 1 and an E. coli strain containing it, E. coli ECSF 1t2, have been deposited in the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRI) since November 27, 1986 under deposit no. FERM BP-1220 in accordance with the Budapest Convention.

Et hvilket som helst plasmid kan anvendes for insersjon av et hG-CSF-polypeptidderivat-kodende DNA deri på betingelse av at det nevnte DNA kan uttrykkes i E. coli. Any plasmid can be used for insertion of an hG-CSF polypeptide derivative-encoding DNA therein provided that said DNA can be expressed in E. coli.

Et plasmid som tillater fremmed DNA insersjon deri ved et punkt nedstrøms fra en passende promoter kan med fordel anvendes, f.eks. en trp eller lac promoter, og har avstanden mellom Shine-Dalgarono-sekvensen (i det følgende SD-sekvensen) og initieringskodonet (ATG) innstilt til en passende avstand, f.eks. 6-18 basepar. A plasmid which allows foreign DNA insertion therein at a point downstream from a suitable promoter may be advantageously used, e.g. a trp or lac promoter, and has the distance between the Shine-Dalgarono sequence (hereinafter the SD sequence) and the initiation codon (ATG) set to a suitable distance, e.g. 6-18 base pairs.

Som passende eksempler på slikt plasmid, kan nevnes pKYPlO (US patent nr. 4.686.191), Videre pLSAl (undereksempel 3), pGELl (Sekine et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, 43 0 6 As suitable examples of such a plasmid, mention may be made of pKYP10 (US patent no. 4,686,191), Furthermore, pLSAl (subexample 3), pGELl (Sekine et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, 43 0 6

(1985)), pKY26 (Japansk patentansøknad (OPI) 48699/87 (1985)), pKY26 (Japanese Patent Application (OPI) 48699/87

(betegnelsen "OPI" betyr en ikke-gransket patentsøknad) og pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2, 95 (1977)). (the designation "OPI" means an unexamined patent application) and pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2, 95 (1977)).

Rekombinasjon mellom et DNA som koder for hG-CSF polypeptidet eller et derivat derav og en vektor DNA kan gjennomføres ved hjelp av rekombinante DNA-metoder i generell bruk og som omfatter kutting av begge DNA med et restriksjonsenzym eller enzymer og etterfølgende ligering under anvendelse av T4 DNA ligase. For ligering kan DNA-fragmentterminiene som resulterer fra restriksjonsenzymkuttingen behandles, ora ønsket, ved å gjøre bruk av "filling-in" under anvendelse av DNA polymerase I Klenow-fragmentet eller "trimming"-reaksjonen under anvendelse av T4 DNA polymerase. DNA-linkerteknikken kan også anvendes. Recombination between a DNA encoding the hG-CSF polypeptide or a derivative thereof and a vector DNA can be carried out using recombinant DNA methods in general use and which include cutting both DNAs with a restriction enzyme or enzymes and subsequent ligation using T4 DNA ligase. For ligation, the DNA fragment termini resulting from restriction enzyme cutting can be processed, if desired, by making use of the "filling-in" using DNA polymerase I Klenow fragment or the "trimming" reaction using T4 DNA polymerase. The DNA linker technique can also be used.

Eksempler på konstruksjon av rekombinante plasmider inneholdende et hG-CSF polypeptidderivat-kodende DNA innskutt deri ved anvendelse av pCSFl-2 som hG-CSF cDNA, pGELl, pKYPlO, pKYP2 6, pBR322 eller pLSAl som plasmidet for innlemmelse av DNA deri og, etter behov, en kjemisk syntetisert DNA-linker eller en teknikk med setespesifikk mutagenese er gitt i det følgende. Examples of construction of recombinant plasmids containing an hG-CSF polypeptide derivative encoding DNA inserted therein using pCSFl-2 as hG-CSF cDNA, pGELl, pKYP10, pKYP2 6, pBR322 or pLSAl as the plasmid for incorporation of DNA therein and, as appropriate , a chemically synthesized DNA linker, or a site-specific mutagenesis technique is provided below.

DETALJERT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE DETAILED DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

(Rekombinas-1 onsprosedvrer) (Recombination procedures)

Som vist i fig. 1, kuttes pCSFl-2 (omtrent 4,5 kilobaser (i det følgende kb)) med Apal og BamHI og et DNA-fragment med omtrent 1,5 kb renses ved hjelp av lav geltemperatur-agarosegelelektroforese (LGT-metoden) (L. Wieslander: Analytical Biochemistry, 98, 305 (1979)). As shown in fig. 1, pCSF1-2 (about 4.5 kilobases (hereafter kb)) is cut with ApaI and BamHI and a DNA fragment of about 1.5 kb is purified by low gel temperature agarose gel electrophoresis (LGT method) (L. Wieslander: Analytical Biochemistry, 98, 305 (1979)).

Deretter kuttes pLSAl med Banlll og BamHI, og et DNAfragment på omtrent 2,8 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Begge fragmentene oppnådd på denne måte og det syntetiske DNA vist i fig. 1 ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfTAl. pLSA1 is then cut with BanIII and BamHI, and a DNA fragment of approximately 2.8 kb is purified using the LGT method. Both fragments obtained in this way and the synthetic DNA shown in fig. 1 are ligated together using T4 DNA ligase to give pCfTAl.

Deretter, som vist i fig. 2, kuttes pCfTAl med BamHI, idet de utstående ender omdannes til buttender ved behandling med Klenow-fragmentet og etter ytterligere kutting med EcoRI renses et DNA-fragment på omtrent 2,5 kb ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfTAl med EcoRI og Dral og et DNA-fragment på omtrent 1,0 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De således oppnådde DNA-fragmenter ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA-ligase til å gi pCfTB20. Then, as shown in fig. 2, pCfTAl is cut with BamHI, the protruding ends being converted to blunt ends by treatment with the Klenow fragment and after further cutting with EcoRI, a DNA fragment of approximately 2.5 kb is purified using the LGT method. Separately, pCfTA1 is cut with EcoRI and Dral and a DNA fragment of approximately 1.0 kb is purified using the LGT method. The DNA fragments thus obtained are ligated together using T4 DNA ligase to give pCfTB20.

Videre, som vist i fig. 3, kuttes pCSFl-2 med Apal og BamHI og et DNA-fragment på omtrent 1,5 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pGELl med Hindlll, BamHI og Pstl og et DNA-fragment på omtrent 1,7 kb renses ved hjelp av LGT-metoden.' Videre kuttes pKYPlO med Pstl og Banlll og et DNA- ■ fragment på omtrent 1,1 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Ligering av disse tre DNA-fragmenter og det syntetiske DNA vist i fig. 3 gir pCfTL23, pCfTL3 8, pCfTL35 og pCfTL41, mens ligering av disse tre DNA-fragmenter og det syntetiske DNA vist i fig. 4 gir pCfTM14, pCfTM17 og pCfTM113. Furthermore, as shown in fig. 3, pCSF1-2 is cut with ApaI and BamHI and a DNA fragment of approximately 1.5 kb is purified using the LGT method. Separately, pGEL1 is cut with HindIII, BamHI and PstI and a DNA fragment of approximately 1.7 kb is purified using the LGT method. Furthermore, pKYP10 is cut with PstI and BanIII and a DNA fragment of approximately 1.1 kb is purified using the LGT method. Ligation of these three DNA fragments and the synthetic DNA shown in fig. 3 gives pCfTL23, pCfTL38, pCfTL35 and pCfTL41, while ligation of these three DNA fragments and the synthetic DNA shown in fig. 4 gives pCfTM14, pCfTM17 and pCfTM113.

Videre, som vist i fig. 5, spaltes pCfTAl med Banlll Furthermore, as shown in fig. 5, pCfTAL is cleaved with Banlll

og Stul og et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment på omtrent- 1,3 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pKY2 6 med BamHI, de utstående ender omdannes til buttender ved behandling med DNA polymerase I Klenow fragment og etter ytterligere kutting med Pstl, renses et DNA på omtrent 1,8 kb ved hjelp av LGT-metoden. Videre kuttes pGELl separat med Banlll og Pstl og et DNA-fragment på omtrent 1,0 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De tre således oppnådde DNA-fragment er ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfWDl. and Stul and an hG-CSF cDNA-containing DNA fragment of approximately 1.3 kb is purified using the LGT method. Separately, pKY2 6 is cut with BamHI, the protruding ends are converted to blunt ends by treatment with DNA polymerase I Klenow fragment and after further cutting with Pstl, a DNA of approximately 1.8 kb is purified using the LGT method. Furthermore, pGEL1 is cut separately with BanIII and Pstl and a DNA fragment of approximately 1.0 kb is purified using the LGT method. The three DNA fragments thus obtained are ligated together using T4 DNA ligase to give pCfWD1.

Videre, som vist i fig. 6, kuttes pCFTL3 8 med HindiII og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,6 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfTL3 8 med Hindlll, BamHI og Dpnl og et DNA-fragment på omtrent 3 00 bp (basepar) renses ved hjelp av LGT-metoden. Videre kuttes pCfTB20 separat med Aval, de utstående ender omdannes til buttender ved behandling med Klenow-fragmentet og etter ytterligere kutting med Bglll, renses et DNA-fragment på omtrent 480 bp ved hjelp avLGT-metoden. De tre således oppnådde DNA-fragmenter ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA-ligase til å gi pCfT95K19. Furthermore, as shown in fig. 6, pCFTL3 8 is cut with HindiII and BglII and a DNA fragment of approximately 2.6 kb is purified by the LGT method. Separately, pCfTL3 8 is cut with HindIII, BamHI and DpnI and a DNA fragment of approximately 300 bp (base pairs) is purified using the LGT method. Furthermore, pCfTB20 is cut separately with Aval, the protruding ends are converted to blunt ends by treatment with the Klenow fragment and after further cutting with BglII, a DNA fragment of approximately 480 bp is purified using the LGT method. The three DNA fragments thus obtained are ligated together using T4 DNA ligase to give pCfT95K19.

Videre, som. også vist i fig. 6, kuttes pCfT95K19 med Banlll og Bgll og en DNA på omtrent 1,0 kb renses ved hjelp av LGT-metoden og separat kuttes pCfT95Ki9 med Bgll alene og et DNA-fragment på omtrent 1,8 kb renses ved hjelp av den nevnte metode. Videre kuttes separat pCfT95K19 med Bgll og Sau3A og et DNA-fragment på omtrent 3 50 bp renses ved hjelp av LGT-metoden. De tre således oppnådde DNA-fragmenter og det syntetiske DNA vist i midten av fig. 6 (omtrent halvveis nede) ligeres sammen til å gi pCfAAl. Deretter, som også vist i fig. 6, kuttes pCfAAl med Xhol og Bgll og et DNA-fragment på 3,0 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Dette fragment, det ovennevnte Bgll Sau3A-fragment (omtrent 350 bp) av pCfT95K19 og det syntetiske DNA vist nederst på fig. 6 ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfABS og pcfAB14. Videre, som vist i fig. 7, kuttes pCfABS med Aval og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,8 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfWDl med Bglll og Aval og DNA på omtrent 1,3 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De to således oppnådde fragmenter ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfBA8. På den annen side kuttes pCfAB14 med Aval og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,8 kb renses ved hjelp av LGT-metoden og dette fragment ligeres med det ovennevnte 1,3 kb DNA-fragment avledet fra pCfWDl ved kutting med Bglll og Aval under anvendelse av T4 DNA ligase, til å gi pCfDA32. Videre, som det også fremgår av fig. 7, kuttes pCfBAS med Banlll, Bglll og Xhol og et DNA-fragment på omtrent 1,4 kb og et DNA-fragment på omtrent 2,7 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Ligering av de to således oppnådde DNA-fragmenter og den syntetiske DNA-linker vist i fig. 7 under anvendelse av T4 DNA ligase gir pCfBBlOl, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28, pCfBDSS, pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCFBC97 og pCfBD82. Furthermore, as also shown in fig. 6, pCfT95K19 is cut with BanIII and BgII and a DNA of approximately 1.0 kb is purified using the LGT method and separately pCfT95K19 is cut with BgII alone and a DNA fragment of approximately 1.8 kb is purified using the aforementioned method. Furthermore, pCfT95K19 is cut separately with Bgll and Sau3A and a DNA fragment of approximately 350 bp is purified using the LGT method. The three DNA fragments thus obtained and the synthetic DNA shown in the middle of fig. 6 (about halfway down) is ligated together to give pCfAAl. Then, as also shown in fig. 6, pCfAAl is cut with XhoI and BgII and a DNA fragment of 3.0 kb is purified using the LGT method. This fragment, the above Bgll Sau3A fragment (about 350 bp) of pCfT95K19 and the synthetic DNA shown at the bottom of Fig. 6 are ligated together using T4 DNA ligase to give pCfABS and pcfAB14. Furthermore, as shown in fig. 7, pCfABS is cut with Aval and BglII and a DNA fragment of approximately 2.8 kb is purified using the LGT method. Separately, pCfWD1 is cut with Bglll and Aval and DNA of approximately 1.3 kb is purified using the LGT method. The two fragments thus obtained are ligated together using T4 DNA ligase to give pCfBA8. On the other hand, pCfAB14 is cut with Aval and Bglll and a DNA fragment of approximately 2.8 kb is purified by the LGT method and this fragment is ligated with the above 1.3 kb DNA fragment derived from pCfWD1 by cutting with Bglll and Aval using T4 DNA ligase, to give pCfDA32. Furthermore, as also appears from fig. 7, pCfBAS is cut with BanIII, BglII and XhoI and a DNA fragment of approximately 1.4 kb and a DNA fragment of approximately 2.7 kb is purified by the LGT method. Ligation of the two thus obtained DNA fragments and the synthetic DNA linker shown in fig. 7 using T4 DNA ligase yields pCfBBlOl, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28, pCfBDSS, pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCFBC97 and pCfBD82.

Som vist i fig. 8 kuttes pBR322 med Pstl, de utstående ender gjøres om til buttender med T4 DNA polymerase, Bglll linkeren innføres under anvendelse av T4 DNA ligase og etter ytterligere kutting med EcoRI og Bglll renses et DNA-fragment på omtrent 3,6 kb ved hjelp av LGT-metoden. As shown in fig. 8, pBR322 is cut with Pstl, the protruding ends are converted to butt ends with T4 DNA polymerase, the Bglll linker is introduced using T4 DNA ligase and after further cutting with EcoRI and Bglll, a DNA fragment of approximately 3.6 kb is purified using LGT - method.

Plasmidene pCfBBlOl, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28 og pCfBD56 oppnådd på den ovennevnte måte kuttes hver med EcoRI og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 1,8 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Hvert 1,8 kb DNA-fragment ligeres med det pBR322-avledede 3,6 kb DNA-fragment under anvendelse av T4 DNA ligase. Det oppnås således pCfCBlOl, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD28 og pCfCD56 tilsvarende de respektive plasmider nevnt i det foregående. The plasmids pCfBB101, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28 and pCfBD56 obtained in the above manner are each cut with EcoRI and BglII and a DNA fragment of about 1.8 kb is purified by the LGT method. Each 1.8 kb DNA fragment is ligated with the pBR322-derived 3.6 kb DNA fragment using T4 DNA ligase. Thus, pCfCBlOl, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD28 and pCfCD56 corresponding to the respective plasmids mentioned above are obtained.

På den annen side kuttes pCfBA8 med Banlll, Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,7 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfBA8 med Xhol og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 1,4 kb- renses ved hjelp av LGT-metoden. Ligering av de to således oppnådde fragmenter og den syntetiske DNA-linker vist i fig. 14 gir pCfTNS7 og pCfTAArg4S. I tillegg, som vist i fig. - 15, kuttes pCfTNS7 med Pvul og Xhol og et DNA-fragment på omtrent l kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfBA32 med Pvul og Xhol og et DNA-fragment på omtrent 3 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De to fragmenter oppnådd på denne måte ligeres sammen- under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfTN205. På lignende måte kuttes pCfTAArg4S med Pvul og Xhol, et fragment på omtrent 1 kb renses ved hjelp av LGT-metoden og dette fragment, ligeres med et DNA-fragment på omtrent 3 kb avledet fra det ovennevnte plasmid pCfBA32 ved kutting med Pvul og Xhol, under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfTAArg4. Videre kuttes pCfBA8 med Banlll og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,7 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfBAS med Xhol og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 1,4 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De to således oppnådde fragmenter og den syntetiske linker vist i fig. 16 ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase .til å gi pCfTNS3 01 og pCfTNS401. Videre, som vist i fig. 12, kuttes pCfBA8 med Xhol, de utstående ender omdannes til buttender ved hjelp av Klenow-fragmentbehandling og etter ytterligere kutting med Pvul, renses et DNA-fragment på omtrent 3 kb ved hjelp av LGT-metoden. Separat blir ATG-vektoren pTrS2 0 (undereksempel 4) kuttet med SacI, etterfulgt av omdannelse av de utstående ender til buttender ved hjelp av Klenow-fragmentbehandling. Etter ytterligere kutting med Pvul, renses et DNA-fragment på omtrent 1 kb ved hjelp av LGT- . metoden. De således oppnådde to fragmenter ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi pCfTNS501. On the other hand, pCfBA8 is cut with BanIII, BglII and a DNA fragment of approximately 2.7 kb is purified by the LGT method. Separately, pCfBA8 is cut with XhoI and BglII and a DNA fragment of approximately 1.4 kb is purified using the LGT method. Ligation of the two thus obtained fragments and the synthetic DNA linker shown in fig. 14 yields pCfTNS7 and pCfTAArg4S. In addition, as shown in fig. - 15, pCfTNS7 is cut with Pvul and Xhol and a DNA fragment of approximately 1 kb is purified using the LGT method. Separately, pCfBA32 is cut with Pvul and XhoI and a DNA fragment of approximately 3 kb is purified using the LGT method. The two fragments thus obtained are ligated together using T4 DNA ligase to give pCfTN205. Similarly, pCfTAArg4S is cut with Pvul and Xhol, a fragment of about 1 kb is purified by the LGT method and this fragment, ligated with a DNA fragment of about 3 kb derived from the above plasmid pCfBA32 by cutting with Pvul and Xhol, using T4 DNA ligase to yield pCfTAArg4. Furthermore, pCfBA8 is cut with BanIII and BglII and a DNA fragment of approximately 2.7 kb is purified using the LGT method. Separately, pCfBAS is cut with XhoI and BglII and a DNA fragment of approximately 1.4 kb is purified using the LGT method. The two thus obtained fragments and the synthetic linker shown in fig. 16 are ligated together using T4 DNA ligase to give pCfTNS301 and pCfTNS401. Furthermore, as shown in fig. 12, pCfBA8 is cut with Xhol, the protruding ends are converted to butt ends by means of Klenow fragment treatment and after further cutting with Pvul, a DNA fragment of approximately 3 kb is purified by the LGT method. Separately, the ATG vector pTrS20 (subexample 4) is cut with SacI, followed by conversion of the overhangs to butt-ends by Klenow fragment processing. After further cutting with Pvul, a DNA fragment of approximately 1 kb is purified using LGT- . the method. The two fragments thus obtained are ligated together using T4 DNA ligase to give pCfTNS501.

I et- eksempel hvor setespesifikk mutagenese anvendes, kuttes pCfBD28 med Banlll og Pstl, som vist i fig. 17, og et DNA-fragment på omtrent 210 bp renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes M13 fag-vektoren M13mpl9RF DNA med AccI og Pstl og.et DNA-fragment på omtrent 7,24 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. De således oppnådde to DNA-fragmenter ligeres sammen under anvendelse av T4 DNA ligase til å gi ptl9BD2 8N. Deretter anvendes dette ptl9BD28N for transfeksjon av E. coli JM105, og enkelttrådet ptl9BD28N utvinnes fra den oppnådde fag. Tilsvarende, som også vist i fig. 17, spaltes Ml3mpl9RF DNA med Hindlll og EcoRI og et DNA-fragment på omtrent 7,2 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Etter at dette 7,2 kb DNA-fragment er blandet med det enkelttrådede ptl9BD28N oppnådd på den nevnte måte, bevirkes åpnet dupleks DNA-dannelse ved denatureringsbehandling etterfulgt av basepartilpasning og det resulterende åpnede dupleks-DNA renses ved hjelp av LGT-metoden. Deretter anneales dette DNA med det syntetiske DNA vist i fig. 17 og blir deretter ringsluttet under anvendelse av Klenow-fragmentet og T4 DNA ligase. Dette ringsluttede DNA anvendes for transfeksjon av E. coli JM105, hvorved ptl9BD28NA17 og ptl9BD28NT17 med sete-spesifikk mutagenese innført deri oppnås. Videre, som også vist i fig. 17, kuttes ptl9BD2 8NA17 og ptl9BD27NT17 med Aval og Xhol og hvert DNA-fragment på omtrent 110 bp renses ved hjelp av LGT-metoden. Separat kuttes pCfBD28 med Xhol og Bglll og et DNA-fragment på omtrent 2,74 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Videre kuttes pCfBD28 separat med Bglll og Aval og et DNA-fragment på omtrent 1,29 kb renses ved hjelp av LGT-metoden. Ligering av de således oppnådde DNA-fragmenter på omtrent 110 bp, omtrent 2,74 kb og 1,2 9 kb under anvendelse av T4 DNA ligase gir henholdsvis pCfBD28Al7 og pCfBD28T17. In an example where site-specific mutagenesis is used, pCfBD28 is cut with BanIII and Pstl, as shown in fig. 17, and a DNA fragment of approximately 210 bp is purified using the LGT method. Separately, the M13 phage vector M13mpl9RF DNA is cut with AccI and PstI and a DNA fragment of approximately 7.24 kb is purified using the LGT method. The two DNA fragments thus obtained are ligated together using T4 DNA ligase to give ptl9BD2 8N. This ptl9BD28N is then used for transfection of E. coli JM105, and the single-stranded ptl9BD28N is recovered from the phage obtained. Correspondingly, as also shown in fig. 17, the Ml3mpl9RF DNA is digested with HindIII and EcoRI and a DNA fragment of approximately 7.2 kb is purified by the LGT method. After this 7.2 kb DNA fragment is mixed with the single-stranded ptl9BD28N obtained in the aforementioned manner, open duplex DNA formation is effected by denaturation treatment followed by base pairing and the resulting open duplex DNA is purified by the LGT method. This DNA is then annealed with the synthetic DNA shown in fig. 17 and is then ring-closed using the Klenow fragment and T4 DNA ligase. This ring-closed DNA is used for transfection of E. coli JM105, whereby ptl9BD28NA17 and ptl9BD28NT17 with site-specific mutagenesis introduced therein is obtained. Furthermore, as also shown in fig. 17, ptl9BD2 8NA17 and ptl9BD27NT17 are cut with Aval and Xhol and each DNA fragment of approximately 110 bp is purified using the LGT method. Separately, pCfBD28 is cut with XhoI and BglII and a DNA fragment of approximately 2.74 kb is purified by the LGT method. Furthermore, pCfBD28 is cut separately with BglII and Aval and a DNA fragment of approximately 1.29 kb is purified using the LGT method. Ligation of the thus obtained DNA fragments of approximately 110 bp, approximately 2.74 kb and 1.29 kb using T4 DNA ligase gives pCfBD28Al7 and pCfBD28T17, respectively.

Reaksjonsbetingelsene for de ovennevnte rekombinasjons-prosedyrer er generelt som følger: DNA-kuttingsreaksjonen i nærvær av et restriksjonsenzym eller enzymer gjennomføres generelt under anvendelse av 0,1 til 20 fig DNA i et reaksjonsmedium som inneholder 2 til 2 00 mM (foretrukket 10 til 40 mM) Tris-HCl (pH 6,0-9,5, foretrukket 7,8-8,0), 0-200 mM NaCl og 2-20 mM (foretrukket 5-10 mM) MgCl2 ved 20-70°C (den optimale temperatur varierer i avhengighet av det eller de restriksjonsenzymer som anvendes) 1 15 min. til 24 timer. Hvert restriksjonsenzym anvendes i en mengde på 0,1-100 enheter (foretrukket 1-3 enheter) pr. mikrogram DNA. Avslutning av reaksjonen oppnås generelt ved oppvarming ved 55-75°C i 5-30 min. Det er også mulig å inaktivere restriksjonsenzymene med et reagens som f.eks. fenol eller dietylpyrokarbonat. The reaction conditions for the above recombination procedures are generally as follows: The DNA cutting reaction in the presence of a restriction enzyme or enzymes is generally carried out using 0.1 to 20 µg of DNA in a reaction medium containing 2 to 200 mM (preferably 10 to 40 mM ) Tris-HCl (pH 6.0-9.5, preferably 7.8-8.0), 0-200 mM NaCl and 2-20 mM (preferred 5-10 mM) MgCl2 at 20-70°C (the optimal temperature varies depending on the restriction enzyme(s) used) 1 15 min. to 24 hours. Each restriction enzyme is used in an amount of 0.1-100 units (preferably 1-3 units) per micrograms of DNA. Termination of the reaction is generally achieved by heating at 55-75°C for 5-30 min. It is also possible to inactivate the restriction enzymes with a reagent such as e.g. phenol or diethyl pyrocarbonate.

DNA-fragmentene dannet ved restriksjonsenzym-kuttingen eller de åpnede dupleks DNA<1>er kan renses ved hjelp av LGT-metoden eller ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese (A.M. Maxam et al., Proe- Nati. Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977)), og flere. The DNA fragments formed by the restriction enzyme cutting or the opened duplex DNA<1>s can be purified by the LGT method or by polyacrylamide gel electrophoresis (A.M. Maxam et al., Proe-Nati. Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977)), and more.

DNA-fragmentligeringsreaksjonen gjennomføres i et reaksjonsmedium inneholdende 2-200 mM (foretrukket 10-40 mM) Tris-HCl (pH 6,1-9,5, foretrukket 7,8-8., 0) , 20-20 mM (foretrukket 5-10 mM) MgCl2, 0,1-10 mM (foretrukket 0,5-2,0 mM) ATP og 1-50 mM (foretrukket 5-10 mM) ditiotreitol ved 1-37°C (foretrukket 3-2 0°C) i 15 min. til 72 timer (foretrukket 2-20 timer) under anvendelse av 0,3-10 enheter T4 DNA ligase. The DNA fragment ligation reaction is carried out in a reaction medium containing 2-200 mM (preferably 10-40 mM) Tris-HCl (pH 6.1-9.5, preferably 7.8-8.0), 20-20 mM (preferably 5 -10 mM) MgCl2, 0.1-10 mM (preferred 0.5-2.0 mM) ATP and 1-50 mM (preferred 5-10 mM) dithiothreitol at 1-37°C (preferred 3-2 0° C) for 15 min. to 72 hours (preferably 2-20 hours) using 0.3-10 units of T4 DNA ligase.

Det rekombinante plasmid DNA oppnådd ved ligeringsreaksjonen kan innføres i E. coli i samsvar med transformasjonsmetoden til Cohen et al. (S.M. Cohen et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)), om ønsket. The recombinant plasmid DNA obtained by the ligation reaction can be introduced into E. coli according to the transformation method of Cohen et al. (S.M. Cohen et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)), if desired.

De rekombinante M13 fag RF DNA'er dannet ved ligerings-reaksjonen innføres i E. coli JM105 (J. Messing et al., Gene, .33, 103 (1985)), under anvendelse av den kjente metode for transfeksjon (Yoshiyuki Kuchino et al., Tanpakush.itsu, The recombinant M13 phage RF DNAs formed by the ligation reaction are introduced into E. coli JM105 (J. Messing et al., Gene, .33, 103 (1985)), using the known method of transfection (Yoshiyuki Kuchino et al., Tanpakush.itsu,

Kakusan, Koso (Protein Nucleic Acid and Enzyme), 29, 294 Kakusan, Koso (Protein Nucleic Acid and Enzyme), 29, 294

(1984)), etter behov. (1984)), as appropriate.

De rekombinante plasmid DNA'er og rekombinante Ml3 fag RF DNA'er kan isoleres fra de respektive E. coli transformanter ved metoden til f,eks. Birnboim et al. (H.C. Birnholm et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1973)). The recombinant plasmid DNAs and recombinant M13 phage RF DNAs can be isolated from the respective E. coli transformants by the method of, e.g. Birnboim et al. (H.C. Birnholm et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1973)).

Isoleringen av det enkelttrådede DNA fra den rekombinante M13 fag gjennomføres ved hjelp av den kjente metode (Yoshiyuki Kuchino et al., Tanpakushitsu, Kalcusan, Koso, 29, 294 The isolation of the single-stranded DNA from the recombinant M13 phage is carried out using the known method (Yoshiyuki Kuchino et al., Tanpakushitsu, Kalcusan, Koso, 29, 294

(1984)) . (1984)).

Plasmid DNA'er undersøkes med hensyn til kuttingsseter ved hjelp av agarosegelelektroforese eller polyakrylamidgelelektroforese etter kutting med 1-10 restriksjonsenzymer. Videre gjennomføres DNA basesekvensbestemmelse, om nødvendig, ved dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag (J. Messing et al., Gene, 19, 269 (1982)). Plasmid DNAs are examined for cut sites by agarose gel electrophoresis or polyacrylamide gel electrophoresis after cutting with 1-10 restriction enzymes. Furthermore, DNA base sequence determination is carried out, if necessary, by the dideoxy sequencing method using M13 phage (J. Messing et al., Gene, 19, 269 (1982)).

De ønskede rekombinante plasmid-DNA'er-kan fremstilles under betingelser som nevnt i det foregående. The desired recombinant plasmid DNAs can be prepared under conditions as mentioned above.

hG-CSF polypeptid-derivatene kan fremstilles på følgende måte. The hG-CSF polypeptide derivatives can be prepared in the following manner.

Således transformeres E. coli K-12 HB101 med et passende plasmid (f.eks. pCfBD28), og en plasmid (f.eks. pCfBD28)-bærende transformant av E. coli selekteres blant ampicillin-resistente (i det følgende Ap<r>) kolonier. Dyrking av den plasmid (f.eks. pCfBD28)-bærende stamme av E. coli i et medium kan føre til dannelse av et hG-CSF polypeptidderivat i Thus, E. coli K-12 HB101 is transformed with an appropriate plasmid (e.g. pCfBD28), and a plasmid (e.g. pCfBD28)-carrying transformant of E. coli is selected among ampicillin-resistant (hereafter Ap<r >) colonies. Cultivation of the plasmid (e.g. pCfBD28)-carrying strain of E. coli in a medium can lead to the formation of an hG-CSF polypeptide derivative in

. kulturen. . the culture.

Et hvilket som helst medium, enten syntetisk eller naturlig, kan anvendes med den betingelse at det er egnet for dyrking av E. coli og for fremstilling av hG-CSF polypeptid-derivatet. Any medium, whether synthetic or natural, can be used provided that it is suitable for the cultivation of E. coli and for the production of the hG-CSF polypeptide derivative.

Brukbare karbonkilder inkluderer glukose, fruktose, laktose, glyserol, månnitol og sorbitol blant andre, og brukbare nitrogenkilder er NH4C1, (NH4)2S04, kasaminosyrer, gjærekstrakt, polypepton, kjøttekstrakt, baktotrypton, maisstøpvæske, etc, I^HPC^, KH2P04, NaCl, MgS04, vitamin Blf MgCl2 og så videre kan anvendes som andre næringskilder. Dyrkingen gjennomføres med lufting og omrøring ved pH 5,5-8,5 og en temperatur 18-40°C. Dyrking i 5-90 timer fører til. akkumulering av et hG-CSF polypeptid-derivat i de dyrkede celler. Cellene høstes så fra kulturen og knuses ved hjelp av ultralydbehandling. Sentrifugering gir cellerester. hG-CSF Usable carbon sources include glucose, fructose, lactose, glycerol, monnitol, and sorbitol among others, and usable nitrogen sources are NH4C1, (NH4)2S04, casamino acids, yeast extract, polypeptone, meat extract, bactotryptone, corn liquor, etc, I^HPC^, KH2P04, NaCl , MgSO4, vitamin Blf MgCl2 and so on can be used as other sources of nutrition. Cultivation is carried out with aeration and stirring at pH 5.5-8.5 and a temperature of 18-40°C. Cultivation for 5-90 hours leads to accumulation of an hG-CSF polypeptide derivative in the cultured cells. The cells are then harvested from the culture and crushed using ultrasound treatment. Centrifugation yields cell debris. hG-CSF

■polypeptid-derivatet ekstraheres fra cellerestene, renses, oppløseliggjøres og regenereres ved metoden til Marston et al. {F.A.O. Marston et al.: BIO/TECHNOLOGY, 2, 800 (1984)). Mus-benmargceller behandles med derivatet og hG-CSF polypeptid-derivatet analyseres ved metoden under anvendelse av antallet dannede kolonier på mykagar som en indeks. ■ the polypeptide derivative is extracted from the cell debris, purified, solubilized and regenerated by the method of Marston et al. {F.A.O. Marston et al.: BIO/TECHNOLOGY, 2, 800 (1984)). Mouse bone marrow cells are treated with the derivative and the hG-CSF polypeptide derivative is analyzed by the method using the number of colonies formed on mycagar as an index.

Ved utøvelsen av oppfinnelsen bestemmes hG-CSF aktiviteten på følgende måte. Benmargceller samles aseptisk fra lårbenet til C3H/He hannmus med 8-12 ukers alder (Shizuoka Laboratory Animal Center) og suspenderes i et a-minimum essensielt medium (Flow Laboratories, i det følgende benevnt ec-MEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Nylonull (0,3 g, Wako Pure Chemical Indutries' Nylon Fiber 146-04231) fylt i en kolonne impregneres med 1,5 ml av den ovennevnte cellesuspensjon (omtrent 5 x IO<7> celler) og reaksjonen får fortsette i en 5% C02 inkubator ved 37°C i 90 min.Deretter føres a-MEM oppvarmet til 37°C på forhånd gjennom kolonnen, og benmargcellene som er uadsorberte på nylonullen samles som en effluentfraksjon. Cellene vaskes en gang med a-MEM og cellekonsentrasjonen innstilles til en forutbestemt verdi. Deretter bestemmes evnen til å danne myelopoetiske stamcelle-kolonier ved hjelp av metoden til Okabe et al. (T. Okabe et al.: Cancer.Research, 44, 4503-4506 (1986)). Således blandes 0,2 ml av benmargcellesuspensjonen (2 x IO<6> celler/ml) fremstilt på den ovennevnte måte med en blanding av 0,2 ml oc-MEM, 0,4 ml FBS og 0,2 ml av hver 2-ganger fortynnet prøve. Et like stort volum {1,0 ml) av 0,6% agaroppløsning {Difco, Agar-renset 0506-01) holdt ved 42°C blandes med den ovennevnte blanding og den resulterende blanding fordeles i 0,5 ml porsjoner på en 24 brønns mikrotiterplate (Nunc<1 >Multidish nr. 143982) (5 x 10<4> celler/brønn, n=3). Etter 7 døgns inkubasjon ved 37°C i en 5% C02-inkubator, telles kolonier som omfatter minst 40 celler under et mikroskop (Olympus X40). Etter telling overføres hver koloni' på en glassplate med forsiktighet, fikseres der med en blandet acetonformalin-oppløsning i 30 min. og underkastes esterase dobbelt-farging ved metoden til Kubota et al. (K. Kubota et al.: Exp. Mematology, 8, 339-344 (1980)) for identifisering av kolonien. In the practice of the invention, the hG-CSF activity is determined in the following way. Bone marrow cells are collected aseptically from the femur of C3H/He male mice aged 8-12 weeks (Shizuoka Laboratory Animal Center) and suspended in a-minimum essential medium (Flow Laboratories, hereafter referred to as ec-MEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Nylon wool (0.3 g, Wako Pure Chemical Industries' Nylon Fiber 146-04231) filled in a column is impregnated with 1.5 ml of the above cell suspension (about 5 x 10<7> cells) and the reaction is allowed to proceed in a 5% C02 incubator at 37°C for 90 min. Then α-MEM preheated to 37°C is passed through the column, and the bone marrow cells that are not adsorbed on the nylon wool are collected as an effluent fraction. The cells are washed once with α-MEM and the cell concentration is adjusted to a predetermined value. The ability to form myelopoietic stem cell colonies is then determined using the method of Okabe et al. (T. Okabe et al.: Cancer. Research, 44, 4503-4506 (1986)). Thus, 0.2 ml of the bone marrow cell suspension (2 x 10<6> cells/ml) prepared in the above manner is mixed with a mixture of 0.2 ml of oc-MEM, 0.4 ml of FBS and 0.2 ml of each 2- times diluted sample. An equal volume {1.0 ml) of 0.6% agar solution {Difco, Agar-renset 0506-01) maintained at 42°C is mixed with the above mixture and the resulting mixture distributed in 0.5 ml portions on a 24 well microtiter plate (Nunc<1>Multidish no. 143982) (5 x 10<4> cells/well, n=3). After 7 days' incubation at 37°C in a 5% CO 2 incubator, colonies comprising at least 40 cells are counted under a microscope (Olympus X40). After counting, each colony is carefully transferred onto a glass plate, fixed there with a mixed acetone-formalin solution for 30 min. and subjected to esterase double-staining by the method of Kubota et al. (K. Kubota et al.: Exp. Mematology, 8, 339-344 (1980)) for identification of the colony.

Potensen av hver prøve beregnes basert på resultatet av The potency of each sample is calculated based on the result of

■telling ved kolonidannelsestesten for den 2-ganger fortynningen som følger. Den aktivitet som gir halvdelen av den maksimale kolonidannelsesverdi oppnådd med intakt G-CSF anvendt som en standard er definert som 50 enheter. Potensen (i enheter) beregnes i samsvar med denne definisjon og faktoren 2 0 anvendes for multiplikasjon for omdannelse til aktivitet pr. ml også av hensyn til fortynningsfaktoren for prøven. Den spesifikke aktivitet uttrykkes som potens ■counting in the colony formation test for the 2-fold dilution that follows. The activity giving half the maximum colony formation value obtained with intact G-CSF used as a standard is defined as 50 units. The potency (in units) is calculated in accordance with this definition and the factor 2 0 is used for multiplication for conversion to activity per ml also due to the dilution factor for the sample. The specific activity is expressed as potency

(enheter/mg) pr. vektenhet (mg) protein. (units/mg) per unit weight (mg) of protein.

hG-CSF polypeptid-derivatene som mangler en eller flere aminosyrer på den N-terminale side av hG-CSF polypeptidet kan også fremstilles ved enzymatisk nedbrytning. The hG-CSF polypeptide derivatives that lack one or more amino acids on the N-terminal side of the hG-CSF polypeptide can also be produced by enzymatic degradation.

Derivatene kan selvfølgelig fremstilles ved enzymatisk nedbrytning av naturlig hG-CSF som utgangsmaterial. Ettersom naturlig hG-CSF har lav reaktivitet med enzymet (protease) er imidlertid bruken av et modifisert hG-CSF med økt reaktivitet overfor protease foretrukket for fremstilling av slike derivater med høy aktivitet i gode utbytter. The derivatives can of course be produced by enzymatic degradation of natural hG-CSF as starting material. As natural hG-CSF has low reactivity with the enzyme (protease), however, the use of a modified hG-CSF with increased reactivity towards protease is preferred for the production of such derivatives with high activity in good yields.

Foretrukket anvendt som slike utgangsmaterialer er de modifiserte hG-CSF (a), (b), (c) og (d) vist i tabell 2 som skriver seg fra substitusjon av en eller flere aminosyrer på den N-terminale side av hG-CSF polypeptidet. Modifikasjoner (a) , (b), (c) og (d) kan oppnås ved dyrking av bakterie-stammer som rommer plasmidene med de tilsvarende base-sekvenser, nemlig henholdsvis pCfBC59 (NC59), pCfBD28 (MD2 8), pCfBC95 (NC95) og pCfTAArg4S (Arg 4S), etterfulgt av isolering og rensing ved hjelp av kjente metoder. Preferably used as such starting materials are the modified hG-CSF (a), (b), (c) and (d) shown in Table 2 which result from the substitution of one or more amino acids on the N-terminal side of hG-CSF the polypeptide. Modifications (a), (b), (c) and (d) can be obtained by culturing bacterial strains harboring the plasmids with the corresponding base sequences, namely pCfBC59 (NC59), pCfBD28 (MD2 8), pCfBC95 (NC95) ) and pCfTAArg4S (Arg 4S), followed by isolation and purification using known methods.

Passende anvendt som enzymet er endoproteaser som f.eks. serinprotease og tiolprotease. Mer spesifikt kan f.eks. nevnes subtilisin A, subtilisin BPN', subtilisin Carlsberg, subtilisin nove, proteinase K, nagase, termolysin, endoproteinase Arg-C, trypsin og a-chymotrypsin. Enzymet anvendes i en mengde på 3.4 x IO"<6> til 8.5 x IO"<3> enheter pr. mg utgangsmaterial. Suitably used as the enzyme are endoproteases such as e.g. serine protease and thiol protease. More specifically, e.g. mention is made of subtilisin A, subtilisin BPN', subtilisin Carlsberg, subtilisin nove, proteinase K, nagase, thermolysin, endoproteinase Arg-C, trypsin and α-chymotrypsin. The enzyme is used in an amount of 3.4 x 10"<6> to 8.5 x 10"<3> units per mg starting material.

Etter oppløsning av utgangsmaterialet i en vandig oppløsning som f.eks. Tris-saltsyrebuffer eller fosfatbuffer og tilsetning av et enzym, gjennomføres den enzymatiske reaksjon ved 10-37°C i 30 min. til 3 døgn. After dissolving the starting material in an aqueous solution such as Tris-hydrochloric acid buffer or phosphate buffer and addition of an enzyme, the enzymatic reaction is carried out at 10-37°C for 30 min. to 3 days.

Den totale proteinmengde og proteinmengden bestemmes ved hjelp av følgende metoder: Den totale proteinbestemmelse gjennomføres ved metoden til ■ M.M. Bradford (M.M. Bradford:■Anal. Biochem., 72, 248 The total protein amount and the protein amount are determined using the following methods: The total protein determination is carried out by the method of ■ M.M. Bradford (M.M. Bradford:■Anal. Biochem., 72, 248

(1976)). (1976)).

Proteinmengden bestemmes ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese ved metoden til Laemmli (U.K. Laemmli: Nature, 227, 680 (1970)) etterfulgt av måling på en kromatoscanner (Shimadzu CS-93 0). The amount of protein is determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis by the method of Laemmli (U.K. Laemmli: Nature, 227, 680 (1970)) followed by measurement on a chromatoscanner (Shimadzu CS-930).

Aminosyresekvensen i den N-terminale ende av peptidet oppnådd etter enzymatisk spaltning bestemmes under anvendelse av en automatisk aminosyresekvensator "Gas-Phase Protein Sequencer Model 470A" (Applied Biosystems) i kombinasjon med en Spectra Physics høytrykksvæskekromatograf. The amino acid sequence at the N-terminal end of the peptide obtained after enzymatic cleavage is determined using an automatic amino acid sequencer "Gas-Phase Protein Sequencer Model 470A" (Applied Biosystems) in combination with a Spectra Physics high-pressure liquid chromatograph.

I det etterfølgende er det angitt en rekke eksempler, testeksempler og undereksempler. In what follows, a number of examples, test examples and sub-examples are specified.

Eksempel 1 Example 1

Konstruksjon av hG- CSF ekspresjonsplasmidet pCfTAl Construction of the hG-CSF expression plasmid pCfTAl

(jfr, fig. 1) (cf. fig. 1)

En 2 ( ig porsjon av pCSFl-2 DNA oppnådd i undereksempel 1 ble oppløst i en total mengde på 20 fil av en oppløsning (i det følgende omtalt som "Y-100 buffer") inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanol og 100 mM NaCl, 10 enheter av hver av restriksjonsenzymene Apal (Boehringer Mannheim) og BamHI (Takara Shuzo, i det følgende med mindre annet er angitt ble alle de anvendte restriksjonsenzymer erholdt fra Takara Shuzo) tilsatt og reaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 4 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det renset og utvunnet 0,4 fig av et 1,5 kb DNA-fragment ved hjelp av LGT-metoden. A 2 µg portion of pCSF1-2 DNA obtained in Subexample 1 was dissolved in a total amount of 20 µl of a solution (hereinafter referred to as "Y-100 buffer") containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5 ), 7 mM MgCl2, 6 mM 2-mercaptoethanol and 100 mM NaCl, 10 units each of the restriction enzymes ApaI (Boehringer Mannheim) and BamHI (Takara Shuzo, in the following unless otherwise stated, all the restriction enzymes used were obtained from Takara Shuzo ) was added and the reaction was carried out for 4 hours at 37° C. From the reaction mixture, 0.4 µg of a 1.5 kb DNA fragment was purified and recovered using the LGT method.

Separat ble 2 fig av plasmidet pLSAl fremstilt ved metoden i undereksempel 3 oppløst i 20 fil Y-100 buffer, 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll (Toyobo) og BamHI ble tilsatt, og reaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 4 timer. Fra denne reaksjonsblanding ble det renset og utvunnet 0,8 fig av et 2,8 kb DNA-fragment ved LGT-metoden. Separately, 2 µg of the plasmid pLSAl prepared by the method in sub-example 3 was dissolved in 20 µl of Y-100 buffer, 10 units of each of the restriction enzymes BanIII (Toyobo) and BamHI were added, and the reaction was carried out at 37°C for 4 hours. From this reaction mixture, 0.8 µg of a 2.8 kb DNA fragment was purified and recovered by the LGT method.

På den annen side ble følgende DNA linker syntetisert for å tilveiebringe de kondoner som som koder for første til femte N-terminale aminosyrer i det ferdige hG-CSF polypeptid (threonin<1> (ACA eller ACT),prolin2 (CCA eller CCT), leucin<3 >(CTA), glycin<4> (GGC) og prolin5(CCC) ) og initieringskodonet (ATG) nødvendig for ekspresjon og for innstilling av avstanden mellom SD-sekvensen og ATG-nedstrøms fra tryptofan-promoteren (Ptrp) til en passende lengde mellom 6-18 bp: On the other hand, the following DNA linkers were synthesized to provide the condons that code for the first to fifth N-terminal amino acids of the finished hG-CSF polypeptide (threonine<1> (ACA or ACT), proline2 (CCA or CCT), leucine<3 >(CTA), glycine<4> (GGC) and proline5(CCC) ) and the initiation codon (ATG) required for expression and for setting the distance between the SD sequence and the ATG downstream from the tryptophan promoter (Ptrp) to a suitable length between 6-18 bp:

Først ble de 26-mer og 20-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av fosfotriestermetoden (R. Crea et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 75, 5765 (1978)). 26-mer og,.!-2 0-mer (hver 2 fig) ble oppløst i 40 fil av en buffer (i det følgende benevnt som "T4 kinasebuffer") inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP, 3 0 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo, også i det følgende) ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. First, the 26-mer and 20-mer single-stranded DNAs were synthesized by the phosphotriester method (R. Crea et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 75, 5765 (1978)). 26-mer and,.!-2 0-mer (each 2 fig) were dissolved in 40 µl of a buffer (hereinafter referred to as "T4 kinase buffer") containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 5 mM dithiothreitol, 0.1 mM EDTA and 1 mM ATP, 30 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo, also hereinafter) were added, and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min.

I 25 fil av en buffer (i det følgende benevnt "T4 ligasebuffer") inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, In 25 µl of a buffer (hereinafter referred to as "T4 ligase buffer") containing 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2,

10 mM ditiotreitol og l mM ATP, ble det oppløst 0,4 fig av det pCSFl-2-avledede Apal-BamHI fragment (1,5 kb) oppnådd på den ovennevnte måte og 0,2 fig av det pLSAl-avledede Banlll-BamHI fragment (2,8kb) oppnådd på den ovennevnte måte. 0,1 fig av 10 mM dithiothreitol and 1 mM ATP, 0.4 µg of the pCSF1-2-derived ApaI-BamHI fragment (1.5 kb) obtained in the above manner and 0.2 µg of the pLSAl-derived BanIII-BamHI were dissolved fragment (2.8kb) obtained in the above manner. 0.1 fig of

den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt til blandingen. Til the above DNA linker was added to the mixture. To

denne blandede oppløsning ble det ytterligere tilsatt 6 enheter T4 DNA ligase (oppnådd fra Takara Shuzo, også i det følgende) og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. to this mixed solution, 6 units of T4 DNA ligase (obtained from Takara Shuzo, also hereinafter) were further added and the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den således oppnådde rekombinante plasmidblanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101 (Bolivar et al., Gene, 2, 75 (1977)) ved metoden til Cohen et al. (S.N. Cohen eta al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)) (i det følgende ble denne metode anvendt ved transformering av E. coli) og en Ap<r> koloni ble oppnådd. Plasmid-DNA ble utvunnet fra de dyrkede celler i denne koloni ved den kjente metode (H.C. Birnboim et al.:Nucleic Acids Res,., 7, 1513 (1979)) (i det følgende ble denne metode anvendt for plasmid DNA sepa-rering) . Strukturen av det oppnådde plasmid ble bekreftet ved kutting med Banlll, Rsal, Pstl, Hindlll og Bglll etter-fulgt av agarosegelelektroforese. Dette plasmid kalles pCfTAl. Basesekvensen av pCfTAl i nærheten av Banlll og Hindlll setene ble bekreftet til å være som følger ved hjelp av dioksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag: The recombinant plasmid mixture thus obtained was used for transformation of E. coli HB101 (Bolivar et al., Gene, 2, 75 (1977)) by the method of Cohen et al. (S.N. Cohen et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)) (hereinafter this method was used in the transformation of E. coli) and an Ap<r> colony was obtained. Plasmid DNA was extracted from the cultured cells in this colony by the known method (H.C. Birnboim et al.: Nucleic Acids Res,., 7, 1513 (1979)) (in the following this method was used for plasmid DNA separation ). The structure of the plasmid obtained was confirmed by digestion with BanIII, RsaI, PstI, HindIII and BglII followed by agarose gel electrophoresis. This plasmid is called pCfTAl. The base sequence of pCfTAl in the vicinity of the BanIII and HindIII sites was confirmed to be as follows by the dioxy sequencing method using M13 phage:

Eksempel '2 Example '2

Konstruksjon av plasmidet pCfTB2 0 med mangel i delen med det 3'-ikke-translasjonale område av hG- CSF cDNA Construction of the plasmid pCfTB2 0 deficient in the 3'-non-translational region portion of the hG-CSF cDNA

I 2 0 fil Y-100 buffer ble det oppløst 2 \ iq av hG-CSF In 20 µl Y-100 buffer, 2 µl of hG-CSF was dissolved

ekspresjonsplasmidet pCfTAl (4,3 kb) oppnådd i eksempel 1, 4 enheter av restriksjonsenzymet BamHI ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 4 timer. Etter ekstrak-sjon med en blanding av et like stort volum av fenol og kloroform (i det følgende benevnt fenol-kloroformekstraksjon) ble 1,8 fig av et DNA-fragment utvunnet ved utfelling med etanol. Dette DNA-fragment ble oppløst i 20 fil av en buffer (i det følgende benevnt "Klenow buffer") inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 7 mM MgCl2 og 6 mM merkaptoetanol, the expression plasmid pCfTAl (4.3 kb) obtained in Example 1, 4 units of the restriction enzyme BamHI were added and the cutting reaction was carried out at 37°C for 4 hours. After extraction with a mixture of an equal volume of phenol and chloroform (hereinafter referred to as phenol-chloroform extraction), 1.8 µg of a DNA fragment was recovered by precipitation with ethanol. This DNA fragment was dissolved in 20 μl of a buffer (hereinafter referred to as "Klenow buffer") containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 7 mM MgCl2 and 6 mM mercaptoethanol,

deretter ble dATP, dTTP, dCTP og dGTP hver tilsatt til en konsentrasjon av 1 mM og etter ytterligere tilsetning av 4 enheter av DNA polymerase I Klenow fragment (oppnådd fra Takara Shuzo, også i det følgende) ble reaksjonen gjennomført ved romtemperatur i 1 time for å omdanne de utstående ender til buttender. Etter fenol-kloroformekstraksjon ble 1,6 fig av et DNA-fragment utvunnet ved etanolutfelling. Dette DNA-fragment ble oppløst i 20 fil Y-100 buffer, 10 enheter EcoRI ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 4 timer. Fra reaksjonsblåndingen ble det oppnådd 1 fig av et 2,5 kb DNA-fragment (BamHI(butt-ende) EcoRI-fragment) ved hjelp av LGT-metoden. then dATP, dTTP, dCTP and dGTP were each added to a concentration of 1 mM and after further addition of 4 units of DNA polymerase I Klenow fragment (obtained from Takara Shuzo, also in the following) the reaction was carried out at room temperature for 1 hour for to convert the protruding ends into butt ends. After phenol-chloroform extraction, 1.6 µg of a DNA fragment was recovered by ethanol precipitation. This DNA fragment was dissolved in 20 μl of Y-100 buffer, 10 units of EcoRI were added and the cutting reaction was carried out at 37°C for 4 hours. From the reaction mixture, 1 µg of a 2.5 kb DNA fragment (BamHI (butt-end) EcoRI fragment) was obtained by the LGT method.

Separat ble 2 fig pCfTAl oppløst i 20 fil Y-100 buffer, 10 enheter EcoRI ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 4 timer. Deretter ble NaCl tilsatt til en NaCl-konsentrasjon på 150 mM, deretter ble 10 enheter Dral tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 4 timer. Etter bekreftelse av fullstendig kutting ved hjelp av agarosegelelektroforese ble 0,2 fig av et hG-CSF cDNA-holdig 1,0 kb DNA-fragment (EcoRI-Dral fragment) renset og utvunnet ved hjelp av LGT-metoden. Separately, 2 µl of pCfTAL was dissolved in 20 µl of Y-100 buffer, 10 units of EcoRI were added and the cutting reaction was carried out at 37°C for 4 hours. Then NaCl was added to a NaCl concentration of 150 mM, then 10 units of Dral were added and the cutting reaction was carried out at 37°C for 4 hours. After confirmation of complete cleavage by agarose gel electrophoresis, 0.2 µg of a hG-CSF cDNA-containing 1.0 kb DNA fragment (EcoRI-Dral fragment) was purified and recovered by the LGT method.

I 25 fil T4 ligasebuffer ble det oppløst 0,2 fig BamHI (buttende)-EcoRI fragment (2,5 kb) og 0,2 fig av EcoRI-Dral fragment (1,0 kb) hvert oppnådd på den ovenstående måte, 6 enheter T4 DNA ligase ble tilsatt til den resulterende blanding og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. In 25 μl of T4 ligase buffer, 0.2 μg of BamHI (butt)-EcoRI fragment (2.5 kb) and 0.2 μg of EcoRI-Dral fragment (1.0 kb) each obtained in the above manner were dissolved, 6 units T4 DNA ligase was added to the resulting mixture and the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den således oppnådde rekombinante plasmidblanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og en Ap<r> koloni ble oppnådd. Fra dyrkede celler avledet fra denne koloni ble et plasmid-DNA utvunnet. Strukturen av det oppnådde plasmid ble bekreftet ved hjelp av agarosegelelektroforese etter kutting med Hindlll og Pstl. Dette plasmid benevnes pCfTB20. The recombinant plasmid mixture thus obtained was used for transformation of E. coli HB101 and an Ap<r> colony was obtained. From cultured cells derived from this colony, a plasmid DNA was recovered. The structure of the plasmid obtained was confirmed by agarose gel electrophoresis after cutting with HindIII and PstI. This plasmid is called pCfTB20.

Eksempel 3 Example 3

Konstruksjon av plasmidene som koder for polypeptider som resulterer fra substitusjon av den N- terminale aminosyre i hG-CSF. nemlig pCfTL23. PCfTL38-. pCfTL3 5 oa pCfTL41 H f r . Construction of the plasmids encoding polypeptides resulting from substitution of the N-terminal amino acid in hG-CSF. namely pCfTL23. PCfTL38-. pCfTL3 5 oa pCfTL41 H f r .

£iq- 3) £iq- 3)

I 60 fil Y-100 buffer ble det oppløst 3 fig pCSFl-2 (4,5 kb) oppnådd ved metoden i undereksempel 1, 8 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Apal (Boehringer Mannheim) og BamHI ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra denne reaksjonsblanding ble det oppnådd omtrent 0,4 fig av et DNA-fragment på omtrent 1,5 kb (Apal-Baml fragment) inneholdende det meste av hG-CSF-genet. In 60 μl of Y-100 buffer, 3 μg of pCSFl-2 (4.5 kb) obtained by the method in sub-example 1 were dissolved, 8 units of each of the restriction enzymes ApaI (Boehringer Mannheim) and BamHI were added and the cutting reaction was carried out at 37° C for 3 hours. From this reaction mixture, about 0.4 µg of a DNA fragment of about 1.5 kb (ApaI-Baml fragment) containing most of the hG-CSF gene was obtained.

Separat ble 2 fig pGELl (Sekine et al.: Proe. Nati. Acad. Sei USA, 82, 4306 (1985)) (oppnådd fra en kultur av E. coli IGEL1 FERM BP-629 ved hjelp av den konvensjonelle metode) (3,4 kb) oppløst i 40 fil Y-100 buffer, 4 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Hindlll, BamHI og Pstl ble tilsatt og kutt ingsreaks jonen ble gjennomført ved 3 7°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det oppnådd omtrent 0,5 jig av et DNA-fragment på omtrent 1,7 kb (Psti-BamHI-fragment) inneholdende den lipoproteinavledete terminator ved hjelp av LGT-metoden. Separately, 2 fig pGEL1 (Sekine et al.: Proe. Nati. Acad. Sei USA, 82, 4306 (1985)) (obtained from a culture of E. coli IGEL1 FERM BP-629 by the conventional method) (3 .4 kb) dissolved in 40 μl Y-100 buffer, 4 units of each of the restriction enzymes HindIII, BamHI and PstI were added and the cutting reaction was carried out at 37°C for 3 hours. From the reaction mixture, about 0.5 µg of a DNA fragment of about 1.7 kb (Psti-BamHI fragment) containing the lipoprotein-derived terminator was obtained by the LGT method.

Separat ble 3 fig pKYPlO fremstilt ved hjelp av metoden beskrevet i japansk patentsøknad (OPI) nr. 110600/83 oppløst i 60 fil Y-10 0 buffer, 6 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll (Toyobo) og Pstl ble tilsatt, og kutt ingsreaks jonen ble gjennomført ved 3 7°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det oppnådd omtrent 0,5 fig av et DNA-fragment på omtrent 1,1 kb (Banlll-Pstl-fragment) inneholdende tryptofan-promoteren (Ptrp) ved hjelp av LGT-metoden. Separately, 3 µg of pKYP10 prepared using the method described in Japanese Patent Application (OPI) No. 110600/83 were dissolved in 60 µl of Y-10 0 buffer, 6 units of each of the restriction enzymes BanIII (Toyobo) and PstI were added, and the cutting reaction the ion was carried out at 37°C for 3 hours. From the reaction mixture, about 0.5 µg of a DNA fragment of about 1.1 kb (BanIII-Pstl fragment) containing the tryptophan promoter (Ptrp) was obtained by the LGT method.

På den annen side ble, av hensyn til nødvendigheten av substituering av den N-terminale aminosyre i det modne hG-CSF, nemlig Thr, med Ser, Cys, Arg eller Gly og tilveiebrin-gelse av initieringskodonet (ATG) nødvendig for ekspresjon og også av hensyn til å innstille avstanden mellom SD-sekvensen og ATG nedstrøms fra Ptrp til en passende lengde på 6-18 bp, og også av andre grunner, følgende DNA-linker syntetisert: On the other hand, due to the necessity of substitution of the N-terminal amino acid of the mature hG-CSF, namely Thr, with Ser, Cys, Arg or Gly and providing the initiation codon (ATG) became necessary for expression and also for the sake of setting the distance between the SD sequence and the ATG downstream of Ptrp to a suitable length of 6-18 bp, and also for other reasons, the following DNA linker synthesized:

I den ovenstående formel er N en av basene G, A, T og C. In the above formula, N is one of the bases G, A, T and C.

Først ble 26-mer og 20-mer enkelttrådede DNA<1>er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 26-mér og 20-mer (hver 20 pikomol) ble.oppløst i 40 [ il T4 kinasebuf f er, 6 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. First, 26-mer and 20-mer single-stranded DNA<1>s were synthesized using the usual phosphotriester method. 26-mer and 20-mer (each 20 picomoles) were dissolved in 40 [mu]l of T4 kinase buffer, 6 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) were added and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min.

Deretter ble 0,3 ( ig av pCSFl-2-avledet Apal-BamHI-fragment (omtrent 1,5 kb), 0,2 fig av pGELl-avledet Pstl-BamHI-fragment (omtrent 1,7 kb), og 0,2 fig av ekspresjonsvektor pKYlO-avledet BanIII-PstI-fragment (omtrent 1,1 kb), hvert oppnådd på den ovenstående måte, oppløst i totalt 30 ( il T4 ligasebuffer og omtrent 1 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter av T4 DNA-ligase til oppløsningen ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.3 µg of pCSF1-2-derived ApaI-BamHI fragment (approximately 1.5 kb), 0.2 µg of pGEL1-derived Pstl-BamHI fragment (approximately 1.7 kb), and 0. 2 µg of expression vector pKY10-derived BanIII-PstI fragment (about 1.1 kb), each obtained in the above manner, dissolved in a total of 30 µl of T4 ligase buffer and about 1 picomole of the above DNA linker were added to the mixture solution. After further addition of 6 units of T4 DNA ligase to the solution, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den rekombinante plasmidholdige reaksjonsblanding ble anvendt for transformering av E. coli C600SF8 (FERM BP-1070) (Cameron et al., Proe. nati. Acad. Sei USA 72, 3416 (1975)) og Ap<r >kolonier ble oppnådd. Fra disse transformanter ble plasmid-DNA separert og renset ved hjelp av kjente metoder. Strukturen av hvert av plasmid-DNA'er ble bekreftet ved kutting med Pstl, EcoRI og Banlll, etterfulgt av polyakrylamidgelelektroforese. Plasmidene oppnådd på denne måte benevnes pCfTL23, pCfTL38, pCfTL3 5 og pCfTL41, som vist i fig. 3. Sekvensene i nærheten av den N-terminale ende av hG-CSP derivatgenene i de nevnte plasmider ble bekreftet ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag til å være som følger: The recombinant plasmid-containing reaction mixture was used to transform E. coli C600SF8 (FERM BP-1070) (Cameron et al., Proe. nati. Acad. Sei USA 72, 3416 (1975)) and Ap<r> colonies were obtained. From these transformants, plasmid DNA was separated and purified using known methods. The structure of each of the plasmid DNAs was confirmed by cutting with PstI, EcoRI and BanIII, followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The plasmids obtained in this way are named pCfTL23, pCfTL38, pCfTL3 and pCfTL41, as shown in fig. 3. The sequences near the N-terminal end of the hG-CSP derivative genes in the said plasmids were confirmed by the dideoxy sequencing method using M13 phage to be as follows:

Substitusjonen av den N-terminale Thr i moden hG-CSF ble bekreftet i det pCfTL23-kodede hG-CSF-derivat, som benevnes hG-CSF(Gly<1>). Tilsvarende ble N-terminal aminosyresubstitu-sjon med Ser bekreftet i det pCfTL38-kodede hG-CSF-derivat, som benevnes hG-CSF (Ser1) , substitusjon med Cys i det pCfTL35-kodede hG-CSF-derivat, som benevnes hG-CSF(Cys<1>), og substitusjon med Arg i det pCfTL4i-kodede hG-CSF-derivat, som benevnes hG-CSF(Arg<1>) . The substitution of the N-terminal Thr in mature hG-CSF was confirmed in the pCfTL23-encoded hG-CSF derivative, which is named hG-CSF(Gly<1>). Similarly, N-terminal amino acid substitution with Ser was confirmed in the pCfTL38-encoded hG-CSF derivative, which is named hG-CSF (Ser1), substitution with Cys in the pCfTL35-encoded hG-CSF derivative, which is named hG-CSF (Cys<1>), and substitution with Arg in the pCfTL4i-encoded hG-CSF derivative, which is named hG-CSF(Arg<1>).

Eksempel 4 Example 4

Konstruksjon av plasmider. pCfTMl4, pCfTMl7 og pCfTM113. som koder for polypeptidene som resulterer fra substitusjon av den N- terminale oa tredi e aminos yre i hG- CSF Hf r. fig. 4) . Construction of plasmids. pCfTM14, pCfTM17 and pCfTM113. which codes for the polypeptides resulting from substitution of the N-terminal oa tredi e amino acid in hG-CSF Hf r. fig. 4).

I 60 fil Y-100 buffer ble det oppløst 3 .[ tg pCSFl-2 (4,5 kb) oppnådd ved prosedyren i undereksempel 1, 8 enheter av hver av Apal og BamHI ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra denne reaksjonsblanding ble det oppnådd omtrent 0,4 [ ig av et DNA-fragment på omtrent 1,5 kb (ApaI-BamHI-fragment) inneholdende det meste av hG-CSF-genet ved hjelp av LGT-metoden. In 60 µl of Y-100 buffer, 3 µg of pCSF1-2 (4.5 kb) obtained by the procedure in subexample 1 was dissolved, 8 units of each of ApaI and BamHI were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C in 3 hours. From this reaction mixture, about 0.4 µg of a DNA fragment of about 1.5 kb (ApaI-BamHI fragment) containing most of the hG-CSF gene was obtained by the LGT method.

Separat ble 2 fig pGELl (3,4 kb) oppløst i 40 [ il Y-100 buffer, 4 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Hindlll, BamHI og Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra denne reaksjonsblanding ble det oppnådd omtrent 0,5 jig av et DNA-fragment på omtrent 1,7 kb (Pstl-BamHI-fragment) inneholdende lipoproteinterminatoren ved hjelp av LGT-metoden. Separately, 2 µg pGEL1 (3.4 kb) was dissolved in 40 µl Y-100 buffer, 4 units of each of the restriction enzymes HindIII, BamHI and PstI were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 3 hours. From this reaction mixture, about 0.5 µg of a DNA fragment of about 1.7 kb (Pstl-BamHI fragment) containing the lipoprotein terminator was obtained by the LGT method.

Ytterligere og separat, ble 3 jig pKYPlO fremstilt ved prosedyren beskrevet i japansk patentsøknad (OPI) nr. 110600/83 oppløst i 60 ( il Y-100 buffer, 6 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll og Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 3 timer. Fra denne reaksjonsblanding ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 /xg av et Ptrp-holdig DNA-fragment på omtrent 1,1 kb (Banlll-Pstl-fragment) . Additionally and separately, 3 µg of pKYP1O prepared by the procedure described in Japanese Patent Application (OPI) No. 110600/83 was dissolved in 60 µl of Y-100 buffer, 6 units of each of the restriction enzymes BanIII and PstI were added, and the cutting reaction was carried out at 3 7° C. for 3 hours From this reaction mixture approximately 0.5 µg of a Ptrp-containing DNA fragment of approximately 1.1 kb (Banlll-Pstl fragment) was obtained by the LGT method.

På bakgrunn av nødvendigheten av å substituere den N-terminale aminosyre Thr i moden hG-CSF med Ser og den tredje aminosyre Leu i moden hG-CSF med en av Gly, Ser, Cys og Arg, og tilveiebringe initieringskodonet (ATG) nødvendig for ekspresjon og også av hensyn til nødvendigheten av å innstille avstanden mellom SD-sekvensen og ATG nedstrøms fra Ptrp med en passende lengde på 6-18 bp og av andre grunner, ble ±ølgende DNA-linker syntetisert. Given the necessity to substitute the N-terminal amino acid Thr in mature hG-CSF with Ser and the third amino acid Leu in mature hG-CSF with one of Gly, Ser, Cys, and Arg, providing the initiation codon (ATG) necessary for expression and also for the necessity of setting the distance between the SD sequence and the ATG downstream of Ptrp with a suitable length of 6-18 bp and for other reasons, the following DNA linkers were synthesized.

I den ovenstående formel er N en av basene G, A, T og C. In the above formula, N is one of the bases G, A, T and C.

Først ble 26-mer og 20-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved den vanlige fosfotriestermetode. 26-mer og 20-mer (hver 2 0 pikomol) ble oppløst i 40 fil T4 kinase- First, 26-mer and 20-mer single-stranded DNAs were synthesized by the usual phosphotriester method. 26-mer and 20-mer (each 20 picomoles) were dissolved in 40 μl of T4 kinase-

buffer, 6 enheter av T4 polynukleotidkinase ble buffer, 6 units of T4 polynucleotide kinase were

tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 60 min. added and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min.

Deretter ble 0,3 tig av det pCSFl-2-avledede Apal-BamHI-fragment (omtrent 1,5 kb), 0,2 iig av det pGELl-avledede Pstl-BamHI-fragmentet (omtrent 1,7 kb) og 0,2 jig av Banlll-Pstl-fragmentet (omtrent 1,1 kb) av ekspresjonsvektoren pKYPlO, hver oppnådd på den ovennevnte måte, oppløst i.3 0 iil T4 ligasebuffer og omtrent 1 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetninger av 6 enheter T4 DNA-ligase til oppløsningen ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.3 µg of the pCSF1-2-derived ApaI-BamHI fragment (approximately 1.5 kb), 0.2 µg of the pGEL1-derived Pstl-BamHI fragment (approximately 1.7 kb) and 0. 2 µg of the BanIII-Pstl fragment (about 1.1 kb) of the expression vector pKYP10, each obtained in the above manner, dissolved in 30 µl of T4 ligase buffer and about 1 picomole of the above DNA linker were added to the mixture solution. After further additions of 6 units of T4 DNA ligase to the solution, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den rekombinante plasmidholdige reaksjonsblanding ble anvendt for transformering av E. coli C600SP8 (FERM BP-1070) ved hjelp av metoden til Cohen et al. og Ap<r->kolonier ble oppnådd. Plasmid-DNA'er ble separert og renset fra disse transformanter ved hjelp av kjente metoder. Strukturen av hver av de nevnte plasmid-DNA'er ble bekreftet ved kutting med Pstl, EcoRI og Banlll, etterfulgt av polyakrylamidgelelektroforese. Plasmidene oppnådd på den ovennevnte måte benevnes pCfTM14, pCfTM17 og pCfTM113, som vist i fig. 4. Sekvensene i nærheten av den N-terminale ende av de hG-CSF derivat-kodende gener ble bekreftet ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag og var som følger: The recombinant plasmid-containing reaction mixture was used to transform E. coli C600SP8 (FERM BP-1070) using the method of Cohen et al. and Ap<r->colonies were obtained. Plasmid DNAs were separated and purified from these transformants using known methods. The structure of each of the aforementioned plasmid DNAs was confirmed by digestion with PstI, EcoRI and BanIII, followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The plasmids obtained in the above manner are named pCfTM14, pCfTM17 and pCfTM113, as shown in fig. 4. The sequences near the N-terminal end of the hG-CSF derivative-encoding genes were confirmed by the dideoxy sequencing method using M13 phage and were as follows:

Substitusjonen av den N-terminale Thr og tredje aminosyre Leu i moden hG-CSF med hhv. Ser og Cys, ble bekreftet i det pCfTM14-kodede derivat, som benevnes hG-CSF(Ser<1>, Cys<3>). På lignende måte ble substitusjonen av den N-terminale Thr og tredje aminosyre Leu med hhv. Ser og Arg, bekreftet i det pCfTMl7-kodede derivat, som benevnes hG-CSF(Ser<1>, Arg<3>), og substitusjonen av den N-terminale Thr og den tredje aminosyre Leu med'hhv. Ser og Ser ble bekreftet i det pCfTM113-kodede derivat, som benevnes hG-CSF(Ser<1>, Ser<3>). The substitution of the N-terminal Thr and third amino acid Leu in mature hG-CSF with resp. Ser and Cys, was confirmed in the pCfTM14-encoded derivative, which is named hG-CSF(Ser<1>, Cys<3>). In a similar way, the substitution of the N-terminal Thr and third amino acid Leu with resp. Ser and Arg, confirmed in the pCfTMl7-encoded derivative, which is named hG-CSF(Ser<1>, Arg<3>), and the substitution of the N-terminal Thr and the third amino acid Leu with'respectively. Ser and Ser were confirmed in the pCfTM113-encoded derivative, named hG-CSF(Ser<1>, Ser<3>).

Eksempel 5 Example 5

(1) Konstruksjon av det rekombinante plasmid pCf WDl ( jfr.. (1) Construction of the recombinant plasmid pCf WD1 (cf..

fig. 5) fig. 5)

I 50 fil Y-100 buffer ble det oppløst 5 fig pCfTAl oppnådd ved prosedyren i eksempel 1, 10 enheter av restriksjonsenzymet Stul og 10 enheter av restriksjonsenzymet Banlll (Toyobo) ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det oppnådd omtrent 0,5 iig av et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment på omtrent 1,3 kb (Banlll-Stul fragment) . Separat ble 3 iig pKYP2 6 fremstilt ved prosedyren i undereksempel 2 oppløst i 50 fil Y-100 buffer, 6 enheter BamHI ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennom-ført ved 3 0°C i 1 time. In 50 μl of Y-100 buffer, 5 μg of pCfTAL obtained by the procedure in example 1 were dissolved, 10 units of the restriction enzyme Stul and 10 units of the restriction enzyme BanIII (Toyobo) were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, approximately 0.5 µg of an hG-CSF cDNA-containing DNA fragment of approximately 1.3 kb (BanIII-Stul fragment) was obtained. Separately, 3 µg of pKYP2 6 prepared by the procedure in sub-example 2 was dissolved in 50 μl of Y-100 buffer, 6 units of BamHI were added and the cutting reaction was carried out at 30°C for 1 hour.

Til blandingen ble det tilsatt et like stort volum av fenol mettet med 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA. Etter kraftig omrøring ble det vandige lag samlet ved hjelp av sakte sentrifugering (3.300 omdr. pr. min, 10 min., i det følgende ble samme betingelser anvendt). Et like stort volum kloroform ble tilsatt og etter kraftig omrøring ble det vandige lag samlet ved hjelp av sakte sentrifugering. Et 1/10 volum av 3 M natriumacetat ble tilsatt, 2,5 volumdeler etanol ble så tilsatt, og blandingen fikk stå ved -20°C i 1 time. Bunnfallet ble samlet ved kaldsentrifugering (4°C, 11.000 omdr. pr, min., 10 min.) Dette bunnfall ble oppløst i 30 fil Klenow-buffer, dATP, dTTP, dCTP og dGTP ble hver tilsatt til en konsentrasjon på 100 iiM, 2 enheter DNA-polymerase I Klenow-fragment ble tilsatt, og reaksjonen ble gjennomført ved 17°C i 15 min. DNA-polymerase I Klenow-fragmentet ble inaktivert ved behandling ved 68°C i 10 min., deretter ble NaCl tilsatt til en konsentrasjon på 100 mM, 5 enheter av restriksjonsenzymet Pstl ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,6 fig av et {pp terminatorholdig DNA-fragment på omtrent 1,8 kb (BamHI (buttende)-Pstl-fragment). Separat ble 4 fig pGELl oppløst i 40 ill Y-100 buffer, 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll (Toyobo) og Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaks jonen ble gjennomført ved 37°C i l time, og 0,4 fig tryptofan-promoterholdig DNA-fragment på omtrent 1 kb (Banlll-Pstl-fragment) ble oppnådd fra reaksjonsblandingen ved hjelp av LGT-metoden. An equal volume of phenol saturated with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 1 mM EDTA was added to the mixture. After vigorous stirring, the aqueous layer was collected by slow centrifugation (3,300 rpm, 10 min, in the following the same conditions were used). An equal volume of chloroform was added and, after vigorous stirring, the aqueous layer was collected by slow centrifugation. A 1/10 volume of 3 M sodium acetate was added, 2.5 volumes of ethanol was then added, and the mixture was allowed to stand at -20°C for 1 hour. The precipitate was collected by cold centrifugation (4°C, 11,000 rpm, 10 min.) This precipitate was dissolved in 30 μl of Klenow buffer, dATP, dTTP, dCTP and dGTP were each added to a concentration of 100 iiM, 2 units of DNA polymerase I Klenow fragment were added, and the reaction was carried out at 17°C for 15 min. DNA polymerase I The Klenow fragment was inactivated by treatment at 68°C for 10 min., then NaCl was added to a concentration of 100 mM, 5 units of the restriction enzyme Pstl were added and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour . From the reaction mixture, approximately 0.6 µg of a {pp terminator-containing DNA fragment of approximately 1.8 kb (BamHI (butted)-Pstl fragment) was obtained by the LGT method. Separately, 4 µg of pGELl were dissolved in 40 µl of Y-100 buffer, 10 units of each of the restriction enzymes BanIII (Toyobo) and PstI were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour, and 0.4 µg of tryptophan promoter-containing DNA fragment of approximately 1 kb (BanIII-Pstl fragment) was obtained from the reaction mixture by the LGT method.

Omtrent 0,2 fig av det pCfTAl-avledede Banlll-Stul-fragment (omtrent. 1,3 kb), omtrent 0,1 fig av pKYP26-avledet BamHI(buttende)-PstI-fragment (omtrent 1,8 kb) og omtrent 0,1 fig av det pGELl - avledede BanIII-PstI-£ragment (omtrent l kb) ble oppløst i 30 fil T4 DNA-ligase-buf f er, 4 enheter av T4 DNA-ligase ble tilsatt og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. About 0.2 µg of the pCfTAl-derived BanIII-Stul fragment (approx. 1.3 kb), about 0.1 µg of the pKYP26-derived BamHI(buttend)-PstI fragment (approx. 1.8 kb) and about 0.1 µg of the pGEL1 -derived BanIII-PstI fragment (approximately 1 kb) was dissolved in 30 µl of T4 DNA ligase buffer, 4 units of T4 DNA ligase were added and the ligation reaction was carried out at 4° C for 18 hours.

Reaksjonsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli HB101 og en Ap<r->koloni ble oppnådd, og plasmid-DNA ble utvunnet fra denne koloni ved hjelp den ovennevnte metoden til Birnboim et al. Det ble således oppnådd pCfWDl vist i fig. 5. The reaction mixture was used to transform E. coli HB101 and an Ap<r> colony was obtained, and plasmid DNA was recovered from this colony using the above method of Birnboim et al. The pCfWD1 shown in fig. was thus obtained. 5.

(2) Konstruksjon av pCfT95K19 ( jfr, fig. 6 ) (2) Construction of pCfT95K19 ( cf. Fig. 6 )

I 50 fil Y-100 buffer ble det oppløst 5 fig av pCfTL38 oppnådd ved prosedyren i eksempel 3, 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Hindlll og Bgllll ble tilsatt, og kuttingsreaks jonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. Omtrent 0,7 fig av et tryptof an promoterholdig DNA-fragment på omtrent 2,6 kb (Hindlll-Balli-fragment) ble oppnådd fra reaksjonsblandingen ved hjelp av LGT-metoden. Separat ble 100 fig pCfTL38 oppløst i 1,5 ml Y-10 0 buffer, 80 enheter av hvert av restriksjonsenzymene BamHI og Hindlll ble tilsatt, og kuttingsreaks jonen ble gjennomført ved 37°C i 6 timer. Et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment ble utvunnet fra reaksjonsblandingen ved hjelp av LGT-metoden og renset under anvendelse av ELUTIPTM-d (varenavn for Schleicher & Schuell). Dette DNA-fragment ble oppløst i et totalt volum på 90 ( il av en oppløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 150 mM NaCl og 6 mM 2-merkaptoetanol {i det følgende benevnt "Y-150 buffer"), 3 enheter av restriksjonsenzymet Dpnl (Boehringer Mannheim) ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 15 min. Omtrent l ( ig av et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment på omtrent 300 bp (HindiII-Dpnl-fragment) ble oppnådd fra reaksjonsblandingen ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese. Separat ble 10 iig av pCfTB2 0 oppnådd ved prosedyren i eksempel 2 oppløst i 100 ( il Y-10 0 buffer, 10 enheter restriksjonsenzym Aval ble tilsatt, og kutt ingsreaks jonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. DNA utvunnet fra kuttingsblandingen ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutf elling ble oppløst i 3 0 ( il Klenow-buffer, 2 enheter DNA-polymerase I Klenow-fragment ble tilsatt, og reaksjonen ble gjennomført ved 17°C i 30 min. DNA-polymerase I Klenow-fragmentet ble inaktivert ved behandling ved 68°C i 10 min., NaCl ble tilsatt til 100 mM, 10 enheter av restriksjonsenzymet Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. Omtrent 0,3 ( ig av et {pp terminator delholdig DNA-fragment på omtrent 480 bp (Aval(buttende)-Bglll-fragment) ble oppnådd fra reaksjonsblandingen ved hjelp av LGT-metoden. In 50 μl of Y-100 buffer, 5 μg of pCfTL38 obtained by the procedure in Example 3 were dissolved, 10 units of each of the restriction enzymes HindIII and BgIII were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. About 0.7 µg of a tryptophan promoter-containing DNA fragment of about 2.6 kb (HindIII-Balli fragment) was obtained from the reaction mixture by the LGT method. Separately, 100 µg of pCfTL38 was dissolved in 1.5 ml of Y-100 buffer, 80 units of each of the restriction enzymes BamHI and HindIII were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 6 hours. An hG-CSF cDNA-containing DNA fragment was recovered from the reaction mixture by the LGT method and purified using ELUTIPTM-d (trade name of Schleicher & Schuell). This DNA fragment was dissolved in a total volume of 90 µl of a solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl and 6 mM 2-mercaptoethanol {hereinafter referred to as "Y -150 buffer"), 3 units of the restriction enzyme Dpnl (Boehringer Mannheim) were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 15 min. Approximately 1 µg of an hG-CSF cDNA-containing DNA fragment of approximately 300 bp (HindiII-Dpnl fragment) was obtained from the reaction mixture by polyacrylamide gel electrophoresis. Separately, 10 µg of pCfTB20 obtained by the procedure of Example 2 was dissolved in 100 µl Y-100 buffer, 10 units of restriction enzyme Aval were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. DNA recovered from the cutting mixture by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation was dissolved in 30 µl Klenow- buffer, 2 units of DNA polymerase I Klenow fragment was added, and the reaction was carried out at 17°C for 30 min. The DNA polymerase I Klenow fragment was inactivated by treatment at 68°C for 10 min., NaCl was added to 100 mM, 10 units of the restriction enzyme Bglll was added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. About 0.3 µg of a {pp terminator partial DNA fragment of about 480 bp (Aval(buttende)-Bglll- fragment) was obtained from the reaction mixture by LGT- the method.

I 30 ill av T4 DNA-ligasebuffer ble det oppløst omtrent 0,1 iig av det pCfTL38-avledede Hindlll-Bglll-fragment (omtrent 2,6 kb), omtrent 0,2 itg av det pCfTL38-avledede Hindlll-Dpnl-fragment (omtrent 300 bp) og omtrent 0,15 fig av det pCfTB20-avledede Aval(buttende)-Bglll-fragment (omtrent 480 bp), hvert oppnådd på den ovennevnte måte, og etter tilsetting av 4 enheter av T4 DNA-ligase, ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og det ble oppnådd en Ap<r->koloni. Fra denne koloni ble det utvunnet plasmid-DNA ved hjelp av den ovennevnte metode til Birnboim et al. Det ble således oppnådd pCfT95K19 vist i fig. 6 . In 30 µl of T4 DNA ligase buffer, approximately 0.1 µg of the pCfTL38-derived HindIII-Bglll fragment (approximately 2.6 kb), approximately 0.2 µg of the pCfTL38-derived HindIII-Dpnl fragment ( about 300 bp) and about 0.15 µg of the pCfTB20-derived Aval(buttening)-Bglll fragment (about 480 bp), each obtained in the above manner, and after addition of 4 units of T4 DNA ligase, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours. The reaction mixture was used to transform E. coli HB101 and an Ap<r> colony was obtained. Plasmid DNA was extracted from this colony using the above-mentioned method of Birnboim et al. pCfT95K19 was thus obtained shown in fig. 6.

(3) Konstruks- ion av pCfAAl f jfr, fig. 6) (3) Construction of pCfAAl f cf., fig. 6)

I 50 fil Y-100 buffer ble det oppløst 5 iig pCfT95Kl9 oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt. 7 enheter av restriksjonsenzymet Banlll (Toyobo) og 2 enheter av Bgll (Nippon Gene) ble tilsatt dertil og kuttingsreaksjonen ble. gjennomført ved 37°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det'ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,6 iig tryptofan-promoterdel-holdig DNA-fragment på omtrent l kb (BandiII-Bgll-fragment) og omtrent 1 fig av et {pp-terminatordel-holdig DNA-fragment på omtrent 1,8 kb (Bgll-Bgll-fragment). In 50 μl of Y-100 buffer, 5 μg of pCfT95Kl9 obtained as described in the previous section were dissolved. 7 units of the restriction enzyme BanIII (Toyobo) and 2 units of BgII (Nippon Gene) were added thereto and the cutting reaction was. carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, by means of the LGT method, about 0.6 µg of tryptophan-promoter part-containing DNA fragment of about 1 kb (BandiII-Bgll fragment) and about 1 µg of a {pp-terminator part-containing DNA- fragment of approximately 1.8 kb (Bgll-Bgll fragment).

Separat ble 15 iig.pCfT95K19 oppløst i 150 fil Y-100 buffer, 6 enheter av restriksjonsenzymet Bgll (Nippon Gene) og 10 enheter Sau3A ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C -i 1 time. Polyakrylamidgelelektroforese av reaksjonsblandingen ga omtrent 0,3 fig av et hG-CSF cDNA-del-holdig DNA-fragment på omtrent 350 bp (BglI-Sau3A-fragment). Separately, 15 µg.pCfT95K19 was dissolved in 150 µl Y-100 buffer, 6 units of the restriction enzyme Bgll (Nippon Gene) and 10 units of Sau3A were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. Polyacrylamide gel electrophoresis of the reaction mixture yielded approximately 0.3 µg of an hG-CSF cDNA portion-containing DNA fragment of approximately 350 bp (BglI-Sau3A fragment).

Videre ble den følgende DNA-linker syntetisert separat: Furthermore, the following DNA linker was synthesized separately:

Først ble 39-mer og 41-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfortriestermetode. 39-mer og 41-mer (hver 2 0 pikomol) ble oppløst i et totalt volum på 4 0 fil av T4 DNA-kinasebuffer, 6 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. First, 39-mer and 41-mer single-stranded DNAs were synthesized using the usual phosphorotriester method. 39-mer and 41-mer (each 20 picomoles) were dissolved in a total volume of 40 µl of T4 DNA kinase buffer, 6 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) were added and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 my.

Deretter ble 0,1 fig av det pCfT95K19 avledede Banlll-Bgll-fragment (omtrent 1 kb), 0,05 fig av Bgll-Bgll-fragmentet (omtrent 1,8 kb) og 0,1 fig av BglI-Sau3A-fragmentet (omtrent Then, 0.1 µg of the pCfT95K19-derived BanIII-Bgll fragment (approximately 1 kb), 0.05 µg of the Bgll-Bgll fragment (approximately 1.8 kb), and 0.1 µg of the BglI-Sau3A fragment ( approximately

3 50 bp), hvert oppnådd på den ovennevnte måte, oppløst i 25 3 50 bp), each obtained in the above manner, dissolved in 25

/il T4 DNA-ligasebuf f er, etterfulgt av tilsetting av omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker. Etter ytterligere tilsetting av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 40°C i 18 timer. /µl of T4 DNA ligase buffer, followed by the addition of approximately 2 picomoles of the above DNA linker. After further addition of 6 units of T4 DNA ligase, the ligation reaction was carried out at 40°C for 18 hours.

Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101, en- Apr-koloni ble oppnådd og plasmid DNA ble utvunnet . fra denne koloni ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al metode. Det ble således oppnådd pCfAAl vist i fig. 6. Bestemmelse av basesekvensen i linkerdelen av pCfAAl ved The reaction mixture was used for transformation of E. coli HB101, one-Apr colony was obtained and plasmid DNA was recovered. from this colony using the above Birnboim et al method. The pCfAAl shown in fig. was thus obtained. 6. Determination of the base sequence in the linker part of pCfAAl by

hjelp av den ovennevnte dideoksysekvenseringsmetode viste at den tredje base i kodonet som koder for den fjerde aminosyre Leu er A. I denne pCfAAl mangler den DNA-del som koder for de 14 aminosyrer fra den 10. aminosyre Pro til den 23. aminosyre Lys i hG-CSF. Videre er denne mutasjon innført for å endre using the above-mentioned dideoxy sequencing method showed that the third base in the codon that codes for the fourth amino acid Leu is A. In this pCfAAl, the DNA part that codes for the 14 amino acids from the 10th amino acid Pro to the 23rd amino acid Lys in hG is missing - CSF. Furthermore, this mutation is introduced to change

den 6. aminosyre i hG-CSF fra Ala til Asn, og der er nå et nytt Xhol-sete. the 6th amino acid in hG-CSF from Ala to Asn, and there is now a new Xhol site.

(4) Konstruksjon av pCfABS H f r. fig. 6) I 30 /il Y-100 buffer ble det oppløst 3 /ig pCfAAl oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt, 5 enheter av restriksjonsenzymet Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Etter bekreftelse av fullstendig Xhol-kutting ved hjelp av agarosegelelektroforese ble en enhet av restriksj onsenzymet Bgll (Nippon Gene) ' " f tilsatt og delvis kutting ble gjennomført ved 37°C i 25 min. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent l fig av et tryptof an-promoter del- og Jpp-terminatordel-holdig DNA-fragment på omtrent 3 kb (Xhol-Bgll-"fragment). Separat ble følgende DNA-linker syntetisert: j (4) Construction of pCfABS H f r. fig. 6) In 30 µl of Y-100 buffer, 3 µg of pCfAAl obtained as described in the previous section was dissolved, 5 units of the restriction enzyme Xhol were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. After confirmation of complete Xhol cleavage by agarose gel electrophoresis, one unit of the restriction enzyme Bgll (Nippon Gene) ' " f was added and partial cleavage was carried out at 37°C for 25 min. From the reaction mixture, by the LGT method, it was obtained about 1 fig of a tryptophan promoter part and Jpp terminator part-containing DNA fragment of about 3 kb (Xhol-Bgll "fragment"). Separately, the following DNA linkers were synthesized: j

Dette linker-.DNA inneholder den DNA-del som koder for de 14 aminosyrer i hG-CSF fra den 10. aminosyre Pro til den 23. aminosyre Lys. Denne del mangler i hG-CSF cDNA av pCfAAl. This linker DNA contains the DNA part that codes for the 14 amino acids in hG-CSF from the 10th amino acid Pro to the 23rd amino acid Lys. This part is missing from the hG-CSF cDNA of pCfAAl.

Først ble 27-mer, 25-mer (to typer) og 23-mer enkelttrådede DNA<1>er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfortriestermetode. 27-mer og 25-mer DNA'er komplementære til hverandre og 25-mer og 23-mer DNA komplementære til hverandre ble. oppløst i par, og hver i en mengde på 20 pikomol, i et totalt volum på 40 ( il T4 kiiiasebuffer. 6 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shyzo) ble tilsatt til hver oppløsning og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. First, 27-mer, 25-mer (two types) and 23-mer single-stranded DNA<1>s were synthesized using the usual phosphoro-triester method. 27-mer and 25-mer DNAs complementary to each other and 25-mer and 23-mer DNAs complementary to each other were. dissolved in pairs, and each in an amount of 20 picomoles, in a total volume of 40 µl of T4 kiiiase buffer. 6 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shyzo) were added to each solution and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min.

Deretter ble 0,1 iig av det pCfAAl-avledede Xhol-Bgll-fragment (omtrent 3 kb) oppnådd som beskrevet ovenfor og 0,1/ig av det pCfT95K19 avledede BglI-Sau3A-fragment (omtrent 350 bp) oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt, oppløst i 3 0 /il T4 DNA-ligasebuffer, og 2 pikomol av hver av de ovennevnte DNA-linkerdeler ble tilsatt blandingsoppløsningen. Ytter-■ ligere ble 6 enheter T4 DNA-ligase tilsatt og ligerings-reaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og det ble oppnådd Ap<r->kolonier. Fra disse kolonier ble plasmid-DNA utvunnet ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al metode. Det ble på denne måte oppnådd pCfABS og pCfAB14 vist i fig. 6. Bestemmelse av basesekvensen av DNA-linkeren av pCfABS og i pCfABi4 ved hjelp av den ovennevnte dioksysekven-seringsmetode viste at den første base i kodonet som koder for den 17. aminosyre er A i pCfABS og T i pCfAB14, og kodonet er følgelig for Ser (-AGC) i den førstnevnte og for Cys (TGC) i den sistnevnte, som fører til substitusjon av Ser for den 17. aminosyre Cys i moden hG-CSF i pCfABS, men ingen substitusjon i pCfAB14. Then, 0.1 µg of the pCfAAl-derived XhoI-Bgll fragment (approximately 3 kb) was obtained as described above and 0.1 µg of the pCfT95K19-derived BglI-Sau3A fragment (approximately 350 bp) was obtained as described in the preceding section, dissolved in 30 µl T4 DNA ligase buffer, and 2 picomoles of each of the above DNA linker moieties were added to the mixture solution. Additionally, 6 units of T4 DNA ligase were added and the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours. The reaction mixture was used to transform E. coli HB101 and Ap<r> colonies were obtained. Plasmid DNA was extracted from these colonies using the above-mentioned Birnboim et al method. pCfABS and pCfAB14 shown in fig. were obtained in this way. 6. Determination of the base sequence of the DNA linker of pCfABS and in pCfABi4 by means of the above-mentioned dioxy sequencing method showed that the first base in the codon coding for the 17th amino acid is A in pCfABS and T in pCfAB14, and the codon is consequently for Ser (-AGC) in the former and for Cys (TGC) in the latter, leading to substitution of Ser for the 17th amino acid Cys in mature hG-CSF in pCfABS, but no substitution in pCfAB14.

Eksempel 6 Example 6

(1) Konstruks- ion av pCfBAS oa pCfBA32 Hfr. fia. 71. (1) Construction of pCfBAS and other pCfBA32 Cf. fia. 71.

I 40 /il Y-100 buffer ble det oppløst 3 /tg pCfABS oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt, 5 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Aval og Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaks jonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time.' Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 1 fig av et tryptofan-promoterdel - og {pp-terminatordel -holdig DNA-fragment på omtrent 2,8 kb (Aval-Bglll-fragment). Separat ble 6 fig pCfWDl oppnådd som beskrevet i avsnitt 1 oppløst i 50 fil Y-100 buffer, 5 enheter restriksjonsenzym Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført, ved 37°C i 1 time. Agarosegelelektroforese bekreftet at kuttingen med Bglll var fullstendig. Deretter ble 3 enheter restriksjonsenzym Aval tilsatt og den delvise kutting ble gjennomført ved 37°C i 20 min. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 0,4 fig av et DNA-fragment (omtrent 1,3 kb) inneholdende det meste av hG-CSF (BglII-AvaI-fragment). In 40 µl of Y-100 buffer, 3 µg of pCfABS obtained as described in the previous section was dissolved, 5 units of each of the restriction enzymes Aval and Bglll were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, by means of the LGT method, about 1 µg of a DNA fragment containing a tryptophan-promoter part - and {pp-terminator part - of about 2.8 kb (Aval-Bglll fragment) was obtained. Separately, 6 µg of pCfWD1 obtained as described in section 1 were dissolved in 50 µl of Y-100 buffer, 5 units of restriction enzyme BglII were added, and the cutting reaction was carried out, at 37°C for 1 hour. Agarose gel electrophoresis confirmed that the cut with BglII was complete. Then 3 units of restriction enzyme Aval were added and the partial cutting was carried out at 37°C for 20 min. From the reaction mixture, 0.4 µg of a DNA fragment (approximately 1.3 kb) containing most of the hG-CSF (BglII-AvaI fragment) was obtained by the LGT method.

Deretter ble 0,1 fig av det ovennevnte pCfABS-avledede Aval-BglII-fragment (omtrent 2,8 kb) og 0,3 fig av det pCfWDl-avledede BgllI-Aval-fragment (omtrent 1,3 kb), hvert oppnådd som beskrevet i det foregående og oppløst i 25 fil T4 DNA-ligase, tilsatt og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.1 µg of the above pCfABS-derived Aval-BglII fragment (approximately 2.8 kb) and 0.3 µg of the pCfWDl-derived BgllI-Aval fragment (approximately 1.3 kb), each obtained as described above and dissolved in 25 µl T4 DNA ligase, added and the ligation reaction carried out at 4°C for 18 hours.

Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Fra denne koloni ble plasmid-DNA utvunnet ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al. metode. Det ble på denne måte oppnådd pCfBAS. The reaction mixture was used to transform E. coli HB101 and an Ap<r> colony was obtained. From this colony, plasmid DNA was recovered using the above Birnboim et al. method. In this way pCfBAS was obtained.

Aminosyresekvensen i hG-CSF-derivatet som kodes for av pCfBAS inneholder Asn i stedet for den 6. aminosyre Ala i moden hG-CSF og Ser i stedet for den 17. aminosyre Cys. I det følgende omtales dette derivat som hG-CSF(NA8) .' På den annen side ble 3 fig pCfAB14 oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt oppløst i 4 0 fil Y-100 buffer, 5 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Aval og Bglll ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 1 ( ig av et tryptof an-promoterdel- og {pp-terminatordel-holdig DNA-fragment på omtrent 2,8 kb (Aval-Bglll-fragment). The amino acid sequence of the hG-CSF derivative encoded by pCfBAS contains Asn instead of the 6th amino acid Ala of mature hG-CSF and Ser instead of the 17th amino acid Cys. In the following, this derivative is referred to as hG-CSF(NA8).' On the other hand, 3 µl pCfAB14 was obtained as described in the previous section dissolved in 40 µl Y-100 buffer, 5 units of each of the restriction enzymes Aval and Bglll were added and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, approximately 1 µg of a tryptophan-promoter- and {pp-terminator-containing DNA fragment of approximately 2.8 kb (Aval-Bglll fragment) was obtained by the LGT method.

Separat ble 6 fig pCfWDl oppnådd som beskrevet i avsnitt Separately, 6 fig pCfWDl was obtained as described in Sect

1 oppløst i 50 fil Y-100 buffer, 5 enheter av restriksj onsenzymet Bglll ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Etter bekreftet fullstendig kutting ved BgllI-kuttingen ved agarosegelelektroforese ble 3 enheter av restriksjonsenzymet Aval tilsatt og delvis kutting ble gjennomført ved 37°C i 20 min. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 0,4 iig av et DNA-fragment (omtrent 1,3 kb) inneholdende det meste av CSF cDNA (BgllI-Aval-fragment). 1 dissolved in 50 µl Y-100 buffer, 5 units of the restriction enzyme BglII were added and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. After confirming complete cutting by the BgllI cut by agarose gel electrophoresis, 3 units of the restriction enzyme Aval were added and partial cutting was carried out at 37°C for 20 min. From the reaction mixture, 0.4 µg of a DNA fragment (approximately 1.3 kb) containing most of the CSF cDNA (BgllI-Aval fragment) was obtained by the LGT method.

Deretter ble 0,1 fig av det pCfAB14-avledede Aval-Bglll-fragment (omtrent 2,8 kb) og 0,3 iig av det pCfWDl-avledede BglII-AvaI-fragment (omtrent 1,3 kb), hver oppnådd'som beskrevet i det foregående, oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuffer, 3 enheter T4 DNA-ligase ble tilsatt, og ligerings-reaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.1 µg of the pCfAB14-derived Aval-BglII fragment (approximately 2.8 kb) and 0.3 µg of the pCfWD1-derived BglII-AvaI fragment (approximately 1.3 kb), each obtained as described above, dissolved in 25 μl of T4 DNA ligase buffer, 3 units of T4 DNA ligase were added, and the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og en Ap<r->koloni ble oppnådd og fra denne koloni ble plasmid-DNA utvunnet ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al. metode. På denne måte ble det oppnådd pCfBA32 vist i fig. 7. The reaction mixture was used to transform E. coli HB101 and an Ap<r> colony was obtained and from this colony plasmid DNA was recovered by means of the above-mentioned Birnboim et al. method. In this way, the pCfBA32 shown in fig. 7.

Aminosyresekvensen i hG-CSF-derivatet som kodes for av The amino acid sequence of the hG-CSF derivative encoded by

pCfBA32 inneholder Asn i stedet for den 6. aminosyre Ala i vanlig hG-CSF. pCfBA32 contains Asn instead of the 6th amino acid Ala in regular hG-CSF.

(2) Konstruksjon av pCfBBlOl (2) Construction of pCfBBlOl

I 50 fil Y-100 buffer ble det oppløst 6 iig pCfBA8 oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt, 10 enheter restriksjonsenzym Banlll (Toyobo), 8 enheter Bglll og 8 enheter Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,6 fig av et hG-CSF cDNA inneholdende DNA-fragment på omtrent 1,4 kb (Xhol-BglII-fragment) og omtrent 0,8 fig av et tryptofan-promoterdel-holdig DNA-fragment på omtrent 2,7 kb {BanIII-BglII-fragment). In 50 µl of Y-100 buffer, 6 µg of pCfBA8 obtained as described in the previous section were dissolved, 10 units of restriction enzyme BanIII (Toyobo), 8 units of BglII and 8 units of XhoI were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, approximately 0.6 µg of an hG-CSF cDNA containing a DNA fragment of approximately 1.4 kb (Xhol-BglII fragment) and approximately 0.8 µg of a tryptophan promoter part were obtained by the LGT method -containing DNA fragment of approximately 2.7 kb (BanIII-BglII fragment).

Separat ble følgende DNA-linker syntetisert: Separately, the following DNA linkers were synthesized:

i Først ble 31-mer og 33-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfortriestermetode. 31-mer og 33-mer (hver 2 fig) ble oppløst i totalt 40 fil T4 kinasebuffer, 30 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyliseringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. Deretter ble 0,1 fig av det pCfBA8-avledete Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kb fragment) og 0,1 fig av det pCfBA8-avledede XhoI-BglU-fragment (omtrent 1,4 kb-fragment), hvert oppnådd som beskrevet i det foregående, oppløst i 25 fil T4 DNA ligasebuffer og omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. i First, 31-mer and 33-mer single-stranded DNAs were synthesized using the usual phosphorotriester method. 31-mer and 33-mer (each 2 fig) were dissolved in a total of 40 µl of T4 kinase buffer, 30 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) were added and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min. Then, 0.1 µg of the pCfBA8-derived BanIII-BglIII fragment (approximately 2.7 kb fragment) and 0.1 µg of the pCfBA8-derived XhoI-BglU fragment (approximately 1.4 kb fragment), each obtained as described above, dissolved in 25 μl of T4 DNA ligase buffer and approximately 2 picomoles of the above DNA linker was added to the mixture solution. After further addition of 6 units of T4 DNA ligase, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den således oppnådde rekombinante plasmid-blanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og det ble oppnådd en Ap<r->koloni. Fra dyrkede celler avledet fra denne koloni ble det utvunnet plasmid-DNA. Det ble således oppnådd pCfBBlOl vist i fig. 7. Aminosyresekvensen av det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfBBlOl inneholder Ala, Thr, Arg, Ser og Ser i stedet for hhv. l. aminosyre Thr, 3. aminosyre Leu, 4. aminosyre Gly, 5. aminosyre Pro og 17. aminosyre Cys i moden hG-CSF. I det følgende omtales dette derivat som hG-CSF (NB101) . (3) Konst ruks- i on' av PCfBC42Bl. PCfBC45! pCf BC52 , pCfBC59. pCfBC76. pCfBC77. pCf BC93. pCfBC95 oa pCfBC97 Hfr. f ia. The recombinant plasmid mixture thus obtained was used for transformation of E. coli HB101 and an Ap<r> colony was obtained. From cultured cells derived from this colony, plasmid DNA was recovered. The pCfBBlOl shown in fig. was thus obtained. 7. The amino acid sequence of the hG-CSF derivative encoded by pCfBBlOl contains Ala, Thr, Arg, Ser and Ser instead of, respectively. 1st amino acid Thr, 3rd amino acid Leu, 4th amino acid Gly, 5th amino acid Pro and 17th amino acid Cys in mature hG-CSF. In the following, this derivative is referred to as hG-CSF (NB101). (3) Konst ruks- i on' of PCfBC42Bl. PCfBC45! pCfBC52, pCfBC59. pCfBC76. pCfBC77. pCf BC93. pCfBC95 oa pCfBC97 Cf. f ia.

Først ble følgende DNA-linker syntetisert: First, the following DNA linkers were synthesized:

(N er en av G, A, T og C). (N is one of G, A, T and C).

I denne syntetiske DNA-linker er de tre baser som hver representeres ved N hver uavhengig en av G, A, T og C og en base er G eller A {i tilfellet av 31-mer) eller C eller T (i tilfellet av 33-mer) og derfor oppnås denne linker som en blanding av totalt 128 DNA-linkere. Som et resultat er designen av denne linker slik at i den N-terminale hG-CSF aminosyresekvens som kodes for av denne linker, er 16 forskjellige aminosyrer mulig som aminosyren nærmest Met og 8 forskjellige aminosyrer er mulig som aminosyren nærmest Pro, og følgelig er 128 aminosyresekvenser totalt mulig. Først ble 31-mer og 33-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriester-metode. 31-mer og 33-mer (hver 2 itg) ble oppløst i et totalt volum på 40/il T4 kinasebuf fer, 3 0 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyliserings-reaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. In this synthetic DNA linker, the three bases each represented by N are each independently one of G, A, T, and C and one base is G or A {in the case of the 31-mer) or C or T (in the case of the 33 -mer) and therefore this linker is obtained as a mixture of a total of 128 DNA linkers. As a result, the design of this linker is such that in the N-terminal hG-CSF amino acid sequence encoded by this linker, 16 different amino acids are possible as the amino acid closest to Met and 8 different amino acids are possible as the amino acid closest to Pro, and thus 128 amino acid sequences totally possible. First, 31-mer and 33-mer single-stranded DNAs were synthesized using the usual phosphotriester method. 31-mer and 33-mer (2 µg each) were dissolved in a total volume of 40 µl T4 kinase buffer, 30 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) were added and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min. .

Deretter ble 0,1 /tg av det pCfBAS-avledede Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kb fragment) og 0,1 /ig av det pCfBAS avledede Xhol-Bglll-fragment (omtrent 1,4 kb fragment), hvert oppnådd i eksempel 6, oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuf f er, og omtrent 2 pikomol av ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.1 µg of the pCfBAS-derived BanIII-BglIII fragment (approximately 2.7 kb fragment) and 0.1 µg of the pCfBAS-derived XhoI-BglIII fragment (approximately 1.4 kb fragment), each obtained in Example 6, dissolved in 25 µl of T4 DNA ligase buffer, and approximately 2 picomoles of the above DNA linker was added to the mixture solution. After further addition of 6 units of T4 DNA ligase, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den således oppnådde rekombinante plasmidblanding ble anvendt . for transformering av E. coli HB101 og Ap<r->kolonier ble oppnådd. Fra dyrkede celler av disse kolonier ble plasmid-DNA utvunnet. Det ble således oppnådd pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 og pCfBC97. Bestemmelse av basesekvensen i hver DNA-linker-del ved hjelp av den ovennevnte dideoksysekvenseringsmetode viste at base-sekvensene på den N-terminale side av hG-CSF-derivatene er som følger: The recombinant plasmid mixture thus obtained was used. for transformation of E. coli HB101 and Ap<r> colonies were obtained. Plasmid DNA was recovered from cultured cells of these colonies. Thus pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 and pCfBC97 were obtained. Determination of the base sequence in each DNA linker portion using the above dideoxy sequencing method showed that the base sequences on the N-terminal side of the hG-CSF derivatives are as follows:

Substituent-aminosyrerestene i hG-CSF-derivatene som kodes for av disse plasmider som hhv. sammenlignet med moden hG-CSF er som følger: The substituent amino acid residues in the hG-CSF derivatives which are coded for by these plasmids as respectively compared to mature hG-CSF is as follows:

Posisjon av aminosyresubstitusion faminosyre av hG- CSF) Position of amino acid substitution amino acid of hG-CSF)

De hG-CSF-derivater som kodes for av pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC56, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 og pCfBC97 benevnes i det følgende henhv. hG-CSF(NC42B1), hG-CSF (NC45), hG-CSF{NC52), hG-CSF(NC59), hG-CSF (NC76) , hG-CSF(NC77), hG-CSF(NC93), hG-CSF(NC95) og hG-CSF(NC97). (4) Konstruksjon av pCfBD28. pCfBD56 og pCfBD82 Først ble følgende DNA-linker syntetisert: 1 denne DNA-linker er de fire baser representert ved N uavhengig G,-A, T eller C og linkeren oppnås følgelig som en blanding av totalt 256 forskjellige DNA-linkere. Som et resultat er konstruksjonen av denne DNA-linker slik at i den N-terminale hG-CSF-aminosyresekvens som kodes for av DNA-linker en, er fire aminosyrer mulige i hver av de fire posisjoner som det er tale om, og følgelig- er totalt 2 56 forskjellige aminosyresekvenser mulig. The hG-CSF derivatives encoded by pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC56, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 and pCfBC97 are named in the following respectively. hG-CSF(NC42B1), hG-CSF (NC45), hG-CSF{NC52), hG-CSF(NC59), hG-CSF (NC76) , hG-CSF(NC77), hG-CSF(NC93), hG -CSF(NC95) and hG-CSF(NC97). (4) Construction of pCfBD28. pCfBD56 and pCfBD82 First the following DNA linker was synthesized: in this DNA linker the four bases are represented by N independently G, -A, T or C and the linker is consequently obtained as a mixture of a total of 256 different DNA linkers. As a result, the construction of this DNA linker is such that in the N-terminal hG-CSF amino acid sequence encoded by DNA linker one, four amino acids are possible in each of the four positions in question, and consequently- a total of 256 different amino acid sequences are possible.

Først ble 31-mer og.33-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige f osf otriester-metode. I totalt 4 0 /il T4 kinasebuffer ble det oppløst 2 iig av hver av 31-mer og 33-mer, 3 0 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 60 min. First, 31-mer and .33-mer single-stranded DNAs were synthesized using the usual phosphorus triester method. In a total of 40 µl of T4 kinase buffer, 2 µg of each of 31-mer and 33-mer were dissolved, 30 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) were added, and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min.

Deretter ble 0,1 /ig av dét pCfBAS-avledede Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kg fragment) og 0,1 /ig av det pCfBAS-avledede Xhol-Bglll-fragment (omtrent 1,4 kb fragment),, hvert oppnådd i eksempel 6, oppløst i 25 /il T4 DNA ligasebuffer og omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.1 µg of the pCfBAS-derived BanIII-BglIII fragment (approximately 2.7 kg fragment) and 0.1 µg of the pCfBAS-derived XhoI-BglIII fragment (approximately 1.4 kb fragment), , each obtained in Example 6, dissolved in 25 µl of T4 DNA ligase buffer and about 2 picomoles of the above DNA linker were added to the mixture solution. After further addition of 6 units of T4 DNA ligase, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den oppnådde rekombinante plasmidblanding ble anvendt for' transformering av E. coli HB101 og Ap<r->kolonier ble oppnådd. Fra dyrkede celler av disse kolonier ble de respektive plasmider utvunnet. Det ble således oppnådd pCfBD28, pCfBD56 og pCfBD82. Bestemmelse av basesekvensen i DNA linkerdelen ved hjelp av den ovennevnte dideoksysekvenseringsmetode viste at basesekvensene på den N-terminale side av hG-CSF-derivatene er som følger: The obtained recombinant plasmid mixture was used for transformation of E. coli HB101 and Aβ colonies were obtained. From cultured cells of these colonies, the respective plasmids were recovered. pCfBD28, pCfBD56 and pCfBD82 were thus obtained. Determination of the base sequence in the DNA linker part using the above-mentioned dideoxy sequencing method showed that the base sequences on the N-terminal side of the hG-CSF derivatives are as follows:

De erstattende aminosyrerester i hG-CSF-derivatene The substituted amino acid residues in the hG-CSF derivatives

som disse plasmider koder for i sammenligning med moden hG-CSF er som følger: that these plasmids encode in comparison to mature hG-CSF are as follows:

hG-CSF-derivatene som kodes for av pCfBD28, pCfBD56 og pCfBD82 er i det følgende omtalt som henhv. hG-CSF(ND28)' hG-CSF(ND56) og hG-CSF(ND82). En E. coli stamme med pCfBD56, nemlig E. coli ECfBD56, og en E. coli stamme med pCfBD2 8, nemlig E. coli ECfBD28, er deponert ved Fermentation Research Institute under deponeringsnummere FERM BP-1221 og FERM BP-1479, i samsvar med Budapestkonvensjonen. The hG-CSF derivatives encoded by pCfBD28, pCfBD56 and pCfBD82 are referred to in the following as respectively hG-CSF(ND28)' hG-CSF(ND56) and hG-CSF(ND82). An E. coli strain with pCfBD56, namely E. coli ECfBD56, and an E. coli strain with pCfBD2 8, namely E. coli ECfBD28, have been deposited at the Fermentation Research Institute under deposit numbers FERM BP-1221 and FERM BP-1479, in accordance with the Budapest Convention.

(5) Konstruksjon av pCfTNS7 Hfr. f ia. 14) (5) Construction of pCfTNS7 Ref. f ia. 14)

Følgende DNA-linker ble syntetisert. The following DNA linkers were synthesized.

j j

I henhold' til oppbygningen av denne DNA-linker er de fire aminosyr<i>er fra den 1. aminosyre Thr til den 4. aminosyre Gly i den N-terminale ende-aminosyresekvens av hG-CSF manglende i den N-terminale aminosyresekvens som kodes for av denne linker. According to the structure of this DNA linker, the four amino acids from the 1st amino acid Thr to the 4th amino acid Gly in the N-terminal end amino acid sequence of hG-CSF are missing in the N-terminal amino acid sequence which coded for by this linker.

Først ble 18-mer og 2 0-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 18-mer og 2 0-mer (hver 2fig) ble oppløst i totalt 4 0 fil T4 kinasebuf f er, 30 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. First, 18-mer and 20-mer single-stranded DNAs were synthesized using the usual phosphotriester method. 18-mer and 20-mer (each 2fig) were dissolved in a total of 40 µl of T4 kinase buffer, 30 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) were added and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min.

Deretter ble 0,1 fig av det pCfBAS-avledede Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kb fragment) og 0,i fig av det pCfBA8-avledede XhoI-BglII-fragment (omtrent 1,4 kb), hvert oppnådd i eksempel 6, oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuffer, omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandings-oppløsningen og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.1 µg of the pCfBAS-derived BanIII-BglII fragment (approximately 2.7 kb fragment) and 0.1 µg of the pCfBA8-derived XhoI-BglII fragment (approximately 1.4 kb), each obtained in example 6, dissolved in 25 μl of T4 DNA ligase buffer, about 2 picomoles of the above DNA linker was added to the mixture solution and the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den rekombinante plasmidblanding oppnådd på denne måte ble anvendt for transformering av E. coli HB101, og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Fra dyrkede celler av denne koloni ble plasmidet utvunnet. Det ble således oppnådd pCfTNS7. Det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTNS7 benevnes i det følgende hG-CSF(Al-4S) . The recombinant plasmid mixture thus obtained was used for transformation of E. coli HB101, and an Aβ colony was obtained. From cultured cells of this colony, the plasmid was recovered. pCfTNS7 was thus obtained. The hG-CSF derivative encoded by pCfTNS7 is named hG-CSF(Al-4S) in the following.

(6) Konstruksjon av pCfTAAro4S fj fr, fia. 14) (6) Construction of pCfTAAro4S fj fr, fia. 14)

Følgende DNA-linker ble syntetisert: The following DNA linkers were synthesized:

I denne DNA-linker er to baser uavhengig A eller G, og følgelig oppnås denne linker som en blanding av totalt fire DNA-linkere. Følgelig er konstruksjonen av denne DNA-linker slik at fire aminosyrer er mulige som den fjerde aminosyre i den N-terminale hG-CSF aminosyresekvens som kodes for av denne linker. In this DNA linker, two bases are independently A or G, and consequently this linker is obtained as a mixture of a total of four DNA linkers. Accordingly, the construction of this DNA linker is such that four amino acids are possible as the fourth amino acid in the N-terminal hG-CSF amino acid sequence encoded by this linker.

Først ble 31-mer og 33-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 31-mer og 33-mer (hver 2fig) ble oppløst i et totalt volum på 40 fil T4 kinasebuffér, 3 0 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. First, 31-mer and 33-mer single-stranded DNAs were synthesized using the usual phosphotriester method. 31-mer and 33-mer (each 2fig) were dissolved in a total volume of 40 µl T4 kinase buffer, 30 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) were added, and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min.

Deretter ble 0,1 fig av det pCfBAS-avledede BanIII-BfIII-fragment (omtrent 2,7 kb-fragment) og 0,1 fig av det pCfBA8-avledede XhoI-BglII-fragment (omtrent 1,4 kb-fragment), hvert oppnådd som beskrevet i avsnitt (l) , oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuffer og omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppløsningen. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.1 µg of the pCfBAS-derived BanIII-BfIII fragment (approximately 2.7 kb fragment) and 0.1 µg of the pCfBA8-derived XhoI-BglII fragment (approximately 1.4 kb fragment), each obtained as described in section (l), dissolved in 25 μl of T4 DNA ligase buffer and about 2 picomoles of the above DNA linker were added to the mixture solution. After further addition of 6 units of T4 DNA ligase, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den rekombinante plasmidblanding oppnådd på denne måte ble anvendt for transformering av E. coli HB101, og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Fra dyrkede celler fra denne koloni ble plasmidet utvunnet. Det ble således oppnådd pCfTAArg4S. Bestemmelse av basesekvensen i DNA-linkerdelen ved hjelp av den ovennevnte dideoksysekvenseringsmetode viste at den N-terminale basesekvéns av hG-CSF-derivatet er som følger: The recombinant plasmid mixture thus obtained was used for transformation of E. coli HB101, and an Aβ colony was obtained. From cultured cells from this colony, the plasmid was recovered. pCfTAArg4S was thus obtained. Determination of the base sequence of the DNA linker using the above dideoxy sequencing method showed that the N-terminal base sequence of the hG-CSF derivative is as follows:

Det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTAArg4S benevnes i det følgende hG-CSF (Arg4, Ser17) . The hG-CSF derivative encoded by pCfTAArg4S is named hG-CSF (Arg4, Ser17) in the following.

(7) ( Konstruksjon av pCfTN205 ( jfr, fig. 15) (7) ( Construction of pCfTN205 ( cf. fig. 15)

I 4 0 fil K-150 buffer (den samme som Y-100 buffer unntatt at 150 mM KC1 erstatter 100 mM NaCl), ble det tilsatt 3 fig pCfTNS7 oppnådd i avsnitt 5, 5 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Pvul og Xhol, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 /ig av et tryptofan-promoterdel-holdig DNA-fragment på omtrent 1,0 kb (Pvul-Xhol-fragment). In 40 μl of K-150 buffer (the same as Y-100 buffer except that 150 mM KCl replaces 100 mM NaCl), 3 μl of pCfTNS7 obtained in section 5, 5 units of each of the restriction enzymes Pvul and Xhol, and the cutting reaction were added was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, approximately 0.5 µg of a tryptophan promoter part-containing DNA fragment of approximately 1.0 kb (Pvul-Xhol fragment) was obtained by the LGT method.

Separat ble 3 fig av PCfBA32 oppnådd i avsnitt (1) oppløst i 4 0 fil K-150 buffer, 5 enheter av hver av restriksjonsenzymene Pvul og Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennom-ført ved 37°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 2 fig av et omtrent 3, 0 kb DNA-fragment (Xhol-Pvul-fragment) inneholdende det meste av hG-CSF cDNA. Separately, 3 µl of PCfBA32 obtained in section (1) was dissolved in 40 µl K-150 buffer, 5 units of each of the restriction enzymes Pvul and Xhol were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, 2 µg of an approximately 3.0 kb DNA fragment (Xhol-Pvul fragment) containing most of the hG-CSF cDNA was obtained by the LGT method.

Deretter ble 0,1 fig av det pCfTNS7-avledede Pvul-Xhol-fragment (omtrent 1,0 kb) og 0,3 fig av det pCfBA32-avledede Xhol-Pvul-fragment (omtrent 3,0 kb), hvert oppnådd på den ovennevnte måte, oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuf f er, 3 enheter av T4 DNA-ligase ble tilsatt, og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.1 µg of the pCfTNS7-derived Pvul-Xhol fragment (approximately 1.0 kb) and 0.3 µg of the pCfBA32-derived Xhol-Pvul fragment (approximately 3.0 kb) were each obtained on the above method, dissolved in 25 μl of T4 DNA ligase buffer, 3 units of T4 DNA ligase were added, and the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og det ble oppnådd en Ap<r->koloni og plasmid-DNA ble utvunnet fra denne koloni ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al. metode. Det ble således oppnådd pCfTB205 vist i fig. 15. The reaction mixture was used to transform E. coli HB101 and an Ap<r> colony was obtained and plasmid DNA was recovered from this colony using the above Birnboim et al. method. pCfTB205 shown in fig. was thus obtained. 15.

I aminosyresekvensen av det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTN205, mangler de 1. til 4. aminosyrer av moden hG-CSF. I det følgende refereres dette derivat til som hG-CSF(Al-4). In the amino acid sequence of the hG-CSF derivative encoded by pCfTN205, the 1st to 4th amino acids of mature hG-CSF are missing. In the following, this derivative is referred to as hG-CSF(Al-4).

(8) Konstruks-ion av pCfTAAra4 f jfr, f ia. 15) (8) Construction ion of pCfTAAra4 f cf, f ia. 15)

I 40 fil K-150 buffer ble det oppløst 3 fig pCfTAArg4S> oppnådd i avsnitt (6), 5 enheter av hver av restriksjonsenzymene Pvul og Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 /tg av et tryptof an-promoterdel-holdig DNA-fragment på omtrent 1,0 kb (Pvul-Xhol-fragment). In 40 μl of K-150 buffer, 3 μg of pCfTAArg4S> obtained in section (6) were dissolved, 5 units of each of the restriction enzymes Pvul and Xhol were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, about 0.5 µg of a tryptophan-promoter part-containing DNA fragment of about 1.0 kb (Pvul-Xhol fragment) was obtained by the LGT method.

Separat ble 3 fig av pCfBA32 oppnådd i avsnitt (1) oppløst i Separately, 3 µg of pCfBA32 obtained in section (1) were dissolved in

4 0 /ti K-15 0 buffer, 5 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Pvul og Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i l time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 2 /tg av et omtrent 3,0 kb DNA-fragment (Xhol-Pvul-fragment) inneholdende det meste av hG-CSF cDNA. 40 /ti K-150 buffer, 5 units of each of the restriction enzymes Pvul and Xhol were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, 2 µg of an approximately 3.0 kb DNA fragment (Xhol-Pvul fragment) containing most of the hG-CSF cDNA was obtained by the LGT method.

Deretter ble 0,1 fig av det pCfTAArg4S-avledede Pvul-Xhol-fragment (omtrent 1,0 kb) og 0,3 ( ig av det pCfBA32-avledede Xhol-Pvul-fragment (omtrent 3,0 kb), hvert oppnådd på den ovenstående måte, oppløst i 2 5 /ti T4 DNA-ligasebuf f er, 3 enheter T4 DNA-ligase ble tilsatt og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.1 µg of the pCfTAArg4S-derived Pvul-Xhol fragment (approximately 1.0 kb) and 0.3 µg of the pCfBA32-derived Xhol-Pvul fragment (approximately 3.0 kb), each obtained on the above manner, dissolved in 2 5 µl of T4 DNA ligase buffer, 3 units of T4 DNA ligase were added and the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Reaksjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. coli HB101, Ap<r->koloni ble oppnådd, og plasmid-DNA ble utvunnet fra denne koloni ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al. metode. På denne måte ble det oppnådd pCfTAArg4 vist i fig. 15. The reaction mixture was used to transform E. coli HB101, Ap<r> colony was obtained, and plasmid DNA was recovered from this colony using the above Birnboim et al. method. In this way, pCfTAArg4 shown in fig. 15.

Den 4. aminosyre i aminosyresekvensen av det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTAArg4 er Arg i stedet for Gly i moden hG-CSF. I det følgende benevnes dette derivat hG-GSF(Arg<4>). The 4th amino acid in the amino acid sequence of the hG-CSF derivative encoded by pCfTAArg4 is Arg instead of Gly in mature hG-CSF. In the following, this derivative is called hG-GSF(Arg<4>).

(9) Konstruks-ion av pCfTNS301 (jf r, fig. 16) (9) Construction of pCfTNS301 (cf. r, fig. 16)

I 50 /il Y-100 buffer ble det oppløst 6 /ig av pCfBAS oppnådd i avsnitt (1), 10 enheter av restriksjonsenzymet Hindlll og 8 enheter av Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,6 /tg av et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment på omtrent 1,4 kb (Hindlll-Bglll-fragment). In 50 µl of Y-100 buffer, 6 µg of pCfBAS obtained in section (1) was dissolved, 10 units of the restriction enzyme HindIII and 8 units of BglIII were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, approximately 0.6 µg of an hG-CSF cDNA-containing DNA fragment of approximately 1.4 kb (HindIII-BglIII fragment) was obtained by the LGT method.

Deretter ble følgende DNA-linker syntetisert: Then the following DNA linkers were synthesized:

Konstruksjonen av denne DNA-linker er slik at de 11 aminosyrer fra den første aminosyre Thr til den 11. aminosyre Gin i hG-CSF mangler i den N-terminale aminosyresekveris' som kodes for av denne linker. The construction of this DNA linker is such that the 11 amino acids from the first amino acid Thr to the 11th amino acid Gin in hG-CSF are missing in the N-terminal amino acid sequence coded for by this linker.

Først ble 27-mer og 29-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 27-mer og 29-mer (hver 2 iig) ble oppløst i totalt 40 [ il T4 kinasebuf f er, 3 0 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. Deretter ble 0,1 iig av det pCfBAS-avledede Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kb-fragment) og 0,1 iig av det pCfBA8-avledede Hindlll-Bglll-fragment (omtrent 1,4 kb-fragment), hvert oppnådd som nevnt i det foregående, oppløst i 25 [ il av T4 DNA-ligasebuffer og omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt blandingsoppiøsningen. Etter ytterligere tilsetning' av~ S"enheter" T4 DNA-ligase ble ligerings-reaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. First, 27-mer and 29-mer single-stranded DNAs were synthesized using the usual phosphotriester method. 27-mer and 29-mer (2 µg each) were dissolved in a total of 40 µl of T4 kinase buffer, 30 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) were added and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min. Then, 0.1 µg of the pCfBAS-derived BanIII-BglIII fragment (approximately 2.7 kb fragment) and 0.1 µg of the pCfBA8-derived HindIII-BglIII fragment (approximately 1.4 kb fragment), each obtained as mentioned above, dissolved in 25 µl of T4 DNA ligase buffer and about 2 picomoles of the above DNA linker were added to the mixture solution. After additional addition of ~S units of T4 DNA ligase, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den rekombinante plasmidblanding oppnådd på denne måte ble anvendt for transformering av E. coli HB101, og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Fra dyrkede celler i denne koloni ble det utvunnet plasmid-DNA. Det ble således oppnådd pCfTNS301. hG-CSF -derivat et som kodes for av pCfTNS3 0l benevnes i det følgende hG-CSF(Al-llS). The recombinant plasmid mixture thus obtained was used for transformation of E. coli HB101, and an Aβ colony was obtained. Plasmid DNA was recovered from cultured cells in this colony. pCfTNS301 was thus obtained. The hG-CSF derivative coded for by pCfTNS3 01 is named hG-CSF(A1-11S) in the following.

( 10) Konstruksjon av pCfTNS401 (jfr, fig. 16) ( 10) Construction of pCfTNS401 (cf. fig. 16)

'■Følgende DNA-linker ble syntetisert: '■The following DNA linkers were synthesized:

Konstruksjonen av denne DNA-linker er slik at de 7 aminosyrer fra den første aminosyre Thr til den 7. aminosyre Ser i hG-CSF mangler i den N-terminale aminosyresekvens som kodes for av denne linker. The construction of this DNA linker is such that the 7 amino acids from the first amino acid Thr to the 7th amino acid Ser in hG-CSF are missing in the N-terminal amino acid sequence coded for by this linker.

Først ble 39rmer og 41-mer enkelttrådede DNA' er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 39-mer og 41-mer (hver 2 itg) ble oppløst i totalt 4 0 /il T4 kinasebuf f er, 3 0 enheter T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. Deretter ble 0,1 itg av det pCfBAS-avledede Banlll-Bglll-fragment (omtrent 2,7 kb-fragment) og. 0,1 iig av det pCfBA8-avledede Hindlll-Bglll-fragment (omtrent 1,4 kb-fragment), hvert oppnådd som beskrevet i det foregående, oppløst i 25 /il T4 DNA-ligasebuf f er, og omtrent 2 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt denne blandingsoppløsning. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. First, 39-mer and 41-mer single-stranded DNA' were synthesized using the usual phosphotriester method. 39-mer and 41-mer (each 2 itg) were dissolved in a total of 40 µl of T4 kinase buffer, 30 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) were added and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min. Then, 0.1 µg of the pCfBAS-derived BanIII-BIII fragment (approximately 2.7 kb fragment) and. 0.1 µg of the pCfBA8-derived HindIII-BglIII fragment (approximately 1.4 kb fragment), each obtained as described above, dissolved in 25 µl of T4 DNA ligase buffer, and approximately 2 picomoles of the above DNA linker was added to this mixture solution. After further addition of 6 units of T4 DNA ligase, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den således oppnådde rekombinante plasmidblanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101, og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Plasmid-DNA ble utvunnet fra denne koloni. På denne måte ble det oppnådd pCfTNS401. The recombinant plasmid mixture thus obtained was used for transformation of E. coli HB101, and an Aβ colony was obtained. Plasmid DNA was recovered from this colony. In this way, pCfTNS401 was obtained.

hG-CSF-derivatet som kodes for av pCfTNS401 er i det følgende benevnt hG-CSF(Å1-7S). The hG-CSF derivative encoded by pCfTNS401 is hereinafter referred to as hG-CSF(Å1-7S).

(11) Konstruksjon av pCfTNS501 fjfr. fig. 12) (11) Construction of pCfTNS501 fjfr. fig. 12)

I 40/il Y-100 buffer ble det oppløst pCfBAS oppnådd i avsnitt In 40 µl Y-100 buffer was dissolved the pCfBAS obtained in section

(1) , 10 enheter restriksjonsenzym Xhol ble tilsatt og (1) , 10 units of restriction enzyme Xhol were added and

kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. DNA utvunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble oppløst i 30 /il Klenow-buf f er, 2 enheter DNA-polymerase I Klenow-fragment ble tilsatt og reaksjonen ble gjennomført ved 17°C i 30 min. DNA-polymerase I Klenow-fragmentet ble inaktivert ved 10 min. behandling ved 68°C, KC1 ble tilsatt til en konsentrasjon på 150 mM, 8 enheter av restriksjonsenzymet Pvul ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennom-ført ved 3 7°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. DNA recovered by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation was dissolved in 30 µl Klenow buffer, 2 units of DNA polymerase I Klenow fragment were added and the reaction was carried out at 17°C for 30 min. The DNA polymerase I Klenow fragment was inactivated at 10 min. treatment at 68°C, KCl was added to a concentration of 150 mM, 8 units of the restriction enzyme Pvul were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. Wood remained from the reaction mixture

hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 2 fig av et hG-CSF cDNA-holdig DNA-fragment på omtrent 3 kb (Xhol(buttende)-Pvul). using the LGT method obtained about 2 µg of an hG-CSF cDNA-containing DNA fragment of about 3 kb (Xhol(buttende)-Pvul).

Separat ble 5 fig av ATG-vektoren pTrS20 (3,8 kb) oppnådd ved prosedyren i undereksempel 4 oppløst i 50 til Y-0 buffer (Y-100.buffer minus 100 mM NaCl), 16 enheter av restriksjonsenzymet SacI ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. DNA utvunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble oppløst i 30 fil Klenow-buf f er, 2 enheter av DNA-polymerase I Klenow fragment ble tilsatt, og reaksjonen ble gjennomført ved 17°C i 30 min. DNA-polymerase I Klenow fragmentet ble inaktivert ved behandling ved 68°C i 10 min., KCl ble tilsatt til en konsentrasjon på 150 mM, 8 enheter av restriksjonsenzymet Pvul ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i l time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 itg av et Ptrp-holdig DNA-fragment på omtrent 1 kb (SacI(buttende)-Pvul). Separately, 5 µg of the ATG vector pTrS20 (3.8 kb) obtained by the procedure in Sub-Example 4 was dissolved in 50 to Y-0 buffer (Y-100 buffer minus 100 mM NaCl), 16 units of the restriction enzyme SacI were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 3 hours. DNA recovered by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation was dissolved in 30 μl of Klenow buffer, 2 units of DNA polymerase I Klenow fragment were added, and the reaction was carried out at 17°C for 30 min. The DNA polymerase I Klenow fragment was inactivated by treatment at 68°C for 10 min., KCl was added to a concentration of 150 mM, 8 units of the restriction enzyme Pvul were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, about 0.5 µg of a Ptrp-containing DNA fragment of about 1 kb (SacI(buttende)-Pvul) was obtained by the LGT method.

Deretter ble 0,1 fig av det pCfBAS-avledede Xhol(buttende)-Pvul-fragment (omtrent 3 kb) og 0,2 fig av det pTrS20-avledede SacI (butt-ende) -Pvul-fragment (omtrent 1 kb) oppløst i 25 fil T4 DNA-ligasebuffer, 3 enheter av T4 DNA-ligase ble tilsatt, og liger ingsreaks jonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. Next, 0.1 µg of the pCfBAS-derived Xhol(blunt)-Pvul fragment (approximately 3 kb) and 0.2 µg of the pTrS20-derived SacI (blunt-ended)-Pvul fragment (approximately 1 kb) were resolved in 25 μl of T4 DNA ligase buffer, 3 units of T4 DNA ligase were added, and the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Reaksjonsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli HB101, en Ap<r->koloni ble oppnådd, og plasmid-DNA ble utvunnet ved hjelp av den ovennevnte Birnboim et al. metode. Det ble således oppnådd pCfTNSSOl vist i fig. 12. The reaction mixture was used to transform E. coli HB101, an Ap<r> colony was obtained, and plasmid DNA was recovered using the above Birnboim et al. method. The pCfTNSSO1 shown in fig. was thus obtained. 12.

I det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTNSSOl, mangler 1. til 6. N-terminale aminosyrer i moden hG-CSF og den 17. aminosyre er Ser i stedet for Cys. Det hG-CSF-derivat som kodes for av pCfTNSSOl benevnes i det følgende hG-CSF(A1-6S). In the hG-CSF derivative encoded by pCfTNSSO1, the 1st to 6th N-terminal amino acids of mature hG-CSF are missing and the 17th amino acid is Ser instead of Cys. The hG-CSF derivative encoded by pCfTNSSO1 is named hG-CSF(A1-6S) in the following.

Eksempel 7 Example 7

(1) Konstruk sjon avpCfBlOl. p CfCC52. pCfCC59. pCfCD28 og pCfCD56 fjfr. fig. 8) . (1) Construction of pCfBlOl. on CfCC52. pCfCC59. pCfCD28 and pCfCD56 yr. fig. 8).

Først ble 3 fig pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2, 95 (1977)) oppløst i 40 til Y-100 buffer, 5 enheter av restriksjonsenzymet Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennom-ført ved 37°C i 1 time. DNA utvunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble oppløst i 20 til av en oppløsning inneholdende 33 mM Tris-eddiksyre (pH 7,9), 66 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat, 5 mM ditiotreitol, og dATP, dCTP, dGTP og dTTP (hver 0,4 mM) (i det følgende benevnt "T4 DNA polymerasebuffer") , l enhet av T4 DNA-polymerase (Takara Shuzo) ble tilsatt, og reaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 30 min. DNA utvunnet ved fenol-klorof ormekstraks jon og etanolut fell ing ble oppløst i 2 0 fil T4 DNA-ligasebuffer. Til denne blanding ble det tilsatt omtrent 8 pikomol av Bglll-linker DNA (Takara Shuzo; d(pC-A-G-A-T-C-T-G)). Etter ytterligere tilsetting av 6 enheter T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. DNA utvunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble oppløst i 40 fil Y-100 buffer, 10 enheter av restriksjonsenzymet EcoRI og 8 enheter av Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,9 iig av et tetracyklinresistens-gendel-holdig DNA-fragment på omtrent 3,6 kb (EcoRI-Bglll-fragment). First, 3 µg of pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2, 95 (1977)) were dissolved in 40 to Y-100 buffer, 5 units of the restriction enzyme Pstl were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour . DNA recovered by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation was dissolved in 20 µl of a solution containing 33 mM Tris-acetic acid (pH 7.9), 66 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 5 mM dithiothreitol, and dATP, dCTP, dGTP, and dTTP ( each 0.4 mM) (hereinafter referred to as "T4 DNA polymerase buffer"), 1 unit of T4 DNA polymerase (Takara Shuzo) was added, and the reaction was carried out at 37°C for 30 min. DNA extracted by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation was dissolved in 20 μl T4 DNA ligase buffer. To this mixture was added about 8 picomoles of BglII linker DNA (Takara Shuzo; d(pC-A-G-A-T-C-T-G)). After further addition of 6 units of T4 DNA ligase, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours. DNA recovered by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation was dissolved in 40 μl of Y-100 buffer, 10 units of the restriction enzyme EcoRI and 8 units of BglII were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, approximately 0.9 µg of a tetracycline resistance gene-containing DNA fragment of approximately 3.6 kb (EcoRI-Bglll fragment) was obtained by the LGT method.

Separat ble 3 .iig av pCfBBlOl oppnådd i eksempel 6-(2), pCfBC52 eller pCfBC59 oppnådd i eksempel 6-(3) eller pCfBD28 eller pCfBD56 oppnådd i eksempel 6- (4) oppløst i 10 ganger konsentrert Y-100 buffer, 5 enheter av restriksjonsenzymet EcoRI og 6 enheter Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 1 time. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,4 /ig av et HG-CSF cDNA-del-holdig DNA-fragment på omtrent 1,8 kb (EcoRI - Bglll-fragment) i hvert tifelle. Separately, 3 µg of pCfBBlOl obtained in Example 6-(2), pCfBC52 or pCfBC59 obtained in Example 6-(3) or pCfBD28 or pCfBD56 obtained in Example 6-(4) were dissolved in 10 times concentrated Y-100 buffer, 5 units of the restriction enzyme EcoRI and 6 units of BglII were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 1 hour. From the reaction mixture, approximately 0.4 µg of an HG-CSF cDNA part-containing DNA fragment of approximately 1.8 kb (EcoRI - BglII fragment) was obtained by the LGT method in each fold.

Fem rør som hvert inneholdt en oppløsning av omtrent 0,05 /ig av det pBR322-avledede EcoRI-BGlII-fragment (omtrent 3,6 kb) oppnådd som beskrevet ovenfor i 20 fil T4 DNA-ligasebuf fer ble fremstilt. Til rørene ble det tilsatt omtrent 0,1 fig av det pCfBBlOl-, pCfBC52-, pCfBC59-, pCfBD28-eller pCfBD56-avledede EcoRI-Bglll- fragment (omtrent 1,8 kb fragment} og etter ytterligere tilsetning av 4 enheter av T4 DNA-ligase ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. Five tubes each containing a solution of about 0.05 µg of the pBR322-derived EcoRI-BGlII fragment (about 3.6 kb) obtained as described above in 20 µl of T4 DNA ligase buffer were prepared. To the tubes was added approximately 0.1 µg of the pCfBBlOl-, pCfBC52-, pCfBC59-, pCfBD28-, or pCfBD56-derived EcoRI-Bglll fragment (approximately 1.8 kb fragment} and after additional addition of 4 units of T4 DNA -ligase, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

De rekombinante plasmidblandinger som ble oppnådd ble anvendt for å transformere E. coli HB101, og Tc<r->kolonier ble oppnådd. Fra dyrkede celler av.hver av disse kolonier ble plasmid-DNA utvunnet. Det ble således oppnådd pCfCBlOl, pCfCC52,. pCfCC59, pCfCD52 og pCfCD56, hver vist i fig. 8. Aminosyresekvensene av hG-CSF-derivatene som kodes for av disse plasmider er identiske med aminosyrene av de hG-CSF-derivater som kodes' for av henhv. pCfBBlOl, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD2 8 og pCfBD56. The recombinant plasmid mixtures obtained were used to transform E. coli HB101, and Tc<r> colonies were obtained. Plasmid DNA was recovered from cultured cells of each of these colonies. pCfCBlOl, pCfCC52, was thus obtained. pCfCC59, pCfCD52 and pCfCD56, each shown in Fig. 8. The amino acid sequences of the hG-CSF derivatives encoded by these plasmids are identical to the amino acids of the hG-CSF derivatives encoded by the respective pCfBB101, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28 and pCfBD56.

Eksempel 8 Example 8

Fremstilling og rensing av hG-CSF-derivater. Preparation and purification of hG-CSF derivatives.

E. coli W3110 strA-avledede transformanter (benevnt ECfTL23, ECfTL3S, ECfTL38, ECfTL41, ECfTM14, ECfTM17, ECfTM113, ECfBBlOl, ECfBC42Bl, ECfBC45, ECfBC52, ECfBC59, ECfBC76, ECfBC77, ECfBC93, ECfBC95, ECfBC97, ECfBD28, ECfBD56, ECfBD82, ECfTNS7, ECfTAArg4S, ECfTNS301, ECfTNS401, ECfTNSSOl, ECfBD28A17 og ECfBD28T17) som inneholdt de rekombinant plasmider (oppnådd i eksemplene 3, 4, 6 og 7) hhv. pCfTL2 3, pCfTL3 5, pCfTL3 8, pCfTL41, pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113, pCfBBlOl, pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTNS7, pCfAArg4S, pCfTNS301, pCfTN401, pCfTNSSOl, pCfBD28Al7 og pCfBD28T17 ble hver dyrket i LG medium (fremstilt ved oppløsning av 10 g Bactotrypton, 5 g gjærekstrakt, 5 g NaCl og 1 g glukose i 1 liter vann og innstilling av pH til 7,0 med NaOH} ved 37°C i 18 timer. En 5 ml porsjon av dyrkingsvæsken ble inokulert i 100 ml MCG-medium (0,6% Na2HP04, 0,3% KH2P04, 0,5% NaCl, 0,5% casamino-syrer, 1 mM MgS04, 4 ptg/ml vitamin Bx, pH 7,2) inneholdende 2 5 itg/ml tryptofan og 50 itg/ml ampicillin. Etter inkubasjon ved 3 0°C i 4-8 timer ble 10 fig/ ml 3 p-indol akryl syre (i det følgende IAA) , et tryptofan-indukksjonsmiddel, tilsatt og inkubasjon ble fortsatt i ytterligere 2-12 timer. Celler ble høstet ved å underkaste dyrkingskulturen for sentrifugering ved 8000 omdr./min. i 10 min. og vasket med 3 0 mM NaCl-3 0 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5). De vaskede celler ble suspendert i 30 ml av den ovennevnte buffer og deretter knust ved ultralydbehandling ved 0°C (BRANSON SONIC POWER COMPANY'S SONIFIER CELL DISRUPTOR 200, Output Control 2, 10 min.). Sentrifugering ved 9000 omdr./min. i 30 min. ga en cellerest-masse. Under anvendelse av metoden til Marston et al. (F.A.O. Marston et al.: BIO/TECHNOLOGY, 2 800 (1984)), ble hG-CSF-derivatet ekstrahert fra cellerestmassen, renset, oppløselig-gjort og regenerert. Proteinmengden ble bestemt ved å anvende "Nippon Bio-Rad laboratories<1> protein assay" bestemmelsessett (standard assaymetode) (M.M. Bradford: Anal. Biochem., 72, E. coli W3110 strA-derived transformants (termed ECfTL23, ECfTL3S, ECfTL38, ECfTL41, ECfTM14, ECfTM17, ECfTM113, ECfBBlOl, ECfBC42Bl, ECfBC45, ECfBC52, ECfBC59, ECfBC76, ECfBC77, ECfBD568, ECfBD82, ECfBD87 ECfTNS7, ECfTAArg4S, ECfTNS301, ECfTNS401, ECfTNSSO1, ECfBD28A17 and ECfBD28T17) which contained the recombinant plasmids (obtained in examples 3, 4, 6 and 7) respectively. pCfTL2 3, pCfTL3 5, pCfTL3 8, pCfTL41, pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113, pCfBBlOl, pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTNS7, pCfAArg4S, pCfTNS301, pCfTN401 , pCfTNSSOl, pCfBD28Al7 and pCfBD28T17 were each grown in LG medium (prepared by dissolving 10 g Bactotryptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl and 1 g glucose in 1 liter water and adjusting the pH to 7.0 with NaOH} at 37° C for 18 h. A 5 mL portion of the culture fluid was inoculated into 100 mL MCG medium (0.6% Na2HP04, 0.3% KH2PO4, 0.5% NaCl, 0.5% casamino acids, 1 mM MgSO4, 4 ptg/ml vitamin Bx, pH 7.2) containing 25 itg/ml tryptophan and 50 itg/ml ampicillin. After incubation at 30°C for 4-8 hours, 10 fig/ml 3 p-indole acrylic acid ( hereinafter IAA), a tryptophan inducer, was added and incubation was continued for an additional 2-12 h. Cells were harvested by subjecting the culture to centrifugation at 8000 rpm for 10 min and washing with 30 mM Na Cl-3 0 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). The washed cells were suspended in 30 ml of the above buffer and then disrupted by sonication at 0°C (BRANSON SONIC POWER COMPANY'S SONIFIER CELL DISRUPTOR 200, Output Control 2, 10 min.). Centrifugation at 9000 rpm. for 30 min. yielded a cell debris mass. Using the method of Marston et al. (F.A.O. Marston et al.: BIO/TECHNOLOGY, 2800 (1984)), the hG-CSF derivative was extracted from the cell debris, purified, solubilized and regenerated. The amount of protein was determined by using "Nippon Bio-Rad laboratories<1> protein assay" determination kit (standard assay method) (M.M. Bradford: Anal. Biochem., 72,

248 (1976)) . 248 (1976)).

G-CSF-aktiviteten ble bestemt på følgende måte. Benmargceller ble aseptisk samlet fra lårbenet fra C3H/He hannmus som var 8-12 uker gamle (Shizuoka Laboratory Animal Center) The G-CSF activity was determined as follows. Bone marrow cells were aseptically collected from the femurs of male C3H/He mice that were 8-12 weeks old (Shizuoka Laboratory Animal Center)

og suspendert i a-MEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Nylonull (Wako Pure Chemical Industries, Nylon Fiber 146-04231) (0,3 g) pakket i en kolonne ble impregnert med 1,5 ml av denne cellesuspensjon (omtrent 5 x IO<7> celler) , og reaksjonen fikk foregå i en 5% C02 inkubator ved 37°C i 90 min. Deretter ble a-MEM som var oppvarmet til 37°C på forhånd passert gjennom kolonnen og benmargceller som var uadsorberte på nylonullen ble oppnådd som en effluentfraksjon. Disse celler ble vasket en gang med a-MEM og innstilt til en forutbestemt konsentrasjon. and suspended in α-MEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Nylon wool (Wako Pure Chemical Industries, Nylon Fiber 146-04231) (0.3 g) packed in a column was impregnated with 1.5 ml of this cell suspension (about 5 x 10<7> cells), and the reaction was allowed to proceed in a 5% C02 incubator at 37°C for 90 min. Then, α-MEM preheated to 37°C was passed through the column and bone marrow cells unadsorbed on the nylon wool were obtained as an effluent fraction. These cells were washed once with α-MEM and adjusted to a predetermined concentration.

Deretter ble den myelopoetiske stamcelle-kolonidannende evne bestemt ved hjelp av metoden til Okabe et al. (Okabe, T. et al.: Cancer Research, 44 4503-4506 (1986)). Således ble 0,2 ml av margcellesuspensjonen fremstilt som ovenfor (2 x 10e celler/ml) blandet sammen med en blanding av 0,2 ml a-MEM, 0,4 ml FBS og 0,2 ml av hver 2-ganger fortynnet prøve. Et like stort volum (1,0 ml) av 0,6% agar (Difco, Agar renset nr. 0560-01) oppvarmet til 42°C ble blandet med blandingen og hele blandingen ble fordelt i 0,5 ml porsjoner i brønner på en 24-brønns plate (Munc's Multidish nr.143982) (5 x IO<4 >celler/brønn, n=3). Etter inkubasjon i en 5% C02 inkubator ved 37°C i 7 døgn ble kolonier som hver omfattet minst 4 0 celler talt under et mikroskop (Olympus x40). Etter kolonitellingen ble celler tatt ut på en glassplate med forsiktighet og fiksert med en aceton-formalin-blandet oppløsning i 30 sek. Etter esterase-dobbeltfarging av cellene ved hjelp av metoden til Kubota et al. (Kubota, K. et al.: Exp. Hematology, 8, 339-344 (1980)), ble hver koloni identifisert. Then, the myelopoietic stem cell colony-forming ability was determined using the method of Okabe et al. (Okabe, T. et al.: Cancer Research, 44 4503-4506 (1986)). Thus, 0.2 ml of the marrow cell suspension prepared as above (2 x 10e cells/ml) was mixed together with a mixture of 0.2 ml α-MEM, 0.4 ml FBS and 0.2 ml of each 2-fold diluted sample . An equal volume (1.0 ml) of 0.6% agar (Difco, Agar purified no. 0560-01) heated to 42°C was mixed with the mixture and the entire mixture was dispensed in 0.5 ml portions into wells of a 24-well plate (Munc's Multidish no.143982) (5 x 10<4 >cells/well, n=3). After incubation in a 5% CO 2 incubator at 37°C for 7 days, colonies each comprising at least 40 cells were counted under a microscope (Olympus x40). After colony counting, cells were carefully taken out on a glass plate and fixed with an acetone-formalin mixed solution for 30 sec. After esterase double staining of the cells using the method of Kubota et al. (Kubota, K. et al.: Exp. Hematology, 8, 339-344 (1980)), each colony was identified.

Potensen av hver prøve ble beregnet på basis av resultatet av tellingen for 2-ganger fortynningen i kolonidannelsesbestem-melsen på følgende måte. Aktiviteten som gir halvparten av den maksimale kolonidannelsesverdi for intakt G-CSF anvendt som standard ble definert som 50 enheter. Potensen' (i enheter) ble beregnet ved å multiplisere med 20, inklusive fortynningsfaktoren for hver prøve, for omdannelse til aktivitet pr.■milliliter. Den spesifikke aktivitet ble uttrykt som potens pr. vektenhet (mg) protein og følgelig i enheter/mg. The potency of each sample was calculated on the basis of the result of the count for the 2-fold dilution in the colony formation determination in the following manner. The activity giving half of the maximal colony formation value of intact G-CSF used as a standard was defined as 50 units. The potency' (in units) was calculated by multiplying by 20, including the dilution factor for each sample, to convert to activity per milliliter. The specific activity was expressed as potency per weight unit (mg) of protein and consequently in units/mg.

Potensene av intakt G-CSF og G-CSF derivater er vist i tabell 3 . The potencies of intact G-CSF and G-CSF derivatives are shown in table 3.

Eksempel 9 Example 9

Måling av aktiviteter av hG- CSF- derivater i forhold Measurement of activities of hG-CSF derivatives in relation

til humane benmaraceller to human bone marrow cells

Benmarg ble samlet fra hoftebenet til normale mennesker med alder 20-30 år. Et like stort volum a-MEM ble tilsatt dertil og blandet med benmargen. 4 ml av benmargen ble lagt på 3 ml Ficoll-Paque-oppløsning (Pharmacia Fine Chemicals, spesifikk vekt 1,077) og etter sentrifugering ved 400 x g i 30 min. ble cellene som forekom i midtlaget separert. Cellene ble vasket to ganger med- PBS (fremstilt ved å oppløse 8 g NaCl, 0,2 g KC1, 1,15 g Na 2HP04 °9 °'2 9 KH2P04 i vann til å danne l liter oppløsning) og deretter suspendert i a-MEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og cellekonsentrasjonen ble innstilt til høyst 2 x IO<6> celler/ml. En 10 ml porsjon av cellesuspensjonen ble anbragt i en plastskål (Falcon 3003) og inkubert i en 5% CO 2 inkubator ved 37°C i 90 min. Celler som var uadsorbert i plastskålen ble samlet, vasket en gang med a-MEM og etter innstilling av konsentrasjonen til et forut bestemt nivå, ble de underkastet human myelopoetisk stamcelle-vekstfremmende aktivitets- og kolonidannelses-tester. Således ble 10% FBS-supplert a-MEM fordelt i 100 [ il porsjoner i brønner i en 96-brønns.plan mikroplate (NUNC, 167 008) . Deretter ble prøver av hG-CSF og hG-CSF-derivater oppnådd ved metoden i eksempel 8 tilsatt i 100 [ Li porsjoner til brønner i den første rad. Etter grundig blanding ble 100 fil av hver blanding overført til en brønn i den andre rad for fremstilling av en 2-ganger fortynning. Dobbeltfortynning ble fortsatt på samme måte inntil den 12. rad (n=3). I en gruppe ble a-MEM alene anvendt som en negativ kontroll. Bone marrow was collected from the hip bone of normal people aged 20-30 years. An equal volume of α-MEM was added thereto and mixed with the bone marrow. 4 ml of the bone marrow was placed on 3 ml of Ficoll-Paque solution (Pharmacia Fine Chemicals, specific gravity 1.077) and after centrifugation at 400 x g for 30 min. the cells occurring in the middle layer were separated. The cells were washed twice with PBS (prepared by dissolving 8 g of NaCl, 0.2 g of KCl, 1.15 g of Na 2 HPO 4 °9 °'2 9 KH 2 PO 4 in water to form 1 liter of solution) and then suspended in a -MEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and the cell concentration was adjusted to a maximum of 2 x 10<6> cells/ml. A 10 ml portion of the cell suspension was placed in a plastic dish (Falcon 3003) and incubated in a 5% CO 2 incubator at 37°C for 90 min. Cells unadsorbed in the plastic dish were collected, washed once with α-MEM and after adjusting the concentration to a predetermined level, they were subjected to human myelopoietic stem cell growth-promoting activity and colony formation tests. Thus, 10% FBS-supplemented α-MEM was distributed in 100 µl portions in wells in a 96-well flat microplate (NUNC, 167 008). Subsequently, samples of hG-CSF and hG-CSF derivatives obtained by the method in example 8 were added in 100 µl portions to wells in the first row. After thorough mixing, 100 μl of each mixture was transferred to a well in the second row to prepare a 2-fold dilution. Double dilution was continued in the same way until the 12th row (n=3). In one group, α-MEM alone was used as a negative control.

Deretter ble 100 [ il (5 x 10<4> eukaryotiske celler) av benmargscellesuspensjonen fremstilt som beskrevet i det foregående utsådd i hver brønn. Inkubasjon ble gjennomført i en 5% C02-inkubator ved 37°C i 3 døgn. Under 20 timers perioden som gikk foran de siste 18 timer, ble 20 [ il 6-<3>H-tymidin (Amersham Japan, kode TRK61, 107 mci/mg) tilsatt. Celler ble isolert på et glassfilter under anvendelse av en cellehøster (Labo-Science), tørket og målt med hensyn til radioaktivitet opptatt av cellene under anvendelse av en væskescintillasjonsteller (Packard, Tricarb 3320). Then 100 µl (5 x 10<4> eukaryotic cells) of the bone marrow cell suspension prepared as described above was seeded into each well. Incubation was carried out in a 5% C02 incubator at 37°C for 3 days. During the 20 hour period preceding the last 18 hours, 20 [mu]l of 6-<3>H-thymidine (Amersham Japan, code TRK61, 107 mci/mg) was added. Cells were isolated on a glass filter using a cell harvester (Labo-Science), dried and measured for radioactivity taken up by the cells using a liquid scintillation counter (Packard, Tricarb 3320).

På den annen side ble den humane myeolopoetiske stamcelle-kolonidannelsesbestemmelsen og koloniidentifiseringen gjennomført som beskrevet i eksempel 8. On the other hand, the human myelopoietic stem cell colony formation assay and colony identification were carried out as described in Example 8.

For å beregne potensen av hver prøve ble aktiviteten som kunne bevirke dannelse'av en koloni definert som en enhet. Således ble halv maksimal verdi (halvparten av den maksimale opptagningsverdi) bestemt basert på dose-responskurven som viste linearitet for resultatene ved tellingen i dobbelt-fortynningsrekken, og potensen av hver prøve ble beregnet. To calculate the potency of each sample, the activity capable of causing the formation of a colony was defined as a unit. Thus, the half-maximum value (half of the maximum uptake value) was determined based on the dose-response curve showing linearity for the results of the counting in the double-dilution series, and the potency of each sample was calculated.

Den spesifikke aktivitet ble uttrykt som potens pr. vektenhet (mg) protein, dvs. i enheter/mg. The specific activity was expressed as potency per weight unit (mg) of protein, i.e. in units/mg.

Potensene for intakt hG-CSF og hG-CSF-derivater er vist i tabell 4. The potencies of intact hG-CSF and hG-CSF derivatives are shown in Table 4.

Eksempel XQ Example XQ

Fremstilling av hG- CSF- derivat som mangler de N- terminale 1. til 7. aminosyrer oa med serin som 17. a minosyre fi det følgende benevnt M- 7S) Production of an hG-CSF derivative lacking the N-terminal 1st to 7th amino acids, among other things with serine as the 17th amino acid (hereinafter referred to as M-7S)

Til 50 ml 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (a) vist i tabell 2 (132 fig/ ral) som oppnådd ved dyrking av E. coli-stammen (ECfBC59) som inneholdt det rekombinante plasmid pCfBC59 oppnådd i eksempel 6, etterfulgt av rensing, ble det tilsatt 0,7 iig subtilisin BPN' (8,5 enheter/mg protein) (Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 40 timer. Etter 3-ganger fortynning med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ble inkubasjonsblandingen tilført en DEAE-Toypearl 650M (Toyo Soda Manufacturing) kolonne (1,7 cm x 4,4 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i en strøm-ningstakt på 10 ml/time. Deretter ble 20 ml av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ført gjennom kolonnen med en strømnings-takt på 5 ml/time. Deretter ble eluering foretatt med et buffersystem av 10 mM Tris-HCl som viste en lineær NaCl-konsentrasjonsgradient på fra 0 M til 0,4 M ved den samme strømningstakt (totalt eluentvolum 50 ml). M-7S-derivåtet ble eluért ved NaCl-konsentrasjoner på 100-150 mM (utbytte 0,7 mg eller 10%). Renheten var minst 90%. To 50 ml of 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl solution (pH 8.0) containing the derivative (a) shown in Table 2 (132 µg/ral) as obtained by culturing the E. coli strain (ECfBC59) containing to the recombinant plasmid pCfBC59 obtained in Example 6, followed by purification, 0.7 µg of subtilisin BPN' (8.5 units/mg protein) (Sigma) was added and incubation was carried out at 25°C for 40 hours. After 3-fold dilution with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), the incubation mixture was applied to a DEAE-Toypearl 650M (Toyo Soda Manufacturing) column (1.7 cm x 4.4 cm) filled with 10 mM Tris-HCl ( pH 8.0) at a flow rate of 10 ml/hour. Then 20 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was passed through the column at a flow rate of 5 ml/hour. Then, elution was carried out with a buffer system of 10 mM Tris-HCl which showed a linear NaCl concentration gradient of from 0 M to 0.4 M at the same flow rate (total eluent volume 50 ml). The M-7S derivative was eluted at NaCl concentrations of 100-150 mM (yield 0.7 mg or 10%). The purity was at least 90%.

Eksempel 11 Example 11

Fremstilling av M-7S Production of the M-7S

Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (b) vist i tabell 2 (132 iig/ml) som oppnådd ved dyrking av E. coli stammen (ECfBC59) som inneholdt det rekombinante plasmid pCfBC5 9 oppnådd i eksempel 6, fulgt av rensing, ble det tilsatt 0,7 iig subtilisin BPN' To 50 ml of a 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl solution (pH 8.0) containing the derivative (b) shown in Table 2 (132 µg/ml) as obtained by culturing the E. coli strain (ECfBC59) as contained the recombinant plasmid pCfBC5 9 obtained in Example 6, followed by purification, 0.7 µg of subtilisin BPN' was added

(8,5 enheter/mg protein) (Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 2 5°C i 14 timer. Etter 3-ganger fortynning med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ble inkubasjonsblandingen tilført en DEAE-Toyopera1 650M (Toyo Soda Manufacturing) kolonne (1,7 cm x 4,4 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) med en strøm-ningstakt på 10 ml/time. Deretter ble 20 ml 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) ført gjennom kolonnen med en strømningstakt på 5 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført fra 0 M til 0,4 M ved samme strømningstakt (totalt eluentvolum 50 ml). M-7S-derivatet ble eluert ved NaCl-konsentrasjoner på 100-150 mM (utbytte 4,2 mg éller 63%). Renheten var minst 90%. (8.5 units/mg protein) (Sigma) and incubation was carried out at 25°C for 14 hours. After 3-fold dilution with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), the incubation mixture was applied to a DEAE-Toyopera1 650M (Toyo Soda Manufacturing) column (1.7 cm x 4.4 cm) filled with 10 mM Tris-HCl ( pH 8.0) with a flow rate of 10 ml/hour. Then 20 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) was passed through the column at a flow rate of 5 ml/hour. Elution was then carried out from 0 M to 0.4 M at the same flow rate (total eluent volume 50 ml). The M-7S derivative was eluted at NaCl concentrations of 100-150 mM (yield 4.2 mg or 63%). The purity was at least 90%.

Eksempel 3.2 Example 3.2

Fremstilling av M- 7S Production of M-7S

Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (d) vist i tabell 2 (132 iig/ml) som oppnådd ved dyrking av E.■coli-stammen (ECfTAArg4) som inneholdt det rekombinante plasmid pCfTAArg4 oppnådd i eksempel 6, etterfulgt av rensing, ble det tilsatt 0,7 fig subtilisin BPN' (8,5 enheter/mg protein) (Sigma) og inkubasjonen ble gjennomført ved 25°C i 40 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen med en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering foretatt med et totalt volum på 30 ml 10 mM Tris-HCl-0,5 M NaCl-buffer på en lineær pH-gradient fra 8,0 til 6,0 ved den samme strømningstakt. M-7S-derivatet ble eluert i nærheten av pH 7,0 (utbytte 0,6 mg eller 9%) . Renheten var minst 90%. To 50 ml of a 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl solution (pH 8.0) containing the derivative (d) shown in Table 2 (132 µg/ml) as obtained by culturing the E.■coli strain (ECfTAArg4 ) containing the recombinant plasmid pCfTAArg4 obtained in Example 6, followed by purification, 0.7 µg subtilisin BPN' (8.5 units/mg protein) (Sigma) was added and the incubation was carried out at 25°C for 40 hours. After adjusting the NaCl concentration to 0.5 M, the incubation mixture was applied to a Zn-chelate Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) column (1.7 cm x 2.6 cm) filled with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)- 0.5 M NaCl at a flow rate of 6 ml/hr. Then 12 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)-0.5 M NaCl was passed through the column at a flow rate of 3 ml/h. Then, elution was performed with a total volume of 30 ml of 10 mM Tris-HCl-0.5 M NaCl buffer on a linear pH gradient from 8.0 to 6.0 at the same flow rate. The M-7S derivative eluted near pH 7.0 (yield 0.6 mg or 9%). The purity was at least 90%.

Eksempel 13 Example 13

Fremstilling av hG- CSF derivat som mangler de N- terminale Preparation of hG-CSF derivative lacking the N-terminals

1. til 6. aminosyrer oa som har serin som 17. 1st to 6th amino acids and others that have serine as 17.

aminosyre fi det følgende benevnt M-6S) amino acid fi hereinafter referred to as M-6S)

Til 50 ml av en oppløsning av derivatet (a) vist i tabell 2 (132 iig/ml) i 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl (pH 8,0), tilsettes 0,7 ttg subtilisin BPN' (8,5 enheter/mg protein) (Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 2 timer. Etter tre-ganger fortynning med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ble inkubasjonsblandingen tilført en DEAE-Toyopearl 650M (Toyo Soda) kolonne (1,7 cm x 4,4 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ved en strømningstakt på 10 ml/time. Deretter ble 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ført gjennom kolonnen ved en strøm-ningstakt på 5 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført med et totalt volum på 50 ml av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) som viste en lineær NaCl-konsentrasjonsgradient fra . 0 M til 0,4 M ved den samme strømningstakten. M-6S derivatet ble eluert ved NaCl-konsentrasjoner på 100-150 mM (utbytte 2,6 mg eller 4 0%). Renheten var minst 90%. To 50 ml of a solution of the derivative (a) shown in Table 2 (132 µg/ml) in 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl (pH 8.0) is added 0.7 ttg of subtilisin BPN' (8.5 units/mg protein) (Sigma) and incubation was carried out at 25°C for 2 hours. After three-fold dilution with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), the incubation mixture was applied to a DEAE-Toyopearl 650M (Toyo Soda) column (1.7 cm x 4.4 cm) filled with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) at a flow rate of 10 ml/hour. Then 20 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was passed through the column at a flow rate of 5 ml/hour. Then, elution was carried out with a total volume of 50 ml of a buffer system of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) which showed a linear NaCl concentration gradient from . 0 M to 0.4 M at the same flow rate. The M-6S derivative was eluted at NaCl concentrations of 100-150 mM (yield 2.6 mg or 40%). The purity was at least 90%.

Eksempel 14 Example 14

Fremstilling .av M-6S Manufacture .of M-6S

Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (a) vist i tabell 2 (132 iig/ml) ble det tilsatt 0,7 fig' "Epolozyme" (4120 enheter/mg protein) To 50 ml of a 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl solution (pH 8.0) containing the derivative (a) shown in Table 2 (132 µg/ml) was added 0.7 µg of "Epolozyme" (4120 units/mg protein)

(Kyowa Hakko Kogyo) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 20 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M, ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført med et totalt volum på 30 ml 10 mM Tris-HCl-0,5 M NaCl-buffer på en lineær pH-gradient på fra 0,8 til 6,0 ved den samme strømningstakt. M-6S-derivatet ble eluert i nærheten av pH 7,0 (utbytte 2,5 mg eller 38%). Renheten var minst 90%. (Kyowa Hakko Kogyo) and incubation was carried out at 25°C for 20 hours. After adjusting the NaCl concentration to 0.5 M, the incubation mixture was applied to a Zn-chelate-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) column (1.7 cm x 2.6 cm) filled with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 )-0.5 M NaCl at a flow rate of 6 ml/hr. Then 12 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)-0.5 M NaCl was passed through the column at a flow rate of 3 ml/hr. Then, elution was carried out with a total volume of 30 ml of 10 mM Tris-HCl-0.5 M NaCl buffer on a linear pH gradient from 0.8 to 6.0 at the same flow rate. The M-6S derivative eluted near pH 7.0 (yield 2.5 mg or 38%). The purity was at least 90%.

Eksempel 15 Example 15

Fremstilling av M- 6S Production of M-6S

Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (b) vist i tabell 2 (132 iig/ml) ble det tilsatt 0,7 /ig subtilisin amylosacchalyticus, og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 20 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8.,0)-0,5 M NaCl passert gjennom kolonnen med en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført med et totalt volum på 3 0 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0}-0,5.M NaCl-buffer på en lineær pH-gradient på fra 8,0 til 6,0 ved samme strømningshastignet. M-6S-derivatet ble eluert i nærheten av pH 7,0 {utbytte 2,5 mg eller 38%). Renheten var minst 90%. To 50 ml of a 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl solution (pH 8.0) containing the derivative (b) shown in Table 2 (132 µg/ml) was added 0.7 µg of subtilisin amylosacchalyticus, and incubation was carried out at 25°C for 20 hours. After setting the NaCl concentration to 0.5 M, the incubation mixture was applied to a Zn-chelate-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) column (1.7 cm x 2.6 cm) filled with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) -0.5 M NaCl at a flow rate of 6 ml/hr. Then 12 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)-0.5 M NaCl was passed through the column at a flow rate of 3 ml/hour. Then, elution was carried out with a total volume of 30 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-0.5 M NaCl buffer) on a linear pH gradient from 8.0 to 6.0 at the same flow rate The M-6S derivative was eluted near pH 7.0 {yield 2.5 mg or 38%). The purity was at least 90%.

Eksempel 16 Example 16

Fremstilling av M-6S Production of the M-6S

Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM KaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet {d) vist i tabell 2 (132 itg/ml) ble det tilsatt 0,7 itg subtilisin Carlsberg {0,034 enhet/mg protein) (NOVO), og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 20 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering foretatt med et totalt volum på 30 ml av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl-0,5 M NaCl som viste en lineær pH-gradient på fra 8,0 til 6,0 ved samme strømningstakt. M-6S-derivatet ble eluert i nærheten av pH 7,0 (utbytte 3 mg eller 45%). Renheten var minst 90%. To 50 ml of a 10 mM Tris-HCl-100 mM KaCl solution (pH 8.0) containing the derivative {d) shown in Table 2 (132 itg/ml) was added 0.7 itg subtilisin Carlsberg {0.034 unit/ mg protein) (NOVO), and incubation was carried out at 25°C for 20 hours. After adjusting the NaCl concentration to 0.5 M, the incubation mixture was applied to a Zn-chelate-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) column (1.7 cm x 2.6 cm) at a flow rate of 6 ml/hr. Then 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)-0.5 M NaCl was passed through the column at a flow rate of 3 ml/hr. Elution was then carried out with a total volume of 30 ml of a buffer system of 10 mM Tris-HCl-0.5 M NaCl which showed a linear pH gradient of from 8.0 to 6.0 at the same flow rate. The M-6S derivative eluted near pH 7.0 (yield 3 mg or 45%). The purity was at least 90%.

Eksempel 17 Example 17

Fremstilling av M-6S Production of the M-6S

Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (a) vist i tabell 2 (132 iig/ml) tilsettes 0,7 jig proteinase K (0,027 enhet/mg protein) To 50 ml of a 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl solution (pH 8.0) containing the derivative (a) shown in Table 2 (132 µg/ml) is added 0.7 µg proteinase K (0.027 unit/mg protein )

(Sigma), og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 40 timer. Etter 3-ganger fortynning med 10 mM Tris-HCl {pH 8,0) (Sigma), and incubation was carried out at 25°C for 40 hours. After 3-fold dilution with 10 mM Tris-HCl {pH 8.0)

ble inkubasjonsblandingen tilført en DEAE-Toyopear1 65OM (Toyo Soda) kolonne {1,7 cm x 4,4 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ved en strømningstakt på 10 ml/time. Deretter ble 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 5 ml/time. Deretter ble eluering foretatt med et totalt volum av 50 ml av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og viste en lineær NaCl-konsentrasjonsgradient på fra 0 M til 0,4 M ved den samme strømningstakt. M-6S-derivatet ble eluert ved NaCl-konsentrasjoner på 100-150 tnM (utbytte 2,6 mg eller 39%). Renheten var minst 90%. the incubation mixture was added to a DEAE-Toyopear1 65OM (Toyo Soda) column {1.7 cm x 4.4 cm) filled with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) at a flow rate of 10 ml/hr. Then 20 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was passed through the column at a flow rate of 5 ml/hour. Then, elution was carried out with a total volume of 50 ml of a buffer system of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and showed a linear NaCl concentration gradient of from 0 M to 0.4 M at the same flow rate. The M-6S derivative was eluted at NaCl concentrations of 100-150 tnM (yield 2.6 mg or 39%). The purity was at least 90%.

Eksempel 18 Example 18

Fremstilling av hG-CSF-derivat som mangle r de N- terminale l. til 5. aminosyrer og som har ser in som 17. amino- Preparation of hG-CSF derivative which lacks the N-terminal 1st to 5th amino acids and which has as in the 17th amino-

syre ( i det følgende benevnt M- 5S) acid (hereinafter referred to as M-5S)

Til 50 ml av en 100 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning {pH 8,0) inneholdende derivatet (b) vist i tabell 1 (132 iig/ml) tilsettes 0,5 iig trypsin {267 enheter/mg protein) {Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 10 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M, ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført med et totalt volum på 30 ml av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl som viste en lineær imidazol-konsentrasjonsgradient på fra 0 M til 0,3 M ved den samme strømningstakt. M-5S derivatet ble eluert ved 0,1 M imidazol (utbytte 2,7 mg eller 41%). Renheten var minst 90%. To 50 ml of a 100 mM Tris-HCl-100 mM NaCl solution {pH 8.0) containing the derivative (b) shown in Table 1 (132 µg/ml) is added 0.5 µg of trypsin {267 units/mg protein) {Sigma) and incubation was carried out at 25°C for 10 hours. After adjusting the NaCl concentration to 0.5 M, the incubation mixture was applied to a Zn-chelate-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) column (1.7 cm x 2.6 cm) filled with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 )-0.5 M NaCl at a flow rate of 6 ml/hr. Then 12 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)-0.5 M NaCl was passed through the column at a flow rate of 3 ml/hr. Then, elution was carried out with a total volume of 30 ml of a buffer system of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)-0.5 M NaCl which showed a linear imidazole concentration gradient of from 0 M to 0.3 M at the same flow rate. The M-5S derivative was eluted with 0.1 M imidazole (yield 2.7 mg or 41%). The purity was at least 90%.

Eksempel 19 Example 19

Fremstilling av hG- CSF- derivat som mangler de N- terminale 1. til 4. aminosyr er og som har serin som 17. amino- Preparation of hG-CSF derivative lacking the N-terminal 1st to 4th amino acids and having serine as the 17th amino-

syre ( i det følgende benevnt M- 4S) acid (hereinafter referred to as M-4S)

Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl-oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (d) vist i tabell 1 (132 fig/ ml) ble det tilsatt 5 fig trypsin (267 enheter/mg protein) (Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 20 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering foretatt med et totalt volum på 3 0 ml av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl som viste en lineær imidazolkonsentrasjonsgradient på fra 0 M til 0,3.M ved den samme strømningstakt. M-4S-derivatet ble eluert ved 0,1 M imidazol {utbytte 2,7 mg eller 41%). Renheten var minst 90%. To 50 ml of a 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl solution (pH 8.0) containing the derivative (d) shown in Table 1 (132 µg/ml) was added 5 µg of trypsin (267 units/mg protein) (Sigma) and incubation was carried out at 25°C for 20 hours. After setting the NaCl concentration to 0.5 M, the incubation mixture was applied to a Zn-chelate-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) column (1.7 cm x 2.6 cm) filled with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) -0.5 M NaCl at a flow rate of 6 ml/hr. Then 12 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)-0.5 M NaCl was passed through the column at a flow rate of 3 ml/hr. Then, elution was carried out with a total volume of 30 ml of a buffer system of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)-0.5 M NaCl which showed a linear imidazole concentration gradient of from 0 M to 0.3 M at the same flow rate. The M-4S derivative was eluted with 0.1 M imidazole (yield 2.7 mg or 41%). The purity was at least 90%.

Eksempel 2 0 Example 2 0

Fremstilling av M-4S Production of M-4S

Til 50 ml av en 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl oppløsning (pH 8,0) inneholdende derivatet (d) vist i tabell 2 (132 /ig/ml) ble det tilsatt 5 iig a-chymotrypsin (267 enheter/mg protein) To 50 ml of a 10 mM Tris-HCl-100 mM NaCl solution (pH 8.0) containing the derivative (d) shown in Table 2 (132 µg/ml) was added 5 µg of α-chymotrypsin (267 units/mg protein)

(Sigma) og inkubasjon ble gjennomført ved 25°C i 40 timer. Etter innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,5 ble inkubasjonsblandingen tilført en Zn-chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) kolonne (1,7 cm x 2,6 cm) fylt med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ved en strømningstakt på 6 ml/time. Deretter ble 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl ført gjennom kolonnen ved en strømningstakt på 3 ml/time. Deretter ble eluering gjennomført med totalt 30 ml (Sigma) and incubation was carried out at 25°C for 40 hours. After setting the NaCl concentration to 0.5, the incubation mixture was added to a Zn-chelate-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) column (1.7 cm x 2.6 cm) filled with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)- 0.5 M NaCl at a flow rate of 6 ml/hr. Then 12 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)-0.5 M NaCl was passed through the column at a flow rate of 3 ml/hr. Elution was then carried out with a total of 30 ml

av et buffersystem av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-0,5 M NaCl som viste en lineær imidazolkonsentrasjonsgradient på fra 0 M til 0,3 M ved den samme strømningstakt. M-4S-derivatet ble eluert ved 0,1 M imidazol (utbytte 2,3 mg eller 35%). Renheten var minst 90%. of a buffer system of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)-0.5 M NaCl which showed a linear imidazole concentration gradient from 0 M to 0.3 M at the same flow rate. The M-4S derivative was eluted with 0.1 M imidazole (yield 2.3 mg or 35%). The purity was at least 90%.

Eksempel 21 Example 21

Som det fremgår fra eksemplene 10-2 0 kan det oppnås hG-CSF-derivater som har serin som en erstatning for den 17. aminosyre og som mangler 4 (M-4S), 5 (M-5S), 6 (M-6S) og 7 (M-7S) N-terminale aminosyrer. Anvendelse av rekombinant DNA-teknologi resulterer generelt i addisjon av metionin til den N-terminale ende, og dette er ett av de ufordelaktige trekk ved rekombinante produkter. I motsetning til dette er bruken av den enzymatiske spaltningsteknikk i samsvar med oppfinnelsen fordelaktig ettersom slike produkter kan fremstilles uten addisjon av metionin til den N-terminale ende. Derivatene oppnådd på denne måte ble analysert med hensyn til G-CSF-aktivitet for sammenligning. Resultatene som ble oppnådd er vist i tabell 5. As can be seen from Examples 10-20, hG-CSF derivatives can be obtained which have serine as a replacement for the 17th amino acid and which lack 4 (M-4S), 5 (M-5S), 6 (M-6S ) and 7 (M-7S) N-terminal amino acids. Application of recombinant DNA technology generally results in the addition of methionine to the N-terminal end, and this is one of the disadvantageous features of recombinant products. In contrast, the use of the enzymatic cleavage technique according to the invention is advantageous as such products can be prepared without the addition of methionine to the N-terminal end. The derivatives thus obtained were analyzed for G-CSF activity for comparison. The results obtained are shown in Table 5.

Tabell 5 Table 5

Aktivitetssammenligning blant G-CSF-derivater dannet ved den enzymatiske kuttingsteknikk. Activity comparison among G-CSF derivatives formed by the enzymatic cleavage technique.

Fra resultatene vist i tabell 5 ble det funnet at ved den ovennevnte in vitro bedømmelse, har derivatene som mangler de 4-7 N-terminale aminosyrer en 2-4 ganger høyere aktivitet sammenlignet med intakt hG-CSF. From the results shown in Table 5, it was found that in the above in vitro evaluation, the derivatives lacking the 4-7 N-terminal amino acids have a 2-4 times higher activity compared to intact hG-CSF.

Derivatene som mangler de N-terminale aminosyrer som kan fremstilles i samsvar med den foreliggende oppfinnelse har derfor ikke noe metionin addert til den N-terminale ende og har 2- til 4 ganger høyere aktivitet enn det intakte produkt. The derivatives which lack the N-terminal amino acids which can be prepared in accordance with the present invention therefore have no methionine added to the N-terminal end and have 2 to 4 times higher activity than the intact product.

De følgende testeksempler illustrerer mottakelighet for spaltning med hydrolytiske enzymer som et resultat av mutasjon i den N-terminale del. The following test examples illustrate susceptibility to cleavage by hydrolytic enzymes as a result of mutation in the N-terminal portion.

Testeksempel 1 Test example 1

Sammenli<g>nin<g> i reaktivitet med subtilis in Carlsberg mellom intakt hG- CSF og N-terminale mutanter av hG-CSF Comparison of reactivity with subtilis in Carlsberg between intact hG-CSF and N-terminal mutants of hG-CSF

Derivatene vist i tabell 2 og intakt hG-CSF ble hver inkubert i nærvær av 3,6 x 10~<4> enheter/mg G-CSF av subtilisin Carlsberg {NOVO) ved 25°C i 14 timer på samme måte som i eksempel 16. Mens derivatene vist i tabell 2 ga M-6S derivatet, forble intakt hG-CSF ureagert. Videre, selv når dette enzym ble anvendt i en 100-ganger så stor mengde (3,6 x IO"<2> enheter/mg G-CSF), frembragte det intakte produkt ikke fli-es, men undergikk foretrukket totale spaltningsreaksjoner. The derivatives shown in Table 2 and intact hG-CSF were each incubated in the presence of 3.6 x 10~<4> units/mg G-CSF of subtilisin Carlsberg {NOVO) at 25°C for 14 hours in the same manner as in Example 16. While the derivatives shown in Table 2 gave the M-6S derivative, intact hG-CSF remained unreacted. Furthermore, even when this enzyme was used in a 100-fold amount (3.6 x 10"<2> units/mg G-CSF), the intact product did not produce fli-es, but preferentially underwent total cleavage reactions.

Testeksempel 2 Test example 2

Sammenligning i reaktivitet med tr<yp>sin mellom intakt hG- CSF oa N-terminale mutanter av hG-CSF Comparison of reactivity with tr<yp>sin between intact hG-CSF and N-terminal mutants of hG-CSF

Derivatet (a) vist i tabell 2 og intakt hG-CSF ble hver inkubert i nærvær av 0,22 enheter/mg G-CSF av trypsin (Sigma) ved 25°C i 20 timer. Mens derivatet (a) vist i tabell 2 ga M-4S derivatet, forble.det intakte hG-CSF ureagert. Videre, selv når enzymet ble anvendt i en 100-ganger så stor mengde (22 enheter/mg G-CSF) ga det intakte hG-CSF ikke M-4S, men undergikk foretrukket totale spaltningsreaksjoner. The derivative (a) shown in Table 2 and intact hG-CSF were each incubated in the presence of 0.22 units/mg G-CSF of trypsin (Sigma) at 25°C for 20 hours. While the derivative (a) shown in Table 2 gave the M-4S derivative, the intact hG-CSF remained unreacted. Furthermore, even when the enzyme was used in a 100-fold amount (22 units/mg G-CSF), the intact hG-CSF did not yield M-4S, but preferentially underwent total cleavage reactions.

Testeksempel 3 Test example 3

Varmestabilitet av hG- CSF derivater Heat stability of hG-CSF derivatives

En 2 0 /xg porsjon av hvert av de forskjellige derivater vist i tabell 6 ble oppløst i l ml fosfatbufret fysiologisk salt-løsning (PBS) (pH 7,2) eller a-MEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Inkubasjon ble gjennomført ved 56°C og prøver ble samlet ved tidsbestemte mellomrom og analysert for CSF aktivitet ved kolonidannelsestesting under anvendelse av mus-benmargceller (den ovennevnte metode til Okabe et al.). Hver prøve ble fortynnet ved dobbelt-fortynningsmetoden fra 4 0 mg/ml til å gi 10 fortynningsnivåer. For hvert nivå ble aktivitetsbestemmeIser gjennomført og restaktiviteten ble bestemt ved å sammenligne aktiviteten ved en viss konsentrasjon med god dose-respons, med tilsvarende for oppvarming (0 min.). A 20 µg portion of each of the different derivatives shown in Table 6 was dissolved in 1 ml of phosphate-buffered physiological salt solution (PBS) (pH 7.2) or α-MEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Incubation was carried out at 56°C and samples were collected at timed intervals and analyzed for CSF activity by colony formation assay using mouse bone marrow cells (the above method of Okabe et al.). Each sample was diluted by the two-fold dilution method from 40 mg/ml to give 10 dilution levels. For each level, activity determinations were carried out and the residual activity was determined by comparing the activity at a certain concentration with a good dose response, with the equivalent for heating (0 min.).

Data for restaktiviteten (tilsvarende den termiske stabilitet) oppnådd i PBS og i 10% FBS supplert a-MEM er vist i hhv. tabell 6 (A) og tabell 6(B). Data for the residual activity (corresponding to the thermal stability) obtained in PBS and in 10% FBS supplemented with α-MEM are shown respectively in table 6 (A) and table 6(B).

Eksempel 23 Example 23

Konstru ksjon av pCfBD2 8A17 oa CfBD28T17 under anvendelse av setespesifikk mutagenese (jfr, f ig. 17) (a) Konstruksjon av enkelttrådet templat DNA■(enkelttrådet Construction of pCfBD2 8A17 and CfBD28T17 using site-specific mutagenesis (cf. Fig. 17) (a) Construction of single-stranded template DNA (single-stranded

ptl9BD28N). ptl9BD28N).

I 50 til Y-10 0 buffer ble det oppløst 3 fig pCfBD28 oppnådd ved .prosedyren i eksempel 6-(4), 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll (Toyobo) og Pstl ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 2 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,1 /ig av et omtrent 210 bp DNA-fragment {Banlll-Pstl fragment) som kodet for den N-terminale del av hG-CSF-derivatet (ND2 8). In 50 to Y-100 buffer, 3 µg of pCfBD28 obtained by the procedure in Example 6-(4) were dissolved, 10 units of each of the restriction enzymes BanIII (Toyobo) and PstI were added and the cutting reaction was carried out at 37°C in 2 hours. From the reaction mixture, approximately 0.1 µg of an approximately 210 bp DNA fragment (Banlll-Pstl fragment) which encoded the N-terminal part of the hG-CSF derivative (ND2 8) was obtained by the LGT method.

Separat ble l. fig av M13 fagvektor M13mpl9RF DNA (Takara Shuzo) oppløst i totalt 50 fil Y-50 buffer, 10 enheter av restriksjonsenzymet AccI (Toyobo) ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Deretter ble NaCl tilsatt til en NaCl-konsentrasjon på 100 mM, 10 enheter av restriksjonsenzymet Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,8. iig av et DNA-fragment på omtrent 7,24 kb {Accl-Pstl fragment). Separately, l. fig of M13 phage vector M13mpl9RF DNA (Takara Shuzo) was dissolved in a total of 50 µl of Y-50 buffer, 10 units of the restriction enzyme AccI (Toyobo) were added and the cutting reaction was carried out at 37°C for 2 hours. Then, NaCl was added to a NaCl concentration of 100 mM, 10 units of the restriction enzyme Pstl were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 2 hours. From the reaction mixture, approximately 0.8 was obtained by the LGT method. iig of a DNA fragment of approximately 7.24 kb (Accl-Pstl fragment).

I 50 fil av T4 DNA ligasebuffer ble det oppløst 0,2 itg av Banlll-Pstl fragmentet (omtrent 210 bp) og 0,05 /tg av Accl-Pstl fragmentet (omtrent 7,24 kb) , hvert oppnådd som beskrevet i det foregående. T4 DNA ligase (10 enheter) ble tilsatt til blandingsoppløsningen og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 12°C i 16 timer. In 50 µl of T4 DNA ligase buffer, 0.2 µg of the BanIII-Pstl fragment (approximately 210 bp) and 0.05 µg of the AccI-Pstl fragment (approximately 7.24 kb) were dissolved, each obtained as described above. . T4 DNA ligase (10 units) was added to the mixture solution and the ligation reaction was carried out at 12°C for 16 hours.

Deretter ble den ovennevnte reaksjonsblanding anvendt for transfeksjon av E. coli JM105 ved hjelp av en kjent metode. Then, the above reaction mixture was used for transfection of E. coli JM105 by means of a known method.

På denne måte ble det oppnådd en rekombinant fag. Fra dyrkede celler av en E. coli JMlOS-avledet transformant infisert med den rekombinante fag, ble det utvunnet rekombinant M13 fag RF DNA. Strukturen av dette RF DNA (i det følgende benevnt ptl9BD2 8N) ble bekreftet ved kutting med Pstl, EcoRI, Aval og Xhol etterfulgt av polyakrylamidgelelektroforese. Deretter ble det enkelttrådede ptl9BD28N utvunnet fra den rekombinante fag ved hjelp av en kjent metode og anvendt som et templat. In this way, a recombinant phage was obtained. From cultured cells of an E. coli JMlOS-derived transformant infected with the recombinant phage, recombinant M13 phage RF DNA was recovered. The structure of this RF DNA (hereafter referred to as ptl9BD2 8N) was confirmed by cutting with PstI, EcoRI, Aval and XhoI followed by polyacrylamide gel electrophoresis. Then, the single-stranded ptl9BD28N was recovered from the recombinant phage by a known method and used as a template.

(b) Konstruksjon av åpnet dupleks DNA (b) Construction of opened duplex DNA

I 30 /il Y-100 buffer ble det oppløst 3 fig av M13mpl9 RF DNA (Takara Shuzo), 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene EcoRI og Hindlll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 2,5 fig av et DNA-fragment på omtrent 7,2 kb (EcoRI-HindiII-fragment). Dette Ml3mpl9 RF DNA-avledede EcoRI-Hindlll-fragment (omtrent 7,2 kb) og 1 /tg av det enkelttrådede templat-DNA ptl9BD28N oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt ble oppløst i 27 fil Klenow buffer' og DNA-denaturer ing ble gjennomført ved koking ved 10 0°C i 6 min. Deretter fikk blandingen stå ved 65°C i 10 min., ved 37°C i. 40 min., ved 4°C i 40 min. og i is 10 min. for å bevirke at annealingreaksjonen fortsatte, hvorved et åpnet dupleks DNA ble tildannet hvori G-CSF gendelen alene i templatet var enkelttrådet. Det således dannede åpnede dupleks DNA ble gjenvunnet ved hjelp av LGT-metoden . In 30 µl of Y-100 buffer, 3 µg of M13mpl9 RF DNA (Takara Shuzo) were dissolved, 10 units of each of the restriction enzymes EcoRI and HindIII were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 2 hours. From the reaction mixture, approximately 2.5 µg of a DNA fragment of approximately 7.2 kb (EcoRI-HindiII fragment) was obtained by the LGT method. This Ml3mpl9 RF DNA-derived EcoRI-Hindlll fragment (approximately 7.2 kb) and 1 µg of the single-stranded template DNA ptl9BD28N obtained as described in the previous section were dissolved in 27 µl Klenow buffer' and DNA denatured carried out by boiling at 10 0°C for 6 min. The mixture was then allowed to stand at 65°C for 10 min., at 37°C for 40 min., at 4°C for 40 min. and in ice for 10 min. to cause the annealing reaction to continue, whereby an open duplex DNA was formed in which the G-CSF gene part alone in the template was single-stranded. The opened duplex DNA thus formed was recovered using the LGT method.

(c) Mutagenese (konstruksjon av ptl9BD28NA17 og ptl9BD2 8NT17) (c) Mutagenesis (construction of ptl9BD28NA17 and ptl9BD2 8NT17)

Et enkelttrådet DNA (D-l) nødvendig for å substituere Ala for den 17. aminosyre (fra den N-terminale ende), nemlig Ser, av hG-CSF-derivatet (ND28) oppnådd i eksempel 6 og et.enkelttrådet DNA (D-2) nødvendig for å substituere Thr for Ser ble syntetisert ved hjelp av den ordinære fosfotriestermetode. Basesekvensene av D-l (33-mer) og D-2 (33-mer) er vist i det følgende: A single-stranded DNA (D-1) necessary to substitute Ala for the 17th amino acid (from the N-terminal end), namely Ser, of the hG-CSF derivative (ND28) obtained in Example 6 and a single-stranded DNA (D-2 ) required to substitute Thr for Ser was synthesized using the ordinary phosphotriester method. The base sequences of D-1 (33-mer) and D-2 (33-mer) are shown in the following:

Utforming av de ovennevnte DNA<1>er er slik at mutagenese under anvendelse av D-l kan bevirke dannelse av et nytt Stul-sete og mutagenese under anvendelse av D-2 kan gi anledning til et nytt Xbal-sete. Mutanter kan derfor identifiseres ved kutting med disse restriksjonsenzymer. The design of the above-mentioned DNA<1>s is such that mutagenesis using D-1 can result in the formation of a new Stul site and mutagenesis using D-2 can give rise to a new XbaI site. Mutants can therefore be identified by cutting with these restriction enzymes.

D-l og D-2 ble hver individuelt oppløst i en mengde av 1 fig, i 50 fil T4 kinasebuffer, 30 enheter T4 polynukleotidkinase ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. D-1 and D-2 were each individually dissolved in an amount of 1 µg, in 50 µl of T4 kinase buffer, 30 units of T4 polynucleotide kinase were added, and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min.

Deretter ble 0,2 fig av det fosforylerte D-l eller D-2 og 0,1 fig av det åpnede dupleks DNA oppnådd som beskrevet i åpnings-avsnittet oppløst i 34 fil buffer inneholdende 6,5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM MgCl2, 1 mM 2-merkaptoe'tanol og 100 mM NaCl, oppløsningen fikk stå ved 65°C i 60 min. og deretter ved romtemperatur i 30 min. hvorved D-l eller D-2 ble annealet med- det åpnede dupleks DNA. Then 0.2 μg of the phosphorylated D-1 or D-2 and 0.1 μg of the opened duplex DNA obtained as described in the opening section were dissolved in 34 μl buffer containing 6.5 mM Tris-HCl (pH 7.5) , 8 mM MgCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol and 100 mM NaCl, the solution was allowed to stand at 65°C for 60 min. and then at room temperature for 30 min. whereby D-1 or D-2 was annealed with the opened duplex DNA.

Til oppløsningen ble det tilsatt dATP, dTTP, dCTP og dGTP hver til en konsentrasjon på 0,5 mM. Etter ytterligere tilsetning av 1,5 enheter DNA polymerase I Klenow-fragment og 10 enheter T4 DNA-ligase, ble forlengelsesreaksjonen gjennomført ved 4°C i 16 timer. To the solution was added dATP, dTTP, dCTP and dGTP each to a concentration of 0.5 mM. After further addition of 1.5 units of DNA polymerase I Klenow fragment and 10 units of T4 DNA ligase, the extension reaction was carried out at 4°C for 16 hours.

Den således oppnådde reaksjonsblanding ble anvendt for transfeksjon av E. coli JM105 og mutantfager ble oppnådd. The reaction mixture thus obtained was used for transfection of E. coli JM105 and mutant phages were obtained.

RF DNA'er ble utvunnet fra de mutantfag-infiserte E. coli JM105 transformanter og identifisert ved kutting med Aval, Xhol og Stul (når D-l ble anvendt) eller med Xbal (når D-2 ble anvendt), etterfulgt av polyakrylamidgelelektroforese. RF DNA med mutasjon innført deri ved hjelp av D-l betegnes ptl9BD2 8NA17 og RF DNA med mutasjon innført deri ved hjelp av D-2 betegnes ptl9BD28NTl7. Basesekvensene i ptl9BD28NA17 og ptl9BD28NTl7 i nærheten av hhv. Stul-setet og Xbal-setet ble bekreftet ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden ved anvendelse av M13 fag til å være som følger: RF DNAs were recovered from the mutant phage-infected E. coli JM105 transformants and identified by cutting with Aval, XhoI and Stul (when D-1 was used) or with XbaI (when D-2 was used), followed by polyacrylamide gel electrophoresis. RF DNA with mutation introduced therein by means of D-1 is designated ptl9BD2 8NA17 and RF DNA with mutation introduced therein by means of D-2 is designated ptl9BD28NTl7. The base sequences in ptl9BD28NA17 and ptl9BD28NTl7 near the resp. The Stul site and the XbaI site were confirmed by the dideoxy sequencing method using M13 phage to be as follows:

(d) Konstruksjon av pCfBD28A17 og pCfBD28T17 (d) Construction of pCfBD28A17 and pCfBD28T17

I 50 ul Y-100 buffer ble det oppløst 3 ug ptl9BD28NAi7 eller ptl9BD2 8NTl7 oppnådd som beskrevet ovenfor, 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Aval og Xhol ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 0,05 iig av et omtrent 110 bp DNA-fragment inneholdende mutasjonssetet innført som beskrevet i det foregående avsnitt (Aval-Xhol-fragment). In 50 µl of Y-100 buffer, 3 µg of ptl9BD28NAi7 or ptl9BD28NT17 obtained as described above was dissolved, 10 units of each of the restriction enzymes Aval and XhoI were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 2 hours. From the reaction mixture, by means of the LGT method, 0.05 µg of an approximately 110 bp DNA fragment containing the mutation site introduced as described in the previous section (Aval-Xhol fragment) was obtained.

Separat ble 2 iig pCfBD28 oppnådd i eksempel 6-(4) oppløst i 50 ul Y-100 buffer,' 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Xhol og Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 1 ag av et tryptofan-promoter del-holdig DNA-fragment på omtrent 2,74 kb (Xhol-Bglll-fragment). Separately, 2 µg of pCfBD28 obtained in Example 6-(4) were dissolved in 50 µl of Y-100 buffer, 10 units of each of the restriction enzymes XhoI and BglII were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 2 hours. From the reaction mixture, about 1 ag of a tryptophan promoter part-containing DNA fragment of about 2.74 kb (Xhol-Bglll fragment) was obtained by the LGT method.

Ytterligere og separat ble 2 ug pCfBD28 oppløst i 50 ul Y-100 buffer, 10 enheter av restriksjonsenzym Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Etter bekreftelse av fullstendig Bglll-kutting ved hjelp av agarosegelelektroforese ble 5 enheter av restriksjonsenzymet Aval tilsatt og delvis kutting ble gjennomført ved 37°C i 10 min. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd 0,4 ug av et omtrent 1,2 9 kb DNA-fragment (Bglll-Aval-fragment) inneholdende det meste av det modne hG-CSF cDNA med {pp-terminatordelen. Additionally and separately, 2 µg pCfBD28 was dissolved in 50 µl Y-100 buffer, 10 units of restriction enzyme BglII was added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 2 hours. After confirmation of complete BglII cleavage by agarose gel electrophoresis, 5 units of the restriction enzyme Aval were added and partial cleavage was carried out at 37°C for 10 min. From the reaction mixture, by means of the LGT method, 0.4 µg of an approximately 1.29 kb DNA fragment (Bglll-Aval fragment) containing most of the mature hG-CSF cDNA with the {pp-terminator part was obtained.

Deretter ble 0,1 iig av det pCfBD2 8-avledede Xhol-Bglll-fragment (omtrent 2,74 kb), det pCfBD28-avledede Bglll-Aval-fragment (omtrent 1,29 kb) og 0,02 ug av ptl9BD28NAl7 eller ptl9BD28NTl7 avledet Aval-Xhol-fragment (omtrent 110 bp) oppløst i 60 ul T4 DNA-ligase, 10 enheter av T4 DNA-ligase ble tilsatt .og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 12°C i 16 timer. Then, 0.1 µg of the pCfBD28-derived XhoI-Bglll fragment (approximately 2.74 kb), the pCfBD28-derived Bglll-Aval fragment (approximately 1.29 kb), and 0.02 µg of ptl9BD28NAl7 or ptl9BD28NTl7 derived Aval-Xhol fragment (about 110 bp) dissolved in 60 µl of T4 DNA ligase, 10 units of T4 DNA ligase was added, and the ligation reaction was carried out at 12°C for 16 hours.

Den således oppnådde reaksjonsblanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101 og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Plasmid-DNA ble utvunnet fra dyrkede celler av denne koloni. Plasmidet konstruert ved å anvende ptl9BD28NA17 betegnes pCfBD2 8Al7 og plasmidet konstruert ved anvendelse av ptl9BD28NTl7 betegnes pCfBD28Tl7. Strukturen av pCfBD28A17 ble bekreftet ved kutting med Aval, Xhol, Bglll og Stul, etterfulgt av agarosegelelektroforese. Strukturen av pCfBD2 8T17 ble bekreftet ved spaltning med Aval, Xhol,Bglll og Xbal, etterfulgt av agarosegelelektroforese. The reaction mixture thus obtained was used for transformation of E. coli HB101 and an Aβ colony was obtained. Plasmid DNA was recovered from cultured cells of this colony. The plasmid constructed using ptl9BD28NA17 is designated pCfBD2 8A17 and the plasmid constructed using ptl9BD28NT17 is designated pCfBD28T17. The structure of pCfBD28A17 was confirmed by digestion with Aval, XhoI, BglII and Stul, followed by agarose gel electrophoresis. The structure of pCfBD2 8T17 was confirmed by digestion with Aval, XhoI, BglII and XbaI, followed by agarose gel electrophoresis.

De erstattende aminosyrerester i hG-CSF-derivatene som kodet for av disse to plasmider sammenlignet med intakt hG-CSF er som følger: The substituted amino acid residues in the hG-CSF derivatives encoded by these two plasmids compared to intact hG-CSF are as follows:

hG-CSF-derivatene som kodes for av pCfBD28A17 og pCfBD28T17 betegnes i det følgende hhv. hG-CSF(ND2 8A17) og hG-CSF (ND28T17) . The hG-CSF derivatives encoded by pCfBD28A17 and pCfBD28T17 are designated in the following respectively hG-CSF (ND2 8A17) and hG-CSF (ND28T17).

Undereksempel 1 Subexample 1

Isolasjon av det hG-CSF cDNA-bærende plasmid pCSFl-2 Isolation of the hG-CSF cDNA-carrying plasmid pCSF1-2

(1) Fremstilling av poly(A) RNA fra makrofag fra normalt humant periferisk blod (1) Preparation of poly(A) RNA from macrophage from normal human peripheral blood

Makrofager, som er adherente celler, ble isolert ved dyrking av leukocytter oppnådd ved sentrifugering av normalt humant periferisk blod i en plastflaske og ved å fjerne ikke-adherente celler ved vasking. Et RNA med' poly{A) ble fremstilt fra makrofagene ved hjelp av guanidintiocyanatlitiumkloridmetoden (Cathala et al.: DNA, 2, 329 (1983)) på følgende måte. Macrophages, which are adherent cells, were isolated by culturing leukocytes obtained by centrifugation of normal human peripheral blood in a plastic bottle and by removing non-adherent cells by washing. An RNA with poly(A) was prepared from the macrophages by the guanidine thiocyanate lithium chloride method (Cathala et al.: DNA, 2, 329 (1983)) in the following manner.

Normalt human periferisk blod (400 ml) ble .sentrifugert Normal human peripheral blood (400 ml) was centrifuged

på en Hitachi RPRlO-rotor ved 1.800 omdr. pr. min. i 20 min. on a Hitachi RPRlO rotor at 1,800 rpm. my. for 20 min.

Det resulterende blodcellepresipitat ble suspendert i 50 ml fosfatbufret saltløsning (8 g/liter NaCl, 0,2 g/liter KCl, 1,15 g/liter vannfritt Na2HP04, 0,2 g/liter KH2P04 (pH 7,2) i det følgende forkortet PBS). En'25 ml porsjon av denne suspensjon ble lagt som et lag på 2 5 ml lymfocyttseparasjons-væske (BIONETICS), og det hele ble sentrifugert på en Hitachi RPR10 rotor ved 1.800 omdr. pr. min. i 30 min. Leukocytter i midtlaget ble samlet, vasket med et like stort volum PBS (på en Hitachi RPR10 rotor ved 1.500 omdr. pr. min. i 10 min.), deretter suspendert i 20 ml RPMI 1640 medium (Nissui Seiyaku) inneholdende 5% føtalt bovint serum, og dyrket under anvendelse av en vevsdyrkingskolbe (Corning). Etter dyrking ved 3 7°C i 1,5 time ble dyrkingssupernatanten fjernet sammen med ikke-adherente celler. En nylaget 2 0 ml porsjon av samme medium og E. coli-avledet lipopolysakkarid (LPS) (i en mengde til å gi en konsentrasjon på 0,3 mg/ml) ble tilsatt, og dyrking ble fortsatt ved 37°C i ytterligere 4 timer. Deretter ble celler høstet fra kulturen ved sentrifugering ved 1.10 0 x g ved 4°C i 10 min., vasket med 80 ml PBS og oppløseliggjort i 10 ml av en oppløsning omfattende 5 M guanidintiocyanat, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 7) og 8% (volum/volum) 2-merkaptoetanol under anvendelse av en hvirveIblander. Dette oppløseliggjorte produkt ble overført til et sentrifugerør, 8 0 ml 4 M LiCl ble tilsatt og blandingen ble omrørt og fikk deretter stå ved 4°C i 20 timer og sentrifugert på en Hitachi RPR10 rotor ved 9.000 omdr. pr. min. i 90 min. Deretter ble et RNA-presipitat utvunnet. RNA-presipitatet ble suspendert i 50 ml av en oppløsning omfattende 4 M urea og 2 M litiumklorid og suspensjonen ble sentrifugert på en Hitachi RPR 10 rotor ved 9.000 omdr. pr. min. i 60 min. og et RNA-presipitat ble på nytt utvunnet. The resulting blood cell precipitate was suspended in 50 ml of phosphate-buffered saline (8 g/liter NaCl, 0.2 g/liter KCl, 1.15 g/liter anhydrous Na 2 HPO 4 , 0.2 g/liter KH 2 PO 4 (pH 7.2) in the following abbreviated PBS). A 25 ml portion of this suspension was layered on 25 ml lymphocyte separation fluid (BIONETICS), and the whole was centrifuged on a Hitachi RPR10 rotor at 1,800 rpm. my. for 30 min. Leukocytes in the middle layer were collected, washed with an equal volume of PBS (on a Hitachi RPR10 rotor at 1,500 rpm for 10 min), then suspended in 20 ml of RPMI 1640 medium (Nissui Seiyaku) containing 5% fetal bovine serum, and cultured using a tissue culture flask (Corning). After culturing at 37°C for 1.5 hours, the culture supernatant was removed along with non-adherent cells. A freshly prepared 20 ml portion of the same medium and E. coli -derived lipopolysaccharide (LPS) (in an amount to give a concentration of 0.3 mg/ml) was added, and culture was continued at 37°C for a further 4 hours. Then, cells were harvested from the culture by centrifugation at 1,100 x g at 4°C for 10 min, washed with 80 ml of PBS and solubilized in 10 ml of a solution comprising 5 M guanidine thiocyanate, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 7) and 8% (v/v) 2-mercaptoethanol using a vortex mixer. This solubilized product was transferred to a centrifuge tube, 80 ml of 4 M LiCl was added and the mixture was stirred and then allowed to stand at 4°C for 20 hours and centrifuged on a Hitachi RPR10 rotor at 9,000 rpm. my. for 90 min. Then, an RNA precipitate was recovered. The RNA precipitate was suspended in 50 ml of a solution comprising 4 M urea and 2 M lithium chloride and the suspension was centrifuged on a Hitachi RPR 10 rotor at 9,000 rpm. my. for 60 min. and an RNA precipitate was recovered.

RNA-presipitatet ble oppløst i 10 ml av en oppløsning omfattende 0,1% natriumlaurylsulfat, 1 mM EDTA og 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og RNA ble utvunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling. Det oppnådde RNA (omtrent 0,8 mg) ble oppløst i 1 ml av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Etter inkubasjon ved 65°C i 5 min. ble 0,1 ml 5 M NaCl tilsatt. Blandingen ble underkastet oligo (dT)-cellulosekolonne (P-L Biochemicals) kromatografi (kolonnevolum 0,5 ml). Det adsorberte, poly(A)-holdige mRNA ble eluert med en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA til å gi omtrent 30 ug poly (A)-holdig mRNA. (2) cDNA-syntese og innføring av DNA i en vektor Okayama-Berg-metoden (Mol. Cell. Biol. 2, 161, (1982)) ble anvendt for cDNA-syntese og rekombinant plasmidkonstruksjon ved innføring av det oppnådde cDNA. Fremgangsmåtene for dette er skissert i fig. 9. The RNA precipitate was dissolved in 10 ml of a solution comprising 0.1% sodium lauryl sulfate, 1 mM EDTA and 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and RNA was recovered by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation. The RNA obtained (approximately 0.8 mg) was dissolved in 1 ml of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA. After incubation at 65°C for 5 min. 0.1 ml of 5 M NaCl was added. The mixture was subjected to oligo (dT)-cellulose column (P-L Biochemicals) chromatography (column volume 0.5 ml). The adsorbed poly(A)-containing mRNA was eluted with a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 1 mM EDTA to yield approximately 30 µg of poly(A)-containing mRNA. (2) cDNA synthesis and introduction of DNA into a vector The Okayama-Berg method (Mol. Cell. Biol. 2, 161, (1982)) was used for cDNA synthesis and recombinant plasmid construction by introduction of the obtained cDNA. The procedures for this are outlined in fig. 9.

Til 3 00 ( il av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 10 mM NaCl ble det tilsatt 400 ug pCDVl (Okayama & Berg: Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)), og etter ytterligere tilsetning av 500 enheter Kpnl, ble reaksjonen gjennomført ved 37°C i 6 timer, hvorved plasmidet ble spaltet ved Kpnl-setet. DNA ble utvunnet ved fenol-kloroform-ekstraks jon og etanolutfelling. Omtrent 200 ug av det Kpnl-kuttede DNA ble tilsatt til 200 ( il av en oppløsning fremstilt ved å tilsette dTTP i en konsentrasjon på 0,25 mM til en buffer (i det følgende forkortet TdT-buffer) omfattende 4 0 mM natriumcacodylat, 30 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 mM CaCl2 og 0,1 mM ditiotreitol (i det følgende forkortet som DTT) og etter ytterligere tilsetning av 81 enheter terminal deoksy-nukleotidyltransferase (i det følgende forkortet som TdT) (P-L Biochemicals), ble reaksjonen gjennomført ved 37°C i 11 min., hvorved en poly(dT)-kjede omfattende omtrent 67 dT-rester ble addert til hver Kpnl-kuttingssete 3<1->ende av pCDVl. Omtrent 100 ug av det poly(dT)-kjede-adderte pCDVl DNA ble utvunnet fra den ovennevnte reaksjonsblanding ved fenol-klorof ormekstraks jon og etanolutfelling. DNA ble tilsatt til 150 ul av en buffer omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 100 mM NaCl, 360 enheter EcoRI ble ytterligere tilsatt og reaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble behandlet ved hjelp av LGT-metoden og et DNA-fragment på omtrent 3,1 kb ble utvunnet. Det ble således oppnådd omtrent 60 ug av poly(dT) kjede-forlenget pCDVl. DNA ble oppløst i 100 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl CpH 8,0) og 1 mM EDTA, oppløsningen ble inkubert ved 65°C i 5 min. og deretter avkjølt med is, og 50 gl 5 M NaCl ble tilsatt. Blandingen ble underkastet oligo(dA)-cellulose-kolonne-kromatografering (Collaborative Research) . Molekyler med en tilstrekkelig poly(dT) kjede-lengde ble adsorbert på kolonnen og de ble eluert med en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og l mM EDTA. Det ble således oppnådd 2 7 ug av det poly{dT) kjedeforlengede pCDVl (i det følgende forkortet som vektor-primer). To 300 µl of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl 2 and 10 mM NaCl was added 400 µg of pCDV1 (Okayama & Berg: Mol. Cell. Biol., 3, 280 ( 1983)), and after additional addition of 500 units of KpnI, the reaction was carried out at 37°C for 6 hours, whereby the plasmid was cleaved at the KpnI site. DNA was recovered by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation. Approximately 200 µg of the KpnI-cut DNA was added to 200 µl of a solution prepared by adding dTTP at a concentration of 0.25 mM to a buffer (hereinafter abbreviated TdT buffer) comprising 40 mM sodium cacodylate, 30 mM Tris-HCl (pH 6.8), 1 mM CaCl2 and 0.1 mM dithiothreitol (hereafter abbreviated as DTT) and after further addition of 81 units of terminal deoxynucleotidyltransferase (hereafter abbreviated as TdT) (P-L Biochemicals), the reaction was carried out at 37°C for 11 min, whereby a poly(dT) chain comprising approximately 67 dT residues was added to each Kpn1 cut site 3<1->e nde of pCDVl. Approximately 100 µg of the poly(dT) chain-added pCDV1 DNA was recovered from the above reaction mixture by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation. DNA was added to 150 µl of a buffer comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl 2 and 100 mM NaCl, 360 units of EcoRI were further added and the reaction was carried out at 37°C for 2 hours. The reaction mixture was processed by the LGT method and a DNA fragment of approximately 3.1 kb was recovered. Approximately 60 µg of poly(dT) chain-extended pCDV1 was thus obtained. DNA was dissolved in 100 µl of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (CpH 8.0) and 1 mM EDTA, the solution was incubated at 65°C for 5 min. and then cooled with ice, and 50 gl of 5 M NaCl was added. The mixture was subjected to oligo(dA)-cellulose column chromatography (Collaborative Research). Molecules with a sufficient poly(dT) chain length were adsorbed on the column and they were eluted with a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA. 27 µg of the poly(dT) chain-extended pCDV1 (hereinafter abbreviated as vector primer) was thus obtained.

Deretter ble et linker-DNA syntetisert. Then a linker DNA was synthesized.

Til 200 ul av en buffer omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 50 mM NaCl ble det tilsatt omtrent 14 fig pLl (Okayamafc Berg: Mol. Cell. Biol., 3, 28 0 (1983)), 50 enheter Pstl ble ytterligere tilsatt og reaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 4 timer, hvorved pLl DNA ble kuttet ved Pstl-setet. Reaksjonsblandingen ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon, etterfulgt av etanolutfelling, hvorved omtrent 13 fig av det Pstl-kuttede pLl DNA ble utvunnet. DNA (omtrent To 200 µl of a buffer comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl 2 and 50 mM NaCl was added approximately 14 µg pLl (Okayamafc Berg: Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983 ), 50 units of Pstl were further added and the reaction was carried out at 37°C for 4 hours, whereby the pL1 DNA was cut at the Pstl site. The reaction mixture was subjected to phenol-chloroform extraction, followed by ethanol precipitation, whereby approximately 13 µg of the Pstl-cut pL1 DNA was recovered. DNA (approx

13 ug) ble tilsatt til 50 ul av TdT-buffer supplert med dGTP i en sluttkonsentrasjon på 0,25 mM, 54 enheter av TdT (P-L Biochemicals) ble ytterligere tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 3 7°C i 13 min., hvorved en dG-kjede inneholdende omtrent 14 dG-rester ble addert til pLl ved hver 3'-ende ved Pstl-kuttingssetet. DNA ble utvunnet ved fenol-kloroform-ekstraks jon etterfulgt av etanolutfelling. DNA ble tilsatt til 100 ul av en buffer omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM enheter av Hindlll ble ytterligere tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 3 timer, hvorved pLl DNA ble kuttet ved Hindlll-setet. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved hjelp av agarosegelelektroforese og et DNA-fragment på omtrent 0,5 kb ble utvunnet ved hjelp av DEAE-papirmetoden (Dretzen et al., Anal. Biochem., 112, 295 13 µg) was added to 50 µl of TdT buffer supplemented with dGTP at a final concentration of 0.25 mM, 54 units of TdT (P-L Biochemicals) was further added, and the mixture was incubated at 37°C for 13 min, whereby a dG chain containing approximately 14 dG residues was added to pL1 at each 3' end at the Pstl cutting site. DNA was recovered by phenol-chloroform extraction followed by ethanol precipitation. DNA was added to 100 µl of a buffer comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl 2 , and 60 mM units of HindIII were further added, and the mixture was incubated at 37°C for 3 hours, whereby pL1 DNA was cut at the Hindlll seat. The reaction mixture was fractionated by agarose gel electrophoresis and a DNA fragment of approximately 0.5 kb was recovered by the DEAE paper method (Dretzen et al., Anal. Biochem., 112, 295

(1981)). Det ble således oppnådd oligo(dG) kjedeforlenget linker-DNA (i det følgende enkelt benevnt linker-DNA). (1981)). Oligo(dG) chain-extended linker DNA (hereinafter simply referred to as linker DNA) was thus obtained.

I 22,3 fil av en oppløsning omfattende 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM' MgCl2, 30 mM KCl, 0,3 mM DTT, 2 mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP og dCTP) og 10 enheter ribonukleaseinhibitor (P-L Biochemicals), ble det oppløst omtrent 3 ug poly(A) RNA og omtrent 1,4 ug av vektor-primeren, hver fremstilt som beskrevet i det foregående, 10 enheter av revers transkriptase (Seikagaku Kogyo) ble tilsatt, og mRNA ble bragt til å syntetisere et DNA komplementært dertil ved inkubasjon av blandingen ved 4l°C i 90 min. Reaksjonsblandingen ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon og vektor-primer DNA med RNA-DNA dobbelttråden addert dertil ble utvunnet ved hjelp av etanolutfelling. Dette DNA ble oppløst i 20 ul TdT-buffer inneholdende 66 um dCTP og 0,2 jag poly (A), 14 enheter av TdT (P-L Biochemicals) ble tilsatt og blandingen ble inkubert ved 37°C i 2 min. hvorved en (dC) - kjede inneholdende 20 dCrester ble addert til 3'-enden av cDNA. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol-kloroform og (dC)-kjedeforlenget cDNA-vektor-primer-DNA ble utvunnet ved etanolutf elling. DNA ble oppløst i 400 fil av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl, 2 0 enheter Hindlll ble tilsatt og inkubasjon ble gjennomført ved 37°C i 2 timer for å bevirke kutting ved Hindlll-setet. Fenol-kloroformekstraksjon av reaksjonsblandingen og etterfølgende etanolutfelling ga 0,5 pikomol av In 22.3 µl of a solution comprising 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 8 mM MgCl2, 30 mM KCl, 0.3 mM DTT, 2 mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP and dCTP) and 10 units of ribonuclease inhibitor (P-L Biochemicals), about 3 µg of poly(A) RNA and about 1.4 µg of the vector primer, each prepared as described above, were dissolved, 10 units of reverse transcriptase (Seikagaku Kogyo) were added, and The mRNA was caused to synthesize a DNA complementary to it by incubation of the mixture at 41°C for 90 min. The reaction mixture was subjected to phenol-chloroform extraction and the vector-primer DNA with the RNA-DNA double strand added thereto was recovered by ethanol precipitation. This DNA was dissolved in 20 µl TdT buffer containing 66 µm dCTP and 0.2 µg poly (A), 14 units of TdT (P-L Biochemicals) was added and the mixture was incubated at 37°C for 2 min. whereby a (dC) chain containing 20 dCrests was added to the 3' end of the cDNA. The reaction mixture was extracted with phenol-chloroform and (dC) chain-extended cDNA vector-primer DNA was recovered by ethanol precipitation. DNA was dissolved in 400 µl of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl 2 and 60 mM NaCl, 20 units of HindIII were added and incubation was carried out at 37°C for 2 hours to effect cutting at the Hindlll seat. Phenol-chloroform extraction of the reaction mixture and subsequent ethanol precipitation yielded 0.5 picomoles of

(dC)-kjedeforlenget cDNA vektor-primer-DNA. I 100 ul av en oppløsning omfattende i 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl (dC) chain-extended cDNA vector-primer DNA. In 100 µl of a solution comprising in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 M NaCl

■ og 1 mM EDTA, ble det oppløst 0,2 pikomol av DNA og 0,4 pikomol av det ovennevnte linker-DNA, og inkubasjonen ble gjennomført ved 65°C, 42°C og 0°C i hhv. 10, 25 og 3 0 min. Et totalt volum på 1.00 0 ul av en reaksjonsblanding ble fremstilt med følgende sammensetning: 2 0 mM Tris-HCl (pH 7,5), 4 TnM MgCl2, 10 mM (NH4)2S04, 0,1 M KCl og 0,1 mM fi-NAD. Til dette reaksjonsmedium ble tilsatt 25 enheter av E. coli-avledet DNA-ligase (New England Bio-Labs), og inkubasjonen ■ and 1 mM EDTA, 0.2 picomole of DNA and 0.4 picomole of the above-mentioned linker DNA were dissolved, and the incubation was carried out at 65°C, 42°C and 0°C in resp. 10, 25 and 30 min. A total volume of 1,000 µl of a reaction mixture was prepared with the following composition: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 4 TnM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1 M KCl and 0.1 mM fi-NAD. To this reaction medium was added 25 units of E. coli-derived DNA ligase (New England Bio-Labs), and the incubation

ble gjennomført ved. 11°C i 18 timer. Reaksjonsmediet ble supplert med 4 0 #M av hver av dNTP og (3-NAD til å gi en endelig konsentrasjon på 0,15 mM, 10 enheter av E. coli DNA-ligase, 20 enheter av E. coli DNA-polymerase I (P-L Biochemicals) og 10 enheter E. coli ribonuklease H (P-L Biochemicals) ble tilsatt, og inkubasjon ble gjennomført ved 12°C i 1 time og deretter ved 25°C i l time. Den ovennevnte reaksjonsprosedyre bevirket ringslutning av det cDNA-holdige rekombinante DNA og substitusjon av RNA-delen av RNA-DNA dobbelttråden med det tilsvarende DNA. Det rekombinante plasmid i den fullstendige dobbelttrådede DNA-form ble således dannet. was carried out by 11°C for 18 hours. The reaction medium was supplemented with 40 #M each of dNTP and (3-NAD to give a final concentration of 0.15 mM, 10 units of E. coli DNA ligase, 20 units of E. coli DNA polymerase I ( P-L Biochemicals) and 10 units of E. coli ribonuclease H (P-L Biochemicals) were added, and incubation was carried out at 12°C for 1 hour and then at 25°C for 1 hour. The above reaction procedure effected circularization of the cDNA-containing recombinant DNA and substituting the RNA portion of the RNA-DNA double-stranded with the corresponding DNA.Thus, the recombinant plasmid in the complete double-stranded DNA form was formed.

(3) Seleksjon av hG-CSF cDNA-holdig rekombinant DNA (3) Selection of hG-CSF cDNA-containing recombinant DNA

Det rekombinante plasmid oppnådd som beskrevet i (2) ble anvendt for transformering av E. coli C600SF8 ved hjelp av metoden til Scott et al. (Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Technology), 2, 616 (1983)). Omtrent 9.200 oppnådde kolonier ble fiksert på et nitrocellulosefilter. En stamme som var i stand til sterk assosiering ved 60°C med en probe fremstilt ved merking med <32>p, det 27-base syntetiske DNA 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTG-3' tilsvarende de N-terminale 9 aminosyrer i modent hG-CSF-protein ble isolert av Nagata et al. (Nagata et al., Nature, 319, 415 (1986)) ble selektert (Grunstein-Hogness-metoden, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975)). Hele basesekvensen av cDNA inneholdt i plasmidet pCSFl-2 som bæres av denne stamme ble bestemt ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag (tabell 1). Som et resultat ble det funnet at cDNA inneholdt i pCSFl-2 koder for hG-CSF. The recombinant plasmid obtained as described in (2) was used to transform E. coli C600SF8 by the method of Scott et al. (Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Technology), 2, 616 (1983)). About 9,200 colonies obtained were fixed on a nitrocellulose filter. A strain capable of strong association at 60°C with a probe prepared by labeling with <32>p, the 27-base synthetic DNA 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTG-3' corresponding to the N-terminal 9 amino acids of mature hG-CSF -protein was isolated by Nagata et al. (Nagata et al., Nature, 319, 415 (1986)) was selected (Grunstein-Hogness method, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975)). The entire base sequence of the cDNA contained in the plasmid pCSF1-2 carried by this strain was determined by the dideoxy sequencing method using M13 phage (Table 1). As a result, it was found that the cDNA contained in pCSF1-2 codes for hG-CSF.

Denne bakteriestamme er blitt deponert med FRI under betegnelsen E. coli ECSF1-2 (FERM BP-1220) som tidligere 'nevnt. This bacterial strain has been deposited with FRI under the name E. coli ECSF1-2 (FERM BP-1220) as previously mentioned.

Undereksempel 2 Subexample 2

Isolering og rensin<g> av plasmidet pKYP26 Isolation and purification of the plasmid pKYP26

En pKYP26-bærende E. coli-stamrae (E. coli IKYP26 (FERM BP-863)) ble dyrket i 10 ml L-medium (1% Bacto-trypton, 0,5% gjaerekstrakt, 1% NaCl, pH 7,5) inneholdende 50 ug/ml ampicillin ved 37°C i 18 timer. Hele kulturen ble overført til l liter L-medium inneholdende 50 ag/ml ampicillin og dyrket ved 3 7°C. Etter 4 timer ble kloramfenikol tilsatt i en konsentrasjon'på 170 ug/ml og dyrking ble gjennomført ved 3 7°C i ytterligere 16 timer. Celler ble høstet ved sentrifugering (5.000 omdr./min., 10 min.), vasket med 0,8% NaCl og suspendert i 20 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) og suspensjonen ble avkjølt med is. Lysozym (10 mg/ml, 8 ml) ble tilsatt og etter henstand i is i 10 min. ble 9,6 ml 0,5 M EDTA tilsatt. Etter henstand i is i 10 min. ble 2,3 ml 2% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries) tilsatt, etterfulgt av ytterligere henstand i is i l time. Ultrasentrifugering ved 50.000 x g ved 4°C i 1 time ga omtrent 40 ml av en supernatant. Denne supernatant ble innstilt til pH 12,5 ved tilsetning av 3 M NaOH og omrørt forsiktig ved romtemperatur i 10 min. pH ble bragt tilbake til 8,5 ved tilsetning av 2 M Tris-HCl (pH 7,5) etterfulgt av ytterligere omrøring i 3 min. Ved dette tidspunkt var væskevolumet omtrent 55 ml. Et 1/9 volum av 5 M NaCl ble tilsatt og deretter ble fenol-ekstraksjon gjennomført. Et 1/250 volum av 5 mg/ml RNase A (Sigma) ble tilsatt, RNA-nedbrytningsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 1 time, et 1/5 volum av 5 M NaCl ble så tilsatt og et 1/3 volum av 3 0% PEG 60 00 (Nakarai Chemicals) ble tilsatt. Den resulterende blanding fikk stå ved -2 0°C i 2 timer. Det resulterende presipitat ble samlet ved sentrifugering og oppløst i 2 ml av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA, natriumdodecylsulfat (SDS) ble tilsatt i en konsentrasjon på 0,5%, proteinase K (Sigma) ble tilsatt i en konsentrasjon på 50 ug/ml og den proteolytiske reaksjon ble gjennomført ved A pKYP26-carrying E. coli strain (E. coli IKYP26 (FERM BP-863)) was grown in 10 ml of L medium (1% Bacto-tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, pH 7.5 ) containing 50 µg/ml ampicillin at 37°C for 18 hours. The entire culture was transferred to 1 liter of L medium containing 50 µg/ml ampicillin and grown at 37°C. After 4 hours, chloramphenicol was added at a concentration of 170 µg/ml and cultivation was carried out at 37°C for a further 16 hours. Cells were harvested by centrifugation (5,000 rpm, 10 min), washed with 0.8% NaCl and suspended in 20 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and the suspension was cooled with ice. Lysozyme (10 mg/ml, 8 ml) was added and after standing in ice for 10 min. 9.6 ml of 0.5 M EDTA was added. After resting in ice for 10 min. 2.3 ml of 2% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries) was added, followed by further standing on ice for 1 hour. Ultracentrifugation at 50,000 x g at 4°C for 1 hour yielded approximately 40 ml of a supernatant. This supernatant was adjusted to pH 12.5 by addition of 3 M NaOH and stirred gently at room temperature for 10 min. The pH was brought back to 8.5 by addition of 2 M Tris-HCl (pH 7.5) followed by further stirring for 3 min. At this point the fluid volume was approximately 55 ml. A 1/9 volume of 5 M NaCl was added and then phenol extraction was carried out. A 1/250 volume of 5 mg/ml RNase A (Sigma) was added, the RNA degradation reaction was carried out at 37°C for 1 hour, a 1/5 volume of 5 M NaCl was then added and a 1/3 volume of 30% PEG 60 00 (Nakarai Chemicals) was added. The resulting mixture was allowed to stand at -20°C for 2 hours. The resulting precipitate was collected by centrifugation and dissolved in 2 ml of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 1 mM EDTA, sodium dodecyl sulfate (SDS) was added at a concentration of 0.5%, proteinase K ( Sigma) was added at a concentration of 50 µg/ml and the proteolytic reaction was carried out at

3 7°C i 1 time. Etter tre repetisjoner av fenolekstråksjon ble DNA utvunnet ved kloroformekstraksjon og etanolutfelling og oppløst i l ml av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA. På denne måte kunne 800 fig pKYP26 oppnås.-Strukturen av pKYP2 6 ble bekreftet ved kutting med EcoRI, Kpnl, BamHI, Bglll og Pstl, etterfulgt av agarosegelelektrofores 3 7°C for 1 hour. After three repetitions of phenol extraction, DNA was recovered by chloroform extraction and ethanol precipitation and dissolved in 1 ml of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 1 mM EDTA. In this way, 800 µg pKYP26 could be obtained.-The structure of pKYP2 6 was confirmed by cutting with EcoRI, KpnI, BamHI, Bglll and Pstl, followed by agarose gel electrophoresis

Undereksempel 3 Subexample 3

Isolasjon av human LT cDNA-bærende plasmid pLTlIsolation of human LT cDNA-carrying plasmid pLT1

(1) Fremstilling av poly(A) RNA fra Lukll-celler (1) Preparation of poly(A) RNA from Luk11 cells

Guanidintiocyanatlitiumkloridmetoden (Cathala et al.: DNA, 2, 329 (1983)) ble fulgt for fremstilling av et poly(A)-bærende RNA fra den humane lymfoblastoidcellelinje Lukll på følgende måte: Humane lymfoblastoid Lukll-celler {Berish Y. Rubin et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, 6637 (1985)) ble inokulert i 1 liter RPMI 164 0 medium (Nissui SEiyaku) inneholdénde 5% fatalt bovint serum og 1 mM N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-etansulfonsyre (HEPES) i en cellekonsentrasjon på 8 x lo5 celler/ml og dyrket der. En roterende dyrkingskolbe ble anvendt for kulturen. Etter dyrking ved 3 7°C i 48 timer ble celler samlet ved sentrifugering og overført til en ny 1-liters porsjon av RPMI 1640 medium inneholdende 5% føtalt bovint serum og 1 mM HEPES, og dyrking ble gjennomført ved 3 7°C i ytterligere 48 timer. Deretter ble celler høstet fra en del (250 ml) av denne cellesuspensjon ved sentrifugering ved 1100 x g ved 4°C i 10 min., vasket med 80 ml fosfatbuffer og solubilisert i 10 ml av en oppløsning omfattende 5 M guanidintiocyanat, 10 mM EDTA, 50- mM Tris-HCl (pH 7) og 8% The guanidine thiocyanate lithium chloride method (Cathala et al.: DNA, 2, 329 (1983)) was followed for the preparation of a poly(A)-bearing RNA from the human lymphoblastoid cell line Lukll as follows: Human lymphoblastoid Lukll cells {Berish Y. Rubin et al . Pro. Nati. Acad. Pollock. USA, 82, 6637 (1985)) were inoculated into 1 liter of RPMI 164 0 medium (Nissui SEiyaku) containing 5% lethal bovine serum and 1 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (HEPES) at a cell concentration of 8x lo5 cells/ml and cultured there. A rotary culture flask was used for the culture. After culture at 37°C for 48 h, cells were collected by centrifugation and transferred to a new 1-liter portion of RPMI 1640 medium containing 5% fetal bovine serum and 1 mM HEPES, and culture was carried out at 37°C for additional 48 hours. Cells were then harvested from a portion (250 ml) of this cell suspension by centrifugation at 1100 x g at 4°C for 10 min, washed with 80 ml phosphate buffer and solubilized in 10 ml of a solution comprising 5 M guanidine thiocyanate, 10 mM EDTA, 50-mM Tris-HCl (pH 7) and 8%

(volum/volum) 2-merkaptoetanol under anvendelse av en hvirvelblander. Solubiliseringsproduktet ble overført til et sentrifugerør, 80 ml 4 M LiCl ble tilsatt og blandingen ble omrørt og fikk deretter stå ved 4°C i 20 timer. Etter sentrifugering på en Hitachi RPR10 rotor ved 9.0 00 omdr./ min. i 90 min. ble et RNA-presipitat utvunnet. RNA-presipitatet ble suspendert i 50 ml av en oppløsning omfattende 4 M urea og 2 M litiumklorid og etter sentrifugering på en Hitachi RPR10 rotor ved 9.000 omdr./min. i 60 min. ble RNA på nytt utvunnet som et presipitat og RNA-presipitatet ble oppløst i 10 ml av en oppløsning omfattende 0,1% natriumlaurylsulfat, 1 mM EDTA.og 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og RNA ble isolert ved fenol-kloroformekstraksjon etterfulgt av fenol- (v/v) 2-mercaptoethanol using a vortex mixer. The solubilization product was transferred to a centrifuge tube, 80 mL of 4 M LiCl was added and the mixture was stirred and then allowed to stand at 4°C for 20 hours. After centrifugation on a Hitachi RPR10 rotor at 9,000 rpm. for 90 min. an RNA precipitate was recovered. The RNA precipitate was suspended in 50 ml of a solution comprising 4 M urea and 2 M lithium chloride and after centrifugation on a Hitachi RPR10 rotor at 9,000 rpm. for 60 min. RNA was recovered as a precipitate and the RNA precipitate was dissolved in 10 ml of a solution comprising 0.1% sodium lauryl sulfate, 1 mM EDTA, and 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and RNA was isolated by phenol- chloroform extraction followed by phenol-

utfelling. Omtrent 2,5 mg av det således oppnådde RNA ble oppløst i 1 ml av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Etter inkubasjon ved 65°C i 5 min. ble 0,1 ml 5 M NaCl tilsatt. Blandingen ble underkastet oligo(dT)-cellulosekolonne (P-L Biochemicals) kromatografi .(kolonnevolum 0,5 ml). Det adsorberte poly(A)-holdige mRNA ble eluert med en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA. Omtrent 100 ug av poly (A)-holdig mRNA ble oppnådd. (2) cDNA-syntese og innføring av DNA i en vektor Okayama-Berg-metoden (Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982)) ble fulgt for cDNA-syntese og rekombinant plasmidkonstruksjon ved innføring av det oppnådde cDNA. Prosessene for dette er skissert i fig. 9. precipitation. About 2.5 mg of the RNA thus obtained was dissolved in 1 ml of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA. After incubation at 65°C for 5 min. 0.1 ml of 5 M NaCl was added. The mixture was subjected to oligo(dT)-cellulose column (P-L Biochemicals) chromatography (column volume 0.5 ml). The adsorbed poly(A)-containing mRNA was eluted with a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 1 mM EDTA. Approximately 100 µg of poly(A)-containing mRNA was obtained. (2) cDNA synthesis and introduction of DNA into a vector The Okayama-Berg method (Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982)) was followed for cDNA synthesis and recombinant plasmid construction by introduction of the obtained cDNA. The processes for this are outlined in fig. 9.

Til 300 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) , 6 mM MgCl2 og 10 mM NaCl ble det tilsatt 400 ug. pCDVl (Okayama & Berg, Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)) og etter ytterligere tilsetning av 500 enheter av Kpnl ble reaksjonen gjennomført ved 3 7°C i 6 timer, hvorved plasmidet ble kuttet ved Kpnl-setet. DNA ble utvunnet ved fenol-kloroform-ekstraks jon etterfulgt av etanolutfelling. Omtrent 2 00 ug av det Kpnl-kuttede DNA ble tilsatt til 200 ul av en oppløsning fremstilt ved tilsetning av dTTP i en konsentrasjon på 0,25 mM til TdT-buffer og etter ytterligere tilsetning av 81 enheter av TdT (P-L Biochemicals) ble reaksjonen gjennomført ved 37°C i 11 min., hvorved en poly(dT)-kjede (omtrent 67 dT-rester) ble tilsatt til hver 3<1->ende av Kpnl-kuttingssetet av pCSVl. Omtrent 100 ug av det poly-(dT) kjedeforlengede pCDVl-DNA ble utvunnet fra oppløsningen ved etanolutfelling etter-fulgt av fenol-kloroformekstraksjon. DNA ble tilsatt til 150 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 100 mM NaCl og, etter ytterligere tilsetning av 360 enheter av EcoRI, ble reaksjonen gjennomført ved 37°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble behandlet ved hjelp av LGT-metoden og et DNA-fragment på omtrent 3,1 kb ble utvunnet. Omtrent 60 ug av poly(dT) kjedeforlenget pCDVl ble oppnådd på denne måte. DNA ble oppløst i 500 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA, oppløsningen ble inkubert ved 65°C i 5 min. og deretter avkjølt med is, og 50 fil av 5 M NaCl ble tilsatt. Blandingen ble underkastet oligo(dA)-cellulosekolonne (Collaborative Research) kromatografi. Molekyler med en tilstrekkelig poly(dT)-kjede-lengde ble adsorbert på kolonnen og de ble eluert med en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA til å gi 27 ug av poly(dT) kjedeforlenget pCDVl (i det følgende omtalt som vektor-primer). To 300 µl of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl2 and 10 mM NaCl was added 400 µg. pCDVl (Okayama & Berg, Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)) and after further addition of 500 units of KpnI, the reaction was carried out at 37°C for 6 hours, whereby the plasmid was cut at the KpnI site. DNA was recovered by phenol-chloroform extraction followed by ethanol precipitation. Approximately 200 µg of the Kpn1-cut DNA was added to 200 µl of a solution prepared by adding dTTP at a concentration of 0.25 mM to TdT buffer and after further addition of 81 units of TdT (P-L Biochemicals) the reaction was carried out at 37°C for 11 min, whereby a poly(dT) chain (approximately 67 dT residues) was added to each 3<1> end of the KpnI cut site of pCSV1. Approximately 100 µg of the poly-(dT) chain-extended pCDV1 DNA was recovered from the solution by ethanol precipitation followed by phenol-chloroform extraction. DNA was added to 150 µl of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl 2 and 100 mM NaCl and, after further addition of 360 units of EcoRI, the reaction was carried out at 37°C for 2 h . The reaction mixture was processed by the LGT method and a DNA fragment of approximately 3.1 kb was recovered. About 60 µg of poly(dT) chain-extended pCDV1 was obtained in this way. DNA was dissolved in 500 µl of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA, the solution was incubated at 65°C for 5 min. and then cooled with ice, and 50 µl of 5 M NaCl was added. The mixture was subjected to oligo(dA)-cellulose column (Collaborative Research) chromatography. Molecules with a sufficient poly(dT) chain length were adsorbed on the column and they were eluted with a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA to give 27 µg of poly(dT) chain extended pCDVl (hereinafter referred to as vector primer).

Deretter ble et linker-DNA fremstilt. Next, a linker DNA was prepared.

Omtrent 14 fig av pLl (Okayama & Berg; Mol. Cell. Biol. 3, 280 About 14 figs of pL1 (Okayama &Berg; Mol. Cell. Biol. 3, 280

(1983)) ble tilsatt til 200 fil av en buffer omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 50 mM NaCl og etter ytterligere'tilsetning av 50 enheter Pstl ble reaksjonen gjennomført ved .37°C i 4 timer for kutting av piil DNA ved Pstl-setet. Reaksjonsblandingen ble underkastet fenol-klor of ormekstraks jon og omtrent 13 (tg av Ps ti-kuttet pLl DNA ble utvunnet ved etanolutf elling. Omtrent 13 fig av DNA ble tilsatt til 50 fil TdT-buffer inneholdende dGTP i en endelig konsentrasjon på 0,25 mM og. etter ytterligere tilsetning av 54 enheter TdT (P-L Biochemicals) ble inkubasjon gjennomført ved 37°C i 13 min. for å bevirke addisjon av en (dG)-kjede (omtrent 14 dGrester) til pLl ved hver Pstl-kuttingssete 3'-ende. Etter fenol-kloroformekstraksjon ble DNA utvunnet ved etanolutf elling. DNA ble tilsatt til 100 fil av en buffer omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl og etter ytterligere tilsetning av 80 enheter Hindlll ble inkubasjonen gjennomført ved 3 7°C i 3 timer for å bevirke spalting av pLl DNA ved Hindlll-setet. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved hjelp av agarosegelelektroforese og et DNA-fragment på omtrent 0,5 kb ble utvunnet ved hjelp av DEAE-papirmetoden (Dretzen et al., Anal. Biochem., 112, 295 (1983)) was added to 200 µl of a buffer comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl 2 and 50 mM NaCl and after further addition of 50 units of Pstl the reaction was carried out at .37°C in 4 hours for cutting of piil DNA at the Pstl site. The reaction mixture was subjected to phenol-chlorine extraction and approximately 13 µg of Ps ti-cut pLl DNA was recovered by ethanol precipitation. Approximately 13 µg of DNA was added to 50 µl of TdT buffer containing dGTP at a final concentration of 0.25 mM and, after additional addition of 54 units of TdT (P-L Biochemicals), incubation was carried out at 37°C for 13 min to effect addition of a (dG) chain (approximately 14 dGrester) to pL1 at each Pstl cut site 3' -end. After phenol-chloroform extraction, DNA was recovered by ethanol precipitation. DNA was added to 100 µl of a buffer comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl2 and 60 mM NaCl and after further addition of 80 units HindIII, the incubation was carried out at 37°C for 3 hours to effect cleavage of pL1 DNA at the HindIII site.The reaction mixture was fractionated by agarose gel electrophoresis and a DNA fragment of approximately 0.5 kb was recovered by the DEAE paper method (Dretzen et al., Anal. Biochem., 112, 2 95

(1981)). På denne måte ble oligo(dG) kjedeforlenget linker-DNA (i det følgende omtalt enkelt som linker-DNA) oppnådd. (1981)). In this way, oligo(dG) chain-extended linker DNA (hereinafter referred to simply as linker DNA) was obtained.

Omtrent 2 fig av poly (A) RNA og omtrent 1,4 ug av vekt or-primeren oppløst i 22,3 fil av en oppløsning omfattende 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl2, 30 mM KCl, 0,3 mM DTT, 2 mM dNTP (dATP, cLTTP, dGTP og dCTP) og 10 enheter ribonuklease-inhibitor (P-L Biochemicals), 10 enheter revers transkriptase (Seikagaku Kogyo) ble tilsatt og inkubasjonen ble gjennomført ved 41°C i 90 min. for å bevirke at mRNA syntetiserte et DNA komplementært dertil. Reaksjonsblandingen ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon etterfulgt av etanolutfelling hvormed vektor-primer DNA med RNA-DNA dobbelttråd addert dertil ble utvunnet. DNA ble oppløst i 20 ul TdT-buffer inneholdende 66 uM dCTP og 0,2 ug poly (A) , 14 enheter TdT (P-L Biochemicals) ble tilsatt og inkubasjon ble gjennomført ved 3 7°C i 2 min. for å bevirke addisjon av en (dC)-kjede (20 dCrester) til 3•-enden av cDNA. Reaksjonsblandingen ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon og deretter ble det (dC)-kjedeforlengede cDNA-vektor-primer DNA utvunnet ved etanolutf elling. DNA ble oppløst i 400 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl, 2 0 enheter Hindlll ble tilsatt og inkubasjon ble gjennomført ved 37°C i 2 timer for kutting ved Hindlll-setet. Fenol-kloroformekstraksjon av reaksjonsblandingen og etanolutfelling ga 0,5 pikomol av det (dC)-kjedeforlengede cDNA vektor-primer-DNA. DNA (0,2 pikomol) ble oppløst i 100 ul av en oppløsning omfattende 10 mM Tris-HCl (PH 7,5), 0,1 M NaCl og 1 mM EDTA og inkubasjon ble gjennomført ved 65°C, 42°C og 0°C i hhv. 10 min., 25 min. og 30 min. og i den nevnte rekkefølge. Et totalt volum på 100 ul av reaksjonsmedium ble fremstilt i henhold til følgende sammensetning: 20 mM Tris-HCl (pH 7; 5), 4 mM MgCl2, 10 mM(NH4)2S04, 0,1 M KCl og 0,1 p-NAD. Til dette reaksjonsmedium ble det tilsatt 25 enheter E. coli DNA-ligase (New England Bio-Labs), og inkubasjon ble gjennomført ved 11°C i 18 timer. Reaksjonsmediet ble supplert med 40 mM av hver av dNTP og med p-NAD i en endelig konsentrasjon på 0,15 mM og etter tilsetning av 10 enheter E. coli DNA-ligase, 20 enheter E. coli DNA-polymerase I (P-L Biochemicals) og 10 enheter E. coli ribonuklease H (P-L Biochemicals) ble inkubasjon gjennomført ved 12°C i 1 time og deretter ved 25°C i 1 time. Den ovennevnte reaksjonsprosedyre bevirket ringslutning av cDNA-holdige rekombinant DNA og substitusjon av RNA-delen av RNA-DNA-dobbelttråden med det tilsvarende DNA. Det rekombinante plasmid ble således tildannet i form av et fullstendig dobbelttrådet DNA. About 2 µg of poly(A) RNA and about 1.4 µg by weight of the primer were dissolved in 22.3 µl of a solution comprising 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 8 mM MgCl 2 , 30 mM KCl, 0.3 mM DTT, 2 mM dNTP (dATP, cLTTP, dGTP and dCTP) and 10 units of ribonuclease inhibitor (P-L Biochemicals), 10 units of reverse transcriptase (Seikagaku Kogyo) were added and the incubation was carried out at 41°C for 90 min . to cause the mRNA to synthesize a DNA complementary to it. The reaction mixture was subjected to phenol-chloroform extraction followed by ethanol precipitation by which vector-primer DNA with RNA-DNA double strand added thereto was recovered. DNA was dissolved in 20 µl TdT buffer containing 66 µM dCTP and 0.2 µg poly (A), 14 units of TdT (P-L Biochemicals) were added and incubation was carried out at 37°C for 2 min. to effect addition of a (dC) chain (20 dCrester) to the 3• end of the cDNA. The reaction mixture was subjected to phenol-chloroform extraction and then the (dC) chain-extended cDNA vector primer DNA was recovered by ethanol precipitation. DNA was dissolved in 400 µl of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl 2 and 60 mM NaCl, 20 units of HindIII were added and incubation was carried out at 37°C for 2 hours before cutting at The hindlll seat. Phenol-chloroform extraction of the reaction mixture and ethanol precipitation yielded 0.5 picomoles of the (dC) chain-extended cDNA vector-primer DNA. DNA (0.2 picomoles) was dissolved in 100 µl of a solution comprising 10 mM Tris-HCl (PH 7.5), 0.1 M NaCl and 1 mM EDTA and incubation was carried out at 65°C, 42°C and 0°C in resp. 10 min., 25 min. and 30 min. and in the order mentioned. A total volume of 100 µl of reaction medium was prepared according to the following composition: 20 mM Tris-HCl (pH 7; 5), 4 mM MgCl 2 , 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1 M KCl and 0.1 p- NAD. 25 units of E. coli DNA ligase (New England Bio-Labs) were added to this reaction medium, and incubation was carried out at 11°C for 18 hours. The reaction medium was supplemented with 40 mM of each of dNTPs and with p-NAD at a final concentration of 0.15 mM and after the addition of 10 units of E. coli DNA ligase, 20 units of E. coli DNA polymerase I (P-L Biochemicals) and 10 units of E. coli ribonuclease H (P-L Biochemicals), incubation was carried out at 12°C for 1 hour and then at 25°C for 1 hour. The above reaction procedure effected circularization of cDNA-containing recombinant DNA and substitution of the RNA part of the RNA-DNA double strand by the corresponding DNA. The recombinant plasmid was thus produced in the form of a complete double-stranded DNA.

(3) Seleksjon av human LT cDNA-holdig rekombinant DNA (3) Selection of human LT cDNA-containing recombinant DNA

Det rekombinante plasmid oppnådd som beskrevet i (2) ble anvendt for transformering av E. coli C600SF8 (Cameron: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3416 (1975)) ved hjelp av fremgangsmåten til Scott et al. (Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Technology), 2, 616 (1983)). Omtrent 30.000 oppnådde kolonier ble fiksert på et nitrocellulosefilter. En stamme som sterkt kunne assosiere ved 52°C med en probe fremstilt ved merking med <32>P av 17-base syntetisk DNA 5'-GATCCCCGGCCTGCCTG-3' tilsvarende basesekvensen av en del av den 5'-ikke-translasjonale region av human LT cDNA isolert av Genentech (Patrick W. Gray et al., Nature, 312, 721 (1984)) ble selektert (Grunstein Hogness-metoden: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975)). Hele basesekvensen av cDNA i plasmidet pLTl som bæres av denne stamme ble bestemt ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13-fag. Som et resultat ble det funnet at pLTl DNA koder for human LT. The recombinant plasmid obtained as described in (2) was used to transform E. coli C600SF8 (Cameron: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3416 (1975)) by the method of Scott et al. (Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Technology), 2, 616 (1983)). About 30,000 colonies obtained were fixed on a nitrocellulose filter. A strain that could strongly associate at 52°C with a probe prepared by <32>P labeling of 17-base synthetic DNA 5'-GATCCCCCGGCCTGCCTG-3' corresponding to the base sequence of part of the 5'-non-translational region of human LT cDNA isolated by Genentech (Patrick W. Gray et al., Nature, 312, 721 (1984)) was selected (Grunstein Hogness method: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975)). The entire base sequence of cDNA in the plasmid pLT1 carried by this strain was determined by the dideoxy sequencing method using M13 phage. As a result, pLT1 DNA was found to encode human LT.

(4) Konstruksjon av det rekombinante plasmid pLAl(4) Construction of the recombinant plasmid pLA1

I totalt 50 ml av en oppløsning (i det følgende omtalt som "Y-0 buffer") inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2 og 6 mM 2-merkaptoetanol, ble det oppløst 5 iig pLTl (4,7 kb) oppnådd ved hjelp av prosedyren beskrevet i det foregående avsnitt, 10 enheter av restriksjonsenzymet XhoII (Boehringer Mannheim) ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. In a total of 50 ml of a solution (hereinafter referred to as "Y-0 buffer") containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl2 and 6 mM 2-mercaptoethanol, 5 µg of pLT1 ( 4.7 kb) obtained by the procedure described in the previous section, 10 units of the restriction enzyme XhoII (Boehringer Mannheim) were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 2 hours.

Deretter ble NaCl tilsatt i en sluttkonsentrasjon på 150 mM, 10 enheter av restriksjonsenzymet Nsil (New England Bio-Labs) ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i ytterligere 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,3 iig av et omtrent 750 bp DNA-fragment (XhoII-Nsil-fragment) inneholdende det meste av human LT DNA. Then NaCl was added to a final concentration of 150 mM, 10 units of the restriction enzyme Nsil (New England Bio-Labs) were added and the cutting reaction was carried out at 37°C for a further 3 hours. From the reaction mixture, approximately 0.3 µg of an approximately 750 bp DNA fragment (XhoII-Nsil fragment) containing most of human LT DNA was obtained by the LGT method.

Separat ble 20 ( iq pLTl oppløst i 200 «1 Y-50-buffer, 40 enheter av restriksjonsenzymet Haelll ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Deretter ble NaCl tilsatt til en endelig konsentrasjon på 150 mM, 40 enheter Nsil ble tilsatt og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i ytterligere 3 timer. Polyakrylamid-gelelektroforese av reaksjonsblandigen ga omtrent 40 ng av et omtrent 50 bp DNA-fragment (HaeIII-NsiI-fragment) Separately, 20 ( iq pLT1 was dissolved in 200 µl Y-50 buffer, 40 units of the restriction enzyme HaelIII was added and the cutting reaction was carried out at 37°C for 2 hours. Then NaCl was added to a final concentration of 150 mM, 40 units Nsil was added and the cutting reaction was carried out at 37°C for an additional 3 hours.Polyacrylamide gel electrophoresis of the reaction mixture yielded approximately 40 ng of an approximately 50 bp DNA fragment (HaeIII-NsiI fragment).

inneholdende den N-terminale del av human LT. containing the N-terminal part of human LT.

Videre ble separat 3 ug pGELl (3,4 kb) oppløst i totalt 3 0 fil Y-100 buffer, 6 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Stul og Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det.ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 1,0 ug av et Ap<r> gen-holdig DNA-fragment på omtrent 2,3 kb (StuI-BglII-fragment) . Furthermore, separately 3 µg of pGEL1 (3.4 kb) was dissolved in a total of 30 µl of Y-100 buffer, 6 units of each of the restriction enzymes Stu1 and Bgl11 were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 3 hours. Using the LGT method, approximately 1.0 µg of an Ap<r> gene-containing DNA fragment of approximately 2.3 kb (StuI-BglII fragment) was obtained from the reaction mixture.

Deretter ble 0,2 ug av det pLTl-avledede XholI-Nsil-fragment (omtrent 750 bp), 20 ng av pLTl-avledet Haelll-Nsil-fragment (omtrent 50 bp) og 0,6 ug av det iiGELl-avledede Stul-Bglll-fragment (omtrent 2,3 kb) oppløst i totalt 20 ul T4 ligasebuffer, 2 enheter T4 DNA-ligase (Takara Shuzo) ble videre tilsatt til denne blandingsoppløsning og reaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.2 µg of the pLTI-derived XholI-Nsil fragment (approximately 750 bp), 20 ng of the pLTI-derived HaelIII-Nsil fragment (approximately 50 bp) and 0.6 µg of the iiGELI-derived Stul- Bglll fragment (about 2.3 kb) dissolved in a total of 20 µl of T4 ligase buffer, 2 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) was further added to this mixture solution and the reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Det rekombinante plasmid DNA oppnådd på denne måte ble anvendt for transformering av E. coli KM430 ved hjelp av metoden til Cohen et al., og det ble oppnådd en Ap<r->koloni. Plasmid-DNA ble isolert og renset fra denne transformant ved hjelp av en kjent metode, og strukturen av plasmidet ble analysert ved kutting av plasmid-DNA med restriksjonsenzymer som f.eks. Stul. Som et resultat ble det bekreftet at det ønskede plasmid var blitt oppnådd. Dette rekombinante plasmid betegnes pLAl. The recombinant plasmid DNA thus obtained was used for transformation of E. coli KM430 by the method of Cohen et al., and an Ap<r> colony was obtained. Plasmid DNA was isolated and purified from this transformant using a known method, and the structure of the plasmid was analyzed by cutting plasmid DNA with restriction enzymes such as Steal. As a result, it was confirmed that the desired plasmid had been obtained. This recombinant plasmid is designated pLA1.

(5) Konstruksjon av LT ekspresjonsplasmidet pLSAl (5) Construction of the LT expression plasmid pLSAl

En E. coli KM430 transformarit som inneholdt pLAl (3,1 kb) oppnådd som beskrevet i det foregående avsnitt ble dyrket og pLAl DNA ble fremstilt fra dyrkede celler derav på konven-sjonell måte. I 30 ul Y-100 buffer ble det oppløst 3 ug av det oppnådde pLAl DNA,--3 enheter av hver-av St-uT og Bglll ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 3 7°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 ug av et omtrent 790 bp DNA-fragment (Stul-BgllI-fragment) inneholdende det meste av det humane LT-gen. An E. coli KM430 transformant containing pLA1 (3.1 kb) obtained as described in the previous section was cultured and pLA1 DNA was prepared from cultured cells thereof in a conventional manner. In 30 µl of Y-100 buffer, 3 µg of the obtained pLA1 DNA was dissolved, 3 units each of St-uT and BglII were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 3 hours. From the reaction mixture, approximately 0.5 µg of an approximately 790 bp DNA fragment (Stul-BgllI fragment) containing most of the human LT gene was obtained by the LGT method.

Separat ble 3 ug pKYLlO fremstilt ved hjelp av metoden beskrevet i US patentskrift nr. 4.686.191 oppløst i 3 yl Y-10 0 buffer, 6 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll og Pstl ble tilsatt, og spaltningsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd et tryptofan-promoter (Ptrp)-holdig DNA-fragment på omtrent 1,1 kb (BanIII-PstI-fragment). Ytterligere 2 ug pGELl (3,4 kb) ble oppløst i 20 fil Y-100 buffer, 4 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Hindlll, BamHI og Pstl ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,7 ug av et lipoproteinavledet terminatorholdig DNA-fragment på omtrent 1,7 kb (Pstl-BamHI-fragment). Separately, 3 µg of pKYL10 prepared using the method described in US Patent No. 4,686,191 was dissolved in 3 µl of Y-10 0 buffer, 6 units of each of the restriction enzymes BanIII and PstI were added, and the cleavage reaction was carried out at 37°C in 3 hours. From the reaction mixture, a tryptophan promoter (Ptrp)-containing DNA fragment of approximately 1.1 kb (BanIII-PstI fragment) was obtained by the LGT method. An additional 2 µg of pGEL1 (3.4 kb) was dissolved in 20 µl of Y-100 buffer, 4 units of each of the restriction enzymes HindIII, BamHI and PstI were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 3 hours. From the reaction mixture, approximately 0.7 µg of a lipoprotein-derived terminator-containing DNA fragment of approximately 1.7 kb (Pstl-BamHI fragment) was obtained by the LGT method.

Separat, av slike grunner som nødvendigheten av å tilveiebringe sekvensen fra den N-terminale ende av det modne humane LT-polypeptid, nemlig Leu (CTA) til den andre basen (GG) av den 5. aminosyren Gly (GGC) såvel som initieringskodonet (ATG) nødvendig for ekspresjon og nødvendigheten av å innstille avstanden mellom SD-sekvensen nedstrøms fra Ptrp og ATG til en passende lengde på 6-18..bp, ble følgende DNA-linker syntetisert: Separately, for reasons such as the necessity to provide the sequence from the N-terminal end of the mature human LT polypeptide, namely Leu (CTA) to the second base (GG) of the 5th amino acid Gly (GGC) as well as the initiation codon ( ATG) required for expression and the necessity to set the distance between the SD sequence downstream from Ptrp and ATG to an appropriate length of 6-18..bp, the following DNA linkers were synthesized:

Først ble 27-mer og 25-mer enkelttrådede DNA'er syntetisert ved hjelp av den vanlige fosfotriestermetode. 27-mer og 25-mer (hver 20 pikomol) ble oppløst i totalt 40 ul T4 kinasebuffer, 6 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. First, 27-mer and 25-mer single-stranded DNAs were synthesized using the usual phosphotriester method. 27-mer and 25-mer (each 20 picomoles) were dissolved in a total of 40 µl of T4 kinase buffer, 6 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) were added and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min.

Deretter ble 0,3 ug av det pLAl-avledede Stul-Bglll-fragment (omtrent 790 bp), 0,6 ug av BanIII-PstI-fragmentet av ekspresjons-vektoren pKYPlO og 0,6 ug av det pGELl-avledede Pstl-BamHI-fragment (omtrent 1,7 kb), hvert oppnådd som beskrevet i det foregående, oppløst i 25 ul T4 ligasebuffer, og omtrent 1 pikomol av den ovennevnte DNA-linker ble tilsatt til denne blandingsoppløsning.. Etter ytterligere tilsetning av 6 enheter av T4 DNA-ligase til denne blanding ble ligeringsreaksjonen gjennomført ved 4°C i 18 timer. Then, 0.3 µg of the pLAI-derived Stul-BglII fragment (approximately 790 bp), 0.6 µg of the BanIII-PstI fragment of the expression vector pKYP10 and 0.6 µg of the pGELI-derived PstI-BamHI -fragment (about 1.7 kb), each obtained as described above, dissolved in 25 µl of T4 ligase buffer, and about 1 picomole of the above DNA linker was added to this mixture solution.. After further addition of 6 units of T4 DNA ligase to this mixture, the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den rekombinante plasmidholdige reaksjonsblanding ble anvendt for transformering av E. coli KM430 og det ble oppnådd en Ap<r->kolbni. Plasmid-DNA ble utvunnet fra dyrkede celler fra denne koloni. Strukturen av det oppnådde plasmid ble bekreftet ved kutting med restriksjonsenzymene EcoRI, Banlll, Pstl, Hindlll og Bglll etterfulgt av agarosegelelektroforese. Dette plasmid betegnes pLSAl. Base-sekvensen av pLSAl i nærheten av Banlll og Hindlll ble bekreftet ved hjelp av Maxam-Gilbert-metoden (A.M. Maxam et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA, 74, 560 (1977)) til å være som følger: The recombinant plasmid-containing reaction mixture was used for transformation of E. coli KM430 and an Ap<r-> colbni was obtained. Plasmid DNA was recovered from cultured cells from this colony. The structure of the obtained plasmid was confirmed by cutting with the restriction enzymes EcoRI, BanIII, PstI, HindIII and BglII followed by agarose gel electrophoresis. This plasmid is designated pLSAl. The base sequence of pLSAl in the vicinity of BanIII and HindIII was confirmed by the Maxam-Gilbert method (A.M. Maxam et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA, 74, 560 (1977)) to be as follows:

Undereksempel 4 Subexample 4

Konstruksjon av ATG- vektoren pTrS2 0 Construction of the ATG vector pTrS2 0

Ved å følge prosedyren vist i fig. 13 ble ATG-vektoren pTrS2 0 . hvori avstanden mellom SD-sekvensen og initieringskodonet ATG er 14 baser og som har et SacI-sete umiddelbart bak ATG-kodonet konstruert. By following the procedure shown in fig. 13, the ATG vector became pTrS2 0 . in which the distance between the SD sequence and the initiation codon ATG is 14 bases and which has a SacI site immediately behind the ATG codon constructed.

Først ble 3 fig pKYPlO fremstilt ved hjelp av metoden beskrevet i US patentskrift nr. 4.686.191 oppløst i 30 fil Y-10 0 buffer, 6 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Banlll og Nrul (New England Bio-Labs) ble tilsatt, og kuttingsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsblandingen ble det ved hjelp av LGT-metoden oppnådd omtrent 0,5 fiq av et Ptrp-holdig DNA-fragment på omtrent 3,8 kb (Banlll-NruI-fragment). First, 3 µg of pKYP10 prepared using the method described in US Patent No. 4,686,191 were dissolved in 30 µl of Y-10 0 buffer, 6 units of each of the restriction enzymes BanIII and NruI (New England Bio-Labs) were added, and the cutting reaction was carried out at 37°C for 3 hours. From the reaction mixture, approximately 0.5 µg of a Ptrp-containing DNA fragment of approximately 3.8 kb (Banlll-NruI fragment) was obtained by the LGT method.

Separat ble følgende DNA-linker syntetisert ved hjelp av fosfotriestermetoden for å tilveiebringe initieringskodonet ATG nedstrøms fra Ptrp: Separately, the following DNA linkers were synthesized by the phosphotriester method to provide the initiation codon ATG downstream of Ptrp:

i in

19-mer og 17-mer syntetiske DNA1 er (hvert 10 pikomol) ble oppløst i totalt 2 0 fil av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP, 3 enheter av T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) ble tilsatt og fosforyleringsreaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 60 min. 19-mer and 17-mer synthetic DNA1s (each 10 picomoles) were dissolved in a total of 20 μl of a solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 5 mM dithiothreitol, 0.1 mM EDTA and 1 mM ATP, 3 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) were added and the phosphorylation reaction was carried out at 37°C for 60 min.

Deretter ble 0,1 fig av det pKYPlO-avledede Banlll-Nrul-fragment (omtrent 3,8 kb) oppnådd som beskrevet i det foregående og omtrent 0,5 pikomol av den ovennevnte DNA-linker oppløst i 2 0 fil T4 ligasebuf f er, 2 enheter T4 DNA-ligase ble ytterligere tilsatt og ligeringsreaksjonen ble gjennomført ved 4°C i 18 timer. Next, 0.1 µg of the pKYP10-derived BanIII-NruI fragment (about 3.8 kb) obtained as described above and about 0.5 picomoles of the above DNA linker were dissolved in 20 µl of T4 ligase buffer. , 2 units of T4 DNA ligase were further added and the ligation reaction was carried out at 4°C for 18 hours.

Den oppnådde rekombinante plasmid-blanding ble anvendt for transformering av E. coli HB101 (Boliver et al.. Gene, 2, 75 The obtained recombinant plasmid mixture was used for transformation of E. coli HB101 (Boliver et al.. Gene, 2, 75

(1977)), og en Ap<r->koloni ble oppnådd. Fra dyrkede celler fra denne koloni ble plasmid-DNA utvunnet. Strukturen av det oppnådde plasmid ble bekreftet ved kutting med restriksjonsenzymene EcoRI, Banlll, Hindlll, SacI og Nrul, etterfulgt av agarosegelelektroforese. Dette plasmid ble betegnet pTrS2 0 (fig. 13). Base-sekvensen av pTrS20 i nærheten av Banlll og Hindlll-setene ble bekreftet ved hjelp av dideoksysekvenseringsmetoden under anvendelse av M13 fag til å være som følger: (1977)), and an Ap<r->colony was obtained. From cultured cells from this colony, plasmid DNA was recovered. The structure of the obtained plasmid was confirmed by cutting with the restriction enzymes EcoRI, BanIII, HindIII, SacI and NruI, followed by agarose gel electrophoresis. This plasmid was designated pTrS2 0 (Fig. 13). The base sequence of pTrS20 in the vicinity of the BanIII and HindIII sites was confirmed by the dideoxy sequencing method using M13 phage to be as follows:

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid avledet fra hG-CSF-polypeptidet ved delesjon, hvor et peptid omfattende første til fjerde, første til femte, første til sjette, første til syvende eller første til ellevte aminosyrer på den N-terminale del av. hG-CSF-polypeptidet mangler, og eventuelt i tillegg til aminosyredelesjonen, er den syttende aminosyre cystein (Cys <+17>) i hG-CSF-polypeptidet erstattet med serin (Ser), med den betingelse at de første til fjerde aminosyrer til hG-CSF-polypeptidet kun er deletert dersom Cys<+17> i hG-CSF-polypeptidet er erstattet med Ser, karakterisert ved at en DNA-sekvens som koder for nevnte polypeptid settes inn i en passende ekspresjonsvektor, uttrykkes i en passende vertscelle og hvorpå polypeptidet isoleres fra cellekulturen.1. Method for producing a polypeptide derived from the hG-CSF polypeptide by deletion, wherein a peptide comprising first to fourth, first to fifth, first to sixth, first to seventh or first to eleventh amino acids on the N-terminal part of. The hG-CSF polypeptide is missing, and possibly in addition to the amino acid deletion, the seventeenth amino acid cysteine (Cys <+17>) in the hG-CSF polypeptide is replaced with serine (Ser), with the condition that the first to fourth amino acids of hG - The CSF polypeptide is only deleted if Cys<+17> in the hG-CSF polypeptide is replaced by Ser, characterized in that a DNA sequence encoding said polypeptide is inserted into a suitable expression vector, expressed in a suitable host cell and then the polypeptide is isolated from the cell culture. 2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 for fremstilling av et polypeptid med en aminosyresekvens som avledet fra aminosyresekvensen til hG-CSF-polypeptidet ved substitusjon av den syttende aminosyren (cystein) med serin og delesjon av fire til syv aminosyrer på den N-terminale del derav, karakterisert ved at den omfatter å underkaste et polypeptid som avledet fra hG-CSF-polypeptidet ved substitusjon av den syttende aminosyre (cystein) med serin og av minst en aminosyre av de første til sjette aminosyrer på den N-terminale del derav med en aminosyre forskjellig derfra for innvirkningen av en protease i et vandig medium for derved å bevirke dannelse av nevnte polypeptid i reaksjonsblandingen, og hvorpå polypeptidet isoleres fra blandingen.2. Method as stated in claim 1 for the production of a polypeptide with an amino acid sequence derived from the amino acid sequence of the hG-CSF polypeptide by substitution of the seventeenth amino acid (cysteine) with serine and deletion of four to seven amino acids on the N-terminal part thereof, characterized in that it comprises subjecting a polypeptide derived from the hG-CSF polypeptide by substitution of the seventeenth amino acid (cysteine) with serine and of at least one amino acid of the first to sixth amino acids on the N-terminal part thereof with a amino acid different therefrom for the action of a protease in an aqueous medium to thereby effect formation of said polypeptide in the reaction mixture, and whereupon the polypeptide is isolated from the mixture. 3 . DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for polypeptidet som fremstilt i krav 1.-3. DNA sequence, characterized in that it codes for the polypeptide as prepared in claim 1.-