NO312226B1 - Anvendelse av 4,6-<Omikron>-(benzyliden-d1)-D-glukopyranose og den tilsvarende 1-isomer ved profylakse og behandling av kreft - Google Patents

Description

Denne oppfinnelsen vedrører anvendelse av benzaldehydderivater til fremstilling av anticancer midler.

De fleste kreftmedikamenter som brukes i dag virker cytotoksisk. Selv om disse midlene har vist gode resultater ved behandling av noen kreftformer som lymfekreft, leukemi og testikkelkreft, gir de ofte alvorlige og uakseptable bivirkninger som begrenser muligheten for effektiv behandling. Dessuten har kjemoterapi ved en rekke kreftformer som f.eks. ved solide tumorer (karsinom) hittil vist seg å ha begrenset verdi, da etablerte cytostatika sjelden bedrer prognosen for pasienten. Kreftcellenes evne til å utvikle motstand mot cytotoksiske produkter er også en hovedårsak til at de ikke kan brukes til behandling av solide tumorer. Derfor er det et behov for nye kreftmedikamenter med færre bivirkninger og en mer selektiv virkning på kreftceller.

Det erkjent bl.a. fra EP-0215395, JP-63264411, JP-8800940, JP-55069510 og EP-0283139 at benzaldehyder og derivater av disse har en selektiv virkning mot kreft.

Aldehyder reagerer med en rekke O-, S- eller N-holdige nukleofile grupper som hydroksylgrupper, sulfhydrylgrupper og aminogrupper under dannelse av karbonylholdige kondensasjonsprodukter som acetaler, merkaptaler, aminaler etc. Med primære aminer vil reaksjonen imidlertid normalt føre til en addisjonsforbindelse i form av en Schiff-base (et imin). Det er velkjent at in vivo Schiff-base dannelse er involvert ibiokjemiske nøkkelprosesser som transaminering, dekarboksylering og andre aminosyremodifiserende reaksjoner som katalyseres ved hjelp av pyridoksalfosfat, virkningen av aldolase på fruktosedifosfat i glykolysen og kondensasjonen av retinal med rodopsin i synsprosessen. Det er også kjent at signalisering gjennom membraner innebærer karbonylkondensasjonsreaksjoner, f.eks. når det skal settes i gang en respons fra immunsystemet.

Dannelsen av iminer skjer ved en totrirmsmekanisme. Ved å tilsette en amino-nukleofil til karbonylgruppen dannes mellomproduktet karbinolamin (aminohydrin), deretter følger et dehydreringstrinn ved dannelsen av dobbeltbindingen C=N. Begge trinnene er reversible, men begunstiges ved forskjellige pH-verdier. Derfor går reaksjonen etter en karakteristisk klokkeformet pH-/hastighetsprofil hvor den høyeste totale reaksjons-hastigheten opptrer ved moderat pH.

Imidlertid vet man at Schiff-baser lett dannes også ved fysiologiske betingelser, og mange karbonylkondensasjonsreaksjoner er vel kjent in vivo (E.Schauenstein et. al., Aldehydes in Biological Systems, London, Pion Ltd., 1977).

Schiff-basen er gjerne selv et reaktivt molekyl, og deltar ofte i ytterligere reaksjoner som fører til addisjon av nukleofile enheter til dobbeltbindingen. For visse svovelholdige aminer, spesielt aminosyrene cystein og metionin og for glutation, vil Schiff-basen som dannes først kunne gjennomgå reversibel intern ringdannelse hvor sulfhydrylgruppen adderes til iminet under dannelse av tiazolidinkarboksylat (M.Friedman, The Chemistry and Biochemistry of the Sulfhydryl Group in Amino Acids, Peptides and Proteins, Oxford, Pergamon Press, 1973).

Indikasjoner på reaksjoner mellom karbonylforbindelser og frie amino grupper i proteiner under dannelse av reversible Schiff-baser ble rapportert av G.E.Means og R.E.Feeney (Chemical Modification of Proteins, s. 125 - 138, San Francisco, Holden-Day, 1971). Aromatiske aldehyder er generelt mer reaktive enn mettede alifatiske aldehyder, og kan danne Schiff-baser selv uten at man fjerner vann under reaksjonen.

(R.W.Layer, Chem. Rev. 63 (1963), 489-510). Dette er viktig når man tar i betraktning dannelse av Schiff-baser under fysiologiske betingelser. Med hemoglobin som kilde for aminogrupper har Zaugg et. al. (J. Biol. Chem. 252 (1977), 8542 - 8548) vist at aromatiske aldehyder er to til tre ganger så reaktive som alifatiske aldehyder for dannelse av Schiff-baser. En forklaring på den begrensede reaktiviteten til alkanalene kunne være at det i vannløsning ved nøytral pH kreves et meget stort overskudd av fritt aldehyd for å forskyve likevekten i retning av Schiff-basedannelse (E.Schauenstein et. al., Aldehydes in Biological Systems, London, Pion Ltd., 1977).

Benzaldehyd danner lett Schiff-baseiminer med membran-arninogrupper, og det er målt høye likevektskonstanter for reaksjonen av benzaldehyd med aminer (J.J. Pesek og J.H.Frost, Org. Magnet. Res. 8 (1976), 173 - 176, J.N.Williams Jr. og R.M.Jacobs, Biochim. Biophys. Acta., 154 (1968), 323 - 331).

Vi har tidligere vist ved å fotografere reaksjoner mellom radioaktivt merkede reagenser at benzaldehydet ikke går inn i cellene, men bindes til cellemembranen (Dornish, J.M. og Pettersen, E.O., Cancer Letters 29 (1985), 235-243). Dette stemmer overens med en tidligere undersøkelse som viser at benzaldehydet reagerte med membranproteinene til E. coli (K.Sakaguchi et. al., Agric. Biol. Chem. 43 (1979), 1775-1777). Det ble også funnet at både pyridoksal og pyridoksal-5-fosfat beskytter cellene mot det cytotoksiske anticancer medikamentet cis-DDP. Cis-DDP virker på kjernen inne i cellen. Selv om pyridoksalet i prinsippet kunne trenge gjennom den lipofile cellemembranen er dette umulig for pyridoksal-5-fosfat på grunn av den ioniske fosfatgruppen. Pyridoksal-5-fosfatet må derfor utøve beskyttelsesvirkningen utenfor cellemembranen. En samtidig observasjon av en forskyvning i spektrografisk absorbans for pyridoksal-5-fosfat til kortere bølgelengder samsvarer med dannelse av Schiff-base-addisjonsforbindelser mellom aldehydet og aminogrupper i cellemembranene (J.M.Dornish og E.O.Pettersen, Cancer Lett. 29, (1985), 235 - 243).

Disse funnene tyder på at aldehyder bindes til aminer og andre nukleofile enheter på cellemembranen ved å danne Schiff-baser og andre kondensasjonsprodukter. Det er kjent at celler stimuleres til vekst av en kaskade av hendelser som virker fra utsiden av cellemembranen. På samme måte kan derivatene i den foreliggende patentsøknaden virke ved å danne addisjonsforbindelser med ligander på cellemembranen og gi opphav til impulser inne i cellen som har betydning for cellevekstparametre som proteinsyntese og mitose, og på uttrykking av immunrespons og tumorundertrykkende gener. Siden kondensasjonsreaksjonene er reversible kan celleeffektene moduleres ved en like-vektforskyvning som involverer de molekylene som bindes sammen. At det finnes dynamiske likevekter på kjemisk nivå stemmer overens med den reversible og ikke-giftige virkningsmåten til benzaldehydderivatene.

Benzaldehydderivatenes hemming av proteinsyntesen er meget godt studert in vitro i forskningsgruppen vår. I solide tumorer kan den reduserte proteinsyntesen resultere i en mangel på livsviktige proteiner som fører til at cellen dør. Normale celler har en potensiell kapasitet for proteinsyntese som er større enn i de fleste kreftceller i solide tumorer. Dette kan man vise ved å sammenlikne cellesyklustiden for normale stam-celler, som ofte er under 10 timer, med cellesyklustiden for de fleste kreftceller i solide; tumorer, som typisk er 30-150 timer (se Gustavo og Pileri i: The Cell C<y>cle of Cancer,' red.: Baserga, Marcel Dekker Inc., N.Y. 1971, s. 99). Siden cellene i gjennomsnitt fordobler proteininnholdet sitt under en cellesyklus betyr dette at det samler seg mer

protein i vekststimulerte normale celler enn i de fleste typer kreftceller.

Med denne forskjellen mellom kreftceller og normale celler i tankene er det en annen forskjell av liknende viktighet å ta i betraktning: mens normale celler reagerer på vekstregulerende stimuli har kreftceller ingen eller en redusert slik respons. Mens normale celler under ordinære vekstbetingelser kan ha et reservevekstpotensiale, vil derfor kreftceller ha liten eller ingen slik reserve. Hvis proteinsyntesen hemmes kontinuerlig over et langt tidsrom både i kreftceller og normale celler, vil de to celletypene kunne reagere forskjellig. Det normale vevet vil kunne bruke noe av reservevekstpotensialet og dermed opprettholde en normal celleproduksjon. Men kreftvev har liten eller ingen slik reserve. Samtidig er hastigheten for oppsamling av protein i kreftceller nokså lav (d.v.s. proteinsyntesen skjer bare litt raskere enn proteinnedbrytingen). Derfor kan proteinsyntesehemmingen være nok til å gjøre kreftvevet ubalansert med hensyn til proteinoppsamlingen, noe som resulterer i en negativ balanse for visse proteiner. Under kontinuerlig behandling i flere dager vil dette resultere i inaktivering av cellene og nekrose i tumorvevet mens det normale vevet forblir uskadd.

Til dags dato er 5,6-benzyliden-di-askorbinsyre [zilascorb(<2>H)] den mest testede av dei forbindelsene som gir reversibel hemming av proteinsyntesen og viser aktivitet mot kreft. Den proteinsyntesehemmende aktiviteten til denne kjente forbindelsen beskrives i detalj av Pettersen et.al. (Anticancer Res., bind 11, s. 1077-1082, 1991) og i EP-0283139. Zilascorb(<2>H) gir tumornekrose in vivo i implantater av humant tumorvev på; nakne mus (Pettersen et al., Br. J. Cancer, bind 67, s. 650-656, 1993). I tillegg til zilascorb(<2>H) er den nærmest beslektede kjente forbindelsen for kreftbehandling 4,6-0-benzyliden-D-glukopyranose (forbindelse 1). Disse to forbindelsene har en kjent generell aktivitet mot kreft og har vært testet klinisk mot en rekke kreftsykdommer. Imidlertid viste ikke noen spesielle kreftsyke organer eller vev seg som mer egnet for behandling enn andre med disse forbindelsene, slik at det ikke var berettiget å utvikle medikamentet kommersielt.

Vi har nå overraskende funnet at benzaldehydderivater av sukkere av heksosetypen (deriblant 4,6-0-(benzyliden-di)-D-glukopyranose, forbindelse 2) har en uventet sterk effekt mot kreft i visse organer eller vev. Vi kan ikke forklare mekanismen for denne selektiviteten ennå, men vi tror at den er forbundet med at sukkergruppen i derivatene har en affinitet for visse celler eller vev. For eksempel har forbindelse 2 (glukose-derivatet av deuterert benzaldehyd) en forbløffende mye bedre virkning mot leverkreft enn zilascorb( H) (derivat av deuterert benzaldehyd og askorbinsyre) (se eksempel 6). Også i eksperimenter med Panc-1-celler som stammer fra menneskelige kreftsvulster i bukspyttkjertelen har vi overraskende nok funnet at forbindelse 2 gir sterkere protein-hemming enn zilascorb(<2>H) (se eksempel 2, fig. 3). Felles for disse vevstypene er høy konsentrasjon av visse glukosetransportører og -reseptorer. Det finnes ingen indikasjoner i den kjente teknikk som tilsier en bedre effekt ved behandling av lever- og bukspyttkjertelkreft med forbindelse 2 enn med zilascorb(<2>H). Tvert imot ville vi basert på kjente eksperimenter som er fremlagt i EP-0283139 vente at forbindelse 2 ville vise en liknende eller litt svakere effekt enn zilascorb(<2>H).

Vi har også funnet ved eksperimentene våre at den deutererte analogen til disse forbindelsene er vesentlig mer effektiv enn tilsvarende protonanalog. Forskjellen i virkning er meget påfallende i cellebindingseksperimentet vårt (se eksempel 3 og også eksempel 7). Når et hydrogenatom er substituert med den dobbelt så tunge deuterium-isotopen endres de kinetiske egenskapene til molekylet, siden hastigheten for å bryte C-D-bindingen er lavere enn for å bryte C-H-bindingen. Det er kjent bl.a. fra M.I.Blake et.al., J.Pharm. Sei. 64 (1975), 367-391 at den farmakologiske funksjonen av medikamenter kan endres ved deuterering.

Det er også kjent (EP 0 283 139 og Anticancer Res. 15: 1921-1928 (1955)) at når acetalprotonet i 4,6-O-benzyliden-D-glukopyranose erstattes med deuterium (forbindelse 1/forbindelse 2) kan dette virke inn både på proteinsyntesen og den celleoverievelsesfraksjonen som måles in vitro. Vi tror at en mulig forklaring på denne deuteriumisotopvirkningen på kjemisk nivå kommer av at det deutererte benzaldehydet oksideres langsommere til den inaktive benzosyren, noe som resulterer i en lengre halveringstid for den deutererte aktive ingrediensen på cellenivået. Imidlertid må man bruke medikamentkonsentrasjoner på mer enn 6 mM for å se en signifikant forskjell i fraksjonen av NHIK 3025-celler som overlever når de utsettes for forbindelse 1 sammenliknet med overlevelsesfraksjonen for forbindelse 2. Forskjellen i protein-syntesehemming var meget liten når disse cellene ble utsatt for konsentrasjoner på 1-10 mM.

Nå gjorde oppfinnerne en helt annen type eksperiment. Adhesjonskraften mellom NHIK 3025-celler og substratum ble målt etter pre-inkubering av cellene i løsninger av forbindelse 1 og 2 (se eksempel 3). Selv ved så lav konsentrasjon som 1 mM så man en forbløffende D-isotopeffekt. Overraskende nok reduserte forbindelse 2 adhesjonskraften signifikant til 1/3 i forhold til kontrollen, mens forbindelse 1 ikke ga noen signifikant reduksjon. Oppfinnerne tror at forbindelse 2 kan interferere med biosyntesen av integriner slik at cellens evne til å binde seg til substratum reduseres. Integriner er strukturelle transmembranproteiner som er viktige for å binde celler til ekstracellulær matriks og for interaksjoner mellom cellene. Å hemme funksjonen til integrinene kan dermed innvirke direkte på kreftcellenes evne til å danne metastaser. Eksperimentet tyder på at integrinene kan være spesielt følsomme for hemming av proteinsyntesen. Forbindelse 2 kan derfor gjerne brukes til å forebygge metastaseprosesser under utvikling av kreft.

I en in vzvo-modell hvor vi sammenliknet forbindelse 1 og 2 ble kreftceller fra den leverinvaderende humane kolorektale kreftcellelinjen C170HM2 injisert intraperitonealt i nakne mus etter behandling med de to medikamentene. Dyrene som var behandlet med forbindelse 2 hadde forbløffende mye mindre tumordannelse i leveren sammenliknet med de som var behandlet med forbindelse 1 (se eksempel 7).

I de ovennevnte eksperimentene har vi vist at D-isotopeffekten kan være mer relevant for kreftbehandling med aldehydderivater enn hva som tidligere var kjent. De to eksperimentene sammen (eksempel 3 og 7) viser at forbindelse 2 og liknende medikamenter kan være spesielt gunstig for behandling av primær og sekundær leverkreft.

Bruk av forbindelse 1 (4,6-O-benzyliden-D-glukopyranose) bl.a. mot kreft i leveren presenteres i US-4.882.314.1 eksperiment 2 i US-4.882.314 ble en pasient som hadde tykktarmskreft med metastaser i leveren kurert. Men i eksperiment 5 i det nevnte US-patentet, avgikk en pasient som hadde en primær levertumor med døden etter fire måneders behandling.

Senere har G.Tanum et al., Am. J. Clin. Oncol. (CCT), 13(2), 1990, s. 161-163 konkludert med at forbindelse 1 ikke er aktiv hos pasienter med kolorektal kreft. I denne undersøkelsen ble behandlingen gitt daglig i to måneder og: virkningen ble evaluert ved måling av tumorstørrelsen.

I et eksperiment som ble utført av oppfinnerne på kjemisk indusert leverkreft hos Wistar-rotter som ble behandlet intravenøst i 10 dager, så man overraskende nok at det hadde utviklet seg massive nekrotiske områder hos 2 av 5 dyr som ble behandlet med forbindelse 2, men ingen av de 5 dyrene som ble behandlet med forbindelse 1 (se eksempel 6).

Oppfinnerne av den foreliggende oppfinnelsen gjorde også en undersøkelse hvor nakne mus som var injisert med C170HM2-celler ble behandlet med forbindelse 1 og forbindelse 2. Tumorlinjen C170HM2 er en human kolorektal cellelinje som fås fra primærsvulsten til pasienten. Ved terminering ble leveren eksponert mens man talte de synlige levertumorene og målte det totale tverrsnittarealet av dem. Virkningen av forbindelse 2 på leverinvasjonen av den humane kolorektale tumoren C170HM2 var langt bedre enn virkningen av forbindelse 1 (eksempel 7).

Videre observerte oppfinnerne overraskende nok at forbindelse 2 ga en vesentlig bedre effekt på utviklingen av leverkreft hos rotter enn zilascorb(<2>H). Etter initiell nitro-saminbehandling og partiell hepatektomi på unge rotter utviklet dyrene leverkreft i løpet av 3 til 6 måneder. Etter ytterligere 11 måneders behandling med enten zilascorb(<2>H) eller forbindelse 2, ble både antallet av dyr som utviklet leverkreft så vel som mengden av kreftvev i kreftsvulstene redusert flere ganger mer for dyr som ble behandlet med forbindelse 2 enn for dyr som ble behandlet med zilascorb(<2>H) (se eksempel 6).

Altså er det nå funnet at noen av forbindelsene av formel (I), som forbindelse 2 og forbindelse 5, overraskende gir mye bedre terapeutisk virkning på leverkreft (primær så vel som metastatisk) enn de tidligere kjente virkningene.

I en innavlet slekt av Wistar-rotter (se Eker R., Acta Path. Microbiol. Scand., 34, (1954) 554-562) utvikler dyrene nyrekreft som resultat av et autosomt dominant gen. Ved 11 måneders alder ble dyrene operert for å inspisere hvilke som hadde utviklet kreft (50% av dem hadde nyrekreft). Dyr med tumorer på 2-4 mm diameter ble inkludert i eksperimentet siden erfaringen tilsier at slike små tumorer ikke har nekrotiske områder: Disse rottene fikk injeksjoner daglig i 10 dager, med isotonisk saltløsning (placebo), med saltvann som inneholdt zilascorb(<2>H), med den ikke-deutererte analogen til zilascorb(<2>H) (5,6-O-benzylidenaskorbinsyre-natriumsalt) eller med forbindelse 2. Mens tumorene til dyr som fikk den ikke-deutererte analogen til zilascorb(<2>H) og de som fikk placebo viste liten eller ingen nekrose etter 10 dagers behandling, var tumorene til de dyrene som ble behandlet med zilascorb(<2>H) eller forbindelse 2 halvt nekrotiske (se eksempel 8).

i Den kjemisk induserte karsinogenesen (som i eksempel 6) har en mekanisme som likner karsinogenesen til visse virustyper som hepatitt B og C, visse papillomvirus, visse herpesvirus etc. Dette er spesielt tilfelle ved utvikling av leverkreft hos pasienter som ér infisert med hepatitt B og C. Man kan derfor anta at en forebyggende behandling av disse pasientene med produkter i henhold til oppfinnelsen kan forebygge eller forsinke utviklingen av leverkreft. Også det faktum at disse produktene har en lav giftighetsprofil (for eksempel forbindelse 2) ville gjøre dem egnet for slik behandling.

Ved en immunologisk gjenkjennelsesprosess sperres et fragment av et fremmed protein inne i kløften i et MHC-klasse II-protein på overflaten av en antigenpresenterende celle (APC). Til dette MHC-antistoffkomplekset bindes også reseptoren for en T-hjelpercelle. For å aktivere en T-hjelpercelle trengs minst to signaler. Det primære signalet gis av antigenet selv, via MHC-klasse II-komplekset og forsterkes av CD4-koreseptorene. Det andre signalet kan fås fra et spesifikt signaliseirngsmolekyl som er bundet i plasma-membranen på overflaten av APC-cellen. Et tilsvarende koreseptorprotein befinner seg på overflaten av T-hjelpercellen. Begge signalene er nødvendige for å aktivisere T-cellene. Når de aktiviseres vil de stimulere sin egen formering ved å skille ut inter-leukinbaserte vekstfaktorer og syntetisere tilsvarende reseptorer på overflaten. Bindingen av interleukinet til disse reseptorene stimulerer så T-cellene direkte til å formere seg.

På 1980-tallet ble det kjent at et syklodekstrin-benzaldehydbasert inklusjonskompleks kunne stimulere immunsystemet ved å styrke de lymfokinaktiverte drepercellene i en musemodell (Y. Kuroki et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117, (1991), 109-114). In vz/ro-studier har senere avslørt naturen til de kjemiske reaksjonene ved APC-donor-/T-cellereseptor-interaksjonsstedene som er ansvarlige for det andre stimulerende signalet, og at disse reaksjonene har form av karbonyl-aminokondensasjoner (Schiff-basedannelse). Videre kan disse interaksjonene imiteres av syntetiske kjemiske enheter. Disse oppdagelsene åpner for nye terapeutiske muligheter for kunstig modulering av immunsystemet. IWO 94/07479 kreves patent for bruk av visse aldehyder og ketoner som danner Schiff-baser og hydrazoner med aminogrupper på T-celleoverflaten. I EP 0609606 A2 er den foretrukne immunstimulerende substansen 4-(2-formyl-3-hydroksy-fenoksymetyl)benzosyre (Tucaresol), en' forbindelse som opprinnelig var konstruert for å kurere sigdcelleanemi. Denne substansen gis oralt og er systemisk biotilgjengelig. Potensialet til Tucaresol for å kurere et antall sykdommer som f.eks. bakterie-, virus- og protozoinfeksjoner, autoimmunsykdommer og kreft undersøkes nå (H.Chen og J.Rhodes, J. Mol. Med. (1996) 74:497-504) og kombinasjonsstrategier hvor Tucaresol gis sammen med en vaksine for å kurere kronisk hepatitt B, HIV og malignt melanom er under utvikling.

Måling av immunparametre in vitro og undersøkelser av virkningene in vivo resulterte i en klokkeformet dose-/responsprofil (H.Chen og J.Rhodes, J. Mol. Med. (1996) 74:497-504). Dette dose-/responsforholdet, som ellers er noe uvanlig, kan begrunnes ved å anta at en høy konsentrasjon av aldehydmedikamentet fører til at de ko-stimulerende ligandene som trengs for effektiv binding av APC til T-cellen mettes med medikament-molekyler slik at virkningen svekkes. En dose som er nok til å danne en dynamisk likevekt som bidrar til stimulering uten å blokkere bindingen mellom cellene ser ut til å være optimal.

Generelt er aldehyder i seg selv ustabile overfor oksidasjon. 4-(2-formyl-3-hydroksy-fenoksymetyl)benzosyre (Tucaresol) som presenteres i EP-0609606 er betydelig mer aktiv in vivo enn in vitro. Årsaken til dette kan være at medikamentet oksideres i vannløsning in vitro (H.Chen og J.Rhodes, J. Mol. Med. (1996) 74:497-504). Mange aldehyder er for reaktive til å gis som aldehyder, og selv om benzaldehyd har vist seg å være et aktivt anticancer medikament in vitro, er det svært irriterende og uegnet for direkte bruk in vivo. I et biologisk system vil karbonylgruppen i aldehydet reagere raskt med nukleofile grupper som finnes i store mengder i alle kroppsvæsker. Disse uønskede sidereaksjonene kan føre til rask metabolisering av medikamentet og vanskeligheter med å kontrollere konsentrasjonen i serum av det aktive medikamentet. Å kontrollere medikamentet på cellenivået innen et smalt konsentrasjonsvindu er avgjørende for å oppnå en effektiv immunmodulering. Tucaresol gis oralt som et ubeskyttet aldehyd, og det kan være grunn til å mistenke at medikamentet kan være utsatt for oksidasjon og at farmakokinetikken kan være vanskelig å kontrollere.

Benzaldehydderivatene 4,6-benzyliden-D-glukose og den deutererte analogen (forbindelse 1 og 2) har vist seg å ha høy biotilgjengelighet enten de gis intravenøst eller peroralt. Biotilgjengeligheten for BALB-mus målt som konsentrasjon i serum etter oral tilførsel av forbindelse 2 var 93-99% (C.B. Dunsaed, J.M. Dornish og E.O. Pettersen, Cancer Chemother. Pharmacol. (1995) 35: 464-470). Dessuten kan glukosegruppen ha affinitet til reseptorer på celleoverflaten slik at medikamentet blir mer tilgjengelig på cellenivået. Det frie aldehydet kan lett frigjøres ved hydrolyse av acetalet slik at karbonylgruppen blir tilgjengelig for Schiff-basedannelse med målligandene.

I den foreliggende patentsøknaden er aldehydene derivatiserte med biologisk akseptable karbohydrater som glukose og danner acetaler med dem. Sukkergruppen vil dermed gi bidrag til å øke stabiliteten og forbedre biotilgjengeligheten av aldehydfunksjonen for målcellene. Dette fører overraskende nok til, at karbonylkondensasjonsreaksjonene blir mer effektive og farmakokinetikken lettere kontrollerbar ved bruk av forbindelsene våre sammenliknet med tidligere kjente forbindelser.

For å sammenlikne forbindelse 2 med Tucaresol ble proteinsyntese og inaktivering av celler målt ved like store konsentrasjoner av de to medikamentene. Som det kan ses fra fig. 1 og fig. 2, ble det påvist at forbindelse 2 var mer effektiv enn Tucaresol med hensyn til begge de målte parametrene.

Den immunstimulerende virkningen av de nye forbindelsene kan også brukes ved behandling av visse virussykdommer i kombinasjon med annen behandling mot virus som f.eks. virusmedikamenter eller vaksiner. Mange virustyper vil etter den første infeksjonen inkorporere seg i cellekjernen og er inaktive i lang tid. Onkogene virus som hepatitt B og C, visse retrovirus og visse papillomvirus kan føre til utvikling av kreft. I disse latente periodene er det svært vanskelig å kurere virusinfeksjonen. Men slike virus vil ofte bli aktivert av immunrespons slik at de går ut i blodet, og i dette trinnet er det mulig å bli kvitt virusinfeksjonen. Benzaldehydderivatenes evne til å utløse immun-responsen kan brukes i kombinasjon med virusmidler eller vaksiner til å utvikle en behandling for disse sykdommene.

Det er et hovedmål med oppfinnelsen å tilveiebringe forbindelser for effektiv og gunstig forebygging og/eller behandling av leverkreft (primær leverkreft såvel som lever-metastaser fra andre kreftformer, f.eks. kolorektal kreft). Forebyggende behandling kan også være av stor betydning for å hindre utviklingen av leverkreft hos personer med hepatitt B- eller C-infeksjon.

Et annet mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe forbindelser for effektiv og gunstig forebygging og/eller behandling av nyrekreft.

Et tredje mål med oppfinnelsen'er å tilveiebringe forbindelser for effektiv og gunstig forebygging og/eller behandling av kreft i bukspyttkjertelen.

Disse og andre mål med oppfinnelsen oppnås ved de vedlagte patentkravene.

Forbindelsene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen er 4,6-0-(benzyliden-di)-D-glukopyranose (forbindelse 2), den tilsvarende L-isomeren, eller farmasøytisk akseptable salter derav.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen beskrives videre nedenfor med eksempler og vedlagte figurer og tabeller.

Beskrivelse av figurene

Fig. 1: Dataene representerer et eksperiment hvor NHIK 3025-celler ble behandlet med forbindelse 2 (A) eller Tucaresol (•) i 20 timer ved 37°C mens de var festet til petri-skåler i plast. Overlevende fraksjon betyr hvor stor andel av cellene som var i stand til å danne en makroskopisk koloni etter behandlingen. Hvert punkt representerer middel-verdien av kolonitellinger fra 5 parallelle skåler. Standardavvikene vises hvis de er større enn symbolene. Fig. 2: Hastigheten av proteinsyntesen i forhold til ubehandlet kontrollgruppe av NHIK 3025-celler behandlet med forbindelse 2 (■) eller Tucaresol (A) i 1 time ved 37°C. Hastigheten av proteinsyntesen ble målt som mengden av [<3>H]-valin som ble inkorporert i løpet av den første timen etter starten av medikamentbehandlingen. Proteinsyntesehastigheten ble målt relativt til den totale mengden av protein i cellene. Dataene er representative for et eksperiment utført i kvadruplikat. Standardavvikene vises hvis de er større enn symbolene. Fig. 3: Hastigheten av proteinsyntesen i forhold til ubehandlet kontrollgruppe av Panc-1-celler behandlet med forbindelse 2 (■) eller zilascorb(<2>H) (a). Hastigheten av proteinsyntesen ble målt som mengden av [<3>H]-valin som ble inkorporert i løpet av dem første timen etter starten av medikamentbehandlingen. Proteinsyntesehastigheten ble målt relativt til den totale mengden av protein i cellene. Standardavvikene er mindre enn symbolene. Fig. 4: Median-adhesjonskraft for celler som ble utsatt for forskjellige benzaldehydderivater. Cellene ble utsatt for en 1 mM konsentrasjon av forbindelse 1 og 2. Fig. 5: Perifere mononukleære blodceller og superantigen i Ex Vivo 10-medium ble utsatt for enten benzaldehyd, deuterert benzaldehyd, forbindelse 2 eller zilascorb(<2>H). Formeringen av perifere mononukleære blodceller ble målt som inkorporering av tritiert tymidin ved de forskjellige medikamentkonsentrasjonene. Fig. 6: NMRI-mus ble infisert intraperitonealt med miltinvaderende Friend-erytroleukemivirus. Infiserte og uinfiserte mus ble behandlet intraperitonealt daglig med 5 mg/kg av forbindelse 2. Etter 19 dagers behandling ble milten dissekert ut og veid.

Fig. 7: Hvilken andel av dyrene som hadde levertumorvev ved obduksjonen.

Fig. 8: Gjennomsnittlig mengde tumormateriale pr. lever i de dyrene som hadde fått tumorer. Fig. 9: Vekstkurver som representerer gjennomsnittlig kroppsvekt pr. dyr for hver gruppe. Tidsskalaen representerer dyrenes alder. For å gjøre kurvene tydeligere vises , standardavvikene bare på noen få av målingene. Fig. 10: Plotting av både hyppigheten og størrelsen av levertumorene på samme kurve, med logaritmisk skala på størrelseaksen. Fig. 11: Viser virkningen av forbindelse 1, 2 og 5 på leverinvasjonen av menneskelig kolorektal tumor, C170HM2. Forbindelse 5 er 4,6-0-(benzyliden-di)-2-deoksy-D-glukopyranose.

Beskrivelse av de vedlagte tabellene.

Tabell 2: Histologiske observasjoner i normalt vev og kreftvev. Gruppe 1: ubehandlet kontroll.

Tabell 3: Histologiske observasjoner i normalt vev og kreftvev. Gruppe 2: placebo.

Tabell 4: Histologiske observasjoner i normalt vev og kreftvev. Gruppe 3: 85 mg/kg/dag av forbindelse 2.

Fremstilling

Som kjent gjennomgår aldehyder syrekatalyserte kondensasjonsreaksjoner med alkoholer under dannelse av acetaler. Samtidig fås vann som et biprodukt. Reaksjonen er reversibel, og i løsning dannes en likevektsblanding av aldehyd/alkohol og acetal/vann. Likevektsposisjonen bestemmes hovedsakelig av reaktiviteten og konsentrasjonen av hvert molekylslag. For å gjøre reaksjonen fullstendig fjerner man gjeme et av produktene (acetal eller vann) fra reaksjonsblandingen.

I den foreliggende patentsøknaden kondenseres D(+) eller L(-) glukose med benzaldehyder eller benzaldehydekvivalenter for å danne benzyliden glukose acetaler. Spesielt foretrukket er en reacetaliseirngsstrategi hvor benzaldehydet innføres beskyttet som dimetylacetalet i stedet for benzaldehydet selv. Dermed dannes metanol som biprodukt. Reaksjonsblandingen oppvarmes moderat ved redusert trykk for å fjerne metanolen så snart den dannes. I de fleste tilfellene vil disse reaksjonsbetingelsene lett forskyve likevekten til fordel for acetalet.

Acetalisering av sukkere vil normalt føre til at det dannes blandinger av regio- og stereoisomerer. Det kan også opptre ringkontraksjoner som fører til blandinger av pyranoser og furanoser og i noen tilfeller dannes di-acetaliseirngsprodukter. Hvis man ikke bruker beskyttelsesstrategier vil man derfor ofte få ytterst komplekse reaksjons-blandinger. Imidlertid ble det fremstilt overraskende rene produktfraksjoner etter passende opparbeiding, spesielt ved væskekromatografi. Identifikasjonen av produktene ble gjort ved GC-MS-spektroskopi og forskjellige NMR-teknikker.

De spesifikke reaksjonsbetingelsene og hvilke løsningsmidler og katalysatorer som

brukes vil i hvert enkelt individuelt tilfelle avhenge av løseligheten og reaktiviteten av reaktantene og av egenskapene til produktet. Katalysatoren kan være en mineralsyre, f.eks. svovelsyre, en organisk syre, f.eks. para-toluensulfonsyre, et surt ionebyttemiddel, f.eks. Amberlyst 15, en elektrofil mineralleire, f.eks. montmorillonitt K-10 eller en resinstøttet supersyre, f.eks. Nafion NR 50. Reaksjonen kan gjerne utføres i et dipolart, aprotisk løsningsmiddel som dimetylformamid, dimetylacetamid, dimetylsulfoksid, N-metylpyrrolidon, dimetoksyetan eller liknende. Paratoluensulfonsyre i dimetylformamid var det foretrukne og mest brukte reaksjonsmediet.

De deutererte forbindelsene kan fremstilles som bekrevet ovenfor, men med utgangspunkt i dimetylacetalet av benzaldehyd-di. Fremstilling av deutero-benzaldehyd kan utføres med en modifisert Rosenmund-reduksjon med D2-gass i et deuterert løsningsmiddel, som beskrevet i EP 0 283 139 Bl.

De følgende eksemplene illustrerer hvordan forbindelsene til den foreliggende oppfinnelsen kan fremstilles.

Forbindelse 1: 4, 6- O- benzyliden- D- glukopvranose

Denne kjente forbindelsen ble fremstilt som beskrevet for forbindelse 2, med utgangspunkt i udeuterert benzaldehyddimetylacetal. Identiteten ble bekreftet ved

'H NMR-spektroskopi i DMSO-d6:

8 rel. til TMS: 7,58-7,29 (5H, m, Ar-H), 6,83 (0,4H, d, OH-l-p), 6,60 (0,6H, d, OH-1-a), 5,61 (1H, s+s, acetal-H), 5,25 (0,4H, d, OH-3-P), 5,21 (0;4H, d, OH-2-P), 5,62 (0,6H, d, OH-3-a), 5,00 (0,6H, H-l-a), 4,82 (0,6H, d, OH-2-a), 4,49 (0,4H, t, H-l-P),

4,18-4,02 (1H, m, H-6'-a+P), 3,89-3,77 (0,6H, m, H-5-a), 3,75-3,57 (1,6H, m, H-6"-a+p og H-3-a), 3,45-3,27 (2,5H, m, H-3-P, H-4-a+p, H-5-p og H-2-a) og 3,11-3,00 (0,4H, m, H-2-<p>).

Forbindelse 2: 4, 6- 0-( benzyliden- dj)- D- glukopyranose

Benzaldehyd-di ble fremstilt og konvertert til benzaldehyddimetylacetal-di som beskrevet i EP 0 283 139 B1. Fremstillingen av 4,6-0-(benzyliden-di)-D-glukopyranose er også beskrevet i EP 0 283 139 Bl, men denne gangen ble forbindelsen fremstilt etter en alternativ fremgangsmåte hvor høy renhet var prioritert: D(+)-glukose (706 g, 3,92 mol), benzaldehyddimetylacetal-di (571 g, 3,73 mol), tørr DMF (1,68 kg) og paratoluensulfonsyre (4,5 g, 24 mmol) ble blandet i et tørrdestillasjonsapparat koblet til en vakuumpumpe gjennom en kaldreflukskondensator. Den mekanisk rørte blandingen ble oppvarmet til maks. 69 °C ved 30 torr for å destillere av metanol og etter 2 timer var det samlet opp 235 g. Reflukskondensatoren ble så stengt av og temperaturen økt til maks. 73 °C for å destillere av DMF. Etter ytterligere 2 timer var det samlet opp ytterligere 1385 g og destillasjonen ble avbrutt. Destillasjonsresten ble avkjølt til 40 °C og tilsatt isvann (2,9 1) før det var gått 5 min. Temperaturen falt under 0 °C og det dannet seg et bunnfall, delvis som store klumper. Blandingen ble overført til et begerglass og tilsatt ytterligere 8-9 1 isvann for å få klumpene til å falle fira hverandre og gå i suspensjon. Suspensjonen ble filtrert på to nutch-filtre og man lot de to filterkakene stå over natten på filtrene tilkoblet vann-strålepumpe og begge filterkakene ble tilført N2 gjennom en omvendt trakt. Filterkakene ble spredd ut på to plater og tørket ved 32 °C i 20 timer i en vakuumovn. Vakuumet ble først satt til 13 millibar og så regulert ned til 1 millibar.

Råproduktet ble omkrystallisert (for å fjerne dibenzylidenacetaler) og vasket med vann (for å fjerne DMF og glukose) inntil disse forurensningene var eliminert. Følgelig ble råproduktet (500 g) løst i varm dioksan (800 ml) og løsningen overført til kokende kloroform (9 1) gjennom et foldefilter. Løsningen ble avkjølt, først til romtemperatur, så i et isbad over natten. Bunnfallet ble filtrert fra, tørket i 2 timer på filteret (under tilførsel av N2 som beskrevet over) og tørket videre over natten ved 31 °C i vakuum på en rotavapor. Produktet (142 g) ble suspendert i isvann (1 1), filtrert på en nutch (vasking med 200 ml isvann) og tørket på filteret over natten som beskrevet over. Deretter ble det oppmalt, siktet (0,5 mm gitter) og tørket i vakuum i 5 timer ved 31 °C på en rotavapor. Produktet (96 g) ble igjen suspendert i isvann (500 ml), filtrert (vasking med 150 ml isvann) og tørket (7 timer under N2-strøm). Det ble til slutt oppmalt i en morter, siktet (0,5 mm) og tørket i en vakuumovn.

Produktet var et hvitt, finfordelt pulver av høy renhet ifølge HPLC-analysen. Utbyttet var 95 g, 10 % av teoretisk utbytte. NMR i DMSO-d6 indikerte et ct:p anomerforhold på omtrent 7:3.

<!>H og <13>C NMR (DMSO-d6), 5 rel. til TMS: 7,55-7,28 (5.00H, m, Ar-H), 6,85 (0,27H, d, OH-l-p), 6,58 (0,71H, d, OH-l-a), 5,24 (0,27H, d, OH-3-P), 5,19 (0,28H, d, OH-2-p), 5,61 (0,71H, d, OH-3-a), 4,99 (0,72H, H-l-a), 4,82 (0,71H, d, OH-2-a), 4,48 (0,29H, t, H-l-p), 4,20-4,04 (1,04H, m, H-6'-a+P), 3,88-3,73 (0,78H, m, H-5-a), 3,73-3,56 (1,72H, m, H-6"-a+p ogH-3-a), 3,46-3,21 (2,61H, m, H-3-P, H-4-a+p, H-5-p og H-2-a) og 3,09-2,99 (0,28H, m, H-2-p); 137,881,128,854, 128,042, 126,435 (Ar-C), 100,462 (acetal-C), 97,642 (C-l-P), 93,211 (C-l-a), 81,729 (C-4-a), 80,897 (C-4-p), 75,796 (C-2-p), 72,906 (C-2-a og C-3-P), 69,701 (C-3-a), 68,431 (C-6-a), 68,055 (C-6-p), 65,810 (C-5-p) og 62,032 (C-5-a).

Biologiske eksperimenter

Eksempel 1

Biologiske materialer og metoder som brukes til å vise virkningen av forbindelsene.

Cellekultutreknikker

Humane celler, NHIK 3025, fra en livmorhalstumor in situ (Nordbye, K og Oftebro, R. Exp. Cell Res., 58:458, 1969, Oftebro, R. og Nordbye K., Exp. Cell Res., 58:459-60, 1969) ble dyrket i Eagels Minimal Essential Medium (MEM) komplettert med 15 % kalvefosterserum (Gibco BRL Ltd). Humane brystkreftceller, T-47D, (Keydar, I. et al., Er. J. Cancer, bind 15, s. 659-670,1979) ble dyrket i mediet RPMI-1640 komplettert med 10 % kalvefosterserum, 0,2 u/ml insulin, 292 mg/ml L-glutamin, 50 u/ml penicillin, 50 mg/ml streptomycin. Cellene dyrkes rutinemessig som enkeltlag ved 37 °C i vevskulturkolber. For å holde cellene i kontinuerlig eksponentiell vekst ble de trypsinifisert og gjenoppdyrket tre ganger pr. uke.

Cellenes overlevelsesfaktor

Overlevelsesfaktoren ble målt som evnen til kolonidannelse. Før såingen ble de eksponentielt voksende cellene trypsinifisert, suspendert som enkeltceller og sådd direkte på 5 cm plastskiver. Antallet sådde celler ble justert slik at antallet overlevende celler ville bli omtrent 150 pr. skive. Etter omtrent 2 timers inkubering ved 37 °C hadde cellene festet seg til bunnen av skivene. Medikamentbehandlingen ble så startet ved å erstatte mediet med et medium som hadde den ønskede medikamentkonsentrasjonen. Etter medikamentbehandlingen ble cellene renset igjen med varm (37 °C) Hanks balanserte saltløsning før det ble tilsatt friskt medium. Etter 10 til 12 dager ved 37 °C i en C02-inkubator ble cellene fiksert i etanol og farget med metylenblått før koloniene ble talt.

Utfra fig. 1 kan man se at forbindelse 2 gir høyere grad av celleinaktivering enn Tucaresol.

Eksempel 2

Proteinsyntese

Proteinsyntesehastigheten ble beregnet som tidligere beskrevet (Ronning, O.W. et al., J. Cell Physiol., 107: 47-57, 1981). Kort sagt ble celleproteinet merket til metningspunktet ved minst 2 dagers preinkubering med [<14>C]-valin av konstant spesifikk radioaktivitet (0,5 Ci/mol). For å holde den spesifikke radioaktiviteten konstant ble det brukt en høy konsentrasjon av valin i mediet (1,0 mM). Ved denne valinkonsentrasjonen vil fortyn-ningen av [<14>C]valin i det intracellulære og det proteolytisk genererte valinet være neglisjerbar (Ronning, O.W., et al., Exp. Cell Res. 123: 63-72, 1979). Proteinsyntesehastigheten ble beregnet utfra inkorporeringen av [<3>H]valin relativt til den totale [<14>C]-radioaktiviteten i proteinet ved begynnelsen av de forskjellige måleperiodene og uttrykt som et prosenttall pr. time (Ronning, O.W. et al., J. Cell Physiol., 107: 47-57, 1981).

Man kan se av fig. 2 at forbindelse 2 fører til sterkere hemming av proteinsyntesen enn Tucaresol.

Fra fig. 3 kan man se at forbindelse 2 fører til sterkere hemming av proteinsyntesen enn zilascorb( H). Cellene som brukes i eksperimentet er Panc-1 -celler fra en human buk-spyttkjerteltumor (Lieber et al., Int. J. Cancer, 15: 741-747, 1975) dyrket i medium E2a.

Eksempel 3

Cellebindingsmålinger

Cellebindingskreftene ble målt med manipulasjonskraftmikroskopet. (G. Sagvolden. Manipulation force microscope. Doktoravhandling, Universitetet i Oslo, 1998, og G. Sagvolden, I. Giaever og J. Feder. Characteristic protein adhesion forces on glass and polystyrene substrates by atomic force microscopy. Langmuir 14 (21), 5984-5987, 1998) NHIK 3025-kreftceller ble dyrket kortvarig i et C02-uavhengig medium som inneholdt 15% kalvefosterserum. Cellene ble i 20 timer utsatt for en 1 mM konsentrasjon av forbindelse 1 eller forbindelse 2 før de ble frigjort fra cellekulturkolbene med trypsin. Cellene ble holdt i suspensjon og sådd i medium med forbindelse 1 eller forbindelse 2 på vevskultursubstrater av polystyren 90 minutter etter at trypsinreaksjonen ble stoppet. Adhesjonskraften mellom celle og substrat ble målt ved å løsne cellene ved hjelp av en skrå atomær kraftmikroskopbom som virket som kraftomformer. Cellene ble løsnet en om gangen og hver av cellene ble løsnet bare en gang.

Den maksimale kraften som ble brukt på hver av cellene ble registrert som funksjon av tiden som var gått siden cellene ble sådd på substratet. Fig. 4 viser medianen av en gruppe på 19 kraftmålinger som en funksjon av gjennomsnittstiden for celler som har vært utsatt for forbindelse 1 eller forbindelse 2 sammen med adhesjonskraften til celler som ikke er utsatt for disse forbindelsene. Forbindelse 2 reduserer adhesjonskraften sterkt ved denne konsentrasjonen, mens forbindelse 1 ikke viser noen signifikant effekt. Virkningen av forbindelsene er hovedsakelig å redusere adhesjonskraften til cellene, men ikke tidsforløpet av adhesjonen.

Den reduserte evnen til å feste seg til substratet kan være beslektet med blokkering av den integrinbaserte celleforankringen. Det har blitt vist at slik blokkering kan føre til programmert celledød både i hepatom- og melanom-tumorer. (Paulsen JE, Hall KS, Rugstad HE, Reichelt KL og Elgjo K, The synthetic hepatic peptides pyroglutamyl-glutamylglycylserylasparagine and pyroglutamylglutamylgylcylserylaspartic acid inhibit growth of MH1C1 rat hepatoma cells transplanted into buffalo rats and athymic mice. Cancer Res. 52 (1992) 1218-1221 og Mason MD, Allman R og Quibell M, "Adhesion molecules in melanoma - more than just superglue?" J. Royal Soc. Med. 89

(1992) 393-395).

Adhesjonskraften mellom NHIK 3025-celler og substratet ble målt etter preinkubering av cellene i løsninger av forbindelse 1 og 2. Selv ved 1 mM konsentrasjon kunne man se en forbløffende D-isotopeffekt. Overraskende nok reduserte forbindelse 2 adhesjonskraften signifikant til 1/3 i forhold til kontrollen, mens forbindelse 1 ikke ga noen signifikant reduksjon. Oppfinnerne tror at forbindelse 2 kan ha innvirket på biosyntesen av integriner og dermed redusert cellens evne til å binde til substratet. Integriner er strukturelle transmembranproteiner som er avgjørende for å binde celler til en ektra-cellulær matriks og for interaksjoner mellom celler. Å hemme funksjonen av integrinene kan derfor direkte virke på metastaseevnen til kreftceller. Eksperimentet tyder på at integriner kan være spesielt følsomme for hemming av proteinsyntesen. Forbindelse 2 kan derfor med fordel brukes til å hindre metastaseprosesser ved utvikling av kreft.

Eksempel 4

Eksperimenter med forbindelse 2 på NMRI- mus infisert med FRIEND erytroleukemivirus ( FLV)

Virus: Eveline-celler ble tilveiebrakt av prof. Gerhard Hunsman, Miinchen. Vi har vist at dette viruset, som opprinnelig ble brukt som en kilde for Fri end hjelpervirus, inneholder et defekt virus av samme størrelse som det miltfokusdannende viruset (Spleen Focus Forming Virus - SFFV) som gir erytroleukemi hos NMRI-mus etter 4-8 uker.

Mus: NMRI-musene kom fra gamle Bomholt Gård i Danmark, og ble innkjøpt via SIFF. Musene ankom 6. mai og var med i eksperimentet fra 11. mai. De ble infisert intraperitonealt med 50 mikroliter supernatant fra Evelin-kultur. Behandlingen ble startet etter 24 timer. Forbindelse 2 ble løst i steril isotonisk glyserolløsning i en konsentrasjon som tilsvarer 5 mg pr. kg ved tilførsel av 50 mikroliter intrapeirtonealt.

Eksperimentet ble satt opp som følger:

10 mus uinfisert kontroll

10 mus infisert kontroll

5 mus uinfisert, behandlet med forbindelse 2

10 mus infisert, behandlet med forbindelse 2

Musene fikk intraperitoneale injeksjoner en gang om dagen i 19 dager. Fra 1. juni til 16. juni, da de ble avlivet, fikk de ingen behandlinger. Musene ble avlivet 16. juni. Det ble tatt blodprøver (for senere analyse). Milten ble fjernet og veid (se tabell 1 nedenfor). En bit av milten ble frosset i nitrogen for å lage tynne snitt og en bit ble fiksert i formalin.

Resultatene vises også i fig. 6.

Som man kan se er det en signifikant forskjell i miltvekten for de infiserte dyrene sammenliknet med de uinfiserte. Miltvekten for de uinfiserte dyrene som behandles med forbindelse 2 ligger over vekten for de uinfiserte kontrolldyrene, selv om dette ikke er signifikant. Man ser at infiserte dyr som ble behandlet med forbindelse 2 faktisk har en lavere gjennomsnittlig miltvekt enn de uinfiserte dyrene som ble behandlet på samme måte (her går man ut fra at resultatet skyldes et dyr i kontrollgruppen som hadde en forholdsvis stor milt).

En histologisk undersøkelse avslørte at de uinfiserte kontrolldyrene hadde en normal miltanatomi. Alle dyrene i den infiserte ubehandlede gruppen hadde invasjon av patologiske leukemiceller i den røde pulpa. Miltene fra begge de uinfiserte kontrollgruppene som ble behandlet med forbindelse 2, har forstørrede kimsentre, noe som tolkes som et uttrykk for immunstimulering. Man finner ikke leukemiske endringer i milten for den infiserte gruppen som ble behandlet med forbindelse 2.

Resultatene er oppmuntrende tatt i betraktning den aggressive karakteren av FLV hos mus og også når man sammenlikner virkningen av medikamentene med virkningene av azidothymin og andre virusbehandlinger.

Eksempel 5

Formering av perifere mononukleære blodceller

Oppfinnerne utførte et eksperiment hvor perifere mononukleære blodceller ble utsatt for superantigen sammen med benzaldehyd, deuterert benzaldehyd, forbindelse 2 eller zilascorb(<2>H). Superantigen brukes som en meget aktiv standard for formering av T-celler og presenteres til T-celler ved hjelp av antigenpresenterende celler.

Eksperimentet viste (se figur 5) at ved å tilsette benzaldehyd, deuterert benzaldehyd eller forbindelse 2 økte formeringen av perifere mononukleære blodceller signifikant på en klokkeformet doseavhengig måte, mens det ble funnet en svært liten virkning med zilascorb(<2>H). Det at vi var i stand til å øke formeringssignalet fra superantigenet tyder på at forbindelsene fungerer ved at de medvirker til å stimulere T-cellene.

Eksempel 6

Virkninger på tumorer ved leverkreft hos rotter fremkalt med nitrosamin

I dette eksperimentet testet vi om 11 måneders behandling med forbindelse 2 eller zilascorb( H) kunne hindre utvikling av kreft i leveren hos rotter etter partiell hepatektomi og behandling med dietylnitrosamin (DENA) og fenobarbital.

Materialer og metoder:

Vi brukte Wistar Kyoto-rotter fra Versuchtierzucht Institut, Hannover. Det ble utført partiell hepatektomi (70% fjernet) på 4 uker gamle rotter ved Radiumhospitalet før intraperitoneal behandling med dietylnitrosamin (DENA) og 4 ukers foring med fenobarbital. De fleste dyrene utviklet leverkreft innen 10 måneder etter en slik karsinogen initiering. Seks og en halv måned etter denne, d.v.s. før det hadde utviklet seg noen kreft, ble behandlingen startet ved Statens arbeidsmiljøinstitutt. 56 dyr ble tilfeldig fordelt på 4 grupper med 14 i hver og gitt den følgende daglige intravenøse medikamentdosen:

Gruppe 1: kontroll, ingen injeksjoner

Gruppe 2: placebo, bare injeksjoner av saltløsning

Gruppe 3: 85 mg/kg forbindelse 2

Gruppe 4: 100 mg/kg zilascorb(<2>H)

Behandlingen ble gitt i en 5 ukers periodisk syklus: første 3 uker daglig intravenøs injeksjon, så 2 ukers pause. Totalt ble det utført 9 fullstendige 5-ukers behandlings-perioder. Totalt forløpt tid fra den første behandlingen til avslutningen av behandlingen og obduksjon var 11 måneder.

Ved obduksjonen ble volumet av levertumorene omtrentlig estimert, men uten å skjære i levermaterialet. Etter fiksering i formalin utførte først professor Jahn M. Nesland, leder av patologiavdelingen ved det norske Radiumhospitalet et nøyaktig estimat av tumor-massen ved å skjære opp og inspisere vevet makroskopisk og utførte deretter en histologisk undersøkelse både på tumorvevet (som viste seg hovedsakelig i leveren) så vel som det normale vevet fra alle relevante organer og vev.

Man foretok en histologisk undersøkelse av forekomsten av multiple foki så vel som premalignante noduler for hvert av dyrene.

Resultater

Medikamentvirkninger på tumorene, analysert som antallet dyr som hadde levertumorer ved obduksjonen, viser at det er en signifikant lavere hyppighet av dyr med levertumorer i gruppen som ble behandlet med forbindelse 2 enn i den som ble behandlet med placebo. Analyse ved hjelp av en ensidig Fischers eksakttest gir en p-verdi på 0,05. Hvis begge kontrollgruppene slås sammen er det 28 kontrolldyr. 25 av disse utviklet leverkreft. Av de 14 dyrene som ble behandlet med forbindelse 2 utviklet 7 leverkreft. I dette tilfellet er antallet dyr høyt nok for en x<2->test, som viser at forskjellen er signifikant med p = 0,015.1 gruppen som ble behandlet med zilascorb(<2>H) utviklet 11 av 14 dyr leverkreft. Dette er bare én færre enn i kontrollgruppen, og ikke signifikant.

Fig. 9 viser gjennomsnittlige kroppsvektmålinger for hver gruppe av dyr gjennom hele perioden fra den partielle hepatektomien og nitrosaminbehandlingen (tid 0). Både kroppsvektmålingene og den histologiske evalueringen av normale vev synes klart å indikere et totalt fravær av bivirkninger. Den tannete formen av kroppsvektkurvene (fig.

9) har tydelig sammenheng med behandlingen, men ikke med medikamentene. Snarere er det injeksjonene i seg selv som virker på dyrene, siden dyr som bare ble behandlet med saltløsning hadde nøyaktig de samme karakteristiske kroppsvektvariasjonene som de som ble behandlet med saltløsning og medikament.

At dyr som behandles med 210 intravenøse injeksjoner over en 11-måneders periode viser tegn til kroppsvektvariasjon er ikke overraskende. For hver injeksjon ble dyrene varmet litt opp under en elektrisk varmelyspære, og ble deretter immobilisert i en spesialkonstruert holder for at injeksjonen kunne finne sted. Selv om denne prosedyren fant sted i et stille rom og ble utført av en dyktig person som var opplært til å roe dem, er det ikke overraskende at den kan føre til en biologisk reaksjon hos dyrene.

Et aspekt av bivirkningsundersøkelsen er den histologiske evalueringen av normalt vev fra forskjellige organer i kroppen. Denne ganske omfattende undersøkelsen kan lett oppsummeres utfra tabell 2 til 4 (vedlagt). Ikke i noe tilfelle ble det funnet noen abnormiteter som kunne tilbakeføres til medikamentbehandlingen. Det er verdt å merke seg at selv rottehalene, hvor de intravenøse injeksjonene ble gitt daglig i så lang tid, ikke fikk skader av behandlingen.

Imidlertid kan det trekkes en interessant konklusjon utfra hyppigheten av preneoplastiske lesjoner i leveren. Utfra tabell 2 til 4 utviklet alle dyrene multiple foki. Denne lesjonen antas å være et tidlig stadium i prosessen med å utvikle ondartet kreft i leveren, og ser ikke ut til å påvirkes av medikamentbehandlingen. Dessuten forekommer preneoplastiske noduler, som om de er begrenset til noen få dyr, i alle gruppene. De foreliggende dataene indikerer derfor ikke noen medikamentvirkning på denne lesjonen, noe som ytterligere styrker inntrykket av at forbindelse 2 har en virkelig kreftspesifikk virkning på leveren.

I fig. 10 er både hyppigheten og størrelsen av levertumorene plottet på den samme kurven med en logaritmisk skala på størrelsesaksen.

H<y>ppigheten av tumorutvikling i leveren: Antall dyr i kontrollgruppen og i placebogruppen som utviklet leverkreft er henholdsvis 13 og 12 av de 14 dyrene i hver gruppe (tabell 2 og 3). I gruppe 3 (85 mg/kg av forbindelse 2) utviklet bare 7 av de 14 dyrene leverkreft (tabell 4). For statistisk testing av forskjellen mellom gruppe 2 (placebo) og 3 er antall tilfeller for lavt til en x<2->test. Men det kan gjøres en ensidig Fischers eksakttest, som viser at de to gruppene er signifikant forskjellige (p = 0,05) med hensyn til forekomsten av leverkreft. Denne forskjellen blir statistisk enda sterkere hvis vi inkluderer også den ubehandlede kontrollgruppen (gruppe 1) i kontrollgruppen. I såfall er det 28 dyr i kontroll, hvorav 25 utviklet leverkreft, og dermed kan en x<2->test aksepteres. I dette tilfellet er forskjellen mellom gruppe 3 og kontrollene signifikant med p = 0,015.

I gruppe 4 (100 mg/kg zilascorb(<2>H)) utviklet 11 av de 14 dyrene leverkreft. Dette er bare en færre enn i placebogruppen, og på ingen måte signifikant. Altså må vi slutte at analysen av utviklingen av leverkreft'vise tat behandlingen med forbindelse 2 reduserte denne utviklingen vesentlig mens zilascorb(<2>H) ikke hadde noen slik effekt.

Størrelsen av de utviklede levertumorene: Størrelsen av levertumorene analyseres lettest utfra fig. 10, men vises også i tabell 3 til 4. Her ser man at forbindelse 2 har en over-bevisende effekt: mens 50% av dyrene i kontroll- og placebogruppene hadde mer en 10 cm3 kreftvev hadde ingen av dyrene i gruppen som ble behandlet med forbindelse 2 så mye kreftvev (x<2->test: p = 0,0038). Dessuten hadde bare 3 dyr (d.v.s. 21%) i gruppen som ble behandlet med forbindelse 2 mer enn 1 cm<3> kreftvev, mens 10 og 13 dyr (d.v.s. 71 og 93 %) i henholdsvis placebo- og kontrollgruppene hadde kreftvev over denne grensen (Fischers eksakttest: p = 0,0002 respektive 0,011).

Altså er virkningen av forbindelse 2 mot kreft enda tydeligere når tunorstørrelsen tas i betraktning enn når man bare analyserer frekvensen av kreftutvikling. Faktisk er denne virkningen så slående at den var åpenbar også ved obduksjonen, da det bare ble tatt et raskt makroskopisk overblikk over leveren.

For dyr som ble behandlet med zilascorb(<2>H) er effekten mye svakere enn for de som ble behandlet med forbindelse 2, selv når tumorvolumet tas i betraktning. Antall dyr behandlet med zilascorb(<2>H) som hadde mer enn 1 cm<3> leverkreftvev var 7. En signifikanstest mot kontroll- og placebogruppene, på samme måte som for forbindelse 2, gir p-verdier på henholdsvis 0,036 og 0,44. Ved sammenlikning med den ubehandlede kontrollgruppen er forskjellen altså signifikant, mens hvis man sammenlikner med placebogruppen er forskjellen tydelig ikke signifikant. Det må nevnes her at 3 av dyrene i placebogruppen hadde tumorvolum like under 1 cm<3>, og at hvis sammen-likningsgrunnlaget hadde vært 0,5 cm3 ville det vært en signifikant forskjell også i forhold til placebogruppen (se fig. 10). Likevel tyder den foreliggende analysen på at virkningen av zilascorb(<2>H) er svak, og trolig på grensen til å være signifikant. Dessuten er det ingen forskjell mellom placebodyrene og de som ble behandlet med zilascorb(<2>H) når det gjelder antall dyr som hadde tumorvolum over ca. 5 cm<3>.

I et separat eksperiment hvor rottene fikk zilascorb(<2>H) og forbindelse 2 i bare 10 dager viste histologiske undersøkelser av levertumorene ingen endringer hos de dyrene som var behandlet med zilascorb(<2>H), mens 2 av de 5 dyrene som var behandlet med forbindelse 2 viste økt tumornekrose.

Eksempel 7

Effekten på leverinvaderende kolorektal kreft hos nakne mus

Materiale og fremgangsmåter

Den evaluerte cellelinjen, C170HM2, er en etablert human kolorektal cellelinje (S.A.Watson et al., Eur.J.Cancer 29A (1993), 1740-1745) og ble opprinnelig tatt fra en primærtumor hos en pasient. C170HM2-celler ble holdt i live in vitro i RPMI1640 kulturmedium (Gibco, Paisley, UK) som inneholdt 10 vol-% varmeinaktivert kalvefosterserum (Sigma, Poole, UK) ved 37 °C i 5 % CO2 og fuktede betingelser. Celler fra semikonfluente enkeltlag ble høstet med 0,025 % EDTA og vasket to ganger i det ovennevnte kulturmediet.

C170HM2-celler høstet fra semikonfluente enkeltlag av celler ble resuspendert til lxl0<6>/ml steril fosfatbufret saltløsning, pH 7,4 [PBS] og injisert i et 1 ml volum i den peritoneale kroppshulen til 20 MFI nakne hannmus (oppfostret i kreftforsknings-avdelingen på universitetet i Nottingham). Musene ble identifisert med et elektronisk merkesystem (RS Biotech DL2000 Datalogger). Dag 10 etter injeksjonen ble musene tilfeldig fordelt enten til en placebo-kontrollgruppe eller eksperimentgrupper. Medikamentene ble dosert intravenøst fra dag 10 og fortsatte til behandlingen ble avsluttet. Eksperimentet ble avsluttet dag 40 etter implanteringen. Musene ble veid med regelmessige mellomrom under forsøket.

Ved avslutningen ble leveren avdekket, synlige levertumorer ble talt og det totale tversnittarealet målt. Tumorene ble også fotografert. Det hadde ikke skjedd noen utflyting av tumorene, så de ble dissekert ut fra det normale levervevet, veid og fiksert i formell saltløsning. Peritoneale noduler ble dissekert ut og vekten og tverrsnittarealet målt.

Det ble utført en detaljert patologisk vurdering av tumorene.

Virkningen av forbindelse 1, 2 og 5 på leverinvasjon av human kolorektal tumor C170HM2 vises i fig. 11.

Eksempel 8

Nekrotiserende effekt på primære rottenyreadenomceller

I et eksperiment på arvelige rottenyreadenomer (Eker og Mossige, Nature 189, (1961) 858-859) ble det funnet sterk tumornekrose etter 10 dagers intravenøse injeksjoner av 85/kg kroppsvekt av forbindelse 2 på to av dyrene. I dyr som fikk saltløsning uten medikament ble det observert liten eller ingen nekrose.

Konklusjoner

Benzaldehydderivatene i henhold til denne oppfinnelsen reagerer til Schiff-baser med visse grupper på celleoverflaten, f.eks. frie aminogrupper. Siden mange celleprosesser, som proteinsyntese, cellesyklus, immunrespons etc, kontrolleres av signaler fra celleoverflaten vil disse bindingene endre oppførselen til cellen. Vi har også vist at benz-aldehydkompleksene på celleoverflaten endrer adhesjonskarakteristikaene til cellen. Vi har vist at forbindelsene i henhold til denne oppfinnelsen kan være nyttige i nye behandlinger for å bekjempe kreft.

Vi har funnet at heksosederivatene av benzaldehyder er overraskende mer effektive enn derivatene av andre karbohydrater for å behandle kreft i visse organer som leveren og nyrene. Vi tror at dette fenomenet er forbundet med reseptoraffiniteten til disse organene for sukkergruppen i derivatene.

Administrering

De farmasøytiske sammensetningene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan gis ved kreftbehandling.

Til dette formålet kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse formuleres på en hvilken som helst egnet måte for å gis til en pasient, enten alene eller tilsatt egnede farmasøytiske bærere eller hjelpestoffer.

Det foretrekkes spesielt at formuleringene for systemisk terapi fremstilles enten som orale preparater eller parenterale formuleringer.

Egnede enterale preparater vil være tabletter, kapsler, f.eks. bløte eller harde gelatin-kapsler, korn eller pulvere, geleer, suspensjoner, løsninger eller stikkpiller. Slike preparater vil fremstilles på kjent måte ved å blande en eller flere av forbindelsene av formel (I) med ikke-giftige, inerte faste eller flytende bærere.

Egnede parenterale preparater av forbindelsene av formel (I) er injeksjons- eller infusj onsløsninger.

Når de gis utvortes kan forbindelsene av formel (I) formuleres som en oppløsning, salve, krem, sirup, tinktur, spray eller liknende som inneholder forbindelsene av formel (I) med tilsetning av ikke-giftige, inerte faste eller flytende bærere som er vanlige i lokale preparater. Det er spesielt godt egnet å bruke en formulering som beskytter den aktive ingrediensen mot luft, vann eller liknende.

Preparatene kan inneholde inerte eller farmakodynamisk aktive tilsetninger. F.eks. kan

tabletter eller granulater inneholde en serie bindemidler, fyllmaterialer, bærersubstanser og/eller fortynningsmidler. Flytende preparater kan for eksempel foreligge i form av en steril løsning. Kapsler kan inneholde et fyllmateriale eller et fortykningsmiddel i tillegg til den aktive ingrediensen. Preparatet kan dessuten også inneholde smaksforbedrende tilsetninger så vel som slike substanser som vanligvis brukes som holdbarhets-, stabilisator-, emulgeringsmidler eller fuktighetsbevarende midler, salter for å variere det osmotiske trykket, buffere og andre tilsetninger.

Doseringen kan variere i samsvar med sykdommen, bruksmåten og innføringsveien, så vel som pasientens behov. Generelt vil en daglig dose i en systemisk terapi for en gjennomsnittlig voksen pasient være omtrent 0,01-500 mg/kg kroppsvekt en eller to ganger om dagen, fortrinnsvis 0,5-100 mg/kg kroppsvekt en eller to ganger om dagen og helst 1-20 mg/kg vekt en eller to ganger om dagen.

Hvis man ønsker det, kan det farmasøytiske preparatet av forbindelsene inneholde en antioksidant, f.eks. tokoferol, N-metyl-tokoferamin, butylert hydroksyanisol, askorbinsyre eller butylert hydroksytoluen.

Claims (2)

1. Anvendelse av 4,6-0-(benzyliden-di)-D-glukopyranose, eller den tilsvarende L-isomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt av disse, til fremstilling av et terapeutisk middel for forebygging og/eller behandling av leverkreft, nyrekreft og kreft i bukspyttkjertelen.

2. Anvendelse ifølge krav 1, til fremstilling av et terapeutisk middel for forebyggende behandling av kreft som skyldes virus som hepatitt B og C, onkogene papillomvirus og andre onkogene virus.