NO310078B1 - Nucleic acid sequence encoding CR1 protein, expression vector and recombinant cell comprising said sequence and a method of producing said protein - Google Patents

Description

1. INTRODUKSJON 1. INTRODUCTION

Foreliggende oppfinnelse vedrører CR1 nukleinsyresekvens og fragment derav. Oppfinnelsen tilveiebringer også ekspresjon av CR1 proteinet og fragmenter derav. Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en farma-søytisk sammensetning som omfatter CR1. CR1 nukleinsyrene og proteinene anvendes for diagnostikk eller terapi av forstyrrelser omfattende komplementaktivitet, og forskjellige betennelsesforstyrrelser og immunforstyrrelser. The present invention relates to the CR1 nucleic acid sequence and fragment thereof. The invention also provides for expression of the CR1 protein and fragments thereof. Furthermore, the invention includes a method for producing a pharmaceutical composition comprising CR1. The CR1 nucleic acids and proteins are used for diagnostics or therapy of disorders involving complement activity, and various inflammatory disorders and immune disorders.

2. BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN 2. BACKGROUND OF THE INVENTION

2.1. Komplementsystemet 2.1. The complement system

Komplementsystemet er en gruppe proteiner som utgjør omtrent 10$ av globuliner i normalt serum til mennesker (Eood, L.E. et al., 1984, Immunology, 2d Ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co. , Menlo Park, California, s. 339). Komplement (C) spiller en viktig rolle ved formidling av immunreaksjoner og allergiske reaksjoner (Rapp, H.J. og Borsos, T, 1970, Molecular Basis of Complement Action, Appleton-Century-Crofts (Meredith ), New York). Aktivering av kompiementkomponentene fører til dannelsen av en gruppe faktorer, inkludert kjemotaktiske peptider som formidler betennelsen assosiert med kompiementavhengige sykdommer. Den sekvensielle akti-veringen av komplementkaskaden kan oppstå via den klassiske reaksjonsveien som omfatter antigen-antistoffkomplekser, eller ved en alternativ reaksjonsvei som omfatter gjenkjenn-ing av visse celleveggpolysakkarider. Aktiviteter formidlet av aktiverte komplementproteiner omfatter lysering av målceller, kjemotaksis, opsonisering, stimulering av vaskulære og andre glatte muskelceller, og funksjonelle avvik så som degranulering av mastceller, øket permeabilitet til små blodkar, ledet migrering av leukocytter, og aktivering av B lymfocytter og makrofager (Eisen, H.N., 1974, Immunology, Harper & Row Publishers, Inc. Hagerstown, Maryland, s. 512). I løpet av proteolyttiske kaskadetrinn blir biologiske aktive peptidfragmenter, anafylatoksinene C3a, C4a og C5a (se WHO Scientific Group, 1977, WHO Tech. Rep. Ser. 606:5 og referanser sitert deri), frigjort fra tredje (C3), fjerde (C4) og femte (C5) native kompiementkomponenter (Hugli, T.E., 1981, CRC Crit. Rev. Immunol. 1:321; Bult. H. and Herman, A.G., 1983, Agents Actions 13:405). The complement system is a group of proteins that make up about 10% of globulins in normal human serum (Eood, L.E. et al., 1984, Immunology, 2d Ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., Menlo Park, California, p. 339) . Complement (C) plays an important role in mediating immune and allergic reactions (Rapp, H.J. and Borsos, T, 1970, Molecular Basis of Complement Action, Appleton-Century-Crofts (Meredith ), New York). Activation of the complement components leads to the generation of a group of factors, including chemotactic peptides that mediate the inflammation associated with complement-dependent diseases. The sequential activation of the complement cascade can occur via the classic reaction pathway that includes antigen-antibody complexes, or by an alternative reaction pathway that includes recognition of certain cell wall polysaccharides. Activities mediated by activated complement proteins include lysis of target cells, chemotaxis, opsonization, stimulation of vascular and other smooth muscle cells, and functional abnormalities such as degranulation of mast cells, increased permeability of small blood vessels, guided migration of leukocytes, and activation of B lymphocytes and macrophages ( Eisen, H.N., 1974, Immunology, Harper & Row Publishers, Inc. Hagerstown, Maryland, p. 512). During proteolytic cascade steps, biologically active peptide fragments, the anaphylatoxins C3a, C4a and C5a (see WHO Scientific Group, 1977, WHO Tech. Rep. Ser. 606:5 and references cited therein), are released from third (C3), fourth (C4 ) and fifth (C5) native complement components (Hugli, T.E., 1981, CRC Crit. Rev. Immunol. 1:321; Bult. H. and Herman, A.G., 1983, Agents Actions 13:405).

2.2. C3b/ C4b komplementreseptor ( CR1) 2.2. C3b/ C4b complement receptor ( CR1)

Humant C3b/C4b reseptor, betegnet CR1, er tilstede på erytrocytter, monocytter/makrofager, granulocytter, B celler, noen T celler, miltfollikulære dendritiske celler og glomerulære podocytter (Fearon, D.T., 1980, J. Exp. Med. 152:20, Wilson, J.G., et al., 1983, J. Immunol. 131:684; Reynes, M., et al., 1985, J. Immunol.. 135:2687; Gelfand, M.C., et al., 1976, N. Engl. J. Med. 295:10; Kazatchkine, M.D., et al., 1982, Clin. Immunol. Immunopathol. 27:170). CR1 binder spesifikt C3b, C4b og iC3b. En oppløselig form av reseptoren er blitt funnet i plasma som har ligandbindings-aktivitet og samme molekylvekt som membran-assosiert CR1 (Yoon, S.H. og Fearon, D.T., 1985, J. Immunol. 134:3332). CR1 binder C3b og C4b som er kovalentlig bundet til immunkomplekser og andre komplementaktivatorer, og konsekvensene til disse interaksjonene avhenger av celletype som bærer reseptoren (Fearon, D.T. og Wong, W.W., 1983, Ann. Rev. Immunol. 1:243). Erytrocytt CR1 binder immunkomplekser for transport til lever (Cornacoff, J.B., et al., 1983, J. Clin. Invest. 71:236; Medof, M.E., et al., 1982, J. Exp. Med. 156:1739). CR1 på nøytrofiler og monocytter internaliserer bundede komplekser, enten ved adsorberende endocyttoser gjennom belagte rom (Fearon, D.T., et al., 1981, J. Exp. Med. 153:1615; Abrahamson, D.R. og Fearon, D.T., 1983, Lab. Invest. 48:162) eller ved fagocyttose etter aktivering av reseptoren ved forbolestere, kjemotaktiske peptider eller proteiner som er tilstede i den ekstracellulære matrisen, så som fibronektin og laminin (Newman, S.L. , et al., 1980, J. Immunol. 125:2236; Wright, S.D. and Silverstein, S.C., 1982, J. Exp. Med. 156:1149; Wright, S.D. , et al., 1983, J. Exp. Med. 158:1338). Fosforylering av CR1 kan spille en rolle i ervervelse av fagocyttisk aktivitet (Changelian, P.S. and Fearon, D.T., 1986, J. Exp. Med. 163:101). Virkningen av CR1 på B lymfocytter er mindre definert, til tross for at behandling av disse cellene med antistoff mot CR1 forsterket deres respons overfor suboptimale doser av permesbær mitogen (Daha, M.R., et al., 1983, Immunobiol. 164:227 (Abstr.)). CR1 på follikulaere dentrittiske celler kan spille en antigen presenterende rolle (Klaus, G.G.B., et al., 1980, Immunol. Rev. 53:3). Human C3b/C4b receptor, designated CR1, is present on erythrocytes, monocytes/macrophages, granulocytes, B cells, some T cells, splenic follicular dendritic cells and glomerular podocytes (Fearon, D.T., 1980, J. Exp. Med. 152:20, Wilson, J.G., et al., 1983, J. Immunol. 131:684; Reynes, M., et al., 1985, J. Immunol.. 135:2687; Gelfand, M. C., et al., 1976, N. Engl. J. Med. 295:10; Kazatchkine, M.D., et al., 1982, Clin. Immunol. Immunopathol. 27:170). CR1 specifically binds C3b, C4b and iC3b. A soluble form of the receptor has been found in plasma that has ligand binding activity and the same molecular weight as membrane-associated CR1 (Yoon, S.H. and Fearon, D.T., 1985, J. Immunol. 134:3332). CR1 binds C3b and C4b covalently bound to immune complexes and other complement activators, and the consequences of these interactions depend on the cell type bearing the receptor (Fearon, D.T. and Wong, W.W., 1983, Ann. Rev. Immunol. 1:243). Erythrocyte CR1 binds immune complexes for transport to liver (Cornacoff, J.B., et al., 1983, J. Clin. Invest. 71:236; Medof, M.E., et al., 1982, J. Exp. Med. 156:1739). CR1 on neutrophils and monocytes internalize bound complexes, either by adsorptive endocytosis through coated compartments (Fearon, D.T., et al., 1981, J. Exp. Med. 153:1615; Abrahamson, D.R. and Fearon, D.T., 1983, Lab. Invest . 48:162) or by phagocytosis following activation of the receptor by phorbol esters, chemotactic peptides or proteins present in the extracellular matrix, such as fibronectin and laminin (Newman, S.L., et al., 1980, J. Immunol. 125:2236 ; Wright, S.D. and Silverstein, S.C., 1982, J. Exp. Med. 156:1149; Wright, S.D., et al., 1983, J. Exp. Med. 158:1338). Phosphorylation of CR1 may play a role in acquisition of phagocytic activity (Changelian, P.S. and Fearon, D.T., 1986, J. Exp. Med. 163:101). The effect of CR1 on B lymphocytes is less defined, although treatment of these cells with antibody to CR1 enhanced their response to suboptimal doses of persimmon mitogen (Daha, M.R., et al., 1983, Immunobiol. 164:227 (Abstr. )). CR1 on follicular dendritic cells may play an antigen presenting role (Klaus, G.G.B., et al., 1980, Immunol. Rev. 53:3).

CR1 kan også hemme den klassiske og alternative reaksjonsveien C3/C5 konvertase og virke som en kofaktor for spaltning av C3b og C4b ved faktor I, som indikerer at CR1 også har komplementregulatoriske funksjoner i tillegg til å virke som en reseptor (Fearon, D.T., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867; lida, K. and Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153:1138). I den alternative reaksjonsveien til komplementaktiveringen er bimolekylærkompleks C3b,Bb et C3 aktiverende enzym (konvertase). CR1 (og faktor H, ved høyere konsentrasjoner) kan bindes til C3b og kan også fremme dissosiasjon av C3b,Bb. Dannelsen av C3b,CRl (og C3b,H) gjør C3b mottagelig for irreversibel proteolyttisk inaktivering ved faktor I, resulterende i dannelsen av inaktivert C3b (iC3b). I den klassiske reaksjonsveien til komplementaktivering er kompleks C4b,2a C3 konvertase. CR1 (og C4 bindingsprotein, C4bp, i høyere konsentrasjoner) kan bindes til C4b, og kan også fremme dissosiasjon av C4b,2a. Bindingen gjør C4b mottagelig for irreversibel proteolyttisk inaktivering ved faktor I gjennom spaltning til C4c og C4d (inaktiverte komplementproteiner). CR1 can also inhibit the classical and alternative reaction pathway C3/C5 convertase and act as a cofactor for cleavage of C3b and C4b by factor I, indicating that CR1 also has complement regulatory functions in addition to acting as a receptor (Fearon, D.T., 1979 , Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867; lida, K. and Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153:1138). In the alternative reaction pathway of complement activation, bimolecular complex C3b,Bb is a C3 activating enzyme (convertase). CR1 (and factor H, at higher concentrations) can bind to C3b and can also promote dissociation of C3b,Bb. The formation of C3b,CR1 (and C3b,H) renders C3b susceptible to irreversible proteolytic inactivation by factor I, resulting in the formation of inactivated C3b (iC3b). In the classical pathway of complement activation, complex C4b,2a is C3 convertase. CR1 (and C4 binding protein, C4bp, in higher concentrations) can bind to C4b, and can also promote dissociation of C4b,2a. The binding renders C4b susceptible to irreversible proteolytic inactivation by factor I through cleavage into C4c and C4d (inactivated complement proteins).

CR1 er et glykoprotein bestående av en enkelt polypeptid-kjede. Fire allotypiske former av CR1 er blitt funnet som er forskjellige i størrelser på ~40 , 000-50 , 000 dalton molekylvekt. De mest vanlige formene, F og S allotypene, også betegnet A og B allotyper, har molekylvekter på 250,000 og 290,000 dalton (Dykman, T.R. , et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:1698; Wong, V/.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685), respektivt, og de to mere sjeldne formene har molekylvekter på 210,000 og >290,000 dalton (Dykman, T.R., et al., 1984, J. Exp. Med. 159:691; Dykman, T.R., et al., 1985, J. Immunol. 134:1787). Disse forskjellene representerer sansynligvis variasjoner i polypeptidkjeden til CR1, og ikke glykosyleringstilstand, p.g.a. at de ikke ble borte ved behandling renset reseptorprotein med endoglykosi-dase F (Wong, W.W. , et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685 ), og de ble observert når reseptorallotyper ble biosyntetisert i nærvær av tunikamycin (Lublin. D.M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736). Alle fire CR1 allotypene har C3b-bindingsaktivitet (Dykman, T.R. et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:1698; Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685; Dykman, T.R., et al., 1984, J. Exp. Med. 159:691; Dykman, T.R., et al., 1985, J. Immunol. 134:1787). CR1 is a glycoprotein consisting of a single polypeptide chain. Four allotypic forms of CR1 have been found that differ in size by ~40,000-50,000 dalton molecular weight. The most common forms, the F and S allotypes, also designated A and B allotypes, have molecular weights of 250,000 and 290,000 daltons (Dykman, T.R., et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:1698; Wong, V/.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685), respectively, and the two rarer forms have molecular weights of 210,000 and >290,000 daltons (Dykman, T.R., et al., 1984, J. Exp. Med. 159:691; Dykman, T.R., et al., 1985, J. Immunol. 134:1787). These differences probably represent variations in the polypeptide chain of CR1, and not glycosylation state, due to that they did not disappear upon treatment of purified receptor protein with endoglycosidase F (Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685 ), and they were observed when receptor allotypes were biosynthesized in the presence of tunicamycin (Lublin . D. M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736). All four CR1 allotypes have C3b binding activity (Dykman, T.R. et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:1698; Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685 ; Dykman, T.R., et al., 1984, J. Exp. Med. 159:691; Dykman, T.R., et al., 1985, J. Immunol. 134:1787).

To ikke-overlappende restriksjonsfragmenter til et CR1 cDNA ble vist å krysshybridisere under betingelser med høy stringenthet (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711). Begge cDNA probene hybridiserer også til multiple restriksjonsfragmenter til genomisk DNA, og det meste var felles for begge probene (id.). Eksistensen av repeterende kodende sekvenser innenfor CR1 ble bekreftet ved sekvenssammenligninger (Klickstein, L.B., et al., 1985, Complement 2:44 (Abstr.)). I tillegg, har CR1 genet blitt vist å ha repeterende intervenerende sekvenser ved demonstrasjon av krysshybridisering av en genomisk probe som mangler kodende sekvenser for flere genomiske restriksjonsfragmenter (Wong, W.W., et al., 1986, J. Exp. Med. 164:1531). DNA fra et individ med større S allotype hadde et ytterligere restrik-sjonsfragment som hybridiserte til denne genomiske proben sammenlignet med DNA fra et individ som F allotype, og dette tyder på at duplikasjon av genomiske sekvenser oppsto i assosiasjon med høyere molekylvekt CR1 allele (id.). Two non-overlapping restriction fragments of a CR1 cDNA were shown to cross-hybridize under high stringency conditions (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711). Both cDNA probes also hybridize to multiple restriction fragments to genomic DNA, and most were common to both probes (id.). The existence of repetitive coding sequences within CR1 was confirmed by sequence comparisons (Klickstein, L.B., et al., 1985, Complement 2:44 (Abstr.)). In addition, the CR1 gene has been shown to have repetitive intervening sequences by demonstration of cross-hybridization of a genomic probe lacking coding sequences for several genomic restriction fragments (Wong, W.W., et al., 1986, J. Exp. Med. 164:1531) . DNA from an individual with a larger S allotype had an additional restriction fragment that hybridized to this genomic probe compared to DNA from an individual with an F allotype, and this suggests that duplication of genomic sequences occurred in association with a higher molecular weight CR1 allele (id. ).

CR1 har blitt vist å ha homologi til komplementreseptortypen 2 (CR2) (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639-5643). CR1 has been shown to have homology to complement receptor type 2 (CR2) (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639-5643).

2.3. Unormal iteter til CR1 i humansykdom 2.3. Abnormalities of CR1 in human disease

Redusert ekspressjon av CR1 på erytrocytter fra pasienter med systemisk lupus erythamatosus (SLE) har blitt rapportert av forskere fra flere geografiske regioner, inkludert Japan (Miyakawa et al., 1981, Lancet 2:493-497; Minota et al., 1984, Arthr. Rheum. 27:1329-1335), U.S.A. (lida et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1427-1438; Wilson et al., 1982, N. Engl. J. Med. 307:981-986) og Europa (Walport et al., 1985, Clin. Exp. Immunol. 59:547; Jouvin et al., 1986, Complement 3:88-96; Holme et al., 1986, Clin. Exp. Immunol. 63:41-48). Sett på som en gruppe, har pasientene et gjennomsnitlig antall reseptorer pr. celle som er 50-60$ i forhold til normale populasjoner. En tidlig rapport beskrev at CR1 antallet på erytrocytter varierte inverst med sykdomsaktiviteten, idet laveste antall oppstår i løpet av perioder med mest alvorlige manifestasjoner av SLE, og høyere antall blir observert i løpet av bedre perioder i samme pasient (lida et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1427-1438). CR1 antallet er også blitt funnet å korrelere inverst med serumnivåene til immunkompleksene, med serumnivåene til C3d og med mengdene av erytrocytt-bundet C3dg, som kanskje reflekterer opptaket av komplement-aktiverende immunkomplekser og deposisjon på erytrocytten som et "uskyldig vedheng" (Ross et al., 1985, J. Immunol. 135:2005-2014; Holme et al., 1986, Clin. Exp. Immunol. 63:41-48; V/alport et al., 1985, Clin. Exp. Immunol. 59:547 ). En pasient med SLE som mangler CR1 på erytrocyttene ble funnet å ha et auto-antistoff mot CR1 (Wilson et al., 1985, J. Clin. Invest. 76:182-190). Reduserte titere av anti-CRl antistoff falt sammen med forbedring av pasientens kliniske tilstand og med delvis reversering av reseptorunormalitet. Anti-CRl antistoff er blitt detektert i to andre SLE pasienter (Cook et al., 1986, Clin. Immunol. Immunopathol. 38:135-138). Nylig ble ervervet tap av erytrocytt CR1 ved setting av aktiv SLE og hemolyttisk anemi demonstrert ved observering av hurtig tap av reseptoren fra transfuserte erytrocytter (Walport et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 69:501-507). Reduced expression of CR1 on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus (SLE) has been reported by researchers from several geographic regions, including Japan (Miyakawa et al., 1981, Lancet 2:493-497; Minota et al., 1984, Arthr . Rheum. 27:1329-1335), U.S.A. (lida et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1427-1438; Wilson et al., 1982, N. Engl. J. Med. 307:981-986) and Europe (Walport et al., 1985 , Clin. Exp. Immunol. 59:547; Jouvin et al., 1986, Complement 3:88-96; Holme et al., 1986, Clin. Exp. Immunol. 63:41-48). Seen as a group, the patients have an average number of receptors per cell which is 50-60$ compared to normal populations. An early report described that the CR1 number on erythrocytes varied inversely with disease activity, with the lowest number occurring during periods of most severe manifestations of SLE, and higher numbers being observed during better periods in the same patient (lida et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1427-1438). CR1 counts have also been found to correlate inversely with serum levels of immune complexes, with serum levels of C3d and with amounts of erythrocyte-bound C3dg, perhaps reflecting the uptake of complement-activating immune complexes and deposition on the erythrocyte as an "innocent appendage" (Ross et al ., 1985, J. Immunol. 135:2005-2014; Holme et al., 1986, Clin. Exp. Immunol. 63:41-48; V/alport et al., 1985, Clin. Exp. Immunol. 59: 547 ). A patient with SLE lacking CR1 on the erythrocytes was found to have an autoantibody to CR1 (Wilson et al., 1985, J. Clin. Invest. 76:182-190). Decreased titers of anti-CR1 antibody coincided with improvement in the patient's clinical condition and with partial reversal of the receptor abnormality. Anti-CR1 antibody has been detected in two other SLE patients (Cook et al., 1986, Clin. Immunol. Immunopathol. 38:135-138). Recently, acquired loss of erythrocyte CR1 in the setting of active SLE and hemolytic anemia was demonstrated by the observation of rapid loss of the receptor from transfused erythrocytes (Walport et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 69:501-507).

Det relative tapet av CR1 fra erytrocytter er også blitt observert i pasienter med human immunsviktvirus (HIV) infeksjoner (Tausk, F.A., et al., 1986, J. Clin. Invest. 78:977-982) og med lepromatus leprosy (Tausk, F.A., et al., 1985, J. Invest. Dermat. 858:58s-61s). The relative loss of CR1 from erythrocytes has also been observed in patients with human immunodeficiency virus (HIV) infections (Tausk, F.A., et al., 1986, J. Clin. Invest. 78:977-982) and with lepromatous leprosy (Tausk, F.A., et al., 1985, J. Invest. Dermat. 858:58p-61p).

Unormaliteter ved komplementreseptorekspressjon i SLE er ikke begrenset til erytrocytt CE1. Relative mangler i total cellulær CR1 til nøytrofiler og plasmamembran CR1 til B lymfocytter i SLE pasienter er blitt vist å oppstå (Wilson et al., 1986, Arthr. Rheum. 29:739-747). Abnormalities of complement receptor expression in SLE are not limited to erythrocyte CE1. Relative deficiencies in total cellular CR1 to neutrophils and plasma membrane CR1 to B lymphocytes in SLE patients have been shown to occur (Wilson et al., 1986, Arthr. Rheum. 29:739-747).

I pasienter med type IV SLE nephritis, blir all detekterbar CR1 antigen tapt fra podocytter, mens i mindre alvorlige former av SLE nephritis og i ikke-SLE typer av proliferativ nephritis, inkludert membranprolifererende glomerulonephritis type I og II, er CR1 ekspressjon på glomerulære podocytter ikke forskjellig fra normale (Kazatchkine et al., 1982, J. Clin. Invest. 69:90-912; Emancipator et al., 1983, Clin. Immunol. Immunophatol. 27:170-175). Pasienter med type IV SLE nephritis har derimot ikke færre antall erytrocytt CR1 enn SLE pasienter som har andre typer av renal lupus eller ingen nephritis (Jouvin et al., 1986, Complement 3:88-96). In patients with type IV SLE nephritis, all detectable CR1 antigen is lost from podocytes, whereas in less severe forms of SLE nephritis and in non-SLE types of proliferative nephritis, including membranous proliferative glomerulonephritis types I and II, CR1 expression on glomerular podocytes is not different from normal (Kazatchkine et al., 1982, J. Clin. Invest. 69:90-912; Emancipator et al., 1983, Clin. Immunol. Immunophatol. 27:170-175). Patients with type IV SLE nephritis, on the other hand, do not have a lower number of erythrocyte CR1 than SLE patients who have other types of renal lupus or no nephritis (Jouvin et al., 1986, Complement 3:88-96).

In vivo komplementaktivering opp-regulerer CR1 ekspressjon i plasmamembranen til neutrofiler (Lee, J., et al., 1984, Clin. Exp. Immunol. 56:205-214; Moore, F.D., Jr., et al., 1986, N. Engl. J. Med. 314:948-953). In vivo complement activation up-regulates CR1 expression in the plasma membrane of neutrophils (Lee, J., et al., 1984, Clin. Exp. Immunol. 56:205-214; Moore, F.D., Jr., et al., 1986, N . Engl. J. Med. 314:948-953).

3. OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN 3. SUMMARY OF THE INVENTION

Foreliggende oppfinnelse vedrører CR1 nukleinsyresekvens og fragment derav. Oppfinnelsen tilveiebringer også ekspresjon av CR1 proteinet og fragmenter derav. Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en farma-søytisk sammensetning som omfatter CR1. CR1 nukleinsyrene og proteinene anvendes for diagnostikk eller terapi av forstyrrelser omfattende komplementaktivitet, og forskjellige betennelsesforstyrrelser og immunforstyrrelser. The present invention relates to the CR1 nucleic acid sequence and fragment thereof. The invention also provides for expression of the CR1 protein and fragments thereof. Furthermore, the invention includes a method for producing a pharmaceutical composition comprising CR1. The CR1 nucleic acids and proteins are used for diagnostics or therapy of disorders involving complement activity, and various inflammatory disorders and immune disorders.

I spesifikke utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse beskrevet i eksemplene nedenfor er kloning, nukleotidsekvens og avledet aminosyresekvens til et full-lengde CR1 cDNA og fragmenter derav beskrevet. In specific embodiments of the present invention described in the examples below, cloning, nucleotide sequence and derived amino acid sequence of a full-length CR1 cDNA and fragments thereof are described.

Ekspressjon av CR1 protein og fragmenter derav er også beskrevet. Ekspressjon av CR1 proteinet og fragmenter derav som inneholder bindingsseter for C3b og/eller C4b, og som utviser faktor I kofaktoraktivitet, er tilveiebragt. Expression of CR1 protein and fragments thereof is also described. Expression of the CR1 protein and fragments thereof which contain binding sites for C3b and/or C4b, and which exhibit factor I cofactor activity, have been provided.

Også beskrevet i eksemplet nedenfor er fremstilling og rensing av oppløselige CR1 molekyler, der molekylene er vist å være terapeutisk nyttige for behandling av betennelses-reaksjoner og ved reduksjon av myokardialinfarktstørrelsen og forhindring av reperfusjonsskade. Also described in the example below is the production and purification of soluble CR1 molecules, where the molecules have been shown to be therapeutically useful for the treatment of inflammatory reactions and in reducing myocardial infarct size and preventing reperfusion damage.

3.1. Def inis. ioner 3.1. Definitions. ions

Ad2 MLP = adenovirus 2 hovedsenpromoter Ad2 MLP = adenovirus 2 major promoter

C = komplement C = complement

C3(ma) = metylamin-behandlet C3 C3(ma) = methylamine-treated C3

C4bp = C4 bindingsprotein C4bp = C4 binding protein

CMV = cytomegalovirus CMV = cytomegalovirus

CR1 = komplementreseptor type 1, C3b/C4b reseptor CR2 = komplementreseptor, type 2 CR1 = complement receptor type 1, C3b/C4b receptor CR2 = complement receptor, type 2

DCFDA = diklorfluorescindiacetat DCFDA = dichlorofluorescein diacetate

HPLC = høy ytelse væskekromatografi HPLC = high performance liquid chromatography

iC3b = inaktivert C3b iC3b = inactivated C3b

LHR = lang homolog gjentagelse LHR = long homologous repeat

mAb = monoklonalt antistoff mAb = monoclonal antibody

PAGE = polyakrylamid gelelektroforese PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis

RPAR = revers passiv Arthrus reaksjon RPAR = reverse passive Arthrus reaction

SCR = kort konsensusgjentagelse SCR = short consensus repeat

sCRl = oppløselig CR1 molekyl sCR1 = soluble CR1 molecule

4. BESKRIVELSE AV FIGURENE 4. DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figur 1. Nukleotid og aminosyresekvens til hele CR1 kodende region. Sekvensen begynner med det første nukleotidet etter oktamer EcoRI linker i klon XT109.1. Nukleotidnummer 1531 i denne sekvens er første nukleotid 5' av nukleotid nr. 1 til sekvensen angitt i fig. 3. Tråden som tilsvarer mRNA er vist, med avledet aminosyresekvens presentert nedenfor. Den antatte signalsekvensen kodet av nukleotidnummerene 28-147 er satt i parentes. Figur 2. Restriksjonskart av 5.5 kb human CR1 cDNa. Den sorte streken angir cDNA, restriksjonssetene er H, Hindlll; B, BamHI; R, EcoRI; P, Pstl; A, Apal; S, SacI; G, Bglll; K, Kpnl. cDNa klonene som sekvensen var avledet fra er vist under kartet. Pilene angir retning og rekkevidde av sekvensanalyse ved dideoksynukleotidkjedetermineringsmetoden. cDNA klonene var orientert på basis av restriksjonskartene og overlappende sekvensidentitet. Figur 3. Nukleotidsekvens til 5.5 kb human CR1 cDNA. Tråden tilsvarende mRNA er vist og base nr. 1 (tilsvarende base nr. 1532 i fig. 1) er første base etter EcoRI linker i 5' klonen. Stoppkodonet er understreket. 110-bp sekvensen i boksen var funnet mellom nukleotidene 147 og 148 (pil) og antas å representere en del av en mellomliggende sekvens. Figur 4. Dottmatriseanalyse av nukleotidsekvensen til 5.5 kb humant CR1 cDNA. En dott ble plottet dersom det var minst 40 bp av 90 bp match. Den mørke linjen som halverer firkanten diagonalt angir identiteten til selve sekvensen. De to ytterligere parallelle mørke linjene 1.35 og 2.7 kb fra identitetslinjen representerer to tandem, direkte lange homologe gjentagelser (LHR) på 1,35 kb hver. De seks lysere, stiplede linjene mellom to LHR tilsvarer korte konsensusgjentagelser på ~0,2 kb. Korte konsensusgjentagelser (SCR) rekker 0,4 kb forbi de lange homologe gjentagelsene. Figur 5. Utledet aminosyresekvens til humant CR1. Hver rest er vist i enbokstavkoden (Lehninger, A.L. , 1975, Biochemistry, 2d Ed., Worth Publishers, Inc., New York, s. 72). Restene i lange homologe gjentagelser er blitt oppstillt for å illustrere homologien. Alle restene i LHR-B er vist, og en rest er gitt for LHR-C og LHR-D bare der hvor den er forskjellig fra den i LHR-B. En hydropatiprofil er oppstillt under COOH-terminus til proteinet for å illustrere den antatte transmembrane regionen. Et strekk på fire positivt ladede rester rett etter den hydrofobe sekvensen er satt strek over. Seks aminosyresekvens med 67$ homologi med et sete til proteinkinase C fosforyleringen i epidermal vekstfaktorreseptor er streket under. Et skjematisk diagram av CR1 proteinet er vist over sekvensen. (TM) transmembranregion, (Cyt) cytoplasmaregion, (3'UT) 3' utranslatert sekvens. Figur 6. (A) Oppstilling av SCR til CR1. Gjentagelsene er nummerert 1-23 fra NH2-terminalen til COOH-terminalen. Opphold er blitt innført for å maksimalisere oppstillingen. Boksene representerer konstante rester og vertikale piler angir posisjoner med aminosyrekonservering. En rest må bli konservert dersom det, eller en konservativ substitusjon, er tilstede i minst halvparten av SCR. Den horisontale pilen angir en SCR som også ble sekvensert fra CR1 genomisk klon 2.38 og blir kodet av et enkelt ekson. (B) Restriksjonskart, sekvenseringsstrategi og delvis sekvens til genomisk klon X2.38. Restriksjonssetene er: (B) BamHI, (S) SacI, (E) EcoRV, (K) Kpnl, (P) Pstl. Horisontale pilen angir retning og grad av sekvensering og vertikale piler angir ekson-introngrenser. Figur 7. Oppstilling av konsensussekvens til SCR til proteiner kjent for å ha denne strukturen. Områder ble innført for å maksimalisere oppstillingen. En rest må bli konservert som i fig. 5, med unntagelse for de proteinene som bare har en eller to SCR, der en rest er konservert dersom den er tilstede i minst halvparten av de andre proteinene. Skråstrekene tilsvarer ikke-konserverte posisjoner. Under-strekede deler av CR2 og C2b angir at ingen sekvens inf orma-sjon er blitt publisert i denne regionen for disse proteinene. Boksene angir konstante halv-cysteiner. Tallene til høyre av sekvensen representerer antall SCR anvendt for å danne konsensussekvensen. Proteinforkortelsene og referansene for sekvensdata anvendt for å bestemme konsensussekvensene er: (CR1) komplemenreseptortype 1, (H) faktor H (Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407), (C4bp) C4 bindingsprotein (Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133), (CR2) komplementreseptortype 2 (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639), (Ba) proteolyttisk fragment til faktor B (Morley, B.J. og Campbell, R.D. , 1984, EMBO J. 3:153), (C2b) proteolyttisk fragment til C2 (Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 306:301), (Clr) r subenhet til Cl (Leytus, S.P., et al., 1986, Biochemistry 25:4855 ), (XHIb) b subenhet til faktor XIII (Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25:4633), (P2GP1) p2 glykoprotein I (Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati., Acad. Sei. U.S.A. 81:3640), (Hap) haptoglobin (Kurosky, A., et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:3388), (IL-2-R) interleukin-2 reseptor (Leonard, W.J. et al., 1985, Science 230:633). Stjerne angir at ufullstendig sekvens er tilgjengelig. Figur 8. Skjematisk diagram til antatt struktur av humant CR1. COOH-terminal cytoplasmaregion er på høyre side av 1ipidbilaget. 30 SCR er oppstilt lineært på den ekstracellulære siden av plasmamembranen. Klammene angir LER. Innskuddet er en forstørring av et enkelt SCR for å illustrere trippelloopstruktur. Figur 9. Restriksjonskart av innskuddet til plastmid, pBSABCD, kodende for humant CR1. Angitt innenfor boksen som angir regionen inneholdende den kodende sekvensen er ni fragmenter av åtte cDNA kloner som ble ligert for å danne CR1 konstruksjonen. Klammene angir posisjonene til hhv. LHR-A,-B, -C og -D. Linjene under boksen representerer posisjonene til nylig isolerte 5' cDNA kloner. Restriksjonssetene er: A, Apal; B, BamHI; G, Bglll; H, Hindlll; K. Kpnl; M, BspMII; P, Pstl; R, EcoRI og S, Sacl. Figur 10. Avledet aminosyresekvens til 5' cDNA kloner kodende for syv SCR til LHR-A, og oppstilling av denne sekvensen med tilsvarende SCR til LHR-B, -C og -D. Fire cysteiner som er konserverte i hver SCR er understreket. En rest er vist for LHR-B, -C og -D bare hvor det er forskjellig fra det i LHR-A. Figur 11. Restriksjonskart til ekspressjonsplamidene, piABCD og pMTABCD. Pmjyj-p og <P>cmv representerer murinmetallotionein og cytomegalovirus "immediate early" promotere, respektivt. Figur 12. Analyse ved fasekontrast (panelene a og c) og immunofluorescens (panelene b og d) mikroskopi av COS celler transfektert med piABCD (panelene a og b) og CDM8 vektor alene (panelene c og d), respektivt, og indirekte farget med YZ1 monoklonalt anti-CRl antistoff og fluorescein-merket geite anti-muse F(ab')2-Figur 13. Analyse av C3b- og C4b-binding ved COS celler som uttrykker rekombinant CR1. COS celler transfektert med piABCD (panelene a og c) eller med CDM8 vektor alene (panelene b og Figure 1. Nucleotide and amino acid sequence of the entire CR1 coding region. The sequence begins with the first nucleotide after the octamer EcoRI linker in clone XT109.1. Nucleotide number 1531 in this sequence is the first nucleotide 5' of nucleotide no. 1 of the sequence indicated in fig. 3. The strand corresponding to the mRNA is shown, with the deduced amino acid sequence presented below. The putative signal sequence encoded by nucleotide numbers 28-147 is in parentheses. Figure 2. Restriction map of 5.5 kb human CR1 cDNA. The black line indicates cDNA, the restriction sites are H, HindIII; B, BamHI; R, EcoRI; P, Pstl; A, Apal; S, SacI; G, Bglll; K, Kpnl. The cDNA clones from which the sequence was derived are shown below the map. The arrows indicate the direction and range of sequence analysis by the dideoxynucleotide chain termination method. The cDNA clones were oriented on the basis of the restriction maps and overlapping sequence identity. Figure 3. Nucleotide sequence of 5.5 kb human CR1 cDNA. The strand corresponding to mRNA is shown and base no. 1 (corresponding to base no. 1532 in Fig. 1) is the first base after the EcoRI linker in the 5' clone. The stop codon is underlined. The 110-bp boxed sequence was found between nucleotides 147 and 148 (arrow) and is thought to represent part of an intervening sequence. Figure 4. Dot matrix analysis of the nucleotide sequence of the 5.5 kb human CR1 cDNA. A dot was plotted if there was at least 40 bp of the 90 bp match. The dark line that bisects the square diagonally indicates the identity of the sequence itself. The two additional parallel dark lines 1.35 and 2.7 kb from the line of identity represent two tandem direct long homologous repeats (LHR) of 1.35 kb each. The six lighter dashed lines between two LHRs correspond to short consensus repeats of ∼0.2 kb. Short consensus repeats (SCR) extend 0.4 kb past the long homologous repeats. Figure 5. Deduced amino acid sequence of human CR1. Each residue is shown in the one-letter code (Lehninger, A.L., 1975, Biochemistry, 2d Ed., Worth Publishers, Inc., New York, p. 72). The residues in long homologous repeats have been plotted to illustrate the homology. All residues in LHR-B are shown, and a residue is given for LHR-C and LHR-D only where it differs from that in LHR-B. A hydropathy profile is plotted below the COOH terminus of the protein to illustrate the putative transmembrane region. A stretch of four positively charged residues right after the hydrophobic sequence is underlined. Six amino acid sequence with 67% homology to a site for protein kinase C phosphorylation in epidermal growth factor receptor is underlined. A schematic diagram of the CR1 protein is shown above the sequence. (TM) transmembrane region, (Cyt) cytoplasmic region, (3'UT) 3' untranslated sequence. Figure 6. (A) Arrangement of SCR to CR1. The repeats are numbered 1-23 from the NH2 terminus to the COOH terminus. Stays have been introduced to maximize the line-up. The boxes represent constant residues and vertical arrows indicate positions of amino acid conservation. A residue must be conserved if it, or a conservative substitution, is present in at least half of the SCR. The horizontal arrow indicates an SCR that was also sequenced from CR1 genomic clone 2.38 and is encoded by a single exon. (B) Restriction map, sequencing strategy and partial sequence of genomic clone X2.38. The restriction sites are: (B) BamHI, (S) SacI, (E) EcoRV, (K) KpnI, (P) Pstl. Horizontal arrow indicates direction and extent of sequencing and vertical arrows indicate exon-intron boundaries. Figure 7. Alignment of the consensus sequence of the SCR of proteins known to have this structure. Areas were introduced to maximize the lineup. A residue must be conserved as in fig. 5, with the exception of those proteins that only have one or two SCRs, where a residue is conserved if it is present in at least half of the other proteins. The slashes correspond to non-conserved positions. Underlined portions of CR2 and C2b indicate that no sequence information has been published in this region for these proteins. The boxes indicate constant half-cysteines. The numbers to the right of the sequence represent the number of SCRs used to form the consensus sequence. The protein abbreviations and sequence data references used to determine the consensus sequences are: (CR1) complement receptor type 1, (H) factor H (Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407), (C4bp) C4 binding protein ( Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133), (CR2) complement receptor type 2 (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639), ( Ba) proteolytic fragment of factor B (Morley, B.J. and Campbell, R.D. , 1984, EMBO J. 3:153), (C2b) proteolytic fragment of C2 (Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 306:301), (Clr) r subunit of Cl (Leytus, S.P., et al., 1986, Biochemistry 25:4855 ), (XHIb) b subunit of factor XIII (Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25:4633), (P2GP1) p2 glycoprotein I (Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati., Acad. Sei. U.S.A. 81:3640), (Hap) haptoglobin (Kurosky , A., et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:3388), (IL-2-R) interleukin-2 receptor (Leonard, W.J. et al., 1985, Science 230:633) . Asterisk indicates that incomplete sequence is available. Figure 8. Schematic diagram of the assumed structure of human CR1. The COOH-terminal cytoplasmic region is on the right side of the lipid bilayer. 30 SCRs are arranged linearly on the extracellular side of the plasma membrane. The brackets indicate LER. The inset is an enlargement of a single SCR to illustrate the triple loop structure. Figure 9. Restriction map of the insert of plasmid, pBSABCD, coding for human CR1. Indicated within the box denoting the region containing the coding sequence are nine fragments of eight cDNA clones that were ligated to form the CR1 construct. The brackets indicate the positions of the LHR-A,-B,-C and -D. The lines below the box represent the positions of newly isolated 5' cDNA clones. The restriction seats are: A, Apal; B, BamHI; G, Bglll; H, HindIII; K. Kpnl; M, BspMII; P, Pstl; R, EcoRI and S, Sacl. Figure 10. Derived amino acid sequence of 5' cDNA clones coding for seven SCRs to LHR-A, and alignment of this sequence with corresponding SCRs to LHR-B, -C and -D. Four cysteines that are conserved in each SCR are underlined. A residue is shown for LHR-B, -C and -D only where it differs from that in LHR-A. Figure 11. Restriction map of the expression plasmids, piABCD and pMTABCD. Pmjyj-p and <P>cmv represent murine metallothionein and cytomegalovirus "immediate early" promoters, respectively. Figure 12. Analysis by phase contrast (panels a and c) and immunofluorescence (panels b and d) microscopy of COS cells transfected with piABCD (panels a and b) and CDM8 vector alone (panels c and d), respectively, and indirectly stained with YZ1 monoclonal anti-CR1 antibody and fluorescein-labeled goat anti-mouse F(ab')2-Figure 13. Analysis of C3b and C4b binding in COS cells expressing recombinant CR1. COS cells transfected with piABCD (panels a and c) or with CDM8 vector alone (panels b and

d) ble inkubert med EAC4b(lim), 3b (panelene a og b) eller med EAC4b (panelene c og d) og undersøkt for dannelsen av d) was incubated with EAC4b(lim), 3b (panels a and b) or with EAC4b (panels c and d) and examined for the formation of

rosetter ved fasekontrastmikroskopi. rosettes by phase contrast microscopy.

Figur 14. Analyse av rekombinant CR1 uttrykt ved transfekterte COS celler ved SDS-PAGE. COS celler transfektert med CDM8 vektor alene (kolonnene 1 og 4) og med piABCD (kolonnene 2 og 5), respektivt, og erytrocytter fra et individ som har F og S allotyper av CR1 (kolonnene 3 og 6) ble overflatemerket med <125>i. Detergentlysater av cellene ble sekvensielt immunoadsorbert med Sepharose-UPlO (kolonnene 1-3) og Sepharose-YZl (kolonnene 4-6) og eluatene analysert ved SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser og autoradiografi. Figure 14. Analysis of recombinant CR1 expressed by transfected COS cells by SDS-PAGE. COS cells transfected with CDM8 vector alone (columns 1 and 4) and with piABCD (columns 2 and 5), respectively, and erythrocytes from an individual carrying F and S allotypes of CR1 (columns 3 and 6) were surface labeled with <125> in. Detergent lysates of the cells were sequentially immunoadsorbed with Sepharose-UP10 (columns 1-3) and Sepharose-YZ1 (columns 4-6) and the eluates analyzed by SDS-PAGE under non-reducing conditions and autoradiography.

Figur 15. Spaltning av <125>I-C3(ma) ved faktor I i nærvær av immunoimmobilisert rekombinant CR1. Replikatprøver av <125>l-C3(ma) ble behandlet med faktor I i nærvær av faktor H (kolonne 1), Sepharose-UPCIO preinkubert med lysatet til COS cellene transfektert med CDM8 vektor alene (kolonne 2), Sepharose-UPCIO preinkubert med lysatet til piABCD-transfekterte COS celler (kolonne 3), Sepharose-YZl (preinkubert med lysatet til CDM8-transfekterte COS celler (kolonne 4), og 6 ul (kolonne 5), 12 >j1 (kolonne 6) og 25 pl (kolonne 7) Sepharose-YZl som er blitt preinkubert med lysatet til piABCD-transfekterte COS celler. Prøver av <125>I-merket C3(ma) ble også behandlet i fravær av faktor I med 25 ul Sepharose-YZl som er blitt preinkubert med lysatet til piABCD-transfekterte COS celler (kolonne 8). Etter reduksjon ble <125>I-C3(ma) analysert ved SCS-PAGE og autoradiografi. Figur 16. cDNA konstruksjoner kodende for CR1 delesjonsmutanter. Posisjonene til cDNA segmentene kodende for fire LHR er angitt med klammer over fullengde piABCD konstruksjon hvor restriksjonsseter anvendt for preparering av delesjonsmutantene er vist. cDNA restriksjonsfragmentene som forblir i hver av mutantene er angitt med hele linjer. Restriksjonssetene er: A, Apal; B, Bsml; E, BstEII; og P, Pstl. Figur 17. Sammenligning av rekombinant delesjonsmutanter til CR1 med vildtype F og S allotyper til CR1. Detergentlysater av <l2>^I-overflatemerkede erytrocytter (kolonnene 1 og 7) og COS celler transfektert med CDM8 vektor alene (kolonnene 2 og 8), piABCD (kolonnene 3 og 9), piBCD (kolonnene 4 og 10), piCD (kolonnene 5 og 11) og piD (kolonnene 6 og 12), respektivt, ble immunpresipitert med Sepharose-UPCIO anti-levanantistoff (kolonnene 1-6), Sepharose-YZ-1 anti-CRl monoklonalt antistoff (kolonnene 7-11) og kanin anti-CRl antistoff og Sepharose-protein A (kolonne 12), respektivt. Eluatene ble utsatt for SDS-PAGE under reduserende betingelser og autoradiografi. Figur 18. Spaltning av 12<5>I-C3(ma) ved faktor I i nærvær av COS celler som uttrykker full lengde og delesjonsmutanter til CR1. Replikatprøver av <125>I-C3(ma) ble inkubert med COS celler transfektert med CDM8 vektor alene (kolonnene 1 og 7), piABCD (kolonnene 2 og 8), piAD (kolonnene 3 og 9), piBD (kolonnene 4 og 10), piCD (kolonnene 5 og 11) og piD (kolonnene 6 og 12), respektivt, i fravær (kolonnene 1-6) eller nærvær (kolonnene 7-12) av faktor I. Prøver av <125>j_ C3(ma) ble også inkubert med faktor H og faktor I (kolonne 13) og med faktor I alene (kolonne 14), respektivt. Etter reduksjon ble <125>I-C3(ma) analysert ved SDS-PAGE og auto-radiograf i. Figur 19. Skjematisk modell som viser typer av SCR omfattende hver LHR til CR1, og antatte seter som bestemmer spesifisitetene til reseptoren for C3b og C4b. Sekundære bindingsspesifisiteter til disse er angitt av parentesene. Figur 20. Et skjematisk diagram som illustrerer DNA regionene som forblir i oppløselige CR1 DNA konstruksjoner. Regioner med fullengde CR1 cDNA er angitt ved boksene langs toppen av figuren. Figur 21. Et skjematisk diagram som illustrerer hovedelementene i pTCS seriene til ekspressjonsvektorer. Figur 22. Et diagram av ekspressjonsvektor PTCSgpt. Polyadenyleringssetet er fra murinet lg kappasekvenser (NBRF nukleindatabaseaksessjon #Kcms, bp 1306-1714); Ad2 MLP og tripartittregioner er fra Ad2 sekvensen (NBRF nukleindatabaseaksessjon #Gdad2, bp 5791-6069); SV40 tidiigpromoter er fra SV40 genomet (NBRF nukleindatabaseaksessjon $GSV40¥). gpt genet, ampicillingenet og bakteriell replikasjonsorigo er fra vektor pSV2gpt (ATCC aksessjonsnr. 37145). Figur 23. 4-20$ SDS-PAGE av antistoffaffinitetsrenset sCRl. Ikke-reduserende (kolonnene 1, 2, 3) og reduserende (kolonnene 4, 5, 6) betingelser. Kolonnene 1, 3: molekylvektsmarkø-rer; kolonnene 3, 5: cellekultursupernatantutgangsmateriale; kolonnene 4, 6: sCRl renset ved antistoffaffinitetskromato-graf i. Figur 24. Kationutbytte HPLC elueringsprofil. Eluert protein ble registrert ved absorbans ved 280 nm (y-akse). Absorbans av både gjennomstrømning (0-100 minutter) og eluert sCRl (150-165 minutter) var begge utenfor skala, x-aksen representerer elueringstid i minutter. Figur 25. 4-20$ gradient SDS-PAGE av kation og anionbytte HPLC renset sCRl. SDS-polyakrylamidgeler ble kjørt under ikke-reduserende betingelser. Kolonne 1, en alikvot av bioreaktorsupernatant; kolonne 2, en alikvot av bioreaktorsupernatant dialysert mot kation HPLC utgangsbuffer; kolonne 3, en alikvot av eluert sCRl topp fra en kationbytte HPLC kolonne; kolonne 4, en alikvot av sCRl topp fra kationbytte HPLC kolonne dialysert inn i utgangsbuffer for anion HPLC; kolonnene 5 og 6, alikvoter av to forskjellige fraksjoner av eluert sCRl fra anion HPLC. Figur 26. C5a induksjon av en oksygenutbrudd i humane neutrofiler. Etter et C5a indusert oksygenutbrudd ble DCFDA oksydert og sterkt fluorescert. Fluorescensintensitet, bestemt ved flowcytometri, ble målt på x-aksen og antall celler på y-aksen. Panel a, profil og fil for cellene; panel b, 0 minutter etter C5a tilsetning; panel c, 1 minutt; panel d, 2 minutter; panel e, 3 minutter; panel f, 4 minutter; panel g, 20 minutter. Denne DCFDA analysen gir en sensitiv indikasjon på C5a. Figur 27. Aktivering av human komplement i nærvær av sCRl viser redusert C5a aktivitet i DCFDA analysen. Panel a, ustimulerte celler; panel b, kontroll uten sCRl som viser en høy grad av fluorescens; panel c, DCFDA analyse i nærvær av sCRl viser en reduksjon på 75$ i fluorescensintensitet. y-akse er antall celler og x-akse er fluorescensintensitet. Figur 28. Hemming av klassisk reaksjonsvei C5a og C3a produksjon i humant serum ved sCRl. Lignende profiler ble observert for enten antistoffaffinitetsrenset eller HPLC renset sCRl. Figur 29. Inhibisjon av komplement-mediert hemolyse ved rekombinant sCRl. Lignende profiler ble observert for antistoffaffinitetrenset eller HPLC renset sCRl. Figur 30. Grov morfologi er RPAR i sCRl-behandlede (venstre) og ubehandlede (høyre) rotter, (a) Begge rottene mottok en intravenøs injeksjon av ovalbumin, etterfulgt av en intrader-mal injeksjon av en blanding av enten sCRl (venstre rotte) eller PBS (høyre rotte) med anti-ovalbumin, ren (venstre sted); anti-ovalbumin, 1/2 fortynning (middelsted) eller kanin IgG (høyre sted). Injeksjonene ble utført dobbelt; topp- og bunnrekker ga identiske resultater. Rottene som mottok sCRl hadde såvidt synlige forandringer, mens ubehandlede rotter utviklet fullstendige symptomer på RPAR. (b) Dermaloverflaten til hudbiopsier fra (a). Biopsi fra ubehandlet rotte (høyre) utviklet klart synlige lesjon, mens biopsi fra sCRl-behandlet rotte (venstre) viste normal morfologi. Figur 31. Lysmikroskopi av hudbiopsier fra sCRl-behandlede (a) og ubehandlede (b) rotter. Figure 15. Cleavage of <125>I-C3(ma) by factor I in the presence of immunoimmobilized recombinant CR1. Replicate samples of <125>l-C3(ma) were treated with factor I in the presence of factor H (column 1), Sepharose-UPCIO preincubated with the lysate of the COS cells transfected with CDM8 vector alone (column 2), Sepharose-UPCIO preincubated with the lysate of piABCD-transfected COS cells (column 3), Sepharose-YZl (preincubated with the lysate of CDM8-transfected COS cells (column 4), and 6 µl (column 5), 12 µl (column 6) and 25 µl (column 7) Sepharose-YZl preincubated with the lysate of piABCD-transfected COS cells Samples of <125>I-labeled C3(ma) were also treated in the absence of factor I with 25 µl Sepharose-YZl preincubated with the lysate to piABCD-transfected COS cells (column 8). After reduction, <125>I-C3(ma) was analyzed by SCS-PAGE and autoradiography. Figure 16. cDNA constructs encoding CR1 deletion mutants. The positions of the cDNA segments encoding four LHRs are indicated by brackets above full-length piABCD construct where restriction sites were used for preparation of the deletion mutants are shown. The cDNA restriction fragments that remain in each of the mutants are indicated by solid lines. The restriction seats are: A, Apal; B, Bsml; E, BstEII; and P, Pstl. Figure 17. Comparison of recombinant deletion mutants of CR1 with wild-type F and S allotypes of CR1. Detergent lysates of <l2>^I-surface-labeled erythrocytes (columns 1 and 7) and COS cells transfected with CDM8 vector alone (columns 2 and 8), piABCD (columns 3 and 9), piBCD (columns 4 and 10), piCD (columns 5 and 11) and piD (columns 6 and 12), respectively, were immunoprecipitated with Sepharose-UPCIO anti-levan antibody (columns 1-6), Sepharose-YZ-1 anti-CR1 monoclonal antibody (columns 7-11) and rabbit anti -CR1 antibody and Sepharose protein A (column 12), respectively. The eluates were subjected to SDS-PAGE under reducing conditions and autoradiography. Figure 18. Cleavage of 12<5>I-C3(ma) by factor I in the presence of COS cells expressing full length and deletion mutants of CR1. Replicate samples of <125>I-C3(ma) were incubated with COS cells transfected with CDM8 vector alone (columns 1 and 7), piABCD (columns 2 and 8), piAD (columns 3 and 9), piBD (columns 4 and 10 ), piCD (columns 5 and 11) and piD (columns 6 and 12), respectively, in the absence (columns 1-6) or presence (columns 7-12) of factor I. Samples of <125>j_ C3(ma) were also incubated with factor H and factor I (column 13) and with factor I alone (column 14), respectively. After reduction, <125>I-C3(ma) was analyzed by SDS-PAGE and auto-radiograph i. Figure 19. Schematic model showing types of SCR comprising each LHR to CR1, and putative sites that determine the specificities of the receptor for C3b and C4b. Secondary binding specificities to these are indicated by the parentheses. Figure 20. A schematic diagram illustrating the DNA regions that remain in soluble CR1 DNA constructs. Regions of full-length CR1 cDNA are indicated by the boxes along the top of the figure. Figure 21. A schematic diagram illustrating the main elements of the pTCS series of expression vectors. Figure 22. A diagram of expression vector PTCSgpt. The polyadenylation site is from murine lg kappa sequences (NBRF Nucleic Database Accession #Kcms, bp 1306-1714); Ad2 MLP and tripartite regions are from the Ad2 sequence (NBRF Nucleic Database Accession #Gdad2, bp 5791-6069); The SV40 early promoter is from the SV40 genome (NBRF Nucleic Database Accession $GSV40¥). The gpt gene, ampicillin gene and bacterial origin of replication are from vector pSV2gpt (ATCC accession no. 37145). Figure 23. 4-20$ SDS-PAGE of antibody affinity-purified sCR1. Non-reducing (columns 1, 2, 3) and reducing (columns 4, 5, 6) conditions. Columns 1, 3: molecular weight markers; columns 3, 5: cell culture supernatant starting material; columns 4, 6: sCR1 purified by antibody affinity chromatograph i. Figure 24. Cation yield HPLC elution profile. Eluted protein was recorded by absorbance at 280 nm (y-axis). Absorbance of both flow through (0-100 minutes) and eluted sCR1 (150-165 minutes) were both off scale, x-axis represents elution time in minutes. Figure 25. 4-20$ gradient SDS-PAGE of cation and anion exchange HPLC purified sCR1. SDS-polyacrylamide gels were run under non-reducing conditions. Column 1, an aliquot of bioreactor supernatant; column 2, an aliquot of bioreactor supernatant dialyzed against cation HPLC starting buffer; column 3, an aliquot of eluted sCR1 peak from a cation exchange HPLC column; column 4, an aliquot of sCR1 peak from cation exchange HPLC column dialyzed into starting buffer for anion HPLC; columns 5 and 6, aliquots of two different fractions of eluted sCR1 from anionic HPLC. Figure 26. C5a induction of an oxygen burst in human neutrophils. After a C5a-induced oxygen burst, DCFDA was oxidized and strongly fluoresced. Fluorescence intensity, determined by flow cytometry, was measured on the x-axis and the number of cells on the y-axis. Panel a, profile and file for the cells; panel b, 0 min after C5a addition; panel c, 1 minute; panel d, 2 minutes; panel e, 3 minutes; panel f, 4 minutes; panel g, 20 minutes. This DCFDA analysis provides a sensitive indication of C5a. Figure 27. Activation of human complement in the presence of sCR1 shows reduced C5a activity in the DCFDA analysis. Panel a, unstimulated cells; panel b, control without sCR1 showing a high degree of fluorescence; panel c, DCFDA analysis in the presence of sCR1 shows a 75% decrease in fluorescence intensity. y-axis is the number of cells and x-axis is fluorescence intensity. Figure 28. Inhibition of classical reaction pathway C5a and C3a production in human serum by sCR1. Similar profiles were observed for either antibody affinity purified or HPLC purified sCR1. Figure 29. Inhibition of complement-mediated hemolysis by recombinant sCR1. Similar profiles were observed for antibody affinity purified or HPLC purified sCR1. Figure 30. Gross morphology is RPAR in sCR1-treated (left) and untreated (right) rats, (a) Both rats received an intravenous injection of ovalbumin, followed by an intradermal injection of a mixture of either sCR1 (left rat) or PBS (right rat) with anti-ovalbumin, pure (left site); anti-ovalbumin, 1/2 dilution (middle site) or rabbit IgG (right site). The injections were performed twice; top and bottom rows gave identical results. The rats that received sCRl had barely visible changes, while untreated rats developed full symptoms of RPAR. (b) Dermal surface of skin biopsies from (a). Biopsy from untreated rat (right) developed clearly visible lesions, while biopsy from sCR1-treated rat (left) showed normal morphology. Figure 31. Light microscopy of skin biopsies from sCR1-treated (a) and untreated (b) rats.

(a) Perivaskulær akkumulasjon av polymorfonukleære og mononukleære celler ble observert, men ingen omfattende infiltrasjon av nøytrofiler eller ekstravasasjon av erytrocytter ble oppdaget, (b) Omfattende infiltrasjon av polymor- (a) Perivascular accumulation of polymorphonuclear and mononuclear cells was observed, but no extensive infiltration of neutrophils or extravasation of erythrocytes was detected, (b) Extensive infiltration of polymorpho-

fonukleære celler og ekstravasasjon av erytrocytter ble identifisert. fonuclear cells and extravasation of erythrocytes were identified.

5. DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN 5. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Foreliggende oppfinnelse vedrører CR1 nukleinsyresekvens og fragment derav. Oppfinnelsen tilveiebringer også ekspresjon av CR1 proteinet og fragmenter derav. Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en farma-søytisk sammensetning som omfatter CR1. CR1 nukleinsyrene og proteinene anvendes for diagnostikk eller terapi av forstyrrelser omfattende komplementaktivitet, og forskjellige betennelsesforstyrrelser og immunforstyrrelser. The present invention relates to the CR1 nucleic acid sequence and fragment thereof. The invention also provides for expression of the CR1 protein and fragments thereof. Furthermore, the invention includes a method for producing a pharmaceutical composition comprising CR1. The CR1 nucleic acids and proteins are used for diagnostics or therapy of disorders involving complement activity, and various inflammatory disorders and immune disorders.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en nukleinsyresekvens kjennetegnet ved at den omfatter en sekvens kodende for full-lengde CRl-protein som angitt i fig.l fra nukleotidnummerne 28 t.o.m. 6144. The present invention relates to a nucleic acid sequence characterized by the fact that it comprises a sequence coding for full-length CR1 protein as indicated in fig. 1 from nucleotide numbers 28 to. 6144.

Oppfinnelsen omfatter også en nukleinsyrekvens kjennetegnet ved at den omfatter et fragment av nukleinsyresekvensen som angitt i figur 1 og som koder for et protein som mangler en transmembranregion, idet nevnte protein har en komplementregulatorisk aktivitet til full-lengde CR1. The invention also includes a nucleic acid sequence characterized in that it comprises a fragment of the nucleic acid sequence as indicated in Figure 1 and which codes for a protein lacking a transmembrane region, said protein having a complement regulatory activity to full-length CR1.

I tillegg omfatter oppfinnelse rekombinant ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter nukleinsyresekvensen ifølge krav 1 eller 2, og som har evne til å uttrykke sekvensen i en bakterie eller i en pattedyrcelle. In addition, the invention includes a recombinant expression vector, characterized in that it comprises the nucleic acid sequence according to claim 1 or 2, and which has the ability to express the sequence in a bacterium or in a mammalian cell.

Oppfinnelsen omfatter også en rekombinant celle, kjennetegnet ved at den omfatter nukleinsyresekvensen eller omfatter en rekombinant ekspresjonsvektor. The invention also encompasses a recombinant cell, characterized in that it comprises the nucleic acid sequence or comprises a recombinant expression vector.

Omfattet er også fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som omfatter et CRl-protein som omfatter aminosyresekvensen som vist i figur 1, eller et fragment derav, som mangler en transmembranregion og utviser en komplementregulatorisk aktivitet av full-lengde CR1, kjennetegnet ved (a) ekspresjon i en rekombinant vertcelle (b) gjenvinning av nevnte CRl-protein eller fragment, og (c) formulering av nevnte CRl-protein eller fragment for terapeutisk administrering til et menneske eller dyr, samt en fremgangsmåte for å produsere et CRl-protein, kjennetegnet ved at den omfatter å dyrke den rekombinante cellen. Also included is a method for producing a pharmaceutical composition comprising a CR1 protein comprising the amino acid sequence as shown in figure 1, or a fragment thereof, which lacks a transmembrane region and exhibits a complement regulatory activity of full-length CR1, characterized by (a) expression in a recombinant host cell (b) recovery of said CR1 protein or fragment, and (c) formulation of said CR1 protein or fragment for therapeutic administration to a human or animal, as well as a method for producing a CR1 protein, characterized in that it comprises culturing the recombinant cell.

Nedenfor er kloning og fullstendig nukleotid og utledet aminosyresekvens til full-lengde CR1 cDNA og av fragmenter derav, og ekspressjon av kodede CR1 produkter, beskrevet. Ekspressjon av CR1 og fragmenter derav, med bindingsseter for C3b og/eller C4b, og som hemmer faktor I kofaktoraktivitet, er også beskrevet. Oppfinnelsen er videre illustrert ved produksjon og rensing av oppløselige, forkortede CR1 molekyler. I spesifikke eksempler har slike molekyler demonstrert å være terapeutisk nyttige ved redusering av betennelse, og ved redusering av hjerteinfarktstørrelse og forhindring av reperfusjonsskade. Below, the cloning and complete nucleotide and deduced amino acid sequence of full-length CR1 cDNA and of fragments thereof, and expression of encoded CR1 products, are described. Expression of CR1 and fragments thereof, with binding sites for C3b and/or C4b, and which inhibit factor I cofactor activity, has also been described. The invention is further illustrated by the production and purification of soluble, shortened CR1 molecules. In specific examples, such molecules have been demonstrated to be therapeutically useful in reducing inflammation, and in reducing myocardial infarct size and preventing reperfusion injury.

5.1. Isolas. ion av CR1 genet 5.1. Isolation. ion of the CR1 gene

Den fullstendige kodende sekvensen til CR1 genet og dets avledede aminosyresekvens er presentert i fig. 1. The complete coding sequence of the CR1 gene and its deduced amino acid sequence are presented in Fig. 1.

En hvilken som helst human celle kan potensielt virke som nukleinsyrekilde for molekylær kloning av CR1 genet. Isolering av CR1 genet omfatter isolering av de DNA sekvensene som koder for et protein som utviser CRl-assosiert struktur eller egenskaper, f.eks. binding av C3b eller C4b eller immunkomplekser, modulerende fagocytose, immunstimulering eller proliferasjon, og regulering av komplement. DNA kan bli tilveiebragt ved standard prosedyrer kjent innenfor fagområdet fra klonet DNA (f.eks. et DNA "bibliotek"), ved kjemisk syntese, ved cDNA kloning eller ved kloning av genomisk DNA, eller fragmenter derav, renset fra ønsket human celle. (Se f.eks. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.). 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K., Vol. I, II.) Celler somkan virke som kilder for nukleinsyre for cDNA kloning av CR1 genet omfatter, men er ikke begrenset til monocytter/makrofager, granulocytter, B celler, T celler, miltfollikulære dendritiske celler og glomerulære podocytter. Kloner avledet fra genomisk DNA kan inneholde regulatoriske og intron DNA regioner i tillegg til kodende regioner; kloner avledet fra cDNA vil bare inneholde eksonsekvenser. Hvilken som helst kilde som anvendes bør CR1 genet bli molekylært klonet inn i en egnet vektor for propagering av genet. Any human cell can potentially act as a nucleic acid source for molecular cloning of the CR1 gene. Isolation of the CR1 gene comprises isolation of the DNA sequences that code for a protein that exhibits CR1-associated structure or properties, e.g. binding of C3b or C4b or immune complexes, modulating phagocytosis, immune stimulation or proliferation, and regulation of complement. DNA can be provided by standard procedures known in the art from cloned DNA (e.g. a DNA "library"), by chemical synthesis, by cDNA cloning or by cloning genomic DNA, or fragments thereof, purified from the desired human cell. (See, e.g., Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.). 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K., Vol. I, II.) Cells that can serve as sources of nucleic acid for cDNA cloning of the CR1 gene include, but are not limited to, monocytes/macrophages, granulocytes, B cells, T cells, splenic follicular dendritic cells and glomerular podocytes. Clones derived from genomic DNA may contain regulatory and intron DNA regions in addition to coding regions; clones derived from cDNA will only contain exon sequences. Whichever source is used, the CR1 gene should be molecularly cloned into a suitable vector for propagation of the gene.

Ved molekylær kloning av genet fra genomisk DNA blir DNA fragmenter dannet, hvor noen vil kode for det ønskede CR1 genet. DNA kan bli spaltet ved spesifikke seter ved anvendelse av forskjellige restriksjonsenzymer. Alternativt kan man anvende DNAse i nærvær av mangan for å fragmentere DNA, eller DNA kan bli fysisk spaltet, som f.eks. ved sonikering. De lineære DNA fragmentene kan deretter bli separert etter størrelse ved standard teknikker, inkludert men ikke begrenset til, agarose og polyakrylamidgelektroforese og kolonnekromatograf i. By molecular cloning of the gene from genomic DNA, DNA fragments are formed, some of which will code for the desired CR1 gene. DNA can be cleaved at specific sites using different restriction enzymes. Alternatively, one can use DNAse in the presence of manganese to fragment the DNA, or the DNA can be physically cleaved, as e.g. by sonication. The linear DNA fragments can then be separated by size by standard techniques, including but not limited to, agarose and polyacrylamide gel electrophoresis and column chromatography.

Når DNA fragmentene er blitt dannet, kan identifikasjon av det spesifikke DNA fragmentet inneholdende CR1 genet bli oppnådd på et antall måter. F.eks., dersom en mengde av et CR1 gen eller dets spesifikke RNA, eller et fragment derav, er tilgjengelig og kan bli renset og merket, kan de dannede DNA fragmentene bli screenet ved nukleinsyrehybridisering til den merkede proben (Benton, W. og Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. og Hogness, D., 1975, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 72:3961). De DNA fragmentene med vesentlig homologi med proben vil hybridisere. Dersom en renset CR1-spesifikk probe ikke er tilgjengelig kan nukleinsyrefraksjo-ner anriket i CR1 bli anvendt som en probe, som en begynnende seleksjonsprosedyre. Som et eksempel kan proben representer-ende B celle cDNA der beskjeder uttrykt av fibroblaster er blitt subtrahert bli anvendt. Det er også mulig å identifisere det hensiktsmessige fragmentet ved restriksjonsen-zymspaltning(er) og sammenligning av fragmentstørrelser med de som ventes ifølge et kjent restriksjonskart, dersom dette er tilgjengelig. Seleksjon på grunnlag av egenskapene til genet, eller fysiske, kjemiske eller immunologiske egenskaper til det uttrykte produktet derav, som beskrevet nedenfor, kan bli anvendt etter den opprinnelige seleksjonen. Once the DNA fragments have been formed, identification of the specific DNA fragment containing the CR1 gene can be achieved in a number of ways. For example, if an amount of a CR1 gene or its specific RNA, or a fragment thereof, is available and can be purified and labeled, the DNA fragments formed can be screened by nucleic acid hybridization to the labeled probe (Benton, W. and Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. and Hogness, D., 1975, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 72:3961). The DNA fragments with significant homology to the probe will hybridize. If a purified CR1-specific probe is not available, nucleic acid fractions enriched in CR1 can be used as a probe, as an initial selection procedure. As an example, the probe representing B cell cDNA from which messages expressed by fibroblasts have been subtracted can be used. It is also possible to identify the appropriate fragment by restriction enzyme cleavage(s) and comparison of fragment sizes with those expected according to a known restriction map, if this is available. Selection on the basis of the properties of the gene, or physical, chemical or immunological properties of the expressed product thereof, as described below, may be applied after the initial selection.

CR1 genet kan også bli identifisert ved mRNA seleksjon ved nukleinsyrehybridisering etterfulgt av in vitro translasjon. I denne prosedyren blir fragmenter anvendt for å isolere komplementære mRNA ved hybridisering. Slike DNA fragmenter kan representere tilgjengelig, renset CR1 DNA eller DNA som er blitt anriket for CR1 sekvenser. The CR1 gene can also be identified by mRNA selection by nucleic acid hybridization followed by in vitro translation. In this procedure, fragments are used to isolate complementary mRNAs by hybridization. Such DNA fragments may represent available, purified CR1 DNA or DNA that has been enriched for CR1 sequences.

Immunopresipitasjonsanalyse eller funksjonelle analyser (f.eks., for C3b eller C4b binding, eller fremming av fagocyttose eller immunstimulering, eller komplementregulering osv.) av in vitro translasjonsprodukter til isolert mRNA identifiserer mRNA og derfor komplementære DNA fragmenter som inneholder CR1 sekvenser. I tillegg kan spesifikk mRNA bli selektert ved adsorbsjon av polysomer isolert fra celler til immobiliserte antistoff spesifikt rettet mot CR1. Et radiomerket CR1 cDNA kan bli syntetisert ved anvendelse av valgte mRNA (fra adsorberte polysomer) som et templat. Radiomerket mRNA eller cDNA kan deretter bli anvendt som en probe for å identifisere CR1 DNA fragmenter fra andre genomiske DNA fragmenter. Immunoprecipitation assay or functional assays (eg, for C3b or C4b binding, or promotion of phagocytosis or immune stimulation, or complement regulation, etc.) of in vitro translation products of isolated mRNA identify mRNA and therefore complementary DNA fragments containing CR1 sequences. In addition, specific mRNA can be selected by adsorption of polysomes isolated from cells to immobilized antibodies specifically directed against CR1. A radiolabeled CR1 cDNA can be synthesized using selected mRNA (from adsorbed polysomes) as a template. Radiolabeled mRNA or cDNA can then be used as a probe to identify CR1 DNA fragments from other genomic DNA fragments.

Alternativer for isolering av CR1 genomisk DNA omfatter, men er ikke begrenset til, kjemisk syntetisering av selve gensekvensen fra en kjent sekvens eller dannelse av cDNA til mRNA som koder for CR1 genet. F.eks., som beskrevet ovenfor, RNA for cDNA kloning av CR1 genet kan bli isolert fra celler inkludert, men ikke begrenset til monocytter/makrofager, granulocytter, B celler, T celler, dentrittiske celler og podocyter. I en foretrukket utførelsesform kan tonisilar-celler virke som kilde for mRNA for cDNA kloning (se seksjon 6.1.2., nedenfor). Andre fremgangsmåter er mulig og innenfor rammen av oppfinnelsen. Alternatives for isolating CR1 genomic DNA include, but are not limited to, chemically synthesizing the gene sequence itself from a known sequence or forming cDNA into mRNA that codes for the CR1 gene. For example, as described above, RNA for cDNA cloning of the CR1 gene can be isolated from cells including but not limited to monocytes/macrophages, granulocytes, B cells, T cells, dendritic cells and podocytes. In a preferred embodiment, tonsilar cells can act as a source of mRNA for cDNA cloning (see section 6.1.2., below). Other methods are possible and within the scope of the invention.

Det identifiserte og isolerte genet kan deretter bli skutt inn i en hensiktsmessig kloningsvektor. Et stort antall vektor-vertssystemer kjent innenfor fagområdet kan bli anvendt. Mulige vektorer omfatter, men er ikke begrenset til, plasmider eller modifiserte virus, men vektorsystemet må være kompatibelt med anvendte vertscelle. Slike vektorer omfatter, men er ikke begrenset til, bakteriofager så som lambdaderiva-ter, eller plasmider så som pBR322 eller pUC plasmid eller CDM8 plasmid (Seed, B., 1987, Nature 329:840-842) eller derivater. Rekombinante molekyler kan bli introdusert inn i vertsceller via transformasjon, transfeksjon, infeksjon, elektroporasjon osv. The identified and isolated gene can then be inserted into an appropriate cloning vector. A large number of vector host systems known in the art can be used. Possible vectors include, but are not limited to, plasmids or modified viruses, but the vector system must be compatible with the host cell used. Such vectors include, but are not limited to, bacteriophages such as lambda derivatives, or plasmids such as pBR322 or pUC plasmid or CDM8 plasmid (Seed, B., 1987, Nature 329:840-842) or derivatives. Recombinant molecules can be introduced into host cells via transformation, transfection, infection, electroporation, etc.

I en alternativ fremgangsmåte kan CR1 genet bli identifisert og isolert etter innskudd inn i en egnet kloningsvektor, i en "shot gun" tilnærmelse. Anrikning for CR1 genet, f.eks., ved størrelsesfraksjonering, kan bli utført før innskudd inn i kloningsvektoren. In an alternative method, the CR1 gene can be identified and isolated after insertion into a suitable cloning vector, in a "shot gun" approach. Enrichment for the CR1 gene, eg, by size fractionation, can be performed prior to insertion into the cloning vector.

CR1 genet blir skutt inn i en kloningsvektor som kan bli anvendt for å transformere, transfektere eller infisere hensiktsmessige vertsceller slik at mange kopier av gensek-vensene blir dannet. I en spesifikk utførelsesform kan kloningsvektoren være CDM8 vektoren, som kan bli anvendt for å oppnå ekspressjon i en pattedyrvertscelle. Innskudd inn i en kloningsvektor kan f.eks. oppnås ved ligering av DNA fragmentet inn i en kloningsvektor som har komplementære kohesive termini. Dersom komplementære restriksjonsseter anvendt for å spalte DNA ikke er tilstede i kloningsvektoren, kan endene til DNA molekylene bli modifisert enzymatisk. Alternativt kan et hvilket som helst sete som er ønsket bli dannet ved ligering av nukleotidsekvenser (linkere) til DNA termini og disse ligerte linkerene kan omfatte spesifikke kjemisk syntetiserte oligonukleotider som koder for restrik-sjonsendonukleasegjenkjenningssekvenser. I en alternativ fremgangsmåte kan den spaltede vektoren og CR1 genet bli modifisert ved homopolymerisk haledannelse. The CR1 gene is inserted into a cloning vector which can be used to transform, transfect or infect suitable host cells so that many copies of the gene sequences are formed. In a specific embodiment, the cloning vector may be the CDM8 vector, which may be used to achieve expression in a mammalian host cell. Insertion into a cloning vector can e.g. is achieved by ligation of the DNA fragment into a cloning vector that has complementary cohesive termini. If complementary restriction sites used to cleave the DNA are not present in the cloning vector, the ends of the DNA molecules can be modified enzymatically. Alternatively, any site desired may be formed by ligation of nucleotide sequences (linkers) to DNA termini and these ligated linkers may comprise specific chemically synthesized oligonucleotides encoding restriction endonuclease recognition sequences. In an alternative method, the cleaved vector and the CR1 gene can be modified by homopolymeric tail formation.

Identifikasjon av det klonede CR1 genet kan oppnås på et antall måter basert på egenskapene til selve DNA, eller alternativt, på fysiske, immunologiske eller funksjonelle egenskaper til dets kodende protein. F.eks. kan selve DNA bli detektert ved plaque eller koloninukleinsyrehybridisering til merkede prober (Benton, W. og Davis. R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. og Eogness, D., 1975, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 72:3961). Alternativt kan tilstedeværelse av CR1 genet bli påvist ved analyser basert på egenskapene til det uttrykte produktet. F.eks. kan cDNA kloner, eller DNA kloner som hybrid-selekterer riktige mRNA bli valgt som produserer et protein som f.eks. har lignende eller identisk elektroforetisk migrering, isoelektrisk fokuseringsadferd, proteolyttiske spaltningskart, C3b og/eller C4b og/eller immunkompleksbindingsaktivitet, komplementregulatorisk aktivitet, virkning på fagocytose eller immunstimulering, eller antigene egenskaper som er kjent for CR1. Ved anvendelse av et antistoff mot CR1 kan CR1 proteinet bli identifisert ved binding av merket antistoff til antatte CR1-syntetiserende kloner, i en ELISA (enzym-bundet immunosorbent analyse)-typeprosedyre. Identification of the cloned CR1 gene can be achieved in a number of ways based on the properties of the DNA itself, or alternatively, on physical, immunological or functional properties of its encoding protein. E.g. DNA itself can be detected by plaque or colony nucleic acid hybridization to labeled probes (Benton, W. and Davis. R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. and Eogness, D., 1975, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 72:3961). Alternatively, the presence of the CR1 gene can be detected by analyzes based on the properties of the expressed product. E.g. cDNA clones, or DNA clones that hybrid-select correct mRNAs can be selected that produce a protein such as e.g. have similar or identical electrophoretic migration, isoelectric focusing behavior, proteolytic cleavage maps, C3b and/or C4b and/or immune complex binding activity, complement regulatory activity, effect on phagocytosis or immune stimulation, or antigenic properties known to CR1. By using an antibody against CR1, the CR1 protein can be identified by binding the labeled antibody to putative CR1-synthesizing clones, in an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)-type procedure.

I spesifikke utførelsesformer muliggjør transformasjon av vertsceller med rekombinante DNA molekyler som inkorporerer det isolerte CR1 genet, cDNA, eller syntetisert DNA sekvens dannelsen av multiple kopier av genet. Genet kan dermed bli oppnådd i store mengder ved dyrking av transformanter, isolering av rekombinante DNA molekyler fra transformantene og, når nødvendig, oppnåelse av det innskutte genet fra isolert rekombinant DNA. In specific embodiments, transformation of host cells with recombinant DNA molecules incorporating the isolated CR1 gene, cDNA, or synthesized DNA sequence enables the generation of multiple copies of the gene. The gene can thus be obtained in large quantities by cultivating transformants, isolating recombinant DNA molecules from the transformants and, when necessary, obtaining the inserted gene from isolated recombinant DNA.

I en spesiell utførelsesform kan CR1 cDNA kloner i en CDM8 vektor bli transfektert inn i COS (apenyre) celler for ekspressjon i stor skala under kontroll av cytomegaloviruspromoter (se seksjon 8, nedenfor). In a particular embodiment, CR1 cDNA clones in a CDM8 vector can be transfected into COS (monkey kidney) cells for large-scale expression under the control of the cytomegalovirus promoter (see Section 8, below).

Dersom målet er å sette genet inn i virusekspressjonsvektorer så som vaccinia virus eller adenovirus, kan rekombinant DNA molekyl som inkorporerer CR1 genet bli modifisert slik at genet er flankert av virussekvenser som muliggjør genetisk rekombinasjon i celler infisert med viruset slik at genet kan bli satt inn i det virale genomet. If the goal is to insert the gene into viral expression vectors such as vaccinia virus or adenovirus, the recombinant DNA molecule incorporating the CR1 gene can be modified so that the gene is flanked by viral sequences that enable genetic recombination in cells infected with the virus so that the gene can be inserted into the viral genome.

Etter at CR1 DNA-inneholdende klon er blitt identifisert, dyrket og høstet, kan dets DNA innskudd bli karakterisert som beskrevet i seksjon 5.4.1, nedenfor. After the CR1 DNA-containing clone has been identified, cultured and harvested, its DNA insert can be characterized as described in Section 5.4.1, below.

Når den genetiske strukturen til CR1 genet er kjent er det mulig å manipulere strukturen for optimal anvendelse i foreliggende oppfinnelse. F.eks. kan promoter DNA bli ligert 5' for CR1 kodende sekvens, i tillegg til eller erstatning av det native promoteren for å tilveiebringe øket ekspressjon av proteinet. Ekspressjonsvektorer som uttrykker CR1 delesjonsmutanter kan også bli dannet, for å tilveiebringe ekspressjon av definerte fragmenter av CR1 sekvensen (se eksempelseksjonene, nedenfor). I en spesiell utførelsesform kan delesjonsmutanter bli konstruert som koder for fragmenter av CR1 proteinet som utviser ønsket C3b og/eller C4b bindingsaktivitet (se seksjon 9, nedenfor), f.eks. LHR-A for binding av C4b, eller LHR-C for binding av C3b. I en foretrukket utførelsesform kan en ekspressjonsvektor som koder for et CR1 molekyl med en deles jon av transmembranregionen bli anvendt for å fremstille et oppløselig CR1 molekyl (se eksempelseksjonene 11-14, nedenfor). Mange manipulasjoner er mulig og er innenfor rammen av foreliggende oppf innelse. When the genetic structure of the CR1 gene is known, it is possible to manipulate the structure for optimal use in the present invention. E.g. promoter DNA can be ligated 5' to the CR1 coding sequence, in addition to or replacing the native promoter to provide increased expression of the protein. Expression vectors expressing CR1 deletion mutants can also be generated to provide expression of defined fragments of the CR1 sequence (see the examples sections, below). In a particular embodiment, deletion mutants can be constructed encoding fragments of the CR1 protein that exhibit the desired C3b and/or C4b binding activity (see section 9, below), e.g. LHR-A for binding C4b, or LHR-C for binding C3b. In a preferred embodiment, an expression vector encoding a CR1 molecule with a portion of the transmembrane region can be used to produce a soluble CR1 molecule (see Example Sections 11-14, below). Many manipulations are possible and are within the scope of the present invention.

5.2. Ekspressjon av det klonede CR1 genet 5.2. Expression of the cloned CR1 gene

Nukleotidsekvensen kodende for CR1 proteinet (fig. 1) eller en del derav, kan bli skutt inn i en hensiktsmessig ekspressjonsvektor, dvs. en vektor som inneholder de nødvendige elementene for transkripsjon og translasjon av den innskutte protein-kodende sekvensen. Nødvendige transkripsjonene og translasjonene signaler kan også bli tilført fra nativt CR1 gen og/eller dets flankerende regioner. Forskjellige vert-vektorsystemer kan bli anvendt for å uttrykke protein-kodende sekvens. Disse omfatter, men er ikke begrenset til pattedyrcellesystemer infisert med virus (f.eks. vaccinia virus, adenovirus, osv.); insektcellesystemer infisert med virus (f.eks. baculovirus); mikroorganismer så som gjær inneholdende gjærvektorer, eller bakterier transformert med bakteriofag DNA, plasmid DNA eller kosmid DNA. Ekspressjons-elementene til disse vektorene varierer i styrke og spesifi-sitet. Avhengig av vert-vektorsystemet som blir anvendt kan hvilke som helst av et antall egnede transkripsjons- og translasjonselementer bli anvendt. F.eks. ved kloning i pattedyrcellesystemer kan promotere isolert fra genomet til pattedyrceller eller fra virus som vokser i disse cellene (f.eks., adenovirus, simianvirus 40, cytomegalovirus) bli anvendt. Promotere produert ved rekombinant DNA eller syntetiske teknikker kan også bli anvendt for å tilveiebringe transkripsjon av innskutte sekvenser. The nucleotide sequence coding for the CR1 protein (Fig. 1) or a part thereof, can be inserted into a suitable expression vector, i.e. a vector containing the necessary elements for transcription and translation of the inserted protein-coding sequence. The necessary transcription and translation signals can also be supplied from the native CR1 gene and/or its flanking regions. Different host-vector systems can be used to express the protein-coding sequence. These include, but are not limited to, mammalian cell systems infected with viruses (eg, vaccinia virus, adenovirus, etc.); insect cell systems infected with viruses (eg, baculovirus); microorganisms such as yeast containing yeast vectors, or bacteria transformed with bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA. The expression elements of these vectors vary in strength and specificity. Depending on the host vector system being used, any of a number of suitable transcription and translation elements may be used. E.g. when cloning in mammalian cell systems, promoters isolated from the genome of mammalian cells or from viruses growing in these cells (eg, adenovirus, simian virus 40, cytomegalovirus) may be used. Promoters produced by recombinant DNA or synthetic techniques can also be used to provide transcription of inserted sequences.

Spesifikke initieringssignaler er også nødvendig for effektiv translasjon av innskutte proteinkodende sekvenser. Disse signalene inkluderer ATG initieringskodon og ved siden av liggende sekvenser. I tilfeller hvor hele CR1 genet inkludert dets eget initieringskodon og ved siden av liggende sekvenser blir skutt inn i hensiktsmessige ekspressjonsvektorer er det ikke nødvendig med ytterligere translasjonskontrollsignaler. I de tilfellene hvor bare en del av CR1 kodende sekvensen blir skutt inn må eksogene translasjonskontrollsignaler, inkludert ATG initieringskodon, bli tilveiebragt. Initie-ringskodonet må derfor være i fase med leserammen til proteinkodende sekvenser for å forsikre translasjon av hele innskuddet. Disse eksogene translasjonskontrollsignalene og initeringskodonene kan ha forskjellige opprinnelser, både naturlige og syntetiske. Specific initiation signals are also required for efficient translation of inserted protein-coding sequences. These signals include the ATG initiation codon and flanking sequences. In cases where the entire CR1 gene including its own initiation codon and adjacent sequences are inserted into suitable expression vectors, no further translational control signals are required. In those cases where only part of the CR1 coding sequence is inserted, exogenous translational control signals, including the ATG initiation codon, must be provided. The initiation codon must therefore be in phase with the reading frame of protein-coding sequences to ensure translation of the entire insert. These exogenous translational control signals and initiation codons can have different origins, both natural and synthetic.

Hvilke som helst av fremgangsmåtene tidligere beskrevet for innskudd av DNA fragmenter inn i en vektor kan bli anvendt for å konstruere ekspressjonsvektor inneholdende et chimerisk gen bestående av hensiktsmessige transkripsjonelle/transla-sjonelle kontrollsignaler og proteinkodende sekvenser. Disse fremgangsmåtene kan omfatte in vitro rekombinant DNA og syntetiske teknikker og in vivo rekombinasjoner (genetisk rekombinasjon). Any of the methods previously described for inserting DNA fragments into a vector can be used to construct an expression vector containing a chimeric gene consisting of appropriate transcriptional/translational control signals and protein coding sequences. These methods may include in vitro recombinant DNA and synthetic techniques and in vivo recombinations (genetic recombination).

Et oppløselig CR1 molekyl bli uttrykt. Et slikt oppløselig molekyl kan bli produsert ved anvendelse av rekombinante DNA teknikker for å deletere DNA sekvenser kodende for CR1 transmembranregion (se seksjonene 11-14, nedenfor). Som demonstrert nedenfor er evnen til å uttrykke et oppløselige CR1 molekyl ikke begrenset til en enkelt genetisk modifikasjon av CR1 nukleinsyresekvensen, dersom nukleinsyresekvensen kodende for en vesentlig del av CR1 transmembranregionen blir deletert, kan oppløselige CR1 konstruksjoner bli oppnådd. A soluble CR1 molecule be expressed. Such a soluble molecule can be produced using recombinant DNA techniques to delete DNA sequences encoding the CR1 transmembrane region (see Sections 11-14, below). As demonstrated below, the ability to express a soluble CR1 molecule is not limited to a single genetic modification of the CR1 nucleic acid sequence, if the nucleic acid sequence encoding a substantial part of the CR1 transmembrane region is deleted, soluble CR1 constructs can be obtained.

Ekspressjonsvektorer inneholdende CR1 innskudd kan bli identifisert ved tre generelle tilnærmelser: (a) DNA-DNA hybridisering, (b) tilstedeværelse eller fravær av "markør" genfunksjoner og (c) ekspressjon av innskutte sekvenser. I den første tilnærmelsen kan tilstedeværelse av et fremmed geninnskudd i en ekspressjonsvektor bli påvist ved DNA-DNA hybridisering ved anvendelse av prober omfattende sekvenser som er homologe med det innskutte CR1 genet. I den andre tilnærmelsen kan rekombinant vektor/vertssystem bli identifisert og selektert basert på tilstedeværelse eller fravær av visse "markør" genfunksjoner (f.eks. tymidinkinaseaktivitet, resistens overfor antibiotika, transformasjonfenotype, okklusjonslegemedannelse i baculovirus osv.) forårsaket av innskudd av fremmede gener inn i vektoren. F.eks., dersom CR1 genet blir skutt inn i markørgensekvensen til vektoren kan rekombinanter inneholdende CR1 innskudd bli identifisert ved fravær av markørgenfunksjon. I den tredje tilnærmelsen kan rekombinante ekspressjonsvektorer bli identifisert ved analysering av det fremmede genproduktet uttrykt av rekombinanten. Slike analyser kan være basert på fysiske, immunologiske eller funksjonelle egenskaper til genproduktet. Expression vectors containing CR1 inserts can be identified by three general approaches: (a) DNA-DNA hybridization, (b) presence or absence of "marker" gene functions, and (c) expression of inserted sequences. In the first approach, the presence of a foreign gene insertion in an expression vector can be detected by DNA-DNA hybridization using probes comprising sequences homologous to the inserted CR1 gene. In the second approach, the recombinant vector/host system can be identified and selected based on the presence or absence of certain "marker" gene functions (eg, thymidine kinase activity, resistance to antibiotics, transformation phenotype, occlusion body formation in baculoviruses, etc.) caused by the insertion of foreign genes into in the vector. For example, if the CR1 gene is inserted into the marker gene sequence of the vector, recombinants containing the CR1 insert can be identified in the absence of marker gene function. In the third approach, recombinant expression vectors can be identified by analyzing the foreign gene product expressed by the recombinant. Such analyzes can be based on physical, immunological or functional properties of the gene product.

Når et bestemt rekombinant DNA molekyl er identifisert og isolert kan flere fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet bli anvendt for å propagere det. Når et egnet vertssystem og vekstbetingelser er etablert, kan rekombinante ekspressjonsvektorer bli propagert og preparert i mengder. When a specific recombinant DNA molecule has been identified and isolated, several methods known in the field can be used to propagate it. Once a suitable host system and growth conditions are established, recombinant expression vectors can be propagated and prepared in quantities.

I en spesiell utførelsesform angitt i eksemplene i foreliggende oppfinnelse kan CDM8 vektorer med et CR1 cDNA innskudd bli transfektert inn i COS celler der CR1 cDNA innskuddet blir uttrykt for å produsere CR1 protein. I andre spesielle utførelsesformer angitt i eksempelseksjonene nedenfor, kan CDM8 vektorer med et CR1 cDNA innskudd tilsvarende en del av CR1 kodende regionene bli transfektert inn i COS celler, hvor CR1 eller fragmentet blir uttrykt. I et ytterligere eksempel angitt nedenfor kan forkortede, oppløselige CR1 molekyler bli uttrykt i pattedyrceller ved anvendelse av ekspressjonsvektorer så som pTCS vektorer beskrevet i seksjon 11.3.1. Som tidligere forklart omfatter ekspressjonsvektorene som kan bli anvendt, men er ikke begrenset til, følgende vektorer og derivater derav: humane eller dyrevirus så som vacciniavirus eller adenovirus, insektviruser så så baculovirus, gjærvektorer, bakteriofagvektorer (f.eks. lambda), og plasmid og kosmid DNA vektorer, for å nevne noen. In a particular embodiment indicated in the examples in the present invention, CDM8 vectors with a CR1 cDNA insert can be transfected into COS cells where the CR1 cDNA insert is expressed to produce CR1 protein. In other particular embodiments set forth in the example sections below, CDM8 vectors with a CR1 cDNA insert corresponding to a portion of the CR1 coding regions can be transfected into COS cells, where CR1 or its fragment is expressed. In a further example set forth below, shortened, soluble CR1 molecules can be expressed in mammalian cells using expression vectors such as the pTCS vectors described in section 11.3.1. As previously explained, the expression vectors that may be used include, but are not limited to, the following vectors and derivatives thereof: human or animal viruses such as vaccinia virus or adenovirus, insect viruses such as baculovirus, yeast vectors, bacteriophage vectors (eg lambda), and plasmid and cosmid DNA vectors, to name a few.

I tillegg, kan en vertscellestamme bli valgt som modulerer ekspressjonen av innskutte sekvenser, eller modifiserer og prosesserer det chimeriske genproduktet på en ønsket måte. Ekspressjon fra visse promotere kan bli forhøyet i nærvær av visse indusere, og ekspressjonen av genetisk omkonstruert CR1 proteinet kan bli kontrollert. Forskjellige vertsceller har karakteristiske og spesifikke mekanismer for translasjonen og etter-translasjonell prosessering og modifikasjon av proteiner. Hensiktsmessige cellelinjer eller vertssystemer kan bli valgt for å forsikre ønsket modikasjon og prosessering av uttrykt heterologt protein. I en utførelsesform kan f.eks. ekspressjon i et bakterielt system bli anvendt for å produsere et uglykosylert CR1 protein med den utledede aminosyresekvensen i fig. 1. Ekspressjon i gjær vil produsere et glykosylert produkt. I en annen utførelsesform kan pattedyr COS celler bli anvendt for forsikre "nativ" glykosylering av heterologt CR1 protein. Forskjellige vektor/vertsekspressjonssystemer kan videre tilveiebringe prosesseringsreaksjoner så som proteolyttiske spaltninger i forskjellige grader. Mange slike forskjellige prosesserte CR1 proteiner kan bli produsert og er innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse. In addition, a host cell strain can be selected that modulates the expression of inserted sequences, or modifies and processes the chimeric gene product in a desired manner. Expression from certain promoters can be elevated in the presence of certain inducers, and the expression of the genetically engineered CR1 protein can be controlled. Different host cells have characteristic and specific mechanisms for the translation and post-translational processing and modification of proteins. Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the desired modification and processing of expressed heterologous protein. In one embodiment, e.g. expression in a bacterial system be used to produce an unglycosylated CR1 protein with the deduced amino acid sequence of fig. 1. Expression in yeast will produce a glycosylated product. In another embodiment, mammalian COS cells can be used to ensure "native" glycosylation of heterologous CR1 protein. Different vector/host expression systems can further provide processing reactions such as proteolytic cleavages to different degrees. Many such different processed CR1 proteins can be produced and are within the scope of the present invention.

Storskala produksjon av oppløselige CR1 molekyler kan bli utført som beskrevet nedenfor i seksjon 12.1 et seq. Large-scale production of soluble CR1 molecules can be carried out as described below in section 12.1 et seq.

5.3. Identifikasjon og rensing av uttrykt genprodukt 5.3. Identification and purification of expressed gene product

Når en rekombinant som uttrykker CR1 genet er identifisert bør genproduktet bli analysert. Dette kan bli oppnådd ved analyser basert på fysiske, immunologiske eller funksjonelle egenskaper til produktet. When a recombinant expressing the CR1 gene has been identified, the gene product should be analyzed. This can be achieved by analyzes based on physical, immunological or functional properties of the product.

CR1 proteinene kan bli isolert og renset ved standardmetoder omfattende kromatografi (f.eks. ionebytte-, affinitets- og størrelseskolonnekromatografi, høytrykks væskekromatografi ), sentrifugering, dif f erensialoppløselighet eller ved annen standard teknikk for rensing av proteiner. The CR1 proteins can be isolated and purified by standard methods including chromatography (e.g. ion exchange, affinity and size column chromatography, high pressure liquid chromatography), centrifugation, differential solubility or by other standard techniques for purification of proteins.

Store mengder oppløselig CR1 kan bli renset ved prosedyrer omfattende HPLC (se seksjon 12.2 et seq.). Som beskrevet nedenfor,kan storskala produksjon av renset av CR1 bli oppnådd ved anvendelse av et ekspress]onssystem som produserer oppløselig CR1 som utgangsmateriale og som dermed eliminerer nødvendigheten av oppløsing av membran-bundet CR1 med detergenter. Reduksjon av føtalt kalveserumkonsentrasjoner i bioreaktorkulturer og/eller anvendelse av alternative kulturmedier i disse kulturene eliminerer nødven-digheten av å fjerne høye konsentrasjoner av ytre proteiner fra oppløselig CRl-inneholdende utgangsmaterialet i løpet av påfølgende rensing. Enten kation HPLC eller en kombinasjon av kation HPLC etterfulgt av anionbytte HPLC kan bli anvendt for rensing i dette foretrukne aspektet. Vesentlig ren oppløselig CR1 i høyt utbytte kan dermed bli oppnådd i bare et eller to trinn. Large amounts of soluble CR1 can be purified by procedures including HPLC (see Section 12.2 et seq.). As described below, large-scale production of purified CR1 can be achieved using an expression system that produces soluble CR1 as starting material and thus eliminates the necessity of solubilizing membrane-bound CR1 with detergents. Reduction of fetal calf serum concentrations in bioreactor cultures and/or use of alternative culture media in these cultures eliminates the need to remove high concentrations of extrinsic proteins from the soluble CR1-containing starting material during subsequent purification. Either cation HPLC or a combination of cation HPLC followed by anion exchange HPLC can be used for purification in this preferred aspect. Substantially pure soluble CR1 in high yield can thus be obtained in only one or two steps.

Alternativt, når et CR1 protein produsert av en rekombinant er identifisert, kan aminosyresekvensen til proteinet bli avledet fra nukleotidsekvensen til det chimeriske genet innbefattet i rekombinanten. Som et resultat kan proteinet bli syntetisert ved standard kjemiske metoder kjent innenfor fagområdet (f.eks. se Hunkapiller, M. , et al., 1984, Nature 310:105-111). Alternatively, when a CR1 protein produced by a recombinant is identified, the amino acid sequence of the protein can be derived from the nucleotide sequence of the chimeric gene contained in the recombinant. As a result, the protein can be synthesized by standard chemical methods known in the art (eg, see Hunkapiller, M., et al., 1984, Nature 310:105-111).

I bestemte utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse omfatter slike CR1 proteiner, enten de blir fremstilt ved rekombinante DNA teknikker eller ved kjemiske syntetiske fremgangsmåter, inkluderer, men er ikke begrenset til de som inneholder, som en primær aminosyresekvens, hele eller del av aminosyresekvensen vesentlig som angitt i fig. 1, inkludert endrede sekvenser der funksjonelt ekvivalente aminosyrerester er substituert for rester innenfor sekvensen som resulterer i en stille forandring. F.eks. kan en eller flere aminosyrerester innenfor sekvensen bli substituert med en annen aminosyre med lignende polaritet som virker som en funksjonell ekvivalent, resulterende i en stille forandring. Ikke-konservative substitusjoner kan også resultere i funksjonelt ekvivalente proteiner. In certain embodiments of the present invention, such CR1 proteins, whether produced by recombinant DNA techniques or by chemical synthetic methods, include, but are not limited to, those containing, as a primary amino acid sequence, all or part of the amino acid sequence substantially as set forth in fig. 1, including altered sequences where functionally equivalent amino acid residues are substituted for residues within the sequence resulting in a silent change. E.g. one or more amino acid residues within the sequence may be substituted with another amino acid of similar polarity that acts as a functional equivalent, resulting in a silent change. Non-conservative substitutions can also result in functionally equivalent proteins.

I en utførelsesform kan substitutter for en aminosyre innenfor CE1 sekvensen bli selektert fra andre medlemmer av klassen som aminosyren hører til. Upolare (hydrofobiske) aminosyre omfatter alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. Polare nøytrale aminosyrer omfatter glycin, serin, treonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. Positivt ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin. Negativt ladede (sure) aminosyrer omfatter asparaginsyre og glutaminsyre. Også innbefattet innenfor rammen av oppfinnelsen er CR1 proteiner som blir differensielt modifisert i løpet av eller etter translasjon, f.eks. glykosylering, proteolyttisk spaltning osv. In one embodiment, substitutes for an amino acid within the CE1 sequence can be selected from other members of the class to which the amino acid belongs. Nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. Also included within the scope of the invention are CR1 proteins that are differentially modified during or after translation, e.g. glycosylation, proteolytic cleavage, etc.

I et eksempel ifølge oppfinnelsen angitt nedenfor bl klonet rekombinant CR1 uttrykt av transfekterte celler vist å ikke kunne sjeldnes fra F allotypen til erytrocytter ved SDS-PAGE (fig. 14), som har evne til å formidle binding av saueerytrocytter som bærer enten C4b eller C3b, og som kan reprodusere ligandspesifisiteten til CR1 (fig. 13), og utvise faktor I ko-faktoraktivitet for spaltning av alfapolypeptidet til C3(ma) (fig. 15). In an example according to the invention set forth below, cloned recombinant CR1 expressed by transfected cells was shown to be indistinguishable from the F allotype of erythrocytes by SDS-PAGE (Fig. 14), which has the ability to mediate binding of sheep erythrocytes carrying either C4b or C3b , and which can reproduce the ligand specificity of CR1 (Fig. 13), and exhibit factor I co-factor activity for cleavage of the alpha polypeptide to C3(ma) (Fig. 15).

5.4. Struktur av CR1 genet og proteinet 5.4. Structure of the CR1 gene and protein

Struktur av CR1 genet og proteinet kan bli analysert ved forskjellige kjente fremgangsmåter innenfor fagområdet, inkludert, men ikke begrenset til de som er beskrevet nedenfor. Structure of the CR1 gene and protein can be analyzed by various methods known in the art, including but not limited to those described below.

5.4.1. Genetisk analyse 5.4.1. Genetic analysis

Klonet DNA eller cDNA tilsvarende CR1 genet kan bli analysert ved fremgangsmåter inkludert, men ikke grenset til Southern hybridisering (Southern, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517), Northern hybridisering (se f.eks., Freeman et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:4094-4098), restriksjonsendonukleasekartlegging (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), og DNA sekvensanalyse. Stringentheten til hybridiseringsbetingelsene for både Southern og Northern hybridisering kan bli manipulert for å forsikre deteksjon av nukleinsyrer med ønsket grad av slektskap til den spesifikke CR1 proben som bli anvendt. F.eks. kan hybridisering under lave stringhetbetingeler med en probe inneholdende CR1 gensekvenser kodende for LHR-B og LHR-C bli anvendt for å påvise CR2 nukleinsyresekvenser. Cloned DNA or cDNA corresponding to the CR1 gene can be analyzed by methods including but not limited to Southern hybridization (Southern, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517), Northern hybridization (see, e.g., Freeman et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:4094-4098), restriction endonuclease mapping (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) , and DNA sequence analysis. The stringency of the hybridization conditions for both Southern and Northern hybridization can be manipulated to ensure detection of nucleic acids with the desired degree of relatedness to the specific CR1 probe being used. E.g. hybridization under low stringency conditions with a probe containing CR1 gene sequences encoding LHR-B and LHR-C can be used to detect CR2 nucleic acid sequences.

Restriksjonsendonukleasekartlegging kan bli anvendt for å i grove trekk bestemme den genetiske strukturen til CR1 genet. Spaltning med restriksjonsenzymer kan bli anvendt for å oppnå restriksjonskartet vist i fig. 2, nedenfor. Restriksjonskart avledet ved restriksjonsendonukleasespaltning kan bekreftes ved DNA sekvensanalyse. Restriction endonuclease mapping can be used to roughly determine the genetic structure of the CR1 gene. Cleavage with restriction enzymes can be used to obtain the restriction map shown in fig. 2, below. Restriction maps derived by restriction endonuclease digestion can be confirmed by DNA sequence analysis.

DNA sekvensanalyse kan bli utført ved hvilke som helst teknikker kjent innenfor fagområdet, inkludert, men er ikke begrenset til fremgangsmåten til Maxam og Gilbert (1980, Meth. Enzymol. 65:499-560), Sanger dideoksymetoden (Sanger, F., et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463), eller anvendelse av en automatisert DNA sekvenator (f.eks. Applied Biosystems, Foster City, CA.). cDNA sekvensen til CR1 genet omfatter sekvensen vesentlig som angitt i fig. 1 og beskrevet i seksjonene 6 og 7, nedenfor. DNA sequence analysis can be performed by any techniques known in the art, including but not limited to the method of Maxam and Gilbert (1980, Meth. Enzymol. 65:499-560), the Sanger dideoxy method (Sanger, F., et al ., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463), or using an automated DNA sequencer (eg, Applied Biosystems, Foster City, CA.). The cDNA sequence of the CR1 gene includes the sequence substantially as indicated in fig. 1 and described in sections 6 and 7, below.

5.4.2. Proteinanalyse 5.4.2. Protein analysis

Aminosyresekvens til CR1 proteinet kan bli avledet ved deduksjon fra DNA sekvensen, eller alternativt, ved direkte sekvensering av proteinet, f.eks., med en automatisert aminosyresekvenator. Aminosyresekvensen til et representativt CR1 protein omfatter sekvensen vesentlig som angitt i fig. 1, og beskrevet i seksjon 6, nedenfor. Som beskrevet nedenfor har hele kodende sekvensen til F allotype CR1 blitt klonet og, etter spaltning av signalpeptidet til 41 aminosyrene inneholdt den modne reseptoren 1998 aminosyrer inkludert en ekstracellulære domene på 1930 rester som danner 30 SCR, 28 som er organisert til LHR-A, -B, -C og -D, (fig. 10), en enkelt membrandekkende domene på 25 aminosyrer og en relativt kort cytoplasmadomene på 43 aminosyrer. The amino acid sequence of the CR1 protein can be derived by deduction from the DNA sequence, or alternatively, by direct sequencing of the protein, e.g., with an automated amino acid sequencer. The amino acid sequence of a representative CR1 protein comprises the sequence substantially as indicated in fig. 1, and described in section 6, below. As described below, the entire coding sequence of the F allotype CR1 has been cloned and, after cleavage of the signal peptide into the 41 amino acids, the mature receptor contained 1998 amino acids including an extracellular domain of 1930 residues forming 30 SCR, 28 of which are organized into LHR-A, - B, -C and -D, (Fig. 10), a single membrane-spanning domain of 25 amino acids and a relatively short cytoplasmic domain of 43 amino acids.

Blant C3/C4-bindingsproteinene som inneholder multiple SCR, er CR1 unik ved at det har grupper av SCR organisert til LHR. Sammenligning av 4 LHR av CR1 viser at hver enkelt er en sammensetning av fire typer SCR: typene a, b, c og d (fig. Among the C3/C4 binding proteins that contain multiple SCRs, CR1 is unique in that it has clusters of SCRs organized into LHRs. Comparison of 4 LHR of CR1 shows that each one is a composition of four types of SCR: types a, b, c and d (Fig.

19). F.eks. er sekvensene til SCR-1 og -2 til LHR-A bare 62$, 62$ og 57$ identiske med første to SCR til LHR-B, -C og -D, respektivt. SCR-3 t.o.m. SCR-7 er forskjellige fra tilsvarende SCR til LHR-B ved bare en enkelt posisjon, og SCR-3 og -4 er forskjellig fra de til LHR-C ved bare tre posisjoner (fig. 10). Noen av type "a" SCR av LHR-A er dermed også tilstede i LHR-B og -C. Første to SCR til LHR-B, som er forskjellige fra de til LHR-A, er 99$ identiske med tilsvarende SCR til LHR-C, slik at LHR-B og -C deler type "b" SCR i disse posisjonene. Femte, sjette og syvende SCR til LHR-C er bare 77$ identisk med type "a" SCR i LHR-A og -B i disse posisjonene, og blir betraktet som type "c" SCR. Første t.o.m. fjerde SCR til LHR-D er relativt unik og er type "d", mens femte t.o.m. syvende SCR er omtrentlig 93$ identisk med "c" type funnet i LHR-C. 19). E.g. the sequences of SCR-1 and -2 of LHR-A are only 62$, 62$ and 57$ identical to the first two SCRs of LHR-B, -C and -D, respectively. SCR-3 up to and including SCR-7 differs from the corresponding SCR of LHR-B by only a single position, and SCR-3 and -4 differ from those of LHR-C by only three positions (Fig. 10). Some of the type "a" SCRs of LHR-A are thus also present in LHR-B and -C. The first two SCRs of LHR-B, which are different from those of LHR-A, are 99$ identical to the corresponding SCRs of LHR-C, so that LHR-B and -C share type "b" SCRs in these positions. Fifth, sixth and seventh SCRs of LHR-C are only 77$ identical to type "a" SCRs in LHR-A and -B in these positions, and are considered type "c" SCRs. First to fourth SCR to LHR-D is relatively unique and is type "d", while fifth to seventh SCR is approximately 93$ identical to "c" type found in LHR-C.

CR1 proteinsekvensen kan videre bli karakterisert ved en hydrofilisitetsanalyse (Hopp. T. og V/oods, K. , 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 78:3824). En hydrofilisitetsprofil kan bli anvendt for å identifisere hydrofobe og hydrofile regioner av CR1 proteinet og tilsvarende regioner av gensekvensen som koder for slike regioner. En hydrofilisitetsprofil av COOH-terminus til CR1 proteinet er angitt i fig. 5. The CR1 protein sequence can further be characterized by a hydrophilicity assay (Hopp. T. and Woods, K., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 78:3824). A hydrophilicity profile can be used to identify hydrophobic and hydrophilic regions of the CR1 protein and corresponding regions of the gene sequence encoding such regions. A hydrophilicity profile of the COOH terminus of the CR1 protein is shown in fig. 5.

Sekundær strukturell analyse (Chou, P. og Fasman, G. , 1974, Biochemistry 13:222) kan også bli utført for å forutsi regioner av CR1 som opprettholder spesifikke sekundære strukturer. Secondary structural analysis (Chou, P. and Fasman, G., 1974, Biochemistry 13:222) can also be performed to predict regions of CR1 that maintain specific secondary structures.

Andre fremgangsmåter for strukturell analyse kan også bli anvendt. Disse omfatter, men er ikke begrenset til røntgen-krystallografi (Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13) og computermodellering (Fletterick, R. og Zoller, M. Other methods of structural analysis can also be used. These include but are not limited to X-ray crystallography (Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13) and computer modeling (Fletterick, R. and Zoller, M.

(eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

5.5. CRl- relaterte derivater, analoger og peptider 5.5. CR1-related derivatives, analogues and peptides

Produksjon og anvendelse av derivater, analoger og peptider beslektet med CR1 blir også betraktet, og hører inn under rammen av foreliggende oppfinnelse. Slike derivater, analoger eller peptider som har ønsket immunogenisitet eller antigeni-sitet kan bli anvendt, f.eks., i immunoanalyser, for immunisering, terapeutisk osv. Slike molekyler som beholder, eller alternativt inhiberer, en ønsket CR1 egenskap, f.eks. binding av C3b eller C4b, regulering av komplementaktivitet eller fremming av immunstimulering eller fagocyttose osv., kan bli anvendt som indusere eller inhibitorer, respektivt, av slik egenskap. The production and use of derivatives, analogues and peptides related to CR1 is also considered, and falls within the scope of the present invention. Such derivatives, analogues or peptides having the desired immunogenicity or antigenicity can be used, e.g., in immunoassays, for immunization, therapeutically, etc. Such molecules which retain, or alternatively inhibit, a desired CR1 property, e.g. binding of C3b or C4b, regulation of complement activity or promotion of immune stimulation or phagocytosis, etc., can be used as inducers or inhibitors, respectively, of such property.

CRl-relaterte derivater, analoger og peptider ifølge oppfinnelsen kan bli produsert ved forskjellige fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet. Manipulasjoner som resulterer i deres produksjon kan oppstå på gen eller proteinnivå. F.eks., klonet CR1 gen kan bli modifisert ved hvilke som helst av de mange strategiene kjent innenfor fagområdet (Maniatis, T. , 1982, Molcular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). CR1 sekvensen kan bli spaltet ved hensiktsmessige seter med restriksjonsendonuklease(er), etterfulgt av ytterligere enzymatisk modifikasjon om ønskelig, isolert og ligert in vitro (se seksjon 8, nedenfor). Ved fremstilling av genet kodende for et derivat, en analog eller et peptid beslektet med CR1, bør det forsikres om at det modifiserte genet forblir innenfor samme translasjonene leseramme som CR1, uavbrutt av translasjonene stoppsignaler, i genregionen hvor ønsket CRl-spesifikk aktivitet er kodet. CR1-related derivatives, analogues and peptides according to the invention can be produced by various methods known in the field. Manipulations that result in their production can occur at the gene or protein level. For example, the cloned CR1 gene can be modified by any of the many strategies known in the art (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). The CR1 sequence can be cleaved at appropriate sites with restriction endonuclease(s), followed by further enzymatic modification if desired, isolated and ligated in vitro (see Section 8, below). When producing the gene coding for a derivative, an analogue or a peptide related to CR1, it should be ensured that the modified gene remains within the same translational reading frame as CR1, uninterrupted by the translational stop signals, in the gene region where the desired CR1-specific activity is encoded.

CR1 genet kan i tillegg bli mutert in vitro eller in vivo, for å danne og/eller ødelegge translasjons-, initierings-og/eller termineringssekvenser, eller å danne variasjoner i kodende regioner og/eller danne nye restriksjonsendonuklease-seter eller ødelegge allerede eksisterende, for å lette ytterligere in vitro modifikasjon. En hvilken som helst teknikk for mutagenese kjent innenfor fagområdet kan bli anvendt, inkludert, men ikke begrenset til, in vitro sete-rettet mutagenese (Hutchingson, C, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), anvendelse av TAB linkere (Pharmacia) osv. The CR1 gene can additionally be mutated in vitro or in vivo, to create and/or destroy translation, initiation and/or termination sequences, or to create variations in coding regions and/or to create new restriction endonuclease sites or to destroy already existing ones, to facilitate further in vitro modification. Any technique of mutagenesis known in the art may be used, including, but not limited to, in vitro site-directed mutagenesis (Hutchingson, C, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), using of TAB linkers (Pharmacia) etc.

Manipulasjoner av CR1 sekvensen kan også bli utført på proteinnivå. Hvilke som helst av mange kjemiske modifikasjoner kan bli utført ved kjente teknikker, inkludert, men ikke begrenset til spesifikk kjemisk spaltning ved cyanogen-bromid, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, NaBH4; acylering, formylering, oksidasjon, reduksjon; metabolsk syntese i nærvær av tunikamycin; osv. Manipulations of the CR1 sequence can also be performed at the protein level. Any of many chemical modifications may be performed by known techniques, including but not limited to specific chemical cleavage by cyanogen bromide, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, NaBH 4 ; acylation, formylation, oxidation, reduction; metabolic synthesis in the presence of tunicamycin; etc.

I tillegg kan analoger og peptider beslektet med CR1 bli syntetisert kjemisk. F.eks. kan et peptid korresponderende med en del av CR1 som formidler ønsket aktivitet (f.eks. C3b og/eller C4b binding, immunstimulering, komplementregulering osv.) bli syntetisert ved anvendelse av en peptidsyntesemas-kin. In addition, analogs and peptides related to CR1 can be synthesized chemically. E.g. a peptide corresponding to a part of CR1 that mediates the desired activity (eg C3b and/or C4b binding, immune stimulation, complement regulation, etc.) can be synthesized using a peptide synthesis machine.

5.6. Anvendelser av CR1 5.6. Applications of CR1

5.6.1. Analyser og diagnose 5.6.1. Analyzes and diagnosis

CR1 proteiner, analoger, derivater og undersekvenser derav, og anti-CRl antistoffer, kan anvendes i analyser og ved diagnostikk. Molekylene ifølge oppfinnelsen som demonstrerer den ønskede CR1 egenskapen eller funksjonen kan bli anvendt for å analysere slik egenskap eller funksjon. F.eks. kan CR1 proteiner eller fragmenter derav, som utviser binding av C3b og/eller C4b, i fri og/eller i komplekse former, bli anvendt i analyser for å måle mengden av slike forbindelser i en prøve, f.eks. en kroppsvæske til en pasient. CR1 proteins, analogues, derivatives and subsequences thereof, and anti-CR1 antibodies, can be used in analyzes and in diagnostics. The molecules according to the invention that demonstrate the desired CR1 property or function can be used to analyze such property or function. E.g. can CR1 proteins or fragments thereof, which show binding of C3b and/or C4b, in free and/or in complex forms, be used in analyzes to measure the amount of such compounds in a sample, e.g. a body fluid to a patient.

Full-lengde CR1 eller en CR1 delesjonsmutant uttrykt på celleoverflaten (f.eks., de som er beskrevet i seksjon 8, nedenfor) med evne til å binde C3b (f.eks., se tabell II, seksjon 9, nedenfor), iC3b eller C4b (f.eks. se tabell II) kan bli anvendt i analyser for å måle nivåene av henholdsvis C3b, iC3b eller C4b, i en prøve. I en annen utførelsesf orm kan et CR1 protein eller et fragment derav som er konstruert ved rekombinant DNA teknologi til å mangle en transmembran sekvens, og som dermed blir utskilt, bli anvendt. Full-length CR1 or a CR1 deletion mutant expressed on the cell surface (e.g., those described in Section 8, below) with the ability to bind C3b (e.g., see Table II, Section 9, below), iC3b or C4b (eg, see Table II) can be used in assays to measure the levels of C3b, iC3b or C4b, respectively, in a sample. In another embodiment, a CR1 protein or a fragment thereof which has been constructed by recombinant DNA technology to lack a transmembrane sequence, and which is thus secreted, can be used.

En slik måling av C3b og/eller C4b kan være pålitelig som en indikasjon på komplementaktivitet, og kan være nyttige ved diagnostikk av betennelsesforstyrrelser og immunforstyrrelser. Slike forstyrrelser omfatter, men er ikke begrenset til vevsskade forårsaket av brann- eller hjerteinfarkt-indusert trauma, voksen respiratorisk distressyndrom (sjokklunge), autoimmune forstyrrelser, så som leddgikt, systemisk lupus erythematosus, og andre sykdommer eller forstyrrelser omfattende uønskelige eller med uhensiktsmessig komplementaktivitet (se f.eks. Miescher,P.A. og Muller-Eberhard, H.J., eds., 1976, Text Book of Immunopathology, 2d Ed., Vols. I og II, Grune og Stratton, New York; Sandberg, A.L., 1981, i Cellular Functions in Immunity and Inflammation, Oppenheim, J.J. et al., eds., Elsevier/North Holland, New York, s. 373; Conrow, R.B., et al., 1980, J. Med. Chem. 23:242; Regal, J.F. og Pickering, R.H., 1983, Int. J. Immunopharmacol. 5:71; Jacobs, H.S., 1980, Arch. Pathol. Lab. Med. 104:617). Such a measurement of C3b and/or C4b can be reliable as an indication of complement activity, and can be useful in the diagnosis of inflammatory disorders and immune disorders. Such disorders include, but are not limited to, tissue damage caused by fire or heart attack-induced trauma, adult respiratory distress syndrome (shock lung), autoimmune disorders, such as arthritis, systemic lupus erythematosus, and other diseases or disorders involving undesirable or inappropriate complement activity ( see, e.g., Miescher, P. A. and Muller-Eberhard, H. J., eds., 1976, Text Book of Immunopathology, 2d Ed., Vols. I and II, Grune and Stratton, New York; Sandberg, A. L., 1981, in Cellular Functions in Immunity and Inflammation, Oppenheim, J.J. et al., eds., Elsevier/North Holland, New York, p 373; Conrow, R.B., et al., 1980, J. Med. Chem. 23:242; Regal, J.F. and Pickering, R.H., 1983, Int. J. Immunopharmacol. 5:71; Jacobs, H.S., 1980, Arch. Pathol. Lab. Med. 104:617).

CR1 proteinet og fragmenter derav inneholdende en epitope anvendes i analyser, inkludert, men ikke begrenset til immunoanalyser. Immunoanalysene som kan bli anvendt omfatter, men er ikke begrenset til konkurrerende og ikke-konkurrerende analysesystemer ved anvendelse av teknikker så som radioim-munoanalyser, ELISA (enzymbundet immunsorbentanalyse), "sandwich" immunoanalyser, presipitinreaksjon, geldiffu-sjonspresepitinreaksjoner, immun diffusjonsanalyser, agglutinasjonsanalyser, komplement-f ikseringsanalyser, immunoradiometriske analyser, fluorescensimmunoanalyser, protein A immunoanalyser og immunoelektroforeseanalyser, for å nevne noen. The CR1 protein and fragments thereof containing an epitope are used in analyses, including but not limited to immunoassays. The immunoassays that may be used include, but are not limited to, competitive and non-competitive assay systems using techniques such as radioimmunoassays, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), "sandwich" immunoassays, precipitin reactions, gel diffusion precipitin reactions, immune diffusion assays, agglutination assays, complement fixation assays, immunoradiometric assays, fluorescence immunoassays, protein A immunoassays and immunoelectrophoresis assays, to name a few.

CE1 gener og beslektede nukleinsyresekvenser og subsekvenser kan bli anvendt i hybridiseringsanalyser. Slike hybridiseringsanalyser kan bli anvendt for å registrere betennelses-reaksjoner eller immunreaksjoner assosiert med CE1 ekspressjon, for å diagnostisere visse sykdomstilstander assosiert med forandringer i CE1 ekspressjon, for å bestemme CE1 allotypen til en pasient, og for å detektere tilstedeværelse og/eller ekspressjon av CE1 genet og beslektede gener (f.eks. CE2 ). CE1 genes and related nucleic acid sequences and subsequences can be used in hybridization assays. Such hybridization assays can be used to detect inflammatory reactions or immune reactions associated with CE1 expression, to diagnose certain disease states associated with changes in CE1 expression, to determine the CE1 allotype of a patient, and to detect the presence and/or expression of CE1 gene and related genes (e.g. CE2 ).

5.6.2. Terapi 5.6.2. Therapy

CR1 proteinet og fragmenter, derivater og analoger derav kan være terapeutisk nyttige ved modulering av funksjoner formidlet av CR1. Slike funksjoner omfatter men er ikke begrenset til binding av C3b og/eller C4b, i frie eller i kompleksformer, fremming av fagocytose, komplementregulering, immunstimulering osv. Effektive doser av CR1 proteinene og beslektede molekyler har terapeutisk verdi i mange av sykdommene eller forstyrrelsene assosiert med slike funksjoner, så som immun- eller betennelsesforstyrrelser (f.eks., de som er beskrevet ovenfor i seksjon 5.6.1). F.eks. kan full-lengde CE1 eller fragmenter derav og beslektede molekyler som utviser ønsket aktivitet ha terapeutiske anvendelser ved inhibisjon av komplement ved deres evne til å virke som faktor I kofaktor, for fremming av irreversibel inaktivering av komplementkomponentene C3b eller C4b (Fearon, D.T., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867; lida, K. og Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153:1138), og/eller ved evnen til å inhibere alternative eller klassiske C3 eller C5 konvertasene. The CR1 protein and fragments, derivatives and analogues thereof may be therapeutically useful in modulating functions mediated by CR1. Such functions include but are not limited to binding of C3b and/or C4b, in free or complex forms, promotion of phagocytosis, complement regulation, immune stimulation, etc. Effective doses of the CR1 proteins and related molecules have therapeutic value in many of the diseases or disorders associated with such functions, such as immune or inflammatory disorders (eg, those described above in section 5.6.1). E.g. full-length CE1 or fragments thereof and related molecules exhibiting the desired activity may have therapeutic applications in the inhibition of complement by their ability to act as a factor I cofactor, to promote irreversible inactivation of the complement components C3b or C4b (Fearon, D.T., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867; lida, K. and Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153:1138), and/or by the ability to inhibit alternative or classical C3 or C5 the convertases.

I en spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen kan en ekspressjonsvektor bli konstruert slik at den koder for et CR1 molekyl som mangler transmembranregionen (f.eks., ved delesjon karboksy-terminal for arginin kodet av det mest C-terminale SCR), resulterende i produksjon av et oppløselig CR1 fragment. I en utførelsesform kan et slikt fragment beholde evnen til å binde C3b og/eller C4b, i frie eller i komplekse former. I en spesiell utførelsesform kan et oppløselig CR1 protein ikke lenger utvise faktor I kofaktoraktivitet. Oppløselig CR1 produkt kan bli administrert in vivo til en pasient slik at oppløselig CR1 effektivt kan konkurrere ut binding av C3b og/eller C4b til nativ celle-overflate CR1, som dermed blokkerer celle-overflate CR1 faktor I kofaktoraktivitet og øker komplementaktiviteten. In a specific embodiment of the invention, an expression vector can be constructed so that it encodes a CR1 molecule lacking the transmembrane region (eg, by deletion carboxy-terminal to the arginine encoded by the most C-terminal SCR), resulting in the production of a soluble CR1 fragment. In one embodiment, such a fragment may retain the ability to bind C3b and/or C4b, in free or in complex forms. In a particular embodiment, a soluble CR1 protein may no longer exhibit factor I cofactor activity. Soluble CR1 product can be administered in vivo to a patient so that soluble CR1 can effectively outcompete binding of C3b and/or C4b to native cell-surface CR1, which thus blocks cell-surface CR1 factor I cofactor activity and increases complement activity.

Etter at C3b er kovalent bundet til partiklene og oppløselige immunkomplekser har inaktivering av C3b ved proteolyttisk prosessering til iC3b og C3dg to biologiske konsekvenser: forhindring av omfattende aktivering av komplementsystemet via amplifikasjonsveien, og dannelse av ligander som kan engasjere reseptorer forskjellig fra CR1. iC3b fragmentet kan ikke binde faktor B slik at omdanning til denne tilstanden blokkerer ytterligere komplementaktivering via den alternative reaksjonsvei amplifikasjonsløkken. iC3b kan bli bundet av CR1 og CR3, de to komplementreseptorene som formidler fagocytose ved myeolomonocyttiske celler. Den primære biologiske konsekvensen av C3b til iC3b omdanning er opphør av komplementaktivering uten innvirkning med CR1- og CR3-formidlet fjerning av CR3-belagt kompleks. I kontrast til dette, danner den ytterligere omdanningen av iC3b til C3dg et fragment som bare reagerer med CR2 og ikke med CR1 og CR3. Denne tilstanden begrenser komplement-avhengig binding av C3dg-bærende kompleks til celletyper som uttrykker CR2, som inkluderer B lymfocytter, follikulære dentritiske celler og kanskje epiteliske celler i huden, og reduserer eller utelukker interaksjon med fagocyttiske celletyper. Den biologiske konsekvensen av dette endrede mønsteret for cellulær assosiasjon vil være målsøking for C3dg-bærende komplekser til celler involvert i den afferente fasen av immunresponsen i steden for til celler involvert i fjerning og degradering av partikler og komplekser. Derfor kan CR1 molekyler bli anvendt terapeutisk ikke bare for å påvirke klaringsprosessen, men også ved målsøking av komplekser til CR2-bærende celletyper som deltar i antigenpresentasjon og anti stoffproduksjon. After C3b is covalently bound to the particles and soluble immune complexes, inactivation of C3b by proteolytic processing to iC3b and C3dg has two biological consequences: prevention of extensive activation of the complement system via the amplification pathway, and formation of ligands that can engage receptors other than CR1. The iC3b fragment cannot bind factor B so that conversion to this state blocks further complement activation via the alternative pathway amplification loop. iC3b can be bound by CR1 and CR3, the two complement receptors that mediate phagocytosis by myelomonocytic cells. The primary biological consequence of C3b to iC3b conversion is cessation of complement activation without interference with CR1- and CR3-mediated clearance of CR3-coated complex. In contrast, the further conversion of iC3b to C3dg forms a fragment that only reacts with CR2 and not with CR1 and CR3. This condition limits complement-dependent binding of the C3dg-bearing complex to CR2-expressing cell types, which include B lymphocytes, follicular dendritic cells, and perhaps skin epithelial cells, and reduces or precludes interaction with phagocytic cell types. The biological consequence of this altered pattern of cellular association would be the targeting of C3dg-bearing complexes to cells involved in the afferent phase of the immune response rather than to cells involved in the removal and degradation of particles and complexes. Therefore, CR1 molecules can be used therapeutically not only to influence the clearance process, but also by targeting complexes to CR2-bearing cell types that participate in antigen presentation and antibody production.

Et CR1 protein eller et fragment derav som kan binde C3b eller C4b, og/eller beholder evnen til å inhibere alternative eller klassiske C3 eller C5 konvertaser, eller beholder faktor I kofaktoraktivitet, kan anvendes for å fremme komplementinaktivering. I en slik utførelsesform kan CR1 proteinet eller fragmentet være verdifullt ved behandling av forstyrrelser som omfatter uønsket eller uhensiktsmessig komplementaktivitet (f.eks., sjokklunge, vevsskade forårsaket av brann eller ischemiske hjertebetingelser, autoimmune forstyrrelser, betennelsesbetingelser osv.). A CR1 protein or a fragment thereof which can bind C3b or C4b, and/or retains the ability to inhibit alternative or classic C3 or C5 convertases, or retains factor I cofactor activity, can be used to promote complement inactivation. In such an embodiment, the CR1 protein or fragment may be valuable in the treatment of disorders involving unwanted or inappropriate complement activity (eg, shock lung, tissue damage caused by fire or ischemic heart conditions, autoimmune disorders, inflammatory conditions, etc.).

Eksempel seksjonen 11-14 nedenfor viser et oppløselig CR1 molekyl bli uttrykt som beholder en ønsket funksjonell aktivitet, som demonstrert, f.eks. ved evnen til å hemme klassisk komplement-formidlet hemolyse, klassisk C5a produksjon, klassisk C3a produksjon eller nøytrofil oksydativ utbrudd in vitro. I en bestemt utførelsesform kan et slikt oppløselig CR1 molekyl bli anvendt for å redusere betennelse og skadelige virkninger, eller å redusere hjerteinfarktsstør-relsen eller forhindre reperfusjonsskade osv. Slike CR1 molekyler som er nyttige for in vivo terapi kan bli undersøkt i forskjellige modellsystemer som er kjent innenfor fagområdet, inkludert, men ikke begrenset til reversert passiv Arthrus-reaksjon (se seksjon 14.1) og en rotte hjerteinfarkt-modell (se seksjon 14.3). Example sections 11-14 below show a soluble CR1 molecule being expressed that retains a desired functional activity, as demonstrated, e.g. by the ability to inhibit classical complement-mediated haemolysis, classical C5a production, classical C3a production or neutrophil oxidative burst in vitro. In a particular embodiment, such a soluble CR1 molecule may be used to reduce inflammation and deleterious effects, or to reduce myocardial infarct size or prevent reperfusion injury, etc. Such CR1 molecules useful for in vivo therapy may be investigated in various model systems known in the art. within the subject area, including but not limited to reversed passive Arthrus reaction (see section 14.1) and a rat myocardial infarction model (see section 14.3).

Et fragment av CR1, eller en analog eller derivat derav, som er vist å inhibere en ønsket CR1 egenskap eller funksjon, kan anvendes for å forhindre eller behandle sykdommer eller forstyrrelser assosiert med den funksjonen. A fragment of CR1, or an analog or derivative thereof, which is shown to inhibit a desired CR1 property or function, can be used to prevent or treat diseases or disorders associated with that function.

Forskjellige leveringssystemer er kjente og kan bli anvendt for å levere CR1 og beslektede molekyler, f.eks., inkapsling i liposomer, ekspressjon ved hematopoetiske stamcelleavkom i genterapi, osv. Andre fremgangsmåter for introduksjon omfatter, men er ikke begrenset til intradermale, intramusku-lære, intraperitoneale, intravenøse, subkutane, intranasale og orale veier. Various delivery systems are known and can be used to deliver CR1 and related molecules, e.g., encapsulation in liposomes, expression by hematopoietic stem cell progeny in gene therapy, etc. Other methods of introduction include, but are not limited to intradermal, intramuscular , intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal and oral routes.

6. EKSEMPEL: KLONING OG SEKVENSERING AV HUMAN C3b/C4b 6. EXAMPLE: CLONING AND SEQUENCE OF HUMAN C3b/C4b

RESEPTOR (CR1) RECEPTOR (CR1)

I eksemplene beskrevet heri er det beskrevet kloning og nukleotidsekvens til 5,5 kilobase par (kb) til CR1 kodende region (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095-1112). In the examples described herein, the cloning and nucleotide sequence of 5.5 kilobase pairs (kb) of the CR1 coding region is described (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095-1112).

Ti overlappende CR1 cDNA kloner som dekker 5,5 kb ble isolert fra et tonsillarbibliotek og sekvensert i sin helhet eller delvis. En enkelt lang åpen leseramme begynnende ved 5' enden av klonene og som rekker 4,7 kb nedstrøms til et stoppkodon ble identifisert. Denne sekvensen representerer ~ 80$ av den beregnede 6 kb av den kodende sekvensen for F allotype til CR1. Tre tandem, direkte, lange homologe gjentagelser (LHR) på 450 aminosyrer ble identifisert. Analyse av sekvensene til tryptiske peptider tydet på en fjerde LHR i F allotypen til CR1. Aminosyreidentitet mellom LHR varierte fra 70$ mellom første og tredje gjentagelser til 99$ mellom NHg-terminale 250 aminosyrer til de første og andre gjentagelsene. Hver LHR omfatter 7 korte konsensusgjentagelser (SCR) på 60-70 aminosyrer som ligner SCR til andre C3/C4 bindende proteiner, så som komplementreseptortype 2, faktor B og H, C4 bindingsprotein og C2. To ytterligere SCR kobler LHR til en enkelt membran-dekkende domene på 25 aminosyrer: F allotypen til CR1 inneholder dermed sansynligvis minst 30 SCR, idet 23 er blitt foreslått. Hver SCR antas å danne en trippel loop struktur der de fire konserverte halv-cysteinene danner disulfidbindinger. Den lineære oppstillingen av 30 SCR som en semi-rigid struktur ville rekke 1,140 Ångstrøm fra plasmamembranen og kan lette interaksjonen til CR1 med C3b og C4b beliggende innenfor mellomrommene til immunkompleksene og mikrobielle cellevegger. COOH-terminale cytoplasmadomenen på 43 rester inneholder en sekvens på 6 aminosyrer som er homolog med sekvensen i epidermal vekstfaktorreseptor som blir fosforylert av proteinkinase C. Ten overlapping CR1 cDNA clones covering 5.5 kb were isolated from a tonsillar library and sequenced in whole or in part. A single long open reading frame beginning at the 5' end of the clones and extending 4.7 kb downstream to a stop codon was identified. This sequence represents ~80$ of the estimated 6 kb of the coding sequence for the F allotype of CR1. Three tandem direct long homologous repeats (LHR) of 450 amino acids were identified. Analysis of the sequences of tryptic peptides indicated a fourth LHR in the F allotype of CR1. Amino acid identity between LHRs ranged from 70$ between the first and third repeats to 99$ between the NHg-terminal 250 amino acids of the first and second repeats. Each LHR comprises 7 short consensus repeats (SCRs) of 60-70 amino acids that resemble the SCRs of other C3/C4 binding proteins, such as complement receptor type 2, factors B and H, C4 binding protein and C2. Two additional SCRs connect the LHR to a single membrane-spanning domain of 25 amino acids: the F allotype of CR1 thus likely contains at least 30 SCRs, with 23 having been proposed. Each SCR is thought to form a triple loop structure where the four conserved half-cysteines form disulfide bonds. The linear arrangement of 30 SCR as a semi-rigid structure would extend 1,140 Angstroms from the plasma membrane and may facilitate the interaction of CR1 with C3b and C4b located within the interstices of the immune complexes and microbial cell walls. The COOH-terminal cytoplasmic domain of 43 residues contains a sequence of 6 amino acids homologous to the sequence in the epidermal growth factor receptor that is phosphorylated by protein kinase C.

6.1. Materialer og fremgangsmåter 6.1. Materials and methods

6.1.1. Isolering og sekvens til CR1 tryptiske peptider CR1 var renset fra vaskede humane erytrocyttmembraner ved sekvensiell Matrex Rød A og YZ-1 monoklon antistoff-af f initetskromatograf i (Wong, W.W. , et al., 1985, J.. Immunol. Methods 828:303). Tryptiske peptider ble preparert og isolert ved sekvensiell gradient og isokratisk revers-fase HPLC (høy ydelse væskekromatografi) som beskrevet (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711). Tryptisk peptidanalyse ble utført med en 470A proteinsekvenator (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), og analyse av hver nedbrytende syklus ble oppnådd ved anvendelse av en 120 PTH-aminosyreanalysator (Applied Biosystems, Inc.). 6.1.1. Isolation and Sequence of CR1 Tryptic Peptides CR1 was purified from washed human erythrocyte membranes by sequential Matrex Red A and YZ-1 monoclonal antibody affinity chromatography (Wong, W.W., et al., 1985, J.. Immunol. Methods 828:303 ). Tryptic peptides were prepared and isolated by sequential gradient and isocratic reverse-phase HPLC (high performance liquid chromatography) as described (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711). Tryptic peptide analysis was performed with a 470A protein sequencer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), and analysis of each degradation cycle was achieved using a 120 PTH amino acid analyzer (Applied Biosystems, Inc.).

6.1.2. Isolasjon av cDNA kloner og genomiske kloner Et cDNA bibliotek ble konstruert i Xgtll fra human mandler (tonsilar) poly(A)<+> RNA som beskrevet (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711). Ved RNA blothybridisering ble det vist at mandeldonoren var homozygot for F allele til CR1 (id.). cDNA ble selektert på en agarosegel til å omfatte fraksjonene mellom 2 og 7 kb før kloningstrinnene. Den opprinnelige kompleksiteten til biblioteket var 4,5 x 10^ rekombinanter pr. 100 mg cDNA og 6.1.2. Isolation of cDNA clones and genomic clones A cDNA library was constructed in Xgtll from human tonsil (tonsilar) poly(A)<+> RNA as described (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711). By RNA blot hybridization, it was shown that the tonsil donor was homozygous for the F allele of CR1 (id.). cDNA was selected on an agarose gel to include the fractions between 2 and 7 kb before the cloning steps. The initial complexity of the library was 4.5 x 10^ recombinants per 100 mg of cDNA and

biblioteket ble amplifisert i Escherichia coli stamme Y1088. Biblioteket ble screenet (Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) med CR1 prober, CRl-1 (ATCC aksessjonsnr. 57330 (E. coli inneholdende CRl-1 plasmid), 57331 (renset CRl-1 DNA)) og CR1-2 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711), som var blitt radiomerket til en spesifikk aktivitet på 2-8 x IO<8 >cpm/ug ved nikkhybridisasjon. Hybridiseringen ble utført i 50$ formamid, 5x SSC (lx SSC: 15 mM natriumsitrat, 150 mM natriumklorid) ved 43°C og filterene ble vasket ved 60°C i 0,2x SSC, ved betingelser som ikke muliggjør deteksjon av CR2 cDNA kloner (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639). Positive kloner ble plaque-renset to ganger før restriksjonskartlegging og DNA sekvensanalyse. the library was amplified in Escherichia coli strain Y1088. The library was screened (Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) with CR1 probes, CR1-1 (ATCC accession no. 57330 (E. coli containing CR1-1 plasmid), 57331 (purified CR1-1 DNA)) and CR1-2 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711), which had been radiolabeled to a specific activity of 2-8 x IO<8 >cpm/ug by nick hybridization. The hybridization was performed in 50% formamide, 5x SSC (1x SSC: 15 mM sodium citrate, 150 mM sodium chloride) at 43°C and the filters were washed at 60°C in 0.2x SSC, under conditions that do not allow detection of CR2 cDNA clones (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639). Positive clones were plaque-purified twice before restriction mapping and DNA sequence analysis.

Et genomisk bibliotek ble konstruert i EMBL-3 med 15-20 kb fragmenter produsert ved delvis spaltning av humant leukocyt DNA med Sau3AI. Den opprinnelige kompleksiteten var 1,2 x IO<6>, og biblioteket ble amplifisert i E. coli stamme P2392. Biblioteket ble også screenet med cDNA probene CRl-1 og CR1-2 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711 ) . A genomic library was constructed in EMBL-3 with 15-20 kb fragments produced by partial digestion of human leukocyte DNA with Sau3AI. The initial complexity was 1.2 x 10<6> and the library was amplified in E. coli strain P2392. The library was also screened with the cDNA probes CR1-1 and CR1-2 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711).

6.1.3. DNA sekvensanalyse 6.1.3. DNA sequence analysis

Restriksjonsfragmenter av cDNA klonene ble subklonet inn i M13mpl8 eller M13mpl9 og sekvensert ved dideoksynukleotidkjedetermineringsmetoden (Sanger, F., et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463). Noen kloner ble sekvensert helt eller delvis ved først å danne ordnede delesjonsmutanter ved anvendelse av eksonuklease III (Henikoff, S., 1984, Gene 28:351). Hver region ble sekvensert i begge trådene og i de fleste tilfellene ble hver region sekvensert i M14 subkloner konstruert fra to uavhengige isolerte cDNA kloner (fig. 2). Sekvensdata ble analysert med "the University of Wisconsin Genetics Computer Group package" (Madison, WI). Restriction fragments of the cDNA clones were subcloned into M13mpl8 or M13mpl9 and sequenced by the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger, F., et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463). Some clones were sequenced in whole or in part by first generating ordered deletion mutants using exonuclease III (Henikoff, S., 1984, Gene 28:351). Each region was sequenced in both strands and in most cases each region was sequenced in M14 subclones constructed from two independently isolated cDNA clones (Fig. 2). Sequence data were analyzed with the University of Wisconsin Genetics Computer Group package (Madison, WI).

6.2. Resultater 6.2. Results

6.2.1. Nukleotldsekvens til CR1 genet 6.2.1. Nucleotide sequence of the CR1 gene

Et størrelses-selektert fra mandel cDNA bibliotek ble screenet med CRl-1 og CR1-2 prober tilveiebragt fra CR1 cDNA klonen, XT8.3 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:7711). Femten positive fag ble identifisert ut i fra 1,5 x 10^ rekombinanter og 13 av disse representerte bestemte kloner. Ti ble restriksjonskartlagt og sekvensert helt eller delvis ved dideoksynukleotidkjedetermineringsmetoden. cDNA klonene ble oppstilt på basis av overlappende sekvensidentitet (fig. 2) og ble funnet å dekke 5,5 kb (fig. 3). En enkel lang åpen leseramme ble identifisert begynnende med 5' enden av cDNA klonene og som rekker 4,7 kb nedstrøms til et stoppkodon. Den kodende sekvensen for CR1 i dette biblioteket er ventet å være 6 kb, basert på en beregnet 220,000 dalton molekylvekt for uglykosylert reseptor (Wong, W.W. , et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685 ). Disse klonene dekker derfor ~80$ av beregnet kodende sekvens. A size-selected almond cDNA library was screened with CR1-1 and CR1-2 probes obtained from the CR1 cDNA clone, XT8.3 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82: 7711). Fifteen positive phages were identified from 1.5 x 10^ recombinants and 13 of these represented specific clones. Ten were restriction mapped and sequenced in whole or in part by the dideoxynucleotide chain termination method. The cDNA clones were aligned on the basis of overlapping sequence identity (Fig. 2) and were found to cover 5.5 kb (Fig. 3). A single long open reading frame was identified beginning at the 5' end of the cDNA clones and extending 4.7 kb downstream to a stop codon. The coding sequence for CR1 in this library is expected to be 6 kb, based on an estimated 220,000 dalton molecular weight for unglycosylated receptor (Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685). These clones therefore cover ~80$ of calculated coding sequence.

Klonene T49.1 og T55.1 inneholder kodende sekvens ved deres 5' ender som indikerer at ytterligere 5' kodende og ikke-kodende sekvenser enda må bli identifisert. I 3' regionen inneholder de overlappende klonene T8.2, T43.1 og T87.1 transmembrane og cytoplasmaregioner kodet av en identisk sekvens i hver klon. Klonen som rekker mest 3', T8.2, inneholder 807 bp av utranslatert sekvens uten en poly(A) sekvens. Klon T8.3 inneholder en 91-bp delesjon av nukleotidene 1,406-1,497 og klon T40.1 inneholder en 9-bp delesjon av nukleotidene 1,498-1,507 relativt til sekvensene som finnes i klonene T6.1 og T55.1. Disse delesjonene oppsto i regioner som har sekvenser homologe med 5' spleiseseter og kan representere spleisefeil i mRNA. Klonene T49.1 og T55.1 inneholder et 110 bp innskudd mellom nukleotidene 147og 148 i den åpne leserammen (fig. 3). Denne sekvensen vurderes å være en del av en intron p.g.a. at den ikke hybridiserte til blotter av mandel poly(A)<+> RNA, den inneholder et 5' spleisesete (Breathnach, R., et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 75:4853) (fig. 3), den er flankert av cDNA sekvenser i CR1 genomiske kloner, og den skifter leseramme. Klon T9.4 inneholder 0,88 kb av mellomliggende sekvens ved 3' enden som ikke hybridiserer til blotter av mandel poly(A)<+>Clones T49.1 and T55.1 contain coding sequence at their 5' ends indicating that additional 5' coding and non-coding sequences have yet to be identified. In the 3' region, the overlapping clones T8.2, T43.1 and T87.1 contain transmembrane and cytoplasmic regions encoded by an identical sequence in each clone. The most 3' reaching clone, T8.2, contains 807 bp of untranslated sequence without a poly(A) sequence. Clone T8.3 contains a 91-bp deletion of nucleotides 1,406-1,497 and clone T40.1 contains a 9-bp deletion of nucleotides 1,498-1,507 relative to the sequences found in clones T6.1 and T55.1. These deletions occurred in regions that have sequences homologous to 5' splice sites and may represent splicing errors in the mRNA. Clones T49.1 and T55.1 contain a 110 bp insert between nucleotides 147 and 148 in the open reading frame (Fig. 3). This sequence is considered to be part of an intron due to that it did not hybridize to blots of almond poly(A)<+> RNA, it contains a 5' splice site (Breathnach, R., et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 75:4853) (Fig . 3), it is flanked by cDNA sequences in CR1 genomic clones, and it shifts the reading frame. Clone T9.4 contains 0.88 kb of intervening sequence at the 3' end that does not hybridize to blots of almond poly(A)<+>

RNA. RNA.

6.2.2. Analyse av nukleotid og aminosyresekvens til CR1 Dotmatriseanalyse av nukleotidsekvensen til CR1 (fig. 3) viste to typer av indre homologier (fig. 4). Første type med indre homologi er representert ved uthevede, uavbrutte linjer som angir tilstedeværelse av tre tandem, direkte, meget homologe gjentagelser på 1,35 kb. Disse nukleotidsekvensene koder for de lange homologe gjentagelsene (LHR) til CR1. Den andre type gjentagelse er representert ved strekede parallel-linjer som angir regioner med mindre homologi. Disse sekvensene oppstår for hver 190-210 nukleotider og koder for de korte konsensusgjentagelsene (SCR) til CR1. 6.2.2. Analysis of nucleotide and amino acid sequence of CR1 Dot matrix analysis of the nucleotide sequence of CR1 (Fig. 3) showed two types of internal homologies (Fig. 4). The first type with internal homology is represented by bold, solid lines indicating the presence of three tandem, direct, highly homologous repeats of 1.35 kb. These nucleotide sequences encode the long homologous repeats (LHR) of CR1. The second type of repeat is represented by dashed parallel lines indicating regions of less homology. These sequences occur every 190-210 nucleotides and encode the short consensus repeats (SCR) of CR1.

Aminosyresekvensen avledet fra cDNA sekvensen er presentert i fig. 5 og de tre LHR, betegnet LHR-B, LHR-C og LHR-D, er oppstilt for å demonstrere deres homologi. LHR-B rekker fra rest 1 til og med rest 438, LHR-C korresponderer med restene 439-891, og LHR-D rekker fra rest 892 til og med 1,341. Restene 451-694 til LHR-C er 99$ identiske med restene 1-244 til LHR-B, men er bare 61$ identisk med de tilsvarende restene til LHR-D. En kontrast til dette er restene 695-891 til LHR-C 91$ identiske med restene 1,148-1,341 til LHR-D, men bare 76$ identiske med den tilsvarende regionen til LHR-B. LHR-C ser dermed ut til å være en hybrid som omfatter sekvenser som er mest homologe med den første halvparten av LHR-B og den andre halvparten av LHR-D. LHR er etterfulgt av to SCR som ikke blir gjentatt, et 25 rest hydrofobt segment og en 43 aminosyre COOH-terminal region uten sekvenshomologi med SCR (fig. 5). The amino acid sequence derived from the cDNA sequence is presented in fig. 5 and the three LHRs, designated LHR-B, LHR-C and LHR-D, are lined up to demonstrate their homology. LHR-B ranges from residue 1 through residue 438, LHR-C corresponds to residues 439-891, and LHR-D ranges from residue 892 through 1,341. Residues 451-694 of LHR-C are 99$ identical to residues 1-244 of LHR-B, but are only 61$ identical to the corresponding residues of LHR-D. In contrast, residues 695-891 of LHR-C are 91$ identical to residues 1,148-1,341 of LHR-D, but only 76$ identical to the corresponding region of LHR-B. LHR-C thus appears to be a hybrid comprising sequences most homologous to the first half of LHR-B and the second half of LHR-D. The LHR is followed by two SCRs that are not repeated, a 25 residue hydrophobic segment and a 43 amino acid COOH-terminal region with no sequence homology to the SCR (Fig. 5).

5' 1,3 kb til CR1 kodende sekvens representerer en fjerde LHR, LHR-A (se fig. 1, ovenfor, og seksjon 7, nedenfor). Denne konklusjonen ble underskjøttet av analyse av tryptiske peptider til erytrocytt CR1. Ti tryptiske peptider har sekvenser som er identiske med aminosyresekvensene avledet fra cDNA klonene (tabell I). 5' 1.3 kb to the CR1 coding sequence represents a fourth LHR, LHR-A (see Fig. 1, above, and Section 7, below). This conclusion was undermined by analysis of tryptic peptides of erythrocyte CR1. Ten tryptic peptides have sequences identical to the amino acid sequences derived from the cDNA clones (Table I).

Hver LHR omfatter syv 60-70 aminosyre SCR som karakteriserer familien av C3 og C4 bindende proteiner (C4bp) (fig. 6A). Maksimal homologi mellom 23 SCR til CR1 ble observert ved innføring av opphold ved oppstilling av sekvensene (fig. 6A). Til sammen ble 29 av de gjennomsnitlige 65 restene i hver gjentagelse konservert. Det er seks rester som tilstede i alle SCR: de fire halv-cysteinene som i lignende relative posisjoner foreslår at hver kan være involvert i en kritisk disulfidbinding, og tryptofan og andre glycin etter andre halv-cystein (fig. 6A). Sekundær strukturanalyse av sekvensene mellom invariante halv-cysteiner ved anvendelse av algoritmen til Chou og Fasman (Chou, P.Y. og Fasman, G.D. , 1974, Biochemistry 13:222) forutså høy sansynlighet for 3-dreiningsdannelse og lav sansynlighet for a-heliksdannelse. Sekvensanalyse av to CR1 genomiske kloner, 2,38 (fig. 6B) og 2,46, angir at SCR-14 (fig. 6A) blir kodet av et enkelt ekson og at COOH-terminus til SCR-23 tilsvarer slutten av en ekson. SCR til CR1 kan dermed bli kodet av separate eksoner som vist for SCR til faktor B (Campbell, R.D. og Bentley, D.R., 1985, Immunol. Rev. 87:19) og til IL-2-R (Leonard, W.J., et al., 1985, Science 230:633). Each LHR comprises seven 60-70 amino acid SCRs that characterize the family of C3 and C4 binding proteins (C4bp) (Fig. 6A). Maximum homology between 23 SCR to CR1 was observed when introducing pauses when aligning the sequences (Fig. 6A). In total, 29 of the average 65 residues in each repeat were conserved. There are six residues present in all SCRs: the four half-cysteines that in similar relative positions suggest that each may be involved in a critical disulfide bond, and tryptophan and other glycine after the second half-cysteine (Fig. 6A). Secondary structure analysis of the sequences between invariant half-cysteines using the algorithm of Chou and Fasman (Chou, P.Y. and Fasman, G.D., 1974, Biochemistry 13:222) predicted a high probability of 3-turn formation and a low probability of α-helix formation. Sequence analysis of two CR1 genomic clones, 2.38 (Fig. 6B) and 2.46, indicates that SCR-14 (Fig. 6A) is encoded by a single exon and that the COOH terminus of SCR-23 corresponds to the end of an exon . The SCR to CR1 may thus be encoded by separate exons as shown for the SCR to factor B (Campbell, R.D. and Bentley, D.R., 1985, Immunol. Rev. 87:19) and to IL-2-R (Leonard, W.J., et al ., 1985, Science 230:633).

Konsensussekvensen til CR1 SCR blir sammenlignet med SCR til andre medlemmer av superfamilien som har denne karakteristike strukturen (fig. 7). Disse medlemmene inkluderer, ikke bare proteiner som har C3/C4 bindingsfunksjon, CR2 (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639), C4bp (Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133), faktor H (Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407), faktor B (Morley, B.J. og Campbell, R.D., 1984, EMBO J. 3:153; Mole, J.E., et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:3407), og C2 (Bentley, D.R. , og Porter, R.R., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:1212; Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 306:301), men også proteiner som ikke er kjent for å ha denne funksjonen, så som interleukin-2 reseptoren (Leonard, W.J., et al., 1985, Science 230:633), e>2~ S^ Y^- °Protein I (Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:3640), Clr (Leytus, S.P., et al., 1986, Biochemistry 25:4855), haptoglobin a kjede (Kurosky, A., et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:3388), og faktor Xlllb (Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25:4633). Halv-cysteinrestene er invariante i SCR til alle proteinene, med unntagelse av haptoglobin som mangler det tredje halv-cysteinet. Tryptofan er også invariant med unntagelse av femte SCR i <g>2"glykoPro"tein I og to av gjentagelsene i faktor XHIb. Andre rester som er konservert, men ikke tilstede i hver SCR pleier å bli sammenklumpet rundt halv-cysteinene. Det er bare en fri tiolgruppe i faktor B og C2 (Christie, D.L., og Gagnon, J., 1982, Biochem. J. 201:555; Parkes, C, et al., 1983, Biochem. J. 213:201), og i SCR til 32-glykoprotein I, er første halv-cystein disulfid-bundet til tredje og andre til fjerde (Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:3640). The consensus sequence of the CR1 SCR is compared with the SCRs of other members of the superfamily that have this characteristic structure (Fig. 7). These members include, but are not limited to proteins having C3/C4 binding function, CR2 (Weis, J.J., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:5639), C4bp (Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133), factor H (Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407), factor B (Morley, B.J. and Campbell, R.D., 1984, EMBO J. 3:153; Mole, J.E., et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:3407), and C2 (Bentley, D.R., and Porter, R.R., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81: 1212; Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 306:301), but also proteins not known to have this function, such as the interleukin-2 receptor ( Leonard, W.J., et al., 1985, Science 230:633), e>2~ S^ Y^- °Protein I (Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81 :3640), Clr (Leytus, S.P., et al., 1986, Biochemistry 25:4855), haptoglobin a chain (Kurosky, A., et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:3388) , and factor Xlllb (Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25:4633). The half-cysteine residues are invariant in the SCR of all the proteins, with the exception of haptoglobin which lacks the third half-cysteine. Tryptophan is also invariant with the exception of the fifth SCR in <g>2"glycoPro"tein I and two of the repeats in factor XHIb. Other residues that are conserved but not present in every SCR tend to be clustered around the half-cysteines. There is only one free thiol group in factor B and C2 (Christie, D.L., and Gagnon, J., 1982, Biochem. J. 201:555; Parkes, C, et al., 1983, Biochem. J. 213:201) , and in the SCR of 32-glycoprotein I, the first half-cysteine is disulfide-bonded to the third and the second to the fourth (Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:3640).

I den avledede aminosyresekvensen til CR1 er det 17 potensielle seter for N-bundede oligosakkarider og alle disse er i den ekstracellulære regionen (Fig. 6A). Molekylvektsforskjel-ler mellom CR1 syntetisert i nærvær eller fravær av tunikamycin (Lublin, D.M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736) og analyse av glykosamininnholdet (Sim, R.B., 1985, Biochem. J. 232:883) foreslår tilstedeværelse av bare 6-8 N-bundede kompleksoligosakkarider, som angir at alle potensielle seter ikke blir anvendt. F.eks. ble asparagin i resten 263 til den avledede aminosyresekvensen (fig. 5) identifisert i peptid 41c (tabell I), som angir fravær av glykosyler ing i dette setet. I kontrast til dette, korresponderer den uiden-tifiserte aminosyren i peptid 34b sansynligvis med et glykosylert asparagin i resten 395. In the deduced amino acid sequence of CR1, there are 17 potential sites for N-linked oligosaccharides and all of these are in the extracellular region (Fig. 6A). Molecular weight differences between CR1 synthesized in the presence or absence of tunicamycin (Lublin, D.M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736) and glycosamine content analysis (Sim, R.B., 1985, Biochem. J. 232: 883) suggests the presence of only 6-8 N-linked complex oligosaccharides, indicating that all potential sites are not utilized. E.g. Asparagine at residue 263 of the deduced amino acid sequence (Fig. 5) was identified in peptide 41c (Table I), indicating the absence of glycosylation at this site. In contrast, the unidentified amino acid in peptide 34b probably corresponds to a glycosylated asparagine in residue 395.

De eneste ikke-repeterende CR1 sekvensene identifisert i 5,5 kb cDNA er beliggende i COOH-terminale regionen. En sekundær strukturanalyse av denne regionen angir en enkelt 25-rest antatt membran-dekkende segment med sterk hydrofob karakter og høyt potensiale for a-heliksdannelse (fig. 5). Denne sekvensen er deretter fulgt av fire positivt ladede rester som er et karaktertrekk til mange membranproteiner. Den antatte cytoplasmaregionen til CR1 omfatter 43 rester og inneholder en seksaminosyre lang sekvens, VHPRTL, som er homolog med sekvensen VRKRTL, et sete av proteinkinase C fosforylering i epidermal vekstfaktor (EGF) reseptor og erbB onkogen produktet (Hunter, T., et al., 1984, Nature 311:480; Davis R.J. og Czech, M.P., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:1974). Det er ingen tyrosinrester i cytoplasmaregionen til mandel CR1. The only non-repetitive CR1 sequences identified in the 5.5 kb cDNA are located in the COOH-terminal region. A secondary structure analysis of this region indicates a single 25-residue putative membrane-spanning segment with strong hydrophobic character and high potential for α-helix formation (Fig. 5). This sequence is then followed by four positively charged residues which are a characteristic feature of many membrane proteins. The putative cytoplasmic region of CR1 comprises 43 residues and contains a six amino acid long sequence, VHPRTL, which is homologous to the sequence VRKRTL, a site of protein kinase C phosphorylation in the epidermal growth factor (EGF) receptor and the erbB oncogene product (Hunter, T., et al. , 1984, Nature 311:480; Davis R.J. and Czech, M.P., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:1974). There are no tyrosine residues in the cytoplasmic region of almond CR1.

6.3. Diskusjon 6.3. Discussion

Omtrent 80$ av den primære strukturen til F allotypen til CR1 er blitt tilveiebragt ved sekvensering av overlappende cDNA kloner. Det mest uvanlige strukturtrekket til CR1 observert i denne analysen er tilstedeværelse av tandem, direkte LHR på 450 aminosyrer, der fire antas å oppstå i F allotypen til CR1 som har en beregnet polypeptidkjedelengde på 2,000 rester (Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685; Sim, R.B., 1985, Biochem. J. 232:883). Tre av LHR er blitt klonet og sekvensert mens bevis for eksistensen av den fjerde ble tilveiebragt ved analyse av tryptiske peptider. Hver LHR består av syv SCR som er hovedstrukturene elementer til andre C3/C4 bindingsproteiner. Bevaring av de fire halv-cysteinene pr. SCR, den sansynlige innbefatningen av første og tredje og andre og fjerde halv-cysteiner i disulfidbindinger (Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:3640) og tilstedeværelse av konserverte aminosyrer så som prolin, glycin og asparagin som ofte er funnet i p-dreininger (Rose, G.D., et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1) fører til forslaget om at en SCR danner en trippel-loop struktur opprettholde av disulfidbindinger (fig. 8). Denne rollen for halv-cysteinrestene er understøttet ved funnet om at mildt trypsin-behandlet CR1 (Sim, R.B., 1985, Biochem. J. 232:883) og faktor H (Sim, R.B. og DiScipio, R.G., 1982, Biochem. J. 205:285) migrerer som intakte molekyler når analysert ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) under ikke-reduserende betingelser og samt multiple tryptiske fragmenter etter reduksjon. Approximately 80% of the primary structure of the F allotype of CR1 has been provided by sequencing overlapping cDNA clones. The most unusual structural feature of CR1 observed in this analysis is the presence of tandem, direct LHRs of 450 amino acids, four of which are thought to occur in the F allotype of CR1 which has a calculated polypeptide chain length of 2,000 residues (Wong, W.W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685; Sim, R.B., 1985, Biochem. J. 232:883). Three of the LHRs have been cloned and sequenced while evidence for the existence of the fourth was provided by analysis of tryptic peptides. Each LHR consists of seven SCRs which are the main structural elements of other C3/C4 binding proteins. Conservation of the four half-cysteines per SCR, the probable inclusion of first and third and second and fourth half-cysteines in disulfide bonds (Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:3640) and presence of conserved amino acids such as proline, glycine and asparagine which are often found in p-turns (Rose, G.D., et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1) lead to the suggestion that an SCR forms a triple-loop structure maintained by disulfide bonds ( Fig. 8). This role for the half-cysteine residues is supported by the finding that mildly trypsinized CR1 (Sim, R.B., 1985, Biochem. J. 232:883) and factor H (Sim, R.B. and DiScipio, R.G., 1982, Biochem. J. 205:285) migrate as intact molecules when analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) under non-reducing conditions and as well as multiple tryptic fragments after reduction.

Denne serien av SCR gjentatt i tandem antas å danne en elongert struktur (fig. 8) som foreslått for faktor H og for hver subenhet av human C4bp (Sim, R.B. og DiScipio, R.G. , 1982, Biochem. J. 205:285; Whaley, K. og Ruddy, S., 1976, J. Exp. Med. 144:1147; Dahlback, B., et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:3461). Elektronmikroskopi studier av subenhetene til C4bp har angitte dimensjoner på 300 x 30 Ångstrøm (Dahlback, B., et al. 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:3461). Ider hver subenhet består av åtte SCR (Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133), kan hver individuell SCR bli beregnet til 38 x 30 Ångstrøm. Ved å anta at SCR til CR1 har lignende dimensjoner og F allotypen har 30 SCR, kan reseptoren rekke så mye som 1,140 Ångstrøm fra cellemembranen. I samsvar med denne antagelsen angående CR1 strukturen er det tidligere funnet om at ferritin-merket antistoff bundet til CR1 på nøytrofiler ofte var 500 Ångstrøm fra ytre delen av plasmamembranen (Abrahamsen, D.R. og Fearon, D.T., 1983, Lab. Invest. 48:162). En slik utvidet struktur av CR1 ville lette interaksjonen mellom reseptor-bærende celler og C3b som er kovalentlig bundet til relativt uoppnåelige seter innenfor immunkompleksene og mikrobielle cel1eoverflater. This series of SCRs repeated in tandem is thought to form an elongated structure (Fig. 8) as proposed for factor H and for each subunit of human C4bp (Sim, R.B. and DiScipio, R.G., 1982, Biochem. J. 205:285; Whaley , K. and Ruddy, S., 1976, J. Exp. Med. 144:1147; Dahlback, B., et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:3461). Electron microscopy studies of the subunits of C4bp have stated dimensions of 300 x 30 Angstroms (Dahlback, B., et al. 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80:3461). Since each subunit consists of eight SCRs (Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133), each individual SCR can be calculated as 38 x 30 Angstroms. Assuming that the SCR of CR1 has similar dimensions and the F allotype has 30 SCR, the receptor can range as much as 1.140 Angstroms from the cell membrane. Consistent with this assumption regarding the CR1 structure, it has previously been found that ferritin-labeled antibody bound to CR1 on neutrophils was often 500 Angstroms from the outer part of the plasma membrane (Abrahamsen, D.R. and Fearon, D.T., 1983, Lab. Invest. 48:162 ). Such an extended structure of CR1 would facilitate the interaction between receptor-bearing cells and C3b that is covalently bound to relatively inaccessible sites within the immune complexes and microbial cell surfaces.

Funnet om at SCR er hoved, og kanskje eneste, ekstracyto-plasmaelement til CR1 tilveiebringer strukturelt bevis for et nære forhold mellom reseptoren og faktor H og C4bp, to plasmaproteiner som eksklusivt eller hovedsakelig består av SCR (Chung, L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133; Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407). CR1 ble opprinnelig isolert som et erytrocyttmembranprotein med faktor H-lignende aktivitet etter detergentoppløsning (Fearon, D.T., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867), og det ble deretter funnet å ha regulatoriske funksjoner til faktor H og C4bp når det var beliggende på plasmamembranen (lida, K. og Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153:1138). Ved analyse av arv av strukturell polymorfisme til CR1, faktor H og C4bp ble genene som koder for disse tre proteinene vist å være bundede (de Cordoba, R., et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1189), og lokuset for denne bindingsgruppen og for den strukturelt beslektede reseptoren, CR2, er i den senere tid blitt vist ved in situ hybridisering og ved analyse av somatiske cellehybrider å være på den lange armen til kromoson 1, bånd q32 (Weis, J.H., et al., 1987, J. Immunol. 138:312). Før foreliggende studie var det eneste beviset for et strukturelt forhold mellom disse proteinene en signifikant likhet i deres aminosyresammensetninger (Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303). Foreliggende funn av minst 23 SCR i CR1 utgjør den direkte og formelle demonstrasjon på et strukturelt forhold til reseptoren med faktor H og C4bp (Chung. L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133; Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407), proteiner med lignende funksjoner og med Ba og C2b fragmentene til faktor B og C2 (Morley, B.J. og Campbell, R.D., 1984, EMBO J. 3:153; Mole, J.E., et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:3407; Bentley, D.R. og Porter, R.R., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:1212; Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 306:301 ), komponenter som danner enzymatiske komplekser med C3b og C4b, respektivt. SCR ble derimot også funnet i flere ikke-komplementproteiner (Campbell, R.D., og Bentley, D.R., 1985, Immunol. Rev. 87:19; Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:3640; Leytus, S.P., et al., 1986, Biochemistry 25:4855; Kurosky, A., et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:3388; Ichinose, A., et al., 1986, Biochemistry 25:4633) The finding that SCR is the major, and perhaps only, extra-cytoplasmic element of CR1 provides structural evidence for a close relationship between the receptor and Factor H and C4bp, two plasma proteins that consist exclusively or mainly of SCR (Chung, L.P., et al., 1985 , Biochem. J. 230:133; Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407). CR1 was originally isolated as an erythrocyte membrane protein with factor H-like activity after detergent solubilization (Fearon, D.T., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867) and was subsequently found to have regulatory functions of factor H and C4bp when it was located on the plasma membrane (lida, K. and Nussenzweig, V., 1981, J. Exp. Med. 153:1138). When analyzing the inheritance of structural polymorphisms of CR1, factor H and C4bp, the genes encoding these three proteins were shown to be linked (de Cordoba, R., et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1189), and the locus for this binding group and for the structurally related receptor, CR2, has recently been shown by in situ hybridization and by analysis of somatic cell hybrids to be on the long arm of chromosome 1, band q32 (Weis, J.H., et al ., 1987, J. Immunol. 138:312). Prior to the present study, the only evidence for a structural relationship between these proteins was a significant similarity in their amino acid compositions (Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303). The present finding of at least 23 SCRs in CR1 constitutes the direct and formal demonstration of a structural relationship to the receptor with factor H and C4bp (Chung. L.P., et al., 1985, Biochem. J. 230:133; Kristensen, T., et al., 1986, J. Immunol. 136:3407), proteins with similar functions and with the Ba and C2b fragments of factor B and C2 (Morley, B.J. and Campbell, R.D., 1984, EMBO J. 3:153; Mole, J.E. , et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:3407; Bentley, D.R. and Porter, R.R., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:1212; Gagnon, J., 1984, Philos. Trans. . R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 306:301 ), components that form enzymatic complexes with C3b and C4b, respectively. However, SCR was also found in several non-complement proteins (Campbell, R.D., and Bentley, D.R., 1985, Immunol. Rev. 87:19; Lozier, J., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:3640; Leytus, S.P., et al., 1986, Biochemistry 25:4855; Kurosky, A., et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:3388; Ichinose, A., et al. ., 1986, Biochemistry 25:4633)

(fig. 7), som angir at det ikke nødvendigvis representerer en C3/C4 bindende struktur. (Fig. 7), indicating that it does not necessarily represent a C3/C4 binding structure.

Blant proteinene som har SCR er CR1 unik idet den har organisert denne hovedstrukturen og genetiske enheten inn høyere ordens strukturell enhet til LHR. Analyse av et 14,5 kb BamHI fragment av genomisk DNA som er assosiert med ekspressjon av S allotype har tydet på minst en gjentagende genomisk enhet i CR1 er et utvidet segment av DNA inneholdende eksonene kodende for minst 5 SCR og deres flankerende introner (Wong, W.W., et al., 1986, J. Exp. Med. 164:1531). Disse studiene har også foreslått at S allele inneholder et ytterligere kopi av denne genomiske enheten sammenlignet med antallet tilstede i F allelet. Denne observasjonen, kombinert med en tryptisk peptidkartleggingsstudie (Nickells, M.W., et al. 1986, Mol. Immunol. 23:661) og foreliggende funn om at en LHR representerer et peptid på ~40-50 kD gjør det mulig å forutsi tilstedeværelse i S allotypen (290 kD) av en ytterligere LHR relativt til beregningen om fire LHR i F allotypen (250,000 dalton molekylvekt). Among the SCR-bearing proteins, CR1 is unique in that it has organized this major structure and genetic unit into the higher-order structural unit of the LHR. Analysis of a 14.5 kb BamHI fragment of genomic DNA associated with expression of the S allotype has suggested that at least one repetitive genomic unit in CR1 is an extended segment of DNA containing the exons encoding at least 5 SCRs and their flanking introns (Wong, W. W., et al., 1986, J. Exp. Med. 164:1531). These studies have also suggested that the S allele contains an additional copy of this genomic unit compared to the number present in the F allele. This observation, combined with a tryptic peptide mapping study (Nickells, M.W., et al. 1986, Mol. Immunol. 23:661) and the present finding that an LHR represents a peptide of ~40-50 kD makes it possible to predict the presence in S allotype (290 kD) of one additional LHR relative to the calculation of four LHR in the F allotype (250,000 dalton molecular weight).

I tillegg til å tilveiebringe bevis for duplikeringshendelser foreslår sekvensene til LHR også at omdannelseshendelser har oppstått innenfor CR1 genet. LHR-B og -D er 67$ identiske i forhold til hverandre i løpet av hele lengden, mens LHR-C er 99$ identisk med LHR-B i NH2-terminale fire SCR og 91$ identisk med LHR-D i COOH-terminale tre SCR. Denne organi-seringen kunne ikke ha oppstått ved en enkel rekombinasjonell hendelse mellom identiske parentale alleler ved opprinnelsen av dette hybrid LHR. Hybrid LHR kan derimot ha oppstått ved genomdanning (Atchison, M. og Adesnik, M., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:2300) der sekvensene i en LHRtC forløper ble erstattet med sekvenser tilstede i LHR-B eller LHR-D. Den nesten fullstendige identiteten og nøyaktige oppstillingen av homologe sekvenser i disse LHR (fig. 5) er også blitt opprettholdt ved en mekanisme omfattende genomdanning. Analyse av grad av homologi mellom mellomliggende sekvenser av de segmentene av CR1 genet for koder for LHR skal kunne bestemme om genomdanningen eller seleksjonen basert på funksjonelle begrensninger har begrenset sekvensdivergens. In addition to providing evidence for duplication events, the sequences of the LHR also suggest that conversion events have occurred within the CR1 gene. LHR-B and -D are 67$ identical to each other over the entire length, while LHR-C is 99$ identical to LHR-B in NH2-terminal four SCRs and 91$ identical to LHR-D in COOH-terminal three SCRs. This organization could not have arisen by a simple recombinational event between identical parental alleles at the origin of this hybrid LHR. Hybrid LHR, on the other hand, may have arisen by genome formation (Atchison, M. and Adesnik, M., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:2300) where the sequences in an LHRtC precursor were replaced with sequences present in LHR-B or LHR-D. The almost complete identity and exact alignment of homologous sequences in these LHRs (Fig. 5) has also been maintained by a mechanism involving genome formation. Analysis of the degree of homology between intermediate sequences of the segments of the CR1 gene that codes for LHR should be able to determine whether the genome formation or the selection based on functional constraints has limited sequence divergence.

Til tross for at en tidligere studie foreslår at CR1 er monovalent (Wilson, J.G., et al., 1982, N. Engl. J. Med. 307:981), kan hver LHR representere en enkelt C3b/C4b bindingsdomene, som skulle gjøre reseptoren multivalent og tilpasset for binding av komplekser som bærer multiple molekyler av C3b og C4b. Alternativt kan bestemte LHR være ansvarlig for binding av henholdsvis C3b og C4b (se seksjon 9, nedenfor), som tilveiebringer et strukturelt grunnlag for kombinasjonen av faktor H og C4bp aktiviteter i CR1. LHR til CR1 kan representere struturelle domener som virker på en slik måte at CR1 går ut i fra plasmamembranen, som foreslått ved den antatte strukturelle modellen (fig. 8), og SCR ved NH-2-terminale regionen binder C3b og C4b, som funnet for faktor H (Sim, R.B. og DiScipio, R.G., 1982, Biochem. J. 205:285; Alsenz, J., et al., 1984, Biochem. J. 224:389). Although a previous study suggests that CR1 is monovalent (Wilson, J.G., et al., 1982, N. Engl. J. Med. 307:981), each LHR may represent a single C3b/C4b binding domain, which would the receptor is multivalent and adapted for the binding of complexes carrying multiple molecules of C3b and C4b. Alternatively, specific LHRs may be responsible for binding C3b and C4b, respectively (see section 9, below), providing a structural basis for the combination of factor H and C4bp activities in CR1. The LHR of CR1 may represent structural domains that act in such a way that CR1 protrudes from the plasma membrane, as suggested by the putative structural model (Fig. 8), and the SCR at the NH-2-terminal region binds C3b and C4b, as found for factor H (Sim, R.B. and DiScipio, R.G., 1982, Biochem. J. 205:285; Alsenz, J., et al., 1984, Biochem. J. 224:389).

Aktivering av proteinkinase C ved forbolestere induserer fosforylering av CR1 i nøytrolfiler, monocytter og eosinofi-ler (Changelian, P.S. og Fearon, D.T. , 1986, J. Exp. Med. 163:101) og CR1 cytoplasmadomenen på 43 aminosyrer har en sekvens som er homolog med et sete som blir fosforylert av proteinkinase C i epidermal vekstfaktorreseptor (Hunger, T. , et al., 1984, Nature 311:480; Davis, R.J. og Czech, M.P., 1985, Proe. Nalt. Acad. Sei. U.S.A. 82:1974). Denne cytoplas-masekvensen, som ble funnet i tre uavhengige kloner av mandel (tonsillar) biblioteket, er mest sansynlig den til B celle CR1, som ikke blir fosforylert etter aktivering av proteinkinase C (Changelian, P.S. og Fearon, D.T., 1986, J. Exp. Med. 163:101). Activation of protein kinase C by phorbol esters induces phosphorylation of CR1 in neutrophils, monocytes and eosinophils (Changelian, P.S. and Fearon, D.T., 1986, J. Exp. Med. 163:101) and the CR1 cytoplasmic domain of 43 amino acids has a sequence that is homologous to a site that is phosphorylated by protein kinase C in the epidermal growth factor receptor (Hunger, T., et al., 1984, Nature 311:480; Davis, R.J. and Czech, M.P., 1985, Proe. Nalt. Acad. Sei. U.S.A. 82 :1974). This cytoplasmic sequence, which was found in three independent clones of the tonsil (tonsillar) library, is most likely that of B cell CR1, which is not phosphorylated upon activation by protein kinase C (Changelian, P.S. and Fearon, D.T., 1986, J. Exp. Med. 163:101).

7. EKSEMPEL: CR1 5' cDNA SEKVENSER INNEHOLDER EN FJERDE LANG HOMOLOG GJENTAGELSE 7. EXAMPLE: CR1 5' cDNA SEQUENCES CONTAIN A FOURTH LONG HOMOLOGOUS REPEAT

Analyse av en delvis cDNA sekvens av CR1 viste en struktur der 3 LHR, LHR-B, LHR-C, LHR-D, på 450 aminosyrer her besto av syv korte konsensusgjentagelser (SCR) på 65 aminosyrer karakteristisk for C3/C4 bindingsproteinene (se seksjon 6, ovenfor). I eksemplene beskrevet heri, blir kloning og nukleotidsekvensen til en fjerde amino-terminal LHR, LHR-A (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180) ved sekvensering av 5' cDNA klonene beskrevet. Analyse av LHR-A viste at den er 99$ homolog med LHR-B i de fem 3' SCR, men bare 61$ homolog i de to 5' SCR. Analysis of a partial cDNA sequence of CR1 showed a structure in which 3 LHR, LHR-B, LHR-C, LHR-D, of 450 amino acids here consisted of seven short consensus repeats (SCR) of 65 amino acids characteristic of the C3/C4 binding proteins (see section 6, above). In the examples described herein, the cloning and nucleotide sequence of a fourth amino-terminal LHR, LHR-A (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180) by sequencing the 5' cDNA clones is described. Analysis of LHR-A showed that it is 99$ homologous to LHR-B in the five 3' SCRs, but only 61$ homologous in the two 5' SCRs.

7.1. Materialer og fremgangsmåter 7.1. Materials and methods

7.1.1. Konstruksjon av et cDNA bibliotek 7.1.1. Construction of a cDNA library

Et selektivt primet cDNa bibliotek, XHH, ble konstruert fra 3 ug poly(A)<+> RNA renset fra DMSO-induserte celler som beskrevet (Chirgwin, J.M., et al., 1979, Biochemistry 18:5290; Aviv, H. og Leder, P., 1972, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 69:1408; Ausubel, F.M., et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) med følgende modifikasjoner. LK35.1, et 35-mer oligonukleotid, 5 ' -TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG TGGGG-3' , ble anvendt i steden for ol igo( dT )12_18 og 40 pCi a32P-dCTP ble tilsatt i løpet av den andre trådsyntesen. En tredje del av cDNA ble klonet i Xgtll og et cDNa bibliotek ble konstruert fra humant mandel poly(A)<+> RNA som beskrevet i seksjon 6.1.2., ovenfor. 750,000 uavhengige rekombinanter tilveiebragt . A selectively primed cDNA library, XHH, was constructed from 3 µg of poly(A)<+> RNA purified from DMSO-induced cells as described (Chirgwin, J.M., et al., 1979, Biochemistry 18:5290; Aviv, H. and Leder, P., 1972, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 69:1408; Ausubel, F. M., et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) with the following modifications. LK35.1, a 35-mer oligonucleotide, 5' -TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG TGGGG-3', was used in place of oligo( dT )12_18 and 40 pCi a32P-dCTP was added during the second strand synthesis. A third portion of cDNA was cloned into Xgtll and a cDNA library was constructed from human almond poly(A)<+> RNA as described in section 6.1.2., above. 750,000 independent recombinants provided.

7.1.2. Isolasjon av kloner, prober og DNA sekvensanalyse 7.1.2. Isolation of clones, probes and DNA sequence analysis

Probene anvendt for screening av cDNA bibliotek var CRl-1 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 82:7711) (ATCC aksessjonsnr. 57331), CR-2 (Wong, W.W., et al., ovenfor), CR1-4 (Wong, W.W. et al., 1986, J. Exp. Med. 164:1531 ), og CR1-18, et 252 bp Sau3AI fragment fra 0,5 kb EcoRI fragmentet til cDNA klon XH3.1 korresponderende med nukleotidene 101-352 i fig. 1. Under betingelser med høy stringenthet hybridiserer CR1-18 bare til cDNA kloner som enten koder for NHg-terminalt SCR til LHR-A eller signalpeptidet. Innskuddene til cDNA klonene ble sekvensert ved dideoksynukleotidteknikken (Sanger, F., et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463) etter subkloning av fragmentene inn i M13mpl8 og M13mpl9 (Yanisch-Perron, C. et al., 1985, Gene 28:351). The probes used for cDNA library screening were CR1-1 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 82:7711) (ATCC Accession No. 57331), CR-2 (Wong, W.W. , et al., supra), CR1-4 (Wong, W.W. et al., 1986, J. Exp. Med. 164:1531 ), and CR1-18, a 252 bp Sau3AI fragment from the 0.5 kb EcoRI fragment to cDNA clone XH3.1 corresponding to nucleotides 101-352 in fig. 1. Under high stringency conditions, CR1-18 hybridizes only to cDNA clones encoding either the NHg-terminal SCR of LHR-A or the signal peptide. The inserts of the cDNA clones were sequenced by the dideoxynucleotide technique (Sanger, F., et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463) after subcloning the fragments into M13mpl8 and M13mpl9 (Yanisch-Perron, C. et al. et al., 1985, Gene 28:351).

7.2. Resultater 7.2. Results

Et spesifikt primet Xgtll cDNA bibliotek, XHH, som inneholdt 7,5 x IO<5> rekombinanter ble preparert med cDNA syntetisert fra poly (A)<+> RNA fra DMSO induserte HL-60 celler. Disse cellene uttrykker bare F allotypen til CR1 (Lublin, D.M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736 ) som antas å ha fire LHR (Lapata, M.A., et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12:5707). Primeren, LK35.1, var en antisens 35-mer korresponderende med nukleotidene 896-930 til delvis cDNA sekvens til CR1 presentert i fig. 3. Dette oligonukleotidet ble vist å hybridisere til LHR-B, LHR-C og LHR-D under betingelser med revers transkripsjon. 250 positive kloner ble identifisert i en utplatning av 3,8 x 10^ uamplifisert rekombinant fag screenet med et blanding av CR1 cDNA prober, CRl-1 og CR1-4. 38 posistive kloner ble plukket og plaque-renset. Southern blots av EcoRI-spaltet DNA fra disse klonene ble screenet med 23-mer oligonukleotidet, KS23.1, 5'-CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG-3', korresponderende med nukleotidene 763-785 til delvis CR1 cDNA sekvensen i fig. 3. Denne proben hybridiserte under betingelser med høy stringenthet ved et enkelt sete i sekvensen kodende for LHR-B men ikke til sekvenser som koder for LHR-C eller LHR-D. Innskuddet til klon XH7.1 (fig. 9) inneholdt EcoRI fragmenter på 1,0 kb, 0,9 kb og 0,4 kb og to større fragmenter hybridiserte til KS23.1, som indikerer at denne klonen inneholdt sekvenser kodende for 3' 5/7 av LHR-A og hele LHR-B. Dette funnet bekreftet at LHR-A er meget homolog med LHR-B. Klon XH3,1 (fig. 9) inneholdt et enkelt KS23,l-positivt EcoRI fragment på 1,0 kb og et 5', 0,5 kb fragment som hybridiserte svakt med CR1-4 med høy stringenthet. Disse klonene ble antatt å inneholde den ytterligere 5' sekvensen som fullfører LHR-A, inkludert SCR-1 og -2 og 0,1 kb av sekvensen oppstrøms. Ingen av de gjenværende 36 klonene, som alle hybridiserte med CRl-1, ble detektert med proben, CR1-18, et 252 bp Sau3AI fragment fra 0,5 kb EcoRI fragmentet til klon XH3,1 som ikke hybridiserer til sekvenser kodende for LHR-B, -C eller -D. A specifically primed Xgtll cDNA library, XHH, containing 7.5 x 10<5> recombinants was prepared with cDNA synthesized from poly (A)<+> RNA from DMSO induced HL-60 cells. These cells express only the F allotype of CR1 (Lublin, D.M., et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5736 ) which is thought to have four LHR (Lapata, M.A., et al., 1984, Nucl. Acids Res 12:5707). The primer, LK35.1, was an antisense 35-mer corresponding to nucleotides 896-930 of the partial cDNA sequence of CR1 presented in fig. 3. This oligonucleotide was shown to hybridize to LHR-B, LHR-C and LHR-D under conditions of reverse transcription. 250 positive clones were identified in a plating of 3.8 x 10 3 unamplified recombinant phage screened with a mixture of CR1 cDNA probes, CR1-1 and CR1-4. 38 positive clones were picked and plaque purified. Southern blots of EcoRI-digested DNA from these clones were screened with the 23-mer oligonucleotide, KS23.1, 5'-CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG-3', corresponding to nucleotides 763-785 of the partial CR1 cDNA sequence in fig. 3. This probe hybridized under high stringency conditions at a single site in the sequence encoding LHR-B but not to sequences encoding LHR-C or LHR-D. The insert of clone XH7.1 (Fig. 9) contained EcoRI fragments of 1.0 kb, 0.9 kb and 0.4 kb and two larger fragments hybridized to KS23.1, indicating that this clone contained sequences encoding the 3' 5/7 of LHR-A and all of LHR-B. This finding confirmed that LHR-A is highly homologous to LHR-B. Clone XH3.1 (Fig. 9) contained a single KS23.1-positive EcoRI fragment of 1.0 kb and a 5', 0.5 kb fragment that hybridized weakly with high stringency CR1-4. These clones were thought to contain the additional 5' sequence that completes LHR-A, including SCR-1 and -2 and 0.1 kb of the upstream sequence. None of the remaining 36 clones, all of which hybridized with CR1-1, was detected with the probe, CR1-18, a 252 bp Sau3AI fragment from the 0.5 kb EcoRI fragment of clone XH3.1 that does not hybridize to sequences encoding LHR- B, -C or -D.

DNA sekvensanalyse av XH3,1 viste at den åpne leserammen fortsatte mot 5'-enden av cDNA og dette indikerer at klonen ikke rakk til translasjonsstartsetet. cDNA bibliotekene, XHH og XS2T, ble derfor på ny screenet med probe CR1-18 for å identifisere en klon fra hver av hhv. XH10.3 og XT109.1. EcoRI fragmentene til disse klonene som hybridiserte med CR1-18 ble sekvensert og dette ble også innskuddene fra klonene, XH3.1 og XH7.1. Hele sekvensen er presentert i fig. 1 slik at nukleotidet etter nr. 1531 i fig. 1 er nukleotid nr. 1 i fig. 3. Overlappende sekvenser til cDNA klonene til HL-60 og mandelbibliotekene er identiske. DNA sequence analysis of XH3.1 showed that the open reading frame continued towards the 5' end of the cDNA and this indicates that the clone did not reach the translation start site. The cDNA libraries, XHH and XS2T, were therefore screened again with probe CR1-18 to identify a clone from each of the respective XH10.3 and XT109.1. The EcoRI fragments of these clones that hybridized with CR1-18 were sequenced and so were the inserts from the clones, XH3.1 and XH7.1. The entire sequence is presented in fig. 1 so that the nucleotide after no. 1531 in fig. 1 is nucleotide no. 1 in fig. 3. Overlapping sequences of the cDNA clones of HL-60 and the almond libraries are identical.

Rett oppstrøms for LHR-A inneholder klonene XH10,3 og XT109.1 identiske antatte hydrofobe ledersekvenser (Von Heijne, G. , 1986, Nucl. Acids Res. 14:4683) kodende for 41 aminosyrer, inkludert en ATG som matcher konsensus NNA/GNNATGG foreslått for eukaryote translasjonsinitieringssete (fig. 10) (Kozak, M. , 1986, Cell 44:283). En annen ATG, beliggende seks kodoner oppstrøms for valgte ATG og like nedstrøms for et i-leseramme stoppkodon, er en dårlig match for denne konsensussekvensen. De første tre aminosyrene til denne ledersekvensen for CR1, MGA, er de samme som de som er angitt for CR2. Sekvensene til disse to klonene divergerer oppstrøms for ATG og den fra klon X10,3 er antatt å representere en del av en mellomliggende sekvens, som beskrevet for andre CR1 cDNA kloner i seksjon 6, ovenfor. Immediately upstream of LHR-A, clones XH10,3 and XT109.1 contain identical putative hydrophobic leader sequences (Von Heijne, G. , 1986, Nucl. Acids Res. 14:4683) encoding 41 amino acids, including an ATG that matches the consensus NNA/ GNNATGG proposed for eukaryotic translation initiation site (Fig. 10) (Kozak, M., 1986, Cell 44:283). Another ATG, located six codons upstream of the selected ATG and just downstream of an in-reading frame stop codon, is a poor match for this consensus sequence. The first three amino acids of this leader sequence for CR1, MGA, are the same as those indicated for CR2. The sequences of these two clones diverge upstream of the ATG and that of clone X10.3 is thought to represent part of an intervening sequence, as described for other CR1 cDNA clones in section 6, above.

Signalpeptidasespaltningen er antatt (Von Heijne, G. , 1986, Nucl. Acids Res. 14:4683) å oppstå mellom glycin-46 og glutamin-47, som foreslår at den blokkerte NHg-terminale enden av CR1 (V/ong, W.W. , et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303; Holeis, V.M., et al., 1986, Complement 3:63) kan være forårsaket av tilstedeværelse av et pyrrolidonamid. De første to SCR av NHg-terminal LHR-A innbefattet i disse klonene er bare 61$ identisk med den korresponderende regionen til LHR-B, mens SCR 3-7 til LHR-A er 99$ identisk med korresponderende SCR til LHR-B (fig. 10). Sammenligning av LHR-A med LHR-C viser at bare tredje og fjerde SCR av hver er sterkt homologe (99$ identisk). LHR-A og -D har bare 68$ helhetlig identitet, med maksimal identitet på 81$ mellom de seks SCR til hver LHR. Fullføring av 5' cDNA sekvensen til CR1 tyder på at F allotypen består av 2039 aminosyrer inkludert et 41 aminosyresignalpeptid, fire LHR til syv. SCR hver, to ytterligere COOH-terminale SCR, en 25 rest transmembranregion og en 43 aminosyre cytoplasmadomene. Det er 25 potensielle N-bundede glykosyleringsseter. The signal peptidase cleavage is thought (Von Heijne, G. , 1986, Nucl. Acids Res. 14:4683) to occur between glycine-46 and glutamine-47, suggesting that the blocked NHg-terminal end of CR1 (V/ong, W.W. , et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303; Holeis, V. M., et al., 1986, Complement 3:63) may be caused by the presence of a pyrrolidonamide. The first two SCRs of NHg-terminal LHR-A included in these clones are only 61$ identical to the corresponding region of LHR-B, while SCRs 3-7 of LHR-A are 99$ identical to the corresponding SCRs of LHR-B ( Fig. 10). Comparison of LHR-A with LHR-C shows that only the third and fourth SCRs of each are highly homologous (99$ identical). LHR-A and -D have only 68$ overall identity, with a maximum identity of 81$ between the six SCRs of each LHR. Completion of the 5' cDNA sequence of CR1 suggests that the F allotype consists of 2039 amino acids including a 41 amino acid signal peptide, four LHR to seven. SCRs each, two additional COOH-terminal SCRs, a 25 residue transmembrane region, and a 43 amino acid cytoplasmic domain. There are 25 potential N-linked glycosylation sites.

7.3. Diskusjon 7.3. Discussion

Den primære strukturen til den NHg-terminale enden og signalpeptidet til F allotypen til CR1 er blitt avledet ved isolasjon og sekvensering av 5' cDNA klonene. Den sterkt repeterende naturen til CR1 sekvensen gjorde utvikling av en hensiktsmessig strategi for preparering og identifisering av cDNA klonene som koder for denne regionen av reseptoren meget kritisk. Et cDNA bibliotek ble preparert ved anvendelse som en primer et 35-mer oligonukleotid kjent for å hybridisere under betingelser med revers transkripsjon til LHR-B, -C og -C; og den muligheten ble betraktet at denne primeren også kan hybridisere til LHR-A som var blitt antatt å være meget homolog med LHR-B (se seksjon 6 ovenfor). Hensiktsmessige cDNA kloner ble identifisert ved anvendelse av et annet oligonukleotid, KS23.1, som bare hybridiserer til LHR-B under stringente betingelser, og derved øker sansynligheten for å finne 5' cDNA kloner. To kloner ble funnet som omfatter nesten hele gjenværende sekvens av CR1, og et Sau3AI fragment av et av disse, CR1-18, hadde sekvens som var tilstrekkelig unik for å tillate anvendelsen derav ved identifikasjon av gjenværende 5' kloner (figurene 9, 10). The primary structure of the NHg-terminal end and the signal peptide of the F allotype of CR1 have been derived by isolation and sequencing of the 5' cDNA clones. The highly repetitive nature of the CR1 sequence made the development of an appropriate strategy for the preparation and identification of the cDNA clones encoding this region of the receptor very critical. A cDNA library was prepared using as a primer a 35-mer oligonucleotide known to hybridize under conditions of reverse transcription to LHR-B, -C and -C; and the possibility was considered that this primer might also hybridize to LHR-A which had been thought to be highly homologous to LHR-B (see section 6 above). Appropriate cDNA clones were identified using another oligonucleotide, KS23.1, which only hybridizes to LHR-B under stringent conditions, thereby increasing the likelihood of finding 5' cDNA clones. Two clones were found comprising almost the entire residual sequence of CR1, and a Sau3AI fragment of one of these, CR1-18, had sequence sufficiently unique to permit its use in the identification of residual 5' clones (Figures 9, 10) .

En 250 bp probe fra 5' regionen av LHR-A, CR1-18, hybridiserte ikke bare til CR1 transkripter på 7,9 og 9,2 kb, men også til et 2 kb transkript i humant mandel RNA under stringente betingelser. Dette kryss-hybridiserende mRNA ble ikke observert med CR1 cDNA prober fra andre LHR eller i Northern blotter av RNA fra dimentylsulfoksid-induserte HL-60 celler og HSB-2 T lymfoblastoide celler. CR1 inneholder dermed sekvenser som er homologe med to ytterligere B celleproteiner, et som blir kodet av dette nylig oppdagede mRNA og CR2. A 250 bp probe from the 5' region of LHR-A, CR1-18, hybridized not only to CR1 transcripts of 7.9 and 9.2 kb, but also to a 2 kb transcript in human tonsil RNA under stringent conditions. This cross-hybridizing mRNA was not observed with CR1 cDNA probes from other LHR or in Northern blots of RNA from dimentyl sulfoxide-induced HL-60 cells and HSB-2 T lymphoblastoid cells. CR1 thus contains sequences homologous to two further B cell proteins, one encoded by this newly discovered mRNA and CR2.

8. EKSPRESSJON AV REKOMBINANT HUMANT CR1 8. EXPRESSION OF RECOMBINANT HUMAN CR1

Som beskrevet ovenfor, er humane CR1 cDNA kloner blitt isolert som dekker 7,0 kb og inneholder en åpen leseramme kodende for 2039 aminosyrer (fig. 1). Den forslåtte forløper-formen av reseptoren omfatter et 41 aminosyresignalpeptid, fire lange homologe gjentagelser (LHR) på 450 aminosyrer der hver LHR omfatter 7 korte konsensusgjentagelser (SCR), to COOH-terminale SCR på 65 aminosyrer, en 25 aminosyretransmem-brandomene og en 43 aminosyre cytoplasmaregion. CR1 F allotypen inneholder dermed 30 SCR. NH2~terminal LHR, LHR-A (se seksjon 7, nedenfor), er 61$ identisk med tilsvarende region til LHR-B i første to SCR og 99$ identisk i COOH-terminale fem SCR. Restriksjonsfragmenter av åtte CR1 cDNA kloner ble spleiset for å danne en fullengdekonstruksjon på 6,9 kb og plassert nedstrøms for en musemetallotioninpromoter eller en cytomegaloviruspromoter, og transfektert inn i L (muse) celler eller COS (ape) celler. Rekombinant celle-overflate CR1 ble detektert ved indirekte radioimmunoanalyse og immunofluorescens. Ikke noe antigen ble detektert på celler transfektert med bare parental vektor (CR1~). Immunopresipitasjon av transfekterte, overflate <12>^I-merkede, COS (ape) celler ved anti-CRl monoklonalt antistoff, og analyse ved ikke-reduserende natriumdodecylsulfat (SDS) polyakrylamidgelelektroforese, ga 190,000 dalton molekyl-vektbånd som migrerte sammen med F allotypen fra humane erytrocytter. Ekspressjon av rekombinant CR1 antigen med riktig molekylvekt (Klickstein, L.B., et al., 1988, FASEB J. 2:A1833) tyder på at cDNA inneholder hele kodende sekvens til humant CR1. As described above, human CR1 cDNA clones have been isolated that span 7.0 kb and contain an open reading frame encoding 2039 amino acids (Fig. 1). The folded precursor form of the receptor comprises a 41 amino acid signal peptide, four long homologous repeats (LHRs) of 450 amino acids where each LHR comprises 7 short consensus repeats (SCRs), two COOH-terminal SCRs of 65 amino acids, a 25 amino acid transmembrane domain and a 43 amino acid cytoplasmic region. The CR1 F allotype thus contains 30 SCR. The NH2~terminal LHR, LHR-A (see Section 7, below), is 61$ identical to the corresponding region of LHR-B in the first two SCRs and 99$ identical in the COOH-terminal five SCRs. Restriction fragments of eight CR1 cDNA clones were spliced to form a full-length construct of 6.9 kb and placed downstream of a mouse metallothionein promoter or a cytomegalovirus promoter, and transfected into L (mouse) cells or COS (monkey) cells. Recombinant cell surface CR1 was detected by indirect radioimmunoassay and immunofluorescence. No antigen was detected on cells transfected with only parental vector (CR1~). Immunoprecipitation of transfected, surface <12>^I-labeled, COS (monkey) cells by anti-CR1 monoclonal antibody, and analysis by non-reducing sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis, gave a 190,000 dalton molecular-weight band that migrated with the F allotype from human erythrocytes. Expression of recombinant CR1 antigen with the correct molecular weight (Klickstein, L.B., et al., 1988, FASEB J. 2:A1833) suggests that the cDNA contains the entire coding sequence of human CR1.

8.1. Konstruksjon av plasmid pBSABCD. inneholdende hele CR1 kodende sekvensen 8.1. Construction of plasmid pBSABCD. containing the entire CR1 coding sequence

Vi beskriver heri konstruksjon av plasmid pBSABCD, en vektor som koder for fullengde (SCR 1-30) CR1 protein. Here we describe the construction of plasmid pBSABCD, a vector that codes for full-length (SCR 1-30) CR1 protein.

2,3 kb innskuddet fra cDNA klon XT8,2 (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; se seksjon 6, ovenfor) ble subklonet inn i pUC18 som et EcoRI fragment, slik at 5' enden var proksimalt for Hindlll setet i plasmidpolylinkeren. Dette plasmidet ble betegnet pl88,2. pl88,2 ble kuttet med Apal og Hindlll, og det store 4,7 kb fragmentet inneholdende CR1 sekvensen fra SCR 26 gjennom 3' utranslaterte regionen pluss vektorsekvensene ble gelrenset. The 2.3 kb insert from cDNA clone XT8.2 (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; see section 6, above) was subcloned into pUC18 as an EcoRI fragment, so that The 5' end was proximal to the HindIII site in the plasmid polylinker. This plasmid was designated p188.2. pI88.2 was cut with ApaI and HindIII, and the large 4.7 kb fragment containing the CR1 sequence from SCR 26 through the 3' untranslated region plus the vector sequences was gel purified.

Innskuddet fra cDNA klon XT50,1 (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; se seksjon 6, ovenfor) ble subklonet som et EcoRI fragment inn i M13mpl8. Denne f agen ble betegnet 18R50.1. DNA fra replikativ form av denne klonen ble kuttet med Hindlll og Apal, og 1,45 kb fragmentet inneholdende CR1 SCR 18-25 ble isolert, ligert til 4,7 kb fragmenter fra pl88,2, og ligeringen transformert inn i E. coli DH5a. Dette plasmidet ble betegnet p8.250.1. The insert from cDNA clone XT50.1 (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; see section 6, above) was subcloned as an EcoRI fragment into M13mpl8. This phase was designated 18R50.1. DNA from the replicative form of this clone was cut with HindIII and ApaI, and the 1.45 kb fragment containing CR1 SCR 18-25 was isolated, ligated to 4.7 kb fragments from p188.2, and the ligation transformed into E. coli DH5a . This plasmid was designated p8.250.1.

0,75 kb og 0,93 kb EcoRI fragmentene fra cDNA klon XT8,3 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 22:7711) ble subklonet inn i plasmid pBR327. Disse subklonene ble betegnet pCRl-1 og pCRl-2, respektivt, og inneholdt hhv. SCR 11-14 og SCR 17-21. EcoRI innskuddene ble renset fra hverandre. 0,75 kb pCRl-1 fragmentet ble spaltet med Smal, og spaltingen ble ligert til pUC18 DNA spaltet med EcoRI og Smal. En subklon, pl81-l.l, med 0,5 kb innskudd korresponderende med SCR 12-14, ble isolert. 0,93 kb fragmentet til pCRl-2 ble spaltet med Hindlll, og ligert til pUC19 spaltet med EcoRI og Hindlll, og en subklone pl91-2.1, ble isolert som inneholdt et 0,27 kb innskudd inneholdende SCR 17. The 0.75 kb and 0.93 kb EcoRI fragments from cDNA clone XT8.3 (Wong, W.W., et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 22:7711) were subcloned into plasmid pBR327. These subclones were designated pCR1-1 and pCR1-2, respectively, and contained respectively SCR 11-14 and SCR 17-21. The EcoRI deposits were purified from each other. The 0.75 kb pCR1-1 fragment was digested with SmaI, and the digest was ligated to pUC18 DNA digested with EcoRI and SmaI. A subclone, p181-1.1, with a 0.5 kb insert corresponding to SCR 12-14, was isolated. The 0.93 kb fragment of pCR1-2 was digested with HindIII, and ligated into pUC19 digested with EcoRI and HindIII, and a subclone p191-2.1 was isolated containing a 0.27 kb insert containing SCR 17.

cDNA klon XT6.1 (se seksjon 6, ovenfor; Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; Wong, W.W., et al., 1987, J. Exp. Med. 164:1531 ) ble spaltet med EcoRI, og 0,37 kb fragmentet korresponderende med CR1 SCR 15 og 16 ble subklonet inn i pBR322. Denne klonene ble betegnet pCRl-4. Klon pl81-l.l ble spaltet med EcoRI og Seal, og 1,4 kb fragmentet ble isolert. Klon pl91-2.1 (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; se seksjon 6, ovenfor) ble spaltet med EcoRI og Seal og 2,0 kb fragmentene ble isolert, ligert til 1,4 kb fragmentet fra pl81-l.l, og blandingen ble transformert inn i E. coli DH5cx. Det resulterende plasmidet ble betegnet pl-11-2. Plasmid pl-11-2 ble spaltet med EcoRI, og 0,37 kb innskuddsfragment fra pCRl-4 ble skutt inn ved ligering. Det resulterende plasmidet ble anvendt for å transformere E. coli DH5cx. cDNA clone XT6.1 (see section 6, above; Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; Wong, W.W., et al., 1987, J. Exp. Med. 164: 1531 ) was digested with EcoRI, and the 0.37 kb fragment corresponding to CR1 SCR 15 and 16 was subcloned into pBR322. This clone was designated pCR1-4. Clone p181-1.1 was digested with EcoRI and Seal, and the 1.4 kb fragment was isolated. Clone pl91-2.1 (Klickstein, L.B., et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1095; see Section 6, above) was digested with EcoRI and Seal and the 2.0 kb fragments were isolated, ligated to 1, 4 kb fragment from p181-1.1, and the mixture was transformed into E. coli DH5cx. The resulting plasmid was designated pl-11-2. Plasmid p1-11-2 was digested with EcoRI, and a 0.37 kb insert fragment from pCR1-4 was inserted by ligation. The resulting plasmid was used to transform E. coli DH5cx.

En subklon ble valgt som inneholdt et 0,39 kb BamHI-Hindlll fragment. Dette plasmidet ble betegnet pl42 og inneholdt CR1 SCR 12-17. 3,5 kb EcoRI-Hindlll innskuddsfragmentet fra p8.250.1 ble overført til pGEM3b. Dette plasmidet ble betegnet pG8.250.1. 1,2 Hindlll fragmenter fra pl42 ble renset og ligert til pG8.250.1 som var blitt kuttet med Hindlll. En subklon ble valgt som inneholdt et 2,4 kb Pstl-Apal innskudd, med dermed selektering av riktig orientering. Dette plasmidet ble betegnet pCD og inneholdt CR1 sekvenser fra SCR 12 til og med 3' enden. A subclone was selected which contained a 0.39 kb BamHI-HindIII fragment. This plasmid was designated p142 and contained CR1 SCR 12-17. The 3.5 kb EcoRI-HindIII insert fragment from p8.250.1 was transferred into pGEM3b. This plasmid was designated pG8.250.1. 1,2 HindIII fragments from p142 were purified and ligated into pG8.250.1 which had been cut with HindIII. A subclone was selected that contained a 2.4 kb Pstl-ApaI insert, thereby selecting the correct orientation. This plasmid was designated pCD and contained CR1 sequences from SCR 12 up to and including the 3' end.

cDNA klon \5'7.1 (Klickstein, L.B., et al., Sept. 1987, Complement 4:180; se seksjon 7, ovenfor) ble kuttet med Pstl , og 1,35 kb fragmentet tilsvarende SCR 6-12 ble isolert og ligert til Pst-I kuttet pCD. Blandingen ble transformert, og en subklon ble selektert som inneholdt 1,35 kb og 1,1 kb Hindlll fragmenter. Denne klonen ble betegnet pBCD. cDNA clone \5'7.1 (Klickstein, L.B., et al., Sept. 1987, Complement 4:180; see section 7, above) was cut with Pstl, and the 1.35 kb fragment corresponding to SCR 6-12 was isolated and ligated to Pst-I cut pCD. The mixture was transformed and a subclone was selected containing 1.35 kb and 1.1 kb HindIII fragments. This clone was designated pBCD.

cDNA klon X5'3.1 (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; se seksjon 7, ovenfor) ble kuttet med EcoRI og spaltningen ble ligert til EcoRI-kuttet pUC18. En subklon, cDNA clone X5'3.1 (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; see section 7, above) was cut with EcoRI and the digest ligated into EcoRI-cut pUC18. A subclone,

p3.11-l, ble isolert, som inneholdt et 1,0 kb innskudd tilsvarende SCR 3-7, der innskuddet ble gelrenset. cDNA klon X5'10.3 (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; se seksjon 7, ovenfor) ble spaltet med EcoRI, og 0,63 kb innskuddet inneholdende SCR 1 og 2 ble subklonet inn i pUC18. Denne klonen ble betegnet pl0.3.5. Plasmid plO.3.5 ble delvis spaltet med EcoRI, og et 3,4 kb fragment tilsvarende lineært plasmid ble isolert og ligert med 1 kb fragmentet fra p3.11-1. En subklon, pLA, ble plukket, som inneholdt et 1,3 kb Pst-I fragment, i riktig innskuddssted og orientering. p3.11-1, was isolated, which contained a 1.0 kb insert corresponding to SCR 3-7, where the insert was gel purified. cDNA clone X5'10.3 (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; see section 7, above) was digested with EcoRI, and the 0.63 kb insert containing SCR 1 and 2 was subcloned into pUC18. This clone was designated pl0.3.5. Plasmid p10.3.5 was partially digested with EcoRI, and a 3.4 kb fragment corresponding to the linear plasmid was isolated and ligated with the 1 kb fragment from p3.11-1. A subclone, pLA, was picked, which contained a 1.3 kb Pst-I fragment in the correct insertion site and orientation.

cDNA klon XT109.4 (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; se seksjon 7, ovenfor) ble spaltet med EcoRI, og subklonet inn i pUC18. En subklon ble valgt som inneholdt et 0,55 kb EcoRI fragment korresponderende til 5' utranslaterte regionen gjennom ledersekvensen og SCR 1 og 2. Plasmid pl09.4 ble spaltet med Pstl og BspMII, og et 3,0 kb fragment inneholdende vektor, ledersekvens og SCR 1, ble isolert. Fragmenter ble ligert til et 0,81 kb Pstl-BspMII fragment fra pLA som inneholdt SCR 2-5. Dette nye plasmidet ble betegnet pNLA. Plasmid pNLA ble delvis spaltet med EcoRI og fullstendig spaltet med Pstl, og et 1,1 kb EcoRI-PstI fragment inneholdende CR1 sekvensen fra ledersekvensen gjennom SCR 5 ble isolert og ligert til pBluescript KS+ (Stratagene, San Diego, CA) for å kutte et Xhol sete på 5' siden av cDNA. Dette plasmidet ble betegnet pXLA. cDNA clone XT109.4 (Klickstein, L.B., et al., 1987, Complement 4:180; see section 7, above) was digested with EcoRI, and subcloned into pUC18. A subclone was selected containing a 0.55 kb EcoRI fragment corresponding to the 5' untranslated region through the leader sequence and SCR 1 and 2. Plasmid p109.4 was cleaved with Pstl and BspMII, and a 3.0 kb fragment containing vector, leader sequence and SCR 1, was isolated. Fragments were ligated to a 0.81 kb Pstl-BspMII fragment from pLA containing SCR 2-5. This new plasmid was designated pNLA. Plasmid pNLA was partially digested with EcoRI and completely digested with PstI, and a 1.1 kb EcoRI-PstI fragment containing the CR1 sequence from the leader sequence through SCR 5 was isolated and ligated into pBluescript KS+ (Stratagene, San Diego, CA) to cut a XhoI site on the 5' side of the cDNA. This plasmid was designated pXLA.

Plasmid pBCD ble spaltet med EcoRV og deretter delvis spaltet med Pstl, og et 6,0 kb Pstl-EcoRV fragment inneholdende CR1 sekvensen fra SCR 6 gjennom 3' utranslaterte regionen ble isolert og ligert til Pstl + Smal-spaltet pXLA. Det resulterende bakterielle ekspressjonsplasmidet, som inneholder hele CR1 cDNA kodende sekvensen ble betegnet pBSABCD. Plasmid pBCD was cleaved with EcoRV and then partially cleaved with Pstl, and a 6.0 kb Pstl-EcoRV fragment containing the CR1 sequence from SCR 6 through the 3' untranslated region was isolated and ligated into Pstl + Smal cleaved pXLA. The resulting bacterial expression plasmid, containing the entire CR1 cDNA coding sequence was designated pBSABCD.

8.2. Konstruksjon og analyse av plasmid piABCD. en patte-dvrekspress. ionsvektor inneholdende hele CR1 kodende sekvens 8.2. Construction and analysis of plasmid piABCD. a teat expresser. ion vector containing the entire CR1 coding sequence

pBSABCD plasmid ble spaltet med Xhol og Noti, og innskuddet ble ligert nedstrøms fra CMV promoteren i 4.4 kb fragmentet til ekspressjonsvektor CDM8 (Seed, B., 1987, Nature 329:840-842), som også var blitt kuttet med disse restriksjonsen-zymene. Den resulterende konstruksjonen ble betegnet piABCD (fig. 11). Alternativt ble 6,9 kb Xhol-Notl fragmentet ligert nedstrøms fra metallotioneinpromoteren i ekspressjonsvektor, pMT.neol, som også var blitt spaltet med disse restriksjons-enzymene. Den resulterende konstruksjonen ble betegnet pMTABCD (fig. 11). The pBSABCD plasmid was digested with XhoI and Noti, and the insert was ligated downstream of the CMV promoter in the 4.4 kb fragment of expression vector CDM8 (Seed, B., 1987, Nature 329:840-842), which had also been cut with these restriction enzymes . The resulting construct was designated piABCD (Fig. 11). Alternatively, the 6.9 kb XhoI-NotI fragment was ligated downstream from the metallothionein promoter in the expression vector, pMT.neol, which had also been digested with these restriction enzymes. The resulting construct was designated pMTABCD (Fig. 11).

Saueerytrocytter sensibilisert med kaninantistoff (EA) og begrensende mengder C4b [EAC4b(lim)] og 12,000 cpm <125>I-C3b pr. celle [EAcC4b(lim),3b] ble preparert ved sekvensiell behandling av EAC4b(lim) (Diamedix) med Cl, C2 og <125>I-C3 etterfulgt av inkubasjon i 60 minutter ved 37°C i gelatin veronal-buffret saltvann inneholdende 40 mM EDTA. Alternativt ble metylamin-behandlet C3 [C3(ma)] kovalentlig knyttet til saue E (erytrocytter) behandlet med 3-(2-pyridylditio)pro-pionsyre N-hydroksysuksinimidester (Sigma) (Lambris, J.D., et al., 1983, J. Immunol. Methods 65:277). EAC4b ble preparert med renset C4 (Hammer, C.H., et al., 1981, J. Biol. Chem. 265 :3995 ). Sheep erythrocytes sensitized with rabbit antibody (EA) and limiting amounts of C4b [EAC4b(lim)] and 12,000 cpm <125>I-C3b per cell [EAcC4b(lim),3b] was prepared by sequential treatment of EAC4b(lim) (Diamedix) with Cl, C2 and <125>I-C3 followed by incubation for 60 min at 37°C in gelatin veronal-buffered saline containing 40 mM EDTA. Alternatively, methylamine-treated C3 [C3(ma)] covalently linked to sheep E (erythrocytes) was treated with 3-(2-pyridyldithio)propionic acid N-hydroxysuccinimide ester (Sigma) (Lambris, J.D., et al., 1983, J . Immunol. Methods 65:277). EAC4b was prepared with purified C4 (Hammer, C.H., et al., 1981, J. Biol. Chem. 265:3995).

Både piABCD og pMTABCD ble transfektert ved DEAE (dietyl-aminoetyl)-dekstran fremgangsmåten inn i COS (ape) celler. Rekombinant CR1 ble detektert på overflaten av transfekterte celler ved immunofluorescens ved anvendelse av anti-CRl monoklonalt antistoff, YZ-1; og ved immunpresipitasjon av <l25>I-merkede celler etterfulgt av ikke-reduserende SDS-PAGE, som viste et protein med en mobilitet identisk med den til CR1 immunopresipitert fra humane erytrocytter til en donor som er homozygod for F allotypen (Wong, W.W. , et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685), og ved dannelsen av rosetter med saueerytrocytter belagt med C3b (Fearon, D.T., 1980, J. Exp. Med. 152:20). Identiske elektroforetiske mobiliteter til native og rekombinante CR1 proteiner bekreftet at CR1 F allotypen inneholder SCR 1-30. Both piABCD and pMTABCD were transfected by the DEAE (diethyl-aminoethyl)-dextran method into COS (monkey) cells. Recombinant CR1 was detected on the surface of transfected cells by immunofluorescence using anti-CR1 monoclonal antibody, YZ-1; and by immunoprecipitation of <l25>I-labeled cells followed by non-reducing SDS-PAGE, which showed a protein with a mobility identical to that of CR1 immunoprecipitated from human erythrocytes of a donor homozygous for the F allotype (Wong, W.W. , et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685), and by the formation of rosettes with sheep erythrocytes coated with C3b (Fearon, D.T., 1980, J. Exp. Med. 152:20). Identical electrophoretic mobilities of native and recombinant CR1 proteins confirmed that the CR1 F allotype contains SCR 1-30.

I tillegg ble murine L celler ko-transfektert ved DEAE-dekstranmetoden (Ausubel, F.M., et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Seidman, J.G. og Struhl, K. , eds., John V/iley & Sons, New York; Seed, B., 1987, Nature 329:840) i duplikat med 0, 2 eller 4 ug av enten piABCD eller pMTABCD og 2 ug pXGE5, et reporterplasmid som leder ekspressjon av veksthormon (Seiden, R.F., et al., 1986, Mol.Cell. Biol. 6:3173). Cellene ble høstet etter to dager og analysert for ekspressjon av CR1 ved binding av YZ1 monoklonalt anti-CRl antistoff. Det var et doseresponsforhold mellom rekombinant plasmid DNA og ekspressjon av CR1 antigen (tabell II). In addition, murine L cells were co-transfected by the DEAE-dextran method (Ausubel, F.M., et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Seidman, J.G. and Struhl, K. , eds., John Williams & Sons, New York; Seed, B., 1987, Nature 329:840) in duplicate with 0, 2 or 4 µg of either piABCD or pMTABCD and 2 µg of pXGE5, a reporter plasmid that directs expression of growth hormone (Seiden, R.F., et al., 1986 , Mol. Cell. Biol. 6:3173). The cells were harvested after two days and analyzed for expression of CR1 by binding of YZ1 monoclonal anti-CR1 antibody. There was a dose-response relationship between recombinant plasmid DNA and expression of CR1 antigen (Table II).

(Changelian, P.S., et al., 1985, J. Immunol. 134:1851). Cellene ble vasket og resuspendert i 0,1 ml buffer inneholdende 1-2 uCi/ml 12<5>I-F(ab')2 geite-antimuse IgG eller 125l-protein A. Etter 1-2 timer ved 0°C ble cellene vasket og analysert for 12^I. (Changelian, P.S., et al., 1985, J. Immunol. 134:1851). The cells were washed and resuspended in 0.1 ml buffer containing 1-2 uCi/ml 12<5>I-F(ab')2 goat anti-mouse IgG or 125l protein A. After 1-2 hours at 0°C, the cells were washed and analyzed for 12^I.

Plasmid, piABCD, ledet ekspressjon av neste tre-ganger mere CR1 antigen enn pMTABCD. Veksthormonkonsentrasjonen i kulturmediet varierte med mindre enn to-ganger med unntagelse av plate 5. Ytterligere eksperimenter viste at piABCD ledet den transiente ekspressjonen av tre-ganger mere CR1 antigen i COS celler enn i L-cellene. Plasmid, piABCD, directed expression of next three times more CR1 antigen than pMTABCD. The growth hormone concentration in the culture medium varied by less than two-fold with the exception of plate 5. Further experiments showed that piABCD directed the transient expression of three-fold more CR1 antigen in COS cells than in the L cells.

CR1 antigenet var tilstede i clustere på overflaten av transfekterte COS celler ifølge vurdering ved indirekte immunofluorecens av celler farget med YZ1 anti-CRl mAB (fig. 12). Denne distribusjonen av rekombinant CR1 på COS celler ligner en til vildtype CR1 på humane leukocytter (Fearon et al., 1981, J. Exp. Med. 153:1615). The CR1 antigen was present in clusters on the surface of transfected COS cells as assessed by indirect immunofluorescence of cells stained with YZ1 anti-CR1 mAb (Fig. 12). This distribution of recombinant CR1 on COS cells is similar to that of wild-type CR1 on human leukocytes (Fearon et al., 1981, J. Exp. Med. 153:1615).

Molekylvekten til rekombinant CR1 ble bestemt ved over-flatejodinering av COS celler transfektert med piABCD, immunopresipitasjon av cellelysater med Sepharose-YZl, SDS-PAGE og autoradiografi. Rekombinant CR1 hadde en molekylvekt på 190,000 uredusert, som er ekvivalent med den til F allotypen og mindre enn den til S allotypen til erytrocytt CR1 (fig. 14). The molecular weight of recombinant CR1 was determined by surface iodination of COS cells transfected with piABCD, immunoprecipitation of cell lysates with Sepharose-YZ1, SDS-PAGE and autoradiography. Recombinant CR1 had a molecular weight of 190,000 unreduced, which is equivalent to that of the F allotype and less than that of the S allotype of erythrocyte CR1 (Fig. 14).

C3b-binding og C4b-bindingsfunksjonen til rekombinant til CR1 ble analysert ved dannelsen av rosetter mellom transfekterte COS celler og EAC4b eller EAC4b(1 im),3b. I 31 separate transfeksjoner bandt 5-50$ av COS cellene transfektert med plasmid, piABCD, fem eller mere EAC4b eller EAC4b(lim),3b (fig. 13). COS celler som uttrykker CR1 dannet ikke rosetter med EAC4b(lim) ,3bi, til tross for at dette intermediatet dannet rosetter med Raj i B lymfoblastoidceller som uttrykker CR2 . C3b-binding and the C4b-binding function of recombinant to CR1 were analyzed by the formation of rosettes between transfected COS cells and EAC4b or EAC4b(1 µm),3b. In 31 separate transfections, 5-50% of the COS cells transfected with plasmid, piABCD, bound five or more EAC4b or EAC4b(lim),3b (Fig. 13). COS cells expressing CR1 did not form rosettes with EAC4b(lim) ,3bi, despite this intermediate forming rosettes with Raj in B lymphoblastoid cells expressing CR2.

8.3. Ekspresjon av CR1 fragmenter 8.3. Expression of CR1 fragments

Ekspresjonsvektorer som koder for del av CR1 kodende sekvens (delsjonsmutanter) ble konstruert som beskrevet nedenfor, og vist å uttrykke deres respektive CR1 innskudd når transformert inn i COS celler. CR1 fragmentene ble uttrykt som celle-overflateproteiner. Expression vectors encoding part of the CR1 coding sequence (deletion mutants) were constructed as described below, and shown to express their respective CR1 inserts when transformed into COS cells. The CR1 fragments were expressed as cell surface proteins.

8.3.1. Konstruksjon av delesjonsmutantene piBCD. piABD.8.3.1. Construction of the piBCD deletion mutants. piABD.

piACD. piAD. piBD. piCD og piD piACD. piAD. piBD. piCD and piD

Konstruksjon av disse delesjonsmutantene ble utført ved å trekke fordel av tilstedeværelsen av et enkelt Bsml sete i en homolog posisjon nære amino-terminus til hver av de fire CR1 lange homologe gjentagelsene (LHR), og fravær av Bsml seter ellers i CR1 cDNA og Bluescriptvektor (Stratagene, San Diego, Construction of these deletion mutants was performed by taking advantage of the presence of a single Bsml site in a homologous position near the amino terminus of each of the four CR1 long homologous repeats (LHR), and the absence of Bsml sites otherwise in the CR1 cDNA and Bluescript vector ( Stratagene, San Diego,

CA). ABOUT).

10 jjg av plasmid pbSABCD ble delvis spaltet med 50 enheter restriksjonsenzym Bsml i 45 minutter, og spaltningen ble fraksjonert ved agarosegelelektroforese. DNA fragmenter på 8,55 kb, 7,20 kb og 5,85 kb ble renset, tilsvarende lineære segmenter av foreldreplasmidet som mangler 1, 2 eller 3 LHR, respektiv. Hver av de tre fragmentene ble ligert til seg selv og legeringene ble anvendt separat for å transformere kompetente E. coli DH5a til ampicillinresistens. 10 µg of plasmid pbSABCD was partially digested with 50 units of restriction enzyme Bsml for 45 minutes, and the digestion was fractionated by agarose gel electrophoresis. DNA fragments of 8.55 kb, 7.20 kb and 5.85 kb were purified, corresponding to linear segments of the parental plasmid lacking 1, 2 or 3 LHR, respectively. Each of the three fragments was ligated to itself and the ligations were used separately to transform competent E. coli DH5α to ampicillin resistance.

8,55 kb fragmentet ble dannet som en konsekvens av spaltning av pBSABCD ved to ved siden av liggende Bsml seter, og det er dermed tre mulige produktplasmider etter legering, pBCD, pACD eller pABD, hvor hele tall representerer LHR som er i plasmidet. Disse kan sjeldnes ved restriksjonskartlegging med Smal. DNA ble preparert fra 12 kolonier, spaltet med Smal og separert ved agarosegelelektroforese. Fem kloner hadde to Smal fragmenter på 2,5 kb og 6,1 kb, tilsvarende delesjon av den kodende sekvensen til LHR-A, som dermed representerer pBCD. Tre kloner hadde et enkelt lineært fragment på 8,5 kb tilsvarende pACD. Fire kloner hadde to Smal fragmenter på 1,2 The 8.55 kb fragment was formed as a consequence of cleavage of pBSABCD at two adjacent Bsml sites, and there are thus three possible product plasmids after fusion, pBCD, pACD or pABD, where whole numbers represent the LHR that is in the plasmid. These can be rarefied by restriction mapping with Smal. DNA was prepared from 12 colonies, digested with SmaI and separated by agarose gel electrophoresis. Five clones had two Smal fragments of 2.5 kb and 6.1 kb, corresponding to the deletion of the coding sequence of LHR-A, thus representing pBCD. Three clones had a single linear fragment of 8.5 kb corresponding to pACD. Four clones had two Smal fragments of 1.2

kb og 7,4 kb, som var ventet for delesjon av den kodende sekvensen til LHR-C, produserende pABC. 5,6 kb innskuddet til hver av disse tre konstruksjonene ble gelrenset etter dobbeltspaltning med Xhol og Noti, og ligert til ekspresjonsvektor CDM8 som var blitt gel-renset etter spaltning med samme restriksjonsenzymer. E. coli DK1/P3 ble transformert med 1 iger ingsblandingene og DNA ble preparert fra fem kolonier av hver. Tilstedeværelse av deletert CR1 cDNA innskudd i ekspresjonsvektoren ble vist i hvert tilfelle ved SacI spaltning, som viste de ventede to fragmentene på 4,20 kb og 5,75 kb. Disse plasmidene ble betegnet piBCD, piACD og piABD. kb and 7.4 kb, which were expected for deletion of the coding sequence of LHR-C, producing pABC. The 5.6 kb insert of each of these three constructs was gel-purified after double digestion with XhoI and Noti, and ligated to expression vector CDM8 which had been gel-purified after digestion with the same restriction enzymes. E. coli DK1/P3 was transformed with the 1-well inoculation mixtures and DNA was prepared from five colonies of each. Presence of deleted CR1 cDNA insert in the expression vector was shown in each case by SacI digestion, which showed the expected two fragments of 4.20 kb and 5.75 kb. These plasmids were designated piBCD, piACD and piABD.

7,20 kb fragmentet fra partiell spaltning av pBSABCD var en konsekvens av Bsml spaltning ved tre ved siden av liggende seter eller, ekvivalent med hensyn på det store fragmentet, ved to seter med et enkelt ukuttet sete mellom dem, slik at det dermed var to mulige produkter oppnåelig etter transformasjon , pAD og pCD. Disse ble sjeldnet ved dobbeltspaltning med Xhol og Pstl, som ga to fragmenter på 1,0 kb og 6,2 kb når det gjelder pAD, og et lineært fragment på 7,2 kb for pCD. 4,2 kb innskuddet fra hver av disse plasmidene ble gel-renset etter dobbeltspaltning med Xhol og Noti, og subklonet inn i CDM8 som ovenfor. Tilstedeværelse av deletert CR1 cDNA i ekspresjonsvektoren ble vist ved dobbeltspaltning med Pstl og Bglll. Klon piAD hadde fragmenter på 2,4 kb og 6,2 kb, mens piCD hadde et enkelt fragment på 8,6 kb. The 7.20 kb fragment from partial cleavage of pBSABCD was a consequence of Bsml cleavage at three adjacent lying sites or, equivalently with respect to the large fragment, at two sites with a single uncut site between them, so that there were thus two possible products obtainable after transformation, pAD and pCD. These were rarefied by double digestion with XhoI and Pstl, yielding two fragments of 1.0 kb and 6.2 kb in the case of pAD, and a linear fragment of 7.2 kb for pCD. The 4.2 kb insert from each of these plasmids was gel-purified after double digestion with XhoI and Noti, and subcloned into CDM8 as above. Presence of deleted CR1 cDNA in the expression vector was shown by double digestion with Pstl and Bglll. Clone piAD had fragments of 2.4 kb and 6.2 kb, while piCD had a single fragment of 8.6 kb.

5,85 kb fragmentet fra Bsml spaltning av pBSABCD representerer et produkt med fullstendig spaltning og en enkelt klon, pD, ble tilveiebragt etter transformasjon av E. coli DH5a. Dette ble bekreftet ved dobbeltspaltning med Hindlll og Bglll som ga de ventede 3,7 kb og 2,2 kb fragmentene. 2,9 kb innskuddet til klonen ble gel-renset etter dobbeltspaltning med Xhol og Noti og ligert til ekspresjonsvektoren som ovenfor. Hindlll spaltning av den resulterende piD klonen ga det ventede 7,3 kb fragmentet, en Xhol + Bglll dobbeltspalt- The 5.85 kb fragment from Bsml digestion of pBSABCD represents a product of complete cleavage and a single clone, pD, was obtained after transformation of E. coli DH5α. This was confirmed by double digestion with HindIII and BglII which gave the expected 3.7 kb and 2.2 kb fragments. The 2.9 kb insert of the clone was gel-purified after double digestion with XhoI and Noti and ligated into the expression vector as above. HindIII digestion of the resulting piD clone yielded the expected 7.3 kb fragment, a XhoI + BglII double-cleaved

ning ga 2,2 kb og 5,1 kb fragmenter, og en SacI spaltning resulterte i de ventede 1,5 kb og 5,8 kb fragmentene. ning gave 2.2 kb and 5.1 kb fragments, and a SacI digestion resulted in the expected 1.5 kb and 5.8 kb fragments.

Plasmid pBD ble preparert ved Bsml delvis spaltning av pBCD. Det lineære 7,2 kb fragmentet korresponderende med spaltning av to ved siden av liggende Bsml seter ble gel-renset, selvligert som ovenfor og E. coli DH5a ble transformert til ampicillinresistens. pBD ble identifisert ved tilstedeværelse av 1,2 kb og 6,0 kb fragmenter ved Smal spaltning. 4,2 kb innskuddet ble renset etter dobbeltspaltning med Xhol og Noti, og overført til CDM8 som ovenfor. Klon piBD ble bekreftet ved observasjon av de ventede 0,8 kb og 7,8 kb fragmentene etter Hindlll spaltning. Plasmid pBD was prepared by Bsml partial digestion of pBCD. The linear 7.2 kb fragment corresponding to cleavage of two flanking Bsml sites was gel-purified, self-ligated as above and E. coli DH5α was transformed to ampicillin resistance. pBD was identified by the presence of 1.2 kb and 6.0 kb fragments by Smal digestion. The 4.2 kb insert was purified after double digestion with Xhol and Noti, and transferred to CDM8 as above. Clone piBD was confirmed by observation of the expected 0.8 kb and 7.8 kb fragments after HindIII cleavage.

COS cellene med transient ekspresjon av piABCD, piBCD, piCD og piD konstruksjoner, respektivt, ble overflatemerket med <125>jf 0g immunopresipitert med anti-CRl antistoff. Ved SDS-PAGE etter reduksjon komigrerte produktet til piABCD konstruksjonen med F allotypen til CR1, mens delesjonsmutantene demonstrerte trinnvise reduksjoner på omt^nt 45,000 dalton, som henholdsvis indikerer delesjon av 1, 2 og 3 LHR (fig. 17). The COS cells transiently expressing piABCD, piBCD, piCD and piD constructs, respectively, were surface labeled with <125>jf 0g immunoprecipitated with anti-CR1 antibody. By SDS-PAGE after reduction, the product of the piABCD construct comigrated with the F allotype of CR1, while the deletion mutants demonstrated stepwise reductions of approximately 45,000 daltons, indicating deletion of 1, 2, and 3 LHR, respectively (Fig. 17).

8.3.2. Konstruksjon av deles. ionsmutantene piPl. piEl. piE2.8.3.2. Construction of parts. the ion mutants piPl. piEl. piE2.

piE- 2. piUl. piU- 2 og piA/ D piE- 2. piUl. piU- 2 and piA/ D

Plasmid piABCD ble fullstendig spaltet med BstEII og de to fragmentene ved 1,35 kb (en dublett) og 8,6 kb ble gel-renset, blandet og ligert, og E. coli DK1/P3 ble transformert til ampicillin og tetracyklinresistens. Kolonier ble screenet ved hybridisering med CR1 cDNA probe CR1-4 (se seksjon 8.1, ovenfor), og sterkt positive kloner ble plukket og ytterligere screenet ved spaltning med Smal. piEl ble identifisert ved tilstedeværelse av to fragmenter ved 2,7 kb og 7,3 kb, og piE2 ble identifisert ved et enkelt 10,0 kb lineært fragment. piE-2 ble identifisert som en svak CR1-4 positiv klon som inneholdt et enkelt 8,6 kb Smal fragment. Plasmid piABCD was completely digested with BstEII and the two fragments at 1.35 kb (a doublet) and 8.6 kb were gel purified, mixed and ligated, and E. coli DK1/P3 was transformed to ampicillin and tetracycline resistance. Colonies were screened by hybridization with CR1 cDNA probe CR1-4 (see section 8.1, above), and strongly positive clones were picked and further screened by digestion with SmaI. piE1 was identified by the presence of two fragments at 2.7 kb and 7.3 kb, and piE2 was identified by a single 10.0 kb linear fragment. piE-2 was identified as a weak CR1-4 positive clone containing a single 8.6 kb Smal fragment.

Plasmid piPl ble tilveiebragt ved fullstendig spaltning av piABCD med Pstl og gel-rensning av det store, 10,0 kb fragmentet. Dette fragmentet ble ligert og E. coli DK1/P3 ble transformert med blandingen. Det resulterende plasmidet, piPl, inneholdt et enkelt, 10,0 kb Smal fragment. Plasmid piP1 was obtained by complete digestion of piABCD with PstI and gel purification of the large, 10.0 kb fragment. This fragment was ligated and E. coli DK1/P3 was transformed with the mixture. The resulting plasmid, piP1, contained a single, 10.0 kb Smal fragment.

Plasmidene piUl og piU-2 ble preparert ved først transformer-ing av dem" stamme GM271/P3 med plasmid pXLA, og isolering av DNA. Dette DNA ble dobbeltspaltet med Stul og Noti, og 3,3 kb fragmentet ble gel-renset. Plasmid pBSABCD ble delvis spaltet med Nsil, og resulterende fire basepar 3' overhengende ble fjernet ved behandling med Klenow fragmentet til E. coli DNA polymerase I. DNA'et ble deretter fullstendig spaltet med Noti, og fragmentene på 5,4 kb og 4,0 kb ble gel-renset. Disse ble ligert til 3,3 kb Stul-Noti fragmentet fra pXLA, og ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli DH5a til ampicillinresistens. Kolonier ble screenet ved hybridisering til CR1 cDNA probe CR1-4, og positive kloner ble ytterligere sjekket ved restriksjonsspaltning med Hindlll som ga tre fragmenter på 0,8 kb, 1,3 kb og 6,5 kb for pUl, og to fragmenter på 0,8 kb og 6,5 kb for pU-2. Stul-blutendet Nsil spleis ble bekreftet å være i ramme ved DNA sekvensering av disse plasmidene. Innskuddene til pUl og pU-2, hhv. 5,6 kb og 4,2 kb, ble gel-renset etter Xhol og Noti dobbeltspaltning, og ble ligert til ekspresjonsvektor CDM8 som beskrevet ovenfor. Strukturene til klonene, piUl og piU-2, ble bekreftet ved restriksjonsspaltning med Xhol + Pstl, som tilveiebringer de ventede to fragmentene på 1,2 kb og 8,8 kb for piUl og et lineært 8,7 kb fragment for piU-2. Plasmids piU1 and piU-2 were prepared by first transforming them into strain GM271/P3 with plasmid pXLA, and isolating DNA. This DNA was double digested with Stul and Noti, and the 3.3 kb fragment was gel-purified. Plasmid pBSABCD was partially digested with Nsil, and the resulting four base pairs 3' overhangs were removed by treatment with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I. The DNA was then completely digested with Noti, and the fragments of 5.4 kb and 4.0 kb were gel-purified. These were ligated to the 3.3 kb Stul-Noti fragment from pXLA, and the ligation mixture was used to transform E. coli DH5α to ampicillin resistance. Colonies were screened by hybridization to CR1 cDNA probe CR1-4, and positive clones were further checked by restriction digestion with HindIII which gave three fragments of 0.8 kb, 1.3 kb and 6.5 kb for pUl, and two fragments of 0.8 kb and 6.5 kb for pU-2. the blunt-ended Nsil splice was confirmed to be in frame by DNA sequencing of these plasmids. pUl and pU-2, respectively. 5.6 kb and 4.2 kb, were gel-purified after Xhol and Noti double digestion, and were ligated into expression vector CDM8 as described above. The structures of the clones, piUl and piU-2, were confirmed by restriction digestion with XhoI + Pstl, which provides the expected two fragments of 1.2 kb and 8.8 kb for piUl and a linear 8.7 kb fragment for piU-2.

Plasmid piA/D ble preparert ved først fullstendig spaltning av piABCD med Pstl, Pstl spaltningen ble deretter delvis spaltet med Apal, og 3' overhengene ble fjernet med Klenow fragmentet til E. coli DNA polymerase I. DNA ble deretter fraksjonert ved agarosegelelektroforese og 7,5 kb fragmentet ble isolert, ligert og anvendt for å transformere E. coli DK1/P3 til ampicillin og tetracyklinresistens. Konstruksjonen ble bekreftet ved dobbeltspaltning med Kpnl + SacI, som ga de ventede fire fragmentene på 0,8 kb, 1,5 kb, 1,7 kb og 3,3 kb. Plasmid piA/D was prepared by first completely cleaving piABCD with Pstl, the Pstl cleavage was then partially cleaved with ApaI, and the 3' overhangs were removed with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I. The DNA was then fractionated by agarose gel electrophoresis and 7, The 5 kb fragment was isolated, ligated and used to transform E. coli DK1/P3 to ampicillin and tetracycline resistance. The construct was confirmed by double digestion with KpnI + SacI, which gave the expected four fragments of 0.8 kb, 1.5 kb, 1.7 kb and 3.3 kb.

9. EKSEMPEL: IDENTIFIKASJON AV C3b og C4b BINDENDE DOMENER 9. EXAMPLE: IDENTIFICATION OF C3b and C4b BINDING DOMAINS

9.1. Assays og resultater 9.1. Assays and results

Plasmidene PiABCD, piAD, piCD og piD, inneholdende LHR(er) angitt ved store bokstaver i navnet, ble transformert inn i COS celler, som ble anvendt i assays for å vurdere evnen til deres kodede CR1 fragmenter til å binde C3b eller C4b. Bindingsassayene ble utført ved observasjon av erytrocytt-rosettering resulterende fra binding av C3b eller C4b-belagte røde celler ved COS celler som uttrykker et full lengde CR1 molekyl eller CR1 delesjonsmutant på deres celleoverflate (transient ekspresjon). Transfekterte celler, 1-4 x 10^/ml, ble inkubert med C3- eller C4-bærende erytrocytter, 2-6 x 10<8>/ml, i 0,02 ml i 60 minutter ved 20°C. Prosentandel av transfekterte celler som danner rosetter ble vurdert mikroskopisk idet en transfektert celle ble vurdert som en rosett dersom det var minst fem adherente erytrocytter. Resultatene er vist i tabell III. Plasmids PiABCD, piAD, piCD and piD, containing LHR(s) indicated by capital letters in the name, were transformed into COS cells, which were used in assays to assess the ability of their encoded CR1 fragments to bind C3b or C4b. The binding assays were performed by observing erythrocyte rosettes resulting from the binding of C3b or C4b-coated red cells by COS cells expressing a full-length CR1 molecule or CR1 deletion mutant on their cell surface (transient expression). Transfected cells, 1-4 x 10^/ml, were incubated with C3- or C4-bearing erythrocytes, 2-6 x 10<8>/ml, in 0.02 ml for 60 minutes at 20°C. The percentage of transfected cells forming rosettes was assessed microscopically, as a transfected cell was assessed as a rosette if there were at least five adherent erythrocytes. The results are shown in Table III.

I hver av tre separate eksperimenter var andel COS celler som uttrykker fullengde piABCD konstruksjonen som dannet rosetter med EC3(ma) lik fraksjonen som har påvisbar rekombinant reseptor, som vurdert ved immunofluorescens ved anvendelse av en YZ1 monoklonalt anti-CRl antistoff eller kanin anti-CRl antiserum (tabell III). I kontrast, celler som uttrykker piD dannet ikke rosetter, og dette tyder på at et C3-bindings-sete(er) må være i eller kreve tilstedeværelse av LHR-A, -B eller -C. Et sete ble vist å være tilstede i både LHR-B og -C ved demonstrering av cellene som uttrykker enten piBD eller piCD konstruksjoner dannet rosetter med EC3(ma). Celler som uttrykker piAD, piA/D eller piE-3 hadde ikke tilsvarende C3-bindende fuksjon. På grunn av at piE-2 konstruksjonen er forskjellig fra piCD bare i å ha SCR-1 og -2 til LHR-A isteden for første to SCR til LHR-C, må funksjonen av C3-bindingssetet i LHR-C ha disse NH2-terminale SCR. In each of three separate experiments, the proportion of COS cells expressing the full-length piABCD construct that formed rosettes with EC3(ma) was equal to the fraction having detectable recombinant receptor, as assessed by immunofluorescence using a YZ1 monoclonal anti-CR1 antibody or rabbit anti-CR1 antiserum (Table III). In contrast, cells expressing piD did not form rosettes, suggesting that a C3 binding site(s) must be in or require the presence of LHR-A, -B, or -C. A site was shown to be present in both LHR-B and -C by demonstrating that cells expressing either piBD or piCD constructs formed rosettes with EC3(ma). Cells expressing piAD, piA/D or piE-3 did not have corresponding C3-binding function. Because the piE-2 construct differs from piCD only in having SCR-1 and -2 of LHR-A instead of the first two SCRs of LHR-C, the function of the C3 binding site in LHR-C must have these NH2- terminal SCR.

Proporsjon av COS celler som uttrykker fullengde piABCD rekombinant som dannet rosetter med EC4(ma) var mindre enn fraksjonen som dannet rosetter med EC3(ma), som kanskje reflekterer færre C4(ma) pr. erytrocytt (tabell III) eller færre C4-bindingsseter pr. reseptor. Delesjonsmutanter som har hele eller deler av LHR-A, piAD, piA/D og piE-2 konstruksjoner, bandt EC4(ma) bedre enn det delesjonsmutanter, piBD og piCD gjorde; idet piD manglet denne funksjonen. C4-bindingssetet til CR1 ligger hovedsakelig i LHR-A, til tross for at sekundære seter kan være tilstede i LHR-B og -C. Den forbedrede rosetteringsevnen til piE-2 konstruksjonen relativt til piCD foreslår at SCR-1 og -2 til LHR-A er involvert i C4-bindingssetet. The proportion of COS cells expressing full-length piABCD recombinant that formed rosettes with EC4(ma) was smaller than the fraction that formed rosettes with EC3(ma), perhaps reflecting fewer C4(ma) per erythrocyte (table III) or fewer C4 binding sites per receptor. Deletion mutants harboring all or part of the LHR-A, piAD, piA/D, and piE-2 constructs bound EC4(ma) better than did deletion mutants, piBD, and piCD; as piD lacked this function. The C4 binding site of CR1 resides predominantly in LHR-A, although secondary sites may be present in LHR-B and -C. The improved rosetting ability of the piE-2 construct relative to piCD suggests that SCR-1 and -2 of LHR-A are involved in the C4 binding site.

Radioimmunoanalyse av binding av YZ1 monoklonalt anti-CRl antistoff indikerte signifikant opptak ved COS celler som uttrykker piABCD, piAD, piBD og piCD konstruksjoner (tabell IV). Celler transfektert med piD eller piA/D, som består av fem NH2-terminale SCR til LHR-A og tre COOH-terminale SCR til LHR-D, bandt ikke YZ1 anti-CRl antistoff, til tross for at produktene til disse konstruksjonene bandt polyklonalt anti-CRl antiserum (tabell IV). YZ1 epitopen blir gjentatt i LHR-A, -B og -C, er ikke tilstede i NH2-terminale SCR til LHR-A, og er ikke tilstede eller er utilgjengelig i LHR-D. Radioimmunoassay of binding of YZ1 monoclonal anti-CR1 antibody indicated significant uptake by COS cells expressing piABCD, piAD, piBD and piCD constructs (Table IV). Cells transfected with piD or piA/D, which consist of five NH2-terminal SCRs to LHR-A and three COOH-terminal SCRs to LHR-D, did not bind YZ1 anti-CR1 antibody, despite the fact that the products of these constructs bound polyclonal anti-CR1 antiserum (Table IV). The YZ1 epitope is repeated in LHR-A, -B and -C, is not present in the NH2-terminal SCR of LHR-A, and is not present or unavailable in LHR-D.

De viste verdiene er gjennomsnittet av duplikate bestemmelser, cpm pr. 3 x IO<5> COS celler. The values shown are the average of duplicate determinations, cpm per 3 x IO<5> COS cells.

9.2. Diskusj on 9.2. Discussion on

Det konserverte Bsml setet som er funnet i midten av den kodende sekvensen til første SCR i hver LHR muliggjorde konstruksjon av en serie delesjonsmutanter som korresponderte nære med grensene til LHR, og som opprettholdte den åpne leserammen og hensiktsmessige posisjoner til de fire cysteinene som er nødvendige for dannelse av disulfidbinding (fig. 16). Sammenligning av C3(ma)- og C4(rna)-bindingsfunk-sjoner til disse delesjonsmutantene sjeldnet ikke bare LHR som har disse spesifisiteter, men også de SCR som er kritiske for bestemming av ligandspesifisiteten. Kapasiteten til piAD, piA/D og piE-2 formene av reseptoren, men ikke piD formen, til å formidle rosettdannelse mellom transfekterte COS celler og EC4(ma) indikerte at NH2-terminale to SCR til LHR-A inneholdt et sete for interaksjon med dette komplementprotei-net (tabell III). Dette setet var bare relativt spe.sifikt for C4(ma) p.g.a. at transfektanter som uttrykker piAD og piA/D også kunne binde EC3(ma) (tabell III). C3(ma)-bindingsfunk-sjonen til reseptorene kodet av piBD og piCD konstruksjonene, demonstrerte ved rosettanalyse og faktor I-kofaktorfunksjon for spaltning av C3(ma) (tabell III; fig. 18), indikerte tilstedeværelse av seter spesifikke for C3(ma) i første to SCR til disse LHR. Disse setene kunne også reagere med C4(ma) The conserved Bsml site found in the middle of the coding sequence of the first SCR in each LHR allowed the construction of a series of deletion mutants that corresponded closely to the boundaries of the LHR, and that maintained the open reading frame and appropriate positions of the four cysteines necessary for formation of a disulfide bond (Fig. 16). Comparison of C3(ma) and C4(rna) binding functions of these deletion mutants rarefied not only the LHR that has these specificities, but also the SCRs that are critical for determining the ligand specificity. The capacity of the piAD, piA/D and piE-2 forms of the receptor, but not the piD form, to mediate rosette formation between transfected COS cells and EC4(ma) indicated that the NH2-terminal two SCRs of LHR-A contained a site for interaction with this complement protein (table III). This seat was only relatively specific for C4(ma) due to that transfectants expressing piAD and piA/D could also bind EC3(ma) (Table III). The C3(ma) binding function of the receptors encoded by the piBD and piCD constructs, demonstrated by rosette analysis and factor I cofactor function for cleavage of C3(ma) (Table III; Fig. 18), indicated the presence of sites specific for C3(ma ) in the first two SCRs to these LHRs. These sites could also react with C4(ma)

(tabell III). Det er foretrekkbart, men overlappende, C4- og C3-bindingsaktiviteter i LHR-A, -B og -C. (Table III). There are preferential, but overlapping, C4 and C3 binding activities in LHR-A, -B and -C.

Alternativt, kapasiteten til COS cellene som uttrykker piBD og piCD konstruksjonene til å binde EC4(ma) kan ha blitt forårsaket av overføring av nukleotider kodende for NHg-terminale 36 aminosyrer fra SCR-1 LHR-A til LHR-B og -C gjennom ligering av Bsml fragmenter. Disse 36 aminosyrene alene virket ikke på piD produkt C4-rosetterende funksjonen. Vi kan ikke ekskludere en sekundær funksjon av LHR-D i disse reaksjonene p.g.a. at denne LHR var tilstede i alle konstruksjonene analysert for funksjon. Funnet av tre bestemte ligandgjenkjenningsseter i CR1, to for C3b og en for C4b (flg. 19), indikerer at hvert reseptormolekyl kan tilveiebringe effektiv binding av komplekser som bærer multiple C4b og C3b molekyler til tross for å ha relativt lav affinitet for monovalente ligander (Arnaout, M.A., et al., 1983, Immunology 48:229). Dette funnet tilveiebringer også en forklaring for den manglende evnen som oppløselig C4b har til å hemme dannelsen av rosetter mellom erytrocytter som bærer C3b og en human B lymfoblastoid cellelinje (Gaither, T.A., et al., 1983, J. Immunol. 131:899). Mulige ligander som CR1 vil være spesielt tilpasset for kan være de molekylære komplek-sene C4b/C3b og C3b/C3b, som blir dannet i løpet av aktivering ifølge klassisk og alternativ reaksjonsvei, respektivt. P.g.a. at det er distingte bindingsseter i tre av fire LHR, kan CR1 strukturelle allotyper som er forskjellige i antallet LHR ha betraktlige funksjonelle forskjeller forårsaket av variasjoner i antall 1igandbindingsseter. Til tross for in vitro studier ikke har rapport forskjellige bindingsak-tiviteter til F, S og F' (A, B og C, respektivt) allotypene, kan mindre F' allotypen som sansynligvis bare har tre LHR kan ha en dårligere evne til å fjerne immunkomplekser. F' allotypen er blitt rapportert å muligens være assosiert med systemisk lupus erythematosus (van Dyne, S. , et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 68:570). Alternatively, the capacity of the COS cells expressing the piBD and piCD constructs to bind EC4(ma) may have been caused by the transfer of nucleotides encoding the NHg-terminal 36 amino acids from SCR-1 LHR-A to LHR-B and -C through ligation of Bsml fragments. These 36 amino acids alone did not act on the piD product C4 rosetting function. We cannot exclude a secondary function of LHR-D in these reactions due to that this LHR was present in all the constructs analyzed for function. The discovery of three specific ligand recognition sites in CR1, two for C3b and one for C4b (ref. 19), indicates that each receptor molecule can provide efficient binding of complexes carrying multiple C4b and C3b molecules despite having relatively low affinity for monovalent ligands ( Arnaout, M.A., et al., 1983, Immunology 48:229). This finding also provides an explanation for the inability of soluble C4b to inhibit the formation of rosettes between erythrocytes bearing C3b and a human B lymphoblastoid cell line (Gaither, T.A., et al., 1983, J. Immunol. 131:899) . Possible ligands for which CR1 will be particularly adapted can be the molecular complexes C4b/C3b and C3b/C3b, which are formed during activation according to the classical and alternative reaction pathway, respectively. Because of. that there are distinct binding sites in three out of four LHRs, CR1 structural allotypes that differ in the number of LHRs may have considerable functional differences caused by variations in the number of ligand binding sites. Although in vitro studies do not report different binding activities to the F, S and F' (A, B and C, respectively) allotypes, the smaller F' allotype which probably only has three LHRs may have a poorer ability to remove immune complexes. The F' allotype has been reported to possibly be associated with systemic lupus erythematosus (van Dyne, S., et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 68:570).

10. EKSEMPEL: DEMONSTRASJON AV FAKTOR I KOFAKTORAKTIVI TET 10. EXAMPLE: DEMONSTRATION OF FACTOR IN COFACTOR ACTIVITY

Rekombinant CR1 protein og spesifikke fragmenter derav, i både celle-overflate og solubiliserte former, ble demonstrert å ha C3b faktor I kofaktoraktivitet. Recombinant CR1 protein and specific fragments thereof, in both cell-surface and solubilized forms, were demonstrated to have C3b factor I cofactor activity.

Assays av faktor I kofaktoraktivitet ble utført ved modifikasjoner av en publisert prosedyre (Fearon, D.T., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867). Assays of factor I cofactor activity were performed by modifications of a published procedure (Fearon, D.T., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:5867).

For assays av faktor I kofaktoraktivitet til solubiliserte CR1 og fragmenter, ble celle-overflate CR1 protein og fragmenter solubilisert med Nonidet P-40, og lysatet ble immunopresipitert med anti-CRl monoklonalt antistoff YZ1 koblet til Sepharose-kuler. Detergentlysater på 1 x 10^ transfekterte COS celler ble immunopresipitert sekvensielt med Sepharose UPC10 anti-levan og Sepharose-YZl. Immunupresi-pitatet ble deretter analysert for faktor I kofaktoraktivitet ved inkubasjon av vaskede kuler i 60 minutter ved 37°C med 0,5ug <125>I-C3(ma) og 200 ng faktor I i 0,05 ml PBS, 0,5$ NP-40. Etter inkubasjon ble supernatanten inneholdende radiomerket C3(ma) analysert ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese og autoradiografi. Faktor I kofaktoraktivitet ble indikert ved tilsynekomst på autoradiogram av lavere molekylærvektsformer av a-kjeden til C3(ma) resulterende fra proteolyttisk spaltning ved faktor I. For assays of factor I cofactor activity to solubilized CR1 and fragments, cell-surface CR1 protein and fragments were solubilized with Nonidet P-40, and the lysate was immunoprecipitated with anti-CR1 monoclonal antibody YZ1 coupled to Sepharose beads. Detergent lysates of 1 x 10^ transfected COS cells were sequentially immunoprecipitated with Sepharose UPC10 anti-levan and Sepharose-YZ1. The immunoprecipitate was then assayed for factor I cofactor activity by incubating washed beads for 60 min at 37°C with 0.5 µg <125>I-C3(ma) and 200 ng factor I in 0.05 ml PBS, 0.5 $ NP-40. After incubation, the supernatant containing radiolabeled C3(ma) was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography. Factor I cofactor activity was indicated by the appearance on the autoradiogram of lower molecular weight forms of the α-chain of C3(ma) resulting from proteolytic cleavage by factor I.

For assays av faktor I kofaktoraktivitet til celleoverflate CR1 og fragmenter ble transfekterte COS celler inneholdende en CR1 ekspresjonsvektor (piABCD, piAD, piBD, piCD, eller piD, beskrevet ovenfor) inkubert med 0,5 ug <l25>I-C3(ma) og 0,2 ug faktor I (Fearon, D.T., 1977, J. Immunol. 119:1248), og analysert som beskrevet ovenfor. For assays of factor I cofactor activity to cell surface CR1 and fragments, transfected COS cells containing a CR1 expression vector (piABCD, piAD, piBD, piCD, or piD, described above) were incubated with 0.5 µg <l25>I-C3(ma) and 0.2 µg factor I (Fearon, D.T., 1977, J. Immunol. 119:1248), and assayed as described above.

Faktor I-kofaktoraktiviteten til celle-overflaterekombinant CR1 er vist i fig. 15. Faktor I spaltet cx-kjeden til C3(ma) til fragmenter med molekylvekter på 76,000 og 46,000 bare i nærvær av immunoimmobilisert, rekombinant CR1 eller faktor H (fig. 15). Regioner korresponderende med båndene fra autoradiogrammet ble kuttet ut fra gelen og analysert for l^I for å bestemme mengden av a-kjeden som var spaltet. I nærvær av faktor H ble 91$ av a-kjeden spaltet mens i nærvær av økende mengde rekombinant CR1, ble 26$, 41$ og 55$ spaltet. Til tross for COS cellene transfektert med CDM8 vektoren alene inneholdt en viss endogen faktor I-kofaktoraktivitet, var en økning i denne funksjonen klart med COS celler transfektert med piABCD, piBD og piCD (fig. 18). Ingen forsterket spaltning av <125>I-C3(ma) ble sett med COS celle transfektert med piAD eller piD. Blant disse konstruksjonene hadde bare deles jonsmutantene piBD og piCD, som betraktt på COS celler en kapasitet for binding av C3, også hadde faktor I-kofaktoraktivitet for spaltning av C3. The Factor I cofactor activity of cell surface recombinant CR1 is shown in Fig. 15. Factor I cleaved the cx chain of C3(ma) into fragments with molecular weights of 76,000 and 46,000 only in the presence of immunoimmobilized recombinant CR1 or factor H (Fig. 15). Regions corresponding to the bands from the autoradiogram were excised from the gel and analyzed for l^I to determine the amount of α-chain cleaved. In the presence of factor H, 91% of the α-chain was cleaved, while in the presence of increasing amounts of recombinant CR1, 26%, 41% and 55% were cleaved. Despite the COS cells transfected with the CDM8 vector alone containing some endogenous factor I cofactor activity, an increase in this function was clear with COS cells transfected with piABCD, piBD and piCD (Fig. 18). No enhanced cleavage of <125>I-C3(ma) was seen with COS cells transfected with piAD or piD. Among these constructs, only the shared ion mutants piBD and piCD, which observed on COS cells a capacity for binding C3, also had factor I cofactor activity for cleaving C3.

Resultatene av analysene for faktor I kofaktoraktivitet med både celle-overflate og solubiliserte former av CR1 og fragmenter derav er vist i tabell V. The results of the analyzes for factor I cofactor activity with both cell surface and solubilized forms of CR1 and fragments thereof are shown in Table V.

Som vist i tabell V, produserte ekspresjon av piABCD (kodende for et fullengde CR1 protein), piBD (kodende for LHR-B og -D) eller piCD (kodende for LHR-C og -D) et CR1 produkt med C3b faktor I kofaktoraktivitet. Data i tabell V tyder derfor på at CR1 proteinet eller et fragment derav kan fremme komplement inaktiver ing. As shown in Table V, expression of piABCD (encoding a full-length CR1 protein), piBD (encoding LHR-B and -D) or piCD (encoding LHR-C and -D) produced a CR1 product with C3b factor I cofactor activity . Data in Table V therefore suggest that the CR1 protein or a fragment thereof can promote complement inactivation.

11. EKSEMPEL: EKSPRESJON AV REKOMBINANT OPPLØSELIG CR1 11. EXAMPLE: EXPRESSION OF RECOMBINANT SOLUBLE CR1

CR1 cDNA ble modifisert ved rekombinante DNA prosedyrer slik at en oppløselig form (sCRl) av CR1 eller CR1 fragmenter ble produsert. sCRl konstruksjonene ble uttrykt i et pattedyrsys-tem hvor det uttrykte proteinet ble utskilt fra cellene. Store mengder av oppløselige polypeptider ble produsert, som i kontrast til den membranbundede formen av CR1 proteinene ikke behøvde å bli oppløst for å få dem i oppløsning. CR1 cDNA was modified by recombinant DNA procedures so that a soluble form (sCR1) of CR1 or CR1 fragments was produced. The sCR1 constructs were expressed in a mammalian system where the expressed protein was secreted from the cells. Large amounts of soluble polypeptides were produced, which, in contrast to the membrane-bound form of the CR1 proteins, did not need to be solubilized to dissolve them.

11.1. Materialer og fremgangsmåter 11.1. Materials and methods

11.1.1. Enzymspaltninger 11.1.1. Enzyme cleavages

Alle restriksjonsenzymspaltninger, 1inkerlegeringer og T4 DNA ligase og E. coli DNA polymerasereaksjoner ble utført ifølge forhandlerens (New England Biolabs, Inc., Beverley, MA) anbefalinger. E. coli DH1 eller DH5cx ble gjort kompetente ved fremgangsmåten til Morrison, D.A., 1979, Meth. Enzymol. 68:326:331. Kompetente bakterielle celler ble transformert med DNA ifølge Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Plasmider ble renset ved alkalisk lysering eller ved kokefremgangsmåten (Maniatis, T., et al., ovenfor ). All restriction enzyme digestions, 1-linkers, and T4 DNA ligase and E. coli DNA polymerase reactions were performed according to the vendor's (New England Biolabs, Inc., Beverley, MA) recommendations. E. coli DH1 or DH5cx were rendered competent by the method of Morrison, D.A., 1979, Meth. Enzymol. 68:326:331. Competent bacterial cells were transformed with DNA according to Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Plasmids were purified by alkaline lysis or by the boiling method (Maniatis, T., et al., supra).

11.1.2. DNA fragmentlsoleringer 11.1.2. DNA fragment isolations

DNA fragmenter ble renset fra agarose (BioRad, Richmond, CA) geler som følger. Hensiktsmessige DNA bånd ble kuttet ut fra gelen ved anvendelse av en kniv, og agarosebiten ble plassert på et parafilmstykke, kuttet til meget små biter og overført til et nytt parafilmstykke. Agarosestykkene ble knust og agarosen overført til et 1,5 ml rør. Et likt volum fenol (ultrarent, BRL, Gaithersburg, MD) ble tilsatt, blandingen vortekst, deretter frosset ved -70°C i 10 minutter og sentrifugert i 10 minutter. Den vandige fasen ble ytterligere ekstrahert to ganger med fenol/kloroform (1:1) og to ganger med kloroform. DNA ble deretter etanolpresipitert, pelleten vasket, tørket i vakuum og resuspendert i 10 mM Tris-HCl, ph 7,0, 1 mM EDTA. DNA fragments were purified from agarose (BioRad, Richmond, CA) gels as follows. Appropriate DNA bands were excised from the gel using a knife, and the piece of agarose was placed on a piece of parafilm, cut into very small pieces and transferred to a new piece of parafilm. The agarose pieces were crushed and the agarose transferred to a 1.5 ml tube. An equal volume of phenol (ultrapure, BRL, Gaithersburg, MD) was added, the mixture vortexed, then frozen at -70°C for 10 min and centrifuged for 10 min. The aqueous phase was further extracted twice with phenol/chloroform (1:1) and twice with chloroform. DNA was then ethanol precipitated, the pellet washed, dried in vacuo and resuspended in 10 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1 mM EDTA.

DNA fragmentene ble isolert fra agarose med lav geldannende temperatur (FMC, Corp., Rockland, ME) som følger. Hensiktsmessig DNA bånd ble kuttet ut fra agarosegelen, plassert i et 1,5 ml rør og smeltet ved 65 °C i 15 minutter. Den flytendegjorte gelen ble ekstrahert med fenol inneholdende 0,1$ natriumdodecylsulfat (SDS, ultraren, BRL, Gaithersburg, MD). Den vandige fasen ble ytterligere ekstrahert en gang med fenol-SDS og to ganger med kloroform. DNA ble deretter etanolpresipitert i 2,0 m NH^acetat, tørket og resuspendert i vann. The DNA fragments were isolated from low gelling temperature agarose (FMC, Corp., Rockland, ME) as follows. Appropriate DNA bands were excised from the agarose gel, placed in a 1.5 ml tube and melted at 65°C for 15 minutes. The liquefied gel was extracted with phenol containing 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS, ultrapure, BRL, Gaithersburg, MD). The aqueous phase was further extracted once with phenol-SDS and twice with chloroform. DNA was then ethanol precipitated in 2.0 m NH 3 acetate, dried and resuspended in water.

11.1.3. Transfeks. ion inn i pattedyrceller 11.1.3. Transfection. ion into mammalian cells

Transfeksjon av DNA inn i pattedyrceller ble utført ved CaP04 presipitasjon og glyserolsjokkprosedyren til Graham og van der Eb (1973, Virology 52:456-467). DUX Bil CHO cellene ble etter å ha vært inkubert med DNA-kalsiumfosfatprepareringen i 4 til 6 timer utsatt for glyserolsjokk ved fjering av vekstmediumet ved oppsuging og tilsetning av 5 ml 20$ glyserol DMEM medium i 1 minutt. Cellene ble deretter vasket to ganger i fullstendig a MEM og inkubert i dette mediet i 48 timer. Transfection of DNA into mammalian cells was performed by the CaPO 4 precipitation and glycerol shock procedure of Graham and van der Eb (1973, Virology 52:456-467). After being incubated with the DNA-calcium phosphate preparation for 4 to 6 hours, the DUX Bil CHO cells were subjected to glycerol shock by removing the growth medium by suction and adding 5 ml of 20$ glycerol DMEM medium for 1 minute. The cells were then washed twice in complete MEM and incubated in this medium for 48 hours.

11.1.4. CHO transfektantcellekultur 11.1.4. CHO transfectant cell culture

DUX Bil CHO celletransfektanter ble dyrket i DHFR (dihydrofolatreduktase) seleksjonsmedium bestående av a MEM medium (Gibco) uten nukleosider, supplementert med 10$ dialysert føtalt kalveserum (Gibco) og 4 mM L-glutamin. Ampiifikasjon ble utført ved dyrking av cellene i økende konsentrasjoner metotreksat (Sigma, #A-6770, Amethopterin) (Kaufman, R.J., et al., 1985, Molec. Cell Biol. 5:1750:1759). DUX Bil CHO cell transfectants were cultured in DHFR (dihydrofolate reductase) selection medium consisting of a MEM medium (Gibco) without nucleosides, supplemented with 10% dialyzed fetal calf serum (Gibco) and 4 mM L-glutamine. Amplification was performed by culturing the cells in increasing concentrations of methotrexate (Sigma, #A-6770, Amethopterin) (Kaufman, R.J., et al., 1985, Molec. Cell Biol. 5:1750:1759).

11.1.5. ELISA for deteksjon av oppløselige CR1 nivåer 11.1.5. ELISA for detection of soluble CR1 levels

11.1.5.1. CR1 standarder 11.1.5.1. CR1 standards

Detergentlysater av hemoglobin-frie røde blodcelle (RBC) antydninger (ghosts) ble anvendt som en CR1 standard i ELISA (enzym-bundet immunosorbent analyse). Antydningene ble preparert som tidligere beskrevet (Wong, W.W. og Fearon D.T. , 1987, Meth. Enzymol. 150:579-585). Utgått fullblod ble tilveiebragt fra Røde Kors. Røde celler ble vasket tre ganger i PBS, deretter lysert i 6 volum hypotonisk lyseringsbuffer (10 mM Tris pH 8, 0,1 mM PMSF (fenylmetylsulf onylf luor id), 0,1 mM TPCK (tosylamidfenyletylklormetylketon), aprotonin, 2 mM EDTA). Antydningene ble vasket flere ganger i lyseringsbuffer, telt i et hemocytometer, alikvotet og frosset ved-70° C inntil bruk. For CR1 ELISA ble antydningene fortynnet til 1,6 x 10<8> antydninger/ml i solubiliseringsbuffer (10 mM Tris pH 8, 50 mM KC1, 0,1$ NP40, 0,3$ DOC, 6,2 mM PMSF, 0,2 mM jodacetamid, aprotonin, 0,1 mM TPCK, 2 mM EDTA, 0,2$ NaN3) og fortynnet i serie til 2,5 x 10^ antydninger/ml for anvendelse som standarder i ELISA. Absorbans ved 490 nm ble plottet og ukjent prøvekjøring ble referert til plotten for å oppnå antydningssekvivalenter/ml. Detergent lysates of hemoglobin-free red blood cell (RBC) ghosts were used as a CR1 standard in ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). The probes were prepared as previously described (Wong, W.W. and Fearon D.T., 1987, Meth. Enzymol. 150:579-585). Expired whole blood was provided from the Red Cross. Red cells were washed three times in PBS, then lysed in 6 volumes of hypotonic lysis buffer (10 mM Tris pH 8, 0.1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), 0.1 mM TPCK (tosylamide phenylethylchloromethyl ketone), aprotonin, 2 mM EDTA) . The blots were washed several times in lysis buffer, counted in a hemocytometer, aliquoted and frozen at -70°C until use. For the CR1 ELISA, the samples were diluted to 1.6 x 10<8> samples/ml in solubilization buffer (10 mM Tris pH 8, 50 mM KCl, 0.1$ NP40, 0.3$ DOC, 6.2 mM PMSF, 0 .2 mM iodoacetamide, aprotonin, 0.1 mM TPCK, 2 mM EDTA, 0.2$ NaN3) and serially diluted to 2.5 x 10^ hints/ml for use as standards in ELISA. Absorbance at 490 nm was plotted and unknown sample runs were referenced to the plot to obtain indicative equivalents/ml.

11.1.5.2. CR1 ELISA 11.1.5.2. CR1 ELISA

Immulon-II plater ble belagt med 100 pl/brønn av en 0,4 ug/ml konsentrasjon av et anti-CRl monoklonalt antistoff (klon J3D3, AMAC IOT 17) (Cook, J., et al., 1985, Molec. Immunol. 22:531-538) i PBS og inkubert over natt ved 4°C. Antistoff-oppløsningen ble deretter fjernet og platene ble blokkert ved tilsetning av blokkeringsbuffer (1,0$ BSA i PBS) ved 300 pl/brønn og inkubering ved 37° C i 2 timer. Etter blokkering ble skålene øyeblikkelig anvendt eller lagret ved 4°C til bruk. Immulon-II plates were coated with 100 µl/well of a 0.4 µg/ml concentration of an anti-CR1 monoclonal antibody (clone J3D3, AMAC IOT 17) (Cook, J., et al., 1985, Molec. Immunol .22:531-538) in PBS and incubated overnight at 4°C. The antibody solution was then removed and the plates were blocked by adding blocking buffer (1.0% BSA in PBS) at 300 µl/well and incubating at 37°C for 2 hours. After blocking, the dishes were used immediately or stored at 4°C until use.

Platene ble vasket tre ganger ved anvendelse av PBS inneholdende 0,05$ Tween-20. Prøvene ble tilsatt ved 100 pl/brønn i duplikat og inkubert i 2 timer ved 37°C. Om nødvendig ble prøvene fortynnet i solubiliseringsbuffer. Standard RBC antydninger ble inkludert ved hver plate. Etter prøveinkuba-sjon ble platene vasket tre ganger og et konjugat (Wilson, M.B. og NaKane, P.K., 1978, Immunofluorescens and Related Staining Techniques, North Holland Biomedical Press, s. 215-224) av pepperrotperoksidase (HRP) og monoklonalt antistoff YZ1 (Changelian, P.S., et al., 1985, J. Immunol. 184:1851-1858) ble fortynnet 1:8,000 i 50$ FCS, 50$ blokkeringsbuffer og tilsatt i 100 pl/brønn. Etter inkubering i 2 timer ved 37°C ble platene igjen vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,05$ Tween-20. Substratet ortofenylendiamin (OPD) ble tilsatt ved 0,2$ konsentrasjon i substratbuffer (0,36$ sitronsyre H20, 1,74$ Na2HP04 • 7H20, 0,1$ timerosal, 0,4$ H202, pH 6,3) i 100 ul/brønn. Reaksjonen ble stoppet etter 20 minutter ved romtemperatur ved anvendelse av 50 ul/brønn av 2 N H2S04. Absorbans ved 490 nm ble avlest. The plates were washed three times using PBS containing 0.05% Tween-20. The samples were added at 100 µl/well in duplicate and incubated for 2 hours at 37°C. If necessary, the samples were diluted in solubilization buffer. Standard RBC cues were included with each plate. After sample incubation, the plates were washed three times and a conjugate (Wilson, M.B. and NaKane, P.K., 1978, Immunofluorescence and Related Staining Techniques, North Holland Biomedical Press, pp. 215-224) of horseradish peroxidase (HRP) and monoclonal antibody YZ1 ( Changelian, P.S., et al., 1985, J. Immunol. 184:1851-1858) was diluted 1:8,000 in 50% FCS, 50% blocking buffer and added at 100 µl/well. After incubation for 2 hours at 37°C, the plates were again washed three times with PBS containing 0.05% Tween-20. The substrate orthophenylenediamine (OPD) was added at 0.2$ concentration in substrate buffer (0.36$ citric acid H2O, 1.74$ Na2HP04 • 7H2O, 0.1$ thimerosal, 0.4$ H2O2, pH 6.3) in 100 ul/well. The reaction was stopped after 20 minutes at room temperature using 50 µl/well of 2 N H 2 SO 4 . Absorbance at 490 nm was read.

11.2. Genetiske modifikas. ioner av CR1 kodende sekvenser CR1 cDNA består av omtrent 6,951 nukleotidbasepar (fig. 1, seksjonene 6, 7, ovenfor). Translasjonsstoppsignalet til nativt cDNA er beliggende ved basepar 6145. Proteinet er et membran-bundet reseptormolekyl bestående av fire lange homologe gjentagelser (LHR) som er eksponert på den ytre overflaten av cellemembranen, pluss en membran-dekkende domene på omtrent 25 aminosyrer, etterfulgt av en karboksyl-terminal region som rekker inn i cytoplasma. Denne cytoplasmadomenen består av 43 aminosyrer. Strategien som ble anvendt for å produsere oppløselige CR1 molekyler (sCRl) var å fjerne transmembranregionen som forankret et protein i cellemembranen og deretter å uttrykke de forkortede konstruksjonene som utskilte polypeptider. 11.2. Genetic modifications. ions of CR1 coding sequences CR1 cDNA consists of approximately 6,951 nucleotide base pairs (Fig. 1, sections 6, 7, above). The translation stop signal of native cDNA is located at base pair 6145. The protein is a membrane-bound receptor molecule consisting of four long homologous repeats (LHR) exposed on the outer surface of the cell membrane, plus a membrane-spanning domain of approximately 25 amino acids, followed by a carboxyl-terminal region that extends into the cytoplasm. This cytoplasmic domain consists of 43 amino acids. The strategy used to produce soluble CR1 molecules (sCR1) was to remove the transmembrane region that anchored a protein to the cell membrane and then to express the shortened constructs as secreted polypeptides.

11.2.1. Konstruksjon av pBSCRlc 11.2.1. Construction of pBSCRlc

Plasmid pBSABCD (eksempel 8, ovenfor) inneholder CR1 cDNA fra nukleotidene 1 til 6860 og mangler de utranslaterte sekvensene 3' til EcoRV setet ved nukleotid 6860. CR1 cDNA inneholder et unikt Ball restriksjonsendonukleasegjenkj en-ningssete ved basepar 5914, 29 basepar bort fra start av transmembrandomenen. pBSABCD ble først spaltet med Ball for å produsere et lineært molekyl med butte ender og ble deretter ligert ved anvendelse av T4 DNA ligase til et syntetiske oligonukleotid bestående av to 38 nukleotidkomplementære tråder med følgende sekvens: Plasmid pBSABCD (Example 8, above) contains the CR1 cDNA from nucleotides 1 to 6860 and lacks the untranslated sequences 3' to the EcoRV site at nucleotide 6860. The CR1 cDNA contains a unique Ball restriction endonuclease recognition site at base pair 5914, 29 base pairs away from the start of the transmembrane domain. pBSABCD was first cleaved with Ball to produce a blunt-ended linear molecule and then ligated using T4 DNA ligase to a synthetic oligonucleotide consisting of two 38 nucleotide complementary strands with the following sequence:

5': CCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTtaaCTCGAG 5': CCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTtaaCTCGAG

3': GGTTTACATGGAGAGCACGTGTACTACGAATTGAGCTC 3': GGTTTACATGGAGAGCACGTGTACTACGAATTGAGCTC

Det resulterende molekylet hadde et gjenopprettet Ball sete og en endret sekvens som reproduserte den native CR1 sekvensen opp til og inkludert alaninresten ved begynnelsen av transmembrandomenen. I tillegg var et translasjonsstoppsignal (med små bokstaver og understreket ovenfor) blitt ført inn rett etter alanin, etterfulgt av et Xhol restriksjonssete for å lette subkloning av endret cDNA. The resulting molecule had a restored Ball site and an altered sequence that reproduced the native CR1 sequence up to and including the alanine residue at the beginning of the transmembrane domain. In addition, a translational stop signal (lowercase and underlined above) had been inserted immediately after alanine, followed by an Xhol restriction site to facilitate subcloning of modified cDNA.

Xhol spaltning av dette plasmidet (betegnet pBSCRlc) spaltet cDNA innskuddet (betegnet sCRlc) ved kutting ved oligonukleotid-tilsatte Xhol setet i cDNA ut og ved Xhol setet i pBSKS+ multippel kloningssete ved 5' enden av CR1 cDNA. pBSCRlc inneholder følgende C-terminale sekvenser: Base nr. 5911: CTGGCCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTTAACTCGAG Aminosyrer: LAKCTSRAHDA END Xhol XhoI cleavage of this plasmid (designated pBSCRlc) cleaved the cDNA insert (designated sCRlc) by cutting at the oligonucleotide-added XhoI site in the cDNA out and at the XhoI site in the pBSKS+ multiple cloning site at the 5' end of the CR1 cDNA. pBSCRlc contains the following C-terminal sequences: Base No. 5911: CTGGCCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTTAACTCGAG Amino acids: LAKCTSRAHDA END Xhol

sete seat

11.2.2. Konstruksjon av pBSCRls 11.2.2. Construction of pBSCRls

En annen sCRl konstruksjon som mangler en transmembranregion ble dannet som følger. pBSABCD ble spaltet med SacI som kutter ved det unike SacI setet ved nukleotidbasepar 5485 i CR1 cDNA og ved SacI setet i det multiple kloningssetet til vertsplasmidet, beliggende ved 3' enden av CR1 cDNA. Denne spaltningen resulterte i avspaltning av 1375 nukleotidene til DNA sekvensen fra 3' enden av cDNA. Dette fragmentet ble deretter fjernet elektroforetisk. De utsatte endene til det resulterende plasmidet, inneholdende gjenværende sCRl cDNA, hie gjort butte ved anvendelse av T4 DNA polymerase og en butt-endet ligering ble utført. Pharmacia universal transla-sjonsterminator (katalog #27-4890-01, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ), en selv-komplementær oligomer som inneholder translasjonene stoppsignaler i alle tre leserammene, ble også inkludert i ligeringen. Ved ligering tilveiebragte den innskutte oligomeren et nytt translasjonsstoppsignal for sCRl cDNA. Another sCR1 construct lacking a transmembrane region was generated as follows. pBSABCD was digested with SacI cutting at the unique SacI site at nucleotide base pair 5485 in the CR1 cDNA and at the SacI site in the multiple cloning site of the host plasmid, located at the 3' end of the CR1 cDNA. This cleavage resulted in cleavage of the 1375 nucleotides of the DNA sequence from the 3' end of the cDNA. This fragment was then removed electrophoretically. The exposed ends of the resulting plasmid, containing residual sCR1 cDNA, were blunted using T4 DNA polymerase and a blunt-end ligation was performed. Pharmacia universal translation terminator (catalog #27-4890-01, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ), a self-complementary oligomer containing the translation stop signals in all three reading frames, was also included in the ligation. Upon ligation, the inserted oligomer provided a new translation stop signal for the sCR1 cDNA.

11.2.3. Konstruksjon av pBIVl- CRlc 11.2.3. Construction of pBIVl-CRlc

pBMT3X er en eukaryot ekspresjonsvektor (Krystal, M. , et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:2709-2713) som inneholder det humane metallotionein - IA genet, som vedrører cellens resistens overfor økte nivåer av tungmetaller såsom kadmium. Vektoren inneholder også musemetallotionein-1 genet som inneholder et ingeniørdannet Xhol sete etter initeringskodo-net for Mt-1 proteinet. Xhol setet blir anvendt som inn-skuddssete for ekspresjon av gener under kontroll av muse Mt-1 promoteren. pBMT3X is a eukaryotic expression vector (Krystal, M., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:2709-2713) containing the human metallothionein - IA gene, which relates to the cell's resistance to increased levels of heavy metals such as cadmium. The vector also contains the mouse metallothionein-1 gene which contains an engineered Xhol site after the initiation codon for the Mt-1 protein. The Xhol site is used as an insertion site for expression of genes under the control of the mouse Mt-1 promoter.

sCRlc innskuddet (omtrent 5,9 kb) ble utkuttet fra pBSCRlc ved anvendelse av Xhol og deretter ligert til det unike Xhol sete til vektor pBMT3X. Den riktige orienteringen til sCRlc innskuddet i pBMT3X ble bestemt ved restriksjonsspalting (Maniatis, T. , et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Det resulterende plasmidet ble betegnet pBM-CRlc. The sCRlc insert (approximately 5.9 kb) was excised from pBSCRlc using XhoI and then ligated into the unique XhoI site of vector pBMT3X. The correct orientation of the sCRlc insert in pBMT3X was determined by restriction digestion (Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). The resulting plasmid was designated pBM-CRlc.

11.2.4. Konstruksjon av deles. i onsmutantene pT- CRlcl. pT-CRlc2. pT- CRlc3. pT- CR1c4 og pT- CRlc5 11.2.4. Construction of parts. in the ons mutants pT- CRlcl. pT-CRlc2. pT-CRlc3. pT-CR1c4 and pT-CRlc5

Forskjellige delesjonsmutanter ble også konstruert som spesifikt deleterte deler av sCRl cDNA (fig. 20). Hver delesjonsmutant mangler transmembranregionen til fullengde cDNA slik at ekspresjon av mutantene ville tilveiebringe oppløselige polypeptider. Various deletion mutants were also constructed as specifically deleted portions of the sCR1 cDNA (Fig. 20). Each deletion mutant lacks the transmembrane region of the full-length cDNA so that expression of the mutants would provide soluble polypeptides.

11.2.4.1. pT- CRlcl 11.2.4.1. pT-CRlcl

pBSCRlc ble spaltet med Smal, resulterende i to fragmenter på størrelse 2,56 kb og 7,3 kb. Disse fragmentene ble separert ved agarose gelelektroforese og 7,3 kb fragmentet ble renset og religert til seg selv. E. coli DH5a celler ble gjort kompetente (Morrison, D.A., 1979, Meth. Enzymol. 68:326-331) og deretter transformert med ligeringsblanding. Det resulterende plasmidet ble betegnet pBL-CRlcl. Denne konstruksjonen fjernet 38$ LHR-B, 100$ LHR-C og 51$ LHR-D av CRlc innskuddet. Det dannet i tillegg Smal setet ved grensen 2335/4894 bp og opprettholdt riktig translasjonsramme. pBL-CRlcl ble spaltet med Xhol og CR1 innskuddet ble separert fra pBluscript-vektor. Det isolerte CR1 fragmentet ble deretter skutt inn i det unike Xhol sete til ekspresjonsvektor pTCSgpt for å produsere plasmid pT-CRlcl. pBSCRlc was digested with SmaI, resulting in two fragments of size 2.56 kb and 7.3 kb. These fragments were separated by agarose gel electrophoresis and the 7.3 kb fragment was purified and religated to itself. E. coli DH5α cells were made competent (Morrison, D.A., 1979, Meth. Enzymol. 68:326-331) and then transformed with ligation mixture. The resulting plasmid was designated pBL-CRlcl. This construction removed 38$ LHR-B, 100$ LHR-C and 51$ LHR-D of the CRlc deposit. It additionally formed the Smal seat at the 2335/4894 bp boundary and maintained the correct translation frame. pBL-CR1c1 was digested with XhoI and the CR1 insert was separated from pBluscript vector. The isolated CR1 fragment was then inserted into the unique XhoI site of expression vector pTCSgpt to produce plasmid pT-CRlcl.

11.2.4.2. pT- CRlc2 11.2.4.2. pT-CRlc2

pBSCRlc ble spaltet med Clal og Ball, resulterende i to fragmenter med størrelse 3,96 kb og 5,9 kb. Disse fragmentene ble renset fra en agarosegel. Plasmid pBR322 ble spaltet med Clal og Ball og 2,9 kb pBR322 fragmentet ble renset og ligert til 5,9 kb fragmentet fra pBSCRlc. E. coli DH5cx cellene ble transformert med ligeringsblandingen og det resulterende plasmidet ble betegnet pBR8.8. Dette plasmidet ble spaltet med Xbal, som dannet to fragmenter med størrelse 7,45 kb og 1,35 kb. 7,45 kb fragmentet ble renset fra en agarosegel og religert til seg selv. Det resulterende plasmidet, pBR7.45 ble spaltet med Clal og Ball, og det isolerte 4,5 kb fragmentet inneholdende sCRl cDNA ble ligert til 3,96 kb fragmentet fra pBSCRlc, resulterende i plasmid pBL-CRlc2. Denne konstruksjonen fjernet 90$ av LHR-B i sCRl innskuddet, regenererte Xbal setet ved grensen 1637/2987 bp, og opprettholdt riktig leseramme. pBL-CRlc2 ble spaltet med Xhol, og sCRl innskuddet ble separert fra pBluescript-vektoren. De isolerte sCRl fragmentet ble deretter skutt inn i det unike Xhol setet til ekspresjonsvektor pT-CRSgpt for å produsere plasmid pT-CRlc2. pBSCRlc was digested with ClaI and Ball, resulting in two fragments of size 3.96 kb and 5.9 kb. These fragments were purified from an agarose gel. Plasmid pBR322 was digested with ClaI and Ball and the 2.9 kb pBR322 fragment was purified and ligated to the 5.9 kb fragment from pBSCRlc. The E. coli DH5cx cells were transformed with the ligation mixture and the resulting plasmid was designated pBR8.8. This plasmid was digested with XbaI, which produced two fragments of size 7.45 kb and 1.35 kb. The 7.45 kb fragment was purified from an agarose gel and religated to itself. The resulting plasmid, pBR7.45 was digested with ClaI and Ball, and the isolated 4.5 kb fragment containing the sCR1 cDNA was ligated to the 3.96 kb fragment from pBSCR1c, resulting in plasmid pBL-CRlc2. This construct removed 90$ of LHR-B in the sCR1 insert, regenerated the Xbal site at the 1637/2987 bp boundary, and maintained the correct reading frame. pBL-CRlc2 was digested with XhoI, and the sCR1 insert was separated from the pBluescript vector. The isolated sCR1 fragment was then inserted into the unique XhoI site of expression vector pT-CRSgpt to produce plasmid pT-CRlc2.

11.2.4.3. PT- CR1C3 11.2.4.3. PT-CR1C3

pBSCRlc ble spaltet med Nsil resulterende i tre fragmenter med størrelse 1,09 kb, 1,35 kb og 7,46 kb. 7,46 kb fragmentet ble renset fra en agarosegel og religert til seg selv, for å danne plasmid pBL-CRlc3. Denne konstruksjonen fjernet 71$ LHR-A og resten av CR1 innskuddet. Nsil setet ble regenerert ved grensen 463/2907 bp. Translasjonsrammen ble modifisert slik at et nonsenskodon ble ført inn rett etter det regenererte Nsil setet. pBL-CRlc3 ble spaltet med Xhol og sCRl innskuddet separert fra pBluescript-vektoren. Det isolerte sCRl fragmentet ble deretter skutt inn i det unike Xhol setet til ekspresjonsvektor pTCSgpt for å produsere plasmid pT-CRlc3. pBSCRlc was digested with NsiI resulting in three fragments of size 1.09 kb, 1.35 kb and 7.46 kb. The 7.46 kb fragment was purified from an agarose gel and religated to itself to form plasmid pBL-CRlc3. This build removed the 71$ LHR-A and the rest of the CR1 deposit. The Nsil site was regenerated at the 463/2907 bp boundary. The translation frame was modified so that a nonsense codon was introduced immediately after the regenerated Nsil site. pBL-CRlc3 was digested with XhoI and the sCR1 insert separated from the pBluescript vector. The isolated sCR1 fragment was then inserted into the unique XhoI site of expression vector pTCSgpt to produce plasmid pT-CRlc3.

11.2.4.4. pT- CRlc4 11.2.4.4. pT-CRlc4

pBSCRlc spaltet med Pstl. Pstl setet i polyregionen til pBluescript var blitt fjernet i løpet av ligering av CR1 cDNA til denne vektoren (eksempel 8.1, ovenfor). Resulterende fragmenter med størrelse 1,35 kb og 8,5 kb ble separert ved gelelektroforese, og 8,5 kb fragmentet ble renset og religert til seg selv, med dannelse av plasmid pBL-CRlc4. Denne konstruksjonen fjernet 31$ LHR-A og 69$ LHR-B av sCRl innskuddet. Pstl setet ble regenerert ved grensen 1074/2424 bp, som dermed opprettholder riktig leseramme. pBL-CRlc4 ble spaltet med Xhol og sCRl innskuddet separert fra pBluescript-vektoren. Det isolerte sCRl fragmentet ble deretter skutt inn i det unike Xhol setet til ekspresjonsvektor pTCSgpt for å produsere plasmid pT-CRlc4. pBSCRlc cleaved with Pstl. The pstl site in the polyregion of pBluescript had been removed during ligation of the CR1 cDNA into this vector (Example 8.1, above). Resulting fragments of size 1.35 kb and 8.5 kb were separated by gel electrophoresis, and the 8.5 kb fragment was purified and religated to itself, forming plasmid pBL-CRlc4. This construct removed 31$ LHR-A and 69$ LHR-B of the sCRl deposit. The Pstl site was regenerated at the 1074/2424 bp boundary, which thus maintains the correct reading frame. pBL-CRlc4 was digested with XhoI and the sCR1 insert separated from the pBluescript vector. The isolated sCR1 fragment was then inserted into the unique XhoI site of expression vector pTCSgpt to produce plasmid pT-CRlc4.

11.2.4.5. pT- CRlc5 11.2.4.5. pT-CRlc5

pBL-CRlcl ble spaltet med Smal, som dermed lineariserer plasmidet ved det unike Smal setet. Plasmidet ble defos-forylert, og ligert til fosforylert Nhel linker inneholdende et nonsenskodon (New England Biolabs, Beverley, MA). Denne linkertypen inneholder et translasjonsstoppkodon i alle tre mulige leserammer, og inneholder også et Nhel restriksjons- pBL-CRlcl was digested with SmaI, which thus linearizes the plasmid at the unique SmaI site. The plasmid was dephosphorylated, and ligated to phosphorylated NheI linker containing a nonsense codon (New England Biolabs, Beverley, MA). This linker type contains a translation stop codon in all three possible reading frames, and also contains an NheI restriction

sete, som letter bekreftnlng på nærvær av nonsenslinkeren 1 sCRl cDNA. Det resulterende plasmidet ble betegnet pBL-CRlc5, og det inneholder LHR-A og 62$ LHR-B av sCRl cDNA. pBL-CRlc5 ble spaltet med Xhol, og sCRl innskuddet ble separert fra pBluescript-vektoren. Det isolerte sCRl fragmentet ble deretter skutt inn i det unike Xhol setet til ekspresjonsvektor pTCSgpt for å produsere plasmid pT-CRlc5. site, which facilitates confirmation of the presence of the nonsense linker 1 sCR1 cDNA. The resulting plasmid was designated pBL-CRlc5, and it contains LHR-A and 62% LHR-B of the sCR1 cDNA. pBL-CRlc5 was digested with XhoI, and the sCR1 insert was separated from the pBluescript vector. The isolated sCR1 fragment was then inserted into the unique XhoI site of expression vector pTCSgpt to produce plasmid pT-CRlc5.

11.3. Ekspresjon av oppløselig CR1 11.3. Expression of soluble CR1

Som demonstrert heri, er ekspresjon av en oppløselig form av CR1 som kan bli utskilt fra celler i høyt utbytte (i) ikke begrenset til et nøyaktig sted i CR1 cDNA som bli anvendt for delesjon eller forkorting, og (ii) er heller ikke begrenset til anvendelse av en bestemt ekspresjonsvektor (se nedenfor). Evnen til å produsere utskilt sCRl ble demonstrert i to forskjellige ekspressjonssystemer. As demonstrated herein, expression of a soluble form of CR1 that can be secreted from cells in high yield is (i) not limited to a precise site in the CR1 cDNA to be used for deletion or truncation, and (ii) is also not limited to use of a particular expression vector (see below). The ability to produce secreted sCR1 was demonstrated in two different expression systems.

11.3.1. Konstruksjon av pTCS serier av ekspresjonsvektorene pTCS seriene av ekspresjonsvektorene som ble anvendt besto av tre plasmider, hvert med et unikt Xhol kloningssete for innskudd av cDNA (fig. 21). Transkripsjon av innskutt cDNA er drevet av et sett tandempromotere. SV40 tidligpromoter som er beliggende oppstrøms for adenovirus 2 hovedsenpromoter (AD2 MLP). Mellom begynnelsen til cDNA og AD2 MLP er adenovirus tripartitlederen. Transkriberte mRNA blir terminert ved et polyadenyleringssignal tilveiebragt av murin immunoglobulin kappa (Igø) sekvenser beliggende nedstrøms for Xhol cDNa kloningssete. Selekterbare markører xantin-guaninfosforibo-syltransferase (gpt), dihydrofolatreduktase (dhfr), eller neomycinresistens (neo<r>), ble tilveiebragt ved innskudd av tilsvarende markører fra henholdsvis pSV2gpt, pSV2dhfr, eller pSV2neo. Disse plasmidene var også kilden for bakteriell replikasjonsorigo og P-laktamasegenet for ampicillinresistens. Valg av hvilke av disse vektorene som bør anvendes avhenger av hvilken selekterbar markør eller kombinasjon av markører er foretrukket for seleksjon av rekombinantene. 11.3.1. Construction of pTCS series of the expression vectors The pTCS series of the expression vectors used consisted of three plasmids, each with a unique Xhol cloning site for insertion of cDNA (Fig. 21). Transcription of inserted cDNA is driven by a set of tandem promoters. SV40 early promoter located upstream of the adenovirus 2 major late promoter (AD2 MLP). Between the beginning of the cDNA and the AD2 MLP is the adenovirus tripartite leader. Transcribed mRNAs are terminated by a polyadenylation signal provided by murine immunoglobulin kappa (Igø) sequences located downstream of the Xhol cDNA cloning site. Selectable markers xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (gpt), dihydrofolate reductase (dhfr), or neomycin resistance (neo<r>), were provided by insertion of corresponding markers from pSV2gpt, pSV2dhfr, or pSV2neo, respectively. These plasmids were also the source of the bacterial origin of replication and the β-lactamase gene for ampicillin resistance. The choice of which of these vectors should be used depends on which selectable marker or combination of markers is preferred for selection of the recombinants.

Fullstendige DNA sekvenser er kjent for adenovirus 2 (Ad2), SV40, psV2cat (Gorman, C, 1985, DNA Cloning, Volume II, A Practical Approach, ed. D.M. Glover, IRL Press, s. 143-190), og murin immunoglobulin kappa. Sekvensene er beliggende i genbankdatabasen og National Biomedical Research merknader og referanser. Hvilke som helst av disse sekvensene kan også virke som en kilde for hensiktsmessige segmenter av pTCS vektorene. Complete DNA sequences are known for adenovirus 2 (Ad2), SV40, psV2cat (Gorman, C, 1985, DNA Cloning, Volume II, A Practical Approach, ed. D.M. Glover, IRL Press, pp. 143-190), and murine immunoglobulin coat. The sequences are located in the gene bank database and National Biomedical Research notes and references. Any of these sequences may also serve as a source for appropriate segments of the pTCS vectors.

Vektorene pTCSgpt, pTCSneo, og pTCS dhfr ble konstruert fra de intermediære plasmidene pEAXgpt og pMLEgpt som følger: The vectors pTCSgpt, pTCSneo, and pTCS dhfr were constructed from the intermediate plasmids pEAXgpt and pMLEgpt as follows:

11.3.1.1. Konstruksjon av pEAXgpt 11.3.1.1. Construction of pEAXgpt

Trinn 1. Ad2 MLP DNA fragmentet ble avledet fra M13 mp9/MLP (Concino, M.F., et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:8493-8496). Dette plasmidet inneholder adenovirus 2 sekvensene av nukleotidene 5778 (Xhol setet) til 6231 (Hindlll setet) inkludert PvuII restriksjonssetet ved nukleotid 6069 og SacII setet ved nukleotid 5791 (se NBRF nukleindatabase, aksessjons #Gdad2). Xhol til Hindlll fragmentet er blitt klonet inn i Hindlll og Sali setene til M13 mp9 ved å danne plasmid M13 mp9/MLP. Step 1. The Ad2 MLP DNA fragment was derived from M13 mp9/MLP (Concino, M.F., et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:8493-8496). This plasmid contains the adenovirus 2 sequences of nucleotides 5778 (Xhol site) to 6231 (Hindlll site) including the PvuII restriction site at nucleotide 6069 and the SacII site at nucleotide 5791 (see NBRF nucleic database, accession #Gdad2). The XhoI to HindIII fragment has been cloned into the HindIII and SalI sites of M13 mp9 creating plasmid M13 mp9/MLP.

Plasmid M13 mp9/MLP ble spaltet med EcoRI og Hindlll og det mindre MLP inneholdende fragmentet ble isolert. Et pUC plasmid (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) ble også spaltet med EcoRI og Hindlll og det større fragmentet fra dette plasmidet ble deretter ligert til EcoRI til Hindlll MLP fragmentet. Dette resulterte i et nytt MLP-inneholdende plasmid med plasmidslette til pUC. Dette plasmidet ble spaltet med Smal, ligert til Sali linkere og resirkularisert. Dette nye plasmidet ble deretter spaltet med PvuII som spaltet plasmidet ved PvuII setet beliggende i posisjon nr. 6069 innenfor adenovirus 2 innskuddssekvensene. Det resulterende lineære fragmentet ble ligert til Xhol linkere og resirkularisert. Dette plasmidet ble deretter spaltet med Xhol og Sali og det mindre fragmentet inneholdende MLP DNA ble isolert (fragment nr. 1). Plasmid M13 mp9/MLP was digested with EcoRI and HindIII and the smaller MLP containing fragment was isolated. A pUC plasmid (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) was also digested with EcoRI and HindIII and the larger fragment from this plasmid was then ligated to EcoRI to the HindIII MLP fragment. This resulted in a new MLP-containing plasmid with plasmid deletion to pUC. This plasmid was digested with SmaI, ligated to SalI linkers and recircularized. This new plasmid was then digested with PvuII which cleaved the plasmid at the PvuII site located at position #6069 within the adenovirus 2 insert sequences. The resulting linear fragment was ligated to Xhol linkers and recircularized. This plasmid was then digested with XhoI and SalI and the smaller fragment containing MLP DNA was isolated (fragment no. 1).

Trinn 2. Plasmid pSV2gpt (American Type Culture Collection (ATCC) Aksessjonsnr. 37145), ble spaltet med PvuII, ligert til Sali linkere, og spaltet med Sali. Sluttproduktet var et lineært pSV2gpt fragment som virket som kilde for gpt genet (fragment nr. 2). Step 2. Plasmid pSV2gpt (American Type Culture Collection (ATCC) Accession No. 37145), was digested with PvuII, ligated to SalI linkers, and digested with SalI. The end product was a linear pSV2gpt fragment which acted as a source for the gpt gene (fragment no. 2).

Trinn 3. Et murint immunoglobulin Igø fragment (Hieter, P.A., et al., 1980, Cell 22:197-207 ) ble spaltet med Haelll og AvalI og fragmentet inneholdende polyadenyleringssekvensene ble isolert. I den murine lg kappa sekvensen tilgjengelig i NBRF nukleindatabasen (aksessjonsnr. Kcms), er lg stoppkodonet i posisjon 1296, etterfulgt av Avall setet ved 1306, AATAAA polyadenyleringssetet ved 1484 og Haelll setet ved 1714. Overhengende ender til dette fragmentet ble fyllt i med E. coli DNA polymerase, og fragmentet ble deretter ligert til Xhol linkere, og spaltet med Xhol. Dette fragmentet (fragment nr. 3) virker som kilde for polyadenyleringssetet. Step 3. A murine immunoglobulin Igø fragment (Hieter, P.A., et al., 1980, Cell 22:197-207) was digested with HaelII and AvalI and the fragment containing the polyadenylation sequences was isolated. In the murine lg kappa sequence available in the NBRF nucleic database (accession no. Kcms), the lg stop codon is at position 1296, followed by the Avall site at 1306, the AATAAA polyadenylation site at 1484, and the Haelll site at 1714. Overhanging ends of this fragment were filled in with E .coli DNA polymerase, and the fragment was then ligated to XhoI linkers, and cleaved with XhoI. This fragment (fragment no. 3) acts as a source for the polyadenylation site.

Trinn 4. Fragmentene 1, 2 og 3 ble ligert sammen med T4 DNA ligase for å produsere et sirkulært plasmid. Den riktige orienteringen til fragmentene i dette plasmidet ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Nedstrøms for Xhol cDNA kloningssetet var murin kappapolyadenyleringssetet, og ytterligere nedstrøms for dette setet var SV40 promoteren og gpt genet. Oppstrøms for Xhol setet var MLP promoteren og videre oppstrøms fra denne promoteren var det bakterielle replikasjonsorigo og ampicillingenet. Dette plasmidet ble deretter spaltet med Sali og overhengende ender fyllt i med E. coli DNA polymerase. Det resulterende buttendede fragmentet ble ligert til EcoRI linkere og resirkularisert med T4 DNA ligase. Dette endelige plasmidet ble betegnet pEAXgpt. Step 4. Fragments 1, 2 and 3 were ligated together with T4 DNA ligase to produce a circular plasmid. The correct orientation of the fragments in this plasmid was confirmed by restriction enzyme analysis. Downstream of the Xhol cDNA cloning site was the murine kappa polyadenylation site, and further downstream of this site was the SV40 promoter and the gpt gene. Upstream of the Xhol site was the MLP promoter and further upstream from this promoter was the bacterial origin of replication and the ampicillin gene. This plasmid was then digested with SalI and overhanging ends filled in with E. coli DNA polymerase. The resulting butt-ended fragment was ligated to EcoRI linkers and recircularized with T4 DNA ligase. This final plasmid was designated pEAXgpt.

11.3.1.2. Konstruksjon av pMLEgpt 11.3.1.2. Construction of pMLEgpt

Trinn 1. Plasmid pMLP CAT (Lee, R.F., et al., 1988, Virology, 165:51-56) er et ekspresjonsplasmid med et pML vektorsjelett og inneholder adenovirus 2 MLP og tripartittledersekvensene Step 1. Plasmid pMLP CAT (Lee, R.F., et al., 1988, Virology, 165:51-56) is an expression plasmid with a pML vector cell and contains the adenovirus 2 MLP and tripartite leader sequences

5' for CAT genet. pMLP CAT ble spaltet med Xhol og SacII, Xhol kutt ved et sete mellom CAT genet og L3 regionen til tripartittlederen, og SacII kutt i posisjon nr. 5791 innenfor adenovirus DNA men 5' for MLP. AD2 MLP og tripartittlederen var dermed beliggende på dette lille Xhol til SacII fragmentet (fragment nr. 4). 5' for the CAT gene. pMLP CAT was cleaved with XhoI and SacII, XhoI cut at a site between the CAT gene and the L3 region of the tripartite leader, and SacII cut at position #5791 within the adenovirus DNA but 5' to MLP. AD2 MLP and the tripartite leader were thus located on this small Xhol to SacII fragment (fragment no. 4).

Trinn 2. Plasmid pEAXgpt ble spaltet med Xhol og SacII, og det mindre MLP inneholdende fragmentet ble fjernet. Det større fragmentet (fragment nr. 5) ble isolert. Fragmentene 4 og 5, begge med SacII og Xhol ender, ble ligert for å produsere plasmid pMLEgpt. Step 2. Plasmid pEAXgpt was digested with XhoI and SacII and the smaller MLP containing fragment was removed. The larger fragment (fragment no. 5) was isolated. Fragments 4 and 5, both with SacII and XhoI ends, were ligated to produce plasmid pMLEgpt.

11.3.1.3. Konstruksjon av pTCSgpt 11.3.1.3. Construction of pTCSgpt

Trinn 1. pMLEgpt ble spaltet med SacII og endene fyllt i med T4 DNA polymerase for å tilveiebringe et buttendet fragment (fragment nr. 6). Dette SacII setet er beliggende ved nukleotid 5791 i adenovirus 2 sekvensen, 5' for MLP-tripartittlederen. Step 1. pMLEgpt was digested with SacII and the ends filled in with T4 DNA polymerase to provide a butt-ended fragment (fragment no. 6). This SacII site is located at nucleotide 5791 in the adenovirus 2 sequence, 5' of the MLP tripartite leader.

Trinn 2. pSV2dhfr (ATCC Aksessjonsnr. 37146) ble spaltet med Hindlll og PvuII. Det mindre 342 nukleotidfragmentet inneholdende SV40 tidligpromoter ble buttendet ved anvendelse Klenow fragmenter til E. coli DNA polymerase (fragment nr. 7). Fragmentene 6 og 7 ble ligert med T4 DNA ligase. Restriksjonsenzymanalyse bekreftet at fragmentene var riktig orientert for å tilveiebringe to, tandempromotere oppstrøms for Xhol cDNA kloningssete, der hver promoter kan prime RNA syntese i samme retning. Dette plasmidet ble betegnet pTCSgpt (fig. 22). Step 2. pSV2dhfr (ATCC Accession No. 37146) was digested with HindIII and PvuII. The smaller 342 nucleotide fragment containing the SV40 early promoter was blunted using Klenow fragments for E. coli DNA polymerase (fragment no. 7). Fragments 6 and 7 were ligated with T4 DNA ligase. Restriction enzyme analysis confirmed that the fragments were correctly oriented to provide two, tandem promoters upstream of the Xhol cDNA cloning site, where each promoter can prime RNA synthesis in the same direction. This plasmid was designated pTCSgpt (Fig. 22).

11.3.1.4. Konstruksjon av pTCSdhfr 11.3.1.4. Construction of pTCSdhfr

Trinn 1. pSV2dhfr ble spaltet med Hindlll og PvuII, og det større fragmentet ble deretter renset fra en agarosegel (fragment nr. 8). Det mindre SV40 tidligpromotorinneholdende fragmentet ble fjernet. Step 1. pSV2dhfr was digested with HindIII and PvuII, and the larger fragment was then purified from an agarose gel (fragment no. 8). The smaller SV40 early promoter-containing fragment was removed.

Trinn 2. pTCSgpt ble spaltet med EcoRI og deretter fyllt i med Klenow fragmentet til E. coli DNA polymerase for å danne butte ender. Dette lineære fragmentet ble deretter spaltet med Hindlll, og fragmentet (omtrent 1600 nukleotider) inneholdende pTCS transkripsjonsenheten til SV40 promoter, MLP, tripartittleder, Xhol cDNA kloningssete, murine IgX sekvenser og annen SV40 promoter ble isolert (fragment nr. 9). Dette fragmentet hadde en buttende og en Hindlll overhengende ende. Ligering av fragmentene 8 og 9 dannet plasmid pTCSdhfr. Step 2. pTCSgpt was digested with EcoRI and then filled in with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase to form blunt ends. This linear fragment was then digested with HindIII, and the fragment (approximately 1600 nucleotides) containing the pTCS transcription unit of SV40 promoter, MLP, tripartite leader, Xhol cDNA cloning site, murine IgX sequences and other SV40 promoter was isolated (fragment no. 9). This fragment had a butted end and a Hindlll overhanging end. Ligation of fragments 8 and 9 produced plasmid pTCSdhfr.

11.3.1.5. Konstruks. 1 onn av pTCSneo 11.3.1.5. Construction. 1 onn of pTCSneo

Trinn 1. pSV2neo (ATCC nr. 37149) ble spaltet med Hindlll og BamHI,. og det større fragmentet (fragment nr. 10) ble isolert. Dette fragmentet inneholdt plasmidsjelettet og neogenet. Step 1. pSV2neo (ATCC No. 37149) was digested with HindIII and BamHI. and the larger fragment (fragment no. 10) was isolated. This fragment contained the plasmid cell and the neogene.

Trinn 2. pTCSdhfr ble spaltet med Hindlll og BamHI, og pTCS transkripsjonsenheten (fragment nr. 11) ble isolert fra en agarosegel etter elektroforese av spaltningsproduktene. Ligering av fragmentene 10 og 11 dannet plasmid pTCSneo. Step 2. pTCSdhfr was digested with HindIII and BamHI, and the pTCS transcription unit (fragment no. 11) was isolated from an agarose gel after electrophoresis of the cleavage products. Ligation of fragments 10 and 11 produced plasmid pTCSneo.

11.3.2. Ekspressjon og analyse av plasmidene pBSCRlc. pBSCRls og pBM- CRlc, pattedy r ekspresjons vekt or er inneholdende oppløselig CR1 kodende sekvenser 11.3.2. Expression and analysis of the plasmids pBSCRlc. pBSCRls and pBM-CRlc, pattedy r expression vectors containing soluble CR1 coding sequences

11.3.2.1. Ekspressjon av CR1 konstruksjoner forkortet ved 11.3.2.1. Expression of CR1 constructs abbreviated by

forskjellige posisjoner innenfor CR1 cDNA different positions within the CR1 cDNA

Plasmidene pBSCRlc og pBSCRls ble konstruert (seksjon 11.1, ovenfor) slik at det meste av cDNA kodende regioner, med unntagelse av transmembrane og cytoplasmaregioner var konserverte (fig. 20). pBSCRls er kortere enn pBSCRc p.g.a. at det også mangler en del av LHR-D og SCR 29 og 30 som er tilstede i pBSCRlc. sCRl delene av disse plasmidene ble skutt inn i pTCSgpt, etterfulgt av transfeksjon og ekspresjon som beskreven nedenfor. Plasmids pBSCRlc and pBSCRls were constructed (section 11.1, above) such that most of the cDNA coding regions, with the exception of transmembrane and cytoplasmic regions, were conserved (Fig. 20). pBSCRls is shorter than pBSCRc because that a part of LHR-D and SCR 29 and 30 which are present in pBSCRlc is also missing. The sCR1 portions of these plasmids were inserted into pTCSgpt, followed by transfection and expression as described below.

pBSCRlc/ pTCSgpt konstruksjon: pBSCRlc ble spaltet med Xhol for å tilveiebringe 5,9 kb innskuddet, sCRlc. sCRlc ble skutt inn i Hhol cDNA kloningssetet til pTCSgpt for å danne pBSCRlc/pTCSgpt. pBSCRlc/ pTCSgpt construction: pBSCRlc was digested with XhoI to provide the 5.9 kb insert, sCRlc. sCRlc was inserted into the Hhol cDNA cloning site of pTCSgpt to form pBSCRlc/pTCSgpt.

pBSCRls/ pTCSgpt konstruksjon pBSCRls ble spaltet med Xhol og Pvul for å frigjøre sCRls innskuddet. Endene til innskuddet ble gjort butte med T4 DNA polymerase. Dette innskuddet ble renset fra en agarosegel. Vektor pTCSgpt ble spaltet med Xhol, og overhengende Xhol ender ble fyllt i med E. coli DNA polymerase I. Deretter, ble sCRls innskuddet ligert til den buttendede vektoren for å danne pBSCRls/pTCSgpt. pBSCRls/ pTCSgpt construct pBSCRls was cleaved with XhoI and Pvul to release the sCRls insert. The ends of the insert were blunted with T4 DNA polymerase. This deposit was purified from an agarose gel. Vector pTCSgpt was cleaved with XhoI, and overhanging XhoI ends were filled in with E. coli DNA polymerase I. Then, the sCR1s insert was ligated to the butt-ended vector to form pBSCR1s/pTCSgpt.

Plasmidene pBSCRlc/pTCSgpt og pBSCRls/pTCSgpt ble spaltet med Fspl, og resulterende lineære DNA ble transfektert inn i kinesisk hamster ovarieceller som var mutant i dhfr-genet (CHO DUX Bli celler) via kalsiumfosfatkopresipitasjon med plasmid pSV2dhfr. Transfektantene ble vagt ved deres evne til å dyrke i dhfr-seleksjonsmedium. Kultursupernatanter av transfektantkloner ble analysert for utskilt sCRl ved ELISA. Kultursupernatanter fra femte pBSCRlc/pTCSgpt rekombinanter ble analysert og positive rekombinanter ble kjørt igjennom amplifikasjonsprosessen ved å dyrke disse i økende konsentrasjoner metotreksat. I tillegg, ble pooler av transfektanter preparert ved ko-dyrking av åtte pBSCRlc/pTCSgpt transfektanter sammen pr. pool og gjennomkjøring gjennom samme amplifikasjonsprosess. Resultatene av amplifikasjonen er presentert i tabell VI. pBSCRlc/pTCSgpt-klon 35.6 var den høyeste produsenten som viser 17,7 ug/ml sCRl. The plasmids pBSCRlc/pTCSgpt and pBSCRls/pTCSgpt were cleaved with FspI, and the resulting linear DNA was transfected into Chinese hamster ovary cells mutant in the dhfr gene (CHO DUX Bli cells) via calcium phosphate coprecipitation with plasmid pSV2dhfr. The transfectants were screened by their ability to grow in dhfr selection medium. Culture supernatants of transfectant clones were analyzed for secreted sCR1 by ELISA. Culture supernatants from fifth pBSCRlc/pTCSgpt recombinants were analyzed and positive recombinants were run through the amplification process by growing these in increasing concentrations of methotrexate. In addition, pools of transfectants were prepared by co-culturing eight pBSCRlc/pTCSgpt transfectants together per pool and pass through the same amplification process. The results of the amplification are presented in Table VI. pBSCRlc/pTCSgpt clone 35.6 was the highest producer showing 17.7 µg/ml sCR1.

MTX: metotreksat. MTX: methotrexate.

Tolv rekombinanter fra pBSCRl/pTCSgpt ble analysert for produksjon av oppløselig CR1 ved ELISA. Alle tolv kandidatene viste detekterbare nivåer av utskilt sCRl. De beste produsen-tene ga sCRl nivåer som kunne sammenlignes med de som ble produsert av beste pBSCRlc/pTCSgpt transfektanter. Twelve recombinants from pBSCR1/pTCSgpt were analyzed for production of soluble CR1 by ELISA. All twelve candidates showed detectable levels of secreted sCR1. The best producers gave sCR1 levels comparable to those produced by best pBSCR1/pTCSgpt transfectants.

pBSCRlc/pTCSgpt og pBSCRls/pTCSgpt rekombinanter produserte oppløselige CR1 med lignende produksjonsnivåer. Dette viste at evnen til å produsere et oppløselig CR1 polypeptid ikke var avhengig av et nøyaktig forkortelsespunkt innenfor CR1 cDNA. pBSCRlc/pTCSgpt and pBSCRls/pTCSgpt recombinants produced soluble CR1 with similar production levels. This showed that the ability to produce a soluble CR1 polypeptide was not dependent on a precise point of truncation within the CR1 cDNA.

11.3.2.2. Ekspresjons av sCRlc i to forskjellige ekspre-sj onssystemer 11.3.2.2. Expression of sCRlc in two different expression systems

Det forkortede CR1 cDNA innskuddet, sCRlc, ble skutt inn i ekspresjonsvektor ptCSgpt og uttrykt som beskrevet ovenfor. Det ble også skutt inn i ekspresjonsvektor pBMT3X som beskrevet ovenfor i seksjon 11.2.3, for å tilveiebringe pBM-CRlc. Begge disse ekspresjonsvektorene har meget sterke promotere. Ekspresjon av oppløselig CR1 ble testet i begge systemene for å bestemme om et system kunne produsere bedre utbytter av utskilt polypeptid. The shortened CR1 cDNA insert, sCRlc, was inserted into the expression vector ptCSgpt and expressed as described above. It was also inserted into expression vector pBMT3X as described above in section 11.2.3, to provide pBM-CRlc. Both of these expression vectors have very strong promoters. Expression of soluble CR1 was tested in both systems to determine if one system could produce better yields of secreted polypeptide.

C127I museceller (ATCC aksessjonsnr. CRL 1616, Rockville, Maryland) ble transfektert med pBM-CRlc ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden (Graham, F.L. og van der Eb, A.J., 1973, Virology 52:456-467). Etter glyserolsjokk, ble cellene på ny matet med D-MEM medium inneholdende 10$ føtalt bovint serum og 2 mM L-glutamin, og inkubert ved 37'C i 48 timer. Deretter ble cellene trypsinert, og fordelt ved 1:5 og 1:10 forhold inn i komplett D-MEM medium pluss 10 um kadmiumklorid. Kadmium-resistente kolonier framkom i løpet av 10 dager. Ti kolonier ble fjernet med anvendelse av kloningssylindere. Hver koloni ble overført til en 60 mM petriskål inneholdende komplett D-MEM medium, og inkubert ved 37"C, 5$ C02 inntil cellene oppnådde konfluens. C127I mouse cells (ATCC Accession No. CRL 1616, Rockville, Maryland) were transfected with pBM-CRlc using the calcium phosphate method (Graham, F.L. and van der Eb, A.J., 1973, Virology 52:456-467). After glycerol shock, the cells were fed again with D-MEM medium containing 10% fetal bovine serum and 2 mM L-glutamine, and incubated at 37°C for 48 hours. The cells were then trypsinized, and distributed at 1:5 and 1:10 ratios into complete D-MEM medium plus 10 µm cadmium chloride. Cadmium-resistant colonies appeared within 10 days. Ten colonies were removed using cloning cylinders. Each colony was transferred to a 60 mM petri dish containing complete D-MEM medium, and incubated at 37°C, 5% CO 2 until the cells reached confluence.

Deretter, for hver skål, ble de trypsinert og delt inn i tre 60 mm skåler som blir anvendt for preparering av lågere av frosne celler, RNA ekstraksjon og ELISA test av cellemediet for nærvær av utskilt sCRlc. Then, for each dish, they were trypsinized and divided into three 60 mm dishes which are used for the preparation of layers of frozen cells, RNA extraction and ELISA testing of the cell medium for the presence of secreted sCRlc.

Når cellemedium fra hver konfluent petriskål ble fjernet og utsatt for ELISA analyse var alle pBM-CRlc klonene som ble testet positive for oppløselig CR1 produksjon. Nivåer av utskilt sCRl fra pBM-CRlc rekombinanter var sammenlignbart med de fra pBSCRlc/pTCSgpt rekombinantene. Dette indikerte at evnen til å produsere høye nivåer av utskilt sCRl polypeptid ikke var avhengig av anvendelsen av bare visse promotere eller ekspresjonssystemer. When cell medium from each confluent Petri dish was removed and subjected to ELISA analysis, all pBM-CRlc clones tested were positive for soluble CR1 production. Levels of secreted sCR1 from pBM-CRlc recombinants were comparable to those from the pBSCRlc/pTCSgpt recombinants. This indicated that the ability to produce high levels of secreted sCR1 polypeptide was not dependent on the use of only certain promoters or expression systems.

11.3.3. Ekspresjon og analyse av plasmidene pT- CRlcl. pT-CRlc2. pT- CRlc3. pT- CR1c4. og pT- CRlc5. pattedvrekspre-s. ionsvektorer inneholdende oppløselige CR1 kodende sekvenser pT-CRlc seriene av delesjonsmutantene manglet transmembrane og cytoplasmadomener, som konstruksjonene, pBSCRlc og pBSCRls. I tillegg inneholdt delesjonsmutantene også nokså store delesjoner i forskjellige LHR regioner av CR1 cDNA (se fig. 20). Delesjonsmutantene ble uttrykt i CHO DUX Bil celler og nivåene av oppløselig CR1 polypeptid produsert ble målt. 11.3.3. Expression and analysis of the plasmids pT-CRlcl. pT-CRlc2. pT-CRlc3. pT-CR1c4. and pT-CRlc5. pattedvrekspre-s. ion vectors containing soluble CR1 coding sequences pT-CRlc series of the deletion mutants lacking transmembrane and cytoplasmic domains, like the constructs, pBSCRlc and pBSCRls. In addition, the deletion mutants also contained quite large deletions in different LHR regions of CR1 cDNA (see fig. 20). The deletion mutants were expressed in CHO DUX Bil cells and the levels of soluble CR1 polypeptide produced were measured.

For hver delesjonskonstruksjon ble førti forskjellige pooler av kloner selektert for ELISA analyse for å bestemme om oppløselige CR1 polypeptider ble produsert. Alle fem pT-CRlc konstruksjonene ble funnet å utskille sCRl inn i cellekulturmediet, som bestemt enten ved ELISA eller ved tilstedeværelse av funksjonell aktivitet i cellekulturmediet. Supernatanter fra celler transfektert med fire av fem pT-CRlc konstruksjoner produserte sCRl som var funksjonell som bestemt ved en hemolyttisk analyse (se tabell VII og seksjon 13.2, nedenfor). For each deletion construct, forty different pools of clones were selected for ELISA analysis to determine whether soluble CR1 polypeptides were produced. All five pT-CRlc constructs were found to secrete sCR1 into the cell culture medium, as determined either by ELISA or by the presence of functional activity in the cell culture medium. Supernatants from cells transfected with four of five pT-CRlc constructs produced sCR1 that was functional as determined by a hemolytic assay (see Table VII and Section 13.2, below).

Det faktum at delesjonsmutantene også kunne produsere oppløselig CR1, demonstrerte videre at evnen til å uttrykke sCRl ikke var avhengig av en nøyaktig genetisk modifikasjon av CR1 cDNA. Dersom transmembranregionene ble deletert kunne alle konstruksjoner produsere et oppløselig polypeptid. The fact that the deletion mutants could also produce soluble CR1 further demonstrated that the ability to express sCR1 was not dependent on a precise genetic modification of the CR1 cDNA. If the transmembrane regions were deleted, all constructs could produce a soluble polypeptide.

12. EKSEMPEL: PRODUKSJON OG RENSING AV OPPLØSELIG CR1 12. EXAMPLE: PRODUCTION AND PURIFICATION OF SOLUBLE CR1

Store mengder sCRl ble produsert i et hult fiber bioreaktor-system. Mengder av sCRl tilveiebragt var proporsjonal med det relative utbyttet av inokkulerte rekombinante kloner. For optimale rensningsresulater ble et serum-fritt medium valgt som resulterte i høye produksjonsnivåer av sCRl i fravær av store mengder eksogent tilsatt føtalt kalveserumpolypeptider. Large amounts of sCR1 were produced in a hollow fiber bioreactor system. Amounts of sCR1 provided were proportional to the relative yield of inoculated recombinant clones. For optimal purification results, a serum-free medium was chosen which resulted in high production levels of sCR1 in the absence of large amounts of exogenously added fetal calf serum polypeptides.

12.1. Stor skalaproduks. ion av oppløselig CR1 12.1. Large scale production. ion of soluble CR1

Et Cell-Pharm cellekultursystem I (CD Medical, Inc., Miami Lakes, FL), utstyrt med en modell IV-L hul fiber bioreaktor (30 kD molekylvektsavkutt), ble opptilt under sterile betingelser. To kloner (klon 2 og klon 35 til pBSCRlc/pTCSgpt) ble ekspandert i åtte T-225 flasker. Ved konfluens ble cellene trypsinert, vasket, pelletert og resuspendert i kulturmediet. Omtrent 5 x 10<8> celler fra klon 2 og 10 x 10<8> celler fra klon 35 ble innokkulert i to separate hule fiber bioreaktorer. Et 20 1 tilførselsreservoar av a-MEM pluss 10$ føtalt kalveserum, 8 mM L-glutamin, 100 ug/ml penicillin-streptomycin og hensiktsmessig konsentrasjon av metotreksat (50 nM for klon 2; 500 nM for klon 35) ble anvendt. Forblandet gass (5$ CO2 i luft) ble boblet inn i reservoarmediet gjennom oksygenatoren for å opprettholde pH. Mediairesirkulering, erstatning og gasstrømningshastigheter ble justert for å tilveiebringe maksimal produksjon. Prøver ble høstet gjennom inokkulerende porter, sentrifugert ved 1,000 rpm i 10 minutter, filtrert gjennom et 0,2 pm porestør-relsesfilter og holdt ved 4°C før rensning. Høstevolumet og frekvens ble gradvis øket fra 25 ml , 3 ganger pr. uke ved begynnelse av kulturen, til 40 ml, 5 ganger i uken etter 2-3 måneder. Produksjon av sCRl ble analysert ved en CR1 ELISA. Utbyttene til klon 2 og klon 35 for første måned etter inokkulasjon var 66 ug/dag og 1060 ug/dag. Disse utbyttene økte når kulturene ble etablert. A Cell-Pharm cell culture system I (CD Medical, Inc., Miami Lakes, FL), equipped with a model IV-L hollow fiber bioreactor (30 kD molecular weight cutoff), was set up under sterile conditions. Two clones (clone 2 and clone 35 of pBSCRlc/pTCSgpt) were expanded in eight T-225 flasks. At confluence, the cells were trypsinized, washed, pelleted and resuspended in the culture medium. Approximately 5 x 10<8> cells from clone 2 and 10 x 10<8> cells from clone 35 were inoculated into two separate hollow fiber bioreactors. A 20 L feed reservoir of α-MEM plus 10 µl fetal calf serum, 8 mM L-glutamine, 100 µg/ml penicillin-streptomycin and appropriate concentration of methotrexate (50 nM for clone 2; 500 nM for clone 35) was used. Premixed gas (5$ CO2 in air) was bubbled into the reservoir medium through the oxygenator to maintain pH. Media recirculation, replacement and gas flow rates were adjusted to provide maximum production. Samples were harvested through inoculating ports, centrifuged at 1,000 rpm for 10 minutes, filtered through a 0.2 µm pore size filter and held at 4°C prior to purification. The harvest volume and frequency was gradually increased from 25 ml, 3 times per week at the beginning of the culture, to 40 ml, 5 times a week after 2-3 months. Production of sCR1 was analyzed by a CR1 ELISA. The yields of clone 2 and clone 35 for the first month after inoculation were 66 ug/day and 1060 ug/day. These yields increased when the cultures were established.

12.1.1. Produksjon av sCRl i serumfritt medium 12.1.1. Production of sCR1 in serum-free medium

To kommersielt tilgjengelige serumfrie media ble testet for dets evne til å understøtte cellevekst og produksjon av sCRl. En konfluent T75 flaske av pBSCRlc/pTCSgpt klon 35 ble delt inn i to T75 flasker. En flaske ble dyrket med alfa MEM, supplementert med 10$ føtalt kalveserum, L-glutamin, antibiotika og 500 nM metotreksat. Den andre flasken ble avvent trinnvis fra 5$, 1$, 0,5$ og ikke føtalt kalveserum i alfa MEM pluss L-glutamin, antibiotika, 500 nM metotreksat pluss HB CHO vekstsupplement (Hana Biologics, Inc., Alameda, CA). Celleveksten og sCRl produksjonsnivåene til de to flaskene ble sammenlignet. Veksten av cellene i serum-fritt medium nådde aldri konfluens. Nivåene av sCRl produksjon er gitt i tabell VIII. I hvert tilfelle var nivået av sCRl produksjon best når cellene ble dyrket i 10$ føtalt kalveserum. For sammenligning, var nivåene funnet på dag 14 i serum-fritt medium 1,4 x 10^<0> antydninger/ml sammenlignet med 4,2 x 10<10> antydninger/ml for 10$ føtalt kalveserum supplementert media. Two commercially available serum-free media were tested for their ability to support cell growth and production of sCR1. A confluent T75 flask of pBSCRlc/pTCSgpt clone 35 was divided into two T75 flasks. One flask was cultured with alpha MEM, supplemented with 10% fetal calf serum, L-glutamine, antibiotics and 500 nM methotrexate. The second bottle was weaned stepwise from 5$, 1$, 0.5$ and non-fetal calf serum in alpha MEM plus L-glutamine, antibiotics, 500 nM methotrexate plus HB CHO growth supplement (Hana Biologics, Inc., Alameda, CA). The cell growth and sCR1 production levels of the two flasks were compared. The growth of the cells in serum-free medium never reached confluence. The levels of sCR1 production are given in Table VIII. In each case, the level of sCR1 production was best when the cells were cultured in 10% fetal calf serum. For comparison, the levels found on day 14 in serum-free medium were 1.4 x 10^<0> hints/ml compared to 4.2 x 10<10> hints/ml for 10$ fetal calf serum supplemented media.

Cellevekst og sCRl produksjon i rekombinanter ble testet ved anvendelse av en annen kilde serum-fritt media (CHO-l, Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME). P.g.a. at det ikke var nødvendig å avvende serum-dyrkede celler i dette mediet, ble cellene tint og dyrket direkte i det serum-frie mediet. Dette mediet besto av en DME-F12 base og et vekstadditiv. Like antall celler ble tint og sådd ut i separate brønner i en 24-brønn plate. Etter at cellene var blitt tilknyttet ble mediet fjernet, og enten 10$ føtalt kalveserum inneholdende medium eller serum-medium ble tilsatt til hensiktsmessige brønner. Hver tilstand ble utført i duplikat. Ulikt tidligere testet serum-fritt media, CHO-l, Ventrex Laboratories medium ga lignende nivåer av cellevekst som føtalt kalveserum inneholdende media. Cell growth and sCR1 production in recombinants were tested using another source of serum-free media (CHO-1, Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME). Because of. that it was not necessary to wean serum-cultured cells in this medium, the cells were thawed and cultured directly in the serum-free medium. This medium consisted of a DME-F12 base and a growth additive. Equal numbers of cells were thawed and seeded into separate wells in a 24-well plate. After the cells had attached, the medium was removed, and either 10% fetal calf serum containing medium or serum medium was added to appropriate wells. Each condition was performed in duplicate. Unlike previously tested serum-free media, CHO-1, Ventrex Laboratories medium produced similar levels of cell growth as fetal calf serum containing media.

12.1.2. Konklusjoner 12.1.2. Conclusions

Ovenfor beskrevne resultater angir at sCRl produserende CHO celler kunne bli opprettholdt i et definert serumfritt medium. Dette resulterte i besparelser av kostnadene til kulturmediet ved stor-skalaproduksjonskjøringer. En ytterligere fordel var at rensing av sCRl fra cellekultursupernatantene ble forenklet p.g.a. at ingen føtalt kalveserumpro-teiner måtte bli fjernet. The results described above indicate that sCR1 producing CHO cells could be maintained in a defined serum-free medium. This resulted in savings of the costs of the culture medium in large-scale production runs. A further advantage was that purification of sCR1 from the cell culture supernatants was simplified due to that no fetal calf serum proteins had to be removed.

12.2. Rensing av oppløselig CR1 12.2. Purification of soluble CR1

Med forløpet av spesifikke anti-CRl antistoffer ble det mulig å erstatte de mange kromatografiske trinnene som var nødvendig for å produsere renset CR1 med en forenklet to-trinnsprosedyre. Dette økte utbyttene av CR1 proteinene som kunne bli oppnådd med omtrent 1-5 mg CR1 pr. 5,9 x IO<13 >erytrocytter (Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303-313). P.g.a. at den rapporterte rensningen var av membran-bundede former av CR1 var det alltid nødvendig å oppløse det CR1 inneholdende materialet i detergentene. With the development of specific anti-CR1 antibodies, it became possible to replace the many chromatographic steps necessary to produce purified CR1 with a simplified two-step procedure. This increased the yields of the CR1 proteins which could be obtained with approximately 1-5 mg of CR1 per 5.9 x 10<13 >erythrocytes (Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303-313). Because of. that the reported purification was of membrane-bound forms of CR1, it was always necessary to dissolve the CR1-containing material in the detergents.

Oppløselige CR1 produsert ved rekombinante transfektanter behøver ikke å bli solubilisert med detergenter for rensing, det er allerede oppløselig. Til tross for at oppløselig CR1 kan bli renset ved anti-CRl antistoffkromatografi (se nedenfor), egner denne prosedyren seg ikke for stor-skalapro-duksjon. Grad av oppskalering er begrenset av mengden av anti-CRl antistoff som kan bli tilveiebragt for preparering av antistoffmatrisen til antistoffrensningskolonnene. Høy bindingsaffinitet til et antistoff så som YZ1 for CR1 betyr i tillegg at heller kraftige betingelser, f.eks. pH 12,2, må bli anvendt for å fjerne bundet sCRl produkt fra antistoffmatrisen (Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303-313). Soluble CR1 produced by recombinant transfectants does not need to be solubilized with detergents for purification, it is already soluble. Although soluble CR1 can be purified by anti-CR1 antibody chromatography (see below), this procedure is not suitable for large-scale production. The degree of scale-up is limited by the amount of anti-CR1 antibody that can be provided for preparing the antibody matrix for the antibody purification columns. High binding affinity to an antibody such as YZ1 for CR1 also means that rather strong conditions, e.g. pH 12.2, must be used to remove bound sCR1 product from the antibody matrix (Wong, W.W., et al., 1985, J. Immunol. Methods 82:303-313).

For å ha kapasitet til rensning av meget store mengder av oppløselig CR1 ble rensningsprosedyrer omfattende HPLC kolonner utviklet. Disse HPLC kolonnene kan lett bli oppskalert for å produsere enda større mengder av renset oppløselig CR1. I tillegg så krever disse ikke kraftige betingelser for eluering og isolering av sCRl. In order to have the capacity to purify very large amounts of soluble CR1, purification procedures involving HPLC columns were developed. These HPLC columns can easily be scaled up to produce even larger amounts of purified soluble CR1. In addition, these do not require strong conditions for elution and isolation of sCR1.

12.2.1. Antistoffaffinitetskolonnerensing 12.2.1. Antibody affinity column purification

12.2.1.1. Fremgangsmåter 12.2.1.1. Procedures

For antistoffaffinitetsrensing av sCRl ble 100 mg monoklonalt antistoff YZ-1 kovalentlig koblet til 7 mg AffiGel-10 (BioRad, Richmond, CA) ifølge forhandlerens instruksjoner. CR1 inneholdende supernatant fra cellekulturer ble inkubert med immobilisert YZ-1 i en flaske som rister ved 4°C over natt. Materialet ble heilt inn i en glasskolonne og vasket omfattende med 10 mM Hepes, 0,1 M NaCl, pH 7. sCRl ble eluert ved anvendelse av 20 mM natriumfosf at, 0,7 M NaCl, pH 12 (Yoon, S.H. og Fearon, D.T., 1985, J. Immunol., 134:3332-3338). Eluerte fraksjoner ble testet for tilstedeværelse av protein ved anvendelse av BioRad proteinanalysen (BioRad, Richmond, CA). Prøver inneholdende protein ble øyeblikkelig slått sammen og dialysert i 0,1 M Hepes pH 7 over natt (2x1 liter) ved 4°C. Prøven ble deretter dialysert i PBS. Tilstedeværelse av sCRl ble analysert ved CR1 ELISA. For antibody affinity purification of sCR1, 100 mg of monoclonal antibody YZ-1 was covalently coupled to 7 mg of AffiGel-10 (BioRad, Richmond, CA) according to the manufacturer's instructions. CR1 containing cell culture supernatant was incubated with immobilized YZ-1 in a shaking bottle at 4°C overnight. The material was poured onto a glass column and washed extensively with 10 mM Hepes, 0.1 M NaCl, pH 7. sCR1 was eluted using 20 mM sodium phosphate, 0.7 M NaCl, pH 12 (Yoon, S.H. and Fearon, D.T., 1985, J. Immunol., 134:3332-3338). Eluted fractions were tested for the presence of protein using the BioRad protein assay (BioRad, Richmond, CA). Samples containing protein were immediately pooled and dialyzed in 0.1 M Hepes pH 7 overnight (2x1 liter) at 4°C. The sample was then dialyzed in PBS. Presence of sCR1 was analyzed by CR1 ELISA.

12.2.1.2. Resultater 12.2.1.2. Results

Cellekultursupernatant inneholdende sCRl produsert ved transfektant pBSCRlc/pTCSgpt klon 2 ble applisert på anti-CRl antistoffaffinitetskolonnen og topp sCRl fraksjoner ble slått sammen. En alikvot av dette rensede materialet ble kjørt på en 4-20$ SDS-PAGE gel (DAIICHI; Inc., polyakrylamidgeler; modifisert prosedyre til Laemmli, U.K., 1970, Nature 227:680-685). Under reduserende betingelser var den tilsynelatende molekylvekten til oppløselig CR1 omtrent 240,000 dalton (fig. Cell culture supernatant containing sCR1 produced by transfectant pBSCR1/pTCSgpt clone 2 was applied to the anti-CR1 antibody affinity column and peak sCR1 fractions were pooled. An aliquot of this purified material was run on a 4-20$ SDS-PAGE gel (DAIICHI; Inc., polyacrylamide gels; modified procedure of Laemmli, U.K., 1970, Nature 227:680-685). Under reducing conditions, the apparent molecular weight of soluble CR1 was approximately 240,000 daltons (Fig.

24). Dette rensede CR1 ble også vist å være aktivt ved dets evne til å hemme komplement-formidlet hemolyse samt C5a og C3a produksjon (seksjon 13, nedenfor). 24). This purified CR1 was also shown to be active by its ability to inhibit complement-mediated hemolysis as well as C5a and C3a production (section 13, below).

12.2.2. CR1 rensing ved HPLC 12.2.2. CR1 purification by HPLC

12.2.2.1. Fremgangsmåter 12.2.2.1. Procedures

12.2.2.1.1. Utgangsmateriale 12.2.2.1.1. Source material

Når kulturer først ble etablert i bioreaktorene var nivåene av sCRl produksjon lavere enn når kulturene var blitt dyrket i flere måneder. Det var generelt en periode på flere uker før cellene i bioreaktoren nådde konfluens og produserte maksimale nivåer sCRl. Cellekultursupernatantene med lave nivåer sCRl kunne blitt konsentrert før rensing ved enten ammoniumsulfatpresipitering eller ved ultrafiltrering. Ammoniumsulfatfraksjonering av supernatantene over området 6080$ metning presipiterte sCRl i essensielt ekvivalente utbytter. Presipitatet ble løst opp i et minimalt volum og dialysert inn i utgangsbuffren for kationbytte HPLC. Alternativt kunne CHO cellekultursupernatantene ble konsentrert ved ultrafiltrering og dialysert inn i utgangsbuffren for kationbyttekromatografi. When cultures were first established in the bioreactors, the levels of sCR1 production were lower than when the cultures had been grown for several months. There was generally a period of several weeks before the cells in the bioreactor reached confluence and produced maximal levels of sCR1. The cell culture supernatants with low levels of sCR1 could be concentrated before purification by either ammonium sulfate precipitation or by ultrafiltration. Ammonium sulfate fractionation of the supernatants above the range of 6080$ saturation precipitated sCR1 in essentially equivalent yields. The precipitate was dissolved in a minimal volume and dialyzed into the starting buffer for cation exchange HPLC. Alternatively, the CHO cell culture supernatants could be concentrated by ultrafiltration and dialyzed into the starting buffer for cation exchange chromatography.

Når bioreaktorene produserte høyere konsentrasjoner av oppløselig CR1 kunne CHO cellekultursupernatantene fra disse kulturene bli dialysert direkte inn i utgangsbufferet for kationbyttekromatografi. When the bioreactors produced higher concentrations of soluble CR1, the CHO cell culture supernatants from these cultures could be dialyzed directly into the starting buffer for cation exchange chromatography.

12.2.2.1.2. Kationbytte HPLC prosedyre 12.2.2.1.2. Cation exchange HPLC procedure

Prøver ble dialysert inn i utgangsbuffer (0,02 M natriumfosf at, 0,06 N natriumklor id, pH 7,0) og deretter filtrert gjennom et 0,2 um filter for å fjerne eventuelt partikulat-materiale. Prøven ble deretter applisert på en kationbytte høytrykksvæskekromatografikolonne (10 cm x 10 mm, Hydropore-SCX HPLC kolonne fra Rainin). Kolonnen ble vasket og eluert med en natriumkloridgradient utviklet ved anvendelse av 0,02 M fosfat, 0,5 N NaCl, pH 7,0. sCRl eluerte et sted mellom 0,06 N og 0,25 N NaCl. Eluering ble registrert ved absorbans ved 280 nm og ved ELISA. Samples were dialyzed into starting buffer (0.02 M sodium phosphate, 0.06 N sodium chloride, pH 7.0) and then filtered through a 0.2 µm filter to remove any particulate material. The sample was then applied to a cation exchange high pressure liquid chromatography column (10 cm x 10 mm, Hydropore-SCX HPLC column from Rainin). The column was washed and eluted with a sodium chloride gradient developed using 0.02 M phosphate, 0.5 N NaCl, pH 7.0. sCR1 eluted somewhere between 0.06 N and 0.25 N NaCl. Elution was recorded by absorbance at 280 nm and by ELISA.

12.2.2.1.3. Anionbvtte HPLC prosedyre 12.2.2.1.3. Anionbvtte HPLC procedure

Om ønskelig, kunne ytterligere rensing av kation HPLC renset sCRl bli tilveiebragt ved anion HPLC. Toppfraksjoner fra kation HPLC ble dialysert inn i utgangsbuf feren for anion HPLC. Prøver ble applisert og kolonnen (Hydropore-AX fra Rainin) ble vasket i 0,01 M fosfat pH 7,5. Kolonnen ble eluert med en serie av trinn og gradienter utviklet ved anvendelse av 0,01 M fosfat, 0,5 N NaCl, pH 7,5. sCRl eluerte et sted mellom 0,0 N og 0,3 N NaCl. Elueringen ble registert som før for kationbytte HPLC. Konsentrasjonene og pH til kation og anion HPLC kolonnebuf ferene er bare gitt som eksempler. Andre bufferkonsentrasjoner, saltkonsentrasjoner eller pH-betingelser kan også anvendes. If desired, further purification of cation HPLC purified sCR1 could be provided by anion HPLC. Top fractions from cation HPLC were dialyzed into the starting buffer for anion HPLC. Samples were applied and the column (Hydropore-AX from Rainin) was washed in 0.01 M phosphate pH 7.5. The column was eluted with a series of steps and gradients developed using 0.01 M phosphate, 0.5 N NaCl, pH 7.5. sCR1 eluted somewhere between 0.0 N and 0.3 N NaCl. The elution was recorded as before for cation exchange HPLC. The concentrations and pH of the cation and anion HPLC column buffers are given as examples only. Other buffer concentrations, salt concentrations or pH conditions can also be used.

12.2.2.1.4. Western blottanalyse 12.2.2.1.4. Western blot analysis

Western blotting ble utført ved anvendelse av en modifisert prosedyre fra Towbin, H. , et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 76:4350-4354. Renset sCRl ble kjørt på en 4-20$ SDS-PAGE, overført til nitrocellulose, spesifikt probet med anti-CRl (muse mAb YZ-1 eller J3D3), og detektert med geite anti-muse antistoff konjugert med alkalisk fosfatase. Western blotting was performed using a modified procedure from Towbin, H., et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Pollock. U.S.A., 76:4350-4354. Purified sCR1 was run on a 4-20$ SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose, specifically probed with anti-CR1 (mouse mAb YZ-1 or J3D3), and detected with goat anti-mouse antibody conjugated to alkaline phosphatase.

12.2.2.2. Resultater 12.2.2.2. Results

I en typisk kjøring ble 50-100 ml av supernatanten fra en bioreaktorkultur dialysert inn i utgangsbuffer og applisert på en 10 cm x 10 mm kationbytte HPLC. Toppf raksjoner ble bestemt ved ELISA og absorbans ved 280 nm, og ble slått sammen. Proteinkonsentrasjonen til blandingen ble bestemt ved absorbans ved 280 nm (c(l$) ved 280 nm = 10, som beregnet fra CRlc aminosyresammensetning). Flere tiendedeler milligram ble renset fra 100 ml amplifisert kultursupernatant. In a typical run, 50-100 ml of the supernatant from a bioreactor culture was dialyzed into starting buffer and applied to a 10 cm x 10 mm cation exchange HPLC. Peak fractions were determined by ELISA and absorbance at 280 nm, and were pooled. The protein concentration of the mixture was determined by absorbance at 280 nm (c(l$) at 280 nm = 10, as calculated from CRlc amino acid composition). Several tenths of a milligram were purified from 100 ml of amplified culture supernatant.

Som et eksempel produserte 100 ml av kultursupernatanten fra transfektant pBSCRlc/pTCSgpt klon 2 22 mg renset sCRl, bestemt ved absorbans ved 280 nm, når renset ved kation HPLC (fig. 24). Når registrert ved CR1 ELISA ble utbyttet beregnet å være 202$ med ytterligere 13$ i gjennomløpet eller kolonnevaskefraksjonen. Det større enn 100$ utbytte reflekterer sansynligvis matriseeffektene i ELISA. As an example, 100 ml of the culture supernatant from transfectant pBSCR1/pTCSgpt clone 2 produced 22 mg of purified sCR1, determined by absorbance at 280 nm, when purified by cation HPLC (Fig. 24). When recorded by CR1 ELISA, the yield was calculated to be 202$ with an additional 13$ in the flow-through or column wash fraction. The greater than $100 yield probably reflects the matrix effects in the ELISA.

Med hastigheter som kultursupernatanter kan bli fjernet fra en bioreaktor med, bør det være mulig ved dette nivå av metotreksatamplifikasjon å produsere omtrent 100 mg renset oppløselig CR1 pr. uke pr. bioreaktor. Noen måter hvorpå dette produksjonsnivået kan bli oppskalert på omfatter amplifisering av utgangskulturene til et maksimalt nivå med metotreksat før tilsåing av bioreaktoren, økning av antall bioreaktorer i produksjon en viss tid og ved anvendelse av HPLC kolonner med høyere kapasitet. At rates at which culture supernatants can be removed from a bioreactor, it should be possible at this level of methotrexate amplification to produce approximately 100 mg of purified soluble CR1 per week per bioreactor. Some ways in which this production level can be scaled up include amplifying the starting cultures to a maximum level of methotrexate before seeding the bioreactor, increasing the number of bioreactors in production for a certain time and using higher capacity HPLC columns.

12.2.2.3. Karakterisering av renset oppløselig CR1 12.2.2.3. Characterization of purified soluble CR1

sCRl inneholdende toppfraksjon fra kation HPLC (fig. 24) ble ytterligere renset på en anion HPLC. Renheten til sCRl materialet ved forskjellige trinn ble testet ved SDS-PAGE (fig. 25). Mindre bånd som sees i disse tungt belastede gelene representerer fragmenter av sCRl bestemt ved Western Blottanalyser ved anvendelse av anti-CRl monoklonale antistoffer, YZ1 eller J3D3. Fragment sCRl båndene ble ikke sett i de fleste preparatene. The sCR1 containing peak fraction from the cation HPLC (Fig. 24) was further purified on an anion HPLC. The purity of the sCR1 material at different steps was tested by SDS-PAGE (Fig. 25). Minor bands seen in these heavily loaded gels represent fragments of sCR1 determined by Western blot analyzes using anti-CR1 monoclonal antibodies, YZ1 or J3D3. The fragment sCR1 bands were not seen in most of the preparations.

Funksjonelle aktiviteter til renset sCRl ble testet ved dets evne til å hemme klassisk komplement-mediert hemolyse med 50$ ved en renset sCRl konsentrasjon på 0,25 ug/ml. Renset oppløselig CR1 kunne også hemme klassisk komplement C5a produksjon med 50$ ved 5 ug/ml og C3a produksjon ved 50$ ved 13 ug/ml (se seksjon 13, nedenfor). Functional activities of purified sCR1 were tested by its ability to inhibit classical complement-mediated hemolysis by 50% at a purified sCR1 concentration of 0.25 µg/ml. Purified soluble CR1 was also able to inhibit classical complement C5a production by 50$ at 5 ug/ml and C3a production by 50$ at 13 ug/ml (see Section 13, below).

12.2.2.4. Konklusjoner 12.2.2.4. Conclusions

Som beskrevet ovenfor, er det blitt utviklet en forbedret fremgangsmåte for rensing av oppløselig CR1 som lett kan bli oppskalert for å produsere mengdene av sCRl som er nødvendig for terapeutiske anvendelser. Hovedelementene til denne prosedyren omfatter et utgangsmateriale som allerede er oppløselig og dette eliminerer derved nødvendigheten av oppløsning av memhranbundet CR1 med detergenter. Reduksjon av føtalt kalveserumkonsentrasjoner i bioreaktorkulturer og/eller anvendelse av alternative kulturmedier i disse kulturene eliminerer nødvendigheten av å fjerne høye konsentrasjoner av ytre proteiner fra sCRl-inneholdende utgangsmaterialer i løpet av påfølgende rensning. Videre tilveiebragte utvikling av en HPLC prosedyre for rensing en fremgangsmåte for rensing i stor skala. Enten kation HPLC eller en kombinasjon av kation HPLC etterfulgt av anionbytte HPLC kan bli anvendt for rensing. Vesentlig rent CR1 i høyt utbytte kan bli oppnådd ved denne prosedyren i bare en eller to trinn. As described above, an improved method for the purification of soluble CR1 has been developed which can be easily scaled up to produce the quantities of sCR1 required for therapeutic applications. The main elements of this procedure include a starting material that is already soluble and this thereby eliminates the necessity of dissolving membrane-bound CR1 with detergents. Reduction of fetal calf serum concentrations in bioreactor cultures and/or use of alternative culture media in these cultures eliminates the necessity to remove high concentrations of extrinsic proteins from sCR1-containing starting materials during subsequent purification. Furthermore, development of an HPLC procedure for purification provided a method for purification on a large scale. Either cation HPLC or a combination of cation HPLC followed by anion exchange HPLC can be used for purification. Substantially pure CR1 in high yield can be obtained by this procedure in only one or two steps.

13. EKSEMPEL: DEMONSTRASJON AV IN VITRO AKTIVITET TIL OPPLØSELIG CR1 13. EXAMPLE: DEMONSTRATION OF IN VITRO ACTIVITY OF SOLUBLE CR1

13.1. Hemming av nøvtrofil oksidativt utbrudd 13.1. Inhibition of neutrophil oxidative burst

I reperfusjonsskademodellen til vevsskade i løpet av hjerteinfarkt induserer aktiverte komplementkomponenter nøytrofil adhesjon og aktivering. Den aktiverte nøytrofilen gjennomgår et oksidativt utbrudd som danner meget toksiske oksygenradikaler. Disse og andre potensielle toksiner blir frigjort i løpet av nøytrofil degranulering som skader omgivende vev. Oppløselig CR1 kan redusere området av skadet vev ved forhindring av dannelsen av C3a og C5a, komplementkomponentene involvert i nøytrofil aktivering. In the reperfusion injury model of tissue injury during myocardial infarction, activated complement components induce neutrophil adhesion and activation. The activated neutrophil undergoes an oxidative burst that forms highly toxic oxygen radicals. These and other potential toxins are released during neutrophil degranulation that damages surrounding tissue. Soluble CR1 can reduce the area of damaged tissue by preventing the formation of C3a and C5a, the complement components involved in neutrophil activation.

For å registrere evnen som oppløselig CR1 har til å blokkere dannelsen til C5a i løpet av komplementaktiveringen in vitro, ble bioanalyse som kan kvantitere dannelsen av oksygen-radikale produsert nøytrofiler i løpet av et C5a indusert oksygenutbrudd anvendt (Bass, D.A., et al., 1983, J. Immunol. 130:1910-1917). Denne analysen anvender diklorfluorescindiacetat (DCFDA), et 1ipidoppløselig molekyl som kan gå inn i celler, bli fanget og blir meget fluorescerende ved oksider-ing. To record the ability of soluble CR1 to block the generation of C5a during complement activation in vitro, bioassays that can quantify the generation of oxygen radicals produced by neutrophils during a C5a-induced oxygen burst were used (Bass, D.A., et al., 1983, J. Immunol. 130:1910-1917). This assay uses dichlorofluorescein diacetate (DCFDA), an lipid-soluble molecule that can enter cells, become trapped, and become highly fluorescent upon oxidation.

13.1.1. Materialer og fremgangsmåter 13.1.1. Materials and methods

13.1.1.1. Materialer 13.1.1.1. Materials

Friskt fullblod, humane komplementkilder (Beth Israel Hospital, Boston, MA), tørket bakergjær, PBS med 0,1$ gelatin og 5 mM glukose, 100 mM EDTA, 10 mM DCFDA i HBSS (Kodak), røde blodcelle (RBC) lyseringsbuffer (Ortho Diagnostics), renset C5a (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), og oppløselig CR1 ble anvendt. Fresh whole blood, human complement sources (Beth Israel Hospital, Boston, MA), dried baker's yeast, PBS with 0.1% gelatin and 5 mM glucose, 100 mM EDTA, 10 mM DCFDA in HBSS (Kodak), red blood cell (RBC) lysis buffer ( Ortho Diagnostics), purified C5a (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), and soluble CR1 were used.

13.1.1.2. Preparering av nøytrofiler 13.1.1.2. Preparation of neutrophils

Nøytrofiler ble preparert som beskrevet av Bass (1983, J. Immunol. 130:1910-1917). 2,0 ml fullblod ble vasket 3 ganger i PBS-gelatin-glukose, resuspendert i 5 ml 10 pm DCFDA i HBSS pluss 5 ml PBS-gelatin-glukose og inkubert i 15 minutter ved 37°C. Celler ble deretter sentrifugert og resuspendert i 2,0 ml PBS-gelatin-glukose pluss 5 mM EDTA. Neutrophils were prepared as described by Bass (1983, J. Immunol. 130:1910-1917). 2.0 ml of whole blood was washed 3 times in PBS-gelatin-glucose, resuspended in 5 ml of 10 µM DCFDA in HBSS plus 5 ml of PBS-gelatin-glucose and incubated for 15 minutes at 37°C. Cells were then centrifuged and resuspended in 2.0 ml PBS-gelatin-glucose plus 5 mM EDTA.

13.1.1.3. Preparering av g. iærpartikler 13.1.1.3. Preparation of g. clay particles

Tørket bakergjær ble resuspendert i H2O, vasket 2 ganger og kokt i 30 minutter. Partiklene ble på nytt vasket 2 ganger i H20 og resuspendert ved 0,5 g/ml i H20 (Simpson, P.J., et al., ovenfor). Dried baker's yeast was resuspended in H2O, washed 2 times and boiled for 30 minutes. The particles were again washed 2 times in H 2 O and resuspended at 0.5 g/ml in H 2 O (Simpson, P.J., et al., supra).

13.1.1.4. Aktivering av nøytrofile ved renset C5a 13.1.1.4. Activation of neutrophils by purified C5a

100 pl DCFDA-belastede celler ble behandlet med RBC lyseringsbuffer, vasket 1 gang i PBS-gelatin-glukose EDTA og resuspendert i 1,0 ml PBS-gelatin-glukose. 50 pl renset C5a i 200 ng/ml eller kontroll ble tilsatt til 0,5 ml målceller ved 37°C og analysert på flow-cytometer vd forskjellige tids-intervaller . 100 µl DCFDA-loaded cells were treated with RBC lysis buffer, washed 1 time in PBS-gelatin-glucose EDTA and resuspended in 1.0 ml PBS-gelatin-glucose. 50 µl purified C5a in 200 ng/ml or control was added to 0.5 ml target cells at 37°C and analyzed on a flow cytometer at different time intervals.

13.1.1.5. Aktivering av nøytrofiler ved renset C5a i human 13.1.1.5. Activation of neutrophils by purified C5a in humans

serum eller plasma serum or plasma

100 ul DCFDA-belastede celler ble inkubert med 50 ul C5a fortynnet 1:1 i humant serum eller heparinisert plasma (100 ng/ml ) eller kontroll ved 37°C i 30 minutter. RBC ble lysert ut og nøytrofilene ble analysert på et flow-cytometer. 100 µl of DCFDA-loaded cells were incubated with 50 µl of C5a diluted 1:1 in human serum or heparinized plasma (100 ng/ml) or control at 37°C for 30 minutes. RBCs were lysed and neutrophils were analyzed on a flow cytometer.

13.1.1.6. Aktivering av nøytrofiler ved gjærpartikkelak-tivert humant serum eller plasma 13.1.1.6. Activation of neutrophils by yeast particle-activated human serum or plasma

425 ul friskt frosset serum og plasma pluss 50 ul sCRl eller kontroll ble inkubert med 25 ul gjærpartikler ved 37° C i 30 minutter. Komplement-aktiverte og kontrollprøver ble deretter sentrifugert for å fjerne gjaerpart iklene. Ti 2-ganger fortynninger av hver av disse prøvene ble utført i PBS-gelatin-glukose EDTA. 50 ul av hver seriefortynning av kontroll og aktivert serum og plasma ble tilsatt til 50 pl DCFDA-belastede målceller og inkubert ved 37°C i 30 minutter. RBC ble deretter lysert ut, og nøytrofiler ble analysert ved flow-cytometri. 425 µl of fresh frozen serum and plasma plus 50 µl of sCR1 or control were incubated with 25 µl of yeast particles at 37°C for 30 minutes. Complement-activated and control samples were then centrifuged to remove yeast particles. Ten 2-fold dilutions of each of these samples were performed in PBS-gelatin-glucose EDTA. 50 µl of each serial dilution of control and activated serum and plasma was added to 50 µl of DCFDA-loaded target cells and incubated at 37°C for 30 minutes. RBCs were then lysed, and neutrophils were analyzed by flow cytometry.

13.1.2. Resultater 13.1.2. Results

13.1.2.1. C5a induserer et oksygenutbrudd i humane nøytrofiler som kan bli målt ved anvendele av DCFDA 13.1.2.1. C5a induces an oxygen burst in human neutrophils that can be measured using DCFDA

Fig. 26 viser en hurtig økning i fluorescensintensiteten til humane nøytrofiler etter stimulering med renset C5a. I løpet av 4 minutter etter tilsetning av C5a (20 ng/ml sluttkon-sentrasjon) var nøytrofilene 10-ganger sterkere enn kontroll DCFDA-belastede nøytrofiler. I løpet av 20 minutter var nøytrofilene 20-ganger så sterke som kontrollene. Denne analysen ser ut til å være en følsom indikator på C5a. Fig. 26 shows a rapid increase in the fluorescence intensity of human neutrophils after stimulation with purified C5a. Within 4 minutes of addition of C5a (20 ng/ml final concentration), the neutrophils were 10-fold stronger than control DCFDA-loaded neutrophils. Within 20 minutes, the neutrophils were 20 times as strong as the controls. This assay appears to be a sensitive indicator of C5a.

13.1.2.2. Human serum blokkerer oksygenutbruddsvirkninger 13.1.2.2. Human serum blocks oxygen burst effects

til renset C5a på nøytrofiler to purified C5a on neutrophils

Ingen økning i fluorescensintensitet ble observert i nøytrofiler belastet med DCFDA og inkubert med renset C5a fortynnet i human serum. Denne virkningen kan være forårsaket av blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) frigjort fra blodpla-ter i løpet av koagulering. Det er blitt vist at lave nivåer PDGF kan inhibere C5a-indusert nøytrofil aktivering (Wilson, E., et al., 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:2213-2217). No increase in fluorescence intensity was observed in neutrophils loaded with DCFDA and incubated with purified C5a diluted in human serum. This effect may be caused by platelet-derived growth factor (PDGF) released from platelets during coagulation. It has been shown that low levels of PDGF can inhibit C5a-induced neutrophil activation (Wilson, E., et al., 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:2213-2217).

13.1.2.3. Heparinisert plasma blokkerer ikke virkningene 13.1.2.3. Heparinized plasma does not block the effects

av C5a på nøytrofiler of C5a on neutrophils

C5a fortynnet 1:1 i heparinisert plasma induserer et oksygenutbrudd i DCFDA belastede nøytrofiler. Til tross for ikke så dramatisk som C5a i buffer var det en 10-ganger økning i fluorescensintensitet etter en 30 minutters inkubasjon med nøytrofilene. Det reduserte signalet kan bli forårsaket av PDGF frigjøringen i løpet av plebotomy eller plasmaisolering. Mere forsiktig og hurtig isolering av plasma fra cellulære komponenter av blod kan minimalisere frigjørin-gen av PDGF og muliggjøre bedre C5a funksjon. C5a diluted 1:1 in heparinized plasma induces an oxygen burst in DCFDA-loaded neutrophils. Although not as dramatic as C5a in buffer, there was a 10-fold increase in fluorescence intensity after a 30 minute incubation with the neutrophils. The reduced signal may be caused by PDGF release during plebotomy or plasma isolation. More careful and rapid isolation of plasma from cellular components of blood can minimize the release of PDGF and enable better C5a function.

13.1.2.4. sCRl tilstede i løpet av komplementaktivering 13.1.2.4. sCR1 present during complement activation

blokkerer C5a dannelsen blocks C5a formation

Zymosan-indusert aktivering av humant komplement i nærvær av oppløselig CR1 viste redusert C5a aktivitet målt med DCFDA analysen. Som vist i fig. 27 dannet 1:16 fortynningen av humant plasma aktivert i nærvær av sCRl dannet 70% mindre fluorescensintensitetøkning i nøytrofiler som 1:16 fortynnet plasma aktivert uten tilstedeværelse av sCRl. Dette impli-serer inhibisjon av C5a dannelsen ved sCRl. Ytterligere optimalisering av DCFDA analysen og plasmasamling bør resultere i en mere dynamisk og sensitiv analyse for oppløselig CR1 aktivitet. Zymosan-induced activation of human complement in the presence of soluble CR1 showed reduced C5a activity as measured by the DCFDA assay. As shown in fig. 27, the 1:16 dilution of human plasma activated in the presence of sCR1 produced 70% less fluorescence intensity increase in neutrophils than the 1:16 dilution of plasma activated without the presence of sCR1. This implies inhibition of C5a formation by sCR1. Further optimization of the DCFDA assay and plasma collection should result in a more dynamic and sensitive assay for soluble CR1 activity.

13.2. Inhibis. jon av komplementformidlet hemolyse 13.2. Inhibits. ion of complement-mediated hemolysis

13.2.1. Fremgangsmåte 13.2.1. Approach

Evnen til å inhibere komplement ble testet ved analysering for hemming av komplement-formidlet rød cellelysering (hemolyse). Hemming av hemolysen ble bestemt som en funksjon av oppløselig CR1 konsentrasjon. sCRl prøver som skal bli undersøkt ble fortynnet i 0,1 M Hepes-buffer (0,15 N NaCl, pH 7,4), og 50 ul ble tilsatt til hver brønn av en V-bunnet mikrotiterplate vanligvis i triplikat. Humant serum, anvendt som komplementkilde, ble fortynnet 1 til 125 i Hepes-buffer, og 50 pl ble satt til hver brønn. Deretter ble kommersielt tilgjengelige saueerytrocytter med anti-saueantistoff (Diamedix Cat. nr. 789-002) anvendt som mottatt og tilsatt 100 pl/brønn for å initiere komplementreaksjonsveien som fører til hemolyse. Platene ble inkubert i 60 minutter ved 37° C og deretter sentrifugert ved 500 x g i 10 minutter. Supernatantene ble fjernet og plassert i en flat-bunnet mikrotiterplate. Grad av hemolyse ble målt som en funksjon av prøveabsorbans ved 410 nm. Maksimal absorbans (tilsvarende maksimal hemolyse), Amax, ble tilveiebragt fra absorbansen til erytrocyttprøve som bare inneholder humant serum Ag, minus absorbansen til en prøve som bare inneholder røde celler, Aq . Dermed er Amax <=> Ag - Aq . Forskjellen mellom absorbansen til en erytrocyttprøve inneholdende både humant serum og sCRl, og absorbansen til en celleprøve inneholdende bare sCRl, ble definert som Aprøve. Hemming, IH, ble uttrykt som fraksjon (Amax/<A>prøve/<A>max), og IH5Q ble definert som konsentrasjon av sCRl nødvendig for å produsere en verdi av IH = 1/2. For å registrere kromatografifraksjonene ble serum-frie kontroller ikke innbefattet og anti-komplementaktivitet ble registrert kvalitativt som en reduksjon i absorbans ved 410 nm av prøven. The ability to inhibit complement was tested by assaying for inhibition of complement-mediated red cell lysis (hemolysis). Inhibition of hemolysis was determined as a function of soluble CR1 concentration. sCR1 samples to be examined were diluted in 0.1 M Hepes buffer (0.15 N NaCl, pH 7.4), and 50 µl was added to each well of a V-bottom microtiter plate usually in triplicate. Human serum, used as a complement source, was diluted 1 to 125 in Hepes buffer, and 50 µl was added to each well. Then, commercially available sheep erythrocytes with anti-sheep antibody (Diamedix Cat. no. 789-002) were used as received and added 100 µl/well to initiate the complement reaction pathway leading to hemolysis. The plates were incubated for 60 minutes at 37°C and then centrifuged at 500 x g for 10 minutes. The supernatants were removed and placed in a flat-bottomed microtiter plate. Degree of hemolysis was measured as a function of sample absorbance at 410 nm. The maximum absorbance (corresponding to maximum hemolysis), Amax, was obtained from the absorbance of erythrocyte sample containing only human serum Ag, minus the absorbance of a sample containing only red cells, Aq. Thus, Amax <=> Ag - Aq. The difference between the absorbance of an erythrocyte sample containing both human serum and sCR1, and the absorbance of a cell sample containing only sCR1, was defined as the A sample. Inhibition, IH, was expressed as fraction (Amax/<A>sample/<A>max), and IH5Q was defined as the concentration of sCR1 required to produce a value of IH = 1/2. To record the chromatography fractions, serum-free controls were not included and anti-complement activity was recorded qualitatively as a decrease in absorbance at 410 nm of the sample.

Den hemolyttiske analysen beskrevet ovenfor ble også anvendt for å vurdere evnen som human rekombinant sCRl har til å inhibere sauerød cellelysering ved komplement fra andre arter, så som marsvin og rotter. For hver art ble friskt-frosset serum eller friskt lyofilisert serum eller plasma anvendt som en komplementkilde. I noen tilfeller ble sera oppnådd kommersielt (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). The hemolytic assay described above was also used to assess the ability of human recombinant sCR1 to inhibit sheep red cell lysis by complement from other species, such as guinea pigs and rats. For each species, fresh-frozen serum or fresh lyophilized serum or plasma was used as a complement source. In some cases, sera were obtained commercially (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).

Serumet ble først titrert for dets evne til å lysere aktiverte røde celler. Den høyeste fortynningen som ga minst 80$ maksimal røde cellelysering ble valgt for å vurdere virkningene til tilsatt human sCRl. Analysen ble deretter utført som beskrevet ovenfor, med substituering av dyreserum for human serum ved foretrukket fortynning. The serum was first titrated for its ability to lyse activated red cells. The highest dilution that gave at least 80% maximal red cell lysis was chosen to assess the effects of added human sCR1. The assay was then performed as described above, substituting animal serum for human serum at the preferred dilution.

13.2.2. Resultater 13.2.2. Results

Som angitt i fig. 28 inhiberte renset sCRl klassisk komplement-formidlet lysering med 50$ ved en sCRl konsentrasjon på 0,12 jig/ml. Evnen som antistoffaffinitetsrenset sCRl har til å inhibere den hemolyttiske analysen ble sammenlignet med den til urenset materiale (sCRl inneholdende cellekultursupernatant). Renset sCRl hadde aktivitet som var sammenlignbar med den til urenset sCRl, idet begge produserte 50$ inhibisjon i den hemolyttiske analysen ved 1,6 x 10<8 >antydninger/ml. Dette indikerte at rensingsprosedyren ikke reduserte den funksjonelle aktiviteten til det endelig sCRl produktet vesentlig. As indicated in fig. 28 purified sCR1 inhibited classical complement-mediated lysis by 50% at an sCR1 concentration of 0.12 µg/ml. The ability of antibody affinity-purified sCR1 to inhibit the hemolytic assay was compared to that of crude material (sCR1 containing cell culture supernatant). Purified sCR1 had activity comparable to that of crude sCR1, both producing 50% inhibition in the hemolytic assay at 1.6 x 10<8> hints/ml. This indicated that the purification procedure did not significantly reduce the functional activity of the final sCR1 product.

For å bestemme dersom renset sCRl kunne bli lagret i frossen tilstand, ble en alikvot lagret ved -70°C i en uke. Konsentrasjonen til frossen sCRl var lik den til ikke-frossen sCRl, ifølge bestemmelser av absorbans ved 280 nm og CR1 ELISA. Frossen sCRl hadde også samme aktivitet som ikke-frossen sCRl bestemt ved hemming av hemolysen. To determine if purified sCR1 could be stored frozen, an aliquot was stored at -70°C for one week. The concentration of frozen sCR1 was similar to that of non-frozen sCR1, as determined by absorbance at 280 nm and CR1 ELISA. Frozen sCR1 also had the same activity as non-frozen sCR1 as determined by inhibition of hemolysis.

Evnen som human rekombinant sCRl har til å inhibere hemolyse formidlet ved komplement fra flere arter er oppsummert i tabell IX. The ability of human recombinant sCR1 to inhibit hemolysis mediated by complement from several species is summarized in Table IX.

Både marsvin- og rottekomplement så ut til å bli inhibert av humant sCRl. Mangel på klar inhibering for andre arter kan reflektere (a) uhensiktsmessigheten av å anvende kaninanti-stoffer og saueerytrocytter i analysesystemet eller (b) den høye konsentrasjonen av serum som er nødvendig for hemolyse i dette systemet. Both guinea pig and rat complement appeared to be inhibited by human sCR1. Lack of clear inhibition for other species may reflect (a) the inappropriateness of using rabbit antibodies and sheep erythrocytes in the assay system or (b) the high concentration of serum required for hemolysis in this system.

13.3. Inhibis. jon av C3a og C5a produksjon 13.3. Inhibits. ion of C3a and C5a production

13.3.1. Fremgangsmåter 13.3.1. Procedures

Evnen til å inhibere komplement ble også undersøkt ved analysering for spesifikk inhibisjon av C3a og C5a produksjon. For alle eksperimentene ble en enkel human serumpool, som skal bli anvendt som en kilde for komplement, alikvotet og lagret frossent ved -70°C. Human IgG ble varmeaggregert, alikvotet og lagret frossent ved -70°C. For hvert eksperiment ble serumalikvoter ekvilibrert ved 37°C idet varierende konsentrasjoner av sCRl skulle bli testet. Komplementreaksjonsveien ble initiert ved tilsetning av aggregert human IgG. Kontrollprøver som ikke inneholdt IgG ble også innbefattet. Etter en fastsatt reaksjonstid på 15 minutter (bestemt i en tidligere tidsforløpsstudie for å tilveiebringe et hensiktsmessig tidsintervall der produksjonen av C5a eller C3a er nærmest fullført, dvs. mer enn 90$), ble nivåene av frigjorte komplementpeptider (C5a eller C3a) bestemt ved radioimmunoanalyse ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige radioimmunoanalyse (RIA) kits (C5a RIA, Amersham Cat nr. RPA.520; C3a RIA, Amersham Cat. nr. RPA.518) i modifierte prosedyrer. The ability to inhibit complement was also investigated by analyzing for specific inhibition of C3a and C5a production. For all experiments, a single pool of human serum, to be used as a source of complement, was aliquoted and stored frozen at -70°C. Human IgG was heat aggregated, aliquoted and stored frozen at -70°C. For each experiment, serum aliquots were equilibrated at 37°C as varying concentrations of sCR1 were to be tested. The complement reaction pathway was initiated by the addition of aggregated human IgG. Control samples that did not contain IgG were also included. After a set reaction time of 15 minutes (determined in a previous time course study to provide an appropriate time interval in which the production of C5a or C3a is almost complete, i.e. more than 90$), the levels of released complement peptides (C5a or C3a) were determined by radioimmunoassay using commercially available radioimmunoassay (RIA) kits (C5a RIA, Amersham Cat. No. RPA.520; C3a RIA, Amersham Cat. No. RPA.518) in modified procedures.

P.g.a. at en konkurrerende immunoanalyse anvendt, varierte komplementpeptid (C5a og C3a) konsentrasjonene med tellin-gene. Bundede tellinger (CB) for en prøve ble bestemt som totale tellinger (i tellinger pr. minutt, cpm) målt i pelleten. Because of. that a competitive immunoassay was used, complement peptide (C5a and C3a) concentrations varied with the tellin genes. Bound counts (CB) for a sample were determined as total counts (in counts per minute, cpm) measured in the pellet.

y-aksen i fig. 29 representerer fraksjonsinhibisjon. Fraksjonsinhibisjon er lik tellinger bundet (CB) for en "prøve", mindre enn CB i "prøve med sCRl", delt på CB for "ingen IgG kontroll" mindre enn CB i "prøve uten sCRl". the y-axis in fig. 29 represents fractional inhibition. Fractional inhibition equals counts bound (CB) for a "sample", less than CB in "sample with sCR1", divided by CB for "no IgG control" less than CB in "sample without sCR1".

13.3.2. Resultater 13.3.2. Results

Aktiviteten til renset sCRl ble analysert ved testing av dets evne til å inhibere C5a og C3a produksjon i en aktivert human serumprøve. The activity of purified sCR1 was analyzed by testing its ability to inhibit C5a and C3a production in an activated human serum sample.

Som angitt i fig. 29, under betingelsene testet, kunne renset sCRl maksimalt inhibere C5a produksjon med 100$ og C3a med 60$. Inhibisjon på 50$ ble observert ved sCRl konsentrasjoner på 5 jjg/ml for C5a produksjon og 15-20 ug/ml for C3a produksjon. Dataene foreslår at rekombinant sCRl inhiberer C5 konvertase mer effektivt enn C3 konvertase. As indicated in fig. 29, under the conditions tested, purified sCR1 could maximally inhibit C5a production by 100$ and C3a by 60$. Inhibition of 50% was observed at sCR1 concentrations of 5 µg/ml for C5a production and 15-20 µg/ml for C3a production. The data suggest that recombinant sCR1 inhibits C5 convertase more effectively than C3 convertase.

15. DEPONERING AV MIKROORGANISMER 15. DEPOSIT OF MICRO-ORGANISMS

E. coli stammen DK1/P3 inneholdende plasmid piABCD (betegnet pCRl/piABCD), kodende for full-lengde CR1 protein, ble deponert til Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, mars 31, 1988 og ble tildelt aksessjonsnr. B-18355. E. coli strain DK1/P3 containing plasmid piABCD (designated pCR1/piABCD), encoding full-length CR1 protein, was deposited in the Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, March 31, 1988 and was assigned accession no. B-18355.

Kinesisk hamsterovariecellelinje DUX Bli inneholdende plasmid pBSCRlc/pTCSgpt klon 35,6, kodende for et oppløselig CR1 molekyl, ble deponert til American Type Clture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, mars 23, 1989 og ble tildelt aksessjonsnr. CRL 10052. Chinese hamster ovary cell line DUX Bli containing plasmid pBSCRlc/pTCSgpt clone 35.6, encoding a soluble CR1 molecule, was deposited with the American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, March 23, 1989 and was assigned accession no. CRL 10052.

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset i ramme av mikroorganismene som er deponert p.g.a. at de deponerte utførelsesformene er ment som enkeltillustrasjon på et aspekt av oppfinnelsen og en hvilken som helst mikroorganisme som er funksjonelt ekvivalent er innenfor rammen av denne oppfinnelsen. Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til de som er vist og beskrevet heri vil fremgå for fagfolk fra beskrivelsen ovenfor og vedlagte figurer. Slike modifikasjoner faller inn under rammen av vedlagte krav. The present invention is not limited in terms of the microorganisms that are deposited due to that the deposited embodiments are intended as a single illustration of an aspect of the invention and any functionally equivalent microorganism is within the scope of this invention. Various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will be apparent to those skilled in the art from the above description and attached figures. Such modifications fall within the scope of the attached requirements.

Det er også å bemerke at alle baseparstørrelser angitt for nukleotider er omtrentlige og blir anvendt for å beskrive. It should also be noted that all base pair sizes given for nucleotides are approximate and are used to describe.

Forskjellige referanser er sitert heri, og beskrivelsen derav er inkorporert som referanse i sin helhet. Various references are cited herein, and the description thereof is incorporated by reference in its entirety.

Claims (18)

1. Nukleinsyresekvens, karakterisert ved at den omfatter en sekvens kodende for full-lengde CRl-protein som angitt i fig.l fra nukleotidnummerne 28 t.o.m. 6144.1. Nucleic acid sequence, characterized in that it comprises a sequence coding for full-length CR1 protein as indicated in fig.1 from nucleotide numbers 28 to. 6144. 2. Nukleinsyrekvens, karakterisert ved at den omfatter et fragment av nukleinsyresekvensen som angitt i figur 1 og som koder for et protein som mangler en transmembranregion, idet nevnte protein har en komplementregulatorisk aktivitet til full-lengde CR1.2. Nucleic acid sequence, characterized in that it comprises a fragment of the nucleic acid sequence as indicated in Figure 1 and which codes for a protein lacking a transmembrane region, said protein having a complement regulatory activity to full-length CR1. 3. Nukleinsyresekvens ifølge krav 2, karakterisert ved at proteinet er funksjonelt som detektert ved evnen til in vitro til å inhibere neutrofil oksidativt utbrudd, komplement-mediert hemolyse eller C3a eller C5a produksjon.3. Nucleic acid sequence according to claim 2, characterized in that the protein is functional as detected by the ability in vitro to inhibit neutrophil oxidative burst, complement-mediated hemolysis or C3a or C5a production. 4. Rekombinant ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter nukleinsyresekvensen ifølge krav 1 eller 2, og som har evne til å uttrykke sekvensen i en bakterie eller i en pattedyrcelle.4. Recombinant expression vector, characterized in that it comprises the nucleic acid sequence according to claim 1 or 2, and which has the ability to express the sequence in a bacterium or in a mammalian cell. 5 . Rekombinant ekspresjonsvektor ifølge krav 4, karakterisert ved at den omfatter piABCD som deponert til NRRL og tildelt aksesjonsnr. B-18355.5 . Recombinant expression vector according to claim 4, characterized in that it comprises piABCD as deposited to NRRL and assigned accession no. B-18355. 6. Rekombinant ekspresjonsvektor ifølge krav 4, karakterisert ved at den blir selektert fra gruppen bestående av pBSCRlc, pBSCRls, pBM-CRlc, pBSCRlc/pTCSgpt og pBSCRls/pTCSgpt eller blir selektert fra gruppen bestående av pT-CRlcl, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 og pT-CRlc5.6. Recombinant expression vector according to claim 4, characterized in that it is selected from the group consisting of pBSCRlc, pBSCRls, pBM-CRlc, pBSCRlc/pTCSgpt and pBSCRls/pTCSgpt or is selected from the group consisting of pT-CRlc1, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 and pT-CRlc5. 7. Rekombinant ekspresjonsvektor ifølge krav 4, karakterisert ved at den omfatter plasmid pBSCRIc/- pTCSgpt, som deponert til ATCC og tildelt aksesjonsnr. CRL 10052.7. Recombinant expression vector according to claim 4, characterized in that it comprises plasmid pBSCRIc/- pTCSgpt, as deposited with ATCC and assigned accession no. CRL 10052. 8. Rekombinant celle, karakterisert ved at den omfatter nukleinsyresekvensen ifølge krav 1 eller 2, eller omfatter en rekombinant ekspresjonsvektor ifølge krav 4.8. Recombinant cell, characterized in that it comprises the nucleic acid sequence according to claim 1 or 2, or comprises a recombinant expression vector according to claim 4. 9. Rekombinant celle ifølge krav 8, karakterisert ved at den omfatter en bakterie.9. Recombinant cell according to claim 8, characterized in that it comprises a bacterium. 10. Escherichia coli ifølge krav 9, karakterisert ved at den er deponert til NRRL og tildelt aksessjonsnr. B-18355.10. Escherichia coli according to claim 9, characterized in that it has been deposited with NRRL and assigned accession no. B-18355. 11 • Kinesisk hamsterovariecelle DUX Bil ifølge krav 8, karakterisert ved at den inneholder plasmid pBSCRIc/PTCSgpt, som er deponert til ATCC og tildelt aksesjonsnr. CRL 10052.11 • Chinese hamster ovary cell DUX Bil according to claim 8, characterized in that it contains plasmid pBSCRIc/PTCSgpt, which has been deposited with ATCC and assigned accession no. CRL 10052. 12 . Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som omfatter et CRl-protein som omfatter aminosyresekvensen som vist i figur 1, eller et fragment derav, som mangler en transmembranregion og utviser en komplementregulatorisk aktivitet av full-lengde CR1, karakterisert ved (a) ekspresjon i en rekombinant vertcelle (b) gjenvinning av nevnte CRl-protein eller fragment, og (c) formulering av nevnte CRl-protein eller fragment for terapeutisk administrering til et menneske eller dyr. 12 . Process for the preparation of a pharmaceutical composition comprising a CR1 protein comprising the amino acid sequence as shown in Figure 1, or a fragment thereof, which lacks a transmembrane region and exhibits a complement regulatory activity of full-length CR1, characterized by (a) expression in a recombinant host cell (b) recovering said CR1 protein or fragment, and (c) formulating said CR1 protein or fragment for therapeutic administration to a human or animal. 13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor nevnte CRl-protein eller fragment er kodet for av en nukleinsyresekvens som vist i figur 1, fra nukleotid nummer 28 til nukleotid nummer 5943, hvor nevnte protein danner en transmembranregion og utviser en komplemtregulatorisk aktivitet av full-lengde CR1, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmateriale. 13. Method according to claim 12, where said CR1 protein or fragment is coded for by a nucleic acid sequence as shown in figure 1, from nucleotide number 28 to nucleotide number 5943, where said protein forms a transmembrane region and exhibits a complement regulatory activity of full-length CR1, characterized by the fact that corresponding starting material is used. 14. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor nevnte CRl-protein eller fragment som mangler en transmembranregion blir utskilt av en celle hvori den uttrykkes, er uglykosylert eller glykosylert, og utviser komplementregulatorisk aktivitet av full-lengde CR1, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmateriale. 14. Method according to claim 12, where said CR1 protein or fragment lacking a transmembrane region is secreted by a cell in which it is expressed, is unglycosylated or glycosylated, and exhibits complement regulatory activity of full-length CR1, characterized in that corresponding starting material is used. 15. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor nevnte CRl-protein eller fragment derav, er funksjonell ved deteksjon av dens evne in vitro til å inhibere neutrofilt oksydativt utbrudd (burst), komplementmediert hemolyse eller C3a- og C5a-produksjon og som kodes for av en nukleinsyrevektor selektert fra gruppen bestående av pBSCRlc, pBSCRls, pBM-CRlc, pBSCRlc/pTCSgpt, pBSCRls/pTCSgpt eller som kodes for av en nukleinsyrevektor selektert fra gruppen bestående av pT-CRlcl. pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 og pT-CRlc5, eller som blir uttrykt ved en kinesisk hamsterovariecelle DUX Bil som bærer plasmid pBSCRlc/pTCSgpt, som er deponert ved ATTC og fått aksesjons-nummer CRL 10052, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmateriale. 15. Method according to claim 12, wherein said CR1 protein or fragment thereof is functional by detection of its ability in vitro to inhibit neutrophil oxidative burst, complement-mediated hemolysis or C3a and C5a production and which is coded for by a nucleic acid vector selected from the group consisting of pBSCRlc, pBSCRls, pBM-CRlc, pBSCRlc/pTCSgpt, pBSCRls/pTCSgpt or which is encoded by a nucleic acid vector selected from the group consisting of pT-CRlc1. pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 and pT-CRlc5, or which is expressed by a Chinese hamster ovary cell DUX Bil carrying plasmid pBSCRlc/pTCSgpt, which has been deposited at ATTC and given accession number CRL 10052, characterized in that it corresponding starting material is used. 16. Fremgangsmåte ifølge krav 12, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, som omfatter å uttrykke i en rekombinant vertscelle et oppløselig CRl-protein som omfatter minst én gangs kort konsensusrepetert (SCR) av humant CR1, gjenvinne det oppløselige CRl-proteinet eller fragmentet, og formulere nevnte oppløselige CRl-protein eller fragment for terapeutisk administrering til et menneske eller dyr, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmateriale. 16. Method according to claim 12, for the preparation of a pharmaceutical composition, which comprises expressing in a recombinant host cell a soluble CR1 protein comprising at least one short consensus repeat (SCR) of human CR1, recovering the soluble CR1 protein or fragment, and formulating said soluble CR1 protein or fragment for therapeutic administration to a human or animal, characterized in that corresponding starting material is used. 17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at nevnte oppløselige CRl-protein eller fragment omfatter minst lang homolog repetisjon A av CR1.17. Method according to claim 16, characterized in that said soluble CR1 protein or fragment comprises at least long homologous repeat A of CR1. 18. Fremgangsmåte for å produsere et CRl-protein, karakterisert ved at den omfatter å dyrke den rekombinante cellen ifølge krav 8 eller 11.18. Method for producing a CR1 protein, characterized in that it comprises cultivating the recombinant cell according to claim 8 or 11.