NO307347B1 - DNA-sekvens som koder for et polypeptid med xylanaseaktivitet, DNA-konstruksjon, transformert mikrobevert, anvendelser av DNA-sekvens og polypeptid med xylanaseaktivitet, dyrefor-deig og kraftmasse som inneholder polypeptid med xylanase- aktivite - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår feltet molekylær biologi. Spesielt angår den foreliggende oppfinnelse kloning og over-ekspresjon av en sopp-DNA-sekvens som koder for et protein med aktivitet som en xylanase. Det tilveiebringes også fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av en enkelt xylanase som kan fås i en form som er fri for andre xylanaser, og faktisk fra andre enzymer generelt.

Foreliggende oppfinnelse omhandler renset og isolert DNA-sekvens som koder for et polypeptid som har xylanaseaktivitet, DNA-konstruksjon som inneholder DNA-sekvensen, transformert mikrobevert som er istand til overekspresjon av en soppxylanase. Videre omhandler oppfinnelsen anvendelser av DNA-sekvens og polypeptid med xylanaseaktivitet. Oppfinnelsen omfatter også deig, dyrefor og kraftmasse som inneholder eller er blitt behandlet med nevnte polypeptid.

Sammensetningen av en plantecellevegg er kompleks og variabel. Polysakkarider finnes hovedsakelig i form av lange kjeder av cellulose (hoved-strukturkomponenten i plantecelle-veggen), hemicellulose (som omfatter forskjellige S-xylan-kjeder) og pektin.. Forekomsten, fordelingen og de strukturel-le trekk av plantecellevegg-polysakkarider bestemmes ved (1) plantearten, (2) varietet, (3) vevstype, (4) vekstbetingelser, (5) aldring og (6) bearbeidelse av plantematerialet før fo-ring.

Det er grunnleggende forskjeller mellom enfrøbladede (f.eks. cerealer og gressarter) og tofrøbladede (f.eks. klø-ver, raps og soyabønner) planter og mellom plantens frø- og vegetative deler (Chesson, 1987; Carré og Brillouet, 1986). Enfrøbladede planter er kjennetegnet ved tilstedeværelse av et arabinoxylankompleks som hemicellulose-hovedskjelettet. Hovedstrukturen for hemicellulose i tofrøbladede planter er et xyloglukan-kompleks. Videre finnes det høyere pektinkonsen-trasjoner i tofrøbladede enn i enfrøbladede planter. Frø har vanligvis meget høyt innhold av pektinsubstanser, men forholdsvis lavt av cellulosemateriale.

Et tverrsnittsdiagram over en plantecelle er tegnet på fig. 1. Tre mer eller mindre vekselvirkende polysakkaridstrukturer kan skjelnes mellom i celleveggen:

(1) Midt-lamellen danner den ytre cellevegg. Den tjener også som tilknytningspunkt for de individuelle celler til hverandre i plantevevsmatriksen. Midt-lamellen består hovedsakelig av kalsiumsal-ter med sterkt forestrede pektiner; (2) Primærveggen befinner seg like innenfor midt-lamellen. Det er en velorganisert struktur av cellulose-mikrofibriller innleiret i en amorf matriks av pektin, hemicellulose, fenolestere og proteiner; (3) Sekundærveggen dannes etter hvert som planten utvikles. Under plantens vekst- og aldringsfase avsettes cellulose-mikrofibriller, hemicellulose og lignin.

Primærcelleveggen hos fullt utviklede, metabolsk aktive planteceller (f.eks. mesofyll og epidermis) er mer utsatt for enzymatisk hydrolyse enn sekundærcelleveggen, som på dette trinn er blitt sterkt lignifisert.

Det er en høy grad av vekselvirkning mellom cellulose, hemicellulose og pektin i celleveggen. Enzymatisk nedbrytning av disse ganske intenst tverrbundne polysakkaridstrukturer er ikke en enkel prosess. Minst fem forskjellige enzymer er nødvendige for fullstendig nedbrytning av for eksempel arabinoxylan. Endo-spaltingen skjer ved anvendelse av en endo-S(l-*4) -D-xylanase. Ekso-(l-»4)-D-xylanase frigjør xylose-enheter ved polysakkaridets ikke-reduserende ende. Tre andre enzymer (a-glukuronidase, a-L-arabinofuranosidase og acetylesterase) anvendes for angriping av substituenter på xylan-skjelettet. Valget av de spesifikke enzymer er selvfølgelig avhengig av den spesifikke hemicellulose som skal nedbrytes (McCleary og Matheson, 1986) .

For visse anvendelser er det imidlertid ikke nødvendig eller ønskelig med fullstendig nedbryting av hele hemicellu-losen til monomerer. Ved flytendegjøring av for eksempel arabinoxylan, er det ganske enkelt nødvendig at hoved-xylan-skjelettet spaltes til kortere enheter. Dette kan oppnås ved innvirkning av en endo-xylanase, som til slutt resulterer i en blanding av xylose-monomerenheter og oligomerer så som xylobi-ose og xylotriose. Disse kortere subenheter er så tilstrekkelig løselige for den ønskede anvendelse.

Trådsopp er kjent i vide kretser for sin kapasitet til utsondring av store mengder av forskjellige hydrolytiske enzymer så som or-amylaser, proteaser og amyloglykosidaser, og forskjellige plantecellevegg-nedbrytende enzymer så som cellulaser, hemicellulaser og pektinaser. Blant disse er man blitt klar over multiple xylan-nedbrytende enzymer som er blitt vist å ha mange forskjellige biokjemiske og fysiske egenskaper. Denne heterogenitet i xylanasefunksjonen gir mulighet for utvelgelse av en aktuell xylanase som er best egnet for en ønsket anvendelse (se Wong et al. (1988), Woodward (1984) og Dekker og Richards (1977)).

Det er kjent at multiple xylanaser med forskjellig molekylvekt dannes av mikroorganismer så som Aspergillus niger, Clostridium thermocellum, Trichoderma reesei, Penicillium janthinellum så vel som arter av Bacillus og Streptomyces.

Derimot er det ikke blitt observert noen xylanase-mang-foldighet i gjærceller. I tre gjærsoppslekter, Trichosporon, Cryptococcus og Aureobasidium kunne det bare påvises en enkelt xylanase.

I naturen dannes det alltid mikrobielle xylanaser sammen med andre enzymer med polysakkaridnedbrytende aktiviteter, så som ekso-arabinase, acetylesterase og cellulaser. For noen anvendelser er disse enzymaktiviteter ikke nødvendige, eller de er uønskede.

Det er kjent at fermenteringsbetingelsene kan varieres for begunstigelse av dannelsen av et ønsket enzym. Det er også kjent at kloning av genet som koder for det ønskede enzym, og overekspresjon av det i dets naturlige vert eller annen forenlig ekspresjonsvert, spesifikt vil forøke dannelsen av det aktuelle enzym. Denne sistnevnte fremgangsmåte er spesielt egnet hvis man vil ha det aktuelle enzym i en form som er fri for uønsket enzymaktivitet.

Ekspresjon av rekombinant bakteriell xylanase er tidligere blitt beskrevet i europeisk patentsøknad 121.138. Genet som koder for den bakterielle xylanase, ble isolert fra kromo-somalt Bacillus-DNA og brakt til ekspresjon i en E. coli-vert. Imidlertid ansees E. coli-ekspresjonsverter i noen tilfeller for å være usikre for dannelse av proteiner ved rekombinant-DNA-metoder på grunn av at de danner uakseptable biprodukter så som toksiner.

Siden bakteriegener ikke inneholder noen introner, vil man møte få problemer ved kloning og ekspresjon av slike gener i prokaryote verter. På den annen side er ikke alltid ekpre-sjon av eukaryote gener så enkelt. Det er velkjent at gener isolert fra eukaryote stammer inneholder introner. Dette medfører naturnødvendig komplikasjoner ved kloning og ekspresjon av disse gener dersom man skulle foretrekke en prokaryot vert.

Videre er det generelt visse forskjeller mellom de fysiske egenskaper hos xylanaser som stammer fra sopp og fra bakterier. Vanligvis har sopp-xylanaser et pH-optimum i området 3,5-5,5, til sammenlikning med bakterie-xylanaser som vanligvis har en pH-optimum i området 5,0-7,0. Sopp-xylanaser har dessuten generelt et bredere pH-stabilitetsområde (pH 3-10) enn sine bakterie-motstykker (pH 5,0-7,5). Sopp-xylanaser har vanligvis et temperatur-optimum på ca. 50°C. Bakterie-xylanaser har vanligvis et temperatur-optimum på mellom 50 og 70°C. For en ytterligere omtale av de fysiske egenskaper hos xylanaser, se Wong et al. (1988), Woodward (1984) og Dekker og Richards (1977).

Det er således klart at bakterie-xylanaser er mindre egnet for anvendelse i for eksempel prosesser som fordrer lavere pH-betingelser. I andre tilfeller er bakterie-xylanaser for termostabile for visse anvendelser så som øllagring (se europeisk patent nr. 227.159).

Det vil følgelig være av stor betydning å oppnå gener som koder for xylan-nedbrytende enzymer fra sopp, som kan bringes til ekspresjon i andre, høyproduserende mikrobielle ekspresjonsverter.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer rensede og isolerte DNA-sekvenser som stammer fra sopp, og som koder for proteiner med xylan-nedbrytende aktivitet. Disse DNA-sekven- . ser innbefatter den xylanase-kodende sekvens og fortrinnsvis også de tilstøtende 5'- og 3'-regulatorsekvenser.

Det er også et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe konstruksjoner for mikrobiell overekspresjon av de xylanase-kodende sekvenser under anvendelse av enten deres naturlige regulatorsekvenser eller, ved en alternativ utførel-sesform, den xylanasekodende sekvens som er operabelt koplet til utvalgte regulatorområder så som promotor-, sekresjonsleder- og terminatorsignaler som kan styre overekspresjonen av xylanaseproteinet i en egnet ekspresjonsvert.

Det er et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe mikrobielle ekspresjonsverter transformert med ekspresjonskonstruksjonene ifølge den foreliggende oppfinnelse, som er i stand til overekspresjon, og hvis ønskelig, sekresjon av en xylanase som stammer fra sopp.

Det er enda et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe anvendelser av en DNA-sekvens for fremstilling av en aktuell xylanase som i sin tur med fordel kan anvendes ved en industriell prosess. En slik industriell prosess fordrer typisk xylanase-aktivitet ved lavere pH enn den ved hvilken xylanaser som stammer fra bakterier, funksjonerer optimalt.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1: Tverrsnittsdiagram over en plantecelle.

Fig. 2: HPLC-elueringsprofil for et dyrkningsfiltrat fra Aspergillus niger DS16813 (CBS 323.90) . Denne stamme er senere blitt omklassifisert som mer sannsynlig å høre til arten Aspergillus tubigensis. Fig. 3: Oligonukleotid-prober AB801-AB806, utformet ut fra den N-terminale aminosyresekvens av Aspergillus tubigensis XYL A-proteinet (formel 1). Fig. 4: Oligonukleotid-probe AB1255, utformet ut fra den N-terminale aminosyresekvens av et indre 19 kDa-fragment av Aspergillus tubigensis-XYL A-proteinet, nedbrutt med S. aureus V8-endopeptidasen (formel 2). Fig. 5: Restriksjonskart over genom-området som inneholder xln A-genet, fra "Southern blot"-analyse av bakteriofag-lambdax^n3. De hybridiserende fragmenter og deres tilsvarende lengder er vist. Fig. 6: Strategi anvendt for sekvensbestemmelse av Aspergillus tubigensis xln A-genet. Pilene viser retningen og antallet sekvensbestemte bp. Fig. 7: Restriksjonskart over pIMlOO inneholdende 6,9 kb Sali-fragmentet inneholdende Aspergillus tubigensis xln A-genet. I tillegg til de to viste Hindlll-seter, finnes det to ytterligere Hindlll-seter i plasmidinnskuddet. Fig. 8: Nukleotidsekvens for Aspergillus tubigensis xln A-genet. Posisjonene for intronet og pro-peptidet er tenkt. Fig. 9: Representasjon av et zymogram som viser XYL A-prote inet uttrykt ved transformantene TrX2 og TrX9. Fig. 10: SDS-polyakrylamidgel-elektroforese som viser ekspresjon av XYL A-proteinet i A. niger CBS 513.88 (A) og A. niger N593 (B). Fig. 11: Naturlig gradient-PAGE som viser XYL A-proteinet uttrykt ved A. niger CBS 513.88-transformanter nr. 10, 29 og 1.1, farget med CBB (A) og med et RBB-belegg (B). Fig. 12: Fysisk kart over pXYLl inneholdende xln A-genet på

et 2,1 kbp Pstl-fragment i pTZ18R. [Forkortinger:

H = HindiII, P = Pstl, B = BamHI, K = Kpnl, E = EcoRI, X = Xhol og S = Sali].

Fig. 13: Fysisk kart over pAB 6-1. Hindlll DNA-innskuddet på

14,5 kbp i pUC19 inneholder hele amyloglukosidase-(AG)-stedet fra A. niger.

Fig. 14: Skjematisk oversikt over dannelsen av AG promotor/-

xylanase-genfusjoner utført ved polymerasekjedereaksjonen.

Fig. 15: Konstruksjonsvei for det mellomliggende plasmid

pXYL2AG. [Forkortinger: se fig. 12]

Fig. 16: Konstruksjonsvei for det mellomliggende plasmid

pXYL2. [Forkortinger: se fig. 12]

Fig. 17: Konstruksjonsvei for det mellomliggende plasmid

pXYL3AG. [Forkortinger: se fig. 12]

Fig. 18: Konstruksjonsvei for det mellomliggende plasmid

pXYL3. [Forkortinger: se fig. 12]

Fig. 19: Partial-restriksjonskart over 6,5 kb Bglll/Sall-fragmentet fra T. reesei klonet i pEMBL18 (pIM030). Den skraverte innramming representerer det hybridiserende fragment i innskuddet. Fig. 20: Partial-restriksjonskart over 7,5 kb BamHI/Bglll-fragmentet fra T. reesei klonet i PUC9 (pIM041). Den skraverte innramming representerer det hybridiserende fragment i innskuddet. Fig. 21: Skjematisk representasjon av konstruksjonene fremstilt ved frembringelse av delesjoner i xln A-promotorområdet. Til orientering er Xbal-setet anvendt ved kloning av A. niger pyr A-genet vist.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse beskriver rensede og isolerte DNA-sekvenser som koder for et polypeptid som har xylanaseaktivitet, kjennetegnet ved at DNA-sekvensen er valgt fra gruppen som består av en DNA-sekvens som stammer fra sopp og som koder for et polypeptid med xylanaseaktivitet beskrevet i figur 8 eller redundante variasjoner derav. DNA-sekvensen innbefatter fortrinnsvis den xylanasekodende sekvens og tilstøtende 5'- og 3'-regulatorsekvenser. Genetiske varianter innbefatter DNA-konstruksjoner som inneholder den xylanase-kodende sekvens koplet til regulatorområder så som promotor-, sekresjons- og terminatorsignaler, som stammer fra homologe eller heterologe organismer. Genetiske varianter innbefatter også redundante variasjoner av DNA-sekvenser som koder for xylanase-proteiner og degenererte DNA-sekvenser hvor den xylan-nedbrytende aktivitet hos enzymet er beholdt. Oppfinnelsen innbefatter DNA-sekvenser som kan være forskjellige når det gjelder kodon-sekvens på grunn av degenerasjon av den genetiske kode eller variasjon på tvers av arten.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også DNA-konstruksjoner som er kjennetegnet ved at den inneholder en DNA-sekvens ifølge kravene 1-3 som er operabelt knyttet til regulatorområdet som kan styre overekspresjon av et polypeptid med xylanaseaktivitet i en egnet ekspresjonsvert. Disse ekspresjonskonstruksjoner innbefatter hybrid-DNA-sekvenser inneholdende det xylanase-kodende område operabelt knyttet til regulatorområder, så som promotor-, sekresjons- og terminatorsignaler som stammer fra homologe eller heterologe organismer, idet disse regulatorområder kan styre overekspresjonen av enzymet kodet ved den xylanasekodende DNA-sekvens i en hensiktsmessig vert. Ekspresjonskonstruksjonen vil fortrinnsvis innordnes i genomet hos den valgte ekspresjonsvert.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre DNA-konstruksjoner som vektorer, fortrinnsvis plasmider, for kloning og/eller transformering av mikrobielle verter via innføring av DNA-konstruksjonene i den mikrobielle vert for ekspresjon av den aktuelle xylanase.

Den foreliggende oppfinnelse angår i tillegg homologe eller heterologe verter transformert med DNA-konstruksjoner beskrevet ovenfor. Mikrobielle ekspresjonsverter kan velges blant bakterier, gjærceller eller sopp.

Innenfor den foreliggende oppfinnelses ramme angir betegnelsen "homolog" alt som er naturlig for DNA-sekvensen som koder for den aktuelle xylanase, innbefattende dens regulator-områder. En homolog vert er definert som den type som slik DNA-sekvens kan isoleres fra.

Betegnelsen "heterolog" er således definert som alt det som ikke er naturlig for DNA-sekvensen som koder for selve den aktuelle xylanase, innbefattende regulatorområder. En "heterolog" vert er definert som hvilken som helst annen mikrobeart enn den det xylanasekodende gen er blitt isolert fra.

Innenfor den foreliggende oppfinnelses ramme skal det med en aktuell xylanase forstås hvilket som helst xylan-nedbrytende enzym som naturlig dannes av en trådsopp. Spesielt aktuel le xylanaser er slike som dannes naturlig av trådsopp av slektene Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neurospora, Fusarium og Trichoderma. Spesielt foretrukkede xylanaser er slike som stammer fra Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus tubigensis, Disporotrichum dimorphosporum og Trichoderma reesei. Mest foretrukket er xylanasene som stammer fra Aspergillus tubigensis og Trichoderma reesei.

En aktuell endo-xylanase kan identifiseres ved analyse-metoder som ikke er avgjørende for den foreliggende oppfinnelse, så som en "spot test"-analyse. Ifølge denne metode kan et filtrat som fås ved dyrkning av en mikroorganisme som man har fått til å danne (f.eks. med havrespelt-xylan) en endo-xylanase, undersøkes med hensyn til tilstedeværelse av endoxylana-seaktivitet. Dråper av elueringsfraksjonene anbringes individuelt på en agarfilm som inneholder en citrat-fosfat-buffer (se eksempel 1.1 nedenfor) og havrespelt-xylan. Filmen blir så inkubert. Hvis det finnes noen endoxylanase-aktivitet, er stedet for de individuelle dråpene på agarfilmen klart synli-ge.

Når en aktuell xylanase er blitt identifisert, kan DNA-sekvensen som koder for en slik xylanase, fås fra trådsoppen som naturlig danner den, ved dyrking av soppen i et xylanholdig medium, isolering av den ønskede xylanase under anvendelse av kjente metoder så som kolonnekromatografi (f.eks. HPLC - se fig. 2) og bestemmelse av i det minste en del av aminosyresekvensen av det rensede protein.

DNA-prober kan deretter utformes ved syntetisering av oligonukleotidsekvenser basert på del-aminosyresekvensen. Aminosyresekvenser kan bestemmes fra den N-terminale del av det fullstendige protein og/eller fra de N-terminale deler av indre peptidfragmenter oppnådd ved proteolytisk eller kjemisk nedbrytning av det fullstendige protein. Når man har fått DNA-proben(e), anvendes disse til screening av et genom- eller cDNA-bibliotek.

Hvis denne fremgangsmåte ikke er vellykket, kan genombiblioteket underkastes differensial-screening med cDNA-prober som fås fra mRNA fra ikke-induserte og induserte celler. Indusert mRNA prepareres fra celler dyrket på medier som inneholder xylan som karbonkilde, mens ikke-indusert mRNA må isoleres fra celler dyrket på en annen karbonkilde enn xylan, f.eks. glukose. Blant de kloner som bare hybridiserer med den induserte cDNA-probe, kan det utvinnes en klon som inneholder det ønskede xylanase-gen. Alternativt kan et xylanase-gen identifiseres ved krysshybridisering med en beslektet xylanase-sekvens (se eksempel 7 nedenfor).

Et genom-bibliotek kan tillages ved delvis nedbryting av kromosomal sopp-DNA med et egnet restriksjonsenzym, f.eks. Sau3A, og kloning av de resulterende fragmenter i et egnet plasmid eller en lambda-fag-vektor, f.eks. lambda EMBL 3. Etter utplating av en tilstrekkelig mengde kolonier eller plakk, kan genom- eller cDNA-biblioteket deretter underkastes screening med en egnet DNA-probe.

Alternativt kan et cDNA-bibliotek tillages ved kloning av cDNA, syntetisert ved mRNA isolert fra soppceller indusert for syntese av xylanase, i en hensiktsmessig fag-vektor, f.eks. lambda gt 10 eller lambda gt 11. cDNA-biblioteket kan så underkastes screening med en DNA-probe, eller alternativt ved anvendelse av immunologiske teknikker eller ved en plate-analyse.

Ved en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse utformes oligonukleotid-prober ut fra den N-terminale aminosyresekvens (se fig. 3, formel1) av en xylanase med en tilsynelatende molekylvekt på 25 kDa, renset fra et Aspergillus tubigrensis-dyrkningsfiltrat og/eller fra aminosyresekvensen av et indre peptidfragment (se fig. 4, formel 2) oppnådd ved nedbryting av xylanasen med Staphylococcus aureus-endoprotease V8. Oligonukleotid-blandingene angitt på fig. 3 og 4 er komplementære til den tilsvarende avledede xylanase-mRNA. Fire positive fag-kloner ble oppnådd ved screening av et lambda EMBL 3-bibliotek, tillaget ut fra delvis Sau3A-nedbrutt DNA isolert fra Aspergillus niger DS16813, med den N-terminale oligoblanding AB 800 (en blanding av like mengder av fra AB801 til og med AB806; se fig. 3). Aspergillus niger DS16813, senere omklassifisert til mer sannsynlig å høre til arten Aspergillus tubigensis (Kusters - van Someren et al.

(1991)), ble deponert hos Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nederland, 20. juli 1990, og ble gitt betegnelsen CBS 323.90.

DNA isolert fra de fire fag-kloner hybridiserte med den N-terminale oligoblanding så vel som med oligoblandingen fra aminosyresekvensen i det indre fragment (se fig. 4). Restrik-sjonsenzymanalyse viste at alle de fire klonene inneholdt DNA fra det samme genom-område av A. tubigensis.

Et område på ca. 2,1 kb, som hybridiserer med begge oligoblandingene, er blitt sekvensbestemt. Nukleotidsekvensen, vist på fig. 8, omfatter en xylanase-kodende sekvens på 681 bp (som er avbrutt av ett lite intron på 49 bp fra stilling 1179 til 1230) så vel som sekvenser på 949 og 423 nukleotider av henholdsvis de 5'- og 3'-flankerende områder.

Varianter blant de rensede xylanase-proteiner er også blitt oppdaget. Det er blitt bestemt at de tilsvarende xylanaser har tre forskjellige N-terminale ender, muligens som et resultat av fermenteringsbetingelsene. Omtrent én tredjedel av disse xylanaser har serin som den N-terminale aminosyre (fig. 8, stilling 1), ytterligere omtrent én tredjedel har alanin som den N-terminale aminosyre (fig. 8, stilling 2) og de gjenværende proteiner har glycin som den N-terminale aminosyre (fig. 8, stilling 3).

Tilgjengeligheten av en DNA-sekvens som koder for et xylanaseprotein, gjør mulig konstruksjon av mutant-xylanaser ved stedrettet mutagenese. Hvis xylanasens tertiærstruktur er kjent og dens katalytiske og substratbindende felter er loka-lisert, kan aminosyrer velges med hensyn til mutagenese (for eksempel ved hjelp av computer-modellering), som mest sannsynlig påvirker katalytiske og/eller substratbindende funksjoner. Hvis proteinets tertiærstruktur ikke er tilgjengelig, kan tilfeldige mutanter enten dannes langs hele kodingssekvensen, eller proteinets tertiærstruktur kan forutses ved sammenlikning med liknende kjente xylanaser isolert fra en annen mikroorganisme .

For å lette innføring av DNA-fragmentet som inneholder den xylanase-kodende sekvens, i ekspresjonskonstruksjoner omfattende ett eller flere heterologe regulatorområder, kan polymerasekjedereaksjonen (PCR) (H.A. Ehrlich (red.), 1989) anvendes for innføring av hensiktsmessige restriksjonsenzym-steder i 5'- og 3'-endene i den xylanase-kodende sekvens. Valget av restriksjonssteder avhenger av DNA-sekvensen i ekspresjonsvektoren, d.v.s. tilstedeværelsen av andre restriksjonssteder i DNA-molekylet.

For oppnåelse av overekspresjon av xylanaseproteinet i den opprinnelige (homologe) produksjonsart, eller alternativt i en annen soppstamme, innføres et 6,9 kb Sall-fragment (se fig. 5) som omfatter det fullstendige gen med sine 5'- og 3'-regulatorområder, eller alternativt det fullstendige gen koplet til regulatorområdene i andre gener, i den valgte ekspresjonsvert for øking av kopiantallet av genet og følgelig proteinekspresj onen.

Hvis en heterolog ekspresjonsvert er foretrukket, og en gjærsopp- eller bakteriestamme velges, anvendes en ikke-avbrutt (intron-manglende) DNA-sekvens for konstruksjon av en heterolog ekspresjonsvektor for unngåelse av den mulighet at skjøtingssignaler som finnes på genom-fragmentet, ikke opp-fattes av den heterologe vert. Denne ikke-avbrutte DNA-sekvens kan fås fra et cDNA-bibliotet konstruert av mRNA isolert fra celler, indusert for syntese av xylanaser. Dette bibliotek kan underkastes screening med en oligonukleotid- eller cDNA-probe oppnådd som beskrevet tidligere. Alternativt kan en ikke-avbrutt DNA-sekvens fås ved anvendelse av en polymerase-kjedereaksjon under anvendelse av hensiktsmessige 5'- og 3'-oligonukleotider på den første kjede-cDNA syntetisert fra RNA hos xylan-induserte celler.

Innenfor den foreliggende oppfinnelses ramme er overekspresjon definert som ekspresjon av den aktuelle xylanase ved nivåer over det man vanligvis støter på i den homologe vill-type-organisme. Innenfor den samme ramme betyr overekspresjon også ekspresjon av den aktuelle xylanase i en heterolog orga-nisme som normalt ikke danner slik xylanase, bortsett fra innføring av DNA-sekvensen som koder for den aktuelle xylanase, i den heterologe ekspresjonsvert. Det må også være klart at avkom etter disse ekspresjonsverter selvfølgelig også omfattes av den foreliggende oppfinnelse.

Overekspresjon av den aktuelle xylanase kan også oppnås ved valg av heterologe regulatorområder, f.eks. promotor-, sekresjonsleder- og terminatorområder, som tjener til øking av ekspresjonen, og hvis ønskelig, sekresjonsnivåer for det aktuelle protein fra den valgte ekspresjonsvert, og/eller til tilveiebringelse av induserbar kontroll av ekspresjonen av den aktuelle xylanase.

Ved siden av den naturlige promotor for den aktuelle xylanase, kan det anvendes andre promotorer for styring av ekspresjonen av den. Promotoren kan velges med hensyn til sin effektivitet ved styring av ekspresjonen av den aktuelle xylanase i den ønskede ekspresjonsvert.

Ved en annen utførelsesform kan en konstitutiv promotor velges til styring av ekspresjonen av den ønskede xylanase, forholdsvis fri for andre xylanaser. En slik ekspresjonskonstruksjon er videre fordelaktig, siden den omgår behovet for dyrking av ekspresjonsvertene på et medium som inneholder faste xylaner som et induserende substrat.

Eksempler på sterke konstitutive og/eller induserbare promotorer som er foretrukket for anvendelse i sopp-ekspresjonsverter, er ATP-syntetase-, subenhet 9 (oliC)-, triosefos-fat-isomerase-(tpi)-, alkohol-dehydrogenase-(adhA)-, a-amylase-(amy)-, amyloglukosidase-(AG)-, acetamidase-(amdS)- og glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase-(gpd)-promotorene.

Eksempler på sterke gjærsopp-promotorer er alkohol-dehyd-rogenase-, laktase-, 3-fosfoglyceratkinase- og triosefosfat-isomerase-promotorene.

Eksempler på sterke bakteriepromotorer er of-amylase- og Spo2-promotorene så vel som promotorer fra ekstracellulære protease-gener.

Hybrid-promotorer kan også med fordel anvendes for forbedring av induserbar regulering av ekspresjonskonstruksjonen.

Foretrukkede promotorer ifølge den foreliggende oppfinnelse er slike som stammer fra amyloglukosidase-(AG)-genet og naturlige xylanase-promotorer.

Det er ofte ønskelig at den aktuelle xylanase utsondres fra ekspresjonsverten i dyrkningsmediet som xylanasen lettere kan utvinnes fra.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse kan den naturlige sekresjons-ledersekvens for den aktuelle xylanase anvendes til bevirkning av sekresjon av den uttrykte xylanase.

Imidlertid resulterer en økning i ekspresjonen av xylanasen noen ganger i dannelse av proteinet i nivåer ut over det som ekspresjonsverten er i stand til å bearbeide og utsondre, slik at det blir en opphoping av proteinprodukt i cellen på grunn av en flaskehals ved transporten av proteinet gjennom celleveggen. Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen også heterologe ledersekvenser for tilveiebringelse av den mest effektive utsondring av xylanasen fra den valgte ekspresjonsvert.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse kan sekresjonslederen velges på basis av den ønskede ekspresjonsvert. Det kan velges en heterolog sekresjonsleder som er homolog til de andre regulator-områder for ekspresjonskonstruksjonen. For eksempel kan lederen for det i stor grad utsondrede amylo-glukosidaseprotein anvendes i kombinasjon med selve amyloglukosidasepromotoren, så vel som i kombinasjon med andre promotorer. Hybridsignalsekvenser kan også med fordel anvendes innenfor den foreliggende oppfinnelses ramme.

Eksempler på foretrukkede heterologe sekresjons-ledersekvenser er slike som stammer fra amyloglukosidase-genet (sopp), a-faktor-genet (gjær) eller a-amylase-genet (Bacillus).

Mest foretrukkede sekresjons-ledersekvenser ifølge den foreliggende oppfinnelse er slike som stammer fra amyloglukosidase- (AG) -genet og den naturlige xylanase-ledersekvens.

Vanligvis anses ikke terminatorer for å være avgjørende elementer for overekspresjon av gener. Hvis ønskelig, kan en terminator velges fra de samme gener som promotorene, eller alternativt kan den homologe terminator anvendes.

I tillegg til det genom-fragment som er nevnt ovenfor, kan den transformerende DNA inneholde en seleksjonsmarkør for utskillelse av celler som har innlemmet det ønskede gen, fra hovedmengden av ikke-transformerte celler. Denne seleksjons-markør, forsynt med de hensiktsmessige 5'- og 3'-regulatorsekvenser, kan være på det samme DNA-molekyl som inneholder det ønskde gen, eller være tilstede på et atskilt molekyl. I sistnevnte tilfelle må det utføres en ko-transformering. Forholdet mellom ekspresjonsvektoren og seleksjonsvektoren må justeres på en slik måte at en høy prosentandel av de utvalgte transformanter også har innlemmet vektoren som inneholder ekspresjonskonstruksjonen for den aktuelle xylanase.

De mest egnede seleksjonssystemer for industrielle mikroorganismer, er slike som utgjøres av den seleksjonsmarkør-gruppe som ikke fordrer mutasjon i vertsorganismen. Eksempler, på sopp-seleksjonsmarkører er genene for acetamidase (amdS), ATP-syntetase, subenhet 9 (oliC) og benomylresistens (benA). Eksempler på ikkesopp-seleksjonsmarkører er G418-resistens-genet (gjær), ampicillinresistensgenet ( E. coli) og neomycin-resistensgenet { Bacillus).

Når den ønskede ekspresjonskonstruksjon er blitt satt sammen, transformeres den til en egnet kloningsvert så som E. coli for formering av konstruksjonen. Deretter innføres ekspresjonskonstruksjonen i en egnet ekspresjonsvert hvor ekspresjonskonstruksjonen fortrinnsvis innlemmes i genomet. Visse verter så som Bacillus-arter kan anvendes både som klonings- og ekspresjonsverter, idet man således unngår et ekstra transformasjonstrinn.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse kan det anvendes mange forskjellige ekspresjonsverter for overekspresjon av den aktuelle xylanase. Ved én utførelsesform kan det anvendes en homolog ekspresjonsvert. Dette innebærer innføring av den ønskede ekspresjonskonstruksjon tilbake i stammen som den xylanasekodende DNA-sekvens ble isolert fra, enten i økte genkopiantall eller under kontroll av heterologe regulator-områder som beskrevet ovenfor, eller begge.

Ved en annen utførelsesform kan en aktuell xylanase overeksprimeres ved innføring og ekspresjon av DNA-konstruksjonen som koder for den aktuelle xylanase, under kontroll av de hensiktsmessige regulatorområder i heterologe verter så som bakterier, gjærceller eller sopp. For dette formål uttrykkes DNA-sekvensen som koder for den aktuelle xylanase, fortrinnsvis under kontroll av promotor- og terminatorsekvenser som stammer fra den heterologe vert. Dessuten kan det være nød-vendig å erstatte den naturlige sekresjons-ledersekvens for den aktuelle xylanase, med en ledersekvens homolog til ekspresjonsverten, for oppnåelse av den mest effektive ekspresjon og sekresjon av produktet.

Faktorer så som størrelsen (molekylvekt), det eventuelle behov for glykosylering eller ønskeligheten for ekstracellulær sekresjon av den aktuelle xylanase spiller en viktig rolle ved utvelgelse av ekspresjonsverten.

Den gramnegative bakterie E. coli anvendes i stor ut-strekning som vert for heterolog gen-ekspresjon, men opphoper hovedsakelig store mengder heterologt protein inne i cellen. Etterfølgende rensing av det ønskede protein fra hovedmengden av intracellulære E. coli-proteiner kan noen ganger være vanskelig.

I motsetning til E. coli, er bakterier fra slekten Bacillus meget godt egnet som heterologe verter på grunn av sin evne til sekresjon av proteiner i dyrkningsmediet.

Alternativt kan en heterolog vert valgt fra gruppen av gjærceller eller sopp, være foretrukket. Vanligvis er gjærceller foretrukket fremfor soppceller fordi de er lettere å manipulere. Imidlertid blir noen proteiner enten dårlig utsondret fra gjærcellen, eller de blir i noen tilfeller ikke bearbeidet nok (f.eks. hyperglykosylering i gjærceller). I disse tilfeller bør det velges en sopp-vertsorganisme.

En heterolog vert kan også velges til ekspresjon av den aktuelle xylanase, hovedsakelig fri for andre polysakkaridnedbrytende enzymer, ved at det velges en vert som normalt ikke danner slike enzymer som Kluyveromyces lactis.

Eksempler på foretrukkede ekspresjonsverter innenfor den foreliggende oppfinnelses ramme er slike sopparter som Aspergillus- arter (beskrevet i EP 184.438 og EP 284.603) og Trichoderma-arter, bakterier så som Bacillus-arter (beskrevet i EP 134.048) og gjærsopp så som Kluyveromyces-arter (beskrevet i EP 96.430 og EP 301.670) og Saccharomyces-arter.

Spesielt foretrukkede ekspresjonsverter kan velges blant Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Kluyveromyces lactis og Saccharomyces cerevisiae.

Overekspresjon av den aktuelle xylanase bevirkes ved dyrking av ekspresjonsvertene, som er blitt transformert med xylanase-ekspresjonskonstruksjonen, i et vanlig næringsfermen-teringsmedium.

Fermenteringsmediet består av et vanlig dyrkningsmedium som inneholder en karbonkilde (f.eks. glukose, maltose, melas-se o.s.v.), en nitrogenkilde (f.eks. ammoniumsulfat, ammonium-nitrat, ammoniumklorid o.s.v.), en organisk nitrogenkilde (f.eks. gjærekstrakt, maltekstrakt, pepton o.s.v.) og uorga-niske næringskilder (f.eks. fosfat, magnesium, kalium, sink, jern o.s.v.). Eventuelt kan det medtas en induktor (f.eks. havrespelt-xylan).

Utvelgelsen av det hensiktsmessige medium kan baseres på valget av ekspresjonsverter og/eller på ekspresjonskonstruk-sjonens reguleringskrav. Slike medier er velkjente for fagfolk på området. Mediet kan, hvis ønskelig, inneholde ytterligere komponenter som begunstiger de transformerte ekspresjonsverter fremfor andre potensielt forurensende mikroorganismer.

Fermenteringen utføres i et tidsrom på 0,5-20 dager i en sats- eller tilførselssats-prosess ved en temperatur i området mellom 0 og 45°C og en pH på mellom 2 og 10. Foretrukkede fermenteringsbetingelser er en temperatur i området mellom 20 og 37°C og en pH mellom 3 og 9. De hensiktsmessige betingelser velges basert på valget av ekspresjonsvert.

Etter fermentering fjernes cellene fra fermenteringsbul-jongen ved hjelp av sentrifugering eller filtrering. Etter fjerning av cellene, kan den aktuelle xylanase så utvinnes, og hvis ønskelig renses og isoleres på vanlige måter.

Produktet utformes stabilt enten i flytende eller i tørr form. For visse anvendelser kan immobilisering av enzymet på en fast matriks være foretrukket.

Aktuelle xylanaser fremstilt ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse kan anvendes enten alene eller sammen med andre utvalgte enzymer ved mange forskjellige prosesser som fordrer virkning av et xylan-nedbrytende enzym. Videre er sopp-xylanasene ifølge den foreliggende oppfinnelse, som vanligvis har lavere pH-optima enn xylanaser som stammer fra bakterier, spesielt godt egnet for anvendelse i industrielle prosesser som utføres ved lav pH.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse er det blitt funnet at xylanasene som dannes ved den foreliggende oppfinnelse, kan anvendes til baking av brød. Innarbeidelse av små mengder xylanase i melet gir deigen, og således selve brødet, gunstige egenskaper såsom økt brødvolum og bedre konsistensegenskaper så som brudd- og rivningsegenskaper og smuldringsegenskaper.

Xylanaser kan også tilsettes til dyreforblandinger som er rike på arabinoxylaner og glykoxylaner. Ved tilsetting til forstoffer (innbefattende silofor) for énmagede dyr (f.eks. fjærfe eller svin) som inneholder cerealer så som bygg, hvete, mais, rug eller havre, eller cereal-biprodukter så som hvetekli eller maiskli, forbedrer enzymet nedbrytningen av plante-cellevegger i betydelig grad, hvilket fører til at dyret bedre utnytter plante-næringsmidlene. Som en følge av dette, for-bedres veksthastigheten og/eller for-omdannelsen. Videre kan xylanaser anvendes til redusering av viskositeten av forstoffer som inneholder xylaner.

Xylanase kan tilsettes på forhånd til foret eller silofo-ret hvis for-bløtlegging eller våte dietter foretrekkes. Mer fordelaktig er det imidlertid at xylanasene som dannes ved den foreliggende oppfinnelse, ved tilsetting til foret fortsetter å hydrolysere xylaner i foret in vivo. Sopp-xylanaser, som vanligvis nar lavere pti-optirad, itcin iiiyjaxe viKLiye iiæx niys-stoffer i slike sure miljøer som magesekken hos dyret som inntar slikt xylanase-supplert for.

Xylanasene som fremstilles ved anvendelse av den foreliggende oppfinnelse, er også effektive til forbedring av filtrering og fjerning av oppløste organiske substanser fra buljongen i prosesser hvor epledestillasjonsavfall bio-omdan-nes til mikrobiell biomasse. Xylanaser som stammer fra trådsopp, kan med fordel anvendes i denne prosess.

Det fremstilles også glukose-sirup med forbedret filtrerbarhet og/eller lavere viskositet, ut fra forurenset cereal-stivelse ved at den forurensede stivelse først utsettes for påvirkning av en a-amylase, og deretter for sopp-xylanaser dannet ved anvendelse av den foreliggende oppfinnelse, og til slutt for hydrolyse. Likeledes kan xylanasene ifølge den foreliggende oppfinnelse anvendes til ølbrygging for forbedring av vørterens filtrerbarhet.

Xylanaser kan også anvendes til fjerning av ligniner fra kraftmasse og således lette blekingen ved reduksjon av mengden klor som trenges til fremstilling av papirprodukter.

Dessuten kan xylanasene anvendes i andre prosesser så som til øking av utbyttet ved fremstilling av frukt- eller grø-nnsaksafter og ved enzymatisk hydrolyse av sukkerroemasse, idet den resulterende hydrolyserte fraksjon kan anvendes i dyrkningsmedier for mikroorganismer; av landbruksrester så som maiskolber, hvetestrå og malt nøtteskall; og av visse resir-kulerbare materialer så som avfallspapir.

Følgende eksempler er tilveiebrakt for å gi vanlige fagfolk på området en fullstendig forklaring og beskrivelse om hvordan oppfinnelsen utføres og anvendes, og er ikke påtenkt å begrense rammen for det som oppfinnerne anser som sin oppfinnelse. Det er blitt gjort anstrengelser for å sikre nøyaktig-het med hensyn til anvendte tall (f.eks. mengder, temperatur, pH o.s.v.), men det må regnes med noen forsøksfeil og -avvik. Dersom ikke annet er angitt, er temperaturen i grader celsius, og trykket er ved, eller nær, atmosfæretrykk.

EKSEMPEL 1

Rensing og karakterisering av Aspergillus tubigensis endo-xylanase XYL A.

Eksempel 1. 1

Rensing av Aspergillus tubigensis endo-xylanase XYL A.

Man fikk et dyrkningsfiltrat ved dyrking av Aspergillus niger DS16813 (CBS 323.90 - senere omklassifisert til mer sannsynlig å høre til arten A. tubigensis; Kusters - van Someren et al. (1991)) i et medium inneholdende (pr. liter): 30 g havrespelt-xylan (Sigma); 7,5 g NH4N03, 0,5 g KCl, 0,5 g MgS04, 15 g KH2P04 og 0,5 g gjærekstrakt (pH 6,0). Dyrkningsfiltratet ble konsentrert til et volum på ca. 35 ml, som så ble ultrafiltrert på et filter av typen Diaflo PM 10 i en 50 ml Amicon-modul under fjerning av salter.

Supernatanten ble så konsentrert til et volum på 10 ml, og retentatet ble vasket to ganger med 25 ml 25 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,0). Etter vasking ble retentat-volumet brakt til 25 ml.

Dette retentat ble injisert i 1 ml mengder på en kolonne av typen Syn Chropak AX 300 (dimensjoner 10 x 250 mm) og eluert etter følgende skjema:

eluerihgshastighet: 2 ml/min.

elueringsbuffer A : 25 mM Tris-HCl pH 7,0 elueringsbuffer B : 25 mM Tris-HCl pH 7,0 + 1 M NaCl elueringsgradient: tid

Fraksjoner på 1 ml av hver ble oppsamlet. Påvisning av elueringsproteinet ble utført ved kontinuerlig måling av UV-absorpsjonen ved 280 nm. Elueringsprofilen er vist på fig. 2.

Fraksjonene ble undersøkt med hensyn til tilstedeværelse av endoxylanase-aktivitet ved en "spot"-test. Denne "spot"- test består av tilsetting av 12 ml sitrat-fosfat-buffer (tillaget ved blanding av 900 ml 0,2 M Na2HP04 og 125 ml 0,5 M sitronsyre, fulgt av justering av løsningens pH til 5,6 under anvendelse av 0,5 M sitronsyre eller 0,2 M Na2HPC>4) inneholdende 0,5% havrespelt-xylan (Sigma) til 180 mg agar (Difco) og oppvarming av blandingen til 100°C under løsing av agaren. Etter avkjøling til 60°C, helles agarblandingen jevnt på Agarose-gelbindingsfilm. Dråper av elueringsfraksjonene anbringes individuelt på filmen og inkuberes i 30 minutter ved 30°C. Hvis endoxylanase-aktivitet er tilstede, er beliggenhet for de individuelle dråper på agarfilmen tydelig.

Total xylanase-aktivitet i de oppsamlede fraksjoner ble

kvantitativt bestemt ved måling av mengden reduserende sukker-arter dannet i løpet av et for-bestemt tidsrom i mikroanalysen beskrevet av Leathers et al. (1984) under anvendelse av havrespelt-xylan i 50 mM natriumacetat ved pH 5,0 som substrat.

Aktivitetsenhetene er også som definert av Leathers (som ovenfor).

Eksoxylanase-aktiviteten i de eluerte fraksjoner ble bestemt ved fremgangsmåten beskrevet av Poutanen og Puls

(1988) under anvendelse av p-nitro-fenyl-S-D-xylopyranosid (0,3 mM, Sigma) som substrat ved pH 5,0 og 30°C.

Spot-testen viste at elueringsfraksjonene som svarer til toppene B, F og K (se fig. 2), inneholder endoxylanase-aktivitet. Analysen av total mengde xylanase viste aktivitet i elueringsfraksjonene med toppene B, F, H og K. Elueringsfraksjonene med toppene B og H ble bestemt å inneholde eksoxylanase-aktivitet.

Elueringsfraksjonene med toppene F (XYL2-protein) og K (XYL A-protein) ble renset ytterligere ved gjentatt ionebyt-terkromatografi. Endoxylanasene i disse blekarakterisert vedSDS/PAGE (Moonen et al., 1982) og isoelektrisk fokusering (3,5 < pH < 9,5) på LKB-utstyr i henhold til produsentens instruksjoner. Den tilsynelatende molekylvekt for endoxylanase F, bestemt ved SDS-PAGE, var ca. 22 kDa; den tilsynelatende molekylvekt for endoxylanase K var ca. 24 kDa. Det isoelektriske punkt (IEP) for endoxylanase F var ca. pH 4,0, mens IEP for endoxylanase K ble bestemt til å være lavere enn pH 3,5.

Eksempel 1. 2

Aminosyre-sekvensbestemmelse av den N-terminale ende av Aspergillus tubigensis endoxylanase XYL A.

Ca. 5 /xg endoxylanase, renset som beskrevet i eksempel 1.1, ble underkastet elektroforese på en 12% SDS-polyakrylamidgel, fulgt av elektro-"blotting" på Immobilon-P-membran (Millipore) ifølge fremgangsmåten beskrevet av Matsudaira

(1987) . Membranfragmentet inneholdende hovedbåndet med en tilsynelatende molekylvekt (SDS-PAGE) på 25 kDa underkastes sekvensanalyse i et gassfase-sekvenseringsapparat (Eurosequence, Groningen). Følgende N-terminale sekvens er blitt bestemt:

Imidlertid ble omtrenglig like mengder av to andre varianter også oppdaget, hvor enten et serin (fig. 8, stilling 1) eller et glycin (fig. 8, stilling 3) ble bestemt å være den N-terminale aminosyre.

Eksempel 1. 3

Aminosyresekvensbestemmelse av endoproteinase Glu-C-frigjorte peptider av endoxylanase XYL A.

Ca. 260 fig endoxylanase, renset som beskrevet i eksempel 1.1, ble oppløst i 110/il av en løsning inneholdende 50 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 7,5 og 2 mg/ml SDS. Etter oppvarming av løsningen i 3 minutter ved 100°C og avkjøling til romtemperatur, ble endoproteinase Glu-C (Staphylococcus aureus protease V8) tilsatt i et 18-dobbelt molart overskudd. Protein -nedbryt ingen ble utført i 20 minutter ved romtemperatur, hvoretter reaksjonsblandingen ble oppvarmet i 3 minutter ved 100°C.

Ca. én femtedel av reaksjonsblandingen ble underkastet elektroforese på en 15% SDS-polyakrylamidgel, fulgt av "blot-ting" på Immobilon-P-membran (Millipore) ifølge fremgangsmåten beskrevet av Matsudaira (1987). Tre fragmenter ble observert med en molekylmasse på henholdsvis 19, 16 og 4 kDa. De to største fragmenter (19 og 16 kDa) ble anvendt ved gassfase-sekvensbestemmelse (protein-sekvensator av typen Applied Biosystems modell 470A, Eurosequence, Groningen). Membran-fragmenter inneholdende 2-3 nmol av det bestemte peptid, ble vasket og underkastet sekvensanalyse i henhold til programmet beskrevet av Amons (1987).

Følgende N-terminale aminosyresekvens er blitt bestemt i 19 kDa-fragmentet:

Identiteten av aminosyren i stilling 9 (X) kunne ikke bestemmes. I stilling 14 finnes bare et spor av Ser, som angitt ved parentes.

Følgende aminosyresekvens er blitt bestemt fra den N-terminale del av 16 kDa-fragmentet:

Identiteten av aminosyre (X) i stilling 10 kunne ikke bestemmes. Den funne sekvens for dette fragment er nesten identisk med sekvensen for 19 kDa-fragmentet. Begge peptider har den samme N-terminale sekvens, som ikke er identisk med den N-terminale aminosyresekvens bestemt for det uskadede protein (eksempel 1.2, formel 1). Det er blitt bestemt at disse to indre fragmenter svarer til sekvensen som begynner med stilling 79, illustrert på fig. 8.

EKSEMPEL 2

Konstruksjon av et genom-bibliotek av Aspergillus niger stamme DS16813 (CBS 323.90; senere omklassifisert som A. tubigensis) .

Eksempel 2. 1

Isolering av DNA fra Aspergillus niger DS16813 (CBS 323.90; senere omklassifisert som A. tubigensis).

Sopp-DNA ble isolert ved fremgangsmåten beskrevet av de Graaff et al. (1988). Mycelium, dyrket over natten i flytende minimal-medium (pr. 1000 ml: 6,0 g NaNO^; 1,5 g KH2P04; 0,5 g MgS04-7H20; 0,5 g KCl; 1 ml Visniac-løsning [Visniac og Santer, 1957: 10 g EDTA; 4,4 g ZnS04.7 H20; 1,0 g MnCl2-4 H20; 0,32 g CoCl2.6 H20; 0,32 g CuS04.5<H>20; 0,22 g (NH4)6Mo?024.4 H20; 1,47 g CaCl2.2 H20; 1,0 g FeS04.7 H20; pH 4,0]; pH 6,0) supplert med 0,2% kasaminosyrer og 0,5% gjærekstrakt, ble høstet, vasket med kald saltløsning, frosset i flytende nitrogen og oppbevart ved -80°C. Nukleinsyrene ble isolert ved sprenging av 0,5 g frosset mycelium under anvendelse av en mikrodismembrator (Braun). Det oppnådde mycelial-pulver ble ekstrahert med nylig tillaget ekstraksjonsbuffer.

Ekstraksjonsbufferen ble tillaget som følger: 1 ml tri-isopropylnaftalensulfonsyre (TNS) (20 mg/ml) ble grundig blandet med 1 ml p-aminosalicylsyre (PAS) (120 mg/ml) og 0,5 ml 5 x RNB-buffer (pr. 1000 ml: 121,10 g Tris; 73,04 g NaCl; 95,10 g EDTA; justert til pH 8,5 med HC1) ble tilsatt. Etter tilsetting av 1,5 ml fenol, ble ekstraksjonsbufferen ekvili-brert i 10 minutter ved 55°C. Den varme buffer ble så tilsatt til myceliumpulveret, og suspensjonen ble grundig blandet i 1 minutt under anvendelse av en virvelblander. Etter tilsetting av 1 ml kloroform, ble suspensjonen blandet på nytt i 1 minutt. Etter sentrifugering ved 10 4 x g i 10 minutter under anvendelse av en høyhastighets-sentrifuge av typen Sorvall, ble den vandige fase ekstrahert én gang til med et likt volum fenol/kloroform (1:1) og ble så ekstrahert to ganger med kloroform. DNA ble isolert fra den vandige fase under anvendelse av følgende fremgangsmåte: DNA ble umiddelbart utfelt med 2 volumdeler etanol ved romtemperatur, og ble deretter oppsamlet ved sentrifugering under anvendelse av en høyhastig-hetssentrifuge av typen Sorvall ved 10 4 x g i 10 minutter, vasket to ganger ved gjenoppløsing av DNA i destillert, ste rilt vann og utfelling igjen med etanol. RNA ble fjernet ved tilsetting av RNase A (20 ug/ ml) til den endelige løsning.

Eksempel 2. 2

Delvis nedbryting av Aspergillus tubigensis- DNA med Sau3A og isolering av DNA-fragmentene etter agarosegel-elektroforese .

DNA (30 ug), isolert fra Aspergillus niger DS 16813 (nylig omklassifisert som A. tubigensis) som beskrevet i eksempel 2.1, ble delvis nedbrutt ved inkubering av DNA med 0,1 U Sau3A i 30 minutter ved 37°C. De resulterende fragmenter ble størrelses-fraksjonert ved elektroforese på 0,4% agarose i TAE-buffer inneholdende 0,5/tg/ml etidiumbromid. Fragmenter med størrelse 14-22 kb, sammenlignet med fragmenter av bakteriofag lambda DNA nedbrutt med Bglll (22,0. 13,3, 9,7, 2,4, 0,65 og 0,44 kb) som størrelsesmarkører, ble utvunnet fra gelen ved at det hensiktsmessige område ble avskåret fra

gelen.

Disse fragmenter ble utvunnet fra agarosestykket ved elektro-eluering under anvendelse av ISCO-kopper. En dialyse-membran ble montert på både de store og små beholdere i denne kopp, koppen ble fylt med 0,005 x TAE (fortynnet fra 50 x TAE forrådsløsning (pr. 1000 ml): 242,0 g Tris; 57,1 ml iseddik; 100 ml 0,5 M EDTA; justert til pH 8,0 med HCl), og agarosestykket ble anbrakt i den store beholder i koppen. Deretter ble koppen anbrakt i elektroelueringsapparatet, med den store beholder i katodekammeret som inneholdt TAE, og den lille beholder ved katodekammeret som inneholdt TAE/3 M NaCl. Fragmentene ble elektro-eluert ved 100 V i et tidsrom på 2 timer. Deretter ble koppen uttatt av elektroelueringsapparatet, og bufferen ble fjernet fra den store beholderen, mens bufferen bare ble fjernet fra den øvre del av den lille beholderen. Den gjenværende buffer (200/il) inneholdende DNA-fragmentene ble dialysert i koppen mot destillert vann i et tidsrom på 3 0 minutter. Til slutt ble DNA utfelt ved tilsetting av 0,1 volumdel 3 M NaAc, pH 5,6, og 2 volumdeler kald (-20°C) etanol. DNA ble oppsamlet ved sentrifugering (Eppendorf) i 30 minutter ved 14 000 x g ved 4°C. Etter fjerning av supernatanten, ble DNA-klumpen tørket under anvendelse av en vakuum-sentrifuge av typen Savant Speedvac. Etter etanolutfelling, ble DNA oppløst i 10/xl TE-buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA; pH 8,0), og konsentrasjonen ble betemt ved agarose-elektroforese under anvendelse av lambda-DNA med kjent konsentrasjon som referanse og etidiumbromidfarging til påvisning av

DNA.

Eksempel 2. 3

Kloning av Aspergillus tubigensis- DNA-fragmenter i bakteriofag lambda EMBL 3.

Fragmenter oppnådd ved delvis nedbryting av genom-DNA, som beskrevet i eksempel 2,2, ble ligert i bakteriofag lambda EMBL 3 BamHI-armer, fra Promega, ved følgende fremgangsmåte: 4/xl (2/xg) EMBL 3 DNA, 1 fil (50 ng) genom-DNA-fragmenter, 0,75 til 10 x ligeringsbuf f er (Maniatis et al., 1982, s. 474: 660 mM Tris-HCl; 50 mM MgCl2; 50 mM ditiotreitol; 10 mM ATP; pH 7,6), 0,75/xl 10 mM ATP og 2/xl (1,5 U//xl) T4-DNA-ligase (BRL) ble utpipettert, omhyggelig blandet og inkubert i 6 timer ved 14°C. Etter denne inkuberingsperiode, ble 1/xl T4~DNA-ligase tilsatt til reaksjonsblandingen, og reaksjonen ble fortsatt i ytterligere 4 timer ved romtemperatur.

Den ligerte DNA ble pakket in vitro under anvendelse av

pakkeekstrakt av typen Gigapack II Gold (Stratagene) og utplatet på E. coli LE392 (Murray, 1977) under anvendelse av NZYCM-medium (pr. 1000 ml: 10 g NZ-amin; 5 g NaCl; 5 g gjærekstrakt; 1 g kasaminosyrer; 2 g MgS04.7 H20; pH 7,5; for plater tilsettes 12 g agar), ifølge produsentens instruksjoner.

Den fullstendige reaksjon beskrevet ovenfor ble gjentatt én gang under anvendelse av 3/xl genom-DNA-fragmenter i et sluttvolum på 10/xl.

Eksempel 2. 4

Titrering og forøkning av Aspergillus tubigensis- genombiblioteket.

Fortynninger av primær-genombiblioteket ble utført i SM-buffer (pr. 1000 ml: 5,8 g NaCl; 2,0 g MgS04.7 H20; 50 ml Tris-HCl; pH 7,5; 5 ml 20% gelatin) og utplatet på E. coli LE392 som vert, som beskrevet av Maniatis et al. (1982, s. 64) under anvendelse av NZYCM-medium. Etter inkubering over natten ved 37°C, ble de resulterende plakk tellet og mengden fager beregnet. Den første ligering og pakking resulterte i ca. 7 x 10 pfu (plakkdannende enheter), den annen i ca. 4 x 10 5 , hvilket resulterte i totalt ca. 5 x 10 5 pfu.

Det således oppnådde genombibiliotek ble utvidet ved utplating av 5 x 10"^ pfu pr. plate med diameter 85 mm (totalt fem plater) på NZYCM-medium, som beskrevet av Maniatis et al.

(1982, s. 293-294). Etter inkubering over natten ved 37°C, ble fagene eluert fra de resulterende sammenflytende plater, ved tilsetting av 5 ml SM-buffer. Platene ble holdt ved 4°C i 2 timer med rysting i perioder. Etter fjerning av supernatanten, ble bakteriene fjernet fra løsningen ved sentrifugering ved 4 000 g i 10 minutter ved 4°C. Til supernatanten ble det tilsatt 0,3% kloroform, og antallet pfu ble bestemt. Dette fag-forråd inneholdt ca.10<10>pfu/ml.

EKSEMPEL 3

Screening av Aspergillus tubigensis-genombiblioteket med hensyn til endoxylanase A'-genet (xln A) og isolering av genet.

Eksempel 3. 1

<32>P-merking av syntetiske oligonukleotider.

Aminosyresekvensen oppnådd i eksempel 1.2 (formel 1) ble anvendt til syntetisering av oligonukleotidblandinger svarende til den N-terminale aminosyresekvens. Oligonukleotidene ble syntetisert ved fosforamiditt-metoden under anvendelse av et oligonukleotid-synteseapparat av typen Applied Biosystems.

Oligonukleotid-blandingene AB801-AB806 (fig. 3) ble blandet i like mengder, i det følgende omtalt som oligonukleotid-blanding AB800, under oppnåelse av en sluttkonsentrasjon på 37 pmol oligonukleotider pr./xl. Denne oligonukleotidblanding ble merket i en reaksjonsblanding med følgende sam-mensetning: 37 pmol oligonukleotidblanding, 66 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM ATP, 1 mM spermidin, 10 mM MgCl_, 15 mM ditiotreitol, 200/xg/ml BSA, 34 pmol gamma- P-ATP (NEN, 6000 Ci/mmol) og 30 U T4~polynukleotidkinase (BRL) i et sluttvolum på 50/xl. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 60 minutter ved 37°C, hvoretter reaksjonen ble avsluttet ved tilsetting av 4/xl 0,5 M EDTA, pH 8,0.

Oligonukleotidblanding AB1255, oppnådd ut fra aminosyresekvensen fra eksempel 1.3 (formler 2 og 3) (fig. 4) ble merket ved samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor. Oligo-mikleotidblandingene ble anvendt ved screening av genombiblioteket (eksempel 3.2) og i Southern blot-analyse (eksempel 3.4 og 3.5) uten ytterligere rensing.

Eksempel 3. 2

Screening av Aspergillus tubigensis-genombiblioteket med hensyn til xln A-gen.

For screening med hensyn til xln A-genet i et Aspergillus tubigensis-genombibliotek, ble 3 x 10 pfu pr. plate utplatet i NZYCM-toppagarose inneholdende 0,7% agarose (NZYCM-medium pluss 7 g agarose) på fire NZYCM-plater med diameter 85 mm (1,2% agar), som beskrevet av Maniatis et al. (1982, s. 64). E. coli LE392 ble anvendt som utplatingsbakterier.

Etter inkubering av platene over natten ved 37°C, ble det laget to paralleller av hver plate på nitrocellulosefiltere (Schleicher og Schiill BA85) som beskrevet av Maniatis et al.

(1982, s. 320-321).

Etter oppvarming av filtrene i 2 timer ved 80°C, ble de fuktet og vasket i 60 minutter ved romtemperatur i 3 x SCC (fortynnet fra 20 x SSC-forrådsløsning (pr. 1000 ml): 175,3 g NaCl; 107,1 g natriumcitrat.5,5 H20; pH 7,0). Filtrene ble for-hybridis<er>t ved 65oc.tQ timer ± en forhybridiseringsbuf-fer som inneholdt: 6 x SSC (fortynnet fra 20 x SSC-forrådsløs-ningen (se ovenfor)), 0,5% SDS, 10 x Denhardts løsning (pr. 5000 ml: 10 g Ficoll-400; 10 g polyvinylpyrrolidon; 10 g bovint serumalbumin (Pentax Fraction V) ) og 100/xg/ml varmedenaturert sildespermie-DNA (Boehringer Mannheim). Etter 2 timers for-hybridisering, ble for-hybridiseringsbufferen erstattet med hybridiseringsbuffer som var identisk med for-hybridiseringsbufferen, bortsett fra at denne buffer ikke

32

inneholdt sildespermie-DNA, men inneholdt P-merket oligonukleotidblanding AB800, fremstilt som beskrevet i eksempel 3.1. Filtrene ble hybridisert i 18 timer ved en sluttempera-tur på 38°C, oppnådd ved langsom, regulert avkjøling fra begynnelsestemperaturen på 65°C.

Etter hybridisering ble filtrene først vasket i 2 x SSC, hvoretter filtrene ble vasket i for-varmet hybridiseringsbuffer ved 38°C i det samme tidsrom. Til slutt ble filtrene vasket i 30 minutter ved 38°C i 6 x SSC, 0,05% natriumpyrofosfat. De lufttørkede filtere ble festet på et ark Whatman 3MM-papir, nøkkelmerker ble laget med radioaktiv farge, og Whatman-papiret og filtrene ble dekket med Såran Wrap". Hybridiserende plakk ble identifisert ved eksponering av røntgenfilm av typen Kodak XAR i 72 timer ved -70°C under anvendelse av en forsterkningsskj erm.

Fire av oligonukleotidblandings-hybridiseringsplakkene, som viste seg som duplikater på replika-filtrene, ble identifisert og betegnet lambdax-^nl - lambdax^n4. Hvert positivt plakk ble fjernet fra platen under anvendelse av en pasteur-pipette, og fagene ble eluert fra agarpluggen i 1 ml SM-buffer inneholdende 20/xl kloroform, som beskrevet av Maniatis et al.

(1982, s. 64). De oppnådde fager ble renset ved at fremgangsmåten beskrevet ovenfor, ble gjentatt under anvendelse av

filter-replika fra plater som inneholdt 50-100 plakk av de isolerte fager.

Etter rensing ble fagene formert ved utplating av 5 x 10"^ fager på NZYCM-medium. Etter inkubering over natten ved 37°C, ble det oppnådd sammenflytende plater, hvorfra fagene ble eluert ved tilsetting av 5 ml SM-buffer og oppbevaring av platen i 2 timer ved 4°C med rysting med mellomrom. Etter fjerning av supernatanten, ble bakteriene fjernet fra løsnin-gen ved sentrifugering ved 4 000 x g i 10 minutter ved 4°C. Kloroform (0,3%) ble tilsatt til supernatanten, og antallet pfu ble bestemt. Disse fag-forråd inneholdt ca. 101 pfu/ml.

Eksempel 3. 3

Isolering av DNA fra bakteriofag lambda.

Hver av de isolerte fager lambdax^nl- lambdax^n4ble formert som beskrevet i eksempel 3.2 under anvendelse av fem plater for hver av fagene. Fagene ble utfelt fra den således oppnådde supernatant (25 ml) ved tilsetting av et likt volum av en løsning som inneholdt 20% PEG-6000 (på vekt/volum-basis) og 2 M NaCl, fulgt av grundig blanding og inkubering på is i 60 minutter. De utfelte fager ble oppsamlet ved sentrifugering ved 14 000 x g ved 4°C i 20 minutter. Supernatanten ble fjernet ved avsuging, mens de siste spor av væske ble fjernet ved anvendelse av et papirhåndkle. Fagene ble omhyggelig gjenoppslemmet i 4 ml SM-buffer og ekstrahert én gang med kloroform.

Før ekstrahering av DNA fra fag-partiklene, ble DNA og RNA som stammet fra de lyserte bakterier, fjernet ved inkubering av fag-suspensjonen med DNase I og RNase A (begge med 100/xg/ml) i 30 minutter ved 37°C. Fag-DNA ble deretter frigjort fra fagene ved tilsetting av SDS og EDTA til en sluttkonsentrasjon på henholdsvis 0,1% og 20 mM, fulgt av inkubering ved 65°C i 10 minutter. Protein ble fjernet fra løsningen ved ekstraksjon to ganger med et likt volum fenol/kloroform/iso-amylalkohol (25:24:1). Etter atskillelse av fasene ved sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge (14 000 x g, 10 min.), ble den vandige fase ekstrahert én gang med et likt volum kloroform/isoamylalkohol (24:1). Fasene ble atskilt ved sentrifugering (Eppendorf-sentrifuge, 14 000 x g, 10 minutter) , hvoretter DNA ble utfelt fra den vandige fase ved tilsetting av 0,1 volumdel 5 M natriumperklorat og 0,1 volumdel isopropanol, og inkubering på is i 30 minutter. DNA ble utvunnet ved sentrifugering i 10 minutter ved 4°C (14 000 x

g). Supernatanten ble fjernet ved oppsuging, hvoretter DNA ble gjenoppslemmet i 400/xl TE-buffer. DNA ble enda en gang

utfelt med etanol. DNA ble oppsamlet ved sentrifugering i 10 minutter ved 4°C (14 000 x g). Supernatanten ble fjernet ved avsuging, den gjenværende celleklump ble tørket i kort tid under vakuum, hvoretter DNA ble gjenoppslemmet i 125/xl TE-buffer som inneholdt 0,1/xg/ml RNase A. Rensningsprosessen resulterte i isolering av ca. 40-50/xg DNA fra hver fag.

Eksempel 3. 4

Restriksjonsanalyse av xln A-holdige fager.

Den isolerte DNA av fagene lambdax^nl- lambdax^n4 ble analysert ved Southern-analyse under anvendelse av følgende restriksjonsenzymer: BamHI, Bglll, EcoRI, Hindlll, Kpnl, Sali, Sstl, Xbal og Xhol. DNA ble nedbrutt i 3 timer ved 37°C, med to paralleller, i en reaksjonsblanding som besto av følgende løsninger: 3/xl DNA-løsning; 1/xl 0,5 M spermidin; 5/xl av den hensiktsmessige 10 x React-buffer (BRL); 20 U Restriksjonsenzym (BRL) og sterilt destillert vann, hvilket ga et sluttvolum på 50/xl. Etter nedbryting, ble DNA utfelt ved tilsetting av 0,1 volumdel 3 M NaAc og 2 volumdeler etanol. DNA ble oppsamlet ved sentrifugering i 10 minutter ved romtemperatur (14 000 x g). Supernatanten ble fjernet ved avsuging. Den gjenværende klump ble tørket i kort tid under vakuum og gjenoppslemmet i sterilt destillert vann. Etter tilsetting av 4/xl DNA-påsettingsbuffer (0,25 vekt/volum% bromfenolblått; 0,25 vekt/volum% xylen-cyanol; 15 vekt/volum% Ficoll type 400 i H20), ble prøvene inkubert i 10 minutter ved 65°C og hurtig avkjølt på is. Prøvene ble så påsatt på en 0,6% agarose-gel i 1 X TAE-buffer. DNA-fragmentene ble skilt ved elektroforese ved 25 V i 15-18 timer.

Etter elektroforese ble DNA denaturert og overført til en nitrocellulosemembran som beskrevet av Maniatis et al. (1982, s. 383-386), fulgt av etterfølgende for-hybridisering og hybridisering under anvendelse av de merkede oligonukleotidblandinger AB800 og AB1255, som beskrevet i eksempel 3.1, og hybridiseringsbetingelser som beskrevet i eksempel 3.2. Hybridiseringsmønsteret for hver oligonukleotidblanding ble oppnådd ved eksponering av røntgenfilm av typen Kodak XAR-5 i 18 timer ved -70°C under anvendelse av en forsterkningsskjerm.

Ut fra resultatene trakk man den konklusjon at DNA fra alle de fire isolerte kloner hybridiserte med oligonukleotidblandingen oppnådd ut fra den N-terminale aminosyresekvens (blanding AB800) så vel som med oligonukleotidblandingen som stammet fra aminosyresekvensen oppnådd fra peptidet isolert etter S. aureus V8-nedbryting (AB1255). I alle de fire kloner ble det funnet fragmenter som stammet fra det samme genom-område.

Restriksjonsfragment-mønstrene og hybridiseringsmønstrene ble anvendt til konstruksjon av et passende restriksjonskart over genom-området hvor xln A-genet befinner seg (fig. 5).

Eksempel 3. 5

Subkloning av xln A-genet.

Sali-fragmentet på 6,9 kb ble isolert fra fag lambdax^n3 som beskrevet i eksempel 2.2. Dette fragment ble ligert i vektoren pUC9 nedbrutt med Sali og defosforylert med alkalisk fosfatase fremstilt som følger: 1/il (1/ig//il) pUC9 ble blandet med 2/il 10 x React 10 (BRL), 1/il (1 U(/il) Sali og 16/il sterilt destillert vann. DNA ble nedbrutt i 1 time ved 37°C, hvoretter 0,5/il alkalisk fosfatase (1 U//xl) (Pharmacia) ble tilsatt, fulgt av ytterligere inkubering ved 37°C i ytterligere 3 0 minutter. Den lineariserte vektor ble isolert fra en 0,6% agarose-gel som beskrevet i eksempel 2.2.

Sali-fragmentet på 6,9 kb ble ligert i den Sall-nedbrutte, defosforylerte pUC-vektor ved følgende fremgangsmåte: 100 ng pUC-fragment ble blandet med 100 ng 6,9 kb Sall-fragment og 4/il 5 x ligeringsbuf f er (500 mM Tris-HCl, pH 7,6; 100 mM MgCl2; 10 mM ATP; 10 mM ditiotreitol; 25% PEG-6000) , og 1/il (1,2 U//il) DNA-ligase (BRL) ble tilsatt til denne blanding, hvilket resulterte i et sluttvolum på 20 fil. Det resulterende plasmid ble betegnet pIMlOO. Etter inkubering i 16 timer ved 14°C, ble blandingen fortynnet til 100/xl med sterilt vann. 10 fil av den fortynnede blanding ble anvendt til transformering av E. coli JM101-(Yanisch-Perron et al., 1985)-kompetente celler, tillaget ved CMI-, CM2-metoden som beskrevet i Pharma-cias manual for M13-klonings-/sekvensbestemmelsessystem. E. coli JM101 inneholdende plasmid pIMlOO ble deponert hos Cen-tral Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nederland, 19. juli 1990, og ble gitt betegnelsen CBS 322.90.

Et utvalg av seks av de resulterende kolonier ble dyrket over natten i LB-medium (pr. 1000 ml: 10 g tryptikase-pepton (BBL); 5 g gjærekstrakt (BBL); 10 g NaCl; 0,5 mM Tris-HCl; pH 7,5) inneholdende 100/xg/ml ampicillin.

Plasmid-DNA ble isolert fra kulturene ved alkalisk lyse-metoden som beskrevet av Maniatis et al. (1982, s. 368-369). Denne plasmid-DNA ble anvendt i restriksjonsanalyse, som beskrevet i eksempel 3.4, for utvelging av en klon som omfat-tet det ønskede plasmid. Plasmid-DNA ble isolert i stor målestokk fra 500 ml kulturer av E. coli JM101 inneholdende plasmidet pIMlOO dyrket i LB-medium inneholdende 100/xg/ml ampicillin (Maniatis et al., 1982, s. 86). Plasmidet ble renset ved CsCl-sentrifugering, fenolisert, etanolutfelt og oppløst i 400 fil TE. Utbyttet var ca. 500 fig.

Plasmidet pIMlOO ble analysert ytterligere ved hjelp av restriksjonsenzymer, hvilket resulterte i restriksjonskartet vist på fig. 7. Orienteringen av genet, som vist, ble bestemt ved hybridiseringsforsøk under betingelser beskrevet i eksempel 3.2 under anvendelse av oligonukleotidblandingene AB800 og AB1255 som prober.

EKSEMPEL 4

Karakterisering av Aspergillus tubigensis xln A-genet.

Eksempel 4. 1

Sekvensbestemmelse av A. tubigensis xln A-genet

Sekvensen av Aspergillus tubigensis xln A-genet, som omfatter dets promotor/reguleringsområde, strukturgenet og termineringsområdet, ble bestemt ved subkloning av fragmenter fra pIMlOO i M13mpl8/mpl9, i kombinasjon med anvendelsen av spesifikke oligonukleotider som primere i sekvenseringsreak-sjonene.

For nukleotidsekvensanalyse ble restriksjonsfragmenter isolert som beskrevet i eksempel 2.2, og ble så klonet i bakteriofag M13 mpl8/l9 RF DNA-vektorer (Messing 1983; Norrander et al. 1983), nedbrutt med de hensiktsmessige restriksjonsenzymer. Nukleotidsekvensene ble betemt ved dideoksy-nukleotid-kjedeavslutningsfremgangsmåten (Sanger et al., 1977) under anvendelse av Pharmacia T7-DNA-polymerase-sekvenserings-settet. Den anvendte strategi for sekvensering av xln A-genet er vist på fig. 6. Data-analyse av de resulterende data ble utført under anvendelse av PC/GENE-programmet (Intelli-genetics, Inc., Madison WI). Den bestemte sekvens er vist på fig. 8.

Eksempel 4. 2

A. tubigensis xln A-genet

Den oppnådde sekvens omfatter 2054 bp, 949 bp i 5'-ikkekodingsområdet og 420 bp i 3'-ikkekodingsområdet. I 5'-opp-strømsområdet ble en tenkt TATA-boks (TATAAAT) funnet fra stilling 848 til stilling 854, foran translasjonsstartings-stedet (stilling 950). En triplikat-repeterende sekvens (5'GTCCATTTAGCCA3') ble funnet i området 190-350 bp fra trans-lasjonsstartingsstedet (stillinger 618-632, 636-650, 656-670).

Strukturdelen av xln A-genet er 681 bp lang og er avbrutt av et enkelt tenkt intron 48 bp langt. Polypeptidet som

stammer fra sekvensen, har en lengde på 211 AA (aminosyrer). En 17 AA lang hydrofob signalsekvens finnes i den N-terminale ende av dette polypeptid, som følges av et propeptid som er 12 rester langt. Det fullstendige protein har en størrelse på 184 AA med en forutsett molekylvekt på 19 kDa og har et teore-tisk IEP på 3,6.

EKSEMPEL 5

Ekspresjon av xln A-genet i en Aspergillus niger N593.

Eksempel 5. 1

Innføring av xln A-genet i Aspergillus niger N593 ved kotransformasj on.

Plasmidet pIMlOO, oppnådd i eksempel 3.5, ble innført i Aspergillus niger ved ko-transformasjon av Aspergillus niger N593 (pyr-mutant av A. niger N402; Goosen et al., 1987) ved anvendelse av Aspergillus niger pyr A-genet som selektiv markør på plasmidet pGW635 (Goosen et al., 1989) og plasmidet pIMlOO som det ko-transformerende plasmid.

Protoplaster ble fremstilt ut fra mycelium ved dyrking av Aspergillus niger N593 på minimal-medium supplert med 0,5% gjærekstrakt, 0,2% kasaminosyrer, 50 mM glukose og 10 mM uridin i 20 timer ved 30°C. Fremstillingen av protoplaster av Aspergillus niger N593 og transformasjonsprosessen ble utført som beskrevet av Goosen et al. (1987). De resulterende PYR<+->transformanter ble så analysert med hensyn til ekspresjon av xln A-genet.

Eksempel 5. 2

Screening av transformanter med hensyn til ekspresjon av xln A-genet.

Transformantene oppnådd i Eksempel 5.1, ble analysert med hensyn til dannelsen av xln A-genproduktet, XYL A-proteinet. Tyve transformanter ble utvalgt og dyrket i 72 timer på medium som inneholdt (pr. liter): 30 g havrespelt-xylan (Sigma), 7,5 g NH4N03, 0,5 g KC1, 0,5 g MgS04, 15 g KH2P04og 0,5 g gjærekstrakt (pH 6,0). Etter dyrking, ble myceliet fjernet ved filtrering, og dyrkningsfiltratet ble analysert ved hjelp av SDS-polyakrylamidgel-elektroforese under anvendelse av en gel som inneholdt 12% akrylamid. XYL A-proteinet ble påvist på nitrocellulose etter elektroblotting og inkubering med poly-klonale antistoffer dannet mot XYL A-proteinet, som ble renset som beskrevet i eksempel 1.1. Det bundne antistoff ble påvist etter inkubering med geite-antikanin-antistoff konjugert til alkalisk fosfatase, ifølge Biorads instruksjonshåndbok.

Seksten av de tyve analyserte transformanter dannet XYL A-proteinet som påvist ved denne fremgangsmåte. Proteinet ble utsondret i mediet. Blant de analyserte transformanter ble transformant TrX9 valgt ved I.E.F.-analyse under anvendelse av en pH-gradient på 3-7 og etterfølgende farging av en fortyn-ningsserie av transformantene TrX2 og TrX9, under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet av Biely et al. (1985 a og b).

Fig. 9 er et zymogram som viser XYL A-proteinet uttrykt ved transformantene TrX2 og TrX9.

SDS-PAGE-analyse ble utført under anvendelse av 4 fil supernatantprøver av individuelle transformanter og A. niger-kontrollstammen, først justert til pH 7 med 3 N NaOH og deretter brakt til et sluttvolum på 20 fil med 1 x SB-buffer, som beskrevet av Laemmli (1970) . Etter oppvarming i 5 minutter ved 100°C, ble totalblandingene underkastet en SDS/12,5% polyakrylamidgelgel-ektroforese og deretter farget med comas-sie-brilliantblått. Som vist på fig. 10B, kunne det påvises et proteinbånd med en tilsynelatende molekylvekt på 25 kDa (sammenliknbar med renset xylanase (felt 2), i transformantene TrX2 (felt 4) og TrX9 (felt 5), som ikke finnes i supernatanten for kontrollstammen (felt 3). Molekylvektmarkører (felt 1) representerer 92, 68, 46 og 30 kDa.

Eksempel 5. 3

Utelukkelsesanalyse for xln A-promotorområdet

Reguleringselementer i A. tubigensis xln A-promotoren ble undersøkt ved promotorutelukkelsesanalyse. En serie på fem konstruksjoner av xln A-genet ble laget og klonet i kombinasjon med A. niger pyr A-genet. pyr A-genet gjør mulig utvelgelse i transformasjonsforsøk som beskrevet i eksempel 5.1. Dessuten gjør pyr A-genet mulig utvelgelse av transformanter med et enkelt kopi av plasmidet innført på pyr A-stedet.

Sall/Xbal-fragmentet på 4,5 kb (fig. 7) ble isolert og ligert i vektoren pEMBL18 som beskrevet i eksempel 3.5, hvilket resulterte i det mellomliggende plasmid pIMlOl. I tillegg til plasmidet pIMlOl, ble følgende fragmenter inneholdende xln A-genet ligert i pEMBL18: 3,5 kb HindiII/Xbal-fragmentet (som resulterte i pIM102), 2,0 kb Pstl-fragmentet (som resulterte i pIM103), 1,98 kb Xhol/Xbal-fragmentet (som resulterte i pIM104) og 1,97 kb Nsil/Xbal-fragmentet (som resulterte i pIM105). De oppnådde plasmider ble nedbrutt under anvendelse av Xbal og ligert til et 3,8 kb Xbal-fragment omfattende det funksjonelle A. niger pyr A-gen, hvilket resulterte i plasmidene pIM112, pIM113, pIM114, pIM116 og pIM117 (fig. 21).

Plasmidene pIM112, pIM113, pIM114, pIM116 og pIM117 ble anvendt til transformering av A. niger N593 som beskrevet i eksempel 5.1. De resulterende PYR<+->transformanter av hvert plasmid ble dyrket, og DNA ble isolert som beskrevet i eksempel 2.1. Den resulterende DNA ble nedbrutt med Hpal, og enkeltkopi-integreringer ble utvalgt ved hjelp av Southern-analyse under anvendelse av et<32>P-merket 3,8 kb Xbal-fragment (merket som beskrevet i eksempel 7.2), som inneholdt pyr A-genet som probe. Transformanter med et hybridiserende Hpal-fragment (hvis størrelse ble øket ved en enhets-plasmidlengde sammenliknet med størrelsen av Hpal-fragmentet i A. niger N593) ble utvalgt som enkeltkopi-integreringer ved pyr A-stedet.

Enkeltkopi-transformanter av hvert av plasmidene, valgt som beskrevet ovenfor, ble dyrket i 36 timer som beskrevet i eksempel 5.2. Ekspresjonen av xln A-genet ble analysert ved IEF-analyse som beskrevet i eksempel 5.2 og ved Northern-analyse etter isolering av total-RNA som beskrevet av de

32

Graaff et al. (1988) under anvendelse av det P-merkede 900 bp XhoI/BamHI-fragment av xln A-genet som probe.

I transformanter som stammer fra plasmidene pIM112, pIM113 og pIM114, ble ekspresjon av xln A-genet funnet ved påvisning ved IEF- og Northern-analyse. Transformantene som stammet fra plasmidene pIM116 og pIM117, uttrykte imidlertid ikke xln A-genet, siden verken XYL A-protein eller hybridise rende RNA ble funnet. Ut fra disse resultater trakk man den konklusjon at 158 bp Pstl/Xhol-fragmentet, den vesentlige forskjell mellom pIM114 og pIM116, inneholder et element som er nødvendig for innføring av xln A-genet i A. niger, som ble dyrket på medium under anvendelse av xylan som karbonkilde.

EKSEMPEL 6

Ekspresjon i A. niger av xln A-genet koplet til promotor-og/eller signalsekvensen i A. niger amyloglukosidase-(AG)-genet.

Eksempel 6. 1

Xylanase-ekspresjonsvektorer

For oppnåelse av ekspresjon av xylanase i stammen A. niger CBS 513.88, ble det frembrakt ytterligere ekspresjonskassetter (pXYL3 og pXYL3AG) hvor xln A-genet er under kontroll av A. niger amyloglukosidase-(AG)-promotoren i kombinasjon med forskjellige signalsekvenser.

I ekspresjonskassett pXYL3 ble AG-promotorsekvensen koplet til den xln A-kodende sekvens innbefattende xylanase-lederen.

I ekspresjonskassett pXYL3AG ble AG-promotorsekvensen så vel som ledersekvensen på 18 aminosyrer (aa) i AG-genet koplet til xln A-genfragmentet som bare koder for det fullstendige protein.

Eksempel 6. 2

Konstruksjon av mellomliggende plasmider.

a) Subkloning av xlnA- stedet.

For redusering av lengden av genom-xln A-stedet, ble 2 kb

Pstl-fragmentet av pIMlOO (beskrevet i eksempel 3.5) omfattende hele xln A-genet innbefattende 5'- og 3'-flankeringssekven-sene, subklonet i Pstl-setet i pTZ18R (Promega). Plasmidet

som inneholdt xln A-genet i riktig orientering (vist på fig.

12), ble betegnet pXYLl.

b) Basis- seleksionsvektor pAmdSH

EcoRI/Kpnl DNA-fragmentet av plasmid pGW325 (K. Wernars

(1986)) inneholdende det homologe Aspergillus nidulans- a. mdS-gen ble innført i EcoRI/Kpnl-setene i pTZ18R (Promega) for å tjene som seleksjonsmarkør for transformasjon av Aspergillus. I den resulterende vektor (pAmdS) ble et ytterligere HindiII-restriksjonssete innført ved innføring av det syntetiske fragment:

i EcoRI-setet. Det således oppnådde plasmid ble betegnet pAmdSH. I denne basisvektor vil AG/xylanase-fusjons-DNA-fragmentet bli innført. c) Isolering av genom- AG- stedet: konstruksjon av pAB6- l.

Plasmid pAB6-l inneholder hele AG-stedet fra A. niger,

isolert fra et A. niger-plasmidbibliotek inneholdende 13-15 kb HindIII-fragmentene, innført i pUC19.

For denne isolering ble følgende AG-spesifikke oligonukleotider anvendt:

begge basert på nukleotidsekvensen publisert for A. niger (Boel et al. (1984a); Boel et al. (1984b)). Oligonukleotid-probene stammet fra sekvensen som omga intron 2: oligo AG-1 befinner seg nedstrøms for dette intron og har en polaritet identisk med AGmRNA; oligo AG-2 finnes oppstrøms for intron 2 og velges antiparallelt med AGmRNA. Plasmid pAB6-l inneholder hele AG-stedet på et 14,5 kb Hindlll-fragment (se fig. 13).

d) De mellomliggende plasmider pXYLAG og pXYL2AG.

Kopling av AG-promotoren og AG-ledersekvensen på 18 aa

til xln A-genet som koder for det fullstendige protein (som mangler serinet fra stilling 1), ble utført ved polymerase-kjedereaksjons-(PCR)-metoden.

I PCR-reaksjonene ble det anvendt to templater: pXYLl, inneholdende xln A-genet, og pAB6-l, inneholdende hele AG-genomstedet.

Som primere for PCR-DNA-forøkningene ble det utformet fire syntetiske oligonukleotider med følgende sekvens:

(en spesifikk xln A-sekvens som befinner seg på BamHI-stedet i stilling 1701 som vist på fig. 8).

PCR ble utført som beskrevet av Saiki et al. (1988) og ifølge leverandøren av TAQ-polymerase (Cetus). Tjuefem forøk-ningssykluser (hver: 2 minutter ved 55°C, 3 minutter ved 72°C, 1 minutt ved 94°C) ble utført i et DNA-forøkningsapparat (Perkin-Elmer/Cetus).

For kopling av AG-sekvensene til xln A-kodingssekvensen, ble det utført to atskilte polymerasekjedereaksjoner: den første reaksjon med pAB6-l som templat og oligonukleotider AB 1771 og AB 1985 som primere for forøkning av et 300 bp DNA-fragment som inneholdt 3'-stykket av AG-promotoren og 18 aa AG-ledersekvensen, flankert ved 3'-grensen av de første 18 nukleotider i kodingssekvensen av xln A, og den annen reaksjon med pXYLl som templat og oligonukleotidene AB 1986 og 1984 som primere for forøkning av xln A DNA-sekvensene som koder for det fullstendige xylanaseprotein, flankert ved 5'-grensen av de siste 18 nukleotider i AG-signalpeptidet. En skjematisk oversikt over disse forøkninger er vist på fig. 14.

De to dannede DNA-fragmenter ble renset ved agarosegel-elektroforese og entanolutfelling og deretter anvendt som templater i den tredje PCR med oligonukleotider AB 1771 og 1984 som primere under dannelse av AG-xylanasefusjonen. Det således oppnådde DNA-fragment ble nedbrutt med EcoRI og BamHI og subklonet i de hensiktsmessige steder i pTZ18R. Den resulterende kopling ble sekvensbestemt og betegnet pXYLAG (se fig. 14 og 15).

Det gjenværende (3,5 kb) oppstrøms område i AG-promotoren ble oppnådd ved nedbryting av pAB6-l med Kpnl og delvis med EcoRI, og renset ved agarosegel-elektroforese og etanolutfelt. Dette 3,5 kb AG-DNA-promotorfragment ble først ligert til EcoRI/BamHI-AG/xylanase-koplingsfragmentet av pXYLAG og deretter molekylklonet i E. coli etter ligering i vektoren pXYLl, som ble nedbrutt med Kpnl/BamHI og hvorfra Kpnl/BamHI-fragmentet, som inneholdt 5'- og kodings-xln A-sekvensene, ble fjernet. Det således oppnådde plasmid pXYL2AG er vist på fig. 15.

e) De mellomliggende plasmider pXYL og pXYL2.

Kopling av AG-promotorsekvensen til xln A-genet innbefattende xylanase-lederen ble utført som beskrevet i del d) ovenfor. Som primere ble det utformet to ytterligere oligonukleotider med følgende sekvens:

For kopling av AG-promotorsekvensen til xylanase-genet (innbefattende xylanase-signalsekvensen), ble det utført to atskilte polymerasekjedereaksjoner: den første reaksjon med pAB6-l som templat og oligonukleotider AB 1771 og AB 1982 som primere under forøkning av et 282 bp-fragment inneholdende 3'-delen av AG-promotoren flankert ved 3'-grensen av 18 nukleotider av xylanase-lederen og den annen reaksjon med pXYLl som templat og oligonukleotidene AB 1983 og AB 1984 som primere under forøkning av et DNA-fragment inneholdende hele xylanase-genet (innbefattende xylanase-lederen) og flankert ved 5'-grensen av 18 nukleotider av AG-promotoren.

De to dannede DNA-fragmenter ble renset ved agarosegel-elektrof orese og etanolutfelling og deretter anvendt som templater i en tredje PCR med oligonukleotidene AB 1771 og 1984 som primere under dannelse av AG-xylanasekoplingen. Det således oppnådde DNA-fragment ble nedbrutt med EcoRI og BamHI og subklonet i de hensiktsmessige steder i pTZ18R. Den resulterende kopling ble sekvensbestemt og betegnet pXYL (se fig. 14 og 16) .

Det gjenværende (3,5 kb) oppstrøms område i AG-promotoren ble innført i pXYLl som beskrevet i del d) ovenfor. Det således oppnådde plasmid ble betegnet pXYL2.

Eksempel 6. 3

Konstruksjon av xylanase-ekspresjonskassettene pXYL3AG og pXYL3.

Begge ekspresjonskassetter ble dannet ved innføring av AG/xylanase-koplingene av pXYL2AG eller pXYL2 i basis-A. niger-vektoren pAmdSH. For denne endelige konstruksjon ble pAmdSH nedbrutt med Kpnl og HindiII (delvis) og pXYL2AG og pXYL2 med Hindlll og delvis med Kpnl. Alle fragmentene ble isolert og renset ved gel-elektroforese og etanolutfelling. Til 6,8 kb Kpnl/HindiII-DNA-fragmentet av pAmdSH ble enten 5,3 kb Kpnl/HindiII-DNA-fragmentet av pXYL2AG eller pXYL2 tilsatt, ligert og deretter molekylklonet ved overføring av begge ligeringsblandinger til E. coli. De således oppnådde ekspresjonskassetter ble betegnet pXYL3AG (inneholdende AG-lederen) og pXYL3 (inneholdende xylanase-lederen), som vist på henholdsvis fig. 17 og 18.

Eksempel 6. 4

Ekspresjon av xln A-genet under kontroll av AG-promotoren i A. niger.

a) Transformasjon av A. niger (CBS 513.88).

Før overføring av begge ekspresjonskassettene pXYL3AG og

pXYL3 til A. niger, ble E. coli-sekvensene fjernet ved HindiII-nedbryting, gel-elektroforese og etanolutfelling. Transformasjon av stammen A. niger (CBS 513.88, deponert 10.

oktober 1988) ble utført med 10 fig linearisert DNA-fragment ved fremgangsmåter som beskrevet av J. Tilburn et al. (1983) og Kelly og Hynes (1985) med følgende modifiseringer: Mycelium ble dyrket på Aspergillus-minimalmedium (D. Cove

(1966)) supplert med 10 mM arginin og 10 mM prolin, i 16

timer ved 3 0°C i en roterende rysteanordning ved 3 00 rpm (omdreininger pr. minutt).

Bare Novozym 234, og ingen helikase, ble anvendt for

dannelse av protoplaster.

Etter 90 minutters protoplastdannelse ble 1 volumdel STC-buffer (1,2 M sorbitol, 10 mM Tric-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2) tilsatt til protoplastsuspensjonen og sentrifugert med 2500 rpm ved 4°C i 10 minutter i en rotor med svin-gende beholder. Protoplastene ble vasket og gjenoppslemmet i STC-buffer med en konsentrasjon på 10 celler pr.

ml.

Plasmid-DNA ble tilsatt i et volum på 10 fil i TE-buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA) til 100 fil av proto-plastsuspensj onen.

Etter inkubering av DNA-protoplastsuspensjonen ved 0°C i 25 minutter, ble 200 fil PEG-løsning tilsatt dråpevis (25%

PEG 4000 (Merck), 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2). Deretter ble 1 ml PEG-løsning (60% PEG 4000 i 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2) tilsatt langsomt med gjentatt blanding av rørene. Etter inkubering ved romtemperatur, ble suspensjonene fortynnet med STC-buffer, blandet ved vending og sentrifugert med 2000 rpm ved 4°C i 10 minutter. Protoplastene ble gjenoppslemmet forsiktig i 200 fil STC-buffer og utplatet på Aspergillus-minimalmedium med 10 mM acetamid som eneste nitrogenkilde, 15 mM CsCl, 1 M sakkarose, stivnet med 0,75% bakteriologisk agar nr. 1 (Oxoid). Dyrkingen ble utført ved 33°C i 6-10 dager.

b) Vekst av transformanter i rystekolber.

Enkelt-A. niger-transformanter fra hver ekspresjonskassett ble isolert, og sporene ble utstrøket på selektive acetamid-agarplater. Sporer av hver transformant ble oppsamlet fra celler dyrket i 3 dager ved 37°C på 0,4% potet-dekstr-ose-agarplater (Oxoid, England). Xylanasedannelsen ble under-søkt i rystekolber under følgende vekstbetingelser: Ca. 1.10 g sporer ble inokulert i 100 ml forkultur-medium inneholdende (pr. liter): 1 g KH2<P>04, 30 g maltose, 5 g gjærekstrakt, 10 g kasein-hydrolysat, 0,5 g MgS04-7 H20 og 3 g Tween 80. pH ble justert til 5,5.

Etter dyrking over natten ved 34°C i et roterende ryste-apparat, ble 1 ml av den voksende kultur inokulert i en 100 ml hovedkultur som inneholdt (pr. liter): 2 g KH2P04#70 g malto-dekstrin (Maldex MD03, Amylum), 12,5 g gjærekstrakt, 25 g kaseinhydrolysat, 2 g K2S04, 0,5 g MgS04.7 H20, 0,03 g ZnCl2#0,02 g CaCl2, 0,05 g MnS04.4 H20 og FeS04. pH ble justert til 5,6. Myceliet ble dyrket i minst 140 timer.

c) Analyser av transformanter.

Xylanase-analyser av individuelle transformanter ble

utført ved måling av xylanaseaktivitet; ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforese farget med Coomassie brilliantblått og ved et zymogram farget med xylan-Remazol brilliantblått R.

Xylanaseaktiviteter ble bestemt som beskrevet av Leathers et al. (1984), med en del modifikasjoner. Substratkonsentra-sjonen ble øket fra 1 til 5% havre-xylan, oppløst i 100 mM NaAc ved pH 3,5 og oppvarmet til 100°C i 10 minutter. Dessuten ble enzymreaksjonene utført ved 39°C i stedet for 3 0°C.

Xylanasedannelsesnivåene ble målt i supernatanten fra 6 dagers rystekolbe-fermenteringer av flere, tilfeldig valgte transformanter fra hver ekspresjonskassett. Resultatene er vist i tabell 1.

SDS-PAGE-analyse ble utført som følger: etter 6 dagers dyrkning som beskrevet i del b) ovenfor, ble 4/il supernatant-prøver fra individuelle transformanter og fra Å. niger-kontrollstammen først justert til pH 7 med 3 N NaOH og deretter brakt til et sluttvolum på 20/il med 1 x SB-buffer, som beskrevet av Laemmli (1970). Etter oppvarming i 5 minutter ved 100°C, ble totalblandingene underkastet en SDS/12,5% polyakrylamidgel-elektroforese og deretter farget med Coomassie brilliantblått. Som vist på fig. 10 A, kunne det påvises et proteinbånd med en tilsynelatende molekylvekt på 25 kDa (sammenliknbar med renset xylanase (felt 1)) i transformanter 10 (felt 4), 29 (felt 5) og 1.1 (felt 6). Dette proteinbånd fantes ikke i supernatanten av kontrollstammen (felt 3) . Molekylvektmarkører (felt 2) representerer 94, 67, 43, 30, 20 og 14,5 kDa.

Zymogram-analyse ble utført som følger. De samme prøver som anvendt ovenfor, ble også påsatt to ganger på en naturlig 8-25% PAA-fasesystem-gel (BRL). Etter elektroforese ble gel A farget med Coomassie brilliantblått (se fig. 11A) og gel B med et Remazol brilliantblått-xylan-(Megazyme)-belegg ved pH 3,5, som beskrevet av Biely et al. (1985a) (se fig. 11B), for visualisering av xylanase-aktiviteten. Prøver tilført til denne RBB-xylan-belegg-gel inneholdt 5 ganger mindre protein sammenliknet med prøvene tilført til gelene vist på fig. 10 og 11A. Identifikasjonen av feltene på fig. 11 A og B er de samme som for fig. 10 A og B.

Disse analyser viser tydelig ekspresjon og sekresjon av aktiv endo-xylanase i A. niger CBS 513.88 transformert med en ekspresjonskassett hvor xln A-genet er under kontroll av A. niger-amyloglukosidasepromotoren. Ekspresjon og sekresjon ble også observert med forskjellige A. niger-signalsekvenser. Videre beholdt dog proteinet som manglet serinresten fra stilling 1, xylan-nedbrytende aktivitet.

EKSEMPEL 7

Screening med hensyn til gener beslektet med xln A-genet i Trichoderma reesei QM9414

Eksempel 7. 1

<32>P-merking av DNA-fragmenter

25 ng av et 900 bp XhoI/BamHI-fragment isolert fra plasmidet pIMlOO som beskrevet i eksempel 2.2, ble merket ved tilfeldig priming under anvendelse av oligonukletidmerkings-settet (Pharmacia) ifølge fabrikantens instruksjoner. For fjerning av det ikke-innlemmede a- 32P-dATP fra blandingen, ble

32

volumet øket til 100 iil med TE-buffer, hvoretter a- P-dATP ble fjernet ved fraksjonering på en kolonne av typen Sephadex G50. Fraksjoner som inneholdt den radioaktivt merkede DNA, ble denaturert ved inkubering i 3 minutter ved 100°C og holdt enkeltkjedet ved hurtig nedkjøling på is, før tilsetting til en hybridiseringsbuffer som inneholdt 6 x SCC; 5 x Denhardts løsning; 0,1% natriumpyrof osf at og 100/xg/ml varmedenaturert sildespermie-DNA.

Eksempel 7. 2

Genom-hybridisering av T. reesei QM9414-DNA.

DNA med høy molekylvekt, isolert fra T. reesei som beskrevet i eksempel 2.1, ble nedbrutt med BamHI, Bglll, EcoRI og Sali. De resulterende fragmenter ble skilt ved agarosegel-elektrof orese og overført til nitrocellulosemembran som beskrevet av Maniatis et al. (1982, s. 383-389). Nitrocellulo-semembranene ble for-hybridisert ved 57°C i 2 timer i hybridi-seringsbuf f er (som beskrevet i eksempel 7.1 ovenfor). Etter denne for-hybridiseringsprosess, ble det radioaktivt merkede fragment, beskrevet i eksempel 7.1, tilsatt til hybridise-ringsbuf f eren, og hybridiseringen ble fortsatt i 44 timer. Etter hybridisering, ble filtrene vasket i 90 minutter ved 57°C i 4 x SSC, 0,1% SDS, 0,1% natriumpyrofosfat, fulgt av en sluttvasking med anvendelse av 2 x SSC ved samme temperatur. Etter fastliming av membranene til Whatman 3MM-papir og passende merking med radiomerket farge, ble filtrene dekket med Såran Wrap' og autoradiografert i 72 timer ved -70°C under anvendelse av røntgenfilm av typen Kodak XAR-5 og Kodak X-Omatic-kassetter med vanlige forsterkningsskjermer.

De funne hybridiseringsfragmenter er oppsummert i tabell 2 .

Eksempel 7. 3

Screening av Trichoderma reesei-genombiblioteket med hensyn til xln A-beslektede gener

Hybridiseringsbetingelsene som ble valgt for screening av Trichoderma reesei-genombiblioteket med hensyn til xln A-beslektede gener under anvendelse av det 3 2P-merkede 900 bp XhoI/BamHI-fragment inneholdende xln A-genet som probe, som beskrevet i eksempler 6.1 og 6.2, var: for-hybridisering i 6 x SSC, 0,1% SDS, 0,05% natriumpyrofosfat og 100/xg/ml denaturert sildespermie-DNA ved 60°C i 3-5 timer, fulgt av hybridisering i 6 x SSC, 0,1% SDS, 0,05% natriumpyrofosf at og 100/xg/ml denaturert sildespermie-DNA ved 57°C i 44 timer, fulgt av to vaskinger i 5 x SSC, 0,1% SDS ved 60°C og to vaskinger i 3 x SSC ved 60°C. Etter overføring av filtrene til 3 MM papir og passende merking med radiomerket farge, ble filtrene dekket med Saran-omslag og eksponert i 72 timer for røntgenfilm av typen Kodak XAR-5 ved -70°C under anvendelse av Kodak X-Oma-tic-kassetter med vanlige forsterkningsskjermer. Under disse betingelser ble det funnet ca. 50 positive signaler.

Eksempel 7. 4

Analyse av fager inneholdende T. reesei xln A-beslektede sekvenser 18 av de hybridiserende bakteriofag-kloner ble renset som beskrevet i eksempel 3.2, og ni fager utvelges, og fra disse isoleres DNA som beskrevet i eksempel 3.3. Fagene ble analysert ved nedbryting av DNA med HincII og Hinfl. Basert på hybridiseringsmønstrene funnet etter Southern-analyse (ved anvendelse av det<32>P-merkede 900 bp XhoI/BamHI-fragment som probe, som beskrevet i eksempel 7.1) ble disse fager henført til to klasser: fem av de analyserte fager som klasse A (fager nr. 1, 3, 4, 20 og 22) og fire som klasse B (fager nr. 10, 16, X2og X^). Fra hver klasse ble det utvalgt én fag for ytterligere restriksjonsanalyse: fag nr. 1 fra klasse A og fag nr.

10 fra klasse B.

Fagene 1 og 10 DNA ble underkastet restriksjonsanalyse ved nedbryting med BamHI, Bglll, EcoRI, Bglll og kombinasjoner av disse, og ved enkeltnedbrytinger med Kpnl, Smal, Xhol, Xbal, Sstl, Hindlll og Pstl. Southern-analyse ved anvendelse av 900 bp Xhol/BamHI-fragmentet som proble ble deretter ut-ført. På basis av de oppnådde mønstre ble et ca. 6,5 kb Bglll/SalI-fragment fra klasse A fag nr. 1 og et ca. 7,5 kb BamHl/Bglll-fragment fra klasse B fag nr. 10 utvalgt for subkloning.

6,5 kb BlgII/SalI-fragmentet ble isolert og ligert som beskrevet i eksempel 3.5, i den BamHI/Sall-nedbrutte vektor pEMBL18, hvilket resulterte i plasmidet pIM03 0. E. coli JM109 inneholdende plasmid pIM03 0 ble deponert hos Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nederland, 11. juli 1991 og ble gitt betegnelsen CBS 420.91.

7,5 kb BamHI/Bglll-fragmentet ble isolert og ligert, nedbrutt med BamHI og innført i defosforylert vektor pUC9, hvilket resulterte i plasmidet pIM041. E. coli JM109 inneholdende plasmid pIM041 ble deponert hos Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nederland, 11. juli 1991, og fikk betegnelsen CBS 421.91.

Begge plasmider pIM03 0 og pIM041 ble underkastet ytterligere restriksjonsanalyse, hvilket ga restriksjonskartene vist på henholdsvis fig. 19 og 20.

EKSEMPEL 8

Anvendelse av XYL A-proteinet i dyreforbiandinger.

Effektiviteten av endoxylanasetilførsel til en diett rik på hvete-biprodukter, på næringsmiddel-fordøyeligheten og zooteknisk utførelse, er vist under anvendelse av følgende forsøksprotokoll.

Én dag gamle hunn-kyllinger ble oppbevart i batteribur med metalltråd-gulv og fåret på en kommersiell startdiett inntil start av forsøkstidsrommet. På dag 13 ble fuglene fordelt tilfeldig i like levende-vekt-behandlingsgrupper. Tre forskjellige forsøksdietter ble gitt til 18 grupper av fugler

med 8 fugler pr. gruppe. Diettene ble pelletert under meget milde betingelser, og kyllingene ble foret fritt i dagene 13-34 (etter utklekking).

Forinntak og vekst ble kontrollert ukentlig for hvert bur. Fordøyeligheten ble målt etter et 3 dagers ekskret-oppsamlingstidsrom. En halvkvantitativ oppsamling av ekskre-tet ble utført. Ved anvendelse av en markør (HCl-uløselig aske) ble individuelle fordøyelighetskoeffisienter for protein, fett, råfiber og nitrogenfritt ekstrakt beregnet. Den tilsynelatende metaboliserbare energi (AME) for hver diett ble beregnet ut fra følgende likning:

Basaldietten ble basert på hvetekli, maisstivelse og proteinrike dyre-biprodukter (tabell 3). Til denne diett ble endo-xylanase tilført i to forskjellige nivåer, 36 000 U/kg og 174 000 U/kg renset endo-xylanase (spesifikk aktivitet 300 000 U/g) .

De viktigste resultater er oppsummert i tabell 4 (ytel-sesdata) og tabell 5 (fordøyelighetsdata). Ytelsesdataene gjelder hele forsøkstidsrommet, dagene 13-34 (etter utklekking) , mens fordøyelighetstallene er de gjennomsnittlige verdier oppnådd ved analyser i ekskret oppsamlet i løpet av dagene 21-24 og dagene 28-31.

Dette forsøk viser effektiviteten av endoxylanase-tilsetting til forblandinger for broilere, som inneholder en stor andel hvetekli. Både kyllingenes ytelse og energiverdien av diettene ble positivt påvirket.

Når det gjelder ytelse-f6r-omdannelse, var effektiviteten det mest følsomme parameter som gjenspeilet virkningen av enzymtilsetting. Det var en tendens mot et lett redusert fårinntak i de enzymtilførte grupper knyttet til en liknende eller bedre vekst. Følgelig ble for:vektøknings-forholdet vesentlig redusert.

Forbedringen i ytelse kan forklares ved virkningene av enzymtilsetting på fordøyelighetskoeffisientene. Alle tall for næringsstoff-fordøyelighet ble positivt påvirket, skjønt økningen i fettfordøyeligheten var mest uttalt, hvilket førte til en 3,5% økning i energiverdien av de enzymtilførte dietter.

Ingen doserespons-forbindelse ble observert ved disse enzym-tilblandingsnivåer.

EKSEMPEL 9

Anvendelse av endo-xylanase ved brødlaging

"Pup"-brød ble bakt av 150 g deigstykker oppnådd ved blanding av 200 g hvetemel (100%), 106 ml vann (53%), 1,2 g tørrpulver-bakegjær (0,6%: Gist-brocades N.V., Delft, Nederland), 4 g NaCl (2%), 400 mg CaCl2"2 H20 (0,2%), 10 mg sopp-a-amylase P200(Gist-brocades, 2250 SKB/kg mel) og et variabelt antall enheter av endoxylanase-(xyl A)-aktivitet. Etter blanding i 6 minutter og 15 sekunder ved 52 r.p.m. (omdreininger pr. minutt) i en stavblander, ble deigen delt, hevet i 45 minutter ved 31°C, utstanset, hevet i ytterligere 25 minutter, formet og lagt i panne. Etter en sluttheving på 70 minutter ved 31°C, ble deigen stekt i 20 minutter i en ovn ved 250°C. Brødvolumet ble bestemt ved rapsfortrengningsmetoden. Resultatene er oppsummert i tabell 6 nedenfor.

Av disse resultater er det tydelig at en økende mengde av endoxylanase-aktivitet tilsatt til deigen fører til en økning i brødvolum og en forbedring av brødkvaliteten med hensyn til bryting, riving og smulestruktur.

Referanse-

Amons, R. (1987) FEBS Lett., 212, 68-72.

Biely, P., Mislovicova, D. and Toman, R. (1985a) Anal.

Biochem, 144, 142-146.

Biely, P., Markovic, O. and Mislovicova, D. (1985b) Anal.

Biochem, 144, 147-151.

Boel, E. et al. (1984a) EMBO J., 3, 1097-1102.

Boel, E. et al. (1984b) Mol. Cell. Biol., 4, 2306-

2315.

Carré, B. and Brillouet, J.M. (1986) J. Science and Food

Agric, 37, 341-351.

Chesson, A. (1987) Recent Advances in Animal Food Nutrition.

Haresign, W. and Cole, D.J.A., eds., Butterworth,

London, 71-89.

Cove, D. (1966) Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56.

Dekker, R.F.A. and Richards, G.M. (1977) Adv. Carb. Chem.

and Biochem., 32, 278-353.

Ehrlich, H.A., ed. (1989) PCR Technology: Principles and A<p>plications for DNA Amplification. Stockton Press,

- New York.

Goosen, T., Bloemheuvel, G., Gysler, C., de Bie, D.A., van den Broek, H.W.J, and Swart, K. (1987) Curr. Genet.,

11, 499-503.

Goosen, T., van Engelenburg, F., Debets, F., Swart, K., Bos,

K. and van den Broek, H.W.J. (1989) Mol. Gen. Genet.,

219, 282-288.

de Graaff, L.H., van den Broek, H.W.J, and Visser, J. (1988)

Curr. Genet., 13, 315-321.

Kelly, J. and Hynes, M. (1985) EMBO J. 4, 475-479. Kusters-van Someren, M.A., Samson, R.A. and Visser, J.

(1991) Curr. Genet., 19, 21.

Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685.

Leathers, T.D., Kurtzman, C.P., Detroy, R.W. (1984)

Biotechnol. Bioeng. Symp., 14, 225.

Maniatis T., E. F. Fritsch, J. Sambrook (1982) Molecular

Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor

Laboratory, New York.

Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem., 262, 10035-10038. McCleary, B.V. and Matheson, N.K. (1986) Adv. Carb. Chem.

and Biochem., 44, 147-276.

Messing, J. (1983) Methods in Enzymology, 101C, 20-78. Moonen, J.H.E., Scheepstra, A., Graveland, A. (1982)

Euphitica, 31, 677.

Murray, N. (1977) Mol. Gen. Genet., 150, 53-58.

Norrander, J., Kempe, T. and Messing, J. (1983) Gene, 26,

101-106.

Poutanen, K. and Puls, J. (1988) Appl. Microbiol.

Biotechnol., 28, 425.

Saiki, R.K. et al. (1988) Science, 239, 487-491.

Sanger, F., Nickelen, S. and Coulson, A.R. (1977) Proe.

Nati. Acad. Sei. USA, 74, 5463-5467.

Tilburn, J. et.al. (1983) Gene 26, 205-221.

Vieirra, J. and Messing, J. (1982) Gene, 19, 259-268. Visniac, W. and Santer, M. (1957) Bact. Rev., 21, 195-213. Wernars, K. (1986) Thesis, Agricultural University,

Wageningen, The Netherlands.

Wong, K.K.Y., et al. (1988) Microbiol. Rev., 52, 305-317. Woodward, G. (1984) Topics in Enzyme Ferment. Biotechnol.,

8, 9-30.

Yanisch-Perron, C., Viera, J. and Messing, J. (1985) Gene,

33, 103-109.

Claims (21)

1. Renset og isolert DNA-sekvens som koder for et polypeptid som har xylanaseaktivitet,karakterisert vedat DNA-sekvensen er valgt fra gruppen som består av en DNA-sekvens som stammer fra sopp og som koder for et polypeptid med xylanase-aktivitet beskrevet i fig. 8 eller redundante variasjoner derav.

2. Renset og isolert DNA-sekvens ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-sekvensen stammer fra en sopp valgt fra slektene som består av Aspergillus og Trichoderma.

3. Renset og isolert DNA-sekvens ifølge krav 2,karakterisert vedat DNA-sekvensen stammer fra en sopp valgt fra gruppen som består av Aspergillus tubigensis, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus og Trichoderma reesei.

4. DNA-konstruksjon,karakterisert vedat den inneholder en DNA-sekvens ifølge kravene 1-3, som er operabelt knyttet til regulatorområder som kan styre overekspresjonen av et polypeptid med xylanaseaktivitet i en egnet ekspresjonsvert.

5. DNA-konstruksjon ifølge krav 4,karakterisert vedat det xylanasekodende gen stammer fra en sopp valgt fra slektene som består av Aspergillus og Trichoderma.

6. DNA-konstruksjon ifølge krav 4,karakterisert vedat genet som koder for en sopp-xylanase, stammer fra en soppart valgt fra gruppen som består av Aspergillus tubigensis, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus og Trichoderma reesei.

7. DNA-konstruksjon ifølge krav 4,karakterisert vedat regulatorområdet innbefatter en promotor valgt fra gruppen som består av promotoren som stammer fra et amyloglukosidasegen og promotoren som er naturlig for et xylanasegen.

8. DNA-konstruksjon ifølge krav 4,karakterisert vedat regulatorområdet innbefatter en sekresjonsledersekvens valgt fra gruppen som består av sekresjonsledersekvensen som stammer fra et amyloglukosidasegen og sekresjonsledersekvensen som er naturlig for et xylanasegen.

9. Transformert mikrobevert som er i stand til overekspresjon av en soppxylanase,karakterisert vedat mikrobe-verten inneholder en ekspresjonskonstruksjon ifølge hvilket som helst av kravene 4-8.

10. Transformert mikrobevert ifølge krav 9,karakterisert vedat den er valgt fra slektene som består av Aspergillus, Kluyveromyces, Trichoderma, Saccharomyces og Bacillus.

11. Transformert mikrobevert ifølge krav 9,karakterisert vedat den er valgt fra slektene som består av Aspergillus tubigensis, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Kluyveromyces lactis og Saccharomyces cerevisiae.

12. Anvendelse av en DNA-sekvens ifølge ethvert av kravene 1-3 for fremstilling av et polypeptid med xylanaseaktivitet,karakterisert vedat den omfatter følgende trinn: a) en mikrobe-vert ifølge krav 9, dyrkes under betingelser som bidrar til ekspresjon av genet som koder for polypeptidet med xylanaseaktivitet, og b) polypeptidet med xylanaseaktivitet gjenvinnes.

13. Polypeptid med xylanaseaktivitet,karakterisert vedat det har aminosyresekvensen som vist i fig. 8.

14. Anvendelse av et polypeptid med xylanaseaktivitet ifølge krav 13, til nedbryting av et xylanholdig substrat.

15. Anvendelse av et polypeptid med xylanaseaktivitet ifølge krav 13, til fremstilling av dyreforstoffer.

16. Dyreforblanding,karakterisert vedat den inneholder et polypeptid med xylanaseaktivitet ifølge krav 13 .

17. Anvendelse av et polypeptid med xylanaseaktivitet ifølge krav 13, i en deig for fremstilling av brød.

18. Deig for fremstilling av brød,karakterisert vedat den inneholder et polypeptid med xylanaseaktivitet ifølge krav 13.

19. Anvendelse av et polypeptid med xylanaseaktivitet ifølge krav 13, for fjerning av ligniner fra kraftmasse ved fremstilling av papirprodukter.

20. Kraftmasse,karakterisert vedat den er blitt behandlet med et polypeptid med xylanaseaktivitet ifølge krav 13.

21. Renset og isolert DNA-sekvens omfattende ekspresjons- og transkripsjonsregulatorområder for et xylanasegen,karakterisert vedat DNA-sekvensen velges fra gruppen bestående av: a) en DNA-sekvens av soppopprinnelse som omfatter ekspresjons- og transkripsjonsregulatorområder fra Aspergillus tubigensis xylanase A gen som beskrevet i fig. 8, b) genetiske varianter av sekvensen i del a) med tilsvarende virkning.