NO301690B1

NO301690B1 - Farmasöytisk kombinasjonspreparat med antiviral virkning

Info

Publication number: NO301690B1
Application number: NO921947A
Authority: NO
Inventors: Janet Mary Cameron; Nicholas Cammack
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1991-05-16
Filing date: 1992-05-15
Publication date: 1997-12-01
Also published as: CA2068790A1; IL101883A; CZ242893A3; EP0513917B2; DE69206876D1; ES2083668T5; NO921947D0; NO921947L; WO1992020344A1; AU1627992A; DE69206876T3; CN1045961C; NZ242754A; IE921566A1; MX9202279A; DK0513917T3; NL980018I2; AU661307B2; DE69206876T2; IE73261B1

Description

Denne oppfinnelse angår blandinger av antivirale midler. Mer spesifikt angår den blandinger av 1,3-oksatiolan-nukleosidanaloger med andre antivirale midler, spesielt midler-effektive mot HIV.

HIV (human immunodeficiency virus) forårsaker en rekke kliniske tilstander, innbefattet AIDS (acquired immune deficiency syndrome) og kroniske neurologiske forstyrrelser. Nukleosider som AZT, ddC og ddl hemmer HIV-replikasjon in vitro og synes å utøve deres antivirale aktivitet på det virus-kodede revers transkriptaseenzym etter metabolisme i cellen til deres 5'-trifosfat-derivater.

AZT reduserer morbiditet og mortalitet i pasienter med AIDS. Imidlertid resulterer HIV-infeksjon av celler, i integrasjon av virusgenomet i vertskromosomet, og det har således vært nødvendig å fortsette AZT-behandlingen over lang tid. Konsekvensene av langvarig AZT-terapi er forbundet med benmargstoksisitet og forekomst av AZT-resistente varianter av HIV-1. Likeledes utvikler enkelte AIDS-pasienter behandlet med ddC, perifer neuropati, og ddl har vist seg å indusere pankreatitt og perifer neuropati.

Bruken av blandinger av forbindelser kan muliggjøre en likeverdig antiviral effekt med nedsatt toksisitet eller en økning i medikamenteffekten dersom det inntrer synergisme mellom forbindelsene. Lavere totale medikamentdoser vil muligens også redusere forekomst-hyppigheten av medikamentresistente varianter av HIV. Mange forskjellige metoder er blitt benyttet for å undersøke effekten av blandinger av forbindelser som virker sammen i forskjellige forsøkssystemer. Alle disse metoder har begrensninger og enkelte har for eksempel vært benyttet til andre systemer enn de som de har vært utviklet for. AZT oppviser synergistisk antiviral aktivitet in vitro i blanding med midler som virker som HIV-l-replikerende trinn utenom revers transkripsjon, innbefattet rekombinant oppløselig CD4-castanospermine og rekombinant interferon alfa. Det må imidlertid bemerkes at blandinger av forbindelser kan føre til øket cytotoksisitet. AZT og rekombinant interferon alfa har en øket cytotoksisk effekt på normale progenitorceller i human benmarg.

Blandinger av AZT med andre nukleosider har også vært undersøkt. ddC eliminerer benmargs-cytotoksisiteten av høye doser AZT uten å påvirke dets antivirale aktivitet, ddl og AZT oppviser i blanding noe forbedret selektivitet gjennom en synergistisk antiviral effekt som virker over en additiv toksisitet til normale progenitorceller i human benmarg.

Forbindelsen med formel (I)

også kjent som BCH-189 ellerNGPB-21, har vært angitt å ha antiviral aktivitet, spesielt mot de humane immunsvikt virus (HIV), midlet som forårsaker AIDS (5th Anti-Aids Conference, Montreal, Canada 5th-9th June 1989: Abstracts T.C.0.1 and M.C.P.63; European Patent Application Publication No. 0382562). Forbindelsen med formel (I) er en racemisk blanding av de to enantiomerene med formel (I-l) og (1-2):

Selv om enantiomerene av forbindelsen med formel (I) er like potente mot HIV, har den ene av enantiomerene (-)-enantiomeren betydelig lavere cytotoksisitet enn enant iomeren. (-)-enantiomeren har den kjemiske betegnelse (-) cis-4-amino-1-(2-hydroksyrnety1-1,3-oksatiolan-5-yl(1H)-pyrimidin-2-on. Den har den absolutte stereokjemi til forbindelsen med formel (I-l) som har betegnelsen (2R,cis)-4-amino-l-(2-hydroksymetyl-1,3-oksatiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on. Denne forbindelse er nå kjent som 3TC.

Vi har nå oppdaget at forbindelsen med formel (I) i form av (-)-enantiomeren, oppviser uventede fordeler når den benyttes- i blanding med den kjente hemmer AZT av HIV-replikasjon.

I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes et farmasøytisk kombinasjonspreparat som omfatter (2R,cis)-4-amino-l-(2-hydroksymetyl-1,3-oksatiolan-5-yl)-lH-pyrimidin-2-on (3TC) eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav, og 3'-azido-3'-deoksytymidin (AZT) eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav.

Forbindelsen med formel (I) i form av (-)-enantiomeren, vil normalt bli benyttet tilnærmet fri for den tilsvarende (+)-enantiomer, det vil si at ikke mer enn ca. 5 vektprosent av (+)-enantiomeren, fortrinnsvis ikke mer enn ca. 2 vektprosent og helst mindre enn ca. 1 vektprosent, vil forekomme.

Med "et farmasøytisk akseptabelt derivat" menes et hvilket som helst farmasøytisk akseptabelt salt, ester eller salt av en slik ester, av en opphavelig forbindelse eller en hvilken som helst annen forbindelse som etter administrasjon til mottageren, er i stand til å gi (direkte eller indirekte) den opphavelige forbindelse eller en antiviralt aktiv metabolitt eller rest av denne.

Fagmannen vil innse at forbindelsen med formel (I) kan modifiseres for å gi farmasøytisk akseptable derivater både i funksjonelle grupper i basedelen og i oksatiolanringens hydroksymetylgruppe. Modifikasjon av alle slike funksjonelle grupper faller inn under rammen av oppfinnelsen. Av særlig interesse er imidlertid farmasøytisk akseptable derivater oppnådd ved modifikasjon av oksatiolanringens 2-hydroksymetylgruppe.

Foretrukne estere av forbindelsen med formel (I) innbefatter de forbindelser hvor hydrogenet i 2-hydroksymetylgruppen er erstattet med en acylfunksjon,

0

II

R-C-, hvor den ikke-karbonylholdige del R av esteren er valgt fra hydrogen, rettkjedet eller forgrenet alkyl (f.eks. metyl, etyl, n-propyl, t-butyl, n-butyl) , alkoksyalkyl (f.eks. metoksymetyl), aralkyl (f.eks. benzyl), aryloksyalkyl (f.eks. fenoksymetyl), aryl (f.eks. fenyl eventuelt substituert med halogen, C1_4alkyl eller C1_4alkoksy); sulfonatestere, så som alkyl- eller aralkylsulfonyl (f.eks. metansulfonyl); aminosyreestere (f.eks. L-valyl eller L-isoleucyl) og mono-, di- eller trifosfatestere.

Når det gjelder de ovenfor beskrevne estere kan en hvilken som helst forekommende alkyldel, om intet annet er angitt, med fordel inneholde 1 til 16 karbonatomer, særlig 1 til4karbonatomer. Eventuelle aryldeler i slike estere omfatter med fordel en fenylgruppe.

Særlig kan esterne være en C.. _alkylester, en

i. — X b

usubstituert benzylester eller en benzylester substituert med minst én halogen- (brom, klor, fluor eller jod), C. 1 - b^alkyl-, C...alkoksy-, nitro- eller trifluormetylgruppe.

X — D

Farmasøytisk akseptable salter av forbindelsen med formel (I) innbefatter salter oppnådd fra farmasøytisk akseptable uorganiske eller organiske syrer og baser. Eksempler på egnede syrer innbefatter salt-, hydrogenbromid-, svovel-, salpeter-, perklor-, fumar-, malein-, fosfor-, glykol-, melke-, salicyl-, rav-, toluen-, p-sulfon-, vin-, eddik-, sitron-, metansulfon-, maur-, benzo-, malon-, naftalen-2-sulfon- og benzensulfonsyre. Andre syrer, så som oksalsyre som selv ikke er farmasøytisk

akseptable, kan være nyttige som mellomprodukter for å oppnå forbindelser i henhold til oppfinnelsen og deres farmasøytisk

akseptable syreaddisjonssalter.

Salter som skriver seg fra passende baser innbefatter alkalimetall- (f.eks. natrium), jordalkalimetall- (f.eks. magnesium), ammonium- og NR4<+>(hvor R er C^^alkyl)salter.

Forbindelsen med formel (I) er enten synergistisk med den andre komponenten i blandingen og/eller fjerner de cytotoksiske virkningene av den andre komponenten.

De fordelaktige virkningene av forbindelsen 3TC sammen med det sekundære antivirale middel AZT, oppnås innenfor et bredt område, for eksempel 1:250 til 250:1, fortrinnsvis 1:50 til 50:1, helst ca. 1:10 til 10:1. Hensiktsmessig vil hver forbindelse i blandingen bli benyttet i en mengde som det oppviser antiviral aktivitet ved når det benyttes alene.

Det forventes at foreliggende blandinger i alminnelighet vil være anvendelige mot virale infeksjoner eller virus-assosierte humantumorer.

Det vil være klart at forbindelsen 3TC og det andre antivirale midlet AZT, kan administreres enten samtidig, suksessivt eller i kombinasjon. Dersom administrasjonen skjer suksessivt, bør utsettelsen av administrasjonen av det andre virkestoffet ikke være slik at gevinsten ved den synergistiske effekt av blandingen tapes. Fortrinnsvis foretas administrasjonen samtidig.

Det er underforstått at når det her er tale om behandling, gjelder dette også profylakse så vel som behandling av etablerte infeksjoner eller symptomer.

Det er likeledes klart at den mengde av en blanding i henhold til oppfinnelsen som trengs for bruk ved behandling, ikke bare vil variere med den aktuelle valgte forbindelse, men også med administrasjonsmåte, tilstandens natur og pasientens alder og tilstand og vil i siste instans avhenge av vurderingen til behandlende lege eller veterinær. Generelt vil imidlertid en passende dose ligge i området fra ca. 1 til ca.750 mg/kg, f.eks. fra ca. 10 til ca. 75 mg/kg legemsvekt per dag, så som 3 til 120 mg per kg legemsvekt per dag, fortrinnsvis innen området 6 til 90 mg/kg/dag og helst innen området 15 til 60 mg/kg/dag av hvert av virkestoffene i

blandingen.

Den ønskede dose kan hensiktsmessig gis som en enkeltdose eller som avdelte doser, administrert med passende mellomrom, - for eksempel som 2, 3, 4 eller flere mindre doser per dag.

Blandingen administreres hensiktsmessig i enhetsdoseform; for eksempel inneholdende 10 til 1500 mg, hensiktsmessig 20 til 1000 mg og helst 50 til 700 mg virkestoff per enhetsdoseform.

Ideelt bør blandingene administreres for å oppnå maksimal plasmakonsentrasjon av hvert virkestoff fra ca. 1 til ca. 75 mmol, fortrinnsvis ca. 2 til 50 mmol og helst fra 3 til ca. 3 0 mmol. Dette kan for eksempel oppnås ved intravenøs injeksjon av en 0,1 til 5% oppløsning av virkestoffene, eventuelt i saltvann, eller peroralt administrert som en bolus inneholdende ca. 1 til ca. 100 mg av hvert virkestoff. Ønskede blodnivåer kan opprettholdes gjennom en kontinuerlig infusjon for å gi ca. 0,01 til ca. 5,0 mg/kg/time eller ved periodevise infusjoner inneholdende ca. 0,4 til ca. 15 mg/kg av hvert virkestoff.

Selv om det ved terapeutisk anvendelse er mulig å administrere virkestoffene i blandingen som det rå kjemikalium, foretrekkes administrasjon av blandingen som en farmasøytisk formulering.

Det farmasøytiske preparat omfatter forbindelsen 3TC eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav og hemmerenAZT sammen med ett eller flere farmasøytisk akseptable bæremidler for disse og, eventuelt, andre terapeutiske og/eller profylaktiske ingredienser. Bæremidlene må være "akseptable" i den forstand at de er forlikelige med de øvrige ingredienser i formuleringen og ikke skadelige for mottageren.

Farmasøytiske formuleringer innbefatter slike som er egnet for peroral, rektal, nasal, lokal (inkludert bukal og sublingval), vaginal eller parenteral (inkludert intramuskulær, subkutan og intravenøs) administrasjon, eller slike som har en form egnet for administrasjon ved inhalasjon eller innblåsning. Formuleringene kan derfor, når det passer, hensiktsmessig forelegges i adskilte doseringsenheter og kan fremstilles etter metoder velkjent innen farmasien. Alle metoder innbefatter det trinn at virkestoffet bringes sammen med flytende bæremidler eller findelte faste bæremidler, eller-begge deler, hvoretter produktet om nødvendig, omdannes til den ønskede formulering.

Farmasøytiske formuleringer egnet for peroral administrasjon, kan tilberedes som diskrete enheter, så som kapsler, pastiller eller tabletter, som hver inenholder en bestemt mengde virkestoff, som pulver eller granuler; som oppløsning, suspensjon eller som emulsjon. Virkestoffet kan også tilberedes som bolus, avføringsmiddel eller pasta. Tabletter og kapsler for peroral administrasjon kan inneholde konvensjonelle hjelpestoffer, så som bindemidler, fyllstoffer, glattemidler, sprengmidler eller fuktemidler. Tablettene kan drasjéres i henhold til velkjente metoder. Perorale flytende preparater kan være i form av vandige eller oljebaserte suspensjoner, oppløsninger, emulsjoner, siruper eller miksturer eller tilberedes som et tørt produkt for tilblanding av vann eller annet egnet bæremiddel, før bruk. Slike flytende preparater kan inneholde konvensjonelle tilsetningsmidler, så som suspenderingsmidler, emulgeringsmidler, ikke-vandige bæremidler (inkludert spiseoljer) eller konserveringsmidler.

Preparatene i henhold til oppfinnelsen kan også formuleres for parenteral administrasjon (f.eks. ved injeksjon, for eksempel bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon) og kan forelegges i enhetsdoseform som ampuller, fylte sprøyter, "small volume infusion" eller i flerdose-beholdere, med tilsatt konserveringsmiddel. Preparatene kan ha form som suspensjoner, oppløsninger eller emulsjoner i olje-eller vannbaserte bæremidler og kan inneholde formuleringsmidler, så som suspensjons-, stabiliserings-og/eller dispergeringsmidler. Virkestoffet kan alternativt være i pulverform oppnådd ved aseptisk isolering av sterilt faststoff eller ved lyofilisering av oppløsninger, for sammensetning med et passende bæremiddel, f.eks. sterilt pyrogenfritt vann, før bruk.

For lokal administrasjon til epidermis, kan preparatene i henhold til oppfinnelsen, formuleres som salver, kremer eller lotions, eller som et transdermalplaster. Salver og kremer kan for eksempel formuleres med et vann- eller oljegrunnlag under - tilsetning av passende fortyknings- og/eller

gelateringsmidler. Lotions kan formuleres med et vann- eller oljegrunnlag og vil i alminnelighet også inneholde ett eller flere emulgeringsmidler, stabiliseringsmidler, dispergeringsmidler, suspenderingsmidler, fortykningsmidler eller farvestoffer.

Passende formuleringer for lokal administrasjon i munnen innbefatter pastiller som omfatter virkestoffet i et grunnlag tilsatt smaksstoffer, vanligvis sukrose, og akasie- eller tragantgummi; pastiller som inneholder virkestoffet i et inert grunnlag, så som gelatin og glycerol eller sukrose og akasie-gummi; samt munnvask som inneholder virkestoffet i et passende flytende bæremiddel.

Farmasøytiske formuleringer egnet for rektal administrasjon, hvor bæremidlet er et faststoff, fremstilles

fortrinnsvis som enhetsdose-suppositorier. Passende bæremidler innbefatter kakaosmør og andre vanlig benyttede materialer, og suppositoriene formes ved blanding av virkestoffet med myknere eller smeltede bæremidler, etterfulgt av avkjøling og støpning i former.

Formuleringer egnet for vaginal administrasjon kan tilberedes som pessarer, tamponger, kremer, gel, pasta, skum eller spray, som i tillegg til virkestoffet, inneholder kjente passende bæremidler.

For intranasal administrasjon, kan forbindelsene i henhold til oppfinnelsen, benyttes som en flytende spray eller dispergerbart pulver, eller i form av dråper.

Dråper kan formuleres med et vandig eller ikke-vandig grunnlag som også inneholder ett eller flere

dispergeringsmidler, solubiliseringsmidler eller suspenderingsmidler. Flytende spray avgis hensiktsmessig fra trykkbeholdere.

For inhalasjonsadministrasjon avgis de aktive bestanddeler i preparatene i henhold til oppfinnelsen, hensiktsmessig fra en insufflator, nebulisator eller sprayboks eller andre hensiktsmessige anordninger for avgivelse av en aerosolspray. Spraybokser kan bestå av et passende drivmiddelrså som diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan, karbondioksyd eller en annen hensiktsmessig gass. Når det gjelder aerosol under trykk, kan doseringsenheten bestemmes ved at det anbringes en ventil som gir en avmålt mengde.

Som alternativ for administrasjon ved inhalasjon eller innblåsning, kan preparatene i henhold til oppfinnelsen, ha form av en tørr pulversammensetning, for eksempel en pulverblanding av forbindelsen og et passende pulvergrunnlag, så som laktose eller stivelse. Pulversammensetningen kan fremstilles i enhetsdoseform, for eksempel som kapsler eller patroner, eller f.eks. gelatin- eller foliepakninger, hvorfra pulveret kan administreres ved hjelp av en inhalator eller insufflator.

Om ønskes kan de ovenfor beskrevne formuleringer benyttes i en form som gir forlenget virkestoff-frigjøring.

De farmasøytiske preparatene i henhold til oppfinnelsen, kan også inneholde andre virkestoffer, så som antimikrobielle midler eller konserveringsmidler.

Forbindelsen med formel (I) kan oppnås som beskrevet-i europeisk patentsøknad, publikasjon nr. 0382562.

De individuelle enantiomerene kan oppnås fra deres racemater ved spaltning etter en hvilken som helst kjent metode for separasjon av racemater i deres enantiomere. Spesielt kan de oppnås fra det kjente racemat ved chiral HPLC, ved enzym-mediert enantio-selektiv katabolisme med et passende enzym, så som cytidin-deaminase, eller ved selektiv enzymatisk nedbrytning av et passende derivat, ved å beytte et 5'-nukleotid. Fremgangsmåter for fremstilling av 3TC er beskrevet i W091/17159.

De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Mellomprodukt 1

5- metoksy- l, 3- oksatiolan- 2- metanol, benzoat

En oppløsning av sink-klorid (1,6 g) i varm metanol

(15 ml) ble tilsatt til en omrørt oppløsning av merkapto-acetaldehyd-dimetylacetal (34,2 g) og benzoyloksyacetaldehyd (48,3 g) i toluen (1300 ml), som så ble kokt under tilbakeløpskjøling under nitrogen i 50 min. Den avkjølte blandingen ble konsentrert, fortynnet med litt toluen og deretter filtrert gjennom kiselgur. De kombinerte filtrater og toluenet ble vasket med vandig mettet natriumbikarbonat-oppløsning (x 2) og saltvann, tørket (MgSC>4) og deretter inndampet til en olje, som ble kolonnekromatografert på silika (2 kg, Merck 9385) under eluering med kloroform, for å gi tittelproduktet som en olje (45,1 g) i en blanding av anomerer (ca. 1:1);

1H NMR (DMSO-dg): 3,1-3,3 (4H), 3,42 (6H), 4,4-4,6 (4H), 5,41 (1H), 5,46 (1H), 5,54 (1H), 5,63 (1H), 7,46 (4H), 7,58 (2H), 8,07 (4H); ymaks (CHBr^) 1717,6 cm<-1>.

Mellomprodukt 2

( + )- cis- 1-( 2- benzoyloksymetyl- l, 3- oksatiolan- 5- yl) -( 1H) - pyrimidin- 2, 4- dion

En blanding av finmalt uracil (9,62 g),

heksametyldisilazan (50 ml) og ammoniumsulfat (30 mg) ble kokt under tilbakeløpskjøling under nitrogen inntil det ble oppnådd en klar oppløsning. Oppløsningen ble avkjølt og deretter inndampet til en farveløs olje, som under nitrogenatmosfære ble oppløst i acetonitril (100 ml). Oppløsningen ble tilsatt til en omrørt, isavkjølt oppløsning av 5-metoksy-l, 3-oksatiolan-2-metanol-benzoat (Mellomprodukt 1) (19,43 g) i actonitril (600 ml) og tilsatt trimetylsilyltrifluor-metansulfonat (14,7 ml). Isbadet ble fjernet og oppløsningen kokt under tilbakeløpskjøling under nitrogen i 45 minutter. Etter avkjøling og inndampning, ble residuet renset ved kolonnekromatografi over 1 kg silikagel (Merck 9385) under eluering med kloroform/metanol, 9:1. Passende fraksjoner ble

avkjølt og inndampet for å gi et rått residuum. Dette ble fraksjonskrystallisert fra et minimum varm metanol (ca.

1200 ml) for å gi tittelforbindelsen (6,32 g) som hvite krystaller.

1H NMR (DMSO-db,.)6 11,36 (1H, bs), 7,50-8,00 (6H, m), 6,20 (1H, t), 5,46 (2H, m), 4,62 (2H, m), 3,48 (1H, m), 3,25 (1H, m) .

Mellomprodukt 3

(+)-( cis)- 4- amino- l-( 2- benzovloksymetvl- 1, 3- oksatiolan- 5- yl)-( 1H)- pyrimidin- 2- on

Metode ( a)

En.suspensjon av cytosin (20,705 g) og ammoniumsulfat (få mg) i heksametyldisilazan (110 ml) ble omrørt og kokt under tilbakeløpskjøling i 2,5 timer under nitrogen. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning og det gjenværende faststoff oppløst i tørr acetonitril (350 ml) . Oppløsningen ble overført ved bruk av en bøyelig nål til en omrørt, isavkjølt oppløsning av 5-metoksy-l,3-oksatiolan-2-metanol-benzoat (Mellomprodukt I) (43,57 g) i acetonitril

(650 ml) under nitrogen. Trimetylsilyl-trifluormetansulfonat (33 ml) ble tilsatt, hvorpå oppløsningen fikk oppvarmes til romtemperatur (1,5 timer) og deretter ble kokt under tilbakeløpskjøling over natten. Den gjenværende blanding ble konsentrert, fortynnet med mettet, vandig natriumbikarbonat-oppløsning (500 ml) og deretter ekstrahert med etylacetat

(3 x 500 ml). De kombinerte ekstraktene ble vasket med vann (2 x 250 ml) og saltvann (250 ml) , tørket (MgS04) og deretter inndampet til et skum, som ble kolonnekromatografert på silika (600 g, Merck 77.34) eluert med etylacetat-metanol-blandinger, for å gi en blanding av anomerer (ca. 1:1; 31,59 g). Blandingen ble krystallisert fra vann (45 ml) og etanol

(9,0 ml) for å gi et faststoff (10,23 g), som ble omkrystallisert fra etanol (120 ml) og vann (30 ml) for å gi tittelproduktet som et hvitt faststoff (9,26 g); Xmaks (MeOH)229,4nm (E- lem 1% 610);272,4 nm (E- lem1% 293);

<1>H NMR (DMSO-d6,) 5 3,14 (1H), 3,50 (1H), 4,07 (2H), 5,52 (1H), 5,66 (1H) , 6,28 (1H) , 7,22 (2H) , 7,56 (2H) , 7,72 (2H) , 8,10 (2H) .

Metode ( b)

Fosforoksyklorid (7,0 ml) ble dråpevis tilsatt til en omrørt, isavkjølt suspensjon av 1,2,4-triazol (11,65 g) i acetonitril (12 0 ml), og mens den innvendige temperatur ble holdt lavere enn 15°C, ble trietylamin (22,7 ml) tilsatt dråpevis. Etter 10 minutter ble en oppløsning av (±)-cis-1-(2-benzoyloksymetyl-1,3-oksatiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2,4-dion (Mellomprodukt 2) (6,27 g) i acetonitril (330 ml) langsomt tilsatt. Omrøringen ble deretter fortsatt ved romtemperatur over natten. Blandingen ble avkjølt i et isbad og langsomt tilsatt trietylamin (30 ml) og deretter vann (21 ml). Den resulterende oppløsning ble inndampet og residuet fordelt mellom mettet natriumbikarbonatoppløsning (4 0 0 ml) og kloroform (3 x 200 ml). De kombinerte kloroformekstraktene ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet for å gi et rått residuum (9,7 g). Residuet ble oppløst i 1,4-dioksan (240 ml) og tilsatt konsentrert vandig ammoniakkoppløsning (sp.v. 0,880, 50 ml). Etter 1,5 timer ble oppløsningen inndampet og residuet oppløst i metanol. Dette forårsaket utfelling av et faststoff, som ble frafiltrert. Moderluten ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (Merck 9385,

600 g). Passende fraksjoner ble slått sammen og inndampet for å gi tittelforbindelsen som et lysebrunt faststoff (2,18 g), identisk med det oppnådd under Metode (a) .

Mellomprodukt 4

(+)-( cis)- 4- amino- l-( 2- hydroksymetyl- l, 3- oksatiolan- 5- vl( 1H)-pyrimidin- 2- on

En suspensjon av (cis)-4-amino-l-(2-benzoyloksymetyl-l,3-oksatiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on (Mellomprodukt 3)

(8,19 g) og Amberlite IRA-400 (OH) resin (8,24 g) i metanol (250ml) ble omrørt og kokt under tilbakeløpskjøling i 1,25 timer. Faststoffet ble fjernet ved filtrering og vasket med

metanol. De kombinerte filtratene ble inndampet. Residuet ble utgnidd med etylacetat (80 ml). Det resulterende hvite faststoffet ble oppsamlet ved filtrering for å gi tittelproduktet (5,09 g) , 1H NMR (DMSO-dJ 3,04 (1H) , 3,40 (1H), 3,73 (2H), 5,18 (1H), 5,29 (1H), 5,73 (1H), 6,21 (1H), 7,19 (2H), 7,81 (1H).

Eksempel 1

(-)- cis- 4- amino- l-( 2- hvdroksvmetyl- 1, 3- oksatiolan- 5- vl( 1H)-pyrimidin- 2- on (i) Tre 50 ml kolber med næringsoppløsning (Oxoid Ltd) ble podet med hver sin skjefull Escherichia coli (ATCC 23848) avskrapet fra en næringsagarplate. Kolbene ble inkubert over natten ved 37°C under risting med 250 omdr./min., hvoretter hver kolbe ble benyttet for å inokulere 4 1 CDD-medium (glutaminsyre, 3 g/l; MgS04#0,2 g/l; K2S04, 2,5 g/l; NaCl, 2,3 g/l; Na2HP04.2H20, 1,1 g/l; NaH2P04 2H20, 0,6 g/l; cytidin 1,2 g/l) i en syv liters fermentor. Kulturene ble fermentert ved 750 omdr./min., 37°C under lufting med 4 l/min. Etter dyrking i 24 timer ble cellene oppsamlet ved sentrifugering (5000 g, 30 min.) for å oppnå 72 g våtvekt. Den resulterende cellepellet ble resuspendert i 300 ml 20 mmol Tris HCl-buffer (pH 7,5) og revet opp ved ultralydbehandling (4 x 45 sekunder). Cellerester ble fjernet ved sentrifugering (30.000 g, 30 min.) og proteinet i supernatanten utfelt ved tilsetning av ammoniumsulfat til 75% metning. Bunnfallet ble oppsamlet ved sentrifugering (30.000 g, 30 min.) og den oppnådde pellet resuspendert i 25 ml Hepes buffer (100 mmol, pH 7,0) inneholdende ammoniumsulfat (75% metning). Enzymoppløsningen ble fremstillet ved sentrifugering ved 12.000 rpm. i 30 min. Supernatanten ble kassert og pelleten oppløst i Tris HCl-buffer (pH 7,0; 100 mmol) til det opprinnelige volum. (ii) Mellomprodukt 4 (115 mg) ble oppløst i vann (100 ml) og omrørt. Enzymoppløsning (0,5 ml) ble tilsatt og blandingen holdt ved konstant pH ved kontinuerlig tilsetning av HCl

(25 mmol). Omdannelsen ble fulgt ved chiral HPLC som viste at fortrinnsvis (+)-enantiomeren av substratet ble deaminert. Etter 22 timer var (+)-enantiomeren av substratet (RT

12,5 min.) fullstendig fjernet og oppløsningen ble justert til pH 10,5 ved tilsetning av kons. natriumhydroksyd.

Den ovenfor fremstillede oppløsningen ble eluert gjennom en kolonne av QAE Sephadex (A25; Pharmacia; 30X 1,6 cm) likevektsinnstillet til pH 11. Kolonnen ble vasket med vann (200 ml) og deretter med HC1 (0,1M). Fraksjoner (40 ml) ble uttatt og analysert ved omvendt fase HPLC. Fraksjonene 5-13 som inneholdt den uomsatte (-)-enantiomer av substratet, ble kombinert og justert til pH 7,5 med HCl. Fraksjon 47 som inneholdt deaminert produkt, ble justert til pH 7,5 med fortynnet NaOH. Analyse ved chiral HPLC viste at dette materialet var en blanding som besto av den ene enantiomer (RT 10,2 min.) som hovedkomponent, med den andre enantiomer (RT 8,5 min.) som underordnet komponent (e.e ca. 90%). (iii) Trinn (ii) ovenfor ble gjentatt i større skala. Forbindelsen i Eksempel 1 (363 mg) i 250 ml vann ble inkubert med enzymoppløsning (0,5 ml), fremstillet som i trinn (i). Ytterligere enzymalikvoter (0,5 ml) ble tilsatt etter 18 og 47 timer. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 70 timer, deretter satt tilside i ytterligere 64 timer. Analyser ved chiral HPLC tydet på at (+)-enantiomeren av substratet var fullstendig deaminert, og den resulterende oppløsning ble deretter justert til 10,5 med NaOH.

Oppløsningen ovenfor ble anbragt på den samme QAE-kolonne og eluert som i trinn (i). Fraksjonene 2-6 som inneholdt en blanding av det gjenværende substrat og deaminert produkt, ble slått sammen. Fraksjonene 7-13 som inneholdt gjenværende substrat ((-)-enantiomer) ble slått sammen og justert til pH 7,5. Fraksjoner 25-26 som inneholdt deaminert produkt ble slått sammen og nøytralisert.

De ovennevnte fraksjonene 2-6 ble eluert på nytt gjennom den samme QAE-kolonne. Fraksjonene 3-11 fra denne andre kolonne inneholdt uomsatt substrat ((-)-enantiomer). Fraksjon

70 inneholdt det deaminerte produkt.

(iv) De spaltede substratfraksjonene fra trinn (ii) og (iii) ble kombinert og justert til pH 7,5. Denne oppløsningen ble eluert gjennom en kolonne av XAD-16 (40 x 2,4 cm), pakket i vann. Kolonnen ble vasket med vann og deretter eluert med aceton:vann (1:4 volumdeler). Fraksjoner som inneholdt den ønskede (-)-enantiomer ble slått sammen og frysetørket for å gi et hvitt pulver (190 mg).

HPLC-metodene som ble benyttet ovenfor, var som følger:

1. Omvendt-fase analytisk HPLC

Kolonne : Capital Cartridge

Spherisorb ODS-2 (5/xM)

150 x 4,6 mm

Eluent : ammonium-dihydrogen-fosfat (50mM)+

5% MeCN

Strømningshastighet : 1,5 ml/min.

Deteksjon : UV, 270nm

Retensjonstider : BCH 189 5,5 min.

deaminert BCH-189 8,1 min.

2. Chiral analytisk HPLC

Kolonne : Cyklobond I acetyl

250 x 4,6 mm

Eluent : 0,2% trietylammoniumacetat (pH 7,2) Strømningshastighet : 1,0 ml/min.

Deteksjon : UV, 270nm

Retensjonstider : BCH 189 11,0 og 12,5 min.

: deaminert BCH-189 8,5 og 10,2 min (bio-omdannelsen ble fulgt ved å overvåke reduksjonen i toppen ved 12,5 min. og akkumuleringen av produkt ved 10,2 min.).

Eksempel 2

3.1 Antivirale virkninger alene eller i kombinasjon

Forbindelsene ble først seriefortynnet i to-folds dekrementer i 96-brønns mikrotiterplater. Sjakkbrett-titreringer ble foretatt ved å blande 25 ml alikvoter av hver forbindelses-fortynning for seg eller i blanding (til et sluttvolum på 50 ml i nye 96-brønns mikrotiterplater). Alikvoter av MT-4 celler (IO<6>celler/ml) i RPMI 1640 vekstmedium ble infisert med HIV-1 stamme RF ved et moi på2x 10 infeksiøse doser/celle. Virus ble adsorbert ved romtemperatur i 90 minutter, hvoretter cellene ble vasket i RPMI 164 0 vekstmedium for å fjerne uadsorbert virus og resuspendert til 10 celler/ml i RPMI 1640 vekstmedium. 50 ml infisert cellesuspensjon ble inokulert i brønner som inneholdt forbindelse eller kun vekstmedium. 50 ml av ikke-infisert ("mock-infested") cellesuspensjon ble inokulert i brønner som ikke inneholdt testforbindelse. Platene ble deretter inkubert i 7 dager ved 37°C i 5% CH2/luft.

Etter inkubering ble 10 ml 3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) i 7,5 mg/ml tilsatt til samtlige brønner og platene inkubert i ytterligere 90 minutter ved 37°C. 150 ml av 10% (volumdeler) Triton X-100 i isopropanol ble deretter tilsatt og cellene resuspendert. Etter15 minutter ved romtemperatur ble platene analysert i en Multiskan MC-leser (Flow Laboratories, Irvine, UK) ved 405 nm. Omdannelse av gul MTT til formazan-derivatet er maksimal i de uinfiserte ubehandlede cellene og mangler i ubehandlede

infiserte celler.

Dose-responskurver ble konstruert for hver forbindelse for seg (IC^Q%-verdier) og for resiproke titreringer av hver forbindelse ved en fast konsentrasjon av den andre forbindelsen. Isobologrammer av alle forbindelses-kombinasjoner som ga IC5Q%-verdier ble tegnet inn.

Figur 1 er et isobologram av 3TC i kombinasjon med AZT. Hvis IC50-verdien av forbindelseskombinasjonen ligger på en linje som forbinder IC5Q-verdier for hver forbindelse for seg, virker de to forbindelsene additivt. Hvis kombinasjonen IC5Q% ligger til venstre for linjen, virker forbindelsene synergistisk.

Dose-responskurve for 3TC i blanding med AZT er vist i

Figur 1.

Ingen toksiske effekter ble observert ved bestemmelsen av de antivirale virkningene av blandingene.

Eksempel 3

Cytotoksisitet av forbindelsene hver for sea ocr i blanding

I disse forsøkene ble cytotoksisiteten av 3TC og AZT hver for seg og i blanding (i mg/ml-forhold på 1:1, 1:5 og 5:1) sammenlignet i uinfiserte perifere blodlymfocytter og en etablert T-lymfocyttcellelinje.

Cytotoksisiteten ble målt ved å benytte et [ H]-tymidin opptaksforsøk. Typisk dose-responskurve for hver forbindelse eller-for en l:l-blanding i PBL-celler er vist i Fig. 2.

Claims

1. Farmasøytisk kombinasjonspreparatkarakterisert vedat det omfatter (2R,cis)-4-aminb-1-(2-hydroksymetyl-l,3-oksatiolan-5-yl)-lH-pyrimidin-2-on (3TC) eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav, og 3'-azido-3'-deoksytymidin (AZT) eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav.

2. Kombinasjonspreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter (2R,cis)-4-amino-1-(2-hydroksymetyl-l,3-oksatiolan-5-yl)-lH-pyrimidin-2-on (3TC) og 3 '-azido-3'-deoksytymidin (AZT) eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav.

3. Kombinasjonspreparat ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat forholdet mellom 3TC og AZT er fra 250:1 til 1:250 etter vekt.

4. Kombinasjonspreparat ifølge krav 3,karakterisert vedat forholdet mellom 3TC og AZT er fra 1:10 til 10:1 etter vekt.

5. Farmasøytisk kombinasjonspreparat ifølge et av kravene 1-4,karakterisert vedat det dessuten omfatter et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.

6. Farmasøytisk kombinasjonspreparat ifølge et av kravene 1-5,karakterisert vedat det er egnet for oral administrasjon.