NO20171470A1

NO20171470A1 - Anvendelse av HIF alfa-stabilisatorer for forhøyelse av erytropoiesen.

Info

Publication number: NO20171470A1
Application number: NO20171470A
Authority: NO
Inventors: Thomas B Neff; Stephen J Klaus; Pukall Volkmar Guenzler; Todd W Seeley; Christopher J Molineaux; Robert C Stephenson; Ingrid Lansetmo Parobok
Original assignee: Fibrogen Inc
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2006-01-06
Also published as: ZA200509279B; CN1816327B; CN1816327A; UA87109C2

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen gjelder fremgangsmåter og forbindelser for regulering eller forsterking av erytropoiese og jernmetabolisme og forbehandling eller forebyggelse av jernmangel og anemi forbundet med kronisk sykdom.

Description

ANVENDELSE AV HIF ALFA-STABILISATORER FOR FORHØYELSE AV

ERYTROPOIESEN

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelsen gjelder fremgangsmåter og forbindelser for regulering eller forhøyelse av erytropoiese og jernmetabolisme og for behandling eller forebygging av jernmangel og anemi forbundet med kronisk sykdom.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Anemi viser generelt til enhver unormalitet i hemoglobin eller erytrocytter som fører til reduserte oksygennivåer i blodet. Anemi kan også utvikles i forbindelse med kroniske sykdommer, for eksempel kronisk infeksjon, neoplastiske lidelser og kroniske betennelseslidelser, innbefattet lidelser med påfølgende betennelsesundertrykking av beinmarg, osv. Anemi forbundet med kronisk sykdom er et av de hyppigst forekommende syndromene innen medisinen.

Anemi forbundet med kronisk sykdom (ACD) er ofte forbundet med jernmangel. ACD kan utvikles fra utilstrekkelig tilgjengelighet på jern (for eksempel anemi forbundet med jernmangel) eller, dersom kroppens totale jernnivå er tilstrekkelig men kravene for hemoglobinproduksjon er defekte (for eksempel funksjonell jernmangel). Jern er nødvendig for dannelse av hemoglobin til de røde blodcellene i erytropoietiske forløperceller i beinmargen.

En rekke fysiologiske mangler observeres hos pasienter med anemi forbundet med kronisk sykdom, innbefattet redusert erytropoietin (EPO) -dannelse, redusert EPO-respons i beinmargen og redusert jernmetabolisme innbefattet redusert absorpsjon av jern fra tarmen, redusert transport av jern gjennom enterocytter, redusert jernoksidering til jern(III)nivå ved hefaestin eller ceruloplasmin, redusert binding og opptak av jern ved transferrin og transferrinreseptoren og redusert transport av jern til beinmargen hvor utnyttelsen av jern foregår, innbefattet syntese av heme. Hver for seg og til sammen bidrar disse fysiologiske manglene til en lite effektiv eller svekket erytropoiese, noe som kan føre til mikrocyttisk anemi og hypokrome røde blodceller forbundet med redusert hemoglobindannelse og redusert oksygentransport.

Anemi forbundet med kronisk sykdom er forbundet med forhøyet dannelse av inflammatoriske cytokiner (Means (1995) Stem cells 13: 32-37 og Means (1999) Int J Hematol 70: 7-12), innbefattet for eksempel tumornekrosefaktor- α (TNF- α), interleukin-1 β (IL-1 β), IL-6 og interferon- γ (IFN- γ). I flere in vitro og in vivo dyremodellsystemer har inflammatoriske cytokiner negativ virkning på evnen til å formidle EPO-dannelse, EPO-respons og koordinert regulering av jernmetabolismen (Roodman et al. (1989) Adv Exp Med Biol 271: 185-196; Fuchs et al. (1991) Eur J Hematol 46: 65-70; Jelkmann et al. (1994) Ann NY Acad Sci 718: 300-311;

Vannucchi et al. (1994) Br J Hematol 87: 18-23; og Oldenburg et al. (2001) Aliment Pharmacol Ther 15: 429-438). Administrering av erytropoietin reverserte ikke anemi hos mus som ble kontinuerlig eksponert overfor TNF- α (Clibon et al. (1990) Exp Hematol 18: 438-441). Forhøyet nivå av inflammatoriske cytokiner så som TNF- α, IL-1 β og IFN- γ, bidrar til den svikt i EPO-dannelsen og EPO-resistensen som observeres hos pasienter med anemi forbundet med kronisk sykdom (Jelkmann et al. (1991) Ann NY Acad Sci 718: 300-311 og Macdougall og Cooper (2002) Neprol Dial Transplant 17(11): 39-43). Følgelig deltar forskjellige cytokiner, for eksempel inflammatoriske cytokiner og cytokiner forbundet med betennelse, i mange aspekter ved patogenesen for anemi forbundet med kronisk sykdom, innbefattet inhibering av erytroide forløperceller, inhibering av EPO-dannelse og svekket frigjøring og tilgjengelighet av jern for erytropoiesen.

Det foreligger således et behov innen faget for fremgangsmåter for behandling eller forebygging av anemi forbundet med kronisk sykdom. Det foreligger et behov innen faget for fremgangsmåter som kan overvinne manglende ved dagens anvendelse av rekombinant EPO for behandling av anemi forbundet med kronisk sykdom.

Nærmere bestemt foreligger det et behov for fremgangsmåter og forbindelser som effektivt kan overvinne den undertrykke EPO-dannelsen og reduserte EPO-respons som er forbundet med anemi forbundet med kronisk sykdom, for fremgangsmåter og forbindelser som effektivt forbedrer reguleringen av jernmetabolismen og overvinner mangler forbundet med endret eller unormal jernmetabolisme og jernanvendelse og for fremgangsmåter og forbindelser som effektivt forsterker den totale eller komplette erytropoiese ved å forbedre de metabolske reaksjonsveiene som er forbundet med EPO-dannelse, EPO-respons og signalisering, tilgjengelighet på jern, utnyttelse av jern, opptak, transport, prosessering av jern, osv. Det foreligger et behov innen faget for fremgangsmåter som kan overvinne eller lindre følgene av cytokininduserte virkninger i individer med anemi forbundet med kronisk sykdom.

Jernmangel er en av de vanligste næringsmiddelmanglene verden over og er globalt sett den viktigste årsaken til anemi. Jernbalansen reguleres i bunn og grunn ved erytropoiesehastigheten og jernlagrenes størrelse. Jernmangel kan opptre med eller uten anemi og har blitt koblet til svekket kognitiv utvikling.

Jernmangel er definert som utilstrekkelig tilførsel av jern (nivå eller lagere) eller som utilstrekkelig tilgjengelighet eller utnyttelse av jern i kroppen. Dette kan skyldes mangler i kostholdet, for eksempel mangel på jern i kosten; sviktende absorpsjon av jern, for eksempel grunnet kirurgisk behandling (post-gastrektomi) eller sykdom (Crohn sykdom); eller en utarming av jernlageret eller forhøyet jerntap grunnet kronisk eller akutt blodtap som følge av skader eller traumer, menstruasjon, bloddonasjon, flebotomi (så som grunnet forskjellige former for medisinsk behandling eller kirurgiske inngrep); grunnet forhøyet behov for jern, for eksempel grunnet hurtig vekst i barndom eller ungdom, graviditet, erytropoietinbehandling, osv.

Jernmangel kan også være funksjonell jernmangel, for eksempel jernmangel grunnet pasientens manglende evne til å få tilgang til og utnytte kroppens jernlagere. Jern er ikke tilgjengelig i den grad som er nødvendig for å tillate normal hemoglobinisering av erytrocytter, noe som fører til redusert retikulocyttinnhold og redusert hemoglobininnhold i erytrocyttene. Funksjonell jernmangel observeres ofte hos friske individer med tilsynelatende normale, eller til og med forhøyede jernlagere, men med svekket tilgjengelighet av jern, målt for eksempel ved et lavt nivå for prosent transferrinmetning. Denne typen jernmangel er ofte forbundet med akutt eller kronisk betennelse.

Jernmangel av alle slag kan føre til jernmanglende eller jernbegrenset erytropoiese, hvori antallet røde blodceller avtar og de røde blodcellene i sirkulasjonen er mindre enn normalt (mikrocyttiske) og mangler tilstrekkelig hemoglobin og følgelig har lys farge (de er hypokrome).

Individer med jernmangel, innbefattet funksjonell jernmangel, kan utvikle svekket hemoglobinsyntese, redusert % mettet transferrin og redusert nivå av hemoglobin og hematokritt, noe som fører til jernmangelanemi. Jernmangelanemi er den hyppigst forekommende anemi i verden. Jern er en nødvendig bestanddel av hemoglobin; uten jern er beinmargen ute av stand til en effektiv hemoglobindannelse.

Jernmangelanemi kan opptre hos individer med utarmet eller svekket jerntilførsel og kan opptre hos individer med funksjonell jernmangel hvor jern foreligger i lagrene, men ikke er tilgjengelig for for eksempel hemoglobindannelse.

I lys av hva som er nevnt ovenfor, foreligger det et behov innen faget for fremgangsmåter for behandling eller forebygging av lidelser forbundet med jernmetabolisme og et behov innen faget for fremgangsmåter for å forsterke jernmetabolismen. Det foreligger et behov for fremgangsmåter for behandling eller forebygging av jernmangel innbefattet funksjonell jernmangel, og for behandling eller forebygging av tilstander forbundet med jernmangel så som mikrocytose og jernmangelanemi.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter og forbindelser for forsterking av de metabolske og fysiologiske reaksjonsveiene som bidrar til fullstendig og effektiv erytropoiese, og nærmere bestemt for behandling av anemi forbundet med kronisk sykdom. Fremgangsmåter og forbindelser for å overvinne de undertrykkende/inhibitoriske virkningene av inflammatoriske cytokiner på EPO-dannelsen og EPO-responsen tilveiebringes også. I tillegg tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen fremgangsmåter og forbindelser for forbedring av jernmetabolismen og for behandling eller forebygging av tilstander forbundet med svekket jernmetabolisme så som jernmangel, innbefattet funksjonell jernmangel, jernmangelanemi, mikrocytose, jerndefisient erytropoiese, osv.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelsen gjelder fremgangsmåter og forbindelser for induksjon av forbedret eller fullstendig erytropoiese i et individ. Nærmere bestemt omfatter fremgangsmåtene å indusere forbedret eller fullstendig erytropoiese ved å stabilisere HIF α i et individ. Fremgangsmåter for induksjon av forbedret erytropoiese ved å inhibere HIF prolylhydroksylase omfattes spesielt. I spesifikke utførelser omfatter fremgangsmåtene administrering til et subjekt av en forbindelse ifølge oppfinnelsen. I forskjellige utførelser kan subjektet være en celle, et vev, et organ, et organsystem eller en hel organisme.

Subjektet er, i forskjellige utførelser, en celle, et vev, et organ, et organsystem eller en hel organisme. I visse utførelser er organismen et pattedyr, fortrinnsvis et menneske.

I ett aspekt økter fremgangsmåten dannelsen av faktorer som er nødvendige for differensiering av erytrocytter fra hematopoietiske forløperceller innbefattet for eksempel hematopoietiske stamceller (HSC), CFU-GEMM (kolonidannende enhet granulocytt/erytroid/monocytt/megakaryocytt) -celler, osv. Faktorer som stimulerer erytropoiesen omfatter, men er ikke begrenset til, erytropoietin. I et annet aspekt øker fremgangsmåtene dannelsen av faktorer som er nødvendige for opptak, transport og anvendelse av jern. Slike faktorer omfatter, men er ikke begrenset til, erytroid aminolevulinatsyntase, transferrin, transferrinreseptor, ceruloplasmin, osv. I nok et aspekt øker fremgangsmåten mengden av faktorer som er nødvendige for differensiering av erytrocytter og i tillegg faktorer som er nødvendige for opptak, transport og anvendelse av jern.

I en annen utførelse øker fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen hematopoietiske forløpercellers respons på erytropoietin. Som beskrevet ovenfor, omfatter slike forløpere HSC; CFU-GEMM, osv. Forløpercellenes respons kan forsterkes ved for eksempel å endre ekspresjonen av erytropoietinreseptorer, intracellulære faktorer som deltar i erytropoietinsignalisering og utskilte faktorer som letter interaksjonen mellom erytropoietin og reseptorene.

I et annet aspekt kan fremgangsmåtene anvendes for å overvinne inhibering av erytropoiesen indusert ved inflammatoriske cytokiner så som tumornekrosefaktor- α (TNF- α), interleukin 1 β (IL-1 β) og lignende. I visse aspekter kan fremgangsmåtene anvendes for behandling av anemi som ikke lar seg behandle med eksogent tilført erytropoietin. Slik anemi kan for eksempel skyldes kroniske betennelseslidelser eller autoimmune lidelser innbefattet, men ikke begrenset til, kronisk bakteriell endokarditt, osteomyelitt, revmatoid artritt, giktfeber, Crohns sykdom og ulcerøs kolitt.

I visse utførelser kan fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen anvendes for behandling av anemi forbundet med kronisk sykdom. Fremgangsmåter for induksjon av forbedret eller fullstendig erytropoiese i pasienter med anemi forbundet med kronisk sykdom tilveiebringes spesielt. I visse utførelser øker fremgangsmåtene mengden av jern som er tilgjengelig for dannelse av nye røde blodceller.

I et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen fremgangsmåter for å forsterke beinmargens EPO-respons.

Fremgangsmåter for inhibering av TNF α-undertrykking av EPO tilveiebringes spesielt, likeså fremgangsmåter for inhibering av IL-1 β-undertrykking av EPO.

Den foreliggende oppfinnelsen gjelder fremgangsmåter for behandling/forebygging av anemi forbundet med kronisk sykdom og fremgangsmåter for regulering av prosessering av jern og behandling/forebygging av tilstander forbundet med jernmangel og/eller svikt i jernprosessering.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av anemi forbundet med kronisk sykdom i et individ, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfa-underenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF) slik at anemi forbundet med kronisk sykdom behandles i individet. Fremgangsmåter for å oppnå spesifikke fysiologiske virkninger i et individ med anemi forbundet med kronisk sykdom tilveiebringes også; nærmere bestemt fremgangsmåter for å øke antallet retikulocytter, økt det gjennomsnittlige blodcellevolumet, øke den gjennomsnittlige mengde av hemoglobin i blodcellene, øke hematokritt, øke hemoglobinkonsentrasjonen og øke antallet røde blodceller, osv., i det individ med anemi forbundet med kronisk sykdom, hvor hver av disse fremgangsmåtene omfatter administrering til et individ av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfa-underenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF), hvorved den ønskede fysiologiske virkningen oppnås. I forskjellige aspekter er anemien forbundet med kronisk forbundet med for eksempel betennelse, autoimmun sykdom, jernmangel, mikrocytose, kreftsykdom, osv.

I forskjellige utførelser er subjektet en celle, et vev eller et organ. I andre utførelser er subjektet et dyr, fortrinnsvis et pattedyr, mest foretrukket et menneske. Dersom subjektet er en celle, omfatter oppfinnelsen spesielt at cellen kan være en isolert celle, enten en prokaryot eller en eukaryot celle. Dersom subjektet er et vev, omfatter oppfinnelsen spesielt både endogene vev og in vitro vev, for eksempel vev dyrket i kultur. I foretrukne utførelser er subjektet et dyr, fortrinnsvis et dyr fra en pattedyrart, innbefattet rotte, kanin, storfe, sau, gris, mus, hest og primatarter. I en mest foretrukket utførelse er subjektet et menneske.

Stabilisering av HIF α kan oppnås ved en hvilken som helst av fremgangsmåtene som er tilgjengelige for og kjente blant fagfolk og kan omfatte anvendelse av ethvert middel som interagerer med, bindes til eller modifiserer HIF α eller faktorer som interagerer med HIF α, innbefattet for eksempel enzymer som HIF α er et substrat for. I visse aspekter omfatter den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringelse av en konstitutivt stabil HIF α-variant, for eksempel stabile HIF-muteiner, osv., eller et polynukleotid som koder for en slik variant. I andre aspekter omfatter den foreliggende oppfinnelsen at stabilisering av HIF α omfatter administrering av et middel som stabiliserer HIF α. Middelet kan bestå av polynukleotider, for eksempel antisenssekvenser; polypeptider; antistoffer; andre proteiner; karbohydrater; fett; lipider; og organiske og uorganiske forbindelser, for eksempel små molekyler, osv. I en foretrukket utførelse omfatter den foreliggende oppfinnelsen stabilisering av HIF α, for eksempel i et subjekt, ved å administrere til subjektet et middel som stabiliserer HIF α, hvor middelet er en forbindelse, for eksempel en lavmolekylær forbindelse eller lignende som stabiliserer HIF α.

I forskjellige aspekter er HIF α HIF1 α, HIF2 α eller HIF3 α. I et foretrukket aspekt omfatter stabilisering av HIF α administrering til subjektet en effektiv mengde av en forbindelse som inhiberer HIF-hydroksylaseaktivitet. I visse aspekter er HIF-hydroksylase utvalgt fra gruppen som består av EGLN1, EGLN2 og EGLN3.

I en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å øke det gjennomsnittlige blodcellevolumet i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). I nok en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å øke det gjennomsnittlige hemoglobinnivået i blodcellene hos et individ, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). I en annen utførelse omfatter den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for reduksjon av mikrocytose hos et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF).

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av mikrocyttisk anemi, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiindusert faktor (HIF).

I ett aspekt gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av en tilstand forbundet med jernmangel i et subjekt hvor fremgangsmåten omfatter administrering til subjektet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). I et spesielt aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å forbedre jernprosesseringen i et subjekt hvor fremgangsmåten omfatter administrering til subjektet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). En fremgangsmåte for behandling eller forebygging av en tilstand forbundet med svekket tilgjengelighet på jern i et subjekt tilveiebringes også, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til subjektet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF).

I andre utførelser gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for å overvinne cytokininduserte virkninger i et subjekt. Nærmere bestemt tilveiebringer oppfinnelsen i ett aspekt en fremgangsmåte for å overvinne cytokinundertrykking av EPO-dannelsen i et subjekt, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til subjektet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å overvinne cytokinundertrykking av tilgjengeligheten av jern i et individ, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). I et annet aspekt omfatter den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av cytokinassosiert anemi i et individ, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). Fremgangsmåter for å øke EPO-dannelsen i nærvær av et cytokin i et subjekt, hvor fremgangsmåtene omfatter administrering til subjektet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF) tilveiebringes også. I spesifikke utførelser er cytokinet utvalgt fra gruppen som består av TNF- α og IL-1 β.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for reduksjon av en cytokininduserte VCAM-ekspresjonen i et subjekt, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til subjektet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). I et spesifikt aspekt er cytokinet TNF- α eller IL-1 β. I ett aspekt gjelder fremgangsmåten reduksjon av cytokinindusert VCAM-ekspresjon i endotelceller i et individ. I et annet aspekt har individet en tilstand utvalgt fra gruppen som består av en betennelsessykdom, en autoimmun sykdom og anemi forbundet med kronisk sykdom.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for reduksjon av cytokinindusert E-selektinekspresjon i et subjekt, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til subjektet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor. I ett spesifikt aspekt er cytokinet TNF- α eller IL-1 β. I ett aspekt gjelder fremgangsmåten reduksjon av cytokinindusert E-selektinekspresjon i endotelceller i et individ. I et annet aspekt har individet en tilstand utvalgt fra gruppen som består av betennelsessykdom, autoimmun sykdom og anemi forbundet med kronisk sykdom.

Oppfinnelsen tilveiebringer forskjellige fremgangsmåter for å regulere/forsterke prosessering og metabolisme av jern. I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å forhøye transport, opptak, anvendelse og absorpsjon av jern i et subjekt, hvor hver av disse fremgangsmåtene omfatter administrering til subjektet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). I spesielle utførelser tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å forhøye transferrinekspresjon, transferrinreseptorekspresjon, IRP-2-ekspresjon, ferritinekspresjon, ceruloplasminekspresjon, NRAMP2-ekspresjon, sproutinekspresjon og ALAS-2-ekpsresjon i et subjekt hvor hver av disse fremgangsmåtene omfatter administrering til subjektet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). I andre utførelser tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å redusere hepcidinekspresjon, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til subjektet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). Fremgangsmåter for å forhøye hemesyntesen i et subjekt ved å administrere subjektet en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF) tilveiebringes også.

I visse aspekter omfatter oppfinnelsen fremgangsmåter for å forhøye jernnivået i serum, forhøye transferrinmetningen, forhøye nivået av løselig transferrinreseptor og forhøye ferritinnivåer i serum hos et individ hvor fremgangsmåtene omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF). I nok et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å forhøye jerntransporten til beinmarg i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer alfaunderenheten av hypoksiinduserbar faktor (HIF).

I ett aspekt benyttes de foreliggende fremgangsmåtene for behandling av eller fremstilling av et medikament for et subjekt, fortrinnsvis et menneske, som har en av lidelsene eller tilstandene som diskuteres heri. Det bør forstås at forskjellige parametere forbundet med kliniske tilstander varierer avhengig av alder, kjønn, osv. I ett aspekt har individet et ferritinnivå i serum som ligger under normalområdet, for eksempel under 50-200 μg/l; således kan et individ med et ferritinnivå i serum som er under 200 ng/ml, under 150 ng/ml, under 100 ng/ml, under 75 ng/ml og under 50 ng/ml være et egnet individ for behandling med fremgangsmåtene eller anvendelse av medikamentene som tilveiebringes av den foreliggende oppfinnelsen. Alternativt kan et egnet individ påvises ved å påvise en total jernbindende kapasitet (TIBC) som ligger under normalområdet, for eksempel mindre enn TIBC 300-360 μg/dl.

I en annen utførelse har individet et jernnivå i serum som ligger under normalområdet, for eksempel under et jernnivå i serum på 50-150 μg/dl. Andre egnede parametere for påvisning av egnede individer omfatter målinger av transferrinmetning på under 30-50%, måling av et sideroblastnivå i beinmarg på under 40-60% og et hemoglobinnivå på under tilnærmet 10 til 11 g/dl. Hvilke som helst av de ovenfor beskrevne parametere måles, for eksempel som i standard hematologiske analyser, kjemisk blodanalyser og analyse av komplett blodtall (CBC), typisk presentert som en måling av flere blodparametere og for eksempel erholdt ved analyse av blod i et automatisk instrument som for eksempel måler det totale antallet røde blodceller, det totale antallet hvite blodceller, blodplatetallet og den relative andelen røde blodceller. Målingen kan utføres ved ethvert standardmiddel for måling av hematologisk og/eller biokjemisk blodanalyse, innbefattet for eksempel automatiske systemer så som CELL DYN 4000-analyseapparatet (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), Coulter GenS-analyseapparatet (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) eller ADVIA 120-analyseapparatet fra Bayer (Bayer Healthcare AG, Leverkusen, Tyskland), osv.

I ett aspekt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av jernmangel i et subjekt, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α, hvorved jernmangel i subjektet behandles eller forebygges. I ytterligere aspekter er jernmangelen en funksjonell jernmangel; den er forbundet med anemi; den er forbundet med en lidelse utvalgt fra gruppen som består av en betennelse, en infeksjon, en immunsviktlidelse og en neoplastisk lidelse; eller den er forbundet med en lidelse utvalgt fra gruppen som består av anemi forbundet med kronisk sykdom, jernmangelanemi (IDA) og mikrocyttisk anemi.

Et individ ifølge oppfinnelsen kan være et individ med enhver klinisk akseptert standardmåling som tyder på jernmangel eller risiko for utvikling av jernmangel. I visse utførelser har for eksempel individet et lavt ferritinnivå i serum (<30 ng/ml) eller redusert % transferrinmetning, for eksempel mindre enn 16% (for voksne). Ferritinniåver i serum som er under 50 ng/ml, under 40 ng/ml, under 30 ng/ml og under 20 ng/ml omfattes spesifikt. Det bør bemerkes at dersom et individ har eller er utsatt for å utvikle en jernmangel som er funksjonell jernmangel, kan ferritinnivået i serum være høyere enn normalområdet, for eksempel 200 ng/ml og høyere. Jernmangel kan observeres ved forekomst av jernbegrenset/jernsviktende erytropoiese (svekket hemoglobinsyntese, typisk observert dersom % transferrinmetning ligger under 15 til 20%). Disse jernparametrene kan måles ved anvendelse av enhver standard CBC-analyse eller biokjemisk analyse som er beskrevet ovenfor og/eller ved anvendelse av automatiske innretninger som mer spesifikt er rettet mot jernanalyse, for eksempel settene Unimate 5 Iron og Unimate 7 UIBC (Roche, Sveits).

Et individ som kan dra nytte av de foreliggende fremgangsmåtene for behandling eller forebygging kan være et individ som har eller er utsatt for å få jernmangelanemi, for eksempel et individ med en transferrinmetningsprosent på 10-15% eller under 10%.

I ett aspekt vil individet som har eller er utsatt for å få jernmangel ha eller være utsatt for å få funksjonell jernmangel. Et hemoglobininnhold i retikulocyttene på mindre enn 28 pikogram/celle vil indikere en slik tilstand. I et annet aspekt viser individet som har eller er utsatt for å få funksjonell jernmangel mer enn 5% hypokrome røde blodceller.

I visse utførelser er individet et individ som har eller som er utsatt for å få anemi forbundet med kronisk sykdom. Et slikt individ kan vise en mild eller moderat anemi, for eksempel et hemoglobinnivå på omkring 10-13 g/dl, nærmere bestemt 10-11 g/dl. I andre utførelser viser individet en mer akutt anemi, for eksempel et hemoglobinnivå som er under 10 g/dl innbefattet et nivå under 5 g/dl og nivåer under 3 g/dl. I noen utførelser viser individet som har eller er utsatt for å få anemi forbundet med kronisk sykdom unormaliteter i jernfordelingen. Slike unormaliteter kan for eksempel være et jernnivå i serum som er under omkring 60 μg/dl eller et ferritinnivå i serum som er over det normale området, for eksempel over 200 ng/ml, over 300 ng/ml eller over 400 ng/ml.

I visse aspekter kan individet ha eller være utsatt for å få mikrocytisk anemi. Et slikt individ kan for eksempel vise et gjennomsnittlig blodcellevolum på mindre enn 80 femtoliter, for eksempel målt som del av en fullstendig blodtallsanalyse. I andre aspekter har individet et gjennomsnittlig blodcellevolum som er mindre enn den normale verdien på 90 /- 8 femtoliter. Individet kan i forskjellige aspekter ha et redusert gjennomsnittlig cellulært hemoglobinnivå, for eksempel et gjennomsnittlig cellulært hemoglobinnivå på mindre enn 30 /- 3 pikogram hemoglobin/celle; eller en redusert gjennomsnittlig cellulær hemoglobinkonsentrasjon, for eksempel en gjennomsnittlig cellulær hemoglobinkonsentrasjon som er mindre enn 33 /- 2%.

En fremgangsmåte for behandling eller forebygging av funksjonell jernmangel i et individ som omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α, hvorved funksjonell jernmangel behandles eller forebygge, tilveiebringes også.

I en utførelse tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for regulering eller forsterking av jernmetabolismen eller en metabolsk prosess som omfatter jern i et individ, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α, hvorved jernmetabolismen eller prosessen som er forbundet med jernmetabolisme reguleres eller forsterkes i individet. I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for regulering eller forsterking av en prosess som inngår i jernmetabolismen utvalgt fra gruppen som består av jernopptak, jernabsorpsjon, jerntransport, jernlagring, jernprosessering, jernmobilisering og jernutnyttelse, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α, hvorved prosessen forbundet med jernmetabolismen reguleres eller forsterkes i individet.

En fremgangsmåte for å forhøye jernabsorpsjonen i et individ, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α og derved forhøyer jernabsorpsjonen i individet, tilveiebringes også heri. I visse aspekter er jernabsorpsjonen i tarmen; absorpsjonen er av jern i kosten; eller den skjer i enterocytter i tolvfingertarmen.

De følgende fremgangsmåtene omfattes også heri: En fremgangsmåte for å forsterke jerntransporten i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α og derved gir forhøyet jerntransport i individet; en fremgangsmåte for å øke jernlagrene i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α og derved øker jernlagringen i individet; en fremgangsmåte for å øke jernopptaket i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α og derved gir økt jernopptak i individet; en fremgangsmåte for å forhøye jernprosesseringen i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α og derved gir forhøyet jernprosessering i individet; en fremgangsmåte for forhøyet jernmobilisering i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α og derved gir forhøyet jernmobilisering i individet; og en fremgangsmåte for å forhøye jernutnyttelsen i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α og derved gir forhøyet jernutnyttelse i individet.

I en utførelse omfatter oppfinnelsen er fremgangsmåte for å forhøye tilgangen på jern for erytropoiese i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α og derved gir forhøyet tilgang på jern for erytropoiese i individet. I forskjellige utførelser er den forhøyede tilgangen på jern for erytropoiese en forhøyet tilgang på jern for hemesyntese; en forhøyet tilgang på jern for hemoglobinproduksjon; eller en forhøyet tilgang på jern for dannelse av røde blodceller.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre fremgangsmåter for regulering av ekspresjonen av jernregulerende faktorer i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α og derved regulerer ekspresjonen av metabolske faktorer for jern i individet.

Fremgangsmåter for å forhøye ekspresjonen av visse jernregulerende faktorer omfattes heri, innbefattet: En fremgangsmåte for å forhøye transferrinreseptorekspresjonen i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at ekspresjonen av transferrinekspresjonen forhøyes i individet; en fremgangsmåte for å forhøye transferrinekspresjonen i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at transferrinekspresjonen forhøyes i individet; en fremgangsmåte for forhøye ceruloplasminekspresjonen i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at ceruloplasminekspresjonen forhøyes i individet; en fremgangsmåte for å forhøye NRAMP2 (slc11a2) -ekspresjonen i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at NRAMP2-ekspresjonen forhøyes i individet; en fremgangsmåte for å forhøye ekspresjonen av cytokrom b reduktase 1 i tolvfingertarmen i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at ekspresjonen av cytokrom b reduktase 1 i individets tolvfingertarm forhøyes; og en fremgangsmåte for å forhøye 5-aminolevulinatsyntaseekspresjonen i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at 5-aminolevulinatsyntaseekspresjonen i individet forhøyes.

I en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å øke jerninnholdet i serum hos et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α og derved forhøyer jerninnholdt i individets serum. I visse utførelser er individet et menneske og jernnivået i serum forhøyes til en verdi på mellom 50 og 150 μg/dl.

I et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen fremgangsmåter for å forhøye den totale jernbindende kapasiteten (TIBC) i et individ. Fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at TIBC forhøyes i individet. I et foretrukket aspekt er individet et menneske og den totale jernbindende kapasiteten forhøyes til en verdi på mellom 300 og 360 μg/dl.

Fremgangsmåter og forbindelser for modulering av ferritinnivået i serum hos et individ tilveiebringes. I en spesiell utførelse er individet et menneske og ferritinnivået i serum forhøyes til over 15 μg/l. I en videre utførelse er individet en voksen mann og ferritinnivået i serum forhøyes til en verdi på omtrent 100 μg/l. I en annen utførelse er individet en voksen kvinne og ferritinnivået i serum forhøyes til et nivå på omtrent 30 μg/l.

I ett aspekt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å forhøye transferrinmetningen i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at transferrinmetningen forhøyes i individet. I ett aspekt forhøyes transferrinmetningen til over et nivå utvalgt fra gruppen som består av 10%, 15%, 20%, 30%, 40% og 50%. Den foreliggende oppfinnelsen omfatter fremgangsmåter for å øke prosent transferrinmetning i et individ. I en utførelse er individet et menneske og prosent transferrinmetning økes til en verdi på over 18%. I en annen utførelse økes prosent transferrinmetning til en verdi på mellom 25 og 50%. Prosent transferrin beregnes typisk ved anvendelse av formelen: (jern i serum)(100)/(TIBC).

Fremgangsmåter for å forhøye nivået av løselig transferrinreseptor i et individ hvor fremgangsmåtene omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at nivået av løselig transferrinreseptor i individet forhøyes, tilveiebringes også. Oppfinnelsen tilveiebringer videre fremgangsmåter for å forhøye den totale erytroide beinmargsmassen, målt for eksempel som nivået av transferrinreseptor i serum. I ett aspekt er individet et menneske og transferrinreseptornivået i serum forhøyes til fra 4 til 9 μg/l, målt ved en immunanalyse.

En fremgangsmåte for å redusere hepcidinekspresjonen i et individ tilveiebringes, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at hepcidinekspresjonen i individet reduseres.

I en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av en lidelse forbundet med jernmangel i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α, hvorved lidelsen som er forbundet med jernmangel i individet behandles eller forebygges. I en utførelse er jernmangelen funksjonell jernmangel. I forskjellige utførelser er lidelsen utvalgt fra gruppen som består av en betennelse, en inflammasjon, en immunsviktlidelse og en neoplastisk lidelse; eller den er utvalgt fra gruppen som består av anemi forbundet med kronisk sykdom, jernmangelanemi og mikrocyttisk anemi.

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å forsterke erytropoiesen i et individ som har eller er utsatt for å få jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at erytropoiesen i individet forsterkes. I et bestemt aspekt omfattes det at jernmangelen er funksjonell jernmangel.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å forsterke erytropoiesen i et individ hvori individet har eller er utsatt for å få funksjonell jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at erytropoiesen i individet forsterkes. I forskjellige aspekter er den kroniske sykdommen utvalgt fra gruppen som består av en betennelse, en infeksjon, en immunsviktlidelse og en neoplastisk lidelse.

En fremgangsmåte for forsterking av erytropoiesen i et individ hvor individet har eller er utsatt for å få anemi forbundet med kronisk sykdom, tilveiebringes også, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at erytropoiesen i individet forsterkes.

I en utførelse omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å forsterke erytropoiesen i et individ hvori individet ikke reagerer på EPO-behandling hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at erytropoiesen i individet forsterkes.

En fremgangsmåte for behandling eller forebygging av anemi forbundet med kronisk sykdom i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at anemi forbundet med kronisk sykdom behandles eller forebygges i individet, tilveiebringes også. Det omfattes i forskjellige aspekter at anemien forbundet med kronisk sykdom er forbundet med en tilstand utvalgt fra gruppen som består av en betennelse, en infeksjon, en immunsviktlidelse og en neoplastisk lidelse.

Oppfinnelsen omfatter spesifikt følgende: En fremgangsmåte for å forhøye retikulocyttinnholdet i et individ med en kronisk sykdom hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at retikulocyttnivået i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye hematokritten i et individ med en kronisk sykdom hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at individets hematokritt forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye hemoglobininnholdet i et individ med en kronisk sykdom hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at hemoglobininnholdt i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye antallet røde blodceller i et individ med en kronisk sykdom hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at antallet røde blodceller i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye det gjennomsnittlige blodcellevolumet i et individ med en kronisk sykdom hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at det gjennomsnittlige blodcellevolumet i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye den gjennomsnittlige hemoglobinmengden i blodcellene hos et individ med en kronisk sykdom hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at den gjennomsnittlige hemoglobinmengden i individets blodceller forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye jernkonsentrasjonen i serum i et individ med en kronisk sykdom hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at jernkonsentrasjonen i individets serum forhøyes; og en fremgangsmåte for å forhøye transferrinmetningen i et individ med en kronisk sykdom hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at transferrinmetningen i individet forhøyes. I alle disse fremgangsmåtene er den kroniske sykdommen i visse utførelser utvalgt fra gruppen som består av en betennelse, en infeksjon, en immunsviktlidelse og en neoplastisk lidelse; eller den er utvalgt fra gruppen som består av anemi forbundet med kronisk sykdom, anemi forbundet med jernmangel, jernmangel, funksjonell jernmangel og mikrocyttisk anemi.

Følgende fremgangsmåter tilveiebringes også: En fremgangsmåte for å forhøye retikulocyttnivået i et individ med jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at retikulocyttnivået i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye hematokritten i et individ med jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at hematokritt i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye hemoglobinnivået i et individ med jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at hemoglobinnivået i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å øke antallet røde blodceller i et individ med jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at antallet røde blodceller i individet i individet økes; en fremgangsmåte for å øke det gjennomsnittlige blodcellevolumet i et individ med jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at det gjennomsnittlige blodcellevolumet i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å øke det gjennomsnittlige hemoglobininnholdet i blodcellene hos et individ med jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at det gjennomsnittlige hemoglobinnivået i individets blodceller forhøyes; en fremgangsmåte for å øke jernkonsentrasjonen i serum hos et individ med jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at jernkonsentrasjonen i individets serum forhøyes; og en fremgangsmåte for å forhøye transferrinmetningen i et individ med jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at transferrinmetningen i individet forhøyes. I alle disse fremgangsmåtene er jernmangelen i visse utførelser en funksjonell jernmangel.

Følgende fremgangsmåter omfattes også: En fremgangsmåte for å forhøye retikulocyttnivået i et individ med funksjonell jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at retikulocyttnivået i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye hematokritten i et individ med funksjonell jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at hematokritt i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye hemoglobinnivået i et individ med funksjonell jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at hemoglobinnivået i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å øke antallet røde blodceller i et individ med funksjonell jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at antallet røde blodceller øker i individet; en fremgangsmåte for å forhøye det gjennomsnittlige blodcellevolumet i et individ med funksjonell jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at det gjennomsnittlige blodcellevolumet i individet forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye det gjennomsnittlige hemoglobinnivået i blodcellene hos et individ med funksjonell jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at det gjennomsnittlige hemoglobinnivået i individets blodceller forhøyes; en fremgangsmåte for å forhøye jernkonsentrasjonen i serum hos et individ med funksjonell jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at jernkonsentrasjonen i individets serum forhøyes; og en fremgangsmåte for å forhøye transferrinmetningen i et individ med funksjonell jernmangel hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at transferrinmetningen i individet forhøyes.

I ett aspekt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å overvinne eller lindre følgene av en cytokinindusert svekkelse av erytropoiesen i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at følgene av den cytokininduserte svekkelsen av erytropoiesen i individet overvinnes eller lindres. I visse aspekter er den cytokininduserte svekkelsen av erytropoiesen undertrykkelse av EPO-produksjonen eller svekket jernmetabolisme. I en hvilken som helst av de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene er cytokinet et inflammatorisk cytokin. I andre utførelser er cytokinet utvalgt fra gruppen som består av TNF- α, IL-1 β og IFN- γ.

Fremgangsmåter for å redusere cytokininduksjon av VCAM-1-ekspresjon og/eller E-selektinekspresjon tilveiebringes også hvor fremgangsmåten omfatter administrering til et individ med behov for dette av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at cytokininduksjon av VCAM-1-ekspresjon og/eller E-selektinekspresjon reduseres.

I en hvilken som helst av de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene er cytokinet et inflammatorisk cytokin. I andre utførelser er cytokinet utvalgt fra gruppen som består av TNF- α, IL-1 β og IFN- γ.

Fremgangsmåter for behandling eller forebygging av en lidelse forbundet med cytokinaktivitet i et individ hvor lidelsen er utvalgt fra gruppen som består av jernmangel, funksjonell jernmangel, jernmangelanemi, anemi forbundet med kronisk sykdom og mikrocyttisk anemi, tilveiebringes heri hvor fremgangsmåtene omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at lidelsen som er forbundet med cytokinaktivitet behandles eller forebygges. I en hvilken som helst av de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene er cytokinet et inflammatorisk cytokin. I ytterligere utførelser er cytokinet utvalgt fra gruppen som består av TNF- α, IL-1 β og IFN- γ.

Fremgangsmåter for behandling eller forebygging av en lidelse forbundet med cytokinaktivitet i et individ hvori lidelsen er forbundet med en tilstand utvalgt fra gruppen som består av en betennelse, en infeksjon, en immunsvikt og en neoplastisk lidelse, hvori fremgangsmåtene omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at lidelsen forbundet med cytokinaktivitet behandles eller forebygges, tilveiebringes også. I enhver av de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene er cytokinet et inflammatorisk cytokin. I ytterligere utførelser er cytokinet utvalgt fra gruppen som består av TNF- α, IL-1 β og IFN- γ.

I ett aspekt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å forhøye EPO-dannelsen i nærvær av et cytokin i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at EPO-dannelsen i individet forhøyes. En fremgangsmåte for behandling eller forebygging av mikrocytose i et individ hvor fremgangsmåten omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α slik at mikrocytose i individet behandles eller forebygges, tilveiebringes også heri. I ytterligere aspekter er mikrocytosen forbundet med en lidelse utvalgt fra gruppen som består av kronisk sykdom, anemi forbundet med kronisk sykdom, jernmangel, funksjonell jernmangel og anemi forbundet med jernmangel. I en hvilken som helst av de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene er cytokinet et inflammatorisk cytokin. I ytterligere utførelser er cytokinet utvalgt fra gruppen som består av TNF- α, IL-1 β og IFN- γ.

I en hvilken som helst av de foreliggende fremgangsmåtene for behandling eller forebygging omfattes det at en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan administreres som del av en kombinasjonsbehandling som i tillegg omfatter administrering av et annet terapeutisk middel, for eksempel EPO, jern og vitaminer, for eksempel B-vitaminer, osv.

Et sett som omfatter en forbindelse som stabiliserer HIF α og minst ett annet middel tilveiebringes heri. I ett aspekt tilveiebringes et tilleggsmiddel utvalgt fra gruppen som består av erytropoietin, jern og B-vitaminer, og likeså en farmasøytisk sammensetning som omfatter en forbindelse som stabiliserer HIF α og minst ett tilleggsmiddel utvalgt fra gruppen som består av erytropoietin, jern og B-vitaminer.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer forbindelser og fremgangsmåter for behandling eller forebygging av anemi forbundet med kronisk sykdom, hvori anemien forbundet med kronisk sykdom er forbundet med et forhøyet cytokinnivå. Nærmere bestemt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter og forbindelser for anvendelse til å overvinne eller lindre følgende av cytokininduserte virkninger i et individ med forhøyet cytokinnivå, for eksempel cytokinundertrykking av EPO-dannelse, cytokinindusert ekspresjon av forskjellige celleadhesjonsfaktorer, osv.

I en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter og forbindelser for å overvinne cytokinundertrykking av EPO-dannelse. Disse fremgangsmåtene og forbindelsene er anvendbare for å overvinne TNF α- og/eller IL-1 β-undertrykking av EPO-dannelse, målt ved for eksempel evnen til å overvinne TNF α- og/eller IL-1 βundertrykking av EPO-dannelse i dyrkede Hep3B-celler.

I en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter og forbindelser for reduksjon av cytokinindusert forhøyelse av ekspresjonen av forskjellige celleadhesjonsfaktorer. Fremgangsmåtene og forbindelsene kan anvendes for å overvinne TNF α-, IL-1 β- og IFN- γ-indusert økning av ekspresjonen av adhesjonsfaktorer, for eksempel VCAM-1 og E-selektin, i endotelceller målt ved for eksempel en reduksjon av ekspresjonsnivået for VCAM-1 eller E-selektin i endotelceller (HUVEC, osv).

Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter og forbindelser for behandling eller forebygging av jernmangel i et individ. Nærmere bestemt kan de foreliggende fremgangsmåter og forbindelser anvendes for å forsterke jernmetabolismen eller behandle eller forebygge sykdommer og lidelser forbundet med svekket jernmetabolisme, for eksempel svekket opptak, lagring, prosessering, transport, mobilisering og utnyttelse av jern, osv.

I ett aspekt modulerer fremgangsmåtene og forbindelsene ekspresjonen av faktorer som deltar i jernmetabolismen, for eksempel transport, utnyttelse, lagring, osv. Fremgangsmåtene og forbindelsene øker for eksempel ekspresjonen av transferrinreseptor målt ved for eksempel forhøyet ekspresjon av transferrinreseptor i leverceller (for eksempel Hep3B, HepG2), nyreceller (for eksempel HK-2) eller lymfocytter (for eksempel THP-1), eller ved forhøyet nivå av løselig transferrinreseptor i mennesker. De foreliggende fremgangsmåtene og forbindelsene forhøyer ceruloplasmingenekspresjonen målt ved for eksempel forhøyet genekspresjon i musenyreceller og i Hep3B-celler. I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter og forbindelser som reduserer hepcidingenekspresjonen, for eksempel målt ved redusert genekspresjon av hepcidin i muselever. I nok et aspekt anvendes fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen til å øke ekspresjonen av faktorer, innbefattet NRAMP2, cytokrom b reduktase 1 i tolvfingertarmen, osv., målt ved for eksempel forhøyet genekspresjon i musetarm. De foreliggende fremgangsmåtene og forbindelsene øker ekspresjonen av 5-aminolevulinatsyntase, det første enzymet i reaksjonsveien for syntese av heme og det hastighetsbegrensende enzymet for hemesyntese, målt ved for eksempel forhøyet genekspresjon i musetarm.

De foreliggende fremgangsmåtene og forbindelsene kan anvendes for å forsterke jernmetabolismen. Nærmere bestemt forsterker de foreliggende fremgangsmåter og forbindelser jernmetabolismen, målt ved for eksempel forhøyet jernnivå i serum, forhøyet prosentandel transferrinmetning og redusert mikrocytose i en rottemodell for svekket jernmetabolisme.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter og forbindelser for induksjon av forsterket erytropoiese. Nærmere bestemt forsterker de foreliggende fremgangsmåtene og forbindelsene erytropoiesen, målt ved for eksempel forhøyet retikulocyttall, hematokritt og antall røde blodceller i en rottemodell for svekket erytropoiese og i mennesker, eller målt ved for eksempel forhøyet hemoglobinnivå i en rottemodell for svekket erytropoiese.

De foreliggende fremgangsmåtene og forbindelsene reduserer mikrocytose målt ved for eksempel forhøyet gjennomsnittlig hemoglobinnivå i blodcellene og forhøyet gjennomsnittlig blodcellevolum i en rottemodell for svekket erytropoiese.

De foreliggende fremgangsmåtene omfatter administrering til et individ av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α. En slik stabilisering kan skje via for eksempel inhibering av HIF-hydroksylaseaktivitet. En foretrukket forbindelse ifølge oppfinnelsen er en forbindelse som inhiberer HIF-prolylhydroksylaseaktivitet. Inhiberingen kan være direkte eller indirekte, kompetitiv eller ikke-kompetitiv, osv. I forskjellige utførelser er en forbindelse ifølge oppfinnelsen utvalgt fra gruppen som består av 2-oksoglutaratlignende forbindelser, jerngelaterende forbindelser og prolinanaloger. I ett aspekt er en 2-oksoglutaratlignende forbindelse et heterosyklisk karbonylglysin med formel I, Ia eller Ib. I et annet aspekt er en jerngelaterende forbindelse en hydroksaminsyre med formel III. I spesielle utførelser som eksemplifisert heri, er forbindelsen forbindelse D.

Eksempler på forbindelser ifølge oppfinnelsen omfatter [(1-klor-4-hydroksyisokinolin-3-karbonyl)amino]eddiksyre (forbindelse A), [(4-hydroksy-7-fenoksyisokinolin-3-karbonyl)amino]eddiksyre (forbindelse B), [(4-hydroksy-7-fenylsulfanylisokinolin-3-karbonyl)amino]eddiksyre (forbindelse C) og 3-{[4-(3,3-dibenzylureido)benzensulfonyl]-[2-(4-metoksyfenyl)etyl]amino}-N-hydroksypropionamid (forbindelse D). Ytterligere forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen og fremgangsmåter for påvisning av andre forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen, tilveiebringes nedenfor.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figurene 1A og 1B beskriver resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen overvinner de undertrykkende virkningene av TNF- α på EPO-dannelse.

Figurene 2A og 2B viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen overvinner de undertrykkende virkningene av TNF- α på EPO-dannelse i celler som på forhånd er behandlet med TNF- α.

Figurene 3A og 3B viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen overvinner de undertrykkende virkningene av IL-1 β på EPO-dannelse.

Figurene 4A og 4B viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen overvinner de undertrykkende virkningene av IL-1 β på EPO-dannelse i celler som på forhånd er behandlet med IL-1 β.

Figur 5 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen reduserer VCAM-1-ekspresjonen som er forbundet med TNF- α.

Figurene 6A, 6B og 6C viser resultater som viser forhøyet ekspresjon av transferrinreseptor og jerntransportør (figur 6A), jerntransport tarmprotein (figur 6B) og 5-aminolevulinatsyntase (figur 6C) etter behandling av mus med forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Figur 7 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga et økt retikulocyttap i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 8 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga økt hematokritt i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 9 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga forhøyet hemoglobinnivå i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 10 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga et forhøyet antall røde blodceller i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 11 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga redusert mikrocytose i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 12 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga økt gjennomsnittlig hemoglobininnhold i blodceller og forbedret hypokromi i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 13 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga økt hematokritt i normale dyr og i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 14 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga forhøyet hemoglobinnivå i normale dyr og i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 15 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga et økt antall røde blodceller i normale dyr og i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 16 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga økt gjennomsnittlig blodcellevolum i normale dyr og i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 17 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga et forhøyet hemoglobinnivå i blodceller i normale dyr og i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figurene 18A og 18B viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga forhøyet jernnivå i serum (figur 18A) og transferrinmetning (figur 18B) i normale dyr og i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 19 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga forhøyet genekspresjon av NRAMP2 (slc112a) og sproutin (CYBRD1, duodenal cytokrom b reduktase 1) i normale dyr og i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom.

Figur 20 viser resultater som viser forhøyet antall retikulocytter etter administrering av en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen til friske mennesker.

Figur 21 viser resultater som viser forhøyet antall røde blodceller i friske mennesker administrert en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Figur 22 viser resultater som viser forhøyet nivå av løselig transferrinreseptor etter administrering av en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen til friske mennesker.

Figur 23 viser resultater som viser redusert ferritinnivå i serum hos friske mennesker administrert en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Figurene 24A og 24B viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen reduserte ekspresjonen av VCAM-1 og E-selektin forbundet med TNF- α.

Figur 25 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen reduserte VCAM-1-ekspresjonen forbundet med TNF- α og IL-1 β.

Figur 26 viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen reduserte E-selekinekspresjonen forbundet med TNF- α, IL-1 β og IFN- γ.

Figurene 27A og 27B viser resultater som viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen og IL-6 synergistisk ga et høyere EPO-nivå i hepatocytter.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Før de foreliggende sammensetninger og fremgangsmåter beskrives, bør det forstås at oppfinnelsen ikke er begrenset til de spesielle metodologiene, fremgangsmåtene, cellelinjene, analysene og reagensene som beskrives, da disse kan variere. Det bør også forstås at terminologien som anvendes heri benyttes for å beskrive spesielle utførelser av den foreliggende oppfinnelsen, og ikke på noen måte er ment å begrense omfanget av den foreliggende oppfinnelsen, som beskrevet i de vedlagte krav.

Det må bemerkes at som anvendt heri og i de vedlagte krav omfatter entallsformene "en" og "et" flere referanser, med mindre sammenhengen klart angir noe annet. Således omfatter for eksempel en henvisning til "et fragment" et stort antall slike fragmenter; en henvisning til "en forbindelse" er en henvisning til en av flere forbindelser og til ekvivalente forbindelser som beskrevet heri og som er kjent blant fagfolk, osv.

Med mindre annet er angitt, har alle tekniske og vitenskapelige begreper som anvendes heri den samme betydning som vanligvis benyttet av gjennomsnittsfagpersoner innen feltet som oppfinnelsen tilhører. Selv om alle fremgangsmåter og materialer som tilsvarer eller er ekvivalente med dem som beskrives heri kan anvendes ved utførelse eller utprøving av den foreliggende oppfinnelsen, er de foretrukne fremgangsmåter, innretninger og materialer nå beskrevet. Alle publikasjoner som siteres heri inkorporeres heri ved referanse i sin helhet for det formål å beskrive metodologiene, reagensene og verktøyene som er rapportert i de publikasjoner som kan anvendes i forbindelse med oppfinnelsen. Intet heri skal oppfattes som en innrømmelse av at oppfinnelsen ikke foregriper slike beskrivelser, grunnet tidligere oppdagelse.

Utførelsen av den foreliggende oppfinnelsen vil, dersom ikke annet er angitt, benytte konvensjonelle fremgangsmåter innen kjemi, biokjemi, molekylærbiologi, cellebiologi, genetikk, immunologi og farmakologi som ligger innen teknikkens stand. Slike teknikker er fullt ut forklart i litteraturen. Se for eksempel Gennaro, A.R., red. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, Mack Publishing Co.; Hardman, J.G., Limbird, L.E., og Gilman, A.G., red. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10. utgave, McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., red., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D.M., og Blackwell, C.C., red. (1986) Handbook of Experimental Immunology, bindene I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., red. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, bindene I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., red. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4. utgave, John Wiley & Sons; Ream et al., red. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C.R., og Graham, A., red. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2. utgave, Springer Verlag.

DEFINISJONER

Begrepet "anemi forbundet med kronisk sykdom" viser til enhver form for anemi som utvikles som en følge av for eksempel langvarig infeksjon, betennelse, neoplastiske lidelser, osv. Anemien som utvikles særpreges ofte ved en forkortet levetid for røde blodceller og sekvestrasjon av jern i makrofager, noe som fører til at en redusert mengde av jern er tilgjengelig for dannelse av nye røde blodceller. Tilstander forbundet med anemi forbundet med kronisk sykdom omfatter, men er ikke begrenset til, kronisk bakteriell endokarditt, osteomyelitt, revmatisk feber, ulcerøs kolitt og neoplastiske lidelser. Ytterligere tilstander omfatter andre sykdommer og lidelser forbundet med infeksjon, betennelse og neoplasi innbefattet for eksempel betennelsesinfeksjoner (for eksempel pulmonal abscess, tuberkulose, osteomyelitt, osv.), ikke infeksiøse betennelseslidelser (for eksempel revmatoid artritt, systemisk lupus erytrematose, Crohns sykdom, hepatitt, inflammatorisk tarmsykdom, osv.) og forskjellige kreftformer, tumorer og ondartede tilstander (for eksempel carcinom, sarkom, lymfom, osv).

Begrepene "lidelser" og "sykdommer" og "tilstander" benyttes om hverandre og viser til enhver tilstand som avviker fra det normale.

Begrepet "erytropoietin" viser til ethvert rekombinant eller naturlig forekommende erytropoietin innbefattet for eksempel humant erytropoietin (GenBank aksesjonsbetegnelse AAA52400; Lin et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 7580-7584), det humane rekombinante erytropoietinet EPOETIN (Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA), det humane rekombinante erytroropoietinet ARANESP (Amgen), det humane rekombinante erytropoietinet PROCRIT (Ortho Biotech Products, L.O., Raritan, NJ), osv.

Begrepet "HIF α" viser til alfaunderenheten av proteinet hypoksiindusert faktor. HIF α kan være ethvert humant protein eller et protein fra et annet pattedyr, eller et fragment derav, innbefattet humant HIF-1 α (Genbank aksesjonsbetegnelse Q16665), HIF-2 α (Genbank aksesjonsbetegnelse AAB41495) og HIF-3 α (Genbank aksesjonsbetegnelse AAD22668); muse-HIF-1 α (Genbank aksesjonsbetegnelse Q61221), -HIF-2 α (Genbank aksesjonsbetegnelse BAA20130 og AAB41496) og -HIF-3 α (Genbank aksesjonsbetegnelse AAC72734); rotte-HIF-1 α (Genbank aksesjonsbetegnelse CAA70701), -HIF-2 α (Genbank aksesjonsbetegnelse CAB96612) og -HIF-3 α (Genbank aksesjonsbetegnelse CAB96611); og HIF-1 α fra storfe (Genbank aksesjonsbetegnelse BAA78675). HIF α kan også være ethvert protein fra et ikke-pattedyr eller et fragment derav, innbefattet HIF-1 α fra Xenopus laevis (Genbank aksesjonsbetegnelse CAB96628), HIF-1 α fra Drosophila melanogaster (Genbank aksesjonsbetegnelse JC4851) og HIF-1 α fra høne (Genbank aksesjonsbetegnelse BAA34234). HIF α-gensekvenser kan også erholdes ved rutinemessige kloningsteknikker, for eksempel ved å anvende hele eller en del av en HIF α-gensekvens beskrevet ovenfor som en probe for gjenvinning og bestemmelse av sekvensen til et HIF α-gen i en annen art.

Fragmenter av HIF α omfatter områdene som er definert ved humant HIF-1 α fra aminosyre 401 til 603 (Huang et al., supra), aminosyre 531 til 575 (Jiang et al. (1997) J Biol Chem 272: 19253-19260), aminosyre 556 til 575 (Tanimoto et al., supra), aminosyre 557 til 571 (Srinivas et al. (1999) Biochem Biophys Res Commun 260: 557-561) og aminosyre 556 til 575 (Ivan og Kaelin (2001) Science 292: 464-468). Videre omfatter et fragment av HIF α ethvert fragment som inneholder minst én forekomst av motivet LXXLAP, for eksempel som dette opptrer i den native HIF α-sekvensen som L397TLLAP og L559EMLAP. I tillegg omfatter et fragment av HIF α ethvert fragment som bibeholder i det minste én funksjonell eller strukturell egenskap forbundet med HIF α.

Begrepene "HIF-prolylhydroksylase" og "HIF PH" viser til ethvert enzym som kan hydroksylere en prolinrest i HIF-proteinet. Prolinresten som hydroksyleres av HIF PH omfatter fortrinnsvis prolinresten som forefinnes i motivet LXXLAP, for eksempel som dette forekommer i den native humane HIF-1 α-sekvensen som L397TLLAP og L559EMLAP. HIF PH omfatter medlemmer av genfamilien Egl-Nine (EGLN) beskrevet av Taylor (2001, Gene 275: 125-132) og karakterisert av Aravind og Koonin (2001, Genome Biol 2: RESEARCH007), Epstein et al. (2001, Cell 107: 43-54) og Bruick og McKnight (2001, Sciences 294: 1337-1349). Eksempler på HIF-prolylhydroksylaseenzymer omfatter humant SM-20 (EGLN1) (GenBank aksesjonsbetegnelse AAG33965; Dupuy et al. (2000) Genomics 69: 348-54), EGLN2 isoform 1 (GenBank aksesjonsbetegnelse CAC42510; Taylor, supra), EGLN2 isoform 2 (GenBank aksesjonsbetegnelse NP_060025) og EGLN3 (GenBank aksesjonsbetegnelse CAC42511; Taylor, supra); muse-EGLN1 (GenBank aksesjonsbetegnelse CAC42515), -EGLN2 (GenBank aksesjonsbetegnelse CAC42511) og -EGLN3 (SM-20) (GenBank aksesjonsbetegnelse CAC42517); og rotte-SM-20 (GenBank aksesjonsbetegnelse AAA19321). I tillegg kan HIF PH omfatte EGL-9 fra Caenorhabditis elegans (GenBank aksesjonsbetegnelse AAD56365) og CG1114-genproduktet fra Drosophila melanogaster (GenBank aksesjonsbetegnelse AAF52020). HIF-prolylhydroksylase omfatter også ethvert fragment av de ovenfor beskrevne fullengde proteinene som bibeholder minst én strukturell eller funksjonell egenskap.

Begrepet "prolylhydroksylaseinhibitor" eller "PHI" som anvendt heri viser til enhver forbindelse som reduserer eller på annet vis modulerer aktiviteten av et enzym som hydroksylerer aminosyrerester. Selv om enzymatisk aktivitet hvor prolinrester hydroksyleres foretrekkes, omfattes også hydroksylering av andre aminosyrer innbefattet, men ikke begrenset til, arginin. Forbindelser som kan anvendes i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen omfatter for eksempel jerngelaterende forbindelser, 2-oksoglutaratlignende forbindelser og modifiserte aminosyreanaloger, for eksempel prolinanaloger.

I spesielle utførelser tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av strukturelle etterlignere av 2-oksoglutarat. Slike forbindelser kan inhibere målenzymet fra 2-oksoglutaratdioksygenaseenzymfamilien kompetitivt relativt til 2-oksoglutarat og ikke-kompetitivt relativt til jern. (Majamaa et al. (1984) Eur J Biochem 138: 239-245; og Majamaa et al. (1985) Biochem J 229: 127-133). PHI som spesifikt omfattes for anvendelse i de foreliggende fremgangsmåtene beskrives for eksempel i Majamaa et al., supra; Kivirikko og Myllyharju (1998) Matrix Biol 16: 357-368; Bickel et al. (1998) Hepatology 28: 404-411; Friedman et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 4736-4741; Franklin (1991) Biochem Soc Trans 19): 812 815; Franklin et al. (2001) Biochem J 353-333-338; og i de internasjonale patentpublikasjonene WO 03/053977 og WO 03/049686 som begge inkorporeres heri ved referanse i sin helhet. Eksempler på PHI, innbefattet [(1-klor-4-hydroksyisokinolin-3-karbonyl)amino]eddiksyre (forbindelse A), [(4-hydroksy-7-fenoksyisokinolin-3-karbonyl)amino]eddiksyre (forbindelse B), [(4-hydroksy-7-fenylsulfanylisokinolin-3-karbonyl)amino]eddiksyre (forbindelse C) og 3-{[4-(3,3-dibenzylureido)benzensulfonyl]-[2-(4-metoksyfenyl)etyl]amino}-N-hydroksypropionamid (forbindelse D), anvendes i de foreliggende eksemplene for å demonstrere fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen som beskrives heri.

OPPFINNELSE

Den foreliggende oppfinnelsen gjelder fremgangsmåter og forbindelser for induksjon av forsterket eller fullstendig erytropoiese i et individ. Nærmere bestemt omfatter fremgangsmåtene induksjon av forsterket eller fullstendig erytropoiese ved stabilisering av HIF α i et individ. Fremgangsmåter for induksjon av forsterket erytropoiese ved å inhibere HIF-prolylhydroksylase omfattes spesifikt. I spesifikke utførelser omfatter fremgangsmåtene administrering til et individ av en forbindelse ifølge oppfinnelsen. I forskjellige utførelser kan subjektet være en celle, et vev, et organ, et organsystem eller en hel organisme.

Anemi forbundet med kronisk sykdom er den vanligste formen for anemi hos pasienter innlagt på sykehus. Anemi forbundet med kronisk sykdom opptrer hos pasienter med betennelseslidelser eller kreftsykdommer, innbefattet betennelsesinfeksjoner (for eksempel pulmonal abscess, tuberkulose, osteomyelitt, osv), ikke-infeksiøse betennelsessykdommer (for eksempel revmatoid artritt, systemisk lupus erytrematose, Crohns sykdom, hepatitt, inflammatorisk tarmsykdom, osv) og forskjellige kreftformer, tumorer og ondartede tilstander (for eksempel carcinom, sarkom, lymfom, osv), kronisk bakteriell endokarditt, osteomyelitt, giktfeber, ulcerøs kolitt og neoplastiske lidelser.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for induksjon av forsterket eller fullstendig erytropoiese for behandling av anemi forbundet med kronisk sykdom. Anemi forbundet med kronisk sykdom er forbundet med en rekke kroniske lidelser, innbefattet for eksempel revmatoid artritt, giktfeber, inflammatorisk tarmsykdom, ulcerøs kolitt, systemisk lupus erytematose, vaskulitt, neoplastiske lidelser, osv., så vel som kronisk infeksjon og kronisk betennelse. Redusert eller ineffektiv erytropoiese er en vanlig sykdomstilstand hos pasienter med anemi forbundet med kronisk sykdom. Redusert eller ineffektiv erytropoiese kan skyldes forskjellige metabolske unormaliteter i den eryotropoietiske reaksjonsveien, innbefattet for eksempel undertrykket EPO-dannelse, redusert EPO-respons i beinmarg og unormal prosessering av jern, for eksempel unormalt eller ineffektivt opptak, mobilisering, lagring og absorpsjon av jern.

En fysiologisk egenskap ved lidelser forbundet med anemi forbundet med kronisk sykdom er forhøyet dannelse av inflammatoriske cytokiner (Means (1995) Stem Cells 13:32-37 og Means (1999) Int J Hematol 70: 7-12) innbefattet for eksempel tumornekrosefaktor- α (TNF- α), interleukin-1 β (IL-1 β) og interferon- γ (IFN- γ) som negativt påvirker evnen til å formidle EPO-dannelse, EPO-respons og koordinert regulering av jernmetabolismen (se for eksempel Roodman et al. (1989) Adv Exp Med Biol 271: 185-196; Fuchs et al. (1991) Eur J Hematol 46: 65-70; Jelkmann et al. (1991) Ann NY Acad Sci 718: 300-311; Vannucchi et al. (1994) Br J Hematol 87: 18-23; og Oldenburg et al. (2001) Aliment Pharmacol Ther 15: 429-438). Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å forbedre metabolske og fysiologiske reaksjonsveier forbundet med EPO-dannelse, EPO-signalisering og jernutnyttelse, noe som fører til fullstendig eller forsterket erytropoiese og reduksjon eller lindring av anemi forbundet med kronisk sykdom.

Den foreliggende oppfinnelsen byr på fordeler sammenlignet med eksisterende behandlingsformer for anemi forbundet med kronisk sykdom, for eksempel administrering av rekombinant EPO. Redusert EPO-dannelse er kun én side ved redusert erytropoiese og det er kjent at administrering av rekombinant EPO ikke innvirker på andre mangler forbundet med redusert erytropoiese som foreligger hos pasienter med anemi forbundet med kronisk sykdom (se for eksempel Clibon et al. (1990) Exp Hematol 18: 438-441 og Macdougall og Cooper (2002) Neprol Dial Transplant 17(11): 39-43). Disse manglene omfatter for eksempel redusert EPO-respons i beinmargen så vel som en rekke aspekter ved jernmetabolismen som bidrar til fullstendig eller total erytropoiese innbefattet absorpsjon av jern fra tarmen, transport gjennom enterocytter, oksidasjon av jern til jern(III)-tilstand ved hepaestin eller ceruloplasmin, binding og opptak av jern ved transferrin og transferrinreseptor og transport av jern til beinmargen hvor jernanvendelsen foregår, innbefattet syntese av heme. Mange pasienter responderer ikke på administrering av rekombinant EPO av de grupper som er beskrevet ovenfor, hvor respons på administrering av rekombinant EPO er redusert eller fraværende, selv ved høye doser av rekombinant EPO.

Forekomsten av inflammatoriske cytokiner ved anemi forbundet med kronisk sykdom fører blant annet til redusert jernnivå i serum og økt lagring av jern, hovedsakelig i makrofager, i en celleavdeling som ikke er lett tilgjengelig for fremkommende erytroide forløperceller som krever jern for korrekt syntese av heme. Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å forsterke de metabolske reaksjonsveiene som bidrar til komplett og total erytropoiese. I en utførelse administreres det terapeutiske middelet i kombinasjon med tilleggsmidler som ytterligere forsterker virkningen, for eksempel jern og B-vitaminer.

Anemi forbundet med kronisk sykdom er forbundet med forhøyet ferritinnivå. Tross i et høyt ferritinnivå er individer med anemi forbundet med kronisk sykdom ikke i stand til å utnytte jernet effektivt. Et høyt ferritinnivå tyder på redusert resirkulasjon av jern til beinmargen og forhøyet lagring av jern, en funksjonell jernmangel som ofte er forbundet med anemi forbundet med kronisk sykdom og en pseudobetennelsestilstand som ofte foreligger hos uremiske pasienter med kronisk nyresykdom. Ved å redusere ferritinnivået fører fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen til redusert lagring av jern og forsterker resirkulasjon av jern via transferrin og transferrinreseptor. Et redusert ferritinnivå i serum vil tyde på forbedret anvendelse av jern og forsterket resirkulasjon av jern til beinmargen, noe som fører til økt tilgjengelighet på jern for dannelse av heme og for erytropoiesen.

Den genomiske responsen på hypoksi omfatter endringer i genekspresjon og cellefysiologi for å lindre de akutte og kroniske virkingene av oksygenmangel.

Hypoksiinduserbar faktor (HIF) er en transkripsjonsfaktor som består av en oksygenregulert alfaunderenhet (HIF α) og en konstitutivt uttrykt betaunderenhet (HIF β). HIF α er destabilisert under normoksiske betingelser grunnet hydroksylering av spesifikke prolinrester ved HIF-spesifikke prolinhydroksylaser (HIF-PH).

Dersom oksygen blir begrensende, for eksempel under hypoksiske betingelser, kan HIF-PH ikke hydrolysere HIF α, underenheten vil ikke degraderes og aktive HIF-komplekser dannes, translokaliseres til kjernen og aktiverer gentranskripsjon.

I visse aspekter tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen fremgangsmåter for behandling av anemi forbundet med kronisk sykdom ved en farmasøytisk etterligning av hypoksi. I visse aspekter forsterker fremgangsmåtene EPO-dannelsen på en måte som er resistent ovenfor de undertrykkende virkningene av inflammatoriske cytokiner. EPO-dannelsen induseres normalt ved hypoksi eller lav oksygenkonsentrasjon, men ekspresjon og sekresjon forblir redusert i nærværet av inflammatoriske cytokiner så som TNF- α, IL-1 β og IFN- γ som alle hyppig forekommer hos pasienter med kronisk sykdom. (Se for eksempel Means (1995) Stem Cells 13: 32-37; Means (1999) Int J Hematol 70: 7-12; Roodman et al. (1989) Adv Exp Med Biol 271: 185-196; Fuchs et al. (1991) Eur J Hematol 46: 65-70; Jelkmann et al. (1991) Ann NY Acad Sci 718: 300-311; og Vannmucchi et al.

(1994) Br J Hematol 87: 18-23). Prolylhydroksylaseinhibitorer overvinner de undertrykkende virkningene av inflammatoriske cytokiner på EPO-dannelsen, i det minste delvis, som vist ved Hep3B-cellers evne til å utskille EPO i et nivå som er høyere enn det som observeres i nærværet av inflammatoriske cytokiner. (Se for eksempel figurene 1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A og 4B). Midler så som den jerngelaterende forbindelsen desferrioksamin har også vist en viss virkning i undersøkelser av erytropoietinresistent anemi, for eksempel anemi forbundet med kronisk sykdom. (Se for eksempel Salvarani et al. (1996) Rheumatol Int 16: 45-48 og Goch et al. (1995) Eur J Hematol 55: 73-77).

I andre aspekter tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen fremgangsmåter for forbedret signalisering via EPO-reseptoren i nærværet av inflammatoriske cytokiner. Den vanlige forekomsten av inflammatoriske cytokiner hos pasienter med kronisk sykdom fører til redusert effektivitet av EPO-signaliseringen, vist ved mange pasienters manglende evne til å respondere på rekombinant EPO med forsterket erytropoiese. Dette antas å skyldes en redusert følsomhet overfor bioaktiviteten til EPO så vel som mangler i beinmargsarkitekturen og/eller mikromiljøet i beinmargen (se for eksempel Clibon et al. (1990) Exp Hematol 18: 438-441 og Macdougall og Cooper (2002) Neprol Dial Transplant 17(11): 39-43). I visse utførelser tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen fremgangsmåter for induksjon av total og fullstendig erytropoiese og gjenvinne egnede cellers sensitivitet overfor signaloverføring via EPO-reseptoren.

Jernmangel er en av de vanligste kostholdsmanglene verden over og er den ledende årsaken til anemi globalt sett. Jernbalansen reguleres i bunn og grunn ut fra erytropoiesehastigheten og jernlagrenes størrelse. Jernmangel kan opptre med eller uten anemi og er forbundet med svekket kognitiv utvikling.

Jernmangel er definert som utilstrekkelig jerntilførsel (nivåer eller lagere) eller som utilstrekkelig tilgjengelighet eller utnyttelse av jern i kroppen. Dette kan skyldes kostholdsmangler, for eksempel mangel på jern i kosten; manglende absorpsjon av jern, for eksempel grunnet kirurgisk behandling (postgastrektomi) eller sykdom (Crohns sykdom); eller til en tømming av jernlagrene eller forhøyet jerntap grunnet kronisk eller akutt blodtap som følge av skade eller traume, menstruasjon, bloddonasjon, flebotomi (så som på grunn av forskjellige medisinske fremgangsmåter, kirurgiske inngrep); grunnet forhøyet jernbehov, for eksempel grunnet hurtig vekst i barndom eller ungdom, graviditet, erytropoietinbehandling, osv.

Jernmangel kan også være funksjonell jernmangel, for eksempel jernmangel karakterisert ved pasientens svekkede evne til å få tilgang til og utnytte jernlagere. Jern er ikke tilgjengelig i en grad som er tilstrekkelig til å tillate normal hemoglobinisering av erytrocytter, noe som fører til redusert hemoglobininnhold i retikulocytter og erytrocytter. Funksjonell jernmangel observeres ofte hos friske individer med tilsynelatende normale eller til og med forhøyede jernlagere, men med svekket tilgjengelighet på jern, målt for eksempel ved et lavt nivå av prosent transferrinmetning. Denne typen av jernmangel er ofte forbundet med akutt eller kronisk betennelse.

Jernmangel av alle slag kan føre til jerndefisient eller jernbegrenset erytropoiese hvor antallet røde blodceller avtar og de røde blodcellene i sirkulasjonen er mindre enn normalt (mikrocyttiske) og mangler tilstrekkelig hemoglobin, og som følgelig har en lys farge (hypokrome).

Individer med jernmangel, innbefattet funksjonell jernmangel, kan utvikle svekket hemoglobinsyntese, redusert % transferrinmetning og redusert hemoglobin- og hematokrittnivå, noe som fører til jernmangelanemi. Jermangelanemi er den vanligste formen for anemi verden over. Jern er en essensiell bestanddel av hemoglobin; uten jern er beinmargen ute av stand til effektivt å danne hemoglobin. Jernmangelanemi kan opptre hos individer med utarmet eller svekket jerntilførsel eller hos individer med funksjonell jernmangel hvor jern foreligger i lagere, men ikke er tilgjengelig for for eksempel hemoglobindannelse.

Jermetabolismen omfatter generelt de prosesser ved hvilke en celle, et vev, et organ, et organsystem eller en hel organisme opprettholder jernhomeostasen ved å endre, for eksempel forsterke eller redusere, spesifikke prosesser i jernmetabolismen.

Jernmetabolismen eller prosesser som inngår i jernmetabolismen omfatter prosesser som deltar i prosessering, transport, opptak, utnyttelse, lagring, mobilisering, absorpsjon, osv. av jern. Spesifikke aspekter ved jernmetabolismen og jernprosesseringen omfatter ekspresjon av jerntransportører og enzymer som letter transport av jern over en cellemembran og tilbakeholdelse i eller sekresjon av jern fra en celle; endret ekspresjon av proteiner som deltar i jerntransport i blodet; endret ekspresjon av transferrin og transferrinreseptorer; endret ekspresjon og/eller aktivitet av proteiner som deltar i jernabsorpsjon; endret ekspresjon og aktivitet av jernassosierte transkripsjons- og translasjonsregulerende proteiner; og endret fordeling av jern i kroppen eller i dyrkningsvæsker, innbefattet for eksempel det interstitielle rom (det vil si det ekstracellulære rommet), det intracellulære rommet, blod, beinmarg og lignende.

I visse aspekter tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen fremgangsmåter for forbedring av opptak, transport, prosessering og utnyttelse av jern. Anemi forbundet med kronisk sykdom er forbundet med defekter i jernutnyttelsen som negativt påvirker hemesyntesen og hemoglobindannelsen, noe som fører til redusert erytropoiese. (Se for eksempel Oldenburg et al. (2001) Aliment Pharmacol Ther 15: 429-438). Redusert jernnivå i serum, redusert mobilisering av jern og eventuelle økninger av jernlagringen forbundet med dette hos pasienter med kronisk sykdom, kan være forbundet med en mikrobiell forsvarsmekanisme hos makrofagen under betingelser med langvarig betennelse. (se Fuchs et al. (1991) Eur J Hematol 46: 65-70). I noen aspekter tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen fremgangsmåter for å forsterke den effektive jernmetabolismen ved å stabilisere HIF α.

En rekke proteiner deltar i jernmetabolismen innbefattet proteiner så som erytroid 5-aminolevulinsyresyntase (ALAS) (det første og det hastighetsbegrensende trinnet i hemesyntesen) (Bottomley og Muller-Eberhard (1988) Semin Hematol 25: 282-302 og Yin et al. (1998) Blood, Cells, Molecules, and Diseases 24(3): 41-533), transferrin, transferrinreseptor, jerntransportører (som deltar i transport av jern), ceruloplasmin, osv. Økt ekspresjon av transferrin og transferrinreseptor stimulerer jernopptaket i erytroide forløperceller og letter opptak av jern og transport til beinmargen ved makrofager (Goswami et al. (2002) Biochem Cell Biol 80: 679-689). Ceruloplasmin fører til økt oksidasjon av jern(II) til jern(III) slik at binding til transferrin kan skje (Goswami et al. (2002) Biochem Cell Biol 80: 679-689). I visse aspekter forsterker fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen jernmetabolismen ved å forhøye ekspresjonen eller aktiviteten av proteiner som deltar i jernmetabolismen, innbefattet erytroid 5-aminolevulinatsyntase, transferrin, transferrinreseptor, NRAMP2, sproutin (duodenal cytokrom b reduktase 1) og ceruloplasmin. I andre aspekter forsterker fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen jernmetabolismen ved å redusere ekspresjonen eller aktiviteten av hepcidin og ved å modulere ferritinekspresjonen.

I en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter og forbindelser for å øke ekspresjonen av gener hvis produkter deltar i metabolisme og prosessering av jern, innbefattet opptak, lagring, transport og absorpsjon av jern, osv. Slike gener omfatter, men er ikke begrenset til, transferrinreseptor, ceruloplasmin, NRAMP2, 5-aminolevulinatsyntase, sproutin (CYRBD1), osv. Terapeutisk oppregulering av gener som deltar i metabolisme og prosessering av jern vil effektivt øke tilgjengeligheten av jern og derved gi en gunstig virkning hos pasienter med anemi forbundet med kronisk sykdom, anemi forbundet med jernmangel, funksjonell jernmangel, osv. I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter og forbindelser for reduksjon av ekspresjonen av hepcidin, et protein forbundet med jernregulering.

En korrekt jernmetabolisme reguleres delvis ved jernresponselementbindende proteiner (IRP) som bindes til jernresponselementer (IRE) som foreligger i de 5'-og/eller 5'-UTR i mRNA som koder for for eksempel ferritin (jernlagring), mitokondriell aconitase (energimetabolisme), erytroid aminolevulinatsyntase og transferrinreseptor. IRP-bindingh til et 5'-IRE, for eksempel i ferritintranskriptet, inhiberer translasjon av det angjeldende mRNA; mens binding til et 3'-IRE så som for eksempel i transferrintranskriptet, beskytter det angjeldende mRNA mot degradering. IRP-2 dannes konstitutivt i celler men degraderes og inaktiveres følgelig under betingelser mer jernmangel. IRP-2 stabiliseres imidlertid under betingelser med jernmangel og/eller hypoksi (Hanson et al. (1999) J Biol Chem 274: 5047-5052). Siden IRP-2 reduserer ekspresjonen av ferritin som er ansvarlig for langtidslagringen av jern og forhøyer ekspresjonen av transferrin og transferrinreseptor, letter IRP-2 opptak, transport og utnyttelse av jern slik at erytropoiesen forsterkes (Klausner et al. (1993) Cell 72: 19-28). Nylig er IRE blitt beskrevet i andre gener som også er nødvendige for erytropoiesen innbefattet 5-aminolevulinatsyntase, jerntransportøren NRAMP2 (også betegnet Alc11a2, DCT1, DMT1, mk (mikrocyttisk anemigenlokus i mus)) og jerntransportøren som formidler absorpsjon av jern fra kostholdskilder i tolvfingertarmen (Haile (1999) Am J Med Sci 318: 230-240 og Gunshin et al. (2001) FEBS Lett 509: 309-316).

Ved å etterligne hypoksiske betingelser, fører fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen til en kraftig stabilisering av IRP-2 i tillegg til HIF α, noe som gir en synergistisk virkning som omfatter både den endogene EPO-dannelsen og forsterket opptak, transport og utnyttelse av jern for dannelse av funksjonelle erytrocytter.

Blant voksne er den gjennomsnittlige absorpsjonen av jern fra jern i kosten tilnærmet 6% for 13% for ikke gravide kvinner. NRAMP2 (også betegnet DMT1, DCT1, slc112) er en allesteds uttrykt divalent metalltransportør som deltar i transmembrantransporten av ikke-transferrinbundet jern. NRAMP2 er et jerntransportprotein som er forbundet med transport av jern fra lumen i magetarmkanalen til enterocytter i tolvfingertarmen og fra erytroblastendosomer til cytoplasma. Hos dyr som manglet jer i kosten, ble ekspresjonen av NRAMP2 (slc11a2) dramatisk forhøyet i den apikale polen i enterocytter i det absorberende søyleepitel i den proksimale tolvfingertarmen. (Se for eksempel Canonne-Hergaux et al. (1999) Blood 93: 4406-4417). Genetiske gnagermodeller har koblet dette genet til anemier forbundet med jernmangel, innbefattet mus med hypokromisk og mikrocyttisk anemi (mk-mus) med et mutert NRAMP2-gen. MK-mus viser alvorlige defekter i jernabsorpsjonen og den erytroide utnyttelsen av jern.

I visse aspekter er fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å øke absorpsjonen av jern fra jern i kosten. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter og forbindelser for å forhøye ekspresjonen av gener forbundet med jerntransport og jernabsorpsjon.

Nærmere bestemt var forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen effektive når det gjaldt å øke ekspresjonen av NRAMP2 i tarm. En forhøyet NRAMP2 (slc11a2) -ekspresjon ville være ønskelig for å øke absorpsjonen av jern i tarmen, for eksempel jern fra kosten.

I tillegg tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen resultater som viser forhøyet sproutingenekspresjon i tarmen hos dyr behandlet med en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Den intestinale jernreduktasen sproutin, også betegnet Dcytb og Cybrd1 (CYBRD1, duodenal cytoktrom b reduktase 1) er en jern(III)reduktase og katalyserer den reduksjon av ekstracellulært jern(III) til jern(II) som er forbundet med absorpsjon av jern. Sproutin uttrykkes sammen med NRAMP2 i jernsultede dyr i det apikale området av duodenale villi (se for eksempel KcKie et al. (2001) Science 291: 1755-1759).

Fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å forhøye ekspresjonen av ceruloplasmingenet. Ceruloplasmin, også betegnet ferroksidase-1, overfører redusert jern frigitt fra lagringsseter (så som ferritin) til den oksiderte formen. Oksidert jern kan bindes til plasmatransportproteinet transferrin. Ceruloplasminmangel er forbundet med akkumulering av jern i lever og andre vev. Det foreligger materiale som tyder på at ceruloplasmin fremmer utstrømming av jern fra leveren og fremmer innstrømming av jern i celler med jernmangel (se for eksempel Tran et al. (2002) J Nutr 132: 351-356).

Forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen reduserte ekspresjonen av hepcidin mRNA i muselever. Betennelse fører til dannelse av IL-6 som virker på hepatocytter og gir induksjon av hepcidindannelse. Hepcidin inhiberer frigjøring av jern fra makrofager og absorpsjon av jern i tarmen, noe som fører til redusert tilgang på jern og for eksempel til hypoferremi. Redusert hepcidinekspresjon er forbundet med økt frigjøring av jern fra retikuloendotelceller og forhøyet absorpsjon av jern fra tarmen. Følgelig er fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å redusere hepcidinekspresjonen, forhøye absorpsjonen av jern fra tarmen og redusere hypoferremi.

Fremgangsmåter for behandling av anemi forbundet med hepatitt C-virus (HCV) -infeksjon omfattes spesifikt. Dagens behandling av HCV-infeksjon omfatter interferon- α og ribaviron i kombinasjon. Denne kombinasjonsbehandlingen er forbundet med redusert hemoglobinkonsentrasjon og anemi. I ett aspekt tilveiebringes fremgangsmåter og forbindelser for behandling av anemi forbundet med HCV-infeksjon. I et annet aspekt tilveiebringes fremgangsmåter og forbindelser for behandling av anemi forbundet med interferon- α-behandling av HCV-infeksjon. I et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen forbindelser og fremgangsmåter som er anvendbare for behandling av anemi forbundet med ribavirinbehandling av HCV-infeksjon.

Fremgangsmåter for å forhøye dannelsen av faktorer som er nødvendige for differensiering til erytrocytter fra hematopoietiske forløperceller innbefattet for eksempel hematopoietiske stamceller (HSC), CFU-GEMM (kolonidannende enhet granulocytt/erytroid/monocytt/megakaryocytt) -celler, osv., omfattes også. Faktorer som stimulerer erytropoiesen omfatter, men er ikke begrenset til, erytropoietin. I et annet aspekt gir fremgangsmåtene forhøyet dannelse av faktorer som er nødvendige for opptak, transport og utnyttelse av jern. Slike faktorer omfatter, men er ikke begrenset til, erytroid aminolevulinatsyntase, transferrin, transferrinreseptor, ceruloplasmin, ferritin, osv. I nok et aspekt gir fremgangsmåten økt konsentrasjon av faktorer som er nødvendige for differensiering til erytrocytter og ytterligere faktorer som er nødvendige for opptak, transport og utnyttelse av jern.

Fremgangsmåter for å forsterke hematopoietiske forløpercellers respons på erytropoietin omfattes også. Som beskrevet ovenfor, omfatter slike forløperceller HSC, CFU-GEMM, osv. Forløpercellenes respons kan for eksempel forsterkes ved å endre ekspresjonen av erytropoietinreseptorer, intracellulære faktorer som deltar i erytropoietinsignalisering og utskilte faktorer som letter interaksjonen mellom erytropoietin og reseptorene. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å forsterke EPO-responsen i beinmarg ved for eksempel å øke ekspresjonen av EPO-reseptor.

Fremgangsmåter

Forskjellige fremgangsmåter tilveiebringes heri. I ett aspekt omfatter fremgangsmåtene administrering til et individ av et middel som stabiliserer HIF α.

Stabilisering av HIF α kan oppnås ved en hvilken som helst av de fremgangsmåter som er tilgjengelige for og kjente blant fagfolk og kan omfatte anvendelse av ethvert middel som interagerer med, bindes til eller modifiserer HIF α eller faktorer som interagerer med HIF α, innbefattet for eksempel enzymer for hvilke HIF α er et substrat. I visse aspekter omfatter den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringelse av en konstitutivt stabil HIF α-variant, for eksempel stabile HIF α-muteiner, osv., eller et polynukleotid som koder for en slik variant. (Se for eksempel U.S. patentskrift nr.

6,562,799 og 6,124,131; samt U.S. patentskrift nr. 5,432,927). I andre aspekter omfatter den foreliggende oppfinnelsen at stabilisering av HIF α omfatter administrering av et middel som stabiliserer HIF α. Middelet kan bestå av polynukleotider, for eksempel antisenssekvenser (se for eksempel internasjonal patentpublikasjon nr. WO 03/045440); polypeptider; antistoffer; andre proteiner; karbohydrater; fett; lipider; og organiske og uorganiske forbindelser, for eksempel små molekyler, osv. I en foretrukket utførelse omfatter den foreliggende oppfinnelsen stabilisering av HIF α, for eksempel i et individ ved å administrere til individet et middel som stabiliserer HIF α, hvori middelet er en forbindelse, for eksempel en lavmolekylær forbindelse, osv., som stabiliserer HIF α.

I andre utførelser omfatter fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen stabilisering av HIF α ved å inhibere aktiviteten av minst ett enzym utvalgt fra 2-oksoglutaratdioksygenasefamilien. I en foretrukket utførelse er enzymet et HIF-hydroksylaseenzym, for eksempel EGLN-1, EGLN-2, EGLN-3, osv. (se for eksempel Taylor (2001) Gene 275: 125-132; Epstein et al. (2001) Cell 107: 43-54; og Bruick og McKnight (2001) Science 294: 1337-1340). Det omfattes imidlertid spesifikt at enzymet kan være ethvert enzym utvalgt fra 2-oksoglutaratdioksygenaseenzymfamilien innbefattet for eksempel prokollagenlysylhydroksylase, prokollagenprolyl 3-hydroksylase, prokollagenprolyl 4-hydroksylase α(I) og - α(II), tymin 7-hydroksylase, aspartyl(asparaginyl) βhydroksylase, ε-N-trimetyllysinhydroksylase og γ-burytobetainhydroksylase, osv (se for eksempel Majamaa et al. (1985) Biochem J 229: 127-133; Myllyharju og Kivirikko (1997) EMBO J 16: 1173-1180; Thornburg et al. (1993) 32: 14023-14033; og Jia et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 7227-7231).

I visse utførelser omfatter fremgangsmåtene behandling av anemi forbundet med kronisk sykdom eller regulering av jernmetabolismen ved administrering til et individ av en effektiv mengde av et middel som stabiliserer HIF α. I foretrukne utførelser er middelet en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen. I ett aspekt stabiliserer forbindelsen HIF α ved å inhibere hydroksyleringen av visse aminosyrerester i HIF α, for eksempel prolinrester, asparaginrester, osv. I en foretrukket utførelse er aminosyrerestene prolinrester. I spesifikke utførelser kan aminosyrerestene være P564-resten i HIF-1 α eller en homolog prolinrest i en annen HIF α-isoform, eller P402-resten i HIF-1 α eller en homolog prolinrest i en annen HIF α-isoform, osv. I andre utførelser kan de foreliggende fremgangsmåtene omfatte inhibering av hydroksylering av HIF α-asparaginrester, for eksempel N803-resten i HIF-1 α eller en homolog asparaginrest i en annen HIF α-isoform.

Forbindelser

I foretrukne fremgangsmåter omfatter de foreliggende fremgangsmåtene administrering til et individ av en effektiv mengde av en forbindelse som stabiliserer HIF α. Eksempler på forbindelser gis i for eksempel internasjonal patentpublikasjon nr. WO 03/049686 og internasjonal patentpublikasjon nr. WO 03/053997 som begge inkorporeres heri ved referanse i sin helhet. Nærmere bestemt omfatter forbindelser ifølge oppfinnelsen følgende.

I visse utførelser er en forbindelse ifølge oppfinnelsen en forbindelse som inhiberer HIF-hydroksylaseaktivitet. I forskjellige utførelser skyldes aktiviteten en HIF-prolylhydroksylase, for eksempel EGLN1, EGLN2 eller EGLN3, osv. I andre utførelser skyldes aktiviteten en HIF-asparaginylhydroksylase, for eksempel innbefattet, men ikke begrenset til, FIH. En foretrukket forbindelse ifølge oppfinnelsen er en forbindelse som inhiberer HIF-prolylhydroksylaseaktivitet.

Inhiberingen kan være direkte eller indirekte, kompetitiv eller ikke-kompetitiv, osv.

I ett aspekt er en forbindelse ifølge oppfinnelsen en hvilken som helst forbindelse som inhiberer eller på annet vis modulerer aktiviteten av et 2-oksoglutaratdioksygenaseenzym. 2-oksoglutaratdioksygenaseenzymer omfatter, men er ikke begrenset til, hydroksylaseenzymer. Hydroksylaseenzymer hydroksylerer aminosyrerester i målsubstratet og omfatter for eksempel prolylhydroksylaser, lysylhydroksylaser, asparaginyl (asparagyl, aspartyl) -hydroksylaser, osv. Hydroksylaser beskrives noen ganger ut fra målsubstratet, for eksempel HIF-hydroksylaser, prokollagenhydroksylaser, osv. og/eller ut fra målrester i substratet, for eksempel prolylhydroksylaser, lysylhydroksylaser, osv., eller ut fra begge disse, for eksempel HIF-prolylhydroksylaser, prokollagenprolylhydroksylaser, osv. Representative 2-oksoglutaratdioksygenaseenzymer omfatter, men er ikke begrenset til, HIF-hydroksylaser innbefattet HIF-prolylhydroksylaser, for eksempel EGLN1, EGLN2 og EGLN3, HIF-asparaginylhydroksylaser for eksempel faktor som inhiberer HIF (FIH) osv.; prokollagenhydroksylaser, for eksempel prokollagenlysylhydroksylaser, prokollagenprolylhydroksylaser, for eksempel prokollagenprolyl 3-hydroksylase, prokollagenprolyl 4-hydroksylase α(I) og - α(II), osv.; tymin 7-hydroksylase; aspartyl (asparaginyl) β-hydroksylase; ε-N-trimetyllysinhydroksylase; γbutyrobetainhydroksylase, osv. Selv om den enzymatiske aktiviteten kan omfatte enhver aktivitet som er forbundet med en hvilken som helst 2-oksoglutaratdioksygenase, omfatter spesifikt hydroksylering av aminosyrerester i et substrat. Selv om hydroksylering av prolin- og/eller asparaginrester i et substrat spesifikt inngår, omfattes også hydroksylering av andre aminosyrer.

I ett aspekt kan en forbindelse ifølge oppfinnelsen som viser inhiberende aktivitet mot ett eller flere 2-oksoglutaratdioksygenaseenzymer også vise inhiberende aktivitet mot ett eller flere andre 2-oksoglutaratdioksygenaseenzymer, for eksempel kan en forbindelse som inhiberer aktiviteten av en HIF-hydroksylase i tillegg inhibere aktiviteten av en kollagenprolylhydroksylase, en forbindelse som inhiberer aktiviteten av en HIF-prolylhydroksylase kan i tillegg inhibere aktiviteten av en HIF-asparaginylhydroksylase, osv.

Siden HIF α modifiseres ved prolinhydroksylering, en reaksjon som krever oksygen og Fe<2+>, omfatter den foreliggende oppfinnelsen i ett aspekt at enzymet som er ansvarlig for HIF α-hydroksylering er et medlem av 2-oksoglutaratdioksygenasefamilien. Slike enzymer omfatter, men er ikke begrenset til, prokollagenlysylhydroksylase, prokollagenprolyl 3-hydroksylase, prokollagenprolyl 4-hydrokylase α(I) og - α(II), tymin 7-hydroksylase, aspartyl (asparaginyl) β-hydroksylase, ε-N-trimetyllysinhydroksylase og γbutyrobetainhydroksylase, osv. Disse enzymene krever oksygen, Fe<2+>, 2-oksoglutarat og askorbinsyre for hydroksylaseaktiviteten (se for eksempel Majamaa et al. (1985) Biochem J 229: 127-133; Myllyharju og Kivirikko (1997) EMBO J 16: 1173-1180; Thornburg et al. (1993) 32: 14023-14033; og Jia et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 7227-7231).

I ett aspekt er en forbindelse ifølge oppfinnelsen en forbindelse som stabiliserer HIF α. Forbindelsen stabiliserer fortrinnsvis HIF α ved å inhibere HIF-hydroksylaseaktivitet. Det omfattes således spesifikt at en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan utvelges blant tidligere påviske modulatorer av hydroksylaseaktivitet. For eksempel har lavmolekylære inhibitorer av prolyl 4-hydroksylase blitt påvist (se for eksempel Majamaa et al. (1984) Eur J Biochem 138: 239-245; Majamaa et al. (1985) Biochem J 229: 127-133; Kivirikko og Myllyharju (1998) Matrix Biol 16: 357-368; Bickel et al. (1998) Hepatology 28: 404-411; Friedman et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 4736-4741; og Franklin et al. (2001) Biochem J 353: 333-338; som alle inkorporeres heri ved referanse i sin helhet). Den foreliggende oppfinnelsen omfatter anvendelsen av disse forbindelsene i fremgangsmåtene som tilveiebringes heri.

I noen aspekter omfatter forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen for eksempel strukturelle etterlignere av 2-oksoglutarat. Slike forbindelser kan inhibere det ønskede medlemmet av 2-oksoglutaratdioksygenaseenzymfamilien kompetitivt relativt til 2-oksoglutarat og ikke-kompetitivt relativt til jern (Majamaa et al. (1984) Eur J Biochem 138: 239-245; og Majamaa et al. Biochem J 229: 127-133).

I visse utførelser er forbindelser som anvendes i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen utvalgt blant forbindelser med formel (I)

hvori

A er 1,2-aryliden, 1,3-aryliden, 1,4-aryliden; eller (C1-C4)-alkylen, eventuelt substituert med en eller to substituenter utvalgt blant halogen, cyano, nitro, trifluormetyl, (C1-C6)-alkyl, (C1-C6)-hydroksyalkyl, (C1-C6)-alkoksy, -O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)Halg, (C1-C6)-fluoralkoksy, (C1-C8)-fluoralkenyloksy, (C1-C8)-fluoralkynyloksy, -OCF2Cl, -O-CF2-CHFCl; (C1-C6)-alkylmerkapto, (C1-C6)-alkylsulfinyl, (C1-C6)-alkylsulfonyl, (C1-C6)-alkylkarbonyl, (C1-C6)-alkoksykarbonyl, karbamoyl, N-(C1-C4)-alkylkarbamoyl, N,N-di-(C1-C4)-alkylkarbamoyl, (C1-C6)-alkylkarbonyloksy, (C3-C8)-sykloalkyl, fenyl, benzyl, fenoksy, benzyloksy, anilino, N-metylanilino, fenylmerkapto, fenylsulfonyl, fenylsulfinyl, sulfamoyl, N-(C1-C4)-alkylsulfamoyl, N,N-di-(C1-C4)-alkylsulfamol; eller med substituert (C6-C12)-aryloksy, (C7-C11)-aralkyloksy, (C6-C12)-aryl, (C7-C11)-aralkylradikal som på arylgruppen bærer fra en til fem like eller forskjellige substituenter utvalgt blant halogen, cyano, nitro, trifluormetyl, (C1-C6)-alkyl, (C1-C6)-alkoksy, -O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)Halg, -OCF2Cl, -O-CF2-CHFCl, (C1-C6)-alkylmerkapto, (C1-C6)-alkylsulfinyl, (C1-C6)-alkylsulfonyl, (C1-C6)-alkylkarbonyl, (C1-C6)-alkoksykarbonyl, karbamoyl, N-(C1-C4)-alkylkarbamoyl, N,N-di-(C1-C4)-alkylkarbamoyl, (C1-C6)-alkylkarbonyloksy, (C3-C8)-sykloalkyl, sulfamoyl, N-(C1-C4)-alkylsulfamoyl, N,N-di-(C1-C4)-alkylsulfamoyl; eller hvori A er -CR<5>R<6>og hvori R<5>og R<6>uavhengig av hverandre er utvalgt blant hydrogen, (C1-C6)-alkyl, (C3-C7)-sykloalkyl, aryl eller en substituent på α-karbonatomet til en α-aminosyre, hvori aminosyren er en naturlig forekommende L-aminosyre eller dens D-isomer.

B er -CO2H, -NH2, -NHSO2CF3, tetrazolyl, imidazolyl, 3-hydroksyisoksazolyl, -CONHCOR''', -CONHSOR''', CONHSO2R''', hvor R''' er aryl, heteroaryl, (C3-C7)-sykloalkyl eller (C1-C4)-alkyl eventuelt monosubstituert med (C6-C12)-aryl, heteroaryl, OH, SH, (C1-C4)-alkyl, (C1-C4)-alkoksy, (C1-C4)-tioalkyl, (C1-C4)-sulfinyl, (C1-C4)-sulfonyl, CF3, Cl, Br, F, I, NO2, -COOH, (C2-C5)-alkoksykarbonyl, NH2, mono-(C1-C4-alkyl)-amino, di-(C1-C4-alkyl)-amino eller (C1-C4)-perfluoralkyl; eller hvori B er et CO2-G-karboksylradikal hvori G er et radikal av en alkohol G-OH hvori G er utvalgt blant (C1-C20)-alkylradikal, (C3-C8)-sykloalkylradikal, (C2-C20)-alkenylradikal, (C3-C8)-sykloalkenylradikal, retinylradikal, (C2-C20)-alkynylradikal, (C4-C20)-alkenynylradikal, hvori alkenyl-, sykloalkenyl-, alkynyl- og alkenynylradikalene inneholder en eller flere dobbelteller trippelbindinger; (C6-C16)-karbosyklisk arylradikal, (C7-C16)-karbosyklisk aralkylradikal, heteroarylradikal eller heteroaralkylradikal, hvori et heteroarylradikal eller en heteroarylgruppe i et heteroaralkylradikal inneholder 5 eller 6 ringatomer; og hvori radikalene som er definert for G er substituert med en eller flere substituenter utvalgt blant hydroksyl, halogen, cyano, trifluormetyl, nitro, karboksyl, (C1-C12)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkyl, (C5-C8)-sykloalkenyl, (C6-C12)-aryl, (C7-C16)-aralkyl, (C2-C12)-alkenyl, (C2-C12)-alkynyl, (C1-C12)-alkoksy, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkyl, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkoksy, (C6-C12)-aryloksy, (C7-C16)-aralkyloksy, (C1-C8)-hydroksyalkyl, -O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg, -OCF2Cl, -OCF2-CHFCl, (C1-C12)-alkylkarbonyl, (C3-C8)-sykloalkylkarbonyl, (C6-C12)-arylkarbonyl, (C7-C16)-aralkylkarbonyl, cinnamoyl, (C2-C12)-alkenylkarbonyl, (C2-C12)-alkynylkarbonyl, (C1-C12)-alkoksykarbonyl, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkoksykarbonyl, (C6-C12)-aryloksykarbonyl, (C7-C16)-aralkoksykarbonyl, (C3-C8)-sykloalkoksykarbonyl, (C2-C12)-alkenyloksykarbonyl, (C2-C12)-alkynyloksykarbonyl, acyloksy, (C1-C12)-alkoksykarbonyloksy, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkoksykarbonyloksy, (C6-C12)-aryloksykarbonyloksy, (C7-C16)-aralkyloksykarbonyloksy, (C3-C8)-sykloalkoksykarbonyloksy, (C2-C12)-alkenyloksykarbonyloksy, (C2-C12)-alkynyloksykarbonyloksy, karbamoyl, N-(C1-C12)-alkylkarbamoyl, N,N-di(C1-C12)-alkylkarbamoyl, N-(C3-C8)-sykloalkylkarbamoyl, N-(C6-C16)-arylkarbamoyl, N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C6-C16)-arylkarbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyl, N-((C1-C10)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-((C6-C12)-aryloksyl-(C1-C10)alkyl)-karbamoyl, N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C1-C10)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C6-C16)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, karbamoyloksyl, N-(C1-C12)-alkylkarbamoyloksy, N,N-di-(C1-C12)-alkylkarbamoyloksy, N-(C3-C8)-sykloalkylkarbamoyloksy, N-(C6-C12)-arylkarbamoyloksy, N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C6-C12)-arylkarbamoyloksy, N(C1-C10)-alkyl-N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyloksy, N-((C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-((C6-C12)-aryloksyl-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-((C7-C16)-aralkyloksyl-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C1-C10)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C6-C12)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, amino, (C1-C12)-alkylamino, di-(C1-C12)-alkylamino, (C3-C8)-sykloalkylamino, (C2-C12)-alkenylamino, (C2-C12)-alkynylamino, N-(C6-C12)-arylamino, N(C-C11)-aralkylamino, N-alkylaralkylamino, N-alkylarylamino, (C1-C12)-alkoksyamino, (C1-C12)-alkoksy-N-(C1-C10)-alkylamino, (C1-C12)-alkylkarbonylamino, (C3-C8)-sykloalkylkarbonylamino, (C6-C12)arylkarbonylamino, (C7-C16)-aralkylkarbonylamino, (C1-C12)-alkylkarbonyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C3-C8)-sykloalkylkarbonyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C6-C12)-arylkarbonyl-N-(C1-C10)alkylamino, (C7-C11)-aralkylkarbonyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C1-C12)-alkylkarbonylamino-(C1-C8)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkylkarbonylamino-(C1-C8)alkyl, (C6-C12)-arylkarbonylamino-(C1-C8)-alkyl, (C7-C12)-aralkylkarbonylamino(C1-C8)-alkyl, amino-(C1-C10)-alkyl, N-(C1-C10)alkylamino-(C1-C10)-alkyl, N,N-di-(C1-C10)-alkylamino-(C1-C10)-alkyl, (C3-C8)sykloalkylamino-(C1-C10)-alkyl, (C1-C12)-alkylmerkapto, (C1-C12)-alkylsulfinyl, (C1-C12)-alkylsulfonyl, (C6-C16)-arylmerkapto, (C6-C16)-arylsulfinyl, (C6-C12)-arylsulfonyl, (C7-C16)-aralkylmerkapto, (C7-C16)-aralkylsulfinyl, (C7-C16)-aralkylsulfonyl, sulfamoyl, N-(C1-C10)-alkylsulfamoyl, N,N-di(C1-C10)-alkylsulfamoyl, (C3-C8)-sykloalkylsulfamoyl, N-(C6-C12)-alkylsulfamoyl, N-(C7-C16)-aralkylsulfamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C6-C12)-arylsulfamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C7-C16)-aralkylsulfamoyl, (C1-C10)-alkylsulfonamido, N-((C1-C10)-alkyl)- (C1-C10)-alkylsulfonamido, (C7-C16)-aralkylsulfonamido og N-((C1-C10)-alkyl-(C7-C16)-aralkylsulfonamido; hvori radikaler som er aryl eller inneholder en arylgruppe kan være substituert på arylgruppen med fra en til fem like eller forskjellige substituenter utvalgt blant hydroksyl, halogen, cyano, trifluormetyl, nitro, karboksyl, (C1-C12)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkyl, (C6-C12)-aryl, (C7-C16)-aralkyl, (C1-C12)-alkoksy, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)alkyl, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)alkoksy, (C6-C12)-aryloksy, (C7-C16)-aralkyloksy, (C1-C8)-hydroksyalkyl, (C1-C12)-alkylkarbonyl, (C3-C8)-sykloalkylkarbonyl, (C6-C12)-arylkarbonyl, (C7-C16)aralkylkarbonyl, (C1-C12)-alkoksykarbonyl, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkoksykarbonyl, (C6-C12)-aryloksykarbonyl, (C7-C16)-aralkoksykarbonyl, (C3-C8)-sykloalkoksykarbonyl, (C2-C12)-alkenyloksykarbonyl, (C2-C12)-alkynyloksykarbonyl, (C1-C12)-alkylkarbonyloksy, (C3-C8)-sykloalkylkarbonyloksy, (C6-C12)-arylkarbonyloksy, (C7-C16)-aralkylkarbonyloksy, cinnamoyloksy, (C2-C12)-alkenylkarbonyloksy, (C2-C12)-alkynylkarbonyloksy, (C1-C12)-alkoksykarbonyloksy, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)alkoksykarbonyloksy, (C6-C12)-aryloksykarbonyloksy, (C7-C16)-aralkyloksykarbonyloksy, (C3-C8)-sykloalkoksykarbonyloksy, (C2-C12)-alkenyloksykarbonyloksy, (C2-C12)-alkynyloksykarbonyloksy, karbamoyl, N-(C1-C12)-alkylkarbamoyl, N,N-di-(C1-C12)-alkylkarbamoyl, N-(C3-C8)-sykloalkylkarbamoyl, N-(C6-C12)-arylkarbamoyl, N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C6-C12)-arylkarbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyl, N-((C1-C10)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-((C6-C12)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C1-C10)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C6-C12)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, karbamoyloksy, N-(C1-C12)-alkylkarbamoyloksy, N,N-di-(C1-C12)-alkylkarbamoyloksy, N-(C3-C8)-sykloalkylkarbamoyloksy, N-(C6-C12)-arylkarbamoyloksy, N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C6-C12)-arylkarbamoyloksy, N(C1-C10)-alkyl-N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyloksy, N-((C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-((C6-C12)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C1-C10)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkylN-((C6-C12)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, amino, (C1-C12)-alkylamino, di-(C1-C12)-alkylamino, (C3-C8)-sykloalkylamino, (C3-C12)-alkenylamino, (C3-C12)-alkynylamino, N-(C6-C12)-arylamino, N-(C7-C11)-aralkylamino, N-alkylaralkylamino, N-alkylarylmino, (C1-C12)-alkoksyamino, (C1-C12)-alkoksy-N-(C1-C10)-alkylamino, (C1-C12)-alkylkarbonylamino, (C3-C8)-sykloalkylkarbonylamino, (C6-C12)-arylkarbonylamino, (C7-C16)-alkylkarbonylamino, (C1-C12)-alkylkarbonyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C3-C8)-sykloalkylkarbonyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C6-C12)-arylkarbonyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C7-C11)-aralkylkarbonyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C1-C12)-alkylkarbonylamino-(C1-C8)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkylkarbonylamino-(C1-C8)-alkyl, (C6-C12)-arylkarbonylamino-(C1-C8)-alkyl, (C7-C16)-aralkylkarbonylamino-(C1-C8)-alkyl, amino-(C1-C10)-alkyl, N-(C1-C10)-alkylamino-(C1-C10)alkyl, N,N-di-(C1-C10)-alkylamino-(C1-C10)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkylamino-(C1-C10)-alkyl, (C1-C12)-alkylmerkapto, (C1-C12)-alkylsulfinyl, (C1-C12)-alkylsulfonyl, (C6-C12)-arylmerkapto, (C6-C12)-arylsulfinyl, (C6-C12)-arylsulfonyl, (C7-C16)-aralkylmerkapto, (C7-C16)-aralkylsulfinyl eller (C7-C16)-aralkylsulfonyl;

X er O eller S;

Q er O, S, NR' eller en binding;

hvor dersom Q er en binding, er R<4>halogen, nitril eller trifluormetyl;

eller hvor, dersom Q er O, S eller NR', så er R<4>hydrogen, (C1-C10)-alkylradikal, (C2-C10)-alkenylradikal, (C2-C10)-alkynylradikal, hvori alkenyl- eller alkynylradikalet inneholder en eller to C-C-dobbelt- eller trippelbindinger; et usubstituert fluoralkylradikal med formelen -[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg, (C1-C8)-alkoksy-(C1-C6)-alkylradikal, (C1-C6)alkoksyl-(C1-C4)-alkoksy-(C1-C4)-alkylradikal, arylradikal, heteroarylradikal, (C7-C11)-aralkylradikal eller et radikal med formelen X

-[CH2]v-[O]w-[CH2]t-E (Z)

hvor

E er et heteroarylradikal, et (C3-C8)-sykloalkylradikal eller et fenylradikal med formel F

v er 0-6,

w er 0 eller 1,

t er 0-3, og

R<7>, R<8>, R<9>, R<10>og R<11>er identiske eller forskjellige og er hydrogen, halogen, cyano, nitro, trifluormetyl, (C1-C6)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkyl, (C1-C6)-alkoksy, -O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg, -OCF3-Cl, -O-CF2-CHFCl, (C1-C6)-alkylmerkapto, (C1-C6)-hydroksyalkyl, (C1-C6)-alkoksy-(C1-C6)-alkoksy, (C1-C6)-alkoksy-(C1-C6)-alkyl, (C1-C6)-alkylsulfinyl, (C1-C6)-alkylsulfonyl, (C1-C6)-alkylkarbonyl, (C1-C8)-alkoksykarbonyl, karbamoyl, N-(C1-C8)-alkylkarbamoyl, N,N-di-(C1-C8)-alkylkarbamoyl eller (C7-C11)-aralkylkarbamoyl, eventuelt substituert med fluor, klor, brom, trifluormetyl, (C1-C6)-alkoksy, N-(C3-C8)-sykloalkylkarbamoyl, N-(C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C4)-alkylkarbamoyl, (C1-C6)-alkylkarbonyloksy, fenyl, benzyl, fenoksy, benzyloksy, NR<Y>R<Z>hvori R<y>og R<z>uavhengig av hverandre er utvalgt blant hydrogen, (C1-C12)-alkyl, (C1-C8)-alkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C7-C12)-aralkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C6-C12)-aryloksy-(C1-C8)-alkyl, (C3-C10)-sykloalkyl, (C3-C12)-alkenyl, (C3-C12)-alkynyl, (C6-C12)-aryl, (C7-C11)-aralkyl, (C1-C12)-alkoksy, (C7-C12)aralkoksy, (C1-C12)-alkylkarbonyl, (C3-C8)-sykloalkylkarbonyl, (C6-C12)arylkarbonyl, (C7-C16)-aralkylkarbonyl; eller videre hvori R<y>og R<z>sammen er -[CH2]h, hvori en CH2-gruppe kan være erstattet med O, S, N-(C1-C4)-alkylkarbonylimino eller N-(C1-C4)-alkoksykarbonylimino; fenylmerkapto, fenylsulfonyl, fenylsulfinyl, sulfamoyl, N-(C1-C8)-alkylsulfamoyl eller N,N-di-(C1-C8)-alkylsulfamoyl; eller hvori alternativt R<7>og R<8>, R<8>og R<9>, R<9>og R<10>eller R<10>og R<11>sammen utgjør en kjede utvalgt blant -[CH2]n- eller -CH=CH-CH=CH-, hvor en CH2-gruppe i kjeden eventuelt er erstattet med O, S, SO, SO2eller NR<Y>; og n er 3, 4 eller 5; og dersom E er et heteroarylradikal, kan radikalet bære 1-3 substituenter utvalgt blant de som er definert for R<7>-R<11>, eller dersom E er et sykloalkylradikal, kan radikalet bære en substituent utvalgt blant substituentene definert for R<7>-R<11>;

eller hvor, dersom Q er NR', er R<4>alternativt R'', hvor R' og R'' er like eller forskjellige og er hydrogen, (C6-C12)-aryl, (C7-C11)-aralkyl, (C1-C8)-alkyl, (C1-C8)-alkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C7-C12)-aralkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C6-C12)-aryloksy-(C1-C8)-alkyl, (C1-C10)-alkylkarbonyl, eventuelt substituert (C7-C16)-aralkylkarbonyl eller eventuelt substituert (C6-C12)-arylkarbonyl; eller hvori R' eller R'' sammen er -[CH2]hhvor en CH2-gruppe kan være erstattet med O, S, N-acylimino eller N-(C1-C10)-alkoksykarbonylimino og h er fra 3 til 7.

Y er N eller CR<3>;

R<1>, R<2>og R<3>er like eller forskjellige og er hydrogen, hydroksyl, halogen, cyano, trifluormetyl, nitro, karboksyl, (C1-C20)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkyl, (C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C12)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkoksy, (C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C12) alkoksy, (C3-C8)-sykoalkyloksy-(C1-C12)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkyloksy-(C1-C12)-alkoksy, (C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C8)-alkyl-(C1-C6)-alkoksy, (C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C8)-alkoksy-(C1-C6)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkyloksy-(C1-C8)-alkoksy-(C1-C6)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkoksy-(C1-C8)-alkoksy-(C1-C8)-alkoksy, (C6-C12)-aryl, (C7-C16)-aralkyl, (C7-C16)-aralkenyl, (C7-C16)-aralkynyl, (C2-C20)-alkenyl, (C2-C20)-alkynyl, (C1-C20)-alkoksy, (C2-C20)-alkenyloksy, (C2-C20)-alkynyloksy, retinyloksy, (C1-C20)-alkoksy-(C1-C12)-alkyl, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkoksy, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C8)-alkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C6-C12)-aryloksy, (C7-C16)-aralkyloksy, (C6-C12)-aryloksy-(C1-C6)-alkoksy, (C7-C16)-aralkoksy-(C1-C6)-alkoksy, (C1-C16)-hydroksyalkyl, (C6-C16)-aryloksy-(C1-C8)-alkyl, (C7-C16)-aralkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C6-C12)-aryloksy-(C1-C8)-alkoksy-(C1-C6)-alkyl, (C7-C12)-aralkyloksy-(C1-C8)-alkoksy-(C1-C6)-alkyl, (C2-C20)-alkenyloksy-(C1-C6)-alkyl, (C2-C20)-alkynyloksy-(C1-C6)-alkyl, retinyloksy-(C1-C6)-alkyl, -O-[CH2]xCfH(2f+1-g)Fg, -OCF2Cl, -OCF2-CHFCl, (C1-C20)-alkylkarbonyl, (C3-C8)-sykloalkylkarbonyl, (C6-C12)-arylkarbonyl, (C7-C16)-aralkylkarbonyl, cinnamoyl, (C2-C20)-alkenylkarbonyl, (C2-C20)-alkynylkarbonyl, (C1-C20)-alkoksykarbonyl, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkoksykarbonyl, (C6-C12)-aryloksykarbonyl, (C7-C16)-aralkoksykarbonyl, (C3-C8)-sykloalkoksykarbonyl, (C2-C20)-alkenyloksykarbonyl, retinyloksykarbonyl, (C2-C20)-alkynyloksykarbonyl, (C6-C12)-aryloksy-(C1-C6)-alkoksykarbonyl, (C7-C16)-aralkoksy-(C1-C6)-alkoksykarbonyl, (C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C6)-alkoksykarbonyl, (C3-C8)-sykloalkoksy-(C1-C6)-alkoksykarbonyl, (C1-C12)-alkylkarbonyloksy, (C3-C8)-sykloalkylkarbonyloksy, (C6-C12)-arylkarbonyloksy, (C7-C16)-aralkylkarbonyloksy, cinnamoyloksy, (C2-C12)-alkenylkarbonyloksy, (C2-C12)-alkynylkarbonyloksy, (C1-C12)-alkoksykarbonyloksy, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkoksykarbonyloksy, (C6-C12)-aryloksykarbonyloksy, (C7-C16)-aralkyloksykarbonyloksy, (C3-C8)-sykloalkoksykarbonyloksy, (C2-C12)-alkenyloksykarbonyloksy, (C2-C12)-alkynyloksykarbonyloksy, karbamoyl, N-(C1-C12)-alkylkarbamoyl, N,N-di-(C1-C12)-alkylkarbamoyl, N-(C3-C8)-sykloalkylkarbamoyl, N,N-disyklo-(C3-C8)-alkylkarbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C3-C8)-sykloalkylkarbamoyl, N-((C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C6)-alkyl)-karbamoyl, N-(C1-C6)-alkyl-N((C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C6)-alkyl)-karbamoyl, N-(+)-dehydroabietylkarbamoyl, N-(C1-C6)-alkyl-N-(+)-dehydroabietylkarbamoyl, N-(C6-C12)-arylkarbamoyl, N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C6-C16)-arylkarbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C7-C16)aralkylkarbamoyl, N-((C1-C18)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-((C6-C16)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C1-C10)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C6-C12)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl; CON(CH2)h, hvori en CH2-gruppe kan være erstattet med O, S, N-(C1-C8)-alkylimino, N-(C3-C8)-sykloalkylimino, N-(C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C4)-alkylimino, N-(C6-C12)-arylimino, N-(C7-C16)-aralkylimino, N-(C1-C4)-alkoksy-(C1-C6)-alkylimino, og h er fra 3 til 7; et karbamoylradikal med formel R

hvori

R<x>og R<y>uavhengig av hverandre er utvalgt blant hydrogen, (C1-C6)-alkyl, (C3-C7)-sykloalkyl, aryl eller substituenten på et α-karbonatom i en α-aminosyre, til hvilken L- og D-aminosyrene tilhører,

s er 1-5,

T er OH, eller NR*R** og R*, R** og R*** er like eller forskjellige og er utvalgt blant hydrogen, (C6-C12)-aryl, (C7-C11)-aralkyl, (C1-C8)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkyl, (+)-dehydroabietyl, (C1-C8)-alkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C7-C12)-aralkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C6-C12)-aryloksy-(C1-C8)-alkyl, (C1-C10)-alkanoyl, eventuelt substituert (C7-C16)-aralkanoyl, eventuelt substituert (C6-C12)-aroyl; eller R* og R** sammen er -[CH2]hhvori en CH2-gruppe kan være erstattet med O, S, SO, SO2, N-acylamino, N-(C1-C10)-alkoksykarbonylimino, N-(C1-C8)-alkylimino, N-(C3-C8)-sykloalkylimino, N-(C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C4)-alkylimino, N-(C6-C12)-arylimino, N-(C7-C16)-aralkylimino eller N-(C1-C4)-alkoksy-(C1-C6)-alkylimino og h er fra 3 til 7;

karbamoyloksy, N-(C1-C12)-alkylkarbamoyloksy, N,N-di-(C1-C12)-alkylkarbamoyloksy, N-(C3-C8)-sykloalkylkarbamoyloksy, N-(C6-C12)-arylkarbamoyloksy, N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C6-C12)-arylkarbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyloksy, N-((C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-((C6-C12)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C1-C10)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C6-C12)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyloksyamino, (C1-C12)-alkylamino, di-(C1-C12)-alkylamino, (C3-C8)-sykloalkylamino, (C3-C12)-alkenylamino, (C3-C12)-alkynylamino, N-(C6-C12)-arylamino, N-(C7-C11)-aralkylamino, N-alkylaralkylamino, N-alkylarylamino, (C1-C12)-alkoksyamino, (C1-C12)-alkoksy-N-(C1-C10)-alkylamino, (C1-C12)-alkanoylamino, (C3-C8)-sykloalkanoylamino, (C6-C12)-aroylamino, (C7-C16)-aralkanoylamino, (C1-C12)-alkanoyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C3-C8)sykloalkanoyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C6-C12)-aroyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C7-C11)-aralkanoyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C1-C12)-alkanoylamino-(C1-C8)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkanoylamino-(C1-C8)-alkyl, (C6-C12)-aroylamino-(C1-C8)-alkyl, (C7-C16)-aralkanoylamono-(C1-C8)-alkyl, amino-(C1-C10)-alkyl, N-(C1-C10)-alkylamino-(C1-C10)-alkyl, N,N-di(C1-C10)-alkylamino-(C1C10)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkylamino(C1-C10)-alkyl, (C1-C20)-alkylmerkapto, (C1-C20)-alkylsulfinyl, (C1-C20)-alkylsulfonyl, (C6-C12)-arylmerkapto, (C6-C12)-arylsulfinyl, (C6-C12)-arylsulfonyl, (C7-C16)-aralkylmerkapto, (C7-C16)-aralkylsulfinyl, (C7-C16)-aralkylsulfonyl, (C1-C12)-alkylmerkapto-(C1-C6)-alkyl, (C1-C12)-alkylsulfinyl-(C1-C6)-alkyl, (C1-C12)-alkylsulfonyl-(C1-C6)-alkyl, (C6-C12)-arylmerkapto-(C1-C6)-alkyl, (C6-C12)-arylsulfinyl-(C1-C6)-alkyl, (C6-C12)-arylsulfonyl-(C1-C6)-alkyl, (C7-C16)-aralkylmerkapto-(C1-C6)-alkyl, (C7-C16)-aralkylsulfinyl-(C1-C6)-alkyl, (C7-C16)-aralkylsulfonyl-(C1-C6)-alkyl, sulfamoyl, N-(C1-C10)-alkylsulfamoyl, N,N-di-(C1-C10)-alkylsulfamoyl, (C3-C8)-sykloalkylsulfamoyl, N-(C6-C12)-arylsulfamoyl, N-(C7-C16)-aralkylsulfamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C6-C12)-arylsulfamoyl, H-(C1-C10)-alkyl-N-(C7-C16)-aralkylsulfamoyl, (C1-C10)-alkylsulfonamido, N-((C1-C10)-alkyl)-(C1-C10)-alkylsulfonamido, (C7-C16)-aralkylsulfonamido og N-((C1-C10)-alkyl-(C7-C16)-aralkylsulfonamido; hvor et arylradikal kan være substituert med fra 1 til 5 substituenter utvalgt blant hydroksyl, halogen, cyano, trifluormetyl, nitro, karboksyl, (C2-C16)-alkyl, (C3-C8)sykloalkyl, (C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C12)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkoksy, (C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C12)-alkoksy, (C3-C8)-sykloalkyloksy-(C1-C12)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkyloksy-(C1-C12)-alkoksy, (C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C8)-alkyl-(C1-C6)-alkoksy, (C3-C8)-sykloalkyl(C1-C8)-alkoksy-(C1-C6)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkyloksy-(C1-C8)-alkoksy-(C1-C6)alkyl, (C3-C8)-sykloalkoksy-(C1-C8)-alkoksy-(C1-C8)-alkoksy, (C6-C12)-aryl, (C7-C16)-aralkyl, (C2-C16)-alkenyl, (C2-C12)-alkynyl, (C1-C16)-alkoksy, (C1-C16)-alkenyloksy, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkyl, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkoksy, (C1-C12)-alkoksy(C1-C8)-alkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C6-C12)-aryloksy, (C7-C16)-aralkyloksy, (C6-C12)-aryloksy-(C1-C6)-alkoksy, (C7-C16)-aralkoksy-(C1-C6)-alkoksy, (C1-C8)-hydroksyalkyl, (C6-C16)-aryloksy-(C1-C8)-alkyl, (C7-C16)-aralkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C6-C12)-aryloksy-(C1-C8)-alkoksy-(C1-C6)-alkyl, (C7-C12)-aralkyloksy-(C1-C8)-alkoksy-(C1-C6)-alkyl, -O-[CH2]xCfH(2f+1-g)Fg, -OCF2Cl, -OCF2-CHFCl, (C1-C12)-alkylkarbonyl, (C3-C8)-sykloalkylkarbonyl, (C6-C12)-arylkarbonyl, (C7-C16)-aralkylkarbonyl, (C1-C12)-alkoksykarbonyl, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkoksykarbonyl, (C6-C12)-aryloksykarbonyl, (C7-C16)-aralkoksykarbonyl, (C3-C8)-sykloalkoksykarbonyl, (C2-C12)-alkenyloksykarbonyl, (C2-C12)-alkynyloksykarbonyl, (C6-C12)-aryloksy-(C1-C6)-alkoksykarbonyl, (C7-C16)-aralkoksy-(C1-C6)-alkoksykarbonyl, (C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C6)-alkoksykarbonyl, (C3-C8)-sykloalkoksy-(C1-C6)-alkoksykarbonyl, (C1-C12)-alkylkarbonyloksy, (C3-C8)-sykloalkylkarbonyloksy, (C6-C12)-arylkarbonyloksy, (C7-C16)-aralkylkarbonyloksy, cinnamoyloksy, (C2-C12)-alkenylkarbonyloksy, (C2-C12)-alkynylkarbonyloksy, (C1-C12)-alkoksykarbonyloksy, (C1-C12)-alkoksy-(C1-C12)-alkoksykarbonyloksy, (C6-C12)-aryloksykarbonyloksy, (C7-C16)-aralkyloksykarbonyloksy, (C3-C8)-sykloalkoksykarbonyloksy, (C2-C12)-alkenyloksykarbonyloksy, (C2-C12)-alkynyloksykarbonyloksy, karbamoyl, N-(C1-C12)-alkylkarbamoyl, N,N-di(C1-C12)-alkylkarbamoyl, N-(C3-C8)sykloalkylkarbamoyl, N,N-disyklo-(C3-C8)-alkylkarbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C3-C8)-sykloalkylkarbamoyl, N-((C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C6)-alkyl)karbamoyl, N-(C1-C6)-alkyl-N-((C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C6)-alkyl)karbamoyl, N-(+)-dehydroabietylkarbamoyl, N-(C1-C6)-alkyl-N-(+)-dehydroabietylkarbamoyl, N-(C6-C12)-arylkarbamoyl, N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C6-C16)-arylkarbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyl, N-((C1-C16)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)karbamoyl, N-((C6-C16)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)karbamoyl, N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C1-C10)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C6-C12)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)karbamoyl, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)-karbamoyl, CON(CH2)h, hvori en CH2-gruppen kan erstattes med O, S, N-(C1-C8)-alkylimino, N-(C3-C8)-sykloalkylimino, N-(C3-C8)-sykloalkyl-(C1-C4)-alkylimino, N-(C6-C12)-arylimino, N-(C7-C16)-aralkylimino, N-(C1-C4)-alkoksy-(C1-C6)-alkylimino og h er fra 3 til 7; karbamoyloksy, N-(C1-C12)-alkylkarbamoyloksy, N,N-di-(C1-C12)-alkylkarbamoyloksy, N-(C3-C8)-sykloalkylkarbamoyloksy, N-(C6-C16)-arylkarbamoyloksy, N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C6-C12)-arylkarbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-(C7-C16)-aralkylkarbamoyloksy, N-((C1-C10)-alkyl)karbamoyloksy, N-((C6-C12)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)karbamoyloksy, N-((C7-C16)-aralkyloky-(C1-C10)-alkyl)karbamoyloksy-N-(C1-C10)-alkyl-N-((C1-C10)-alkoksy-(C1-C10)-alkyl)karbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C6-C12)-aryloksy-(C1-C10)-alkyl)karbamoyloksy, N-(C1-C10)-alkyl-N-((C7-C16)-aralkyloksy-(C1-C10)-alkyl)karbamoyloksy, amino, (C1-C12)-alkylamino, di-(C1-C12)-alkylamino, (C3-C8)-sykloalkylamino, (C3-C12)-alkenylamino, (C3-C12)-alkynylamino, N-(C6-C12)-arylamino, N-(C7-C11)-aralkylamino, N-alkylaralkylamino, N-alkylarylamino, (C1-C12)-alkoksyamino, (C1-C12)-alkoksy-N-(C1-C10)-alkylamino, (C1-C12)-alkanoylamino, (C3-C8)-sykloalkanoylamino, (C6-C12)-aroylamino, (C7-C16)-aralkanoylamino, (C1-C12)-alkanoyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C3-C8)-sykloalkanoyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C6-C12)-aroyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C7-C11)-aralkanoyl-N-(C1-C10)-alkylamino, (C1-C12)-alkanoylamino-(C1-C8)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkanoylamino-(C1-C8)-alkyl, (C6-C12)-aroylamino-(C1-C8)-alkyl, (C7-C16)-aralkanoylamino(C1-C8)-alkyl, amino-(C1-C10)-alkyl, N-(C1-C10)-alkylamino-(C1-C10)-alkyl, N,N-di-(C1-C10)-alkylamino-(C1-C10)-alkyl, (C3-C8)-sykloalkylamino-(C1-C10)-alkyl, (C1-C12)-alkylmerkapto, (C1-C12)-alkylsulfinyl, (C1-C12)-alkylsulfonyl, (C6-C16)-arylmerkapto, (C6-C16)-arylsulfinyl, (C6-C16)-arylsulfonyl, (C7-C16)-aralkylmerkapto, (C7-C16)-aralkylsulfinyl eller (C7-C16)-aralkylsulfonyl;

eller hvori R<1>og R<2>eller R<2>og R<3>danner en kjede [CH2]osom er mettet eller umettet med en C=C-dobbeltbinding, hvori 1 eller 2 CH2-grupper eventuelt er erstattet med O, S, SO, SO2eller NR' og R' er hydrogen, (C6-C12)-aryl, (C1-C8)-alkyl, (C1-C8)-alkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C7-C12)-aralkoksy-(C1-C8)-alkyl, (C6-C12)aryloksy-(C1-C8)-alkyl, (C1-C10)-alkanoyl, eventuelt substituert (C7-C16)-aralkanoyl eller eventuelt substituert (C6-C12)-aroyl; og o er 3, 4 eller 5;

eller hvori radikalene R<1>og R<2>eller R<2>og R<3>sammen med pyridinet eller pyridazinet de er bundet til danner en 5,6,7,8-tetrahydroisokinolinring, en 5,6,7,8-tetrahydrokinolinring eller en 5,6,7,8-tetrahydrocinnolinring;

eller hvori R<1>og R<2>eller R<2>og R<3>danner en karbosyklisk eller heterosyklisk aromatisk ring med fra 5 til 6 medlemmer;

eller hvori R<1>og R<2>eller R<2>og R<3>sammen med pyridinet eller pyridazinet de er bundet til danner et eventuelt substituert heterosyklisk ringsystem utvalgt blant tienopyridiner, furanopyridiner, pyridopyridiner, pyrimidinopyridiner, imidazopyridiner, tiazolopyridiner, oksazolopyridiner, kinolin, isokinolin og cinnolin; hvori kinolin, isokinolin eller cinnolin fortrinnsvis tilfredsstiller formlene Ia, Ib og Ic:

og hvori substituentene R<12>til R<23>i alle tilfeller uavhengig av hverandre har samme betydning som R<1>, R<2>og R<3>;

eller hvori radikalene R<1>og R<2>sammen med pyridingruppen de er bundet til danner en forbindelse med formel Id:

hvori V er S, O eller NR<k>og R<k>er utvalgt blant hydrogen, (C1-C6)-alkyl, aryl eller benzyl; hvori et arylradikal om ønskelig kan være substituert med fra 1 til 5 substituenter som definert ovenfor; og

R<24>, R<25>, R<26>og R<27>i alle tilfeller uavhengig av hverandre har samme betydning som R<1>, R<2>og R<3>;

f er fra 1 til 8;

g er 0 eller fra 1 til (2f+1);

x er fra 0 til 3; og

h er fra 3 til 7;

omfattende fysiologisk aktive salter og promedikamenter avledet derav.

Eksempler på forbindelser ifølge formel (I) er beskrevet i de europeiske patentskriftene EP0650960 og EP0650961. Alle forbindelser som er opplistet i EP0650960 og EP0650961, særlig de som er opplistet i forbindelseskravene og de endelige produktene i arbeidseksemplene, inkorporeres i den foreliggende patentsøknaden ved referanse. Eksempler på forbindelser med formel (I) omfatter, men er ikke begrenset til, [(3-hydroksypyridin-2-karbonyl)amino]eddiksyre og [(3-metoksypyridin-2-karbonyl)amino]eddiksyre.

I tillegg er eksempler på forbindelser ifølge formel (I) beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5,658,933. Alle forbindelser som er opplistet i U.S. patentskrift nr. 5,658,933, særlig de som er opplistet i forbindelseskravene og de endelige produktene i arbeidseksemplene, inkorporeres i den foreliggende patentsøknaden ved referanse. Eksempler på forbindelser med formel (I) omfatter, men er ikke begrenset til, 3-metoksypyridin-2-karboksylsyre N-(((heksadecyloksy)karbonyl)metyl)amidhydrokorid, 3-metoksypyridin-2-karboksylsyre N-(((1-oktyloksy)karbonyl)metyl)-amid, 3-metoksypyridin-2-karboksylsyre N-(((1-oktyloksy)karbonyl)metyl)amid, 3-metoksypyridin-2-karboksylsyre N-(((heksyloksy)karbonyl)metyl)amid, 3-metoksypyridin-2-karboksylsyre N-(((butyloksy)karbonyl)metyl)amid, 3-metoksypyridin-2-karboksylsyre N-(((2-nonyloksy)karbonyl)metyl)amidrasemat, 3-metoksypyridin-2-karboksylsyre N-(((heptyloksy)karbonyl)metyl)amid, 3-benzyloksypyridin-2-karboksylsyre N-(((oktyloksy)karbonyl)metyl)amid, 3-benzyloksypyridin-2-karboksylsyre N-(((butyloksy)karbonyl)metyl)amid, 5-(((-3-(1-butyloksy)propyl)amino)karbonyl)-3-metoksypyridin-2-karboksylsyre N-((benzyloksykarbonyl)metyl)amid, 5-(((3-(1-butyloksy)propyl)amino)karbonyl)-3-metoksypyridin-2-karboksylsyre N-(((1-butyloksy)karbonyl)metyl)amid og 5-(((3-lauryloksy)propyl)amino)karbonyl)-3-metoksypyridin-2-karboksylsyre N-(((benzyloksy)karbonyl)metyl)amid.

Ytterligere forbindelser ifølge formel (I) er substituerte heterosykliske karboksyamider som beskrives i U.S. patentskrift nr. 5,620,995; 3-hydroksypyridin-2-karboksamidoestere som beskrives i U.S. patentskrift nr. 6,020,350; sulfonamidokarbonylpyridin-2-karboksamider som beskrives i U.S. patentskrift nr.

5,607,954; og sulfonamidokarbonylpyridin-2-karboksamider og sulfonamidokarbonylpyridin-2-karboksamidestere som beskrives i U.S. patentskrift nr. 5,610,172 og 5,620,996. Alle forbindelser som er opplistet i disse patentskriftene, særlige forbindelsene som er opplistet i forbindelseskravene og de endelige produktene i arbeidseksemplene, inkorporeres i den foreliggende patentsøknaden ved referanse.

Eksempler på forbindelser ifølge formel (Ia) er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5,719,164 og 5,726,305. Alle forbindelser som er opplistet i disse patentskriftene, særlig forbindelsene som er opplistet i forbindelseskravene og i de endelige produktene i arbeidseksemplene, inkorporeres i den foreliggende patentsøknaden ved referanse. Eksempler på forbindelser med formel (Ia) omfatter, men er ikke begrenset til, N-((3-hydroksy-6-isopropoksykinolin-2-karbonyl)amino)eddiksyre, N-((6-(1-butyloksy)-3-hydroksykinolin-2-yl)karbonyl)glysin, [(3-hydroksy-6-trifluormetoksykinolin-2-karbonyl)amino]eddiksyre, N-((6-klor-3-hydroksykinolin-2-yl)karbonyl)glysin, N-((7-klor-3-hydroksykinolin-2-yl)karbonyl)glysin og [(6-klor-3-hydroksykinolin-2-karbonyl)amino]eddiksyre.

Eksempler på forbindelser ifølge formel (Ib) beskrives i U.S. patentskrift nr.

6,093,730. Alle forbindelser som er opplistet i U.S. patentskrift nr. 6,093,730, særlig de som er opplistet i forbindelseskravene og de endelige produktene fra arbeidseksemplene, inkorporeres i den foreliggende patentsøknaden ved referanse. Eksempler på forbindelser med formel (Ib) omfatter, men er ikke begrenset til, N-((1-klor-4-hydroksy-7-(2-propyloksy)isokinolin-3-yl)karbonyl)glysin, N-((1-klor-4-hydroksy-6-(2-propyloksy)isokinolin-3-yl)karbonyl)glysin, N-((1-klor-4-hydroksyisokinolin-3-karbonyl)amino)eddiksyre (forbindelse A), N-((1-klor-4-hydroksy-7-metoksyisokinolin-3-yl)karbonyl)glysin, N-(1-klor-4-hydroksy-6-metoksyisokinolin-3-yl)karbonyl)glysin, N-((7-butyloksy)-1-klor-4-hydroksyisokinolin-3-yl)karbonyl)glysin, N-((6-benzyloksy-1-klor-4-hydroksyisokinolin-3-karbonyl)amino)eddiksyre, ((7-benzyloksy-1-klor-4-hydroksyisokinolin-3-karbonyl)amino)eddiksyremetylester, N-((7-benzyloksy-1-klor-4-hydroksyisokinolin-3-karbonyl)amino)eddiksyre, N-((8-klor-4-hydroksyisokinolin-3-yl)karbonyl)glysin, N-((7-butoksy-4-hydroksyisokinolin-3-karbonyl)amino)eddiksyre.

Ytterligere forbindelser ifølge formel (I) som også kan anvendes i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til, 6-sykloheksyl-1-hydroksy-4-metyl-1H-pyridin-2-on, 7-(4-metylpiperazin-1-ylmetyl)-5-fenylsulfanylmetylkinolin-8-ol, 4-nitrokinolin-8-ol, 5-butoksymetylkinolin-8-ol, [(4-hydroksy-7-fenoksyisokinolin-3-karbonyl)amino]eddiksyre (forbindelse B) og [(4-hydroksy-7-fenylsulfanylisokinolin-3-karbonyl)amino]eddiksyre (forbindelse C). Videre tilveiebringer oppfinnelsen ytterligere eksempler på forbindelser hvori for eksempel posisjon A og B sammen kan være for eksempel heksansyre, cyanometyl, 2-aminoetyl, benzosyre, 1H-benzoimidazol-2-ylmetyl, osv.

I andre utførelser er forbindelser som anvendes i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen utvalgt blant forbindelser med formel (III)

eller farmasøytisk akseptable salter derav, hvori:

a er et helt tall fra 1 til 4;

b er et helt tall fra 0 til 4;

c er et helt tall fra 0 til 4;

Z er utvalgt fra gruppen som består av (C3-C10)sykloalkyl, (C3-C10)sykloalkyl uavhengig substituert med en eller flere Y<1>, heterosykloalkyl med 3-10 medlemmer og heterosykloalkyl med 3-10 medlemmer som uavhengig av hverandre er substituert med en eller flere Y<1>; (C5-C20)aryl, (C5-C20)aryl som uavhengig er substituert med en eller flere Y<1>, heteroaryl med 5-20 medlemmer og heteroaryl med 5-20 medlemmer som uavhengig av hverandre er substituert med en eller flere Y<1>;

Ar<1>er utvalgt fra gruppen som består av (C5-C20)aryl, (C5-C20)aryl som uavhengig er substituert med en eller flere Y<2>, heteroaryl med 5-20 medlemmer og heteroaryl med 5-20 medlemmer som uavhengig av hverandre er substituert med en eller flere Y<2>;

hver Y<1>er uavhengig av de andre utvalgt fra gruppen som består av en lipofil funksjonell gruppe, (C5-C20)aryl, (C6-C26)alkaryl, heteroaryl med 5-20 medlemmer og alk-heteroaryl med 6-26 medlemmer;

hver Y<2>er uavhengig av de andre utvalgt fra gruppen som består av -R', -OR', -OR'', -SR'', -NR'R', -NO2, -halogen, -trihalometyl, trihalometoksy, -C(O)R', -C(O)OR', -C(O)NR'R', -C(O)NR'OR', -C(NR'R')=NOR', -NR'-C(O)R', -SO2R', -SO2R'', -NR'-SO2-R', -NR'-C(O)-NR'R', tetrazol-5-yl, -NR'-C(O)-OR', -C(NR'R')=NR', -S(O)-R', -S(O)-R'' og -NR'-C(S)-NR'R'; og

hver R' er uavhengig av de andre utvalgt fra gruppen som består av -H, (C1-C8)alkyl, (C2-C8)alkenyl og (C2-C8)alkynyl; og

hver R'' er uavhengig av de andre utvalgt fra gruppen som består av (C5-C20)aryl og (C5-C20)aryl som uavhengig er substituert med en eller flere -OR', -SR', -NR'R', -NO2, -CN, halogenatomer eller trihalometylgrupper,

eller hvori c er 0 og Ar<1>er en N'-substituert ureaaryl, hvor forbindelsen har strukturformelen (IIIa):

eller farmasøytisk akseptable salter derav, hvori:

a, b og Z er som definert ovenfor; og

R<35>og R<36>uavhengig av hverandre er utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, (C1-C8)alkyl, (C2-C8)alkenyl, (C2-C8)alkynyl, (C3-C10)sykloalkyl, (C5-C20)aryl, (C5-C20) substituert aryl, (C6-C26)alkaryl, (C6-C26) substituert alkaryl, heteroaryl med 5-20 medlemmer, substituert heteroaryl med 5-20 medlemmer, alk-heteroaryl med 6-26 medlemmer og substituert alk-heteroaryl med 6-26 medlemmer; og

R<37>er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, (C1-C8)alkyl, (C2-C8)alkenyl og (C2-C8)alkynyl.

Eksempler på forbindelser med formel (III) er beskrevet i internasjonal patentpublikasjon WO 00/50390. Alle forbindelser som er opplistet i WO 00/50390, særlig de som er opplistet i forbindelseskravene og de endelige produktene i arbeidseksemplene, inkorporeres i den foreliggende patentsøknaden ved referanse. Eksempler på forbindelser med formel (III) omfatter 3-{[4-(3,3-dibenzylureido)benzensulfonyl]-[2-(4-metoksyfenyl)etyl]amino}-N-hydroksypropionamid (forbindelse D), 3-{{4-[3-(4-klorfenyl)ureido]benzensulfonyl}-[2-(4-metoksyfenyl)etyl]amino}-N-hydroksyproprionamid og 3-{{4-[3-(1,2-difenyletyl)ureido]benzensulfonyl}-[2-(4-metoksyfenyl)etyl]amino}-N-hydroksypropionamid.

Fremgangsmåter for påvisning av forbindelser ifølge oppfinnelsen tilveiebringes også. I visse aspekter er en forbindelse ifølge oppfinnelsen en forbindelse som stabiliserer HIF α. En forbindelses evne til å stabilisere eller aktivere HIF α kan for eksempel måles ved direkte måling av HIF α i en prøve, indirekte måling av HIF α, for eksempel ved å måle en nedgang av HIF α assosiert med von Hippell Lindauproteinet (se for eksempel internasjonal patentpublikasjon nr. WO 00/69908) eller aktivering av HIF-responderende målgener eller rapportørkonstruksjoner (se for eksempel U.S. patentskrift nr. 5,942,434). Måling og sammenligning av nivået av HIF og/eller HIF-responderende målproteiner i fravær og nærvær av forbindelsen vil påvise forbindelser som stabiliserer HIF α og/eller aktiverer HIF.

I andre aspekter er en forbindelse ifølge oppfinnelsen en forbindelse som inhiberer HIF-hydroksylaseaktivitet. Analyser for hydroksylaseaktivitet er standardmessige innen faget. Slike analyser kan måle hydroksylaseaktivitet direkte eller indirekte. En analyse kan for eksempel måle hydroksylerte aminosyrerester, for eksempel prolin, asparagin, osv., som foreligger i enzymsubstratet, for eksempel et målprotein, et syntetisk peptid som ligner på målproteinet eller et fragment derav (se for eksempel Palmerini et al. (1985) J Chromatogr 339: 285-292). En reduksjon av mengden hydroksylert aminosyrerest, for eksempel prolin eller asparagin, i nærværet av en forbindelse, tyder på en forbindelse som inhiberer hydroksylaseaktivitet. Alternativt kan analysene måle andre produkter fra hydroksyleringsreaksjonen, for eksempel dannelse av succinat fra 2-oksoglutarat (se for eksempel Cunliffe et al. (1986) Biochem J 240: 617-619). Kaule og Gunzler (1990; Anal Biochem 184: 291-297) beskriver et eksempel på en fremgangsmåte som måler dannelsen av succinat fra 2-oksoglutarat.

Fremgangsmåter så som de beskrevet ovenfor kan anvendes for påvisning av forbindelser som modulerer HIF-hydroksylaseaktivitet. Målproteinet kan omfatte HIF α eller et fragment derav, for eksempel HIF(556-575). Enzymet kan omfatte for eksempel HIF-prolylhydroksylase (se for eksempel GenBank aksesjonsbetegnelse AAG33965, osv.) eller HIF-asparaginylhydroksylase (se for eksempel GenBank aksesjonsbetegnelse AAL27308, osv.), erholdt fra en hvilken som helst kilde.

Enzymet kan også foreligge i et urent cellelysat eller i delvis renset form.

Fremgangsmåter som måler HIF-hydroksylaseaktivitet beskrevet i for eksempel Ivan et al. (2001, Science 292: 464-468; og 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99:

13459-13464) og Hirsila et al. (2003, J Biol Chem 278: 30772-30780); ytterligere fremgangsmåter beskrives i internasjonal patentpublikasjon WO 03/049686. Måling og sammenligning av enzymaktivitet i fravær og nærvær av forbindelsen vil påvise forbindelser som inhiberer hydroksylering av HIF α.

En forbindelse ifølge oppfinnelsen er forbindelse som videre gir en målbar virkning, målt in vitro eller in vivo, påvist ved forhøyet erytropoiese, forhøyet jernmetabolisme eller en terapeutisk forbedring av tilstander som for eksempel omfatter jernmangel, innbefattet funksjonell jernmangel; anemi forbundet med kronisk sykdom, jernmangel og mikrocytose eller mikrocyttisk anemi; eller en tilstand forbundet med betennelse, infeksjon, immunsvikt eller en neoplastisk lidelse.

Den målbare virkningen kan være en hvilken som helst av de følgende parameterne: Økt hemoglobin, hematokritt, retikulocytt, antall røde blodceller, plasma-EPO, osv.; forbedret jernmetabolisme, målt ved reduksjon av observerte symptomer innbefattet for eksempel lindring av kronisk tretthet, pallor, svimmelhet, osv. eller ved forhøyet jernnivå i serum, endret nivå av ferritin i serum, % transferrinmetning, total jernbindingskapasitet, forbedret retikulocyttall, hemoglobin eller hematokritt, alle målt ved en standard blodtallsanalyse.

Farmasøytiske preparater og administreringsveier

Sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan tilføres direkte eller i farmasøytiske sammensetninger som omfatter eksipienter som er velkjente innen faget. Aktuelle behandlingsfremgangsmåter kan omfatte administrering av en effektiv mengde av en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen til et individ som har eller er utsatt for å få en metabolsk lidelse; fortrinnsvis en lidelse forbundet med glukoseregulering, for eksempel diabetes, hyperglykemi, osv. I en foretrukket utførelse er individet et pattedyr og i en mest foretrukket utførelse er individet et menneske.

En effektiv mengde, for eksempel en dose, av en forbindelse eller et medikament kan lett fastslås ved rutinemessig eksperimentering, likeså en effektiv og hendig administreringsvei og en egnet utforming. Forskjellige utforminger og medikamenttilførselssystemer er tilgjengelige innen faget. (Se for eksempel Gennaro, red. (2000) Remington's Pharmaceutical Sciences, supra; og Hardman, Limbird og Gilman, red. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, supra).

Egnede administrasjonsveier kan for eksempel omfatte oral, rektal, topisk, nasal, pulmonal, okulær, intestinal og parenteral administrering. Primære veier for parenteral administrering omfatter intravenøs, intramuskulær og subkutan administrering. Sekundære administreringsveier omfatter intraperitoneal, intraarteriell, intraartikulær, intrakardial, intracisternal, intradermal, intralesjonal, intraokulær, intrapleural, intratekal, intrauretinal og intraventrikulær administrering. Tilstanden som skal behandles vil sammen med medikamentets fysiske, kjemiske og biologiske egenskaper bestemme hva slags type utforming og hvilken administrasjonsvei som skal benyttes, så vel som hvorvidt lokal eller systemisk tilførsel vil foretrekkes.

Farmasøytiske doseringsformer av en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringes i et system for umiddelbar frigjøring, kontrollert frigjøring, vedvarende frigjøring eller målstyrt medikamenttilførsel. Vanlig anvendte doseringsformer omfatter for eksempel løsninger og suspensjoner, (mikro-) emulsjoner, salver, geler og plastere, liposomer, tabletter, drops, kapsler med mykt eller hardt skall, stikkpiller, ovuler, implantater, amorfe eller krystallinske pulvere, aerosoler og frysetørkede utforminger. Avhengig av den anvendte administrasjonsveien, kan det være nødvendig med spesielle innretninger for påføring eller administrering av medikamentet, for eksempel sprøyter og kanyler, inhalatorer, pumper, injeksjonspenner, applikatorer eller spesielle flasker.

Farmasøytiske doseringsformer består ofte av medikamentet, en eller flere eksipienter og en beholder/et innelukkingssystem. En eller flere eksipienter, også betegnet inaktive bestanddeler, kan tilsettes til en forbindelse ifølge oppfinnelsen for å forbedre eller lette fremstilling, stabilitet, administrering og sikkerhet av medikamentet og kan utgjøre midler for å oppnå en ønsket medikamentfrigjøringsprofil. Hvilken eller hvilke typer eksipienter som skal tilsettes til medikamentet kan følgelig avhenge av forskjellige faktorer, for eksempel medikamentets fysiske og kjemiske egenskaper, administrasjonsveien og fremstillingsfremgangsmåten. Farmasøytisk akseptable eksipienter er tilgjengelige innen faget og omfatter dem som er opplistet i forskjellige farmakopoeiaer. (Se for eksempel USP, JP, EP og BP, FDA nettsiden (www.fda.gov), Inactive Ingredient Guide 1996 og Handbook of Pharmaceutical Additives, red. Ash; Synapse Information Resources, Inc. 2002).

Farmasøytiske doseringsformer av en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan fremstilles ved en hvilken som helst av fremgangsmåtene som er velkjente innen faget, for eksempel ved konvensjonelle fremgangsmåter som blanding, sikting, oppløsning, smelting, granulering, dropsfremstilling, tablettfremstilling, suspendering, ekstrudering, sprøytetørking, pulverisering, emulgering, (nano/mikro-) innkapsling, innfanging eller frysetørking. Som bemerket ovenfor, kan sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatte en eller flere fysiologisk akseptable inaktive bestanddeler som letter prosesseringen av aktive molekyler til preparater for farmasøytisk anvendelse.

Egnet utforming vil avhenge av den ønskede administrasjonsveien. For intravenøs injeksjon kan for eksempel sammensetningen utformes i vandig løsning, om nødvendig ved anvendelse av fysiologisk kompatible buffere, innbefattet for eksempel fosfat, histidin eller citrat for justering av utformingens pH og et tonisitetsmiddel så som for eksempel natriumklorid eller dekstrose. For transmukosal eller nasal administrering kan halvfaste eller flytende preparater eller plastere være å foretrekke, muligens inneholdende penetrasjonsfremmende midler. Slike penetrasjonsfremmende midler er generelt kjente innen faget. For oral administrering kan forbindelsene utformes i flytende eller faste doseringsformer og som utforminger for umiddelbar eller kontrollert/vedvarende frigjøring. Egnede doseringsformer for oralt inntak omfatter tabletter, piller, drops, kapsler med hardt og mykt skall, væsker, geler, siruper, grøter, suspensjoner og emulsjoner.

Forbindelsene kan også utformes til rektale sammensetninger så som stikkpiller eller retensjonsklysterer, som for eksempel inneholder konvensjonelle stikkpillematerialer så som kakaosmør eller andre glyserider.

Faste orale doseringsformer kan erholdes ved anvendelse av eksipienter som kan omfatte fyllstoffer, desintegrasjonsmidler, bindemidler (tørre og våte), oppløsningsretarderende midler, smøremidler, glidemidler, antiklebemidler, kationbytteharpikser, fuktemidler, antioksidanter, konserveringsmidler, fargestoffer og smaksmidler. Disse eksipientene kan være syntetiske eller naturlige. Eksempler på slike eksipienter omfatter cellulosederivater, sitronsyre, dikalsiumfosfat, gelatin, magnesiumkarbonat, magnesium/natriumlaurylsulfat, mannitol, polyetylenglykol, polyvinylpyrrolidon, silikater, silsiumdioksid, natriumbenzoat, sorbitol, stivelser, stearinsyre eller et stearinsyresalt, sukkere (for eksempel dekstrose, sukrose, laktose, osv.), talkum, tragakantgummi, vegetabilske oljer (hydrogenerte) og vokser. Etanol og vann kan fungere som granuleringshjelpemidler. I visse tilfeller er belegging av tabletter med for eksempel smaksmaskerende film eller magesyreresistent film eller en frigjøringsretarderende film ønskelig. Naturlige og syntetiske polymerer i kombinasjon med fargestoffer, sukkere og organiske løsemidler eller vann anvendes ofte for belegging av tabletter, noe som fører til drops. Dersom en kapsel foretrekkes fremfor en tablett, kan medikamentpulveret, -suspensjonen eller -løsningen leveres i en forenlig kapsel med hardt eller mykt skall.

I en utførelse kan forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen administreres topisk, så som gjennom et hudplaster, et halvfast eller flytende preparat, for eksempel en gel, en (mikro-) emulsjon, en salve, en løsning, en (nano/mikro-) suspensjon eller et skum. Penetrasjonen av medikamentet inn i huden og de underliggende vev kan for eksempel reguleres ved å anvende penetrasjonsfremmende midler; et egnet valg og en egnet kombinasjon av lipofile, hydrofile og amfifile eksipienter innbefattet vann, organiske løsemidler, vokser, oljer, syntetiske og naturlige polymerer, overflateaktive midler og emulsjonsmidler; ved justering av pH; og ved anvendelse av kompleksdannende midler. Andre teknikker så som iontoforese kan anvendes for å regulere hudpenetrasjonen av en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Transdermal eller topisk administrering vil for eksempel foretrekkes i situasjoner hvor lokal tilførsel med minimal systemisk eksponering er ønskelig.

For administrering ved inhalering eller administrasjon til nesen, leveres forbindelsene for anvendelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen med fordel i form av en løsning, en suspensjon, en emulsjon eller en halvfast aerosol fra beholdere under trykk eller en nebulisator, vanligvis ved anvendelse av en drivgass, for eksempel halogenerte karboner avledet fra metan og etan, karbondioksid eller enhver annen egnet gass. For topiske aerosoler er hydrokarboner som butan, isobuten og pentan anvendbare. Når det gjelder en aerosol under trykk, kan den egnede doseringsenheten bestemmes ved å utstyre beholderen med en ventil som leverer en på forhånd bestemt mengde. Kapsler og patroner av for eksempel gelatin for anvendelse i en inhalator eller insufflator kan utformes. Disse inneholder typisk en pulverblanding av forbindelsen og en egnet pulverbase så som laktose eller stivelse.

Sammensetninger utformet for parenteral administrering ved injeksjon er vanligvis sterile og kan foreligge i enhetsdoseformer, for eksempel i ampuller, sprøyter, injeksjonspenner eller i flerdosebeholdere, hvor disse siste vanligvis inneholder et konserveringsmiddel. Sammensetningene kan være utformet som suspensjoner, løsninger eller emulsjoner i oljebaserte eller vandige bærerstoffer og kan inneholde utformingsmidler så som buffere, tonisitetsmidler, viskositetsforhøyende midler, overflateaktive midler, suspensjons- og dispergeringsmidler, antioksidanter, biokompatible polymerer, gelateringsmidler og konserveringsmidler. Avhengig av injeksjonssetet, kan bærerstoffet inneholde vann, en syntetisk eller vegetabilsk olje og/eller organiske tilleggsløsemidler. I visse tilfeller så som med et frysetørket produkt eller et konsentrat, vil den parenterale utformingen rekonstitueres eller fortynnes før administrering. Deponeringsutforminger som gir kontrollert eller vedvarende frigjøring av en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan omfatte injiserbare suspensjoner av nano/mikropartikler, nano/mikrokrystaller eller ikke-mikroniserte krystaller. Polymerer som poly(melkesyre), poly(glykolsyre) eller sampolymerer av disse kan fungere som støttemidler for kontrollert/vedvarende frigjøring, i tillegg til andre som er velkjente innen faget. Andre deponeringstilførselssystemer kan foreligge i form av implantater og pumper som krever kirurgiske inngrep.

Egnede bærere for intravenøs injeksjon av molekylene ifølge oppfinnelsen er velkjente innen faget og omfatter vannbaserte løsninger som inneholder en base så som for eksempel natriumhydroksid, slik at det dannes en ionisert forbindelse, sukrose eller natriumklorid som et tonisitetsmiddel og en buffer som inneholder fosfat eller histidin. Tilleggsløsemidler så som for eksempel polyetylenglykoler kan tilsettes. Disse vannbaserte systemene oppløser effektivt forbindelser ifølge oppfinnelsen og gir lav toksisitet ved systemisk administrering. Mengdeforholdet mellom bestanddelene i et oppløst system kan varieres betraktelig uten å ødelegge løselighetsegenskapene og toksisitetsegenskapene. Videre kan bestanddelenes identitet varieres. For eksempel kan det benyttes overflateaktive midler med lav toksisitet så som polysorbater eller polyoksamerer, og likeså polyetylenglykol eller andre tilleggsløsemidler, biokompatible polymerer så som polyvinylpyrrolidon kan tilsettes og andre sukkere og polyoler kan erstatte dekstrose.

For sammensetninger som er anvendbare for de foreliggende behandlingsfremgangsmåtene, kan en terapeutisk effektiv dose i utgangspunktet estimeres ved anvendelse av en rekke teknikker som er velkjente innen faget.

Innledende doser for anvendelse i dyreundersøkelser kan bygge på effektive konsentrasjoner etablert i celledyrkningsanalyser. Doseringsområder som passer for mennesker kan bestemmes ved for eksempel å anvende resultater erholdt fra dyreundersøkelser og celledyrkningsanalyser.

En terapeutisk effektiv dose eller mengde av en forbindelse, et middel eller et medikament ifølge den foreliggende oppfinnelsen viser til en mengde eller dose av forbindelsen, middelet eller medikamentet som fører til lindring av symptomer eller forlenget overlevelse i et individ. Slike molekylers toksisitet og terapeutiske virkning kan bestemmes ved standardmessige farmasøytiske fremgangsmåter i cellekulturer eller forsøksdyr, for eksempel ved å bestemme LD50 (dosen som er dødelig for 50% av populasjonen) og ED50 (dosen som er terapeutisk effektiv i 50% av populasjonen). Doseforholdet med toksiske og terapeutiske virkninger er den terapeutiske indeksen, som kan uttrykkes som forholdet LD50/ED50. Midler som viser høy terapeutisk indeks foretrekkes.

Den effektive mengden eller terapeutisk effektive mengden er den mengde av forbindelsen eller den farmasøytiske sammensetningen som vil utløse den biologiske eller medisinske responsen i et vev, et system, et dyr eller et menneske som ønskes av forskeren, veterinæren, legen eller annet klinisk personell, for eksempel regulering av glukosemetabolisme, reduksjon av et forhøyet eller forøkt glukosenivå i blodet, behandling eller forebygging av en lidelse forbundet med endret glukosemetabolisme, for eksempel diabetes, osv.

Doser ligger fortrinnsvis innenfor et område av konsentrasjoner i sirkulasjonen som omfatter ED50 med liten eller ingen toksisitet. Dosene kan variere innenfor dette området avhengig av den benyttede doseringsformen og/eller den anvende administrasjonsveien. Den nøyaktige utforming, administrasjonsvei og dose og det nøyaktige doseringsskjemaet bør utvelges ifølge fremgangsmåter som er kjente innen faget i lys av detaljene vedrørende pasientens tilstand.

Doseringsmengden og doseringsskjemaet kan justeres individuelt for erholdelse av et plasmanivå av den aktive gruppen som er tilstrekkelig til å oppnå de ønskede virkningene, for eksempel regulering av glukosemetabolismen, reduksjon av glukosenivået i blodet, osv., det vil si den minimale effektive konsentrasjonen (MEC). MEC vil variere for de enkelte forbindelsene, men kan for eksempel estimeres ut fra in vitro resultater og dyreforsøk. Dosene som er nødvendige for å oppnå MEC vil avhenge av pasientens egenskaper og administrasjonsveien. Når det gjelder lokal administrering eller selektivt opptak, er den effektive lokale konsentrasjonen av medikamentet ikke nødvendigvis forbundet med plasmakonsentrasjonen.

Mengden av middel eller sammensetning som administreres kan avhenge av en rekke faktorer, innbefattet kjønn, alder og vekt for individet som behandles, tilstandens omfang, administrasjonsmåten og den behandlende leges vurderinger.

De foreliggende sammensetningene kan om ønskelig foreligge i en pakke eller dispenserinnretning som inneholder en eller flere enhetsdoseformer som inneholder den aktive bestanddelen. En slik pakke eller innretning kan for eksempel omfatte metall- eller plastfolie så som en boblepakke eller glass og gummikorker, for eksempel som i en medisinflaske. Pakken eller dispenserinnretningen kan ledsages av instruksjoner for administrering. Sammensetninger som omfatter en forbindelse ifølge oppfinnelsen utformet i et kompatibelt farmasøytisk bærerstoff kan også fremstilles, plasseres i en egnet beholder og merkes for behandling av en angitt tilstand.

Disse og andre utførelser av den foreliggende oppfinnelsen vil lett fremstå for gjennomsnittsfagfolk ut fra den foreliggende beskrivelsen.

EKSEMPLER

Oppfinnelsen vil forstås ytterligere ved henvisning til de påfølgende eksemplene som kun er ment å være eksempler på oppfinnelsen. Disse eksemplene gis kun for å illustrere oppfinnelsen ifølge kravene. Den foreliggende oppfinnelsen er ikke begrenset i område av de eksemplifiserte utførelsene, som kun er ment som illustrasjoner på enkelte aspekter av oppfinnelsen. Alle fremgangsmåter som er funksjonelt ekvivalente ligger innenfor oppfinnelsens område. Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til dem som er beskrevet heri, vil være åpenbare for fagfolk ut fra beskrivelsen ovenfor og de vedlagte figurer. Slike modifikasjoner er ment å ligge innenfor omfanget av de vedlagte krav.

Eksempel 1: Overvinnelse av undertrykkende virkninger av TNF- α på EPO-dannelsen

Hep3B-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 0,4, 2, 10 ng/ml) av TNF- α i fravær eller nærvær av forbindelse A eller forbindelse B i 3 dager. Det utskilte EPO-nivået ble bestemt ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig ELISA-sett (R&D Systems, katalog nr. DEP00). I fravær av forbindelse, reduserte behandling av Hep3B-celler med TNF- α EPO-dannelsen på en doseavhengig måte. Hep3B-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av enten forbindelse A (figur 1A) eller forbindelse B (figur 1B) i fravær av TNF- α, viste en doseavhengig økning av EPO-dannelse. Tilsetning av en hvilken som helst av disse forbindelsene i nærvær av TNF- α ga en kraftig reduksjon av de inhibitoriske virkningene av TNF-α på EPO-dannelsen. En overvinnelse av den undertrykkende virkningen av TNF- α på EPO-dannelse ved inhibering av prolylhydroksylase, ble observert i nærvær av lave (for eksempel 0,4 ng/ml) og høye (for eksempel 10 ng/ml) konsentrasjoner av TNF- α. Følgelig ble de inhibitoriske virkningene av det inflammatoriske cytokinet TNF- α på EPO-dannelse overvunnet ved inhibering av prolylhydroksylaseaktivitet ved anvendelse av forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Disse resultatene tyder på at forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å forhøye EPO-dannelse i nærvær av det inflammatoriske cytokinet TNF- α. Videre er fremgangsmåtene og forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å forhøye EPO-dannelsen, og følgelig for for eksempel behandling av anemi i et individ hvori individet har en lidelse forbundet med TNF- α, så som akutt eller kronisk betennelse eller en annen anemi forbundet med kronisk sykdom.

En serie av eksperimenter ble utført for å undersøke virkningene av forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen på EPO-dannelsen etter behandling av celler med det inflammatoriske cytokinet TNF- α (det vil si i celler som allerede hadde vært eksponert overfor TNF- α). I disse eksperimentene ble derfor TNF- αsignalisering initiert før tilsetning av en prolylhydroksylaseinhibitor. Hep3B-cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 0,4, 2, 10 ng/ml) av TNF- α i 2 timer, hvoretter forskjellige konsentrasjoner av forbindelse A eller forbindelse B ble tilsatt til de dyrkede cellene. Det utskilte EPO-nivået ble bestemt som beskrevet ovenfor 3 dager etter tilsetning av forbindelse.

Som vist i figurene 2A og 2B, overvant forbindelse A og forbindelse B de undertrykkende virkningene av TNF- α på EPO-dannelsen etter 2 timers forbehandling av Hep3B-celler med TNF- α. Disse resultatene viste at forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å forhøye EPO-dannelsen i celler behandlet med TNF- α. Disse resultatene antydet også at behandling med forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er et anvendbart middel for å forhøye EPO-dannelse og behandle anemi i et individ i hvilket EPO-dannelsen er undertrykt av TNF- α.

Tilsetning av forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen reduserte i stor grad de inhibitoriske virkningene av TNF- α på EPO-dannelsen. Følgelig er forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for behandling eller forebygging av anemi forbundet med forhøyet TNF- α, for eksempel ved betennelseslidelser.

Eksempel 2: Overvinnelse av de undertrykkende virkningene av IL-1 β på EPO-dannelsen

Hep3B-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 0,4, 2, 10 ng/ml) av IL-1 β i fravær eller nærvær av forbindelse A eller forbindelse B i 3 dager. Det utskilte EPO-nivået ble bestemt ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig ELISA-sett (R&D Systems, katalog nr. DEP00). I fravær av forbindelse, reduserte behandling av Hep3B-celler med IL-1 β EPO-dannelsen på en doseavhengig måte. Hep3B-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av enten forbindelse A (figur 3A) eller forbindelse B (figur 3B) i fravær av IL-1 β, viste en doseavhengig økning av EPO-dannelse. Tilsetning av en hvilken som helst av disse forbindelsene i nærvær av IL-1 β, reduserte i stor grad de inhiberende virkningene av IL-1 β på EPO-dannelsen. En overvinnelse av de undertrykkende virkningene av IL-1 β på EPO-dannelsen ved inhibering av prolylhydroksylase ble observert i nærværet av lave (for eksempel 0,4 ng/ml) og høye (for eksempel 10 ng/ml) konsentrasjoner av IL-1 β. Følgelig ble de inhibitoriske virkningene av det inflammatoriske cytokinet IL-1 β på EPO-dannelsen overvunnet ved å inhibere prolylhydroksylaseaktivitet ved anvendelse av forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Disse resultatene tyder på at forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å forhøye EPO-dannelsen i nærvær av det inflammatoriske cytokinet IL-1 β. Videre er fremgangsmåtene og forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å forhøye EPO-dannelsen og følgelig for behandling av anemi i et individ, for eksempel hvori individet har en lidelse forbundet med IL-1 β, for eksempel akutt eller kronisk betennelse eller en annen anemi forbundet med kronisk sykdom.

En serie av eksperimenter ble utført for å undersøke virkningene av forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen på EPO-dannelsen etter behandling av celler med det inflammatoriske cytokinet IL-1 β (det vil si i celler som allerede hadde vært eksponert overfor IL-1 β). I disse eksperimentene ville følgelig IL-1 β-signalisering være innledet før tilsetning av en prolylhydroksylaseinhibitor. Hep3B-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 0,4, 2, 10 ng/ml) av IL-1 β i 2 timer, hvoretter forskjellige konsentrasjoner av forbindelse A eller forbindelse B ble tilsatt til de dyrkede cellene. Det utskilte EPO-nivået ble bestemt som beskrevet ovenfor 3 dager etter tilsetning av forbindelsen.

Som vist i figurene 4A og 4B, overvant forbindelse A og forbindelse B de undertrykkende virkningene av IL-1 β på EPO-dannelsen etter 2 timere forbehandling av Hep3B-celler med IL-1 β. Disse resultatene viste at forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å forhøye EPO-dannelsen i celler eksponert overfor IL-1 β. Disse resultatene tydet også på at behandling med forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er et anvendbart middel for å forhøye EPO-dannelse og behandle anemi i et individ hvori EPO-dannelse er undertrykt av IL-1 β.

Tilsetning av forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen reduserte i stor grad de inhibitoriske virkningene av IL-1 β på EPO-dannelsen. Forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen er følgelig anvendbare for behandling eller forebygging av anemi forbundet med IL-1 β, for eksempel ved betennelseslidelser.

Eksempel 3: Inhibering av TNF- α-indusert VCAM-1-ekspresjon

Endotelcellenes evne til å binde lymfocytter skyldes delvis ekspresjon på endotelcellene av vaskulært celleadhesjonsmolekyl (VCAM)-1. VCAM-1-ekspresjon i endotelceller induseres av forskjellige inflammatoriske cytokiner så som TNF- α. For å undersøke virkningen av HIF-prolylhydroksylaseinhibering på TNF- α-indusert VCAM-1-ekspresjon, ble HUVEC (endotelceller fra human navlestrengvene) stimulert med TNF- α i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av forbindelse B eller forbindelse C i 1 dag. VCAM-ekspresjonen ble så målt.

Som vist i figur 5, induserte TNF- α (1 ng/ml) VCAM-1-ekspresjonen i HUVEC-celler. Tilsetning av forbindelse B eller forbindelse C til TNF- α-stimulerte celler førte imidlertid til en doseavhengig inhibering av den TNF- α-induserte VCAM-1-ekspresjonen. Disse resultatene viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen effektivt reduserer VCAM-1-ekspresjonen som er forbundet med det inflammatoriske cytokinet TNF- α. Resultatene tydet videre på at forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for inhibering av VCAM-1-ekspresjon forbundet med forskjellige betennelsessykdommer og autoimmune sykdommer så som for eksempel anemi forbundet med kronisk sykdom.

Eksempel 4: Inhibering av IL-1 β-indusert VCAM-1-ekspresjon

VCAM-1-ekspresjon i endotelceller induseres av også av det inflammatoriske cytokinet IL-1 β. For å undersøke virkningen av HIF-prolylhydroksylaseinhibering på IL-1 β-indusert VCAM-1-ekspresjon, ble HUVEC (endotelceller fra human navlestrengvene) stimulert med IL-1 β i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av forbindelse B eller forbindelse C i 1 dag. VCAM-ekspresjonen ble så målt.

IL-1 β (1 ng/ml) induserte VCAM-1-ekspresjon i HUVEC-celler. Tilsetning av forbindelse B eller forbindelse C til IL-1 β-stimulerte celler førte imidlertid til en doseavhengig inhibering av den IL-1 β-induserte VCAM-1-ekspresjonen (resultater ikke vist). Disse resultatene viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen effektivt reduserer VCAM-1-ekspresjonen som er forbundet med det inflammatoriske cytokinet IL-1 β. Resultatene tydet videre på at forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for inhibering av VCAM-1-ekspresjon forbundet med forskjellige betennelsessykdommer og autoimmune sykdommer så som for eksempel anemi forbundet med kronisk sykdom.

Eksempel 5: Inhibering av TNF- α- og IL-1 β-indusert VCAM-1-ekspresjon på endotelceller

HUVEC ble behandlet med bærerstoffkontroll eller forskjellige konsentrasjoner (0, 20, 40, 80 μM) av forbindelse B eller forbindelse C i 24 timer. Cellene ble vasket og så stimulert med enten 1 ng/ml TNF- α eller 1 ng/ml IL-1 β i 4 timer. VCAM-1-ekspresjonen på celleoverflaten ble så målt ved en cellebasert ELISA.

Som vist i figur 25, førte forbehandling med prolylhydroksylaseinhibitorer til redusert induksjon av VCAM-1-ekspresjon på celleoverflaten indusert av de inflammatoriske cytokinene TNF- α og IL-1 β. Disse resultatene viste at forbindelser og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen inhibert den inflammatoriske funksjonen av TNF- α og IL-1 β og inhiberte den ekspresjon av adhesjonsmolekyler på celleoverflaten som er nødvendig for å formidle heterocellulær leukocyttadhesjon. Inhibering av leukocyttadhesjonen ved behandling med de foreliggende forbindelsene, er et effektivt middel for å redusere betennelseskaskader slik at betennelsen reduseres og den inflammatoriske virkningen av begrenset EPO-dannelse og undertrykt erytropoiese reduseres.

Eksempel 6: Inhibering av TNF- α-indusert E-selektinekspresjon

Endotelt E-selektin tilhører selektinfamilien av cellulære adhesjonsmolekyler som formidler den innledende tilkoblingen av leukocytter til vaskulære endotelceller under betennelsessituasjoner. IL-1, TNF- α og lipopolysakkarider induserer alle ekspresjonen av E-selektin. (Se for eksempel Bevilacqua et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 9238-9242 og Bevilacqua og van Furth (1993) J Leukoc Biol 54: 363-378). For å undersøke virkningen av HIF-prolylhydroksylaseinhibering på TNF- α-indusert E-selektinekspresjon, ble HUVEC stimulert med 1 ng/ml TNF- α i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av forbindelse B eller forbindelse C i 1 dag. Ekspresjonen av E-selektin og VCAM ble så målt.

Som vist i figurene 24A og 24B, viste forbindelse B og forbindelse C en doseavhengig inhibering av TNF- α-indusert ekspresjon av VCAM og E-selektin i HUVEC. Resultatene i figurene 24A og 24B er gitt som prosent inhibering av ekspresjonen av VCAM og E-selektin observert som respons på forskjellige konsentrasjoner av forbindelse B (figur 24A) eller forbindelse C (figur 24B). Mer enn 60% inhibering av ekspresjonen av VCAM og E-selektin ble observert i HUVEC behandlet med 50 μM forbindelse B eller forbindelse C. Disse resultatene viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen effektivt reduserer ekspresjonen av VCAM og E-selektin forbundet med det inflammatoriske cytokinet TNF- α i endotelceller. Resultatene antydet videre at forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for inhibering av den ekspresjon av VCAM og E-selektin som er forbundet med forskjellige betennelseslidelser og autoimmune lidelser, for eksempel anemi forbundet med kronisk sykdom. I tillegg utgjør inhibering av endotelcelleekspresjonen av adhesjonsmolekyl, innbefattet VCAM og E-selektin, ved fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen, et middel for reduksjon av tidlige begivenheter i vaskulær betennelse.

Eksempel 7: Inhibering av IL-1 β-indusert E-selektinekspresjon

For å undersøke virkningen av HIF-prolylhydroksylaseinhibering på IL-1 β-indusert E-selektinekspresjon, ble HUVEC stimulert med 1 ng/ml IL-1 β i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av forbindelse B eller forbindelse C i 1 dag. E-selektinekspresjonen ble så målt.

Forbindelse B og forbindelse C viste en doseavhengig inhibering av IL-1 β-indusert E-selektinekspresjon i HUVEC (resultater ikke vist). Disse resultatene viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen effektivt reduserer E-selektinekspresjonen i endotelceller forbundet med det inflammatoriske cytokinet IL-1 β. Resultatene tydet videre på at forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for inhibering av den E-selektinekspresjonen som er forbundet med forskjellige betennelseslidelser og autoimmune lidelser så som for eksempel anemi forbundet med kronisk sykdom. I tillegg utgjør inhibering av endotelcelleekspresjonen av adhesjonsmolekyler, innbefattet VCAM og E-selektin, ved fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen, et middel for reduksjon av tidlige begivenheter i vaskulær betennelse.

Eksempel 8: Inhibering av TNF- α-, IL-1 β- og IFN- γ-indusert E-selektinekspresjon

HUVEC ble behandlet med bærerstoffkontroll eller forskjellige konsentrasjoner av forbindelse B eller forbindelse C i 24 timer. Cellene ble vasket og så stimulert med enten 1 ng/ml TNF- α, 1 ng/ml IL-1 β eller en kombinasjon bestående av 1 ng/ml av hver av TNF- α, IL-1 β og IFN- γ i 4 timer. Ekspresjonen av E-selektin på celleoverflaten ble målt ved en cellebasert ELISA.

Som vist i figur 26, inhiberte forbehandling av HUVEC med forbindelse B eller forbindelse C den induksjon av E-selektinekspresjon på celleoverflaten som induseres av de inflammatoriske cytokinene TNF- α og IL-1 β. I tillegg reduserte forbehandling med en hvilken som helst av disse forbindelsene E-selektinekspresjonen i nærvær av tre inflammatoriske cytokiner som vites å gi forhøyet E-selektinekspresjon (TNF- α, IL-1 β og IFN- γ). Disse resultatene viste at de foreliggende forbindelsene blokkerte den inflammatoriske virkningen av TNF- α, IL-1 β og IFN- γ på endotelceller, eksemplifisert ved inhibering av ekspresjonen av de adhesjonsmolekylene på celleoverflaten som formidler rulling av leukocytter på aktivert endotel. Siden leukocyttadhesjon til aktivert endotel via E-selektin er et tidlig trinn i videreføringen av inflammatoriske kaskader, byr inhibering av leukocyttrulling ved inhibering av E-selektrinekspresjonen på et middel for å redusere inflammatoriske kaskader som videre begrenser EPO-dannelse og undertrykker erytropoiesen.

Eksempel 9: Synergistisk økning av EPO-dannelse

Hep3B-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 0,1, 1, 10 ng/ml) av IL-6 i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner (3 μM, 10 μM, 30 μM) av forbindelse A eller forbindelse B i 1 eller 3 dager. Det utskilte EPO-nivået ble bestemt ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig ELISA-sett (R&D Systems, katalog nr. DEP00). I fravær av forbindelse, hadde behandling av Hep3B-celler med IL-6 minimal virkning på EPO-dannelsen. Som vist i figurene 27A og 27B, hadde Hep3B-celler behandlet med IL-6 en noe forhøyet EPO-ekspresjon sammenlignet med ubehandlede celler. Nærmere bestemt var EPO-nivået i kontrollcellene tilnærmet 20 mIU/ml, mens nivået i celler behandlet med 10 ng/ml IL-6 var tilnærmet 50 mIU/ml.

Hep3B-celler behandlet med forbindelse A eller forbindelse B uten IL-6 viste forhøyet EPO-nivå på en doseavhengig måte. Hep3B-celler behandlet med forbindelse A eller forbindelse B i nærvær av IL-6 viste imidlertid en signifikant økning av EPO-nivået (se figurene 27A og 27B). Virkningen av behandling med forbindelse på EPO-dannelsen i nærvær av IL-6 var synergistisk. For eksempel viste Hep3B-celler behandlet med 10 ng/ml IL-6 et EPO-nivå på tilnærmet 50 mIU/ml. Behandling av Hep3B-celler med 10 mM forbindelse A eller forbindelse B i fravær av IL-6 førte til tilnærmet 60 mIU/ml EPO henholdsvis 220 mIU/ml EPO. I nærvær av 10 ng/ml IL-6 ga tilsetning av forbindelse A og forbindelse B et EPO-nivå som var forhøyet til tilnærmet 270 mIU/ml henholdsvis høyere enn 400 mIU/ml.

Forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen virket således synergistisk med IL-6 for induksjon av EPO-ekspresjon i hepatocytter.

Eksempel 10: Overvinnelse av cytokinindusert undertrykkelse av EPO-reseptorsignalisering

Cellelinjen TF-1 (human erytroleukemi; ATCC katalogbetegnelse CRL-2003) stimuleres til proliferasjon som respons på tilsetning av EPO. I nærvær av forskjellige proinflammatoriske cytokiner svekkes den EPO-formidlede økningen av TF-1-celleproliferasjonen. For å bestemme virkningene av prolylhydroksylaseinhibering på TF-1-celleproliferasjon, behandles TF-1-celler med forskjellige konsentrasjoner av de proinflammatoriske cytokinene IL-1 β, TNF- α eller IFN- γ i fravær eller nærvær av prolylhydroksylaseinhibitorer, og den EPOformidlede celleproliferasjonen måles som følger. Brønner i triplikat av celler dyrket i 96 brønners mikrotiterplater innkuberes med serumfritt medium i fravær eller nærvær av EPO i 24 timer. Under de siste 4 timene med dyrking, tilsettes 1 μCi tritiert tymidin (<3>H-TdR; Amersham) til hver brønn. Cellenes respons på EPO-reseptorsignalisering bestemmes ved å måle celleproliferasjonen.

Celleproliferasjonen måles ved å kvantifisere mengden<3>H-TdR som inkorporeres i cellene ved først å lysere cellene med vann og så innfange DNA på nylonfiltere i en cellehøster.

Alternativt anvendes enkeltcellesuspensjoner av miltceller erholdt fra fenylhydrazinbehandlede dyr, noe som fører til økt forekomst av EPO-responderende forløperceller i milt, som kilde for EPO-responderende celler. EPO-formidlet proliferasjon måles så ex vivo som beskrevet ovenfor.

Behandling av TF-1-celler med EPO fører til økt celleproliferasjon, bestemt ved økt inkorporering av tritiert tymidin. Tilsetning av de proinflammatoriske cytokinene IL-1 β, TNF- α eller IFN- γ til EPO-behandlede TF-1-celler, fører til redusert evne til å respondere på EPO, noe som fører til redusert celleproliferasjon. Virkningen av tilsetning av de foreliggende forbindelsene på de inhiberende virkningene av proinflammatoriske cytokiner på EPO-formidlet celleproliferasjon i TF-1-celler bestemmes. Forhøyet celleproliferasjon, målt ved forhøyet inkorporering av tritiert tymidin, i TF-1-celler behandlet med EPO og proinflammatoriske cytokiner, viser at forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen overvinner de undertrykkende virkningene av proinflammatoriske cytokiner på den EPO-formidlede økningen av celleproliferasjonen.

Eksempel 11: Forhøyet ekspresjon av transferrinreseptor

Virkningen av forbindelser ifølge oppfinnelsen på ekspresjonen av transferrinreseptor ble undersøkt som følger. Forskjellige celler (Hep3B, HepG2, HK-2) ble innkubert med forbindelse A eller forbindelse B i 1 dag. Cellene ble så analysert for transferrinreseptorekspresjon ved FACS-analyse og anvendelse av antistoffet CD71-PE (Ancell, katalog nr. 223-050). Resultatene er vist nedenfor i tabell 1.

TABELL 1

Som vist ovenfor i tabell 1, ga tilsetning av forskjellige forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen til celler forhøyet ekspresjon av transferrinreseptor.

Inhibering av HIF-prolylhydroksylering ved anvendelse av prolylhydroksylaseinhibitorer ifølge den foreliggende oppfinnelsen, ga økt ekspresjon av transferrinreseptor i cellene. Forhøyet ekspresjon av transferrinreseptor ved anvendelse av prolylhydroksylaseinhibitorer ifølge den foreliggende oppfinnelsen, ble observert i leverceller (for eksempel Hep3B, HepG2), nyreceller (for eksempel HK-2) og lymfocytter (for eksempel THP-1). Følgelig er fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å øke transferrinreseptorekspresjonen i forskjellige celletyper. I tillegg vil forhøyet ekspresjon av transferrinreseptor føre til forhøyet transferrinreseptorformildet endocytose av transferrin med jern(III) slik at transport, utnyttelse, lagring og metabolisme av jern øker. Følgelig er fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å forhøye erytropoiesen ved å gi økt transport, utnytelse, lagring og metabolisme av jern.

Eksempel 12: Forhøyet ekspresjon av transferrinreseptor og forhøyet jernopptak in vitro

Virkningen av forbindelser på jernopptak i celler, bestemmes som følger. Primære monocytter og makrofager og monocytt- og makrofagcellelinjer (for eksempel THP-1) behandles i en, to eller tre dager med forskjellige konsentrasjoner av prolylhydroksylaseinhibitorer. Cellene undersøkes så for nærvær av transferrinreseptor på celleoverflaten ved anvendelse av fluorescensimmunfarging og flowcytometri. Resultater som viser at tilsetning av prolylhydroksylaseinhibitorer gir økt ekspresjon av transferrinreseptor på celleoverflaten, viser virkningen av prolylhydroksylaseinhibering når det gjelder økt transferrinbinding og følgelig jernbinding til celler. Et endret jernopptak hos celler behandlet med prolylhydroksylaseinhibitorer bestemmes som følger. Cellene behandles med forbindelse i nærvær av<59>Fe. Forhøyet jernopptak av celler behandlet med prolylhydroksylaseinhibitorer bestemmes ved å måle celleassosiert<59>Fe. En økt mengde celleassosiert<59>Fe viser forhøyet jernopptak i cellene.

Eksempel 13: Forhøyet nivå og aktivitet av jernregulerende protein 2

Reguleringen av opptak, lagring og utnyttelse av jern skjer delvis ved ekspresjon og aktivitet av nøkkelproteiner som deltar i jernmetabolismen, innbefattet transvirkende proteiner som betegnes jernregulerende proteiner (IRP). IRP-1 og IRP-2 kontrollerer stabilitet og translasjon av mRNA ved å bindes til spesifikke jernresponderende elementer i forskjellige mRNA for proteiner som deltar i jernmetabolismen slik at nær sagt alle sider ved jernmetabolismen påvirkes.

Jernmangel gir økt IRP-aktivitet, noe som fører til forhøyet ekspresjon av transferrinreseptor og redusert ferritinekspresjon. Likeså avtar IRP-aktiviteten i nærvær av jern, noe som fører til redusert transferrinreseptorekspresjon og forhøyet ferritinekspresjon.

For å undersøke virkningen av de foreliggende forbindelsene på forskjellige sider ved jernmetabolisme, utføres følgende eksperiment. Musecellene Hepa-1 behandles med prolylhydroksylaseinhibitorer i opptil 48 timer. Cellene høstes så og cellelysater analyseres for IRP-2-ekspresjon ved immunblotting og anvendelse av et antistoff som er spesifikt for IRP-2 (Alpha Diagnostic International, Inc., San Antonio, TX). Resultater som viser forhøyet nivå av cytoplasmatisk IRP-2 etter tilsetning av forbindelse, viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å gi et forhøyet IRP-nivå og følgelig forhøyet jernmetabolisme.

Virkningen av forbindelser ifølge oppfinnelsen på IRP-2-aktivitet, målt ved endret ferritin- og transferrinekspresjon, bestemmes som følger. Musemakrofagcellelinjen RAW 264.1 behandles med prolylhydroksylaseinhibitorer i opptil 48 timer. Cellene høstes så og analyseres for ekspresjon av ferritin- og transferinprotein ved immunblotting (ADI, katalog nr. IRP21-S). Redusert nivå av ferritinekspresjon og forhøyet nivå av transferrinekspresjon etter prolylhydroksylaseinhibering, viser at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for stabilisering og forhøying av aktiviteten av IRP-2. Forhøyet ekspresjon av IRP-2 gir redusert ekspresjon av ferritin, som er ansvarlig for langtidslagringen av jern, og gir forhøyet ekspresjon av transferrin og transferrinreseptor, noe som letter opptak, transport og utnyttelse av jern og følgelig gir forhøyet erytropoiese. Ved å øke ekspresjonen og aktiviteten av IRP-2, er fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å redusere ekspresjonen av ferritin og langtidslagringen av jern forbundet med ferritin og økt ekspresjon av transferrin og transferrinreseptor. Følgelig er fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å gi forhøyet opptak, transport og utnyttelse av jern og de er følgelig anvendbare for å forhøye erytropoiese.

Eksempel 14: Forbedret utnyttelse av jern

Rotter administreres enten bærerstoffkontroll eller HIF-prolylhydroksylaseinhibitor før intravenøs injeksjon av<59>Fe-merket jern(II)citrat (Amersham). Serielle blodprøver tappes fra halevenen og total fri radioaktivitet i plasma og erytrocyttassosiert radioaktivitet måles i en scintillasjonsteller for påvisning av transport av jern og inkorporering i heme i erytrocyttene og hemoglobinsyntese. En forhøyet mengde erytrocyttassosiert<59>Fe viser at de foreliggende forbindelsene er anvendbare for å forsterke den utnyttelse av jern som er nødvendig for hemesyntese, hemoglobindannelse og erytropoiese.

Eksempel 15: Forhøyet ekspresjon av erytropoiesegener in vitro

Hep3B-celler (ATCC nr. HB-8064) ble dyrket i DMEM tilsatt 8% kalvefosterserum. Hep3B-celler ble utsådd i 6 brønners dyrkningsplater med �500000 celler pr brønn. Etter 8 timer ble mediet utbyttet med DMEM tilsatt 0,5% kalvefosterserum og cellene ble innkubert i ytterligere 16 timer. Forbindelse B eller forbindelse D ble tilsatt til cellene (sluttkonsentrasjon 25 μM) og cellene ble innkubert i forskjellige tidsrom. Kontrollceller (ikke behandlet med forbindelse, kun tilsetning av DMSO alene) ble høstet etter 0, 6 og 48 timer. De høstede cellene ble analysert for cellelevedyktighet (GUAVA) eller tilsatt til RNA-ekstraksjonsbuffer (RNeasy, Qiagen) og lagret ved -20 ºC for påfølgende RNA-rensing. Mikromatriser i replikat ble fremstilt ved anvendelse av RNA isolert fra eksperimenter i replikat, utført på forskjellige dager. Totalt RNA ble isolert fra cellene ved anvendelse av settet RNeasy (Qiagen).

RNA ble utfelt i 0,3 M natriumacetat (pH 5,2), 50 ng/ml glykogen og 2,5 volumer etanol i en time ved -20 ºC. Prøvene ble sentrifugert og nedsentrifugert materiale ble vasket med kald 80% etanol, tørket og resuspendert i vann. Dobbelttrådet cDNA ble syntetisert ved anvendelse av en T7-(dT)24 første tråds primer (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) og SUPERSCRIPT CHOICE-systemet (Invitrogen) ifølge produsentens instruksjoner. Det endelige cDNA ble ekstrahert med et likt volum 25:24:1 fenol:kloroform:isoamylalkohol ved anvendelse av et PHASE LOCK GEL-innlegg (Brinkman, Inc., Westbury, NY). Vannfasen ble oppsamlet og cDNA utfelt ved anvendelse av 0,5 volumer 7,5 M ammoniumacetat og 2,5 volumer etanol.

Alternativt ble cDNA renset ved anvendelse av prøverensemodulen GENECHIP (Affymetrix) ifølge produsentens instruksjoner.

Biotinmerket cRNA ble syntetisert fra cDNA i en in vitro translasjons (IVT) -reaksjon ved anvendelse av RNA-transkriptmerkingssettet BIOARRAY HighYield (Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY) ifølge produsentens instruksjoner. Det endelige merkede produktet ble renset og fragmentert ved anvendelse av prøverensemodulen GENECHIP (Affymetrix) ifølge produsentens instruksjoner.

En hybridiseringsblanding ble fremstilt ved å fortynne 5 μg probe til 100 μl med 1x hybridiseringsbuffer (100 mM MES, 1 M [Na<+>], 20 mM EDTA, 0,01% Tween 20), 100 μg/ml sildemelke-DNA, 500 μg/ml acetylert BSA, 0,03 nM kontroll oligonukleotid B2 (Affymetrix) og 1x GENECHIP eukaryot hybridiseringskontroll (Affymetrix). Blandingen ble først innkubert ved 99 ºC i 5 minutter, så ved 45 ºC i 5 minutter og så sentrifugert i 5 minutter. Matrisen "The Human Genome 133A" (Affymetrix) ble oppvarmet til romtemperatur og så prehybridisert med 1x hybridiseringsbuffer ved 45 ºC i 10 minutter under rotering. Bufferen ble så erstattet med 80 μl hybridiseringsblanding og matrisen ble hybridisert i 16 timer ved 45 ºC ved 60 rpm med en motvekt. Etter hybridiseringen ble matrisene vasket en gang med 6x SSPE, 0,1% Tween 20 og så vasket og farget ved anvendelse av R-fykoerytrinkonjugert streptavidin (Molecular Probes, Eugene, OR), antistreptavidinantistoff fra geit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og et GENECHIP Fluidics Station 400-instrument (Affymetrix) ifølge produsentens mikro_1v1-fremgangsmåte (Affymetrix). Matrisene ble analysert ved anvendelse av en GENEARRAY-skanner (Affymetrix) og programvaren Microarray Suite (Affymetrix).

Matrisen "The Human Genome 133A" (Affymetrix) representerer alle sekvenser i den humane unigenedatabasen versjon 133 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) og omfatter tilnærmet 14500 godt karakteriserte humane gener.

RNA-kvaliteten ble analysert ved kapillærelektroforese (Agilent Bioanalyzer). Hybridiseringsblandinger ble fremstilt som beskrevet (Affymetrix) og hybridisert til humane U133A-matriser fra Affymetrix omfattende22283 probesett. Matrisens yteevne ble analysert med programvaren Affymetrix MicroArray Suite (MAS) og enkeltvise probesett ble betegnet som "foreliggende", "marginale" og "fraværende" ut fra programvarens standardparametere. Statistisk analyse og filtrerte probesettlister ble fremstilt ved anvendelse av programvaren GeneSpring (Silicon Genetics). Grenseverdien for "uttrykte" probesett benyttet en kombinasjon av Affymetrix "P"-verdier og absolutte ekspresjonsverdier avledet fra den iboende datafeilmodellen i Genespring. Verdiene ble normalisert relativt til gjennomsnittlige kontrollprøver.

Som vist i tabell 2 nedenfor, var ekspresjonen av gener (gangers økning av mRNA-nivået relativt til kontroll) som koder for erytropoietiske proteiner forhøyet i Hep3B-celler behandlet med forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen. (To datapunkter for ceruloplasmin for hver betingelse er gitt nedenfor i tabell 2).

Nærmere bestemt var ekspresjonen av ceruloplasmin og transferrinreseptor 2 forhøyet i Hep3B-celler behandlet med forskjellige forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

TABELL 2

Eksempel 16: Dosering til dyr

Dyrene som anvendes i de påfølgende eksemplene omfatter Swiss Webster hannmus (30-32 g), Sprague-Dawley hannrotter (200-350 g) og Lewis hunnrotter, erholdt fra Simonsen, Inc. (Gilroy, CA), Charles River (Hollister, CA) eller Harlan. Dyrene ble oppstallet ved anvendelse av standardfremgangsmåter og fôr og vann var tilgjengelig for dyrene ad libitum. Under behandlingen ble dyrene analysert for endringer i kroppsvekt og tegn på åpenbar toksisitet og mortalitet.

Forbindelsene ble generelt administrert oralt ved gavage eller ved intravenøs administrering. Dyrene som ble behandlet ved oral gavage ble gitt et volum på 4-10 ml/kg av enten 0,5% karboksymetylcellulose (CMC; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) med eller uten 0,1% Polysorbate 80 (0 mg/kg/dag) eller varierende doser av en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen (for eksempel en HIF-prolylhydroksylaseinhibitor) i 0,5% CMC med eller uten 0,1% Polysorbate 80 ved anvendelse av forskjellige doseringsskjemaer. Blodprøver ble oppsamlet ved egnede tidsrom i løpet av behandlingen fra for eksempel halevenen (rotter), fra bukvenen eller ved kardiocentese (mus eller rotter). Generelt ble dyrene bedøvd med isofluran og blodprøver ble oppsamlet i MICROTAINER serumseparasjonsrør (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). For måling av serumbestanddeler ble rørene innkubert ved romtemperatur i 30 minutter og så sentrifugert ved 8000 rpm ved 4 ºC i 10 minutter. Serumfraksjonen ble så prosessert og analysert for nærvær av spesifikke bestanddeler, for eksempel jern (analyse utført av Quality Clinical Labs, Mountain View, CA). For bestemmelse av hematokritt, ble blodprøver oppsamlet i MICROTAINER EDTA-2K-rør (Becton-Dickinson); EDTA-blod ble så suget inn i 75 mm x 1,1-1,2 mm LD kapillærrør (Chase Scientific Glass, Inc., Rockwood, TN) til tilnærmet 3⁄4 av lengden, en ende av røret ble forseglet med CRITOSEAL forseglingsmiddel (Sherwood Medical Company), og rørene ble sentrifugert i en J-503M MICROHEMATOCRIT-sentrifuge (Jorgensen Laboratories, Inc., Loveland, CO) ved 12000 rpm i 5 minutter. Hematokritten ble avlest mot et avlesningskort. Hvor dette er angitt, ble en fullstendig blodtallsanalyse (CBC), innbefattet hemoglobinnivået i blodet, retikulocyttallet og hematokritten, utført av Quality Clinical Labs (Mountain View, CA).

Ved hver undersøkelses avslutning, ble dyrene avlivet, for eksempel ved tapping av blod under generell bedøvelse eller ved CO2-kvelning, og organprøver og vevsprøver ble oppsamlet. Vevene ble enten fiksert i nøytralt bufret formalin eller lagret nedfrosset ved -70 ºC. Vev for genomisk analyse ble plassert i RNAlater.

Eksempel 17: Forhøyet ekspresjon av gener som koder for jernprosesserende protein in vivo

Swiss Webster hannmus ble behandlet som beskrevet ovenfor med en enkelt dose av 0,5% CMC (Sigma-Aldrich) (0 mg/kg) eller 100 mg/kg forbindelse A. 4, 8, 16, 24, 48 eller 72 timer etter administreringen ble dyrene bedøvet og avlivet, og vevsprøver fra nyre, lever, hjerne, lunge og hjerte ble isolert og lagret i RNALATER-løsning (Ambion) ved -80 ºC. Alternativt ble dyrene behandlet med 4 daglige, på hverandre følgende doser av 0,5% CMC (0 mg/kg/dag), 7,5 mg/ml forbindelse A i 0,5% CMC (30 mg/kg/dag) eller 25 mg/ml forbindelse i 0,5% CMC (100 mg/kg/dag). Fire timer etter administrering av den siste dosen, ble dyrene bedøvet og avlivet og tilnærmet 150 mg lever og hver nyre ble isolert og lagret i RNALATER-løsning (Ambion) ved -20 ºC.

RNA-isolering ble utført ved anvendelse av følgende fremgangsmåte. En bit av hvert organ ble kuttet i biter, 875 μl RLT-buffer (RNEASY-sett; Qiagen Inc., Valencia, CA) ble tilsatt og bitene ble homogenisert i tilnærmet 20 sekunder ved anvendelse av en rotor-stator POLYTRON homogenisator (Kinematica, Inc., Cincinnati, OH). Homogenatet ble mikrosentrifugert i 3 minutter for nedsentrifugering av uløselig materiale, supernatanten ble overført til et nytt rør og RNA ble isolert ved anvendelse av et RNEASY-sett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. RNA ble eluert i 80 μl vann og kvantifisert med RIBOGREEN-reagens (Molecular Probes, Eugene, OR). Absorbansen ved 260 og 280 nm ble målt for å bestemme renhet og konsentrasjon av RNA.

Alternativt ble vevsprøvene oppkuttet og homogenisert i TRIZOL-reagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) ved anvendelse av en rotor-stator POLYTRON homogenisator (Kinematica). Homogenatene ble oppvarmet til romtemperatur, 0,2 volumer kloroform ble tilsatt og prøvene ble grundig sammenblandet. Blandingene ble innkubert ved romtemperatur i flere minutter og så sentrifugert ved 12000 g i 15 minutter ved 4 ºC. Den vandige fasen ble oppsamlet og 0,5 volumer isopropanol ble tilsatt. Prøvene ble blandet, innkubert ved romtemperatur i 10 minutter og sentrifugert i 10 minutter ved 12000g ved 4 ºC. Supernatanten ble fjernet og nedsentrifugert materiale ble vasket med 75% EtOH og sentrifugert ved 7500g i 5 minutter ved 4 ºC. Absorbansen ved 260 og 280 nm ble målt for å bestemme renhet og konsentrasjon av RNA.

RNA ble utfelt i 0,3 M natriumacetat (pH 5,2), 50 ng/ml glykogen og 2,5 volumer etanol i en time ved -20 ºC. Prøvene ble sentrifugert og nedsentrifugert materiale ble vasket med kald 80% etanol, tørket og resuspendert i vann. Dobbelttrådet cDNA ble syntetisert ved anvendelse av en T7-(dT)24 første tråds primer (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) og SUPERSCRIPT CHOICE-systemet (Invitrogen) ifølge produsentens instruksjoner. Det endelige cDNA ble ekstrahert med et likt volum av 25:24:1 fenol:kloroform:isoamylalkohol ved anvendelse av et PHASE LOCK GEL-innlegg (Brinkman, Inc., Westbury, NY). Den vandige fasen ble oppsamlet og cDNA ble utfelt ved anvendelse av 0,5 volumer 7,5 M ammoniumacetat og 2,5 volumer etanol. Alternativt ble cDNA renset ved anvendelse av prøverensemodulen GENECHIP (Affymetrix) ifølge produsentens instruksjoner.

Biotinmerket cRNA ble syntetisert fra cDNA i en in vitro translasjons- (IVT) reaksjon ved anvendelse av et BIOARRAY HighYield RNA-transkriptmerkingssett (Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY) ifølge produsentens instruksjoner. Det endelige merkede produktet ble renset og fragmentert ved anvendelse av prøverensemodulen GENECHIP (Affymetrix) ifølge produsentens instruksjoner.

En hybridiseringsblanding ble fremstilt ved å fortynne 5 μg probe til 100 μl i 1x hybridiseringsbuffer (100 mM MES, 1 M [Na<+>], 20 mM EDTA, 0,01% Tween 20), 100 μg/ml sildemelke-DNA, 500 μg/ml acetylert BSA, 0,03 nM kontroll oligonukleotid B2 (Affymetrix) og 1x GENECHIP eukaryot hybridiseringskontroll (Affymetrix). Blandingen ble først innkubert ved 99 ºC i 5 minutter og så ved 45 ºC i 5 minutter og så sentrifugert i 5 minutter. Musegenommatrisen MOE430Aplus2 (Affymetrix) ble oppvarmet til romtemperatur og så prehybridisert med 1x hybridiseringsbuffer ved 45 ºC i 10 minutter under rotering. Bufferen ble så erstattet med 80 μl hybridiseringsblanding og matrisen ble hybridisert i 16 timer ved 45 ºC og 60 rpm med motvekt. Etter hybridiseringen ble matrisene vasket en gang med 6x SSPE, 0,1% Tween 20 og så vasket og farget ved anvendelse av R-fykoerytrinkonjugert streptavidin (Molecular Probes, Eugene, OR), antistreptavidinantistoff fra geit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og et GENECHIP Fluidics Station 400-instrumetn (Affymetrix) ifølge produsentens EukGE-WS2v4-fremgangsmåte (Affymetrix). Matrisene ble analysert ved anvendelse av en GENEARRAY-skanner (Affymetrix) og programvaren Microarray Suite (Affymetrix).

Musegenommatrisen MOE430Aplus2 (Affymetrix) representerer alle sekvenser i UniGene-musedatabasen versjon 107 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) innbefattet tilnærmet 14000 godt karakteriserte musegener.

Tabell 3 nedenfor viser ceruloplasmin mRNA-ekspresjonen i musenyre etter administrering av forbindelse A. Resultatene ble normalisert relativt til den gjennomsnittlige verdien observert i ubehandlede kontrolldyr.

TABELL 3

Resultatene som vist i tabell 3 ovenfor viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å forhøye ekspresjonen av ceruloplasmingenet. Ceruloplasmin, også betegnet ferroksidase-1, overfører redusert jern frigitt fra lagringsseter (så som ferritin) til den oksiderte formen.

Oksidert jern kan bindes til plasmatransportproteinet transferrin.

Ceruloplasminmangel er forbundet med akkumulering av jern i leveren og andre vev. Tilgjengelig materiale tyder på at ceruloplasmin fremmer utstrømming av jern fra leveren og innstrømming av jern i celler med jernmangel (se for eksempel Tran et al. (2002) J Nutri 132: 351-356).

Tabell 4 nedenfor viser hepcidin mRNA-ekspresjonen i muselever etter administrering av forbindelse A. Resultatene ble normalisert relativt til nivået observert i ubehandlede kontrolldyr.

TABELL 4

Som vist ovenfor i tabell 4, førte administrering av forbindelse A til redusert ekspresjon av hepcidin mRNA i muselever. Redusert hepcidinekspresjon er forbundet med økt frigjøring av jern fra retikuloendotelceller og økt absorpsjon av jern i tarmen. Følgelig er fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å redusere hepcidinekspresjonen og forhøye jernabsorpsjonen i tarmen.

Figur 6A viser relative ekspresjonsnivåer for transferrinreseptoren (grå søyler) i nyre og den duodenale jerntransportøren NRAMP2 (naturlig resistensassosiert makrofagprotein 2) (også betegnet Slc11a2 (løselig bærerfamilie 11, protonkoblet divalent metalliontransportør, medlem 2), alternativt betegnet DCT1 (divalent kationtransportør 1), DMT1 (divalent metalltransportør 1)) i tarm (svarte søyler).

I et annet eksperiment ble mRNA isolert fra tynntarm høstet 4 timer etter intravenøs administrering av 60 mg/kg forbindelse A, forbindelse B og forbindelse C til mus. Prober ble fremstilt fra hvert av to dyr fra 5 behandlingsgrupper og hybridisert til musemikromatrisene MOE430Aplus2 fra Affymetrisk (ett dyr pr matrise). En statistisk sammenligning av resultater erholdt fra matriser fra behandlede dyr og matriser fra ubehandlede dyr ble utført. Figur 6B viser det relative ekspresjonsnivået av NRAMP2 mRNA i tynntarm hos dyr behandlet med forbindelse A, forbindelse B og forbindelse C. Ekspresjonsnivået er vist som antallet ganger induksjon over nivået i ubehandlede kontrolldyr for hvert uttrykte gen. Resultatene fra disse eksperimentene viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å forhøye ekspresjonen av NRAMP2 i tarm. Disse resultatene tydet videre på at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å øke jernabsorpsjonen slik at tilgjengeligheten på jern for hemesyntese, hemoglobinsyntese, dannelse av røde blodceller og erytropoiese forhøyes.

Figur 6C viser antallet gangers induksjon av 5-aminolevulinatsyntase (ALAS-2) -ekspresjonen i behandlede dyr sammenlignet med dyrene kun tilført bærerstoff. Resultatene viste at behandling av normale dyr med prolylhydroksylaseinhibitorer førte til forhøyet ekspresjon av gener som deltar i jernmetabolismen, innbefattet gener som deltar i absorpsjon av jern fra tarmen og transport av jern til perifere vev via transferrinreseptorer. Ekspresjonen av disse genene vendte tilbake til basalnivået (kontroll) 16 timer etter doseringen. Resultatene viste også en koordinert ekspresjon av ALAS-2, det første enzymet i synteseveien i heme og det hastighetsbegrensende enzymet for hemesyntese i de angitte vev etter behandling med prolylhydroksylaseinhibitor. Sett sammen viste disse resultatene at forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga en koordinert økning av ekspresjonen av gener som koder for proteiner som deltar i en fremming av erytropoiesen, innbefattet jernabsorpsjon, jerntransport og hemesyntese.

Alternativt anvendes flowcytometrianalyse for å måle makrofagcelleoverflatemarkøren CD11c og transferrinreseptornivået i immunfargede mononukleære celler fra perifert blod. Aktiviteten ved behandling av forbindelse vises ved å påvise forhøyet ekspresjon av transferrinreseptor på makrofager. Videre kan plasma oppsamles og transferrinnivået måles ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig ELISA-sett (se for eksempel KomaBiotech, Korea).

Eksempel 18: Forhøyet erytropoiese in vivo

Virkningen av administrering av de foreliggende forbindelsene på erytropoiesen bestemmes som følger. Normale mus gjøres anemiske og holdes i en anemisk tilstand ved kronisk administrering av TNF- α, en behandling som vites å inhibere erytropoiese grunnet manglende EPO-dannelse og EPO-signalisering som respons på TNF- α. Etter induksjon av anemi over et tidsrom på en til fire uker, administreres dyrene prolylhydroksylaseinhibitorer. Vevene undersøkes for dannelse av BFU-E og CFU-E og blodprøver analyseres for sammensetning.

Resultater som viser økt antall av BFU-E og CFU-E i beinmarg, milt og perifere vev og/eller forhøyet hemoglobinnivå i serum, økt antall retikulocytter og forhøyet hematokritt i dyr behandlet med PHI, viser virkning.

En annen eksperimentell dyremodell er anvendt for å undersøke virkningen av administrering av prolylhydroksylaseinhibitorer på erytropoiese. I denne modellen utviklet transgene mus anemi forbundet med kronisk sykdom som følge av konstitutiv overekspresjon av TNF- α. Etter fremkomst av anemi i disse musene tilføres prolylhydroksylaseinhibitorer over forskjellige tidsrom og ved anvendelse av forskjellige doseringsstrategier. Prøver av vev og blod oppsamles så og analyseres. Som beskrevet ovenfor, vil resultater som viser økt antall PFU-E og CFU-E i beinmarg, milt og perifere vev og/eller forhøyet hemoglobinnivå i serum, økt antall retikulocytter og forhøyet hematokritt effektivt vise at anemi forbundet med TNF- α-overproduksjon i transgene dyr behandles ved administrering av prolylhydroksylaseinhibitorer ved anvendelse av fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Eksempel 19: Forhøyet jernnivå i serum

Hann- og hunnmus ble behandlet to ganger ukentlig (mandag og torsdag) med forskjellige konsentrasjoner (0, 20, 60 eller 150 mg/kg) av forbindelse A i 93 dager. Det totale jernnivået i serum ble bestemt.

TABELL 5

Som vist i tabell 5, ga administrering av forbindelse A økt jernnivå i serum, både hos hannrotter og hos hunnrotter. (Resultatene i tabell 5 er gitt som jernnivå i serum /- standardavvik. * angir en signifikant forskjell i jernnivået i serum sammenlignet med ubehandlede dyr). Disse resultatene viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å øke jernnivået i serum og følgelig er anvendbare for behandling av lidelser forbundet med jernmangel.

Eksempel 20: Virkning i en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom/svekket erytropoiese/svekket jernmetabolisme

Anemi forbundet med kronisk sykdom (ACD) er forbundet med forskjellige betennelsestilstander innbefattet artritt, neoplastisk sykdom og andre lidelser forbundet med kronisk betennelse. En rottemodell for ACD ble anvendt for å undersøke virkningene av HIF-stabilisering ved anvendelse av fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen for behandling av anemi forbundet med kronisk sykdom. I denne dyremodellen induseres ACD i rotter ved peptidoglykanpolysakkaridpolymerer. (Se for eksempel Sartor et al. (1989) Infection and Immunity 57: 1177-1185). I denne modellen utvikler dyrene alvorlig akutt anemi i de innledende stadier fulgt av moderat alvorlig kronisk mikrocyttisk anemi i de senere stadier.

Dyremodell for ACD - eksperimentserie 1:

Lewis hunnrotter med kroppsvekt på omtrent 160 gram ble tilført PG-PS 10S (Lee Laboratories, 15 μg/g kroppsvekt, intraperitonealt). PG-PS 10S inneholder rensede peptidoglykanpolysakkaridpolymerer isolert fra celleveggen til Streptococcus pyogene, gruppe A, stamme D58. Artritt og anemi fikk utvikle seg i 35 dager. På dag 35 ble blodprøver (omtrent 400 μl) tappet fra halevenen under generell bedøvelse (isofluran) for CBC og retikulocyttmåling (utført av Quality Clinical Labs). Dyr med et sentrifugert hematokrittnivå på 45% eller høyere ble ansett som ikke-anemiske og ble fjernet fra undersøkelsen.

På dag 35 etter PG-PS-injeksjonen ble anemiske dyr behandlet med bærerstoff alene eller med forbindelse A (60 mg/kg, PO) i to på hverandre følgende dager pr uke i to uker. Automatisk komplett blodtall (CBC) ble målt på dag 35 (se ovenfor), 39, 42 og 49; og jernnivået i serum ble målt på dag 49.

Retikulocyttall

Som vist i figur 7, ga administrering av forbindelse A til anemiske dyr et økt retikulocyttall på dag 39 (det vil si 5 dager etter påbegynt tilførsel av forbindelse). Retikulocyttnivået var tilnærmet 2% og 4% av antallet røde blodceller i kontrolldyr (ikke anemiske) henholdsvis anemiske dyr (PG-PS-behandlede). Retikulocyttnivået i behandlede dyr var imidlertid tilnærmet 10% av antallet røde blodceller.

Behandling med forbindelse A ga en økning av retikulocyttallet i anemiske dyr. Følgelig stimulerte forbindelse A erytropoiesen i en rottemodell for ACD.

Hematokritt

Hematokrittnivået var forhøyet i anemiske dyr behandlet med forbindelse A.

Hematokrittnivået (målt i et Baker 9000-instrument ved Quality Clinical Labs) i anemiske dyr (PG-PS-behandlede) var lavere enn 35% sammenlignet med 41% i ikke-anemiske kontrolldyr (se figur 8). Administrering av forbindelse A til anemiske dyr ga en økning av hematokrittnivået til tilnærmet 37% allerede 5 dager etter påbegynt behandling med forbindelsen. Etter en andre dose av forbindelse A, ble hematokrittnivået forhøyet til tilnærmet 40%, nær hematokrittnivået observert i ikke-anemiske kontrolldyr. Forbindelse A ga økt hematokritt i anemiske dyr ved anvendelse av en rottemodell for ACD. Følgelig er fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å forhøye hematokritten og behandle anemi forbundet med kronisk sykdom.

Hemoglobin

Administrering av forbindelse A ga også en økning av hemoglobinnivået i anemiske dyr. Som vist i figur 9, hadde ikke-anemiske kontrolldyr på dag 35 et hemoglobinnivå på tilnærmet 15 g/dl, mens hemoglobinnivået i PG-PS-behandlede dyr (det vil si anemiske dyr) var tilnærmet 13 g/dl. Som vist i figur 9, ga forbindelse A en økning av hemoglobinnivået i anemiske dyr allerede 5 dager (dag 39) etter administrering av forbindelse. Hemoglobinnivået var fortsatt forhøyet på dag 49 og nådde et nivå som tilsvarte nivået ikke-anemiske kontrolldyr, noe som viste at en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen restituerte et normalt hemoglobinnivå i anemiske dyr. Disse resultatene viste at forbindelse A ga en økning av hemoglobinnivået i anemiske dyr ved anvendelse av en rottemodell for ACD. Følgelig er fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å øke hemoglobinnivået og behandle anemi forbundet med kronisk sykdom.

Antall røde blodceller

Administrering av forbindelse A ga et økt antall røde blodceller i anemiske dyr. Som vist i figur 10, var antallet røde blodceller forhøyet i anemiske dyr behandlet med forbindelse A allerede 5 dager etter påbegynt administrering av forbindelse (det vil si dag 39 i figur 10) sammenlignet med ubehandlede anemiske dyr.

Forbindelse A ga en økning av antallet røde blodceller i anemiske dyr ved anvendelse av en rottemodell for ACD. Følgelig er fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å øke antallet røde blodceller og behandle anemi forbundet med kronisk sykdom.

Gjennomsnittsvolum av blodceller

Anemiske dyr viste et redusert gjennomsnittlig volum av blodceller sammenlignet med ikke-anemiske kontrolldyr (se figur 11). Anemiske dyr behandlet med forbindelse A viste et forhøyet gjennomsnittsvolum av blodcellene allerede 5 dager etter behandlingen (dag 39 i figur 11) sammenlignet med ubehandlede anemiske dyr. Det gjennomsnittlige blodcellevolumet i behandlede dyr forble forhøyet sammenlignet med ubehandlede anemiske dyr gjennom hele eksperimentet. Disse resultatene viste at forbindelse A forbedret (det vil si reduserte) mikrocytosenivået (det vil si mikrocytemi, forekomst av mange mikrocytter, unormalt små røde blodceller forbundet med forskjellige former for anemi). Følgelig forbedrer/reduserer fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen mikrocytose ved anemi forbundet med kronisk sykdom.

Gjennomsnittlig hemoglobinnivå i blodceller

Anemiske dyr viste også redusert gjennomsnittlig hemoglobinnivå i blodcellene. Som vist i figur 12, ga behandling av anemiske dyr med forbindelse A en økning av det gjennomsnittlige hemoglobinnivået i blodcellene sammenlignet med ubehandlede anemiske dyr. Disse resultatene viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å øke det gjennomsnittlige hemoglobinnivået i blodcellene.

Dyremodell for ACD - eksperimentserie 2:

Lewis hunnrotter (tilnærmet 150-200 g) ble injisert med PG-PS (intraperitonealt). Artritt og anemi fikk utvikle seg i 28 dager. Dyrene ble administrert forbindelse A ved oral gavage to ganger ukentlig (mandag og torsdag) i seks uker, tilsvarende dagene 28, 31, 35, 38, 42, 45, 49, 52, 56, 59, 63, 66 og 70 etter PG-PS-injeksjon.

Helt blod ble oppsamlet via halevenen for CBC-analyse på dagene 28, 42, 56 og 70. I tillegg ble serum oppsamlet på dag 70 for jernbindingsanalyse. CBC og jernbindingsanalyse ble utført av Quality Clinical Labs (Mountain View, CA).

Hematokritt

Hematokrittnivået var redusert i dyr 28 dager etter behandling med PG-PS. Figur 13 viser at dyr som var injisert med PG-PS var anemiske og hadde en hematokritt som var 85% av nivået i ubehandlede (det vil si ikke-anemiske) dyr. (Uke 0 i figur 13 tilsvarer dag 28 i dette eksperimentelle oppsettet). Ubehandlede (det vil si ikkeanemiske) dyr behandlet med forbindelse A (40 mg/kg) viste en økning av hematokrittnivået med tiden, opptil mer enn 110% av nivået i ubehandlede dyr. Som vist i figur 13, førte administrering av forbindelse A til anemiske dyr til forhøyet hematokrittnivå.

Hemoglobin

Administrering av forbindelse A ga en økning av hemoglobinnivået både hos anemiske og ikke-anemiske dyr. Som vist i figur 14, økte hemoglobinnivået i ikkeanemiske dyr behandlet med forbindelse A (40 mg/kg) til tilnærmet 110% av nivået i ubehandlede kontrolldyr. (Uke 0 i figur 14 tilsvarer dag 28 i dette eksperimentelle oppsettet). I anemiske dyr økte hemoglobinnivået ved to ukentlige administreringer av 10 mg/kg, 20 mg/kg eller 40 mg/kg forbindelse A. Hematokrittnivået fortsatte å øke i minst 4 uker.

Antall røde blodceller

Anemiske dyr hadde et lavere antall røde blodceller enn ikke-anemiske dyr.

Nærmere bestemt var antallet røde blodceller i anemiske dyr mindre enn 90% av nivået observert i ikke-anemiske dyr på dag 28 etter PG-PS-injeksjon. Som vist i figur 15, økte antallet røde blodceller i anemiske dyr behandlet med forbindelse A sammenlignet med ubehandlede dyr. (Uke 0 i figur 15 tilsvarer dag 28 i dette eksperimentelle oppsettet). Et økt antall røde blodceller ble observert 2 uker etter administrering av forbindelse, og tallet fortsatte å øke gjennom de 6 ukene eksperimentet varte.

Gjennomsnittsvolum av blodceller

Anemiske dyr viste et redusert gjennomsnittsvolum av blodcellene sammenlignet med ikke-anemiske (ubehandlede) dyr. Som vist i figur 16, fortsatte gjennomsnittlige blodcellevolumet å avta med tiden i dyr behandlet med PG-PS, noe som viser at anemi forbundet med kronisk sykdom førte til mikrocyttisk anemi (til dels særpreget ved et lavere antall røde blodceller og mindre røde blodceller) og manglende evne til å danne hemoglobin grunnet manglende tilgang til jernlagrene. (Uke 0 figur 16 tilsvarer dag 28 i dette eksperimentelle oppsettet). Administrering av forbindelse A til anemiske dyr førte til en reduksjon av nedgangen av det gjennomsnittlige blodcellevolumet. Følgelig reduserte inhibering av prolylhydroksylase ved anvendelse av forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen effektivt nedgangen i det gjennomsnittlige blodcellevolumet som er forbundet med anemi forbundet med kronisk sykdom og anemi forbundet med jernmangel, slik at det gjennomsnittlige blodcellevolumet ble restituert, det gjennomsnittlige blodcellevolumet ble bibeholdt, osv. Disse resultatene viste videre at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å forhøye tilgangen på jern fra lagere for anvendelse i hemoglobindannelse.

Gjennomsnittlig hemoglobinnivå i blodceller

Anemiske dyr hadde et redusert gjennomsnittlig hemoglobinnivå i blodcellene sammenlignet med kontrolldyr, noe som viser at anemi forbundet med kronisk sykdom påvirket hemoglobindannelsen. Som vist i figur 17, viste anemiske dyr administrert forbindelse A en reduksjon av nedgangen i det gjennomsnittlige hemoglobinnivået i blodcellene med tiden. (Uke 0 i figur 17 tilsvarer dag 28 i dette eksperimentelle oppsettet).

Jernstatus - jernnivå i serum og transferrinmetning

Pasienter med anemi forbundet med kronisk sykdom særpreges klinisk ved redusert jernkonsentrasjon i plasma og redusert transferrinmetning. Virkningen av de foreliggende forbindelsene på jernnivået i serum og transferrinmetningen i normale og anemiske dyr ble bestemt. Ved anvendelse av en dyremodell for anemi forbundet med kronisk sykdom, ble anemi indusert i rotter ved intraperitoneal injeksjon av peptidoglykanpolysakkaridpolymerer som beskrevet ovenfor. Artritt og anemi fikk utvikle seg i 28 dager. Dyrene ble så behandlet med forskjellige konsentrasjoner av forbindelse A to ganger ukentlig i 6 uker. Jernnivået i serum og transferrinmetningen ble bestemt av Quality Clinical Labs.

Som vist i figur 18A, hadde anemiske dyr (PG-PS) et lavere jernnivå i serum en ikke-anemiske dyr (narrebehandlede). Administrering av forbindelse A førte til forhøyet jernnivå i serum, både hos anemiske (PG-PS) dyr og hos ikke-anemiske kontrolldyr (narrebehandlede). Dyr behandlet med forbindelse A hadde høyere transferrinmetning enn ubehandlede ikke-anemiske dyr og ubehandlede anemiske dyr (se figur 18B). Disse resultatene viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å forhøye jernnivået i serum og prosent transferrinmetning.

Jernabsorpsjon

I uke 6 etter administrering av forbindelse A til anemiske dyr (40 mg/kg to ganger ukentlig), ble en mikromatriseanalyse utført for å undersøke ekspresjonen av gener som koder for proteiner som deltar i transport og absorpsjon av jern i tarmen.

Mikromatriseanalysen ble utført ved anvendelse av fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor ved anvendelse av rottegenommatrisen 230A (Affymetrix) som representerer alle sekvenser i Unigene rottedatabasen versjon 99 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD), innbefattet tilnærmet 4699 godt karakteriserte rottegener, tilnærmet 10467 EST-sekvenser og tilnærmet 700 ikke-EST-sekvenser.

Som vist i figur 19, førte administrering av forbindelse A til kontrolldyr til økt ekspresjon i tarmen av mRNA for NRAMP2 (åpne søyler) og sproutin (fylte søyler). Ubehandlede anemiske dyr (PG-PS) hadde redusert mRNA-ekspresjonsnivå for både NRAMP2 og sproutin. Disse resultatene viste at anemi forbundet med kronisk sykdom er forbundet med redusert ekspresjon av proteiner som deltar i absorpsjonen av jern. Anemiske dyr behandlet med forbindelse A viste imidlertid forhøyet ekspresjon av både NRAMP2 og sproutin i tarmen (figur 19). Disse resultatene viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å forhøye ekspresjonen av gener forbundet med transport og absorpsjon av jern. I tillegg tydet disse resultatene på at forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen gir økt absorpsjon og transport av jern i friske individer og i individer med anemi forbundet med kronisk sykdom.

Eksempel 21: Forhøyet erytropoiese i mennesker

Virkningen av prolylhydroksylaseinhibering på erytropoiesen i mennesker ble undersøkt som følger. En oral dose på 20 mg/kg av forbindelse A ble administrert enten to eller tre ganger ukentlig i fire uker til friske frivillige forsøkspersoner. På forskjellige tidspunkter etter administrering av forbindelse ble blod tappet for analyse av EPO, hemoglobin, hematokritt, antall røde blodceller, løselig transferrinreseptor og ferritinnivå i serum.

Retikulocyttall

Som vist i figur 20, førte administrering av forbindelse A til mennesker til et retikulocyttall som var høyere enn for placebo kontrollpersonene. Et forhøyet retikulocyttall opptrådte hos individer administrert forbindelse to eller tre ganger ukentlig. Retikulocyttallet økte til mer enn omtrent 1,7% av antallet røde blodceller i behandlede individer, sammenlignet med et nivå på tilnærmet 1,4% i ubehandlede individer. Administrering av forbindelse A ga et økt retikulocyttall i mennesker. Følgelig er fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å forhøye erytropoiesen og derved øke retikulocyttnivået.

Hematokritt

Hematokrittnivået var forhøyet hos mennesker behandlet med forbindelse A. Hos mennesker administrert forbindelse A to ganger ukentlig i tre uker, var hematokrittnivået høyere enn 46% sammenlignet med tilnærmet 44% i individer behandlet med placebo. Forbindelse A ga forhøyet hematokritt hos mennesker. Følgelig er forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendbare for å forhøye erytropoiesen og derved gi økt hematokritt.

Antall røde blodceller

Administrering av forbindelse A ga et økt antall røde blodceller i mennesker. Som vist i figur 21, var antallet røde blodceller forhøyet i mennesker behandlet med 20 mg/kg forbindelse A, enten to eller tre ganger i uken sammenlignet med ubehandlede placebo kontrollindivider. Disse resultatene viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for å forhøye erytropoiesen og derved gi et økt antall røde blodceller.

Jernstatus - løselig transferrinreseptor og ferritinnivå i serum

Resultater som er vist ovenfor viste at fremgangsmåter og forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen effektivt øker retikulocyttallet, antallet røde blodceller, hemoglobinnivået og hematokritten i mennesker. Som vist i figur 22, ga administrering av forbindelse A til mennesker et økt nivå av løselig transferrinreseptor sammenlignet med nivået observert i ubehandlede kontrollindivider. Et økt nivå av løselig transferrin ble observert i mennesker behandlet 2 eller 3 ganger ukentlig. En maksimal respons på 35% og 31% ble observert på dag 21 i pasienter behandlet henholdsvis 2 og 3 ganger ukentlig. Den gjennomsnittlige plasmakonsentrasjonen av sTfR i placebopasienter var uendret. I tillegg var ferritinnivået i serum redusert med tilnærmet 46% hos mennesker behandlet med forbindelse A, noe som tyder på forhøyet utnyttelse av jern i disse individene (se figur 23).

Sett under ett viste disse resultatene at HIF-stabilisering ved anvendelse av forbindelser og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen førte til forhøyet mobilisering av jernlagere, økt transport av jern til beinmarg og forbedret utnyttelse av jern for hemoglobinsyntese, erytropoiese og dannelse av røde blodceller.

Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til dem som er vist og beskrevet heri, vil være åpenbare for fagfolk ut fra beskrivelsen ovenfor. Slike modifikasjoner er ment å ligge innenfor omfanget av de vedlagte kravene.

Alle referanser som siteres heri, inkorporeres heri ved referanse i sin helhet.