NO20160707A1 - Humane antistoffmolekyler fra IL-13 - Google Patents
Humane antistoffmolekyler fra IL-13 Download PDFInfo
- Publication number
- NO20160707A1 NO20160707A1 NO20160707A NO20160707A NO20160707A1 NO 20160707 A1 NO20160707 A1 NO 20160707A1 NO 20160707 A NO20160707 A NO 20160707A NO 20160707 A NO20160707 A NO 20160707A NO 20160707 A1 NO20160707 A1 NO 20160707A1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- human
- specific binding
- binding member
- antibody
- seq
- Prior art date
Links
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 title claims description 281
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 title claims description 278
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 121
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 102
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 101
- 101001076430 Homo sapiens Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 93
- 102000019207 human interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 82
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 47
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 47
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 45
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 40
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 38
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 36
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 14
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 11
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 11
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 11
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 10
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 7
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 6
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 6
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 claims description 6
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 claims description 6
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 85
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 85
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 85
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 70
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 65
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 61
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 49
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 43
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 43
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 41
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 38
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 34
- 230000008859 change Effects 0.000 description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 101001076402 Mus musculus Interleukin-13 Proteins 0.000 description 31
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 31
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 28
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 28
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 28
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 27
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 27
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 24
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 23
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 23
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 22
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 21
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 21
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 21
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 20
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 20
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- 230000004044 response Effects 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 14
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 14
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 14
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 13
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000002200 Respiratory Hypersensitivity Diseases 0.000 description 12
- 230000010085 airway hyperresponsiveness Effects 0.000 description 12
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 12
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 12
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 102100023688 Eotaxin Human genes 0.000 description 9
- 101710139422 Eotaxin Proteins 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- NZWOPGCLSHLLPA-UHFFFAOYSA-N methacholine Chemical compound C[N+](C)(C)CC(C)OC(C)=O NZWOPGCLSHLLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960002329 methacholine Drugs 0.000 description 9
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 9
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 101710112634 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 8
- 102100020793 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 8
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 7
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 7
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 7
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 7
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 7
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 6
- 230000008371 airway function Effects 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 6
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 6
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 5
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 230000009285 allergic inflammation Effects 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 5
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 5
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 5
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 5
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 5
- 238000002663 nebulization Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 5
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 5
- 102220212766 rs1060500017 Human genes 0.000 description 5
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 5
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000004003 Chemokine CCL11 Human genes 0.000 description 4
- 108010082548 Chemokine CCL11 Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005372 Plexiglas® Polymers 0.000 description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 4
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 4
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 4
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 4
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 3
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 3
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 3
- 101001033249 Homo sapiens Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 3
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 229940123932 Phosphodiesterase 4 inhibitor Drugs 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 3
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- -1 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000020800 chemokine (C-C motif) ligand 11 production Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 3
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 3
- 239000002587 phosphodiesterase IV inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000001350 reed-sternberg cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 3
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 3
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical class O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 241000244188 Ascaris suum Species 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 2
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101100286681 Homo sapiens IL13 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 102000004559 Interleukin-13 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100020791 Interleukin-13 receptor subunit alpha-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710112663 Interleukin-13 receptor subunit alpha-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 101100232361 Mus musculus Il13ra2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229940121948 Muscarinic receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102000013968 STAT6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010011005 STAT6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 2
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 2
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 208000037884 allergic airway inflammation Diseases 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 2
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 2
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000003678 bronchial smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 230000006041 cell recruitment Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 229940109248 cromoglycate Drugs 0.000 description 2
- IMZMKUWMOSJXDT-UHFFFAOYSA-N cromoglycic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)=CC(=O)C2=C1C=CC=C2OCC(O)COC1=CC=CC2=C1C(=O)C=C(C(O)=O)O2 IMZMKUWMOSJXDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229940125369 inhaled corticosteroids Drugs 0.000 description 2
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000018711 interleukin-13 production Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 2
- 229940125389 long-acting beta agonist Drugs 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000003843 mucus production Effects 0.000 description 2
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940124624 oral corticosteroid Drugs 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 229940125390 short-acting beta agonist Drugs 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229940065721 systemic for obstructive airway disease xanthines Drugs 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YYPNLXNMXQFMHG-GSEHKNNPSA-N (3r,5s,8s,9s,10s,13s,14s,17s)-17-acetyl-3-hydroxy-10,13-dimethyl-1,2,3,4,5,6,7,8,9,12,14,15,16,17-tetradecahydrocyclopenta[a]phenanthren-11-one;[2-[(3r,5s,8s,9s,10s,13s,14s,17s)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-11-oxo-1,2,3,4,5,6,7,8,9,12,14,15,16,17-tetradecahyd Chemical compound C([C@@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)C)[C@@]2(C)CC1=O.C([C@@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)COC(=O)C)[C@@]2(C)CC1=O YYPNLXNMXQFMHG-GSEHKNNPSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTAPDZBZLSXHQQ-UHFFFAOYSA-N 8-methyl-3,7-dihydropurine-2,6-dione Chemical class N1C(=O)NC(=O)C2=C1N=C(C)N2 RTAPDZBZLSXHQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000000884 Airway Obstruction Diseases 0.000 description 1
- 208000036065 Airway Remodeling Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 206010009137 Chronic sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101100384805 Homo sapiens ARCN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101150027484 ILI3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101100286685 Mus musculus Il13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001003131 Mus musculus Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000007027 Oral Candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101800000323 Soluble interleukin-4 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102400000528 Soluble interleukin-4 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101100136094 Streptomyces exfoliatus penH gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005091 airway smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000005057 airway smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000028004 allergic respiratory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 238000002819 bacterial display Methods 0.000 description 1
- 229940125388 beta agonist Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BMLSTPRTEKLIPM-UHFFFAOYSA-I calcium;potassium;disodium;hydrogen carbonate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].OC([O-])=O BMLSTPRTEKLIPM-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J calcium;potassium;sodium;2-hydroxypropanoic acid;sodium;tetrachloride Chemical compound [Na].[Na+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].CC(O)C(O)=O ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000023819 chronic asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 208000027157 chronic rhinosinusitis Diseases 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000005274 electronic transitions Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 229910001679 gibbsite Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000017307 interleukin-4 production Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000990 laser dye Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003199 leukotriene receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- YHXISWVBGDMDLQ-UHFFFAOYSA-N moclobemide Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(=O)NCCN1CCOCC1 YHXISWVBGDMDLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003909 pattern recognition Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical group 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 1
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000016160 smooth muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Description
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører spesifikke bindingsmedlemmer, spesielt humane anti-IL-13 antistoffmolekyler, og spesielt de som nøytraliserer IL-13 aktivitet. Den vedrører videre fremgangsmåter for å anvende anti-IL-13 antistoffmolekyler i diagnoser eller behandling av IL-13 relaterte forstyrrelser, inkludert astma, atopisk dermatitt, allergisk rinitt, fibrose, inflammatorisk bowels sykdom og Hodgkin's lymfoma.
Foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelsen bruker antistoff VH og/eller VL domenet til antistoffmolekyler som her kalles BAK502G9 og andre antistoffmolekyler i BAK502G9 linjen og i BAK278D6 linjen, som her definert. Videre foretrukne utførelsesf ormer bruker komplementære determinante regioner (CDRer) fra BAK278D6 linjen, og helst BAK502G9, spesielt VH CDR3 i andre antistoffleserammeregioner. Videre aspekter av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer sammensetninger som inneholder spesifikke bindingsmedlemmer av oppfinnelsen, og deres anvendelse i fremgangsmåter for å hemme eller å nøytralisere IL-13, inkludert fremgangsmåter for behandling av den humane eller dyrekroppen ved terapi.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer antistoffmolekyler av spesiell verdi i å binde og å nøytralisere IL-13, og dermed av anvendelse i enhver av en rekke terapeutiske behandlinger, som indikert ved eksperimenteringen som finnes her og videre ved den støttende tekniske litteratur.
Interleukin (IL)-13 er et 114 aminosyrecytokin med en umodifisert molekylær masse på ca 12 kDa [1,2]. IL-13 er nærest relatert til IL-4 som det deler 30% sekvenslikhet med på aminosyrenivået. Det human IL-13 genet er lokalisert på kromosom 5q31 tilstøtende til IL-4 genet. [1] [2]. Denne region av kromosom 5q inneholder gensekvenser for andre Th2 lymfocyttutledede cytokiner inkludert GM-CSF og IL-5 hvis nivåer sammen med IL-4 har vært vist å korrolere med sykdomsalvorligheten hos astmatikere og gnagermodeller av allergisk inflammasjon [3] [4] [5] [6] [7] [8].
Selv om det initielt ble identifisert som et Th2 CD4+ lymfocyttutledet cytokin, så produseres IL-13 også av Thl CD4+ Tceller, CD8+ T-lymfocytt NK-celler, og ikke-T-cellepopulasjoner slik som mastceller, basofiler, eosinofiler, makrofager, monocytter og glatte muskelceller i luftveien.
IL-13 er rapportert å styre dets effekter gjennom et reseptorsystem som inkluderer IL-4 reseptor a-kjeden (IL-4Ra), som i seg selv kan binde IL-4 men ikke IL-13, og minst to andre celleoverflateproteiner, IL-13Ra2 [9] [10]. IL-13Ral kan binde IL-13 med lav affinitet, og deretter rekruttere IL-4Ra til å danne en høy affinitetsfunksjonell reseptor som signalerer [11] [12]. Genbank-databasen opplister aminosyresekvensen og nukleinsyresekvensen til IL-13Ral som henholdsvis NP 001551 og Y10659. Studier i STAT6 (signaltransduser og aktivator av transkripsjon 6) -manglende mus har avslørt at IL-13, på en lignende måte som IL-4, signalerer ved å anvende JAK-STAT6 reaksjonsveien [13] [14]. IL-13Ra2 deler 37% sekvensidentitet med IL-13Ral på aminosyrenivået og binder IL-13 med høy affinitet [15] [16]. Imidlertid så har IL-13Ra2 en kortere cytoplasmatisk hale som mangler kjente signaleringsmotiver. Celler som uttrykker IL-13Ra2 fesponderer ikke på IL-13 selv ikke i nærværet av IL-4Ra [17]. Det er derfor postulert at IL-13Ra2 virker som en lukkereseptor som regulerer IL-13 men ikke IL-4 funksjon. Dette blir støttet av studier i IL-13Ra2 manglende mus hvis fenotype var i overensstemmelse med øket respons for IL-13 [18] [19]. Gengank-databasen opplister aminosyresekvensen og nukleinsyresekvensen til IL-13Ra2 som henholdsvis NP_000631 og Y08768.
Det signalerende IL-13Ral/IL-4Ra reseptorkomplekset uttrykkes på humane B-celler, mastceller, monocytt/makrofager, dendrittceller, eosinofiler, basofiler, fibroblaster, endotelceller, luftveisepitelceller og luftveis glatte muskelceller.
Bronkial astma er en vanlig vedvarende inflammatorisk sykdom i lungen som erkarakterisert vedluftveishyperfølsomhet, slimoverproduksjon, fibrose og økede serum IgE-nivåer. Luftvei shyperfølsomhet (AHR) er den overdrevne sammentrekningen av luftveiene på ikke-spesifikk stimuli slik som kald luft. Både AHR og slimoverproduksjon tror man er ansvarlig for den variable luftveishindringen som fører til kortpusthet som er karakteristisk for astmaanfall (eksaserbasjoner) og som er ansvarlig for dødeligheten som er assosiert med denne sykdom (rundt 2000 dødsfall/år i Storbritannia).
Forekomsten av astma, sammen med andre allergiske sykdommer, har øket signifikant de senere årene [20] [21]. For eksempel så har på det nåværende tidspunkt rundt 10% av populasjonen i Storbritannia (UK) blitt diagnostisert som astmatiske.
Nåværende retningslinjer fra British Thoracic Society (BTS) og Global Initiative for Asthma (GINA) foreslår en trinnvis tilnærming til behandlingen av astma [22, 23]. Mild til moderat astma kan vanligvis kontrolleres ved anvendelsen av inhalerte kortikosteroider, i kombinasjon med beta-agonister eller leukotrienhemmere. På grunn av de dokumenterte bieffektene av kortikosteroider, så tenderer pasienter imidlertid til ikke å overholde behandlingskurer som reduserer effektiviteten av behandling [24-26].
Det er et klart behov for nye behandlinger for individer med mer alvorlig sykdom, som ofte oppnår veldig begrenset fordel fra enten høyere doser av inhalerte eller orale kortikosteroider anbefalt av astmaretningslinjene. Langvarig behandling med orale kortikosteroider er assosiert med bieffekter slik som osteoporose, nedsatt veksthastighet i barn, diabetes og orale kandidias [88]. Ettersom både gunstige og alvorlige effekter av kortikosteroider styres via den samme reseptoren, så er behandling en balanse mellom sikkerhet og effektivitet. Hospi tali sering av disse pasienter, som representerer rundt 6% av Storbritannias astmapopulasjon, som et resultat av alvorlige eksaserbasjoner utgjør hoveddelen av den signifikante økonomiske byrden for astma på helsevesenautoriteter
[89]. Man tror at patalogien til astma er forårsaket av pågående Th2 lymfocyttstyrt inflammasjon som er et resultat av upassende responser av immunsystemet på uskadelige antigener. Bevis har tiltatt som impliserer IL-13 heller enn det klassisk Th2 utledede cytokinet IL-4, som nøkkelmediatoren i patogenesen av etablert luftvei ssykdom. Administrering av rekombinant IL-13 til luftveiene hos naive ikke-sensitiserte gnagere forårsaket mange aspekter av astmafenotypen inkludert luftveisinflammasjon, slimproduksjon og AHR [27] [28] [29] [30]. En lignende fenotype ble observert i en transgen mus hvor IL-13 ble spesifikt overuttrykt i lungen. I denne modell så resulterte mer kronisk eksponering for IL-13 også i fibrose [31]. I gnagermodeller med allergisk sykdom så har videre mange aspekt av astmafenotypen blitt assosiert med IL-13. Løselig muse IL-13Ra2, en potent IL-13 nøytralisator, har vært vist å hemme AHR, slimhypersekresjon og influksen av inflammatoriske celler som er karakteristiske i denne gnagermodell [27] [28] [30]. I komplementære studier så mislyktes mus hvor IL-13 genet var blitt slettet, å utvikle allergenindusert AHR. AHR kunne gjenvinnes i disse IL-13 manglende mus ved administreringen av rekombinant IL-13.1 motsetning til dette så utviklet IL-4 manglende mus luftvei ssykdom i denne modell [32] [33]. Ved å anvende en langvarig allergenindusert lungeinflammasjonsmodell, så viste Taube et al. effektiviteten av løselig muse-IL-13Ra2 mot etablerte luftvei ssykdom [34]. Løselig muse-IL-13Ra2 hemmet AHR, slimoverproduksjon og i mindre grad luftveisinflammasjon. I motsetning til dette så hadde løselig IL-4Ra, som binder og antagoniserer IL-4, liten effekt på AHR eller luftveisinflammasjon i dette system [35]. Disse funn ble støttet av Blease et al. som utviklet en kronisk soppmodell for astma hvor polyklonale antistoffer mot IL-13 men ikke IL-4 var i stand til å redusere slimoverproduksjon, AHR og subepitelial fibrose [36]. En rekke genetiske polymorfi smer i IL-13 genet har også vært koplet til allerkisk sykdom. Spesielt så har en variant av IL-13 genet hvor argininresidiet ved aminosyre 130 er substituert med glutamin (Q130R) vært assosiert med bronkial astma, atopisk dermatitt og økede serum IgE-nivåer [37] [38] [39] [40]. Denne bestemte IL-13 variant refereres også til som Ql 10R varianten (argininresidiet ved aminosyre 110 er substituert med glutamin) av noen grupper som ekskluderer 20 aminosyresignalsekvensen fra aminosyretallet. Arima et al, [41] rapporterte at denne variant er assosiert med økede nivåer av IL-13 i serum. IL-13 varianten (Q130R) og antistoffer mot denne variant er diskutert i WO 01/62933. En IL-13 promoterpolymorfisme, som forandrer IL-13 produksjon, har også blitt assosiert med allergisk astma [42].
Økede nivåer av IL-13 er også blitt målt i humane individer med astma, atopisk rinitt (høyfeber), allergisk dermatitt (eksem) og kronisk sinusitt. For eksempel så ble nivåer av IL-13 funnet å være høyere i bronkiale biopsi er, sputum og bronko-alveolære utskillings (BAL) -celler fra astmatikere sammenlignet med kontrollindivider [43] [44]
[45] [46]. Videre så øket nivåer av IL-13 i BAL-prøver i astmatiske individer ved utfordring med allergen [47] [48]. IL-13 produksjonskapasiteten til CD4 (+) T-celler har videre vært vist å være nyttig markør for risiko for etterfølgende utvikling av allergisk sykdom i nyfødte [49].
Li et al [114] har nylig rapportert effekter av et nøytraliserende anti-muse IL-13 antistoff i en kronisk musemodell for astma. Kronisk astmalignende respons (slik som AHR, alvorlig luftveisinflammasjon, hyperslimproduksjoner) ble indusert i OVA-sensitiserte mus. Li et al rapporterte at administrering av et IL-13 antistoff ved tidspunktet for hver OVA-utfordring supresserer AHR, eosinofil infiltrasjon, serum IgE-nivåer, proinflammatosike cytokin/kemokinnivåer og luftveisremodellering [14].
I oppsummering så tilveiebringer disse data indikasjon på at IL-13 heller enn IL-4 er et mer attraktivt mål for behandlingen av human allergisk sykdom. IL-13 kan spille en rolle i patogenesen av inflammatorisk bowels sykdom. Heller et al.
[116] rapporterte at nøytralisering av IL-13 ved administrering av løselig IL-13Ra2 forbedret inflammasjon i: en musemodell med human ulserøs kolitt [116]. I overensstemmelse med dette så var IL-13 ekspresjon høyere i rektale biopsiprøver fra ulserøs kolittpasienter sammenlignet med kontroller [117].
Bortsett fra astma så har IL-13 vært assosiert med andre fibrøse tilstander. Økede nivåer av IL-13, opp til 1000 ganger høyere enn IL-4, har vært målt i serumet til pasienter med systemisk sklerose [50] og BAL-prøver fra pasienter angrepet av andre former for lungefibrose [51]. I overensstemmelse med dette så resulterte overuttrykk av IL-13 men ikke IL-4 i muselungen i uttalt fibrose [52] [53]. Bidraget til IL-13 på fibrose i andre vev enn lungen er blitt nøye studert i en musemodell med parasittindusert leverfibrose. Spesifikk hemming av IL-13 ved administrering av løselig IL-13a2 eller IL-13 genødeleggelse, men ikke fjerning av IL-4 produksjon hindret fibrogenese i leveren [54]
[55] [56].
Kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD) indkluderer pasientpopulasjoner med forskjellige grader av kronisk bronkitt, små luftveissykdom og emfysem og erkarakterisert vedprogressiv irreversibel lungefunksjonnedsettelse som responderer dårlig på nåværende astmabasert terapi [90]. Forekomsten av COPD har økt dramatisk i senere år til å bli den fjerde ledende årsaken til død i verden (Verdens Helseorganisasjon). COPD representerer derfor et stort udekket medisinsk behov.
De underliggende årsakene til COPD er enda dårlig forstått. Den "Nederlandske hypotesen" foreslår at det finnes en vanlig mottakelighet for COPD og astma og derfor at lignende mekanismer kan bidra til patogenesen av begge forstyrrelser [57].
Zeng et al [58] har vist at overuttrykk av IL-13 i muselungen forårsaket emfysem, øket slimproduksjon og inflammasjon, noe som reflekterer aspektet av human COPD. Videre så har AHR, en IL-13 avhengig respons i musemodeller for allergisk inflammasjon, vært vist å være forutsigende for lungefunksjonnedgang hos røykere [59]. En link har også vært etablert mellom en IL-13 promoterpolymorfisme og mottakelighet for å utvikle COPD [60].
Tegnene er derfor at IL-13 spiller en viktig rolle i patogenesen av COPD, spesielt i pasienter med astmalignende trekk inkludert AHR og eosinofilia. mRNA-nivåer til IL-13 har vært vist å være høyere i autopsi vevsprøver fra individer med en COPD-historie sammenlignet med lungeprøver fra individer som ikke hadde rapportert lungesykdom (J. Elia, Oral communication at American Thoracic Society Annual Meeting 2002). I en annen studie så ble økede nivåer av IL-13 vist ved immunhistokjemi i perifere lungesnitt fra COPD-pasienter [91].
Hodgkin's sykdom er en vanlig type lymfoma, som står for ca 7.500 tilfeller pr år i USA. Hodgkin's sykdom er uvanlig blant ondartethetene ved at den neoplastiske Ree-Sternberg-cellen, ofte utledet fra B-celler, utgjør bare en liten del av den klinisk detekterbare massen. Hodgkin's sykdoms utledede cellelinjer og primære Ree-Sternberg-celler uttrykker ofte IL-13 og dets reseptor [61]. Ettersom IL-13 fremmer celleoverlevelse og proliferering i normale B-celler, så ble det foreslått at IL-13 kunne virke som en vekstfaktor for Reed-Sternberg-celler. Skinnider et al. har vist at nøytraliserende antistoffer mot IL-13 kan hemme veksten av Hodgkin's sykdom-utledede cellelinjer in vitro [62]. Dette funn tydet på at Reed-Sternberg-celler kan øke deres egen overlevelse ved en IL-13 autokrin og parakrin cytokinsløyfe. I overensstemmelse med denne hypotese, så har økede nivåer av IL-13 vært detektert i serumet til noen Hodgkin's sykdoms-pasienter sammenlignet med normale kontroller
[63]. IL-13 hemm ere kan derfor forhindre sykdomsutvikling ved å hemme proliferering av maligne Reed-Sternberg celler.
Mange humane cancerceller uttrykker immunogene tumorspesifikke antigener. Selv om mange tumorer spontant regredierer, så unngår imidlertid en rekke immunsystemer (immunovervåking) ved å undertrykke T-cellestyrt immunitet. Terabe et al. [64] har vist en rolle til IL-13 i immunundertrykking i en musemodell hvor tumorene spontant regregierer etter initiell vekst og deretter kommer tilbake. Spesifikk hemming av IL-13, med løselig IL-13Ra2, beskyttet disse mus fra tumorgj enkom st. Terabe et al. [64] gjkk videre til å vise at IL-13 undertrykker differensieringen av tumorspesifikke CD8+ cytotoksiske lymfocytter som styrer anti-tumor-immunresponser. IL-13 hemmere kan derfor anvendes terapeutisk for å hindre tumor-tilbakefall eller metastaser. Hemming av IL-13 har vært vist å øke antivirale vaksiner i dyremodeller og kan være gunstig i behandlingen av HIV og andre infeksiøse sykdommer [65].
Det bør legges merke til at referanse generelt her til interleukin-13 eller IL-13 er, unntatt der hvor sammenhengen indikerer noe annet, referanse til humant IL-13. Dette blir også referert til på steder som "antigenet". Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer antistoffer mot humant IL-13, spesielt humane antistoffer, som kryss-reagerer med ikke- humant primat IL-13, inkludert cynomolg og rhesusape IL-13. Antistoffer i sammenheng med noen antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen gjenkjenner ingen variant av IL-13 hvor argininresidiet ved aminosyreposisjon 130 er erstattet med glutamin. I andre aspekter og utførelsesf ormer så tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen spesifikke bindingsmedlemmer mot muse-IL-13, spesielt mus-IL-13.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser nøytraliseirngspotens (% hemming) av BAK 167Al 1 (lukkede firkanter) og dets derivat BAK615E3 (åpne firkanter) som scFv mot 25 ng/ml humant IL-13 i TF-1 celleproliferingsanalysen. Trianglene representerer et irrelevant scFv. Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper av triplikate bestemmelser innen det samme eksperimentet. Figur 2 viser nøytraliseirngspotensen (% hemming) av BAK278D6 (lukkede firkanter) og dets derivat BAK502G9 (åpne firkanter) som scFv mot 25 ng/ml humant IL-13 i TF-1 celleprolifereringsanalysen. Trianglene representerer et irrelevant scFc. Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper av triplikate bestemmelser innen det samme eksperimentet. Figur 3 viser nøytraliseirngspotensen (% hemming) av BAK209B11 (lukkede firkanter) som en scFv mot 25 ng/ml muse-IL-13 i TF-1 celleprolifereringsanalysen. Trianglene representerer et irrelevant scFv. Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper av triplikate bestemmelser innen det samme eksperimentet. Figur 4 viser nøytralisringspotensen (% hemming) av BAK278D6 (lukkede firkanter) som et scFv mot IL-13 i TF-1 celleprolifereirngsanalysen. Trianglene representerer et irrelevant scFv. Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper av triplikate bestemmelser innen det samme eksperimentet.
Figur 4A viser potens mot 25 ng/ml humant IL-13.
Figur 4B viser potens mot 25 ng/ml humant variant IL-13.
Figur 4C viser potens mot 50 ng/ml ikke-humant primat IL-13.
Figur 5 viser en sammenligning av potensen til anti-humane IL-13 antistoffer i TF-1 prolifereringsanalysen. Dataene representerer gjennomsnitt nøytraliseirngspotensen med standard feilstolper over 5-7 eksperimenter mot 25 ng/ml humant IL-13. Utførelsen i forhold til det kommersielt tilgjengelige antistoffet, B-B13, ble evaluert statistisk ved å utføre en en-veis ANOVA med Dunnetfs test.<*>P<0,05,<**>P<0,01 sammenlignet med B-B13. Figur 6 viser nøytraliseringspotensen (% hemming) av BAK502G9 (lukkede firkanter), BAKI 167F2 (lukkede triangler) og BAKI 183H4 (lukkede inverterte triangler) som humant IgG4 mot tagget IL-13 i TF-1 celleprolifereringsanalysen. Åpne triangler representerer et irrelevant IgG4. Dataene representerer gjennomsnittt med standard feilstolper av tre separate eksperimenter.
Figur 6A viser potens mot 25 ng/ml humant IL-13.
Figur 6B viser potens mot 25 ng/ml humant variant IL-13.
Figur 6C viser potens mot 50 ng/ml ikke-humant primat IL-13.
Figur 7 viser nøytraliseringspotensen (% hemming) av BAK502G9 (lukkede firkanter), BAKI 167F2 (lukkede triangler), BAKI 183H4 (lukkede inverterte triangler) som humant IgG4 og kommersielle anti-humane IL-13 antistoffer (B-B13 - åpne firkanter; JES10-5A2 - åpne inverterte triangler) i den native IL-13 avhengige FIDLM-2 celleprolifereringsanalysen. Åpne triangler representerer et irrelevant IgG4. Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper av triplikate bestemmelser innen det samme eksperimentet. Figur 8 viser en sammenligning av potensen av anti-humane IL-13 antistoff i NHLF-analysen. Data representerer den gjennomsnittlige nøytraliseringspotensen (IC50pM) med standard feilstolper over 4-5 eksperimenter mot 10 ng/ml humant IL-13 i NHLF eotaksin frigjøringsanalysen. Utførelsen i forhold til det kommersielt tilgjengelige antistoffet, B-B13, ble evaluert statistisk ved å utføre en en-veis ANOVA med Dunnetfs test.<*>P<0,05,<**>P<0,01 sammenlignet med B-B13. Figur 9 viser nøytraliseringspotensen (% hemming) av BAK502G9 (lukkede firkanter), BAKI 167F2 (lukkede triangler), BAKI 183H4 (lukkede inverterte triangler) som humant IgG4 mot VCAM-1 oppregulering av overflaten av HUVEC som respons på 10 ng/ml humant IL-13. Åpne triangler representerer irrelevant IgG4. Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper av triplikate bestemmelser innen det samme eksperiment. Figur 10 viser nøytraliseringspotensen (% hemming) av BAK502G9 (lukkede firkanter) BAKI 1867F2 (lukkede triangler), BAKI 183H4 (lukkede inverterte triangler) som humant IgG4 mot eotaksin frigjøring fra VCAM-1 oppregulering på overflaten av HUVEC som respons på enten 1 ng/ml humant IL-4 (firug 10A) eller 0,5 ng/ml humant IL-ip (figur 10B). Åpne triangler representerer et irrelevant IgG4. Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper av triplikate bestemmelser innen det samme eksperimentet. Figur 11 viser nøytraliseirngspotensen (% hemming) av BAK209B11 (firkanter) som et humant IgG4 mot 1 ng/ml muse IL-13 i den faktor avhengige B9 celleprolifereringsanalysen. Åpne triangler representerer et irrelevant IgG4. Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper av triplikate bestemmelser innen det samme eksperimentet. Figur 12 viser det relative nivået av IL-13 i lungehomogenater fra sensitiserte (s) (høyre-hånds stolpe) og ikke-sensitiserte (ns) (venstre-hånds stolpe) mus etter utfordring i en musemodell med akutt lungeallergjsk inflammasjon. Effekten av sensi ti sering ble statistisk evaluert ved å utføre Student's t-test ved å anvende kvantitet av IL-13 data. *<0 5<**><o,01 sammenlignet med ikke sensitiserte kontrolldyr (n=5-6 mus). Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper. Figur 13 illustrerer effektene av i.v. administrering av BAK209B11 som humant IgG4 i forskjellige mengder sammenlignet med et isotype passet IgG4 irrelevant kontroll antistoff på ovalbuminindusert leukocyttrekruttering til lungen i ovalbuminsensitiserte mus. Antallet leukocytter er vist (x IO<4>). Effekten av antistoffbehandling ble statistisk evaluert ved å utføre en-veis ANOVA med Dunnetfs test ved å anvende differensielle celletalldata.<*><0,05.<**><0,01 sammenlignet med ovalbuminutfordrede PBS-kontrolldyr (=0% hemming; n=5-8 mus). Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper. Figur 14 illustrerer effektene av i.v. administrering av BAK209B11 som humant IgG4 i forskjellige mengder sammenlignet med et isotypetilpasset IgG4 irrelevant kontrollantistoff på ovalbuminindusert eosinofil rekruttering til lungen i ovalbuminsensitiserte mus. Antallet eosinofiler er vist (x IO<4>). Effekten av antistoffbehandling ble statistisk evaluert ved å utføre en-veis ANOVA med Dunnetfs test ved å anvende differensielle celletalldata.<*><0,05.<**><0,01 sammenlignet med ovalbuminutfordrede PB S-kontrolldyr (=0% hemming; n=5-8 mus). Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper. Figur 15 illustrerer effektene av i.v. administrering av BAK209B11 som humant IgG4 i forskjellige mengder sammenlignet med et isotypetilpasset IgG4 irrelevant kontrollantistoff på ovalbuminindusert neutrofil rekruttering til lungen i ovalbuminsensitiserte mus. Antallet neutrofiler er vist (x IO<4>). Effekten av antistoffbehandling ble statistisk evaluert ved å utføre en-veis ANOVA med Dunnetfs test ved å anvende differensielle celletalldata.<*><0,05.<**><0,01 sammenlignet med ovalbuminutfordrede PB S-kontrolldyr (=0% hemming; n=5-8 mus). Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper. Figur 16 illustrerer effektene av i.v. administrering av BAK209B11 som humane IgG4 i forskjellige mengder sammenlignet med et isotypetilpasset IgG4 irrelevant kontrollantistoff på ovalbuminindusert lymfocyttrekruttering til lungen i ovalbuminsensitiserte mus. Induksjonen av lymfocytter var doseavhengig hemmet av BAK209B11 med maksimal hemming ved 3 ng/ml ved BAK209B11. Effekten av antistoffbehandling ble statistisk evaluert ved å utføre en-veis ANOVA med Dunnetfs test ved å anvende differensiell celltalldata.<*><0,05.<**><0,01 sammenlignet med ovalbuminutfordrede PB S-kontrolldyr (=0% hemming; n=5-8 mus). Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper. Figur 17 illustrerer effektene av i.v. administrering av BAK209B11 som humant IgG4 i forskjellige mengder sammenlignet med et isotypetilpasset IgG4 irrelevant kontrollantistoff på ovalbuminindusert monocytt/makrofagrekruttering til lungen i ovalbuminsensitiserte mus. Det var ingen signifikant økning i nivåene av monocytt/makrofager i sensitiserte dyr sammenlignet med kontrolldyr. Slike bakgrunnsnivåer av disse celler ble imidlertid slått ned ved >36 u.g/ml BAK209B11 i sensitiserte dyr. Effekten av antistoffbehandling ble statistisk evaluert ved å utføre en-veis ANOVA med Dunnetfs test ved å anvende differensielt celletalldata.<*><0,05.<**><0,01 sammenlignet med ovalbumin utfordrede PB S-kontrolldyr (=0% hemming; n=5-8 mus). Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper. Figur 18 viser effektene av et kommersielt anti-IL-13 nøytraliserende antistoff JES 10-5A2 tilgangen av celler (antall leukocytter er vist (x IO<4>)) inn i muse "air-pouchen" fremkalt ved administrering av bakterielt utledet rekombinant humant IL-13. Effekten av antistoffbehandling ble statistisk evaluert ved å utføre en-veis ANOVA med Dunnetfs test ved å anvende differensiell celletalldata.<*><0,05.<**><0,01 sammenlignet med CMC-kontrolldyr (=0% hemming; n=l 1-13 mus). Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper. Figur 19 viser en sekvensoppstilling av cynomolg IL-13 mot humant IL-13 aminosyresekvenser. De syv aminosyreresidiene som skiller mellom humant og cynomolgt IL-13 er skyggelagt. Rhesus og cynomolg IL-13 har en identisk aminosyresekvens. Figur 20 illustrerer effekten av enkel 10 mg/kg i.v. bolusdose av BAK502G9 som humant IgG4 på serum IgE-nivåer i 4 allergiske men ikke-utfordrede cynomolge primater (2 hanner/2 hunner) i løpet av 29 dager. Serum IgE-konsentrasjon er signifikant redusert fra 100 % (predose) til 66 ± 10 % av kontrollverdier (p<0,05), ved 4 og 5 dager etter dosering. Denne reduksjon av serum IgE-konsentrasjon stiger til 88 ± 8 % av kontrollnivåer ved dag 22.<*>= p<0,05 sammenlignet med predose IgE-nivåer, repeterte målinger ANOVA etterfulgt av Dunnetfs multippel sammenligningstest (n=4 dyr). Figur 20B viser relative serum IgE-nivåer av hann og hunn cynomolge primater mot tid etter en enkel 10 mg/kg intravenøs dose av BAK502G9. Relative serum IgE-data er uttrykt som aritmetisk gjennomsnitt + SEM prosent av grunnlinjeverdi. Figur 21 illustrerer effektene av intraperitoneal administrering av BAK209B11 i forskjellige mengder (H=237 u.g/dag, M=23,7 u.g/dag og L=2,37 ug/dag) sammenlignet med et isotypetilpasset IgGl irrelevant kontrollantistoff av lungefunksjonen av ovalbuminsensitiserte og utfordrede mus. I figur 21A så er lungefunksjonen representert med log PC50S(log metakolinkonsentrasjon som er nødvendig for å øke grunnlinje PenH ved 50%) før noen behandling (dag 0) og etter sensi ti sering, utfordring og medikamentbehandling (dag 25). Figur 21A viser rådataene som ble anvendt fo rå beregne studieendepunktet, vist i figur 2IB (Delta log PC50). Dataene representerer gjennomsnittet med standard feilstolper på n=8.
I figur 2IB så er å forandre lungefunksjon vist ved en forandring i en individuell mus sin log PC50(delta log PC50). Delta log PC50er definert som et individs forandring i log PC50ved dag 25 mot dag 0. Data representerer gruppe gjennomsnitt delta log PC50(individuelle forandringer i gjennomsnitt innen behandlingsgruppene) med standard feilstolper. Effekten av antistoffbehandling ble statistisk evaluert ved å utføre en-veis ANOVA med Dunnetfs test ved å anvende delta log PC50data.<**>p<0,01 sammenlignet med ovalbuminsensitiserte og utfordrede kontrollmus (n=8 mus).
Figur 22 illustrerer effektene av lokal (i.po.) og systemisk (i.v.) administrering av BAK502G9 som humant IgG4 i forskjellige mengder sammenlignet med et isotypetilpasse IgG4 irrelevant kontrollantistoff på den totale leukocyttrekrutteringen
(figur 22A) og eosinofilrekruttering (figur 22B) til "air-pouchen" til BALB/C mus. Dataene representerer gjennomsnitt med standard feilstolper til n=10. Effekten av antistoffbehandling ble statistisk evaluert ved å utføre en-veis ANOVA med Dunnetfs test ved å anvende log-transformerte data.<*>p<0.05.<**>p<0.01 sammenlignet med HuIL-13 utfordrede mus (n=10). Figur 23: illustrerer effektene av i.p. administrering av BAK502G9 som humant IgG4 sammenlignet med et isotypetilpasset IgG4 irrelevant kontrollantistoff på utviklingen av AHR etter intratrakeal administrering av humant IL-13 til luftveiene hos mus. Effekten av antistoffbehandling ble statistisk evaluert ved å utføre en-veis ANOVA med Dunnetfs test ved å anvende PC200Metacholine-data<*><0,05.<**><0,01 sammenlignet med den humane IL-13 positive kontrollgruppen (n=6-8 mus). Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper. Figur 24 viser nøytraliseringspotensen (% maksimal respons) til BAK502G9 (lukkede firkanter) som IgG4 mot 30 ng/ml IL-13 i en human B-celle IgE-produksjonsanalyse. Åpne firkanter representerer et irrelevant IgG4. Data representerer gjennomsnittet med standard feilstolper av seks donorer fra separate eksperimenter.
Firug 25 viser effektene av BAK502G9 på IL-13 indusert potensiering av agonistindusert CA<2+>signalering i bronkiale glatte muskelceller. Arealet under kurven (AUC) av CA<2+>signaleringsresponsen til histamin ble bestemt for hvert antistoff +/- IL-13 pre-behandlingsbetingelser. Kombinerte data fra tre uavhengige eksperimenter er vist for irrelevant antistoff CAT-001 (a) og BAK502G9 (b) som prosentforskj ellen mot ubehandlede mus med AUC±SD (ns=ikke signifikant (p<0,05),<*>å<0,05,<**>p<0,01). Resultatene ble statistisk evaluert ved å benytte en en-veis analyse av variant (ANOVA) med Bonferroni's multippel sammenligningsposttest.
Figur 26 viser effektene av fase II administrert BAK502G9.
Figur 26A viser effekt på AHR som målt ved forandring i areal under histamin doseresponskurven (n=14).
Figur 26B viser effekten på AHR målt ved forandring i PC30(n=18).
Figur 26C viser effekt på antigenpriming (n=20).
Figur 26D viser effekt på BAL-inflammasjon (n=21).
Figur 27 viser effekt av BAK502G9 på IL-13-indusert CD23 uttrykk. Dataene er presentert som en prosent av responsen på IL-13 alene (100%) og uttrykt som gjennomsnitt ± SEM % kontroll av 6 separate eksperimenter fra 6 individuelle donorer (utsatt i triplikat). Figur 18 viser effekt av BAK502G9 og irrelevant IgG4 på IL-13 og/eller IL-4 indusert PBMC CD23 uttrykk. Data er presentert som en prosent av responsen på IL-4 alene (100 %) og uttrykt som gjennomsnitt ± SEM % kontroll av 4 separate eksperimenter fra 4 individuelle donorer (utført i triplikat). Figur 29A viser effekt av BAK502G9 på NHLF eotaksin-1 produksjon indusert ved 48 timers dyrking med IL-13/ TNF-a/ TGF-pi inneholdende medium. Data er vist som et aritmetisk gjennomsnitt ±SEM fra triplikate bestemmelser av mediet anvendt i denne studie for å indusere leukocytt for sånn forandring. Figur 29B viser effekt av BAK502G9 på for sånn forandring av humane eosinofiler indusert ved 1:16 fortynning av kondisjonert medium. Datapunkter som er representert er gjennomsnitt + SEM % blank medium for sånn forandring fra separate eksperimenter fra fire individuelle donorer. Figur 30 viser oppstilling av humant IL-13 mot muse IL-13 som trekker fram mutasjonene som ble introdusert inn i humant IL-13 kimærer. De fire alpha-heliksene er fremhevet i bokser og sløyfe 1 og sløyfe 3 er merket. Fem kimære proteiner ble produsert hvor heliksene B, C og D og sløyfene 1 og sløyfe 3 ble erstattet med musesekvensen. Fire videre kimære proteiner ble produsert og nummerert i henhold til aminosyren i det humane pre-proteinet (ikke til nummereringen av den multiple oppstillingen over) hvor arginin ved residiet 30 (posisjon 34 over) ble mutert, residiene 33 og 34 (posisjon 37 og 38 over) ble mutert, residiene 37 og 38 (VH) ble mutert (posisjon 41 og 42 over), og residiene 40 og 41 (TQ) ble mutert (posisjon 44 og 45 over). Figur 31 viser oppstilling av humant IL-13 mot muse IL-13 som fremhever mutasjonene som ble introdusert inn i humant IL-13 for å produsere det andre panelet med IL-13 kimærer. Seks kimærer ble produsert hvor det humane residiet eller residiene ble substituert med museresidiet eller residiene (fremhevet med bokser). Fire videre kimære proteiner ble produsert (nunnerering er i henhold til aminosyreposisjonen i det humane pre-proteinet) hvor leusin ved residie 58 (62 i den ovenfor nevnte figur) ble mutert, leusin ved residie 119 (residie 123 over) ble mutert, lysin ved posisjon 123 (residie 127 over) ble mutert og arginin ved residie 127 (residie 132 over) ble mutert. Figur 32 viser mutasjoner laget i humant IL-13. Mutasjoner i mørk grått reduserte binding til BAK502G9, mutasjoner i lys grått forandret ikke binding. Lineær sekvens av pre-humant ILI3 med muterte residier er indikert.
I forskjellige aspekt og utførelsesformer av oppfinnelsen så blir det tilveiebrakt emnespørsmålene til kravene som er inkludert under.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer spesifikke bindingsmedlemmer for IL-13, spesielt humant og/eller primat IL-13 og/eller variant IL-13 (Q130R), og muse IL-13. Foretrukne utførelsesformer innen den foreliggende oppfinnelsen er antistoffmolekyler, enten hele antistoff (feks. IgG, slik som IgG4) eller antistoffragmenter (feks. scFv, Fab, dAb). Antistoffantigenbindingsregioner ble tilveiebrakt, det blir også antistoff VH og VL domener. Innen VH og VL domener så blir det tilveiebrakt komplementaritets-bestemmende regioner, CDR'er, som kan tilveiebringes innen forskjellige leserammeregioner, FR'er, til å danne VH eller VL domener som tilfellet kan være. Et antigenbindende sete kan bestå av et antistoff VH domene og/eller et VL domene.
Et antigenbindende sete kan tilveiebringes ved hjelp av arrangemang av CDR'er på ikke-antistoff proteinscaffold slik som fibronektin eller cytokrom B osv. [115, 116]. Scaffold for å konstruere nye bindingsseter i proteiner er blitt gjennomgått i detalj av Nygren et al [116]. Proteinscaffold for antistoffetterligninger er utgrei et i WO/0034784 hvor oppfinnerne beskriver proteiner (antistoffetterligninger) som inkluderer et fibronektin type Ul domene som har minst en randomisert sløyfe. Et passende scaffold som man kan sette inn en eller flere CDR'er i, feks. et sett med HCDR'er, kan tilveiebringes ved ethvert domenemedlem av den immunglobuline gensuperfamilien.
Foretrukne utførelsesformer i den foreliggende oppfinnelsen er i det som her kalles "BAK278D6 linjen". Dette er definert med referanse til et sett med seks CDR sekvenser av BAK278D6 som følger: HCDR1 (SEW ID NO: 1), HCDR2 (SEC ID NO: 2), HCDR3 (SEC ID NO: 3), LCDR1 (SEQ ID NO: 4), LCDR2 (SEQ ID NO: 5) og LCDR3 (SEQ ID NO: 6). I ett aspekt så tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et spesifikt bindingsmedlem for humant IL-13, som omfatter et antistoffantigenbindende sete som er sammensatt av et humant antistoff VH domene og et humant antistoff VL domene og som omfatter et sett med CDR'er hvor VH domenet omfatter HCDR1, HCDR2 og HCDR3 og VL domenet omfatter LCDR1, LCDR2 og LCDR3, hvor HCDR1 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 1, HCDR2 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 2, HCDR3 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 3, LCDR1 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO:4, LCDR2 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 5, og LCDR3 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 6; eller hvor settet med CDR'er inneholder en eller to aminosyresubstitusjoner sammenlignet med settet av CDR'er hvor HCDR1 har aminosyresekvensen SEQ ID NO: 1, HCDR2 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 2, HCDR3 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 3, LCDR1 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 4, LCDR2 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 5 og LCDR3 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 6.
Settet med CDR'er hvor HCDR1 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 1, så har HCDR2 aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 2, HCDR3 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 3, LCDR1 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 4, LCDR2 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 5, og LCDR3 har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 6, blir her referert til som"BAK278D6 settet av CDR'er". HCDR1, HCDR2 og HCDR3 innen BAK278D6 settet med CDR'er blir referert til som "BAK278D6 settet med HCDR'er" og LCDR1, LCDR2 og LCDR3 innen BAK278D6 settet med CDR'er blir referert til som "BAK278D6 settet med LCDR'er". Et sett med CDR'er med BAK278D6 settet med CDR'er, BAK278D6 settet med HCDR'er eller BAK278D6 LCDR'er, eller en eller to substitusjoner i den, sies å være av BAK278D6 linjen.
Som bemerket så tilveiebringer oppfinnelsen ett aspekt et spesifikt bindingsmedlem for humant IL-13, som omfatter et antistoffantigenbindende sete som er sammensatt av et humant antistoff VH domene og et humant antistoff VL domene og som omfatter et sett med CDR'er, hvor settet med CDR'er er BAK278D6 settet med CDR'er eller et sett med CDR'er som inneholder en eller to substitusjoner sammenlignet med BAK278D6 settet med CDR'er.
I foretrukne utførelsesformer så er den ene eller de to substitusjonene ved ett eller to av de følgende residiene innen CDR'ene til VH og/eller VL domenene, ved å anvende den standard nummereringen til Kabat [107].
31, 32, 34iHCDRl
52, 52A, 53, 54, 56, 58, 60, 61, 62, 64, 65 i HCDR2
96, 97, 98, 99, 101 i HCDR3
26, 27, 28, 30, 31 i LCDR1
56 i LCDR2
95 A, 97 i LCDR3
Foretrukne utførelsesformer har to substitusjoner sammenlignet med BAK278D6 settet av CDR'er, ved HCDR3 residie 99 og LCDR1 residie 27. Av disse utførelsesformer så har foretrukne utførelsesformer S substituert for N ved HCDR3 residie 99 og/eller I substituert for N ved LCDR1 residie 27. Enda videre utførelsesformer har en substitusjon ved HCDR3 residie 99 valgt fra gruppen som består av S, A, L R, P og K, og/eller en substitusjon ved LCDR1 residie 27 valgt fra gruppen som består av I, L,
M, C, V, K, Y, F, R, T, S, A, HogG.
I foretrukne utførelsesformer så blir en eller to substitusjoner gjort ved ett eller to av de følgende residiene innen BAK278D6 settet med CDR'er i henhold til de identifiserte gruppene av mulige substituttresidier:
Posisjon av Substituttresidie
substitusjoner valgt fra gruppen som
består av
31 i HCDR1: Q, D, L, G og E
32iHCDRl: T
34iHCDRl: V, log F
52iHCDR2. D, N, A, R, G ogE
52A i HCDR2: D, G, T, P, N og Y
53 i HCDR2: D, L, A, P, T, S, I og R
54 i HCDR2: S, T, D, G, K og I
56 i HCDR2: T, E, Q, L, Y, N, V, A, M og G
58 i HCDR2: I, L, Q, S, M, H, D og K
60 i HCDR2. R
61 i HCDR2: R
62iHCDR2: K og G
64 i HCDR2: R
65 i HCDR2: K
96iHCDR3: R og D
97iHCDR3: N, D, T og P
98iHCDR3: R
99iHCDR3: R
99 i HCDR3: S, A, I, R, P og K
101iHCDR3: Y
26iLCDRl: D og S
27iLCDRl: I, L, M, C, V, K, Y, F, R, T, S, A, H og G 28iLCDRl: V
30iLCDRl: G
31iLCDRl: R
55 i LCDR2. T
95 A i LCDR3: H
97iLCDR3: I
Foretrukne utførelsesformer har BAK278D6 settet med CDR'er med en substitusjon av S for N ved residie 99 innen HCDR3 og I for N ved residie 27 innen LCDR1. Settet med CDR'er som dermed er definert er som følger: HCDR1 - SEQ ID NO: 7; HCDR2 - SEQ ID NO: 8, HCDR3 - SEQ ID NO: 9; LCDR1 - SEQ ID NO: 10, LCDR2 - SEQ ID NO: 11, LCDR3 - SEQ ID NO: 12. Dette sett med CDR'er blir her referert til som "BAK502G9 settet med CDR'er".
Videre foretrukne utførelsesformer har BAK278D6 settet med CDR'er med en eller to substitusjoner innen CDR'ene, med det forbeholdet at paret med substitusjoner av S for N ved residie 99 innen HCDR3 og I for N ved residie 27 innen LCDR1 er ekskludert.
Andre foretrukne utførelsesformer er som følger: BAKI 166G2:
HCDRl - SEQ ID NO: 67, HCDR2 - SEQ ID NO: 68, HCDR3 - SEQ ID NO: 69, LCDR1 - SEQ ID NO: 70, LCDR2 - SEQ ID NO: 71; LCDR3 - SEQ ID NO: 72.
BAKI 167F1 HCDRl - SEQ ID NO: 61, HCDR2 - SEQ ID NO: 62, HCDR3 - SEQ ID NO: 63, LCDR1 - SEQ ID NO: 64, LCDR2 - SEQ ID NO: 65; LCDR3 - SEQ ID NO: 66.
BAKI 184C8: HCDR - SEQ ID NO:73, HCDR2; SEQ ID NNO: 74, HCDR3 - SEQ ID NO: 75. LCDR1 - SEQ ID NO. 76, LCDR2 - SEQ ID NO: 77, LCDR3 - SEQ ID NO: 78.
BAKI 185E1: HCDRl - SEQ ID NO. 79, HCDR2 - SEQ ID NO: 80, HCDR3 - SEQ ID NO: 81. LCDR1 - SEQ ID NO: 82, LCDR2 - SEQ ID NO: 83; LCDR3 - SEQ ID NO: 84.
BAKI 167F4: HCDRl - SEQ ID NO: 85, HCDR2 - SEQ ID NO. 86, HCDR3 - SEQ ID NO: 87. LCDR1 - SEQ ID NO: 88, LCDR2 - SEQ ID NO: 89; LCDR3 - SEQ ID NO: 90.
BAKI 111D10: HCDRl - SEQ ID NO: 91, HCDR2 - SEQ ID NO: 92, HCDR3 - SEQ ID NO: 93. LCDR1 - SEQ ID NO: 94, LCDR2 - SEQ ID NO: 95; LCDR3 - sEQ ID NO: 96.
BAKI 183H4: HCDRl - sEQ ID NO: 97, HCDR2 - SEQ ID NO: 98, HCDR3 - SEQ ID NO: 99, LDCR1 - SEQ ID NO: 100, LCDR2 - SEQ ID NO: 101; LCDR3 - SEQ ID NO: 102.
BAKI 185F8: HCDRl - SEQ ID NO: 103, HCDR2 - SEQ ID NO: 104, HCDR3 - SEQ ID NO: 105. LCDR1 - SEQ ID NO: 106, LCDR2 - SEQ ID NO: 107, LCDR3 - SEQ ID NO: 108. Alle disse var utledet fra BAK502G9 ved tungkjede CDR1 og CDR2 randomisering og er dermed av BAK502G9 linjen.
Et VH domene omfatter et sett av CDR'er HCDRl, HCDR2 og HCDR3 av enhver klon som er vist i tabell 1. Tabell 1 ble også tilveiebrakt av den foreliggende oppfinnelsen, det blir også et separat VL domene som omfatter et sett med CDR'er LCDR1, LCDR2 og LCDR3 av klonene vist i tabell 1. Helst så blir et slikt VH domene paret med et slikt VL domene, og mest ønskelig så er VH og VL domene-paringene den samme som i klonene satt fram i tabell 1.
Videre så tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et VH domene som omfatter et sett med CDR'er HCDRl, HCDR2 og HCDR3 hvor settet med CDR'er korresponderer til det for enhver klon vist i tabell 1 med en eller to aminosyresubstitusjoner.
Videre tilveiebrakt av den foreliggende oppfinnelsen er et VL domene som omfatter et sett med CDR'er LCDR1, LCDR2 og LCDR3 hvor settet med CDR'er korresponderer til det for enhver klon vist i tabell 1 med en eller to aminosyresubstitusjoner.
Et spesifikt bindingsmedlem som omfatter et antistoffantigenbindende domene som omfatter slikt et VH og/eller VL domene ble også tilveiebrakt av den foreliggende oppfinnelsen.
De foreliggende oppfinnerne har identifisert BAK278D6 linjen som å tilveiebringe humane antistoffantigenbindende domener mot IL-13 som er av spesiell verdi. Innen linjen, så har BAK502G9 blitt identifisert å være av spesiell verdi. BAK278D6 og BAK502G9 sett med CDR'er er blitt identifisert allerede ovenfor.
Ved å følge sporet med computerkjemi i å bruke multivariat dataanalyseteknikker på struktur/egenskapsaktivitetsforhold [94], så kan kvantitative aktivitetsegenskapsforhold til antistoffer utledes ved å anvende velkjente matematiske teknikker slik som statistisk regresjon, mønstergjenkjenning og klassifisering [95-100]. Egenskapene til antistoffer kan utledes fra empiriske og teoretiske modeller (for eksempel) analyse av sannsynlige kontaktresidier eller beregnede fysikalskkjemiske egenskaper) til antistoffsekvens, funksjonelle og tre-dimensjonelle strukturer og disse egenskapene kan betraktes enkeltvis eller i kombinasjon.
Et antistoffantigenbindingssete sammensatt av et VH domene og et VL domene dannes ved seks sløyfer av polypeptid; tre fra det lette kjedevariable domenet (VL) og tre fra det tungkjedevariable domenet (VH). Analyser av antistoffer med kjent atomisk struktur har klarlagt forhold mellom sekvens og den tre-dimensjonale strukturen til antistoff ved å kombinere seter [101, 102]. Disse forhold tyder på at unntatt for den tredje regionen (sløyfen) i VH domener, så har bindingssetet sløyfer en av et lite antall hovedkjede-konformasjoner: kanoniske strukturer. Den kanoniske strukturen dannes i en bestemt sløyfe har vært vist å være bestemt av dets størrelse og tilstedeværelse av visse resi di er ved nøkkelseter i både sløyfen og i leserammeregjoner [101, 102].
Denne studie med sekvensstrukturforhold kan anvendes for å forutsi disse residier i et antistoff med kjent sekvens, men av en ukjent tre-dimensjonal struktur, som er viktig i opprettholdelsen av den tre-dimensjonale strukturen til dets CDR sløyfer og følgelig opprettholde bindingsspesifisitet. Disse forutsigelsene kan oppbackes av sammenligning av forutsigelsene til utbytte fra blyoptimaliseringsinstrumentene.
I en strukturell tilnærmingsmåte, så kan en modell dannes av antistoffmolekylet [103] ved å anvende en fritt tilgjengelig eller kommersiell pakke slik som WAV [104]. En proteinvisualiserings- og analysesoftwarepakke slik som Insight II [105] eller Deppe View [106] kan så anvendes for å evaluere mulige substitusjoner ved enhver posisjon i CDR'en. Denne informasjon kan så anvendes for å lage substitusjoner som sannsynligvis har en minimal eller gunstig effekt på aktivitet.
De foreliggende oppfinnerne analyserte sekvensdata til panelet med kloner hvor settene med CDR'ene er vist i tabell 1.
Analysen testet hypotesen om at binære kombinasjoner av opplistede aminosyrervariasjoner i CDR'ene fra det presenterte settet med scFv varianter førte til en scFv variant med i det minste startpotensen til foreldre scFv BAK278D6.
Alle scFv variantene i panelet vist i tabell 1 er blitt valgt for forbedret affinitet og er blitt bekreftet å utvise høyere potens.
De observerte aminosyrevariasj onene kan enten være gunstige, ikke-gunstige eller nøytrale i deres effekt på startpotensen til scFv BAK278D6 i TF-1 analysen med 44 nM.
Ingen kopling ble observert mellom noen av de to aminosyrevariasj onene som bekrefter at det ikke var noen synergi, enten "positiv" eller "negativ", mellom enhver av de to valgte aminosyrevariasj oner.
Det er fire scenario hvor slik binær kombinasjon vil oppfylle hypotesen og tre scenarioer hvor hypotesen ikke vil være av verdi. Synergistiske aminosyrevarianter blir ikke betraktet ettersom ingen kopling ble observert.
Hypotesen er gjeldende der hvor:
Al: mutasj on 1 er gunstig og mutasjon 2 er gunstig
A2: mutasjon 1 er gunstig og mutasjon 2 er nøytral
A3: mutasj on 1 er nøytral og mutasj on 2 er nøytral
A4: mutasjon 1 er gunstig og mutasjon 2 er ikke-gunstig
(med effekten av 1 som oppveier effekten av 2).
Hypotesen er ikke gyldig der hvor:
B1: mutasj on 1 er ikke-gunstig og mutasj on 2 er nøytral
B2: mutasjon 1 er ikke-gunstig og mutasjon 2 er ikke-gunstig B3: mutasjon 1 er gunstig og mutasjon 2 er ikke-gunstig
(med effekten av 2 som oppveier effekten av 1).
For at A4 skal være mulig så må mutasjon 1 være svært gunstig for å motbalansere den negative effekten av mutasjon 2 på potens. Fordi slik veldig gunstig mutasjon ville være tilstede i biblioteket av varianter anvendt for seleksjon, så ville den selektere for og ville derfor komme til syne ofte i panelet med varianter. Fordi synergi kan ekskluderes, så ville slik mutasjon være gunstig i enhver type sekvenssammenheng og skulle derfor komme tilbake i forskjellige scFv varianter. Et eksempel på slik frekvent aminosyreforandring er forandringen i lettkjede CDR1 Asn27He. Imidlertid så har denne mutasjon på egenhånd (i klon BAK531E2) bare en moderat 2-gangers effekt på potens (endelig IC50 på 23,2 nM). På egenhånd så ville denne mutasjon ikke tillate scenarioet som er skissert i A4, ettersom den ikke er en sterk gunstig mutasjon. Dette tyder på at hver klon i de presenterte settet med IL-13 bindingskloner (tabell 1) som har en lettkjede CDR1 Asn27He variant sammen med en eller flere videre mutasjoner er minst like potent som varianten som har den enkle lettkjede CDR1 Asn27He mutasjonen. De andre mutasjonene er enten nøytrale eller positive, men har ikke en negativ eller skadelig påvirkning.
Et videre eksempel er i den tunge kjede CDR3 Asn99Ser (se tabell 1). Ettersom en klon som bærer denne bestemte enkel-aminosyrevariasjonen ikke er observert, så potensen av en slik klon er blitt estimert til å være ca 12,0 nM ved den følgende logiske forklaringen: BAK278D6 potens er 44 nM. Forandringer i VL CDR1 N27I + VH CDR3 N99S fører til BAK502G9 med potens 8 nM, dvs en 5,5 gangers forbedring.
BAK278D6 potens er 44 nM. Forandring av VL CDR1 N27I fører til BAK531E2 med potens 23 nM, dvs en 1,9 gangers forbedring.
BAK278D6 potens er 44 nM. Forandring VH CDR3 N99S for å tilveiebringe en mulig klon med potens 12,2 nM, dvs en 2,9 gangers forbedring (5,5/1,9 = 2,9).
Den binære kombinasjon av tungkjede CDR3 Asn99Ser med lettkjede CDR1 Asn27He gir en scFv BAK0502G9 med en potens på 8 nM. Ettersom synergi er ekskludert så er bidraget til tung kjede CDR3 Asn99Ser forandring i BAK502G9 derfor additiv.
Derfor så ville hver klon i det presenterte sett med IL-13 bindingskloner (tabell 1) som har en tungkjede CDR3 AsnH99Ser forandring sammen med en eller flere videre mutasjoner ha en potens på minst 12 nM eller større, innen et tillatt analysevindu på 2,5 ganger for n= 1-2.
Oppfinnerne legger dermed merke til at en sterkt fordelaktig aminosyrevariasj on som fordelaktig ville velges ikke er observert. Som diskutert over, så ble to variasjoner som var hovedsakelig representert i tabell 1 med ScFv varianter analysert nærmere. Enhver scFv variant i tabell 1 med enhver av disse mutasjoner sammen med en eller flere videre mutasjoner viste en potens som var minst så forbedret som en klon som inneholdt enhver av disse to enkle aminosyrevariasj oner i foreldre BAK278D6. Det er derfor ikke noe bevis for at en veldig fordelaktig aminosyrevariasj on som ville tillate scenario A4, er tilstede i panelet.
Denne observasjon førte til at oppfinnerne konkluderte at det ikke var noen ikke-fordelaktige mutasjoner tilstede i dette sett med scFv varianter. Dette betyr at scenarioene A4 og Bl til B3 ikke er relevante og at hypotesen er gyldig.
Følgelig som allerede er notert, så tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen spesifikke bindingsmedlemmer som omfatter de definerte settene med CDR'er, spesielt settet med CDR'er til BAK278D6, og sett til CDR'er i BAK278D6 linjen, med en eller to substitusjoner innen settet for CDR'er, feks. BAK502G9 settet med CDR'er.
Det relevante settet av CDR'er ble tilveiebrakt innen antistoffleserammeregioner eller andre proteinscaffold, feks. fibronektin eller cytokrom B [115, 116]. Helst så blir antistoffleserammeregioner benyttet, og der hvor de blir benyttet så er de helst "germline", mer ønskelig så kan antistoffleserammeregionen til den tunge kjeden være DP14 fra VH1 familien. Den foretrukne leserammeregjonen for den lette kjeden kan være X3-3H. For BAK502G9 settet med CDR'er så er det foretrukket at antistoff leserammeregionene er for VH FRI, SEQ ID NO: 27, for VH FR2, SEQ ID NO: 28, For VH FR3, SEQ ID NO: 29, for lettkjede FRI, SEQID NO: 30, for lettkjede FR2, SEQID NO: 31, for lettkjede FR3, SEQ ID NO: 32.1 en veldig foretrukket utførelsesform så blir et VH domene tilveiebrakt med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 15, dette blir kalt
"BAK502G9 VH domene". I en enda veldig foretrukket utførelsesf orm, så blir et VL domene tilveiebrakt med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 16, dette blir kalt "BAK502G9 VL domene". Et veldig foretrukket antistoffantigenbindende sete tilveiebrakt i henhold til den foreliggende oppfinnelsen er sammensatt av BAK502G9 VH domenet, SEQ ID NO: 15 og BAK502G9 VL domenet, SEQ ID NO: 17. Dette antistoffantigenbindende setet kan tilveiebringes innen ethvert ønsket antistoffmolekylformat, feks. scFv, Fab, IgG, IgG4, dAb osv, som blir diskutert videre annet steds her.
I en videre sterkt foretrukket utførelsesf orm, så tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et IgG4 antistoffmolekyl som omfatter BAK502G9 Vh domenet, SEQ ID NO: 15, og BAK502G9 VL domenet, SEQ ID NO: 16. Dette kalles her "BAK502G9 IgG4".
Andre IgG4 eller andre antistoffmolekyler som omfatter BAK502G9 VH domenet, SEQ ID NO: 15, og/eller BAK502G9 VL domenet, SEQ ID NO: 16, blir tilveiebrakt av den foreliggende oppfinnelsen, det samme blir andre antistoffmolekyler som omfatter BAK502G9 settet til HCDR'er (SEQ ID NO: 7, 8 og 9) innen et antistoff VH domene, og/eller BAK502G9 settet til LCDR'er (SEQ ID NO: 10, 11 og 12) innen et antistoff VL domene.
Det er passende å peke på her at "og/eller" hvor det anvendes her må tas som spesifikk utgreiing av hver av de to spesifiserte trekkene eller komponentene med eller uten den andre. For eksempel "A og/eller B" må sees på som spesifikk utgreiing av hver av (i) A, (ii) B og (iii) A og B, akkurat som om hver er satt frem individuelt her.
Som bemerket så tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et spesifikt bindingsmedlem som binder humant IL-13 og som omfatter BAK502G9 VH domenet (SEQ ID NO: 15) og/eller BAK502G9 VL domenet (SEQ ID NO: 16).
Generelt så er et VD domene paret med et VL domene for å tilveiebringe et antistoffantigenbindende sete, selv om som diskutert videre under, et VH domene alene kan anvendes for å binde antigen. I en foretrukket utførelsesform så blir BAK502G9 VH domenet (SEQ ID NO: 15) paret med BAK502G9 VL domenet (SEQ ID NO: 16), slik at et antistoffantigenbindende sete dannes som omfatter både BAK502G9 VH og VL domenene. I andre utførelsesformer så blir BAK502G9 paret med et VL domene forskjellig fra BAK502G9 VL. Lettkjedepromiskuiteten er godt etablert i fagfeltet.
På samme måte så kan ethvert sett av HCDR'er til bAK278D6 linjen tilveiebringes i et VH domene som anvendes som et spesifikt bindingsmedlem alene eller i kombinasjon med et VL domene. Et VH domene kan tilveiebringes med et sett av HCDR'er til et BAK278D6 linjeanti stoff, feks. som vist i tabell 1, og hvis slikt et VH domene pares med et VL domene, så kan dermed VL domenet tilveiebringes med et sett av LCDR'er til et BAK278D6 linjeanti stoff, feks. som vist i tabell 1. En paring med et sett av HCDR'er og et sett med LCDR'er kan være som vist i tabell 1, å tilveiebringe et antistoffantigenbindende sete som omfatter et sett med CDR'er som vist i tabell 1. Rammeregjonene til VH og/eller VL domenene kan være "germline" rammer. Rammeregjonene til det tunge kjededomenet kan velges fra VH-1 familien og en foretrukket VH-1 ramme er DP-14 rammen. Rammeregioner til den lette kjeden kan velges fra X3 -familien og en foretrukket slik ramme er X3 3H.
En eller flere CDR'er kan tas fra BAK502G9 VH eller VL domenet og inkorporeres inn i en passende ramme. Dette diskuteres videre her. BAK502G9 HCDR'ene 1, 2og 3 er vist i henholdsvis SEQ ID NO: 7, 8 og 9. BAK502G9 LCDR'ene 1, 2 og 3 er vist i henholdsvis SEQ ID NO: 10, 11 og 12.
Det samme benyttes for andre BAK278D6 linje CDR'er og sett med CDR'er som vist i tabell 1.
Videre utførelsesformer av oppfinnelsen vedrører et spesifikt bindingsmedlem som omfatter VH og/eller VL domenet eller et antigenbindende sete som omfatter CDR'er til VH og/eller VL domenet av antistoffmolekylet som er utgreiet her som 167A11 (VH: SEQ ID NO: 23 og VL: SEQ ID NO: 24) og dets derivater 615E3 (VH: SEQ ID NO: 33 og VL: SEQ ID NO: 34) BAK582F7 (VH CDR'ene SEQ ID 141-143) og BAK612B5 (VH CDR'er SEQ ID 147-149). Disse gjenkjenner humant IL-13. Derivatene til 167A11 fra VH CDR3 randomisering er potente scFv molekyler (5-6 nM). 167A11 linjen kan benyttes i ethvert aspekt og utførelsesf orm av den foreliggende oppfinnelsen som utgreiet her for andre molekyler, feks. fremgangsmåter for mutasjon og seleksjon av antigenbindende seter med forbedret potens.
Varianter av VH og VL domenene og CDR'er i den foreliggende oppfinnelsen, inkludert de som aminosyresekvenser er satt frem for her, og som kan benyttes i spesifikke bindingsmedlemmer for IL-13 kan skaffes tilveie ved hjelp av fremgangsmåter med sekvensforandring eller mutasjon og screening. Slike fremgangsmåter ble også tilveiebrakt av den foreliggende oppfinnelsen.
Variable domeneaminosyresekvensvarianter av enhver av VH og VL domenene hvis sekvenser er spesifikt utledet her kan benyttes i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen, som diskutert. Spesielle varianter kan inkludere en eller flere aminosyresekvensforandringer (tilsetting, sletting, substitusjon og/eller insetting av et aminosyreresidie), kan være mindre enn ca 20 forandringer, mindre enn ca 15 forandringer, mindre enn ca 10 forandringer eller mindre enn ca 5 forandringer, 4, 3, 2 eller 1. Forandringer kan gjøres i en eller flere rammeregjoner og/eller en eller flere CDR'er.
I overensstemmelse med videre aspekter av den foreliggende oppfinnelse så blir det tilveiebrakt et spesifikt bindingsmedlem som konkurrerer for binding til antigen med enhvert spesifikt bindingsmedlem som både binder antigenet og som omfatter et spesifikt bindingsmedlem, VH og/eller VL domenet som er utgreiet her, eller HCDR3 som er utgreiet her, eller varianter av enhver av disse. Konkurranse mellom bindingsmedlemmer kan lett analyseres in vitro, ved for eksempel å anvende ELISA og/eller ved å tagge et spesifikt reportermolekyl til et bindingsmedlem som kan detekteres i nærværet av andre ikke-taggede bindingsmedlem eller medlemmer, for å muliggjøre identifikasjon av spesifikke bindingsmedlemmer som binder seg til den samme epitopen eller en overlappende epitop.
Et videre aspekt av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer dermed et spesifikt bindingsmedlem som omfatter et humant antistoffantigenbindende sete som konkurrerer med et BAK502G9 antistoffmolekyl, spesielt BAK502G9 scFv og/eller IgG4, for binding til IL-13.1 videre aspekt så tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et spesifikt bindingsmedlem som omfatter et humant antistoffantigenbindende sete som konkurrerer med et antistoffantigenbindende sete for binding til IL-13, hvor det antistoffantigenbindende setet er sammensatt av et VH domene og et VL domene, og hvor VH og VL domenene omfatter et sett med CDR'er fra BAK278D6 linjen.
Forskjellige fremgangsmåter er tilgjengelige i fagfeltet for å skaffe tilveie antistoffer mot IL-13 og som kan konkurrere med et BAK502G9 antistoffmolekyl, et antistoffmolekyl med et BAK502G9 sett av CDR'er, eller at antistoffmolekyl med et sett CDR'er fra BAK278D6 linjen, for binding til IL-13.
I et videre aspekt så tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for å skaffe tilveie ett eller flere spesifikke bindingsmedlemmer som er i stand til å binde antigenet, fremgangsmåten inkluderer å bringe et bibliotek i kontakt med spesifikke bindingsmedlemmer i overensstemmelse med oppfinnelsen og nevnte antigen, og å velge ett eller flere spesifikke bindingsmedlemmer i biblioteket som er i stand til binde nevnte antigen.
Biblioteket kan være vist på overflaten av bakteriofagpartikler, hver partikkel inneholder nukleinsyrer som koder for det antistoff VH variable domenet som er vist på dets overflate, og valgfritt også et vist VL domene hvis det er tilstede.
Etter seleksjon av spesifikke bindingsmedlemmer som er i stand til å binde antigenet og vises på bakteriofagpartikler, så kan nukleinsyre tas fra en bakteriofagpartikkel som viser et nevnte valgt spesifikt bindingsmedlem. Slik nukleinsyre kan anvendes i etterfølgende produksjon av et spesifikt bindingsmedlem eller et antistoff VH variabelt domene (valgfritt et antistoff VL variabelt domene) ved uttrykk fra nukleinsyre med sekvensen av nukleinsyre tatt fra en bakteriofagpartikkel som viser et nevnte selektert spesifikt bindingsmedlem.
Et antistoff VH variabelt domene med aminosyresekvensen til et antistoff VH variabelt domene til et nevnte valgt spesifikt bindingsmedlem kan tilveiebringes i isolert form,
det kan også et spesifikt bindingsmedlem som omfatter et slikt VH domene. Evnen til å binde IL-13 kan videre testes, også evnen til å konkurrere med BAK502G9 (feks. i scFv format og/eller IgG format, feks. IgG4) for binding til IL-13. Evnen til å nøytralisere IL-13 kan testes, som diskutert videre under.
Et spesifikt bindingsmedlem ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan binde IL-13 med affiniteten til et BAK502G9 antistoffmolekyl, feks. scFv, eller helst BAK502G9 IgG4, eller med en affinitet som er bedre.
Et spesifikt bindingsmedlem i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan nøytralisere IL-13 med potensen til et BAK502G9 antistoffmolekyl, feks. scFv, eller helst BAK502G9 IgG4, eller med en potens som er bedre.
Et spesifikt bindingsmedlem i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan nøytraliseres naturlig forekommende IL-13 med potensen til et BAK502G9 antistoffmolekyl, feks. scFv, eller helst BAK502G9 IgG4, eller med en potens som er bedre.
Bindingsaffinitet og nøytraliseirngspotens til forskjellige spesifikke bindingsmedlemmer kan sammenlignes under passende betingelser.
Antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen har en rekke fordeler i forhold til eksisterende kommersielle anti-IL-13 antistoffer, spesielt tre kommersielle gnager anti-humane IL-13 antistoffer, kalt JES10-5A2 (SioSource), B-B13 (Euroclone) og klon 321166 (R&D Systems). Potensen til antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen ble sammenlignet med kommersielle antistoffer JES10-A2 og B-B13. Klon 321166 ble ikke evaluert ettersom tidligere eksperimenter avslørte at denne klon var betraktelig mindre potent enn andre kjente kommersielle antistoffer.
Effektiviteten og anvendelsen av de gnagerkommersielle IL-13 antistoffene i mennesket er sannsynligvis begrenset, på grunn av deres økede potensiale til å indusere immunogene responser og derfor raskere fjerning fra kroppen. Kinetisk analyse av antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen i ikke-humane primater tyder på at disse antistoffer har en fjerningshastighet som ligner til den til andre kjente humane eller humaniserte antistoffer.
Antistoffer tilveiebrakt av forskjellige utførelsesformer i den foreliggende oppfinnelsen gjenkjenner ikke humant primat IL-13, inkludert rhesus og cynomolg IL-13. Å bestemme effektivitet og trygghetsprofiler til et antistoff i ikke-humane primater er veldig verdifullt ettersom det tilveiebringer en måte fra å forutsi antistoffets sikkerhet, farmakokinetikk og farmakodynamikkprofil i mennesker.
Videre så gjenkjenner antistoffer i forskjellige utførelsesformer i den foreliggende oppfinnelsen den human IL-13 variant, Q130R, som er assosiert med astma. Kryssreaktivitet med variant IL-13 tillater antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen og sammensetningene som omfatter antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen å anvendes for behandlingen av pasienter med villtype og variant IL-13.
En foretrukket utførelsesf orm av den foreliggende oppfinnelsen omfatter antistoffer som nøytraliserer naturlig forekommende IL-13 med en potens som er lik eller bedre enn potensen til et IL-13 antigenbindende sete formet av BAK502G9 VH domenet (SEQ ID NO: 15) og BAK502G9 VL domenet (SEQ ID NO: 16). For eksempel så har oppfinnerne demonstrert at representatice kloner slik som BAK502G9, 1167F2 og 1183H4 er signifikant mer potente mot naturlig forekommende IL-13 enn kjente kommersielle antistoffer (figur 7)
I tillegg til antistoffsekvenser så kan et spesifikt bindingsmedlem ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatte andre aminosyrer, for eksempel å danne et peptid eller polypeptid, slik som et foldet domene, eller å gi molekylet en annen funksjonell karakteristikk i tillegg til evnen å binde antigen. Spesifikke bindingsmedlemmer av oppfinnelsen kan bære en detekterbar merking, eller kan være konjugert til et toksin eller en målrettet del eller enzym (feks. via en peptidylbinding eller linker).
I videre aspekt så tilveiebringer oppfinnelsen en isolert nukleinsyre som omfatter en sekvens som koder for et spesifikt bindingsmedlem, VH domenet og/eller VL domener i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, og fremgangsmåter for å lage et spesifikt bindingsmedlem, et VH domene og/eller et VL domene i oppfinnelsen, som omfatter å uttrykke nevnte nukleinsyre under betingelser for å få produksjon av nevnte spesifikke bindingsmedlem, VH domene og/eller VL domene for å gjenvinne det.
Spesifikke bindingsmedlemmer i henhold til oppfinnelsen kan anvendes i en fremgangsmåte for å behandle eller å diagnostisere den humane eller dyrekroppen, slik som en fremgangsmåte for å behandle (som kan inkludere profylaktiske behandling) av en sykdom eller forstyrrelse i en human pasient som omfatter å gi til nevnte pasient en effektiv mengde av et spesifikt bindingsmedlem i oppfinnelsen. Tilstandene som er behandlingsbare i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen inkluderer enhver hvor IL-13 spiller en rolle, spesielt astman, atopisk dermatitt, allergisk rinitt, fibrose, kronisk obstruktiv lungesykdom, skleroderma, inflammatorisk bowel sykdom og Hodgkin's lymfoma. Videre så antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen også anvendes til å behandle tumorer og virale infeksjoner ettersom disse antistoffer vil hemme IL-13 styrt immunsuppresjon [64, 65].
Et videre aspekt av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer nukleinsyre, generelt isolert, som koder for et antistoff VH variabelt domene og/eller VL variabelt domene som er utgreiet her.
Et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer nukleinsyre, generelt isolert, som koder for en VH CDR eller VL CDR sekvens som er utgreiet her, spesielt en VH CDR valgt fra SEQ ID NO: 7, 8 og 9 eller et VL CDR valgt fra SEQ ID NO: 10, II og 12, mest ønskelig BAK502G9 VH CDR3 (SEQ ID NO: 9). Nukleinsyre som koder for BAK502G9 settet med CDR'er, nukleinsyre som koder for BAK502G9 settet med HCDR'er og nukleinsyre som koder for BAK502G9 settet med LCDR'er ble også tilveiebrakt av den foreliggende oppfinnelsen, det samme blir nukleinsyrer som koder for individuelle CDR'er, HCDR'er, LCDR'er og sett med CDR'er, HCDR'er, LCDR'er i BAK278D6 linjen.
Et videre aspekt tilveiebringer er vertcelle som er transformert med nukleinsyre i oppfinnelsen.
Et enda videre aspekt tilveiebringer en fremgangsmåte for produksjon av et antistoff VH variabelt domene, fremgangsmåten inkluderer og forårsake uttrykk fra kodet nukleinsyre. En slik fremgangsmåte kan omfatte å dyrke vertceller under betingelser for produksjon av nevnte antistoff VH variable domene.
Analoge fremgangsmåter for produksjon av VL variable domener og spesifikke bindingsmedlemmer som omfatter et VH og/eller VL domene blir tilveiebrakt som videre aspekter i den foreliggende oppfinnelsen.
En fremgangsmåte for produksjon kan omfatte et trinn av isolasjon og/eller rensing av produktet.
En fremgangsmåte for produksjon kan omfatte og formulere produktet til en sammensetning som inkluderer minst en tilleggskomponent, slik som et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff.
Disse og andre aspekt av oppfinnelsen er beskrevet i videre detalj under.
TERMINOLOGI
Spesifikt bindingsmedlem
Dette beskriver et medlem av et par med molekyler som har bindingsspesifisitet for hverandre. Medlemmene av et spesifikt bindingspar kan være naturlig utledet eller fullstendig eller delvis syntetisk produsert. Ett medlem av paret av molekylet har et område på dets overflate eller en hule som spesifikt binder seg til og som derfor er komplementær til en bestemt romlig og polar organisering av det andre medlemmet av paret med molekyler. Dermed så har medlemmene av paret egenskapen med å binde spesifikt til hverandre. Eksempler på typer med spesifikke bindingspar er antigenantistoff, biotin-avidin, hormon-hormonreseptor, resptorligang, enzymsubstrat. Den foreliggende oppfinnelsen vedrører antigenantistofftypereaksj oner.
Antistoffmolekyl
Dette beskriver et immunglobulin enten naturlig eller delvis eller fullstendig syntetisk produsert. Uttrykket dekker også ethvert polypeptid eller protein som omfatter et antistoffbindende domene. Antistoffragmenter som omfatter et antigenbindende domene er molekyler slik som Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; og diastoffer.
Det er mulig å ta monoklonale og andre antistoffer og anvende teknikker med rekombinant DNA teknologi for å produsere andre antistoffer eller kimære molekyler som har bibeholdt spesifisiteten til det opprinnelige antistoffet. Slike teknikker kan involvere og introdusere DNA som koder for den immunglobulinvariable regionen, eller de kompiementaritetsbestemmende regionene (CDR'ene), til et antistoff til de konstante regionene, eller konstante regioner pluss rammeregioner, fra et forskjellig immunglobulin. Se for eksempel EP-A-184187, GB 2188638A eller EP-A-239400, og en stor mengde etterfølgende litteratur. En hybridoma eller annen celle som produserer et antistoff kan bli utsatt for genetisk mutasjon eller andre forandringer, som kan eller trenger ikke forandre bindingsspesifisiteten til antistoffene som blir produsert.
Ettersom antistoffer kan modifiseres på en rekke måter, så bør uttrykket "antistoffmolekyl" oppfattes som å dekke ethvert spesifikt bindingsmedlem eller substans som har et antistoffantigenbindende domene med den nødvendige spesifisiteten. Dette utrykk dekker dermed antistoffragmenter og derivater, inkludert ethvert polypeptid som omfatter et immunglobulinbindende domene, enten naturlig eller fullstendig eller delvis syntetisk. Kimære molekyler som omfatter et immunglobulinbindende domene, eller ekvivalent, som er fusert til andre polypeptid er derfor inkludert. Kloning og uttrykk av kimære antistoffer er beskrevet i EP-A-0120694 og eP-A-0125023 og en stor masse med etterfølgende litteratur.
Videre teknikker som er tilgjengelige i fagfeltet for å konstruere antistoff har gjort det mulig å isolere humane og humaniserte antistoffer. For eksempel så kan humane hybridoma lages som beskrevet av Kontermann et al [107]. Fagdisplay, en annen etablert teknikk for å generere spesifikk bindingsmedlemmer er også blitt beskrevet i detalj i mange publikasjoner slik som Kontermann et al [107] og WO92/01047 (diskutert videre under). Transgene mus hvor muse-antistoffgenene er inaktivert og funksjonelt erstattet med humane antistoffgener mens andre komponenter av muse-immunsystemet er intakt, kan anvendes for å isolere humane antistoffer til humane antigener [108].
Syntetiske antistoffmolekyler kan lages ved uttrykk fra gener som laget ved hjelp av oligonukleotider syntetisert og sammenstillet innen passende ekspresjonsvektorer, for eksempel som beskrevet av Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86 eller Krebs et al. Journal of Jmmunological Methods 254 2001 67-84.
Det har vært vist at fragmenter av et helt antistoff kan utføre funksjonen med å binde antigener. Eksempler på bindingsfragmenter er (i) Fab fragmentet som består av VL, vH, CL og CH1 domener; (ii) Fd fragmentet som består av VH og CH1 domenene; (iii) Fv fragmentet som består av VL og VH domenene fra et enkelt antistoff; (iv) dAb fragmentet (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554) som består av et VH domene; (v) isolerte CDR regioner: (vi) F(ab')2 fragmenter, et bivalent fragment som omfatter to koplede Fab fragmenter (vii) enkeltkjede Fv molekyler (scFv), hvor et VH domene og et VL domene er koplet med en peptidlinker som tillater de to domene å assosiere eller danne et antigenbindende sete (Bird et al, Science, 242 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) bispesifikke enkelkjede Fv dimerer (PCT/US92/09965) og (ix) "diastoffer" multivalente eller multispesifikke fragmenter som er konstruert ved genfusjon (WO94/13804; P. Holliger et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90 6444-6448, 1993). Fv, scFv eller diastoffmolekyler kan stabiliseres ved inkorporeringen av disulfidbroer som kopler VH og VL domenene (Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Ministoffer som omfatter et scFv koplet til et CH3 domene kan også lages (S, Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996).
Der hvor bispesifikke antistoffer skal anvendes så kan disse være konvensjonelle bispesifikke antistoffer, som kan produseres på en rekke måter (Holliger, P, og Winter G. Current Opinion Biotechnol, 4, 446-449 (1993)), feks. tillaget kjemisk eller fra hybrid hybridoma, eller de kan være ethvert av de bispesifikke antistoffragmentene som er nevnt over. Eksempler på bispesifikke antistoffer inkluderer de med BiTE™ teknologien hvor bindingsdomenene til to antistoffer med forskjellig spesifisitet kan anvendes og direkte koples via korte fleksible peptider. Dette kombinerer to antistoffer på en kort enkel polypeptidkjede. Diastoffer og scFv kan konstrueres uten en Fc region, ved å anvende bare variable domener, og potensielt redusere effektene av anti-idiotypisk reaksjon.
Bispesifikke diastoffer, i motsetning til bispesifikke hele antistoffer, kan også være spesielt nyttig fordi de kan lett konstrueres og uttrykkes i E. coli. Diastoffer (og mange andre polypeptider slik som antistoffragmenter) med passende bindingsspesifisitet kan lett selekteres ved å anvende fagdisplay (WO94/13804) fra biblioteker. Hvis en arm av diastoffet skal holdes konstant for eksempel, med en spesifisitet rettet mot IL-13, så kan et bibliotek lages hvor den andre armen varierer og et antistoff med passende spesifisitet selekteres. Bispesifikke hele antistoffer kan lages ved "knobs-into-holes" konstruering (J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng-, 9, 616-621, 1996).
Antigenbindende domene
Dette beskriver delen av et antistoffmolekyl som omfatter området som spesifikt binder seg til og er komplementær til del eller hele av et antigen. Der hvor et antigen er stort, så kan et antistoff bare binde seg til en bestemt del av antigenet, Denne delen kalles en epitop. Et antigenbindernde domene kan tilveiebringes ved ett eller flere antistoffvariable domener (feks. et såkalt Fd antistoffragment som består av et VH domene). Helst så omfatter et antigenbindende domene en antistofflettkjedevariabel region (VL) og et antistofftungkjedevariabel region (VH).
Spesifikk
Dette kan anvendes for å referere til situasjonen hvor ett medlem av et spesifikt bindingspar ikke vil vise noen signifikant binding til molekyler andre enn dets spesifikke bindingspartner eller partnere. Uttrykket er også brukbart hvor feks. et antigenbindende domene er spesifikk for et bestemt epitop som bæres av en rekke antigener, i dette tilfellet så vil det spesifikke bindingsmedlemmet som bærer det antigenbindende domenet være i stand til å binde seg til de forskjellige antigenene som bærer epitopet.
Omfatte
Dette blir generelt anvendt i betydningen av å inkludere, dvs å tillate tilstedeværelse av ett eller flere trekk eller komponenter.
Isolert
Dette refererer til tilstanden som de spesifikke bindingsmedlemmene i oppfinnelsen, eller nukleinsyre som koder for slike bindingsmedlemmer, generelt vil være i ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Isolerte medlemmer og isolert nukleinsyre vil være fri eller vesentlig fri for materiell som de naturlig er assosiert med slik som andre polypeptider eller nukleinsyrer som de finnes sammen med i deres naturlige miljø, eller miljøet hvor de lages (feks. cellekultur) når slik tillaging er ved rekombinant DNA teknologi praktisert in vitro eller in vivo. Medlemmer og nukleinsyre kan formuleres med fortynnere eller hjelpemidler og fremdeles for praktiske formål isoleres, for eksempel så vil medlemmene normalt blandes med gelatin eller andre bærere hvis de anvendes for å dekke mikrotiterplater for anvendelse i immunanalyser, eller så vil de blandes med farmasøytisk akseptable bærere eller fortynnere når de anvendes i diagnose eller terapi. Spesifikke bindingsmedlemmer kan være glykosylerte, enten naturlig eller ved systemer i heterologe eukaryote celler (feks. CHO eller NSO (ECACC 85110503) celler, eller så kan de være (for eksempel hvis de produseres ved uttrykk i en prokaryot celle) ikke-glykosylerte.
Naturlig forekommende IL- 13
Dette refererer generelt til en tilstand hvor IL-13 proteinet eller fragmenter av dem kan finne sted. Naturlig forekommende IL-13 betyr IL-13 protein som blir naturlig produsert av en celle uten tidligere introduksjon av kodende nukleinsyre ved å anvende rekombinant teknologi. Dermed så kan naturlig forekommende IL-13 være som produsert naturlig ved for eksempel CD4+ T-celler og/eller som isolert fra et pattedyr, feks. menneske, ikke-humant primat, gnager slik som rotte eller mus.
Rekombinant IL- 13
Dette refererer til en tilstand hvor IL-13 proteinet eller fragmenter av den kan finne sted. Rekombinant IL-13 betyr IL-13 protein eller fragmenteter av den produsert ved rekombinant DNA i en heterolog vert. Rekombinant IL-13 kan være forskjellige fra naturlig forekommende IL-13 ved glykosylering.
Rekombinante proteiner uttrykt i prokaryote bakterielle uttrykkssystemer blir ikke glykosylert mens de som uttrykkes i eukaryote systemer slik som pattedyr eller insektceller blir glykosylert. Proteiner uttrykt i insektceller har imidlertid en annen glykosylering enn proteiner uttrykt i pattedyrceller.
Med "vesentlig som fremvist" betyr at det relevante CDR eller VH eller VL domenet i oppfinnelsen vil være enten identisk eller veldig likt til de spesifiserte regionene som sekvensen er satt fram fra her. Ved "veldig lik" så er det overveid at fra 1 til 5, helst fra 1 til 4 slik som 1 til 3 eller 1 eller 2, eller 3 eller 4, aminosubstitusjoner kan gjøres i CDR og/eller VH eller VL domenet.
Strukturen for å bære et CDR eller et sett med CDR'er i oppfinnelsen vil vanligvis være en antistofftung- eller lettkjedesekvens eller vesentlig del av den hvor CDR eller sett av CDR'en er lokalisert ved en lokalisering som korresponderer til CDR'en eller settet med CDR'er til naturlig forekommende VH og VL antistoffvariable domener som kodes for av rearrangerte immunglobulingener. Strukturene og lokaliseringene av immunglobulinvariable domener kan bestemmes ved referanse til (Kabat, E. A. etal, Sequences of Proteins of Immunologi cal Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987, og oppdateringer av den som nå er tilgjengelig på Internet.
(http://immuno.bme.nwu.edu eller finn "Kabat" ved å anvende enhver søkemotor).
CDR'er kan også bæres av andre scaffold slik som fibronektin eller cytokrom B [115, 116].
Helst så er en CDR aminosyresekvens vesentlig som satt fram her båret som et CDR i et humant variabelt domene eller en vesentlig del av den. HCDR3 sekvensene vesentlig som satt fram her representerer foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelsen og det er foretrukket at hver av disse bæres som en HCDR3 i et humant tungtkjedevariabelt domene eller en vesentlig del av det.
Variable domener som er brukt i oppfinnelsen kan skaffes tilveie fra enhver germ-line eller rearrangert humant variabelt domene, eller kan være et syntetisk variabelt domene basert på konsensussekvenser til kjente humane variable domener. En CDR sekvens i oppfinnelsen (feks. CDR3) kan introduseres inn i et repertoar med variable domener som mangler en CDR (feks. CDR3), ved å anvende rekombinant DNA teknologi.
For eksempel så beskriver Marks et al ( Bio/ Technology, 1992, 10:779-783) fremgangsmåter for å produsere repertoarer med antistoffvariabelt domene hvor konsensusprimerne som er styrt ved eller tilstøttende til den 5' enden av det variable domeneområdet anvendes sammen med konsensusprimere til den tredje rammeregionen til humane VH gener for å tilveiebringe et repertoar av VH variable domener som mangler en CDR3. Marks et al beskriver videre hvordan dette repertoar kan kombineres med et CDR3 til et bestemt antistoff. Ved å anvende analoge teknikker så kan CDR3-utledede sekvenser i den foreliggende oppfinnelsen skyfles med repertoarene til VH eller VL domener som mangler et CDR3, og de skyflede fullstendige VH eller VL domenene kombinert med et beslektet VL eller VH domene for å tilveiebringe spesifikke bindingsmedlemmer i oppfinnelsen. Repertoaret kan så vises frem i et passende vertsystem slik som fagdisplaysystemet i WO92/01047 eller enhver av de etterfølgende store massene med litteratur, inkludert Kay, B. K., Winter, J.; og Mc Cafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press, slik at passende spesifikke bindingsmedlemmer kan selekteres. Et repertoar kan bestå av fra alt fra IO<4>individuelle medlemmer oppover, for eksempel fra IO<6>til IO8 eller IO<10>medlemmer. Andre passende vertsystemer inkluderer gjærdisplay, bakterielldisplay, T7 display, ribosmdisplay også videre. For en oversikt over ribosomdisplay ser Lowe D og Jermutus L, 2004, Curr. Pharm. Biotech, 517-27, ogsåWO92/01047.
Analog skyfling eller kombinatoriske teknikker blir også utgreiet av Stemmer { Nature, 1994, 370:389-391), som beskriver teknikken i relasjon til et P-laktamasegen men observerer at tilnærmingsmåten kan anvendes for genereringen av antistoffer.
Et videre alternativ er å generere nye VH eller VL regioner som bærer CDR-utledede sekvenser i oppfinnelsen ved å anvende tilfeldig mutagenese av en eller flere valgte VH og/eller VL gener for å genere mutasjoner innen hele det variable domenet. En slik teknikk er beskrevet av Gram et al (1992, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 89:3576-3580), som anvendte fei,-"prone" PCR. I foretrukne utførelsesformer så lages en eller to aminosyresubstitusjoner innen et sett med HCDR'er og/eller LCDR'er.
En annen fremgangsmåte som kan anvendes er å styre mutagenese til CDR regioner i VH eller VL gener. Slike teknikker er utgreiet av Barbas et al. (1994, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 91:3809-3813)og Schier etal(\ 996, J. Mol. Biol. 263:551-567). Alle de ovenfor beskrevne teknikkene er kjent i fagfeltet og danner i seg selv ikke en del av den foreliggende oppfinnelsen. En fagperson vil være i stand til å anvende slike teknikker for å tilveiebringe spesifikke bindingsmedlemmer i oppfinnelsen ved å anvende rutinemetodologi i fagfeltet.
Et videre aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å skaffe tilveie et antistoffantigenbindende domene som er spesifikt for IL-13 antigen, fremgangsmåten omfatter å tilveiebringe ved hjelp av tilsetting, sletting, substitusjon eller innsetting av en eller flere aminosyrer i aminosyresekvensen til et VH domene satt frem her et VH domene som er en aminosyresekvensvariant av VH domenet, valgfritt å kombinere VH domenet som dermed tilveiebringes med ett eller flere VL domener, og å teste VH domenet eller VH/VL kombinasjonen eller kombinasjonene for å identifisere et spesifikt bindingsmedlem eller et antistoffantigenbindende domene som er spesifikt fra IL-13 antigenet og valgfritt med en eller flere foretrukne egenskaper, helst evnen til å nøytralisere IL-13 aktivitet. Nevnte VL domene kan ha en aminosyresekvens som er vesentlig som satt fram her.
En analog fremgangsmåte kan anvendes hvor en eller flere sekvensvarianter av VL domenet som er utgreiet her er kombinert med en eller flere VH domener.
I en foretrukket utførelsesform så kan BAK502G9 VH domene (SEQ ID NO: 15) utsettes for en mutasjon for å tilveiebringe en eller flere VH domene-aminosyre-sekvensvarianter, og/eller BAK502G9 VL (SEQ ID NO: 16).
Et videre aspekt i oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangmsåte for å tillage et spesifikt bindingsmedlem som er spesifikt for IL-13 antigen, hvor fremgangsmåten omfatter: (a) å tilveiebringe et startrepertoar med nukleinsyre som koder for et VH domene som enten inkluderer en CDR3 som skal erstattes eller mangler en CDR3 kodende region; (b) å kombinere nevnte repertoar med en donornukleinsyre som koder for en aminosyresekvens som vesentlig som satt frem her for et VH CDR3 slik at nevnte donornukleinsyre blir satt inn i CDR3 regionen i repertoaret, for å tilveiebringe et produktrepertoar med nukleinsyrer som koder for et VH domene; (c) å uttrykke nukleinsyrene av nevnte produktrepertoar;
(d) å velge et spesifikt bindingsmedlem som er spesifikt for IL-13; og
(e) å gjenvinne nevnte spesifikke bindingsmedlem eller nukleinsyre som koder for
det.
Igjen så kan en analog fremgangsmåte benyttes hvor et VL CDR3 i oppfinnelsen kombineres med et repertoar av nukleinsyrer som koder for et VL domene som enten inkluderer et CDR3 som skal erstattes eller mangler en CDR3 kodende region.
På samme måte så kan en eller flere eller alle tre CDR'ene settes inn i et repertoar med VH eller VL domener som så screenes for et spesifikt bindingsmedlem eller spesifikke bindingsmedlemmer som er spesifikke for IL-13.
I en foretrukket utførelsesform så kan en eller flere av BAK502G9 og CDR1 (SEQ ID NO: 7), HCDR2 (SEQ ID NO: 8) og HCDR3 (SEQ ID NO: 9), eller BAK502G9 settet med HCDR'er, benyttes og/eller en eller flere av BAK502G9 LCDR1 (SEQ ID NO: 10), LCDR2 (SEQ ID NO: 11), eller BAK502G9 settet med LCDR'er.
En vesentlig del av et immunglobulinvariabelt domene vil omfatte minst det tre CDR regionene, sammen med deres mellomliggende rammeregioner. Helst så vil delen også inkludere minst ca 50 % av en av dem eller begge av de første og fjerde rammeregjonen, de 50 % er de C-terminale 50 % av den første rammeregjonen og den N-terminale 50 % er den fjerde rammeregjonen. Tilleggsresidier ved den N-terminale eller den C-terminale enden av den vesentlige deler av det variable domenet kan være de som normalt ikke er assosiert med naturlig forekommende variable domeneregjoner. For eksempel så kan konstruksjon av spesifikke bindingsmedlemmer i den foreliggende oppfinnelsen lages ved rekombinante DNA teknikker resultere i introduksjonen av N-eller C-terminale resi di er som kodet for av linkere introdusert for å fremme kloning eller andre mani pul eringstrinn. Andre mani pul eringstrinn inkluderer introduksjonen av linkere som å kople variable domener i oppfinnelsen til videre proteinsekvenser inkludert immunglobulin tunge kjeder, andre variable domener (for eksempel i produksjonen av diastoffer) eller proteinmerkinger som diskutert i mer detalj annet sted her.
Selv om i et foretrukket aspekt av oppfinnelsen spesifikke bindingsmedlemmer som omfatter et par med VH og VL domener er foretrukket, så danner enkelbindingsdomener basert på enten VH eller VL domenesekvenser videre aspekter av oppfinnelsen. Det er kjent at enkle immunglobulindomener, spesielt VH domener, er i stand til å binde målantigener på en spesifikk måte.
I tilfelle med begge de enkle spesifikke bindingsdomenene, så kan disse domener anvendes for å screene etter komplementære domener som er i stand til å danne et to-domenespesifikt bindingsmedlem som er i stand til å binde IL-13.
Dette kan oppnås ved fagdisplay-screeningsfremgangsmåter ved å anvende den såkalte hierarki sti ske tosidige kombinatoriske tilnærmingsmåten som er utgreiet i WO92/01047, hvor en individuell koloni som inneholder enten en H eller L kjedeklon anvendes for å infisere et fullstendig bibliotek med kloner som kloner for den andre kjeden (L eller H) og det resulterende to-kjedespesifikke bindingsmedlemmet er valgt i overensstemmelse med fagdisplayteknikker slik som de som er beskrevet i den referanse. Denne teknikk er også utgreiet i Marks et al, ibid.
Spesifikke bindingsmedlemmer i den foreliggende oppfinnelsen kan videre omfatte
antistoffkonstante regioner eller deler av den. For eksempel så kan et VL domene festes ved dets C-terminalende til et antistofflettkjedekonstante domener inkludert Ck eller CX, kjeder, helst CX kjeder. På samme måte så kan et spesifikt bindingsmedlem basert på et VH domene festes ved dets C-terminale ende til hele eller del (feks. et CH1 domene) av en immunglobulintunkjede utledet fra enhver antistoffisotype, feks. IgG, IgA, IgE og IgM og enhver av isotypeunderklassene, spesielt IgGl og IgG4. IgG4 er foretrukket. IgG4 er foretrukket fordi den ikke binder komplement og ikke skaper effektorfunksjoner. Enhver syntetisk eller annen konstant regionvariant som har disse egenskaper og stabiliserer variable regioner er også foretrukket for anvendelse i utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelsen.
Spesifikke bindingsmedlemmer i oppfinnelsen kan være merket med en detekterbar eller funksjonell merking. Detekterbare merkinger inkluderer radioaktive merkinger slik som<131>I eller "Tc, som kan festes til antistoffer i oppfinnelsen ved å anvende konvensjonell kjemi kjent i fagfeltet innen antistoffbilledgjøring. Merkinger inkluderer også enzymmerkinger slik som pepperrotperoksidase. Merkinger inkluderer videre kjemiske enheter slik som biotin som kan detekteres via binding til en spesifikk beslektet detekterbar enhet, feks. merket avidin.
Spesifikke bindingsmedlemmer i den foreliggende oppfinnelsen er designet for å anvendes i fremgangsmåter for diagnose eller behandling i humane eller dyreindivider, helst humane.
Følgelig så tilveiebringer videre aspekt av oppfinnelsen fremgangsmåter for behandling som omfatter å gi et spesifikt bindingsmedlem som er tilveiebrakt, farmasøytiske sammensetninger som omfatter et slikt spesifikt bindingsmedlem, og anvendelse av slikt et spesifikt bindingsmedlem i produksjonen av medikament for administrering, for eksempel i en fremgangsmåte for å lage et medikament eller farmasøytisk sammensetning som omfatter å formulere det spesifikke bindingsmedlemmet med et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff.
Kliniske indikasjoner hvor et anti-IL-13 antistoff kan anvendes for å tilveiebringe terapeutisk fordel inkluderer astma, atopisk dermatitt, allergisk rinitt, fibrose, kronisk obstruktiv lungesykdom, inflammatoriske bowel sykdom, skleroderma og Hodgkin's lymfoma. Som allerede forklart så er anti-IL-13 behandling effektiv for alle disse sykdommer.
Anti-IL-13 behandling kan gis oralt, ved injeksjon (for eksempel subkutant, intravenøst, intraperitonealt eller intramuskulært), ved inhalering eller topikalt (for eksempel intraokkulært, intranasalt, rektalt, inni sår, på hud). Administreringsruten kan bestemmes av de fysikalskkjemiske karakteristikkene til behandlingen, ved spesielle betraktninger for sykdommen eller ved kravet for å optimalisere effekt eller å minimalisere bieffekter.
Det er medregnet at anti-IL-13 behandling ikke vil være begrenset til anvendelse i klinikker. Derfor er subkutan injeksjon ved å anvende en målfri innretning også å foretrekke.
Kombinasjonsbehandlinger kan anvendes for å tilveiebringe signifikante synergistiske effekter, spesielt kombinasjonen av et anti-IL-13 spesifikt bindingsmedlem med en eller flere andre medikamenter. Et spesifikt bindingsmedlem i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan tilveiebringes i kombinasjon eller i tillegg til kort- eller langtidsvirkende beta-agonister, kortikosteroider, kromoglykat, leukotrien (reseptor) antagonister, metylxantiner og deres derivater, IL-4 hemmere, muskarinlignende reseptorantagonister, IgE hemmere, histaminlignende hemmere, IL-5 hemmere, eotaksin/CCR3 hemmere, PDE4 hemmere, TGF-beta-antagonister, interferon-gamma, perfenidon, kjemoterapeutiske midler og immunterapeutiske midler.
Kombinasjonsbehandling med en eller flere kort- eller langtidsvirkende beta-agonister, kortikosteroider, kromoglykat, leukotrien (reseptor) antagonister, xantiner, IgE hemmere, IL-4 hemmere, IL-5 hemmere, eotaksin/CCR3 hemmere, PDE4 hemmere kan benyttes for behandling astma. Antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen kan også anvendes i kombinasjon med kortikosteroider, anti-metabolitter, antagonister av TGF-beta og dets nedstrømssignaleringsreaksjonsvei, for behandling av fibrose. Kombinasjonsterapi med disse antistoffer med PDE4 hemmere, xantiner og deres derivater, muskarinlignende reseptorantagonister, korte og lange beta-antagonister kan være nyttige for å behandle kronisk obstruktiv lungesykdom. Lignende betraktning av kombinasjoner gjelder anvendelsen av anti-IL-13 behandling for atopisk dermatitt, allergisk rinitt, kronisk obstruktiv lungesykdom, inflammatorisk bowel sykdom, skleroderma og Hodgkin's lymfoma.
I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen så kan sammensetningene som tilveiebringes administreres til individer. Adminisstrering er helst i en "terapeutisk effektiv mengde", denne er tilstrekkelig til å vise gevinst til en pasient. Slik gevinst kan være minst forbedring av minst ett symptom. Den aktuelle mengden som gjs, og hastighet og tidsforløpet for administrering, vil være avhengig av naturen og alvorligheten av det som blir behandlet. Resepten for behandling, dvs bestemmelser angående dose osv, er innen ansvarligheten for allmennpraktikere og andre medisinske doktorer. Passende doser av antistoff er velkjent i fagfeltet; se Ledermann J.A. et al.
(1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922.
Den nøyaktige dosen vil være avhengig av en rekke faktorer, inkludert om antistoffer er for diagnose eller for behandling, Størrelsen og lokalisering av området som skal behandles, den nøyaktige naturen til antistoffet (feks. hele antistoff, fragment eller diastoff), og naturen til enhver detekterbar merking eller annet molekyl som er festet til antistoffet. En typisk antistoffdose vil være i området 100 ug til 1 g for systemisk bruk, og 1 ug til 1 mg for topikal bruk. Vanligvis så vil antistoffet være et helt antistoff, helst IgG4 isotypen. Dette er en dose for en enkel behandling av en voksen pasient, som kan proporsjonalt justeres for barn og nyfødte, og også justeres for andre antistoff-formater i forhold til molekylvekt. Behandlinger kan repeteres i daglige, to ganger i uken, ukentlige eller månedlige intervaller, ved påpasselighet fra legen. I foretrukne utførelsesformer i den foreliggende oppfinnelsen så er behandling periodisk, og perioden mellom administreringene er ca to uker eller mer, helst ca tre uker eller mer, mer ønskelig ca fire uker eller mer, eller ca en gang i måneden.
Spesifikke bindingsmedlemmer i den foreliggende oppfinnelsen vil vanligvis administreres i formen av en farmasøytisk sammensetning, som kan omfatte minst en komponent i tillegg til det spesifikke bindingsmedlemmet.
Dermed så kan farmasøytiske sammensetninger ifølge den foreliggende oppfinnelsen, og få anvendelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen, omfatte, i tillegg til aktiv ingrediens, et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff, bærer, buffer, stabilisator eller andre materialer som er velkjent for fagfolk. Slike materialer bør være ikke-toksiske og bør ikke interferere med effektiviteten av den aktive ingrediensen. Den nøyaktige naturen til bæreren og annet materiale vil være avhengig av administreringsruten, som kan være oral eller ved injeksjon, feks. intravenøs.
Farmasøytiske sammensetninger for oral administrering kan være i tablett, kapsel, pulver eller flytende form. En tablett kan omfatte en fast bærer slik som gelatin eller et hjelpestoff. Flytende farmasøytiske sammensetninger omfatter generelt en flytende bærer slik som vann, petroleum, dyre eller vegetabilske oljer, mineralolje eller syntetiske olje. Fysiologisk saltløsning, dekstrose eller annen sakkaridløsning eller glykoler slik som etylenglykol, propylenglykol eller polyetylenglykol kan inkluderes.
For intravenøs injeksjon eller injeksjon på det rammede stedet, så vil den aktive ingrediensen være i formen av en parenteral akseptabel vandig løsning som er pyrogenfri og som har passende pH, isotonisitet og stabilitet. Fagfolk er i stand til å lage passende løsninger ved for eksempel å anvende isotone verktøy slik som natriuimklorid-injeksjon, Ringer's injeksjon, laktert Ringer's injeksjon. Konserveringsmidler, stabilisatorer, buffere, antioksidanter og/eller andre tilleggsstoffer kan inkluderes der det er nødvendig.
En sammensetning kan administreres alene eller i kombinasjon med andre behandlinger, enten samtidig eller sekvensielt avhengig av betingelsen som skal behandles.
Spesifikke bindingsmedlemmer i den foreliggende oppfinnelsen kan formuleres i flytende eller faste former avhengig av de fysikalskkjemiske egenskapene til molekylet og leveringsruten. Formuleringer kan inkludere hjelpestoffer, eller kombinasjoner av hjelpestoffer, for eksempel: sukkere, aminosyrer og overflateaktive stoffer. Flytende formuleringer kan inkludere et vidt område av antistoffkonsentrasj oner og pH. Faste formuleringer kan produseres ved lyofilisering, spraytørking, eller tørking ved superkritisk væsketeknologi, for eksempel. Formuleringer med anti-IL-13 vil være avhengig av den påtenkte leveringsruten: for eksempel så kan formuleringer for lungelevering bestå av partikler med fysikalske egenskaper som sikrer penetrering inn i den dype lungen ved inhalering; topikale formuleringer kan inkludere viskositets-modifiserende midler, som forlenger tiden som medikamentet forblir på virkningsstedet.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte som omfatter, forårsaker eller tillater binding av et spesifikt bindingsmedlem som tilveiebrakt her til IL-13. Som bekjent, så kan slik binding finne sted in vivo, feks. etter administrering av et spesifikt bindingsmedlem, eller nukleinsyre som koder for et spesifikt bindingsmedlem, eller den kan finne sted in vitro, for eksempel i ELISA, Western blotting, immuncytokjemi, immunpresipi sering, affinitetskromatografi eller cellebaserte analyser slik som en TF-1 analyse.
Mengden av binding av spesifikt bindingsmedlem til IL-13 kan bestemmes. Kvantitering kan relateres til mengden av antigenet i en testprøve som kan være av diagnostisk interesse.
Et kit som omfatter et spesifikt bindingsmedlem eller antistoffmolekyl ifølge ethvert aspekt eller utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen ble også tilveiebrakt som et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen. I et kit i oppfinnelsen, så kan det spesifikke bindingsmedlemmet eller antistoffmolekylet merkes for å tillate dets reaktivitet i en prøve å bli bestemt, feks. som beskrevet videre under. Komponenter i et kit er generelt sterile og i forseglede rør eller andre beholdere. Kit kan benyttes i diagnostisk analyse eller andre fremgangsmåter som antistoffmolekyler er nyttig for. Et kit kan inneholde instruksjoner for anvendelse av komponentene i en fremgangsmåte, feks. en fremgangsmåte i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen. Tilhørende materialer for å assistere i eller til å få til å utføre en slik fremgangsmåte kan inkluderes innen et kit i oppfinnelsen.
Reaktivitetene til antistoffer i en prøve kan bestemmes på enhver passende måte. Radioimmunanalyse (RIA) er en mulighet. Radioaktivt merket antigen ble blandet med umerket antigen (testprøven) og få lov til å binde seg til antistoffet. Bundet antigen blir fysisk separert fra ubundet antigen og mengden av radioaktivt antigen bundet til antistoffet bestemmes. Jo mer antigen det finnes i testprøven jo mindre radioaktivt antigen vil binde seg til antistoffet. En kompetitiv bindingsanalyse kan også anvendes ved ikke-radioaktivt antigen, ved å anvende antigen eller en analog koplet til et reportermolekyl. Reportermolekylet kan være en fluorokrom, fosfor eller laserfarge med spekter isolert absorpsjon eller emisjonskarakteristika. Passende fluorokromer inkluderer fluorescein, rodamin, fykoerytrin og Texas rødt. Passende kromogene farger inkluderer diaminobenzidin.
Andre reportere inkluderer makromolekylære kolloidale partikler eller partikulært materiale slik som latekskuler som er fargede, magnetiske eller paramagnetiske, og biologiske eller kjemisk aktive midler som kan direkte eller indirekte forårsake detekterbare signaler som kan observeres visuelt, detekteres elektronisk eller på annen måte nedtegnes. Disse molekyler kan være enzymer som katalyserer reaksjoner som utvikler eller forandrer farger eller forårsaker forandringer i elektriske egenskaper for eksempel. De kan være molekylært eksiterbare, slik at elektroniske transisjoner mellom energitilstander resulterer i karakteristiske spektrale absorpsjoner eller emisjoner. De kan inkludere kjemiske objekter anvendt sammen med biosensorer. Biotin/avidin eller biotin/treptavidin og alkalisk fosfatase-deteksjonssystemer kan benyttes.
Signalene generert ved individuelle antistoffreporterkonjugater kan anvendes for å utlede kvantifiserbare absolutte eller relative data av den relevante antistoffbindingen i prøver (normal og test).
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelsen av et spesifikt bindingsmedlem som over for å måle antigennivåer i en konkurranseanalyse, dvs en fremgangsmåte for å måle nivået av antigen i en prøve ved å benytte et spesifkt bindingsmedlem som tilveiebrakt av den foreliggende oppfinnelsen i en konkurranseanalyse. Dette kan være der hvor den fysikalske separasjonen av bundet fra ikke-bundet antigen ikke er nødvendig. Å kople et reportermolekyl til det spesifikke bindingsmedlemmet slik at en fysikalsk eller optisk forandring finner sted på binding er en mulighet. Reportermolekylet kan direkte eller indirekte generere detekterbare og helst målbare signaler. Koplingen av reportermolekyler kan være direkte eller indirekte, kovalent, feks. via en peptidbinding eller ikke-kovalent. Kopling via en peptidbinding kan være som et resultat av rekombinant ekspresjon av en genfusjon som koder for antistoff og reportermolekyl.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også for å måle nivåer av antigen direkte, ved å benytte et spesifikt bindingsmedlem i henhold til oppfinnelsen for eksempel i et biosensorsystem.
Måten for å bestemme binding er ikke et trekk i den foreliggende oppfinnelsen og fagfolk er i stand til å velge en passende måte i henhold til deres preferanse og generelle kunnskap.
Som bekjent, i forskjellige aspekt og utførelsesform, så utvider den foreliggende oppfinnelsen seg til et spesifikt bindingsmedlem som konkurrerer for binding til IL-13 med ethvert spesifikt bindingsmedlem som er definert her, feks. BAK502G9 IgG4. Konkurranse mellom bindingsmedlemmer kan lett analyseres in vitro, for eksempel ved å tagge et spesifikt reportermolekyl til ett bindingsmedlem som kan detekteres i nærværet av andre ikke-taggede bindingsmedlem eller medlemmer, for å muliggjøre identifikasjon av spesifikke bindingsmedlemmer som binder den samme epitopen eller en overlappende epitop.
Konkurranse kan bestemmes for eksempel ved å anvende ELISA hvor IL-13 blir immobilisert til en plate og et første tagget bindingsmedlem sammen med ett eller flere andre ikke-takkede bindingsmedlemmer ble tilsatt til platen. Tilstedeværelse av et ikke-tagget bindingsmedlem som konkurrerer med det taggede bindingsmedlemmet blir observert ved en nedgang i signalet emittert av det taggede bindingsmedlemmet.
For å teste for konkurranse så kan et peptidfragment av antigenet benyttes, spesielt et peptid som inkluderer en epitop av interesse. Et peptid som har epitopsekvensen pluss en eller flere aminosyrer ved den ene eller andre enden kan anvendes. Et slikt peptid kan sies å "bestå vesentlig" av den spesifiserte sekvensen. Spesifikke bindingsmedlemmer i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan være slik at deres binding for antigen er hemmet av et peptid med eller inkludert sekvensen som er gitt. For å teste for dette så kan et peptid med begge sekvensene pluss en eller flere aminosyrer anvendes.
Spesifikke bindingsmedlemmer som kan binde et spesifikt peptid kan isoleres for eksempel fra et fagdisplaybibliotek ved å klemme med pepidet eller peptidene.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre en isolert nukleinsyre som koder for et spesifikt bindingsmedlem i den foreliggende oppfinnelsen. Nukleinsyre kan inkludere DNA og/eller RNA. I et foretrukket aspekt så tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en nukleinsyre som koder for en CDR eller sett med CDR'er eller VH domene eller VL domene eller antistoffantigenbindende sete eller antistoffmolekyl, feks. scFv eller IgG4, i oppfinnelsen som definert over.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også konstruksjoner i formen av plasmider, vektorer, transkripsjon eller uttrykkskassetter som omfatter minst ett polynukleotid som over.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også en rekombinant vertcelle som omfatter en eller flere av konstruksjonene over. En nukleinsyre som koder for enhver CDR eller sett med CDR'er eller VH domene eller VL domene eller antistoffantigenbindende sete eller antistoffmolekyl, feks. scFv eller IggG4 som tilveiebrakt, danner i seg selv et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, det gjør også en fremgangsmåte for produksjon av det kodede produktet, denne fremgangsmåte omfatter uttrykk fra kodende nukleinsyre. Uttrykk kan lett oppnås ved å dyrke under passende betingelser rekombinante vertceller som inneholder nukleinsyre. Etter produksjon ved uttrykk av VH eller VL domenet, så kan et spesifikt bindingsmedlem isoleres og/eller renses ved å anvende enhver passende teknikk, og deretter anvendes som passende.
Spesifikke bindingsmedlemmer, VH og/eller VL domener, og kodende nukleinsyre-molekyler og vektorer i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan tilveiebringes isolert og/eller renset, for eksempel fra deres naturlige miljø, i vesentlig ren eller homogen form, eller i tilfellet med nukleinsyre, fri eller vesentlig fri for nukleinsyre eller gener med annen opprinnelse enn sekvensen som koder for et polypeptid med den nødvendige funksjonen. Nukleinsyre i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte DNA eller RNA og kan være helt eller delvis syntetisk. Referanse til en nukleotidsekvens som satt frem her omfatter et DNA molekyl med den spesifiserte sekvensen, og omfatter et RNA molekyl med den spesifiserte sekvensen hvor U er substituert for T, med mindre sammenheng krever noe annet.
Systemer for kloning og uttrykk av et polypeptid i en rekke forskjellige vertceller er velkjent. Passende vertceller inkluderer bakterier, pattedyrceller, planteceller, gjær- og baculovirussystemer og transgene planter og dyr. Pattedyrcellelinjer tilgjengelig i fagfeltet for uttrykk av heterologt polypeptid inkluderer kinesiske hamster ovarie (CHO) celler, HeLa-celler, babyhamsternyreceller, NSO-musemelanomaceller, YB2/0 rottemyelomaceller, humane embryone nyreceller, humane embryone retinaceller og mange andre. En vanlig foretrukket bakteriell vert er E. coli.
Uttrykket av antistoffer og antistoffragmenter i prokaryote celler slik som E. coli er godt etablert i fagfeltet. For en oversikt se for eksempel Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1992). Uttrykk i eukaryote celler i kultur er også tilgjengelig for fagfolk som et valg for produksjon av et spesifikt bindingsmedlem for eksempel Chadd HE og Chamow SM (2001) 110 Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194, Andersen DC og Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117, Larrick JW og Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 411-418.
Passende vektorer kan velges eller konstrueres, som inneholder passende regulatoriske sekvenser, inkluder promotersekvenser, terminatorsekvenser, polyadenylererings-sekvenser, enhansersekvenser, markørgener og andre sekvenser som passende. Vektorer kan være plasmider, virale feks. fag, eller fagemid ettersom det passer. For videre detaljer se for eksempel, Molecular Cloning: aLaboratory Manual: 3dje utgave, Sambrook og Russel, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Mange kjente teknikker og protokoller for å manipulere nukleinsyre, for eksempel i tillaging av nukleinsyrekonstruksjoner, mutagenese, sekvensering, introduksjon av DNA inn i celler og genekspresjon, og analyse av proteiner, er beskrevet i detalj i Current Protocols in Molecular Biology, andre utgave, Ausubel et al, utg., John Wiley & Sons, 1988, Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., utg., John Wiley & Sons, 4de utgave 1999. Utgreiingene av Sambrook et al og Ausubel et al (begge) er inkorporert her ved referanse.
Et videre aspekt av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer dermed en vertcelle som inneholder nukleinsyre som utreiet her. En slik vertcelle kan være in vitro og kan være i kultur. En slik vertcelle kan være in vivo. In vivo tilstedeværelse av vertcellen kan tillate intracellulært uttrykk av de spesifikke bindingsmedlemmene i den foreliggende oppfinnelsen som "intrastoffer" eller intracellulære antistoffer. Intrastoffer kan anvendes for genterapi [112].
Et enda videre aspekt tilveiebringer en fremgangsmåte som omfatter å introdusere slik nukleinsyre inn i en vertcelle. Introduksjonen kan benytte enhver tilgjengelig teknikk. For eukaryote celler så kan passende teknikker inkludere kalsiumfosfattransfeksjon, DEAE-dekstran, elektroporering, liposomstyrt transfeksjon og transduksjon ved å anvende retrovirus eller annen virus, feks. vaccinia eller for insektceller, baculovirus. For å introdusere nukleinsyre i vertcellen, så kan spesielt en eukaryot celle anvendes som et viralt eller et plasmidbasert system. Plasmidsystemet kan opprettholdes episomalt eller så kan det inkorporeres inn i vertcellen eller inn i et artifisielt kromosom [110, 111]. Inkorporering kan være enten ved tilfeldig eller målrettet integrering av en eller flere kopier ved et enkelt eller ved flere loki. For bakterielle celler så kan passende teknikker inkludere kalsiumkloridtransformasjon, elektroporering og transfeksjon ved å anvende bakteriofag.
Introduksjonen kan følges ved å forårsake eller tillate uttrykk fra nukleinsyren, feks. ved å dyrke vertcellene under betingelser for uttrykk av genet.
I en utførelsesform så blir nukleinsyren i oppfinnelsen integrert inn i genomet (feks. kromosom) til vertcellen. Integrering kan fremmes ved inklusjon av sekvenser som fremmer rekombinasjon med genomet, i henhold til standard teknikker.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte som omfatter å anvende en konstruksjon som nevnt over i et uttrykkssystem for å uttrykke et spesifikt bindingsmedlem eller polypeptid som over.
Aspekter og utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelsen vil nå bli illustrert ved hjelp av eksempler med referanse til den følgende eksperimenteringen.
EKSEMPEL 1
Isolering av anti- IL- 13 scFv
ScFv antist<q>ffrepertoar
Et stort enkelkjedet Fv (scFv) humant antistoffbibliotek utledet fra miltlumfocytter fra 20 donorer og klonet inn i en fagemidvektor ble anvendt for seleksjoner [66].
Seleksjon av scFv
ScFv som gjenkjenner IL-13 ble isolert fra fagdisplaybiblioteker i en rekke repterte seleksjonssykluser for rekombinant bakterielt utledet humant eller muse-IL-13 (Peprotech) vesentlig som beskrevet i [67]. I korthet så ble etter inkubering med biblioteket, det immobiliserte antigenet som på forhånd var blitt koplet til paramagnetiske kuler, og bundet fag gjenvunnet ved magnetisk separasjon mens ubundet fag ble vasket bort. Bundet fag ble så fanget som beskrevet av Vaughan et al
[67] og seleksjonsprosessen ble repetert. Forskjellige faste overflater og fangningsfremgangsmåter ble anvendt ved forskjellige runder med seleksjon for å redusere ikke-spesifikk binding. Antigen ble enten kovalent koplet til kuler (Dynabeads M-270 karboksyl syre) eller modifiserte ved biotinylering før den andre fangingen ved streptavidin-overtrukne kuler (Dynabeads M-280) i henhold til produsentens protokoller (Dynal). En representativ del av klonene fra utbytte av seleksjonsrundene ble DNA sekvensert som beskrevet i Vaughan et al [67] og Osbourn et al [70]. Unike kloner ble undersøkt for deres evne til å nøytralisere IL-13 som rensede scFv preparater i IL-13 avhengige celleprolifereringsanalyser.
Ribosom-displaybiblioteker ble laget og screenet for scFv som spesifikt gjenkjenner rekombinant, bakterielt utledet humant eller muse-IL-13 (Peprotech), vesentlig som beskrevet i Hanes et al [113]. Initielt så ble BAK278D6 ledeklonen fra de initielle seleksjonene omdannet til ribosom-displayformat, og dette templat ble deretter anvendt for bibliotekdannelse. På DNA nivået så ble en T7 promoter tilsatt til den 5' enden for effektiv transkripsjon til mRNA. På mRNA nivået så inneholdt konstruksjonen et prokaryot ribosom-bindende sete (Shine-Dalgarno sekvens). Ved den 3' enden av den enkle kjeden, så ble stoppkodonet fjernet og en del av gUI (gen Hf) ble tilsatt for å virke som et avstandsstykke [113].
Ribosom-displaybiblioteker utledet fra BAK278D6 ble dannet ved mutagenese av antistoffkomplementaritetsbestemmende regioner (CDRer) hvor PCR reaksjoner ble utført med ikke-korrekturlesende Taq polymerase. Affinitetsbaserte seleksjoner ble utført hvor, etter inkubering med biblioteket, det biotinylerte humane IL-13 ble fanget ved streptavidin-overtrukne paramagnetiske kuler (Dynal M280) og bundne tertiære komplekser (mRNA-ribosom-scFv-IL-13) ble gjenvunnet ved magnetisk separasjon mens ubundne komplekser ble vasket bort. mRNAet som kodet for de bundne scFv'ene ble så fjernet ved RT-PCR som beskrevet i Hanes et al [113] og seleksjonsprosessen ble repetert med minkende konsentrasjoner (loo nM -100 pM iløpet av 5 runder) med biotinylert humant IL-13 tilstede under seleksjonen.
Feil-"prone" PCR ble også anvendt for å videre øke biblioteksstørrelse. Tre feil intensiteter ble anvendt (2,0, 3,5 og 7,2 mutasjoner pr 1.000 bp etter en standard Per reaksjon, som beskrevet i produsentens protokoll (Clontech)) iløpet av seleksjonsregjmet. Initiell feil-prone PCR reaksjoner fant sted før runde en seleksjoner ble påbegynt ved 100 nM. En etterfølgende runde med feil-prone PCR ble utført før runde tre seleksjoner ved 10 nM biotinylert humant IL-13. Som over så ble en representativ del av klonene fra utbyttet av seleksjonsrundene DNA sekvensert som beskrevet i Vaughan et al [67] og Osbourn et al [70]. Unike kloner ble undersøkt for deres evne til å nøytralisere IL-13 som rensede scFv preparater i IL-13 avhengige celleprolifereirngsanalyser.
EKSEMPEL 2
Nøytraliseringpotens til anti- IL- 13 scFv i den IL- 13 avhengige TF- 1 celleprolifereringsanalysen
Nøytraliseirngspotensen til rensede scFv preparater mot human og muse-IL-13 bioaktivitet ble undersøkt ved å anvende TF-1 celleprolifereringsanalyse. Rensede scFv preparater ble laget som beskrevet i eksempel 3 i WO01/66754. Proteinkonsentrasjoner av rensede scFv preparater ble bestemt ved å anvende BCA fremgangsmåten (Pierce). TF-1 er en human premyeloid cellelinje etablert fra en pasient med erytroleukemi [68]. TF-1 cellelinjen er faktoravhengig for overlevelse og proliferering. Med hensyn til dette så responderte TF-1 celler på enten humant eller muse-IL-13 [69] og ble opprettholdt i medien som inneholdt humant GM-CSF (4 ng/ml, R&D Systems). Hemming av IL-13 avhengig proliferering ble bestemt ved å måle reduksjonen i inkorporering av tritiert tymidin inn i det ny syntetiserte DNA til delende celler.
TF- 1 celleanalyseprotokoll
TF-1 celle ble skaffet tilveie fra R&D Systems og opprettholdt ifølge vedlagte protokoller. Analysemdium omfattet RPMI-1640 med GLUTAMAXI (Invitrogen) som inneholdt 5 % fetalt bovint serum (JFH) og 1 % natriumpyruvat (Sigma). Før hver analyse så ble TF-1 celler pelletert ved sentrifugering med 300 x g i 5 minutter, mediet ble fjernet ved aspirering og cellene resuspendert i analysemedium. Denne prosess ble repetert to ganger med celler resuspendert til en sluttkonsentrasjon på 10<5>celler/ml i analysemedium. Testløsninger med antistoff (i triplikat) ble fortynnet til den ønskede konsentrasjonen i analysemedium. Et irrelevant antistoff ikke rettet mot IL-13 ble anvendt som en negativ kontroll. Rekombinant bakterielt utledet humant eller muse-IL-13 (Peprotech) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 50 ng/ml når den ble blandet med det passende testanti stoffet i et totalvolum på 100 ul/brønn i en 96-brønners analyseplate. Konsentrasjonen av IL-13 anvendt i anlysen ble selektert som dosen som ved sluttanalysekonsentrasjon ga ca 80 % av den maksimale proliferative responsen. Alle prøver ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. 100 ul av resuspenderte celler ble så tilsatt til hvert analysepunkt for å gi et totalt analysevolum på 200 ul/brønn. Analyseplater ble inkubert i 72 timer ved 37°C uner 5 % CO2. 25 ul tritiert tymidin (10 uCi/ml, NEN) ble så tilsatt til hvert analysepunkt og analyseplatene ble satt tilbake til inkubatoren i enda 4 timer. Celler ble høstet på glassfiberfilterplater (Perkin Eimer) ved anvende en cellehøster. Tymidin-inkorporering ble bestemt ved å anvende en Packard TopCount mikroplateflytende scintillasjonsteller. Data ble analysert ved å anvende Graphpad Prism software.
Resultater
Til tross for alternerende seleksjonssykluser mellom humant og museantigen så ble ingen kryssreaktive nøytraliserende antistoffer skaffet tilveie. To distinkte anti-humant og ett anti-muse-IL-13 nøytraliserende scFv'er ble skaffet tilveie fra seleksjoner. BAK278D6 (VH SEQ ID NO: 13; VL SEQ ID NO: 14) og BAK167A11 (VH SEQ ID NO: 23; VL SEQ ID NO: 24) gjenkjente human IL-13 menst BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26 gjenkjente muse-IL-13. BAK278D6 (figur 2) og BAK167A11 (figur 1) som scFv nøytraliserte 25 ng/ml humant IL-13 med en IC50på henholdsvis 44 nM og 111 nM. BAK209B11 (figur 3) som et scFv nøytraliserte 25 ng/ml muse-IL-13 med en IC50på 185 nM.
EKSEMPEL 3
Nøytralisasjonpotens til ledekloner fra målrettet optimalisering av tungkjede CDR3 fra parentale kloner i IL- 13 avhengig TF- 1 celleprolifereringsanalyse
Osbourn et al. [70] har vist at målrettet mutagenese av residier innen tungkjede CDR3 kan signifikant forbedre affiniteten til antistoffer. Seleksjoner ble utført som beskrevet i eksempel 1, på scFv repertoarer hvor residier innen den tunge kjede CDR3 til BAK278D6 (SEQ ID NO: 6) BAK167A11 (SEQ ID NO: 57) var blitt randomisert ved mutagenese. Unike kloner fra seleksjonsutbytte ble identifisert ved DNA sekvensering og deres nøytraliseringspotens undersøkt som scFv i TF-1 celleprolifereringsanalysen, som beskrevet i eksempel 2.
Resultater
Signifikant gevinst i potens ble oppnådd for begge linjer. De mest potente klonene fra BAK167A11 linjen var BAK615E3, BAK612B5 og BAK582F7 som hadde som scFv IC50på henholdsvis 3 nM (figur 1), 6,6 nM, 6,65 nM mot 25 ng/ml humant IL-13 i TF-1 celleprolifereringsanalyse. Fra BAK278D6 linjen så var den mest potente klonen BAK502G9, som hadde som scFv IC50på 8 nM mot 25 ng/ml humant IL-13 i TF-1 celleprolifereringsanalysen (figur 2).
EKSEMPEL 4
Nøytraliseringspotens til BAKI67All og BAK278D6 linjer mot ikke- humantprimat IL-13 og en IL- 13 variant assosiert med astma i den TF- 1 faktoravhengige celleprolifereringsanalysen
Ingen av de BAK167A11 og BAK278D6 humane IL-13 nøytraliserende linjene kryssreagerte med mus. Oppfinnerne bestemte derfor de følgende kriteriene for linjen valgt for videre optimalisering og klinisk utvikling: burde helst kryssreagere med ikke-humant primat IL-13 og bør gjenkjenne en variant av IL-13 hvor arginin ved aminosyreposisjon 130 er substituert med glutamin (Q130R). Denne variant har blitt genetisk assosiert med astma og andre allergiske sykdommer [37, 39, 41, 71]. Kryssreaktivitet ble bestemt ved evnen rensede scFv preparater har til å binde seg til ikke-humant primat IL-13 og IL-13 variant ved overflateplasmonresonans (BIAcore) analyse. Funksjonell aktivitet ble bestemt ved å anvende TF-1 celleprolifereringsanalysen.
Produksjon av villtype, variant og ikke- humant primat IL- 13
Et cDNA for villtype humant IL-13 ble skaffet tilveie fra InvivoGen og modifisert ved sete-dirigert mutagenese (Stratagene Quikchange<®>kit) for å gi et cDNA som koder for en variant IL-13. Den kodende sekvensen for både rhesus og cynomolg ape IL-13 ble skaffet tilveie ved PCR på genomisk DNA templat ved å anvende degenererte primere basert på den humane IL-13 sekvensen. Begge ikke-humane primat (rhesus og cynomolg) sekvenser var identiske til hverandre, men var forskjellig fra humant IL-13 med syv aminosyrer (figur 19). Rekombinant villtype, variant og ikke-humant primat IL-13 ble så uttrykt ved å anvende baculovirus-uttrykkssystemet (Invitrogen). Uttrykkskonstruksjoner hadde tilsatt en karboksylterminal affinitetstag til det uttrykte protein som tillot rensing fra insektcellekondisjonert medium til nær homogenitet.
Kvalitativ bindingsanalyse ved å anvende BIAcore
Bindingsaffiniteten av rensede scFv preparater til ikke-humant primat, variant og villtype IL-13 ble bestemt ved overflateplasmon-resonansmålinger ved å anvende en
BIAcore 2000 Biosensor (BIAcore AB) som beskrevet i Karlsson et al [72]. I korthet så ble IL-13 koplet til CM5 sensorchip ved å anvende et aminkoplingskit (BIAcore) ved en overflatetetthet på ca 200Ru og tre testkonsentrasjoner av scFv (ca 350 nM, 175 nM og 88 nM) i HBS-EP buffer passert over sensorchipoverflaten. De resulterende sensorgrammene ble evaluert ved å anvende BIA evaluerings 3,1 software for å tilveiebringe relative bindingsdata.
TF- 1 analyseprotokoll
Analysen ble utført essensielt som beskrevet i eksempel 2 med de følgende modifikasjonene: ikke-humant primat IL-13, human variant IL-13 (Q130R) og villtype humant IL-13 ble anvendt ved konsentrasjoner på henholdsvis 50 ng/ml, 25 ng/ml og 25 ng/ml.
Resultater
BIAcore-bindingsanalysedata tydet på at BAK278D6 men ikke BAK167A11 linjen hadde den nødvendige kryssreaktivitetsprofilen for videre terapeutisk utvikling (tabell 2). Dette funn ble støttet av bioanalysedata som viste at BAK278D6 (figur 4) og BAK501G9 (figur 6) var i stand til å nøytralisere humant IL-13, den humane IL-13
(Q130R) varianten og ikke-humant primat IL-13 i TF-1 celleprolifereringsanalysen med nær ekvivalent potens. Selv om BAK615E3 (VH SEQ ID NO: 33, VL SEQ ID NO: 34) hadde en signifikant øket potens mot humant IL-13 i forhold til dets foreldre
BAK167A11 (VH SEQ ID NO: 23; VL SEQ ID NO: 24) i den TF-1 celleprolifererende analysen (figur 1), så bandt ingen klon ikke-humant primat eller variant IL-13 i BIAcore bindingsanalysen.
" Germlining" rammeregioner tilBAK278D6 ogBAK502G9
Den utledede aminosyresekvensen til BAK278D6 VH (SEQ ID NO: 13) og VL (SEQ ID NO: 14) ble oppstillet mot kjente humane germlinesekvenser i VBASE-databasen
[73] og den nærmeste germlinen identifisert ved sekvenslikhet. Den nærmeste germlinen for VH domenet til BAK278D6 (SEQ ID NO: 149 og dets derivater, ble identifisert som DP14, et medlem av VH1 familien. BAK278D6 VH har 9 forandringer fra DPI4 germlinen innen rammeregioner. Den nærmeste germlinen til VL i BAK278D6 ble identifisert som V^3 3h. BAK278D6 VL domenet (SEQ ID NO: 14) har bare 5 forandringer fra germlinen innen rammeregioner. Rammeregioner til BAK278D6 og dets derivater ble returnert til germline ved setedirigert mutagenese (Stratagene Quikchange kit) for identisk å passe native humane antistoffer.
EKSEMPEL 5
Nøytraliseringspotens til ledekloner fra målrettet optimalisering av tungkjede CDR1 og tungkjede CDR2 sekvenser til BAK502G9 i den humane IL- 13 avhengige TF- 1 celleprolifereringsanalysen
En andre fase med optimalisering ble utført ved å anvende BAK502G9 sekvens, med rammeregioner som var blitt germline som et templat. Seleksjoner ble utført essensielt som beskrevet i eksempel 1 på scFv repertoarer hvor begge residier innen den tunge kjede CDR1 eller tunge kjede CDR2 i BAK502G9 var blitt randomisert ved mutagenese. Unike kloner fra seleksjonsutbyttet ble identifisert ved DNA sekvensering og deres nøytraliseringspotens undersøkt som rensede scFv preparater i TF-1 celleprolifereringsanalysen som beskrevet i eksempel 2. Vektorer ble konstruert for de mest potente scFv klonene for å tillate re-uttrykk som helt humant IgG4 antistoff som beskrevet av Persic et al. (1997) Gene 187; 9-18) med noen få modifikasjoner. Et oriP fragment ble inkludert i vektorene for å fasilitere anvendelsene hos HEK-EBNA 292 celler og for å tillate episomal replikering. Det VH variable domenet ble klonet inn i polylinkeren mellom sekresjonsledersekvensen og det humane gamma 4 konstante domenet i uttrykksvektoren pEU8.1(+). Det VL variable domenet ble klonet inn i polylinkeren mellom sekresjonsledersekvensen og det humane lambda-konstante domenet i ekspresjonsvektoren pEU4.1(-).
Helt antistoff ble renset fra kondisjonert medium fra EBNA-293 celler som var ko-transfektert med konstruksjoner som uttrykte tung- og lettkjeder ved hjelp av protein A affinitetskromatografi (Amersham Pharmacia). De rensede antistoffpreparasjonene ble sterilfiltrert og lagret ved 4°C i fosfatbufret saltvann (PBS) før evaluering. Proteinkonsentrasjon ble bestemt ved å måle absorbans ved 280 nM ved å anvende BCA fremgangsmåten (Pierce). Reformaterte humane IgG4 hele antistoffer ble sammenlignetmed kommersielt tilgjengelige anti-humane IL-13 antistoffer i TF-1 prolifereringsanalysen beskrevet i eksempel 2.
Resultater
Som vist i figur 5 så ble det kommersielle antistoffet B-B13, (muse IgGl -Euroclone 5) vist å være signifikant mer potent mot humant IL-13 enn det kommersielle antistoffet JES10-5A1 (rotte IgGl - Biosource) med IC50på henholdsvis 1021 pM og 471 pM. Åtte kloner, nemlig BAKI 111D10, BAKI 166G02, BAKI 167F02, BAKI 167F04, BAKI 183H4, BAKI 184C8, BAKI 185E1, BAKI 185F8, utledet fra BAK502G9 (og dermed "BAK502G9 linje"), hvor den tunge kjeden CDR1 eller CDR2 var blitt målrettet, viste forbedret potens som scFv i forhold til de kommersielle antistoffene. Disse forbedringene ble opprettholdt ved omdannelse til hele antistoffhumane IgG4. Hvert av disse VH og VL domener individuelt og i de respektive paringene av disse representerer et aspekt eller utførelsesform fra den foreliggende oppfinnelsen, det gjør også spesifikke bindingsmedlemmer for IL-13 som omfatter ett eller flere av dem, også spesifikke bindingsmedlemmer som omfatter en eller flere CDRer fra BAK502G9 linjeklonene, helst et VH domene som omfatter et BAK502G9 linjesett med HCDRer og/eller et VL domene som omfatter et BAK502G9 linjesett av LCDRer disse kan benyttes i ethvert og alle aspekt av oppfinnelsen som er utgreiet andre steder her. Derivater av BAK502G9 som hele antistoffer (IgG4) hadde en IC50i området fra 244 pM til 283 pM. BAK502G9 som et helt antistoff IgG4 hadde en IC50på 384 pM. Oppsummert så kunne store forbedringer i potens skaffes tilveie ved å målrette tungkjede CDR1 (SEQ ID NO: 7) eller CDR2 (SEQ ID NO: 8) av BAK502G9. Statistiske sammenligninger med B-B13 ble gjort ved å anvende en ANOVA etterfulgt av en Dunnetfs post testanalyse (InStat software).
Videre karakterisering
Valgte anti-humane antistoffer fra BAK278D6 linjen gjennomgikk videre karakterisering for å bestemme deres spesifisitet. Disse inkluderte BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16) og dets derivater BAKI 167F1 (VH SEQ ID NO: 35; VL SEQ ID NO: 36) og BAKI 183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38), som er representative eksempler på kloner med modifikasjoner til henholdsvis tungkjede CDR1 og tungkjede CDR2 i BAK502G9.
EKSEMPEL 6
Nøytraliseringspotens av ledekloner fra målrettet optimalisering av tungkjede CDR1 og tungkjede CDR2 sekvenser av BAK502G9 mot ikke- humant primat IL- 13 og et IL- 13 variant assosiert med astma i den TF- faktoravhengige celleprolifereringsanalysen.
Kryss-reaktivitet av anti-humane IL-13 antistoffer ble bestemt ved deres evne til å hemme ikke-humant primat IL-13 og IL-13 variantstyrt TF-1 celleproliferering som beskrevet i eksempel 4.
Resultater
Optimaliserte anti-humane IL-13 antistoffer BAKI 167F2 (VH SEQ ID NO: 35; VL SEQ ID NO: 36) og BAKI 183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38) opprettholdt spesifisiteten til deres foreldre BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16) (figur 6). Potensgevinst mot villtype IL-13 var reflektert i deres evne til å nøytralisere ikke-humant primat IL-13 og IL-13 variant med vesentlig ekvivalent potens. IC5o'en for BAK502G9 mot humant, human variant og ikke-humant primat IL-13 var henholdsvis 1,4 nM, 1,9 nM og 2,0 nM. ICso'en fra BAK1167F2 mot humant, human variant og ikke-humant primat IL-13 var henholdsvis 1,0 nM og 1,1 nM og 1,3 nM. IC5o'en fra BAKI 183H4 mot humant, human variant og ikke-humant primat IL-13 var henholdsvis 0,9 nM, 1,0 nM og 1,6 nM. Disse kloner er passende for terapeutisk anvendelse.
EKSEMPEL 7
Nøytraliseringspotens for lede- anti- humane IL- 13 antistoffer mot native humane IL- 13 i HDIM- 2 celleprolifereringsanalyse
Den humane IL-13 sekvensen har fire potensielle N-glykosyleringsseter. Oppfinnerne har demonstrert at evnen til BAK278D6 og dets derivater til å nøytralisere rekombinant IL-13 uttrykt enten i bakterielle eller baculovirus-uttrykkssystemer. Selv om det er bevis at mange prosesseringsbegjvenheter som er kjent i pattedyrsystemer også finner sted i insekter så er det nøkkelforskj eller i proteinglykosylering, spesielt N-glykosylering [74].
Oppfinnerne undersøkte evnen til BAK278D6 derivater hadde til å nøytralisere nativt IL-13 frigjort fra humane celler.
HDLM-2 celler ble isoert ved Drexler et al [75] fra en pasient med Hodgkin's sykdom. Skinnider et al [76] viste at HDLM-2 celleproliferering var delvis avhengig av autokrin og parakrin frigjøring av IL-13. Lede-anti-humane IL-13 antistoffer ble undersøkt for deres evne til å hemme HDLM-2 celleproliferering styrt av frigjøringen av nativt (eller naturlig forekommende) IL-13.
HDLM- 2 celleanalyseprotokoll
HDLM-2 celler ble skaffet tilveie fra den Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen (DSMZ) og opprettholdt ifølge medfulgte protokoller. Analysemediet omfattet RPI-1640 med Glutamax I (Invitrogen) som inneholdt 20 % fetalt bovint serum. Før hver analyse så ble cellene pelletert ved sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter, mediet ble fjernet ved aspirering og cellene ble resuspendert i friskt medium. Denne prosess ble repterert tre ganger og cellene ble til slutt resuspendert i en sluttkonsentrasjon på 2 x 10<5>celler/ml i analysemedium. 50 ul resuspenderte celler ble tilsatt til hvert analysepunkt i en 96 brønners analyseplate. Testløsninger med antistoffer (i triplikat) ble fortynnet til den ønskede konsentrasjonen i analysemedium. Et irrelevant isotype-antistoff ikke rettet mot IL-13 ble anvendt som en negativ kontroll. Det passende test-antistoffet i et totalvolum på 50 ul/brønn ble tilsatt til cellene, hvert analysepunkt ga et totalt analysevolum på 100 ul/brønn. Analyseplater ble inkubert i 72 timer ved 37°C under 5 % C02. 25 ul tritiert tymidin (10 uCi/ml, NEN) ble så tilsatt til hvert analysepunkt og analyseplater ble satt inn i inkubatoren igjen i enda 4 timer. Celler ble høstet på glassfiberfilterplater (Perkin Eimer) ved å anvende en cellehøster. Tymidininkorporering ble bestemt ved å anvende en Packard TopCount mikroplate flytende scintillasjonsteller. Data ble analysert ved å anvende Graphpad Prism software.
Resultater
Som vist i figur 7, så var BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16), og dets derivater BAKI 183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38) og BAKI 167F2 (VH SEQ ID NO: 35; VL SEQ ID NO: 36) i stand til å forårsake en doseavhengig hemming av celleproliferering med relative potenser lignende til de som ble observert i andre bioanalyser. IC50fra BAK502G9, BAKI 183H4, BAKI 167F2 som humant IgG4 var henholdsvis 4,6 nM, 3,5 nM og 1,1 nM. IC50for de kommersielle antistoffene JES10-5A2 og B-B13 var henholdsvis 10,7 nM og 16,7 nM.
EKSEMPEL 8
Nøytraliseringspotens til lede- anti- humane IL- 13 antistoffer mot IL- 13 avhengige responser i sykdomsrelevante primære celler
Sekundære bioanalyser ble utført ved å anvende primære celler og readouts som var mer relevante for luftvei ssykdom. Disse inkluderte eotaksinfrigj øring fra normale humane lungefibroblaster (NHLF) og vaskulær adhesjonsmolekyl 1 (VCAM-l) oppregulering på overflaten av humane endotelceller fra navlesnor (FfUVEC). Begge IL13 avhengige responser kunne bidra til eosinofil rekruttering, et trekk med astma-fenotyper [92].
NHLF analyseprotokoll
IL-13 har vært vist å forårsake eotaksinfirgj øring fra lungefibroblaster [77] [78] [79]. Faktoravhengig eotaksinfirgj øring fra NHLF ble bestemt ved ELISA.
NHLF ble skaffet tilveie fra Biowhittaker og opprettholdt ifølge medfulgte protokoller. Analysemediet var FGM-2 (Biowhittaker). Testløsninger med antistoff (i triplikat) ble fortynnet til den ønskede konsentrasjonen i analysemedium. Et irrelevant antistoff ikke rettet mot IL-13 ble anvendt som en negativ kontroll. Rekombinant bakterielt utledet humant IL-13 (Peprotech) ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 ng/ml og blandet med det passende test-antistoffet i et totalvolum på 200 ul. Konsentrasjonen av IL-13 anvendt i analysen ble selektert som dosen som ga ca 80 % av den maksimale responsen. Alle prøver ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Analyseprøver ble så tilsatt til NHLF som på forhånd var sådd ut ved en tetthet på 1 x IO<4>celler pr brønn i 96-brønners analyseplater. Analyseplater ble inkubert ved 37°C i 16-24 timer ved 37°C under 5 % CO2. Analyseplater ble sentrifugert ved 300 x g i 5 minutter for å pelletere løsnede celler. Eotaksinnivåer i supernatanten ble bestemt ved ELISA ved å anvende reagenser og fremgangsmåter beskrevet av produsenten (R&D Systems). Date ble analysert ved å anvende Graphpad Prism software.
Resultater
BAK278D6 linj eki oner var i stand til å hemme humant IL-13 avhengig eotaksinfrigjøring fra NHLF. Relativ potens var lik den som ble observert i TF-1 celleprolifereringsanalysen (figur 8). BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16), BAKI 183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38), BAKI 167F2 (VH SEQ ID NO: 35; VL SEQ ID NO: 36) hadde IC50på henholdsvis 207 pM, 118 pM og 69 pM mot 10 ng/ml humant IL-13. Kommersielle antistoffer JES10-5A2 og B-B13 hadde IC50på henholdsvis 623 pM og 219 pM.
HUVEC analyseprotokoll
IL-13 har vært vist å oppregulere uttrykk av VCAM-1 på celleoverflate til HUVEC [80, 81]. Faktoravhengjg VCAM-1 uttrykk ble bestemt ved deteksjon av oppregulering av VCAM-1 reseptorcellulært uttrykk ved å anvende en tidsoppløst fluorescens-gjennomlesing.
HUVEC ble skaffet tilveie fra Biowhittaker og opprettholdt i henhold til medfulgte protokoller. Analysemediet var EGM-2 (Biowhittaker). Testløsninger med antistoff (i triplikat) ble fortynnet til den ønskede konsentrasjonen i analysemedium. Et irrelevant antistoff ikke rettet mot IL-13 ble anvendt som en negativ kontroll. Rekombinant bakterielt utledet humant IL-13 (Peprotech) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 ng/ml og den ble blandet med det passende test-antistoffet i et totalvolum på 200 ul. Konsentrasjonen av IL-13 som ble anvendt i analysen var valgt som dosen som ga ca 80 % av den maksimale responsen. Alle prøver ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Analyseprøver ble så tilsatt til HUVEC som på forhånd var blitt sådd ut ved 4 x IO<4>celelr pr brønn i 96-brønners analyseplater. Analyseplater ble inkubert ved 37°C i 16-20 timer under 5 % CO2. Analysemedium ble så fjernet ved aspirering og erstattet med blokkeløsning (PBS som inneholdt 4 % tørr Marvel® melkepulver). Analyseplater ble inkubert ved romtemperatur i 1 time. Brønner ble vasket tre ganger med PBST Tween før 100 ul (1:500 fortynning i PBST/1 % Marvel<®>) med biotinylert anti-VCAM-1 antistoff (Serotec) ble tilsatt til hver brønn. Analyseplater ble inkubert ved romtemperatur i 1 time. Brønner ble vasket tre ganger med Delfia vaskebuffer (Perkin Eimer) før 100 ul Eurpium-merket streptavidin eller anti-muse IgGl (1:1000 fortynning i Delfia analysebuffer, Perkin Eimer) ble tilstt til hver brønn. Analyseplater ble så inkubert ved RT i 1 time. Brønner ble vasket 7 ganger med Delfia vaskebuffer (Perkin Eimer). Til slutt ble 100 ul av forsterkerløsning (Perkin Eimer) tilsatt til hver brønn og fluorescensintensitet ble bestemt ved å anvende Wallac 1420 VIKTOR2 plateleser (Standard Europium protokoll). Date ble analysert ved å anvende Graphpad Prism software.
Resultater
Typiske data for BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16), BAKI 183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38), BAKI 167F2 (VH SEQ ID NO: 35; VL SEQ ID NO: 36) som fullstendig antistoff humant IgG4 er vist i figur 9. Relativ potens var lik den som ble observert i TF-1 celleprolifereringsanalysen. IC50for BAK502G9, BAKI 183H4 og BAKI 167F2 var henholdsvis 235 pM, 58 pM og 55 pM mot 10 ng/ml humant IL-13.
EKSEMPEL 9
Nøytraliseringspotens for anti- IL- 13 antistoffer motIL- ip og IL- 4 avhengig VCAM- 1 oppregulering
Spesifisiteten til BAK278D6 linjen med kloner ble undersøkt i en modifikasjon av HUVEC bioanalysen. Sammen med IL-13 så er både IL-4 og IL-ip vist å oppregulere uttrykk av VCAM-1 på celleoverflate til HUVEC [80, 81].
HUVEC analyseprotokoll
Analysen ble utført essensielt som beskrevet i eksempel 5 med de følgende modifikasjonene. Rekombinant humant IL-ip og IL-4 (R&D Systems) ble anvendt i stedet for humant IL-13 ved henholdsvis 0,5 ng/ml og 1 ng/ml og representerte dosen som ga ca 80 % av den maksimale responsen.
Resultater
Ingen av klonene evaluert fra BAK278D6 linjen nøytraliserte VCAM-1 oppregulering som respons på enten human IL-ip eller IL-4 og demonstrerte dermed spesifisitet for IL-13 (figur 10). IL-4 er den som er nærmest relatert til IL-13, og deler 30 % sekvensidentitet på aminosyrenivået [82].
EKSEMPEL 10
Nøytraliseringspotens til BAK209B11 som et humant IgG4 i en muse- IL- 13 avhengig muse- B9 celleprolifereringsanalyse
BAK206B11, identifisert som en anti-muse-IL-13 nøytraliserende klon som en scFv som beskrevet i eksempel 1, ble reformatert som et helt antistoff humant IgG4 som beskrevet i eksempel 5 og dets potens evaluert i den muse-IL-13 avhengige B9 celleprolifereringsanalysen. B9 er en muse-B-celle hybridomacellelinje [83]. B9 er faktoravhengig for overlevelse og proliferering. Med hensyn til dette så responderer B-celler på muse-IL-13 og blir opprettholdt i medium som inneholder humant IL-6 (50 pg/ml, R&C Systems). Hemming av muse-IL-13 avhengig proliferering ble bestemt ve d å måle reduksjonen i inkorporering av tritiert tymidin inn i det nylig syntetiserte DNAet til delende celler.
B9 celleanalyseprotokoll
B9 celler ble skaffet tilveie fra European Collection of Animal Cell Culture ECACC og opprettholdt i henhold til medfulgte protokoller. Analysen ble utført vesentlig som beskrevet for TF-1 analysen i eksempel 2, men med de følgende modifikasjonene. Analysemediet omfattet RPMI-1640 med GLUTAMAX 1 (Invitrogen) som inneholdt 5 % fetalt bovint serum (Hyclone) og 50 uM 2-merkaptoetanol (Invitrogen). Rekominant bakterielt utledet muse-IL-13 (Peprotech) erstattet humant IL-13 med en sluttanalysekonsentrasjon på 1 ng/ml.
Resultater
BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26) som et humant IgG4 nøytraliserte 1 ng/ml muse-IL-13 med en IC50på 776 pM i B9 analysen (figur 11). BAK209B11 representerte derfor et nyttig verktøy for å undersøke rollen til IL-13 i musemodeller for sykdom. Dette demonstreres klart i eksempel 12, som viser effektiviteten til BAK209B11 i en musemodell for akutt lungeinflammasjon.
EKSEMPEL 11
Affinitetsbestemmelse av anti- IL- 13 antistoffer ved BIAcore- analyse
Affiniteten til BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16), BAKI 167F2 (VH SEQ ID NO: 35; VL SEQ ID NO: 36) og BAKI 183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38) for humant IL-13 og BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26) for muse-IL-13 som humant IgG4 ble bestemt ved overflateplasmonresonans-målinger ved å anvende en BIAcore 2000 Biosensor (BIAcore AB) vesentlig som beskrevet i [72]. I korthet så ble antistoffer koplet til CM5 sensorchip ved å anvende et aminkoplingskit (BIAcore) ved en overflatetetthet på ca 500 Ru og en seriefortynning av IL-13 (mellom 50 nM og 0,78 nM) i HBS-EP buffer passerte over sensortipoverflaten. De resulterende sensorgrammene ble evaluert ved å anvende BIA-evaluering 3,1 software for å tilveiebringe kinetiske data.
Resultater
BAK502G9, BAKI 167F2 og BAKI 183H4 i IgG4 bandt humant IL-13 med høy affinitet med Kd på henholdsvis 178 pM, 136 pM og 81 pM som korresponderte til deres relative potens i cellebaserte analyser. BAK209B11 bandt muse-IL-13 med affinitet på 5,1 nM (tabell 3).
EKSEMPEL 12
Effektiviteten til BAK209B11 i en musemodell med akutt allergisk lungeinflammasjon
Musemodell med akutt allergisk lungeinflammasjon
Effekten av BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26), et anti-muse-IL-13 nøytraliserende humant IgG4 antistoff, ble undersøkt i en musemodell med akutt allergisk lungeinflammasjon. Denne modell ble utført essensielt som beskrevet av Riffo-Vasquez et al [84] og erkarakterisert veddets endepunkt ved øket bronkial alveolærutskyllet (BAL) IL-13 (figur 12), cellulær infiltrering i lungen og BAL (figur 13), økede serum IgE nivåer og luftveishyperresponsivitet (AHR).
Modellprotokoll
Hunnlige Balb/C mus (Charles River UK) ble behandlet med enten anti-muse-IL-13 antistoff BAK209B11 (ved 12, 36, 119 eller 357 ug doser) eller et isotypetilpasset kontrollantistoff (357 ug dose). På dagene 0 og 7 så ble mus i hver gruppe sensitisert ved intraperitoneal injeksjon av 10 ug ovalbumin (Ova) i 0,2 ml av verktøyet (saltvann som inneholdt 2 % AI2O3(Rehydragel) som et hjelpestoff). En separat kontrollgruppe med ikke-sensitiserte mus mottok et likt volum av verktøyet. Mus ble utfordret med ovalbumin på dagene 14, 15 og 16. Ovalbumin ble fortynnet til 1 % (w/v) i sterilt saltvann før nebulisering. Alle inhaleringsutfordringene ble administrert i et pleksiglasseksponeringskammer. Ova ble aerosolisert ved å anvende en deVilbiss Ultraneb 2000 forstøver (Sunrise Medical) i et serie på tre eksponeringer på 20 minutter separert med 1 times intervaller.
BAK209B11 eller et irrelevant humant IgG4 ble administrert intravenøst, 1 dag før den første utfordring og deretter 2 timer før hver etterfølgende utfordring (4 doser totalt). Modellen sluttet ved dag 17, 24 timer etter siste utfordring. Blod (serum) og BAL ble samlet. Serum ble analysert fra total IgE. BAL ble skaffet tilveie ved å injisere 3 aliquoter med saltvann (0,3 ml 0,3 ml og 0,4 ml) og å slå sammen prøvene. Total leukocytt og differensielt celletall ble skaffet tilveie fra BAL celler.
Resultater
Ovalbuminutfordring av sensitiserte mus forårsaket en signifikant (p<0,05) økning i totalt BAL cellerekruttering i forhold til ikke-sensitiserte, men utfordrede mus. Denne rekruttering ble doseavhengig hemmet av BAK209B11; signifikant (p<0,05) hemming ble sett med >36 ug BAK209B11, men uten kontrollantistoff (figur 13). Lignende effekter ble også sett på eosinofiler (figur 14) og neutrofiler (figur 15) med signifikant (p<0,05) hemming av cellulær innstrømning ved en minimal BAK209B11 dose på 36 ug. Denne hemming så man ikke med kontrollantistoffet. Lymfocytter ble også indusert i sensitiserte, men ikke i ikke-sensitiserte mus ved utfordring. Denne induksjon ble doseavhengig hemmet av BAK209B11, med maksimal hemming sett med 36 ug BAK209B11. Kontrollantistoff hadde ingen effekt (figur 16). Selv om monocytt/makrofager ikke induserte i sensitiserte dyr sammenlignet med ikke-sensitiserte dyr, så var bakgrunnsnivåene satt ned ved >36 ug BAK209B11, men ikke av kontrollantistoff (figur 17). Serum IgE nivåer var signifikant øket i sensitiserte dyr sammenlignet med ikke-sensitiserte etter utfordring (p<0,05). Denne økning ble redusert etter behandling med 36 ug BAK209B11, men ikke av kontrollantistoffet.
Oppsummert så hemmet systemisk administrering av BAK209B11, en muse-IL-13 nøytraliserende antistoff, men ikke kontrollantistoff inflammatorisk celleinnstrømning og oppregul eringen av serun IgE nivåer forårsaket av sensiti sering og påfølgende utfordring med ovalbumin i en musemodell for allergisk inflammasjon.
Eksemplene 13 til 20 er profetiske.
EKSEMPEL 13
Effekten av BAK209B11 i Lloy- musemodellen for akutt lungeinflammasjon
Musemodell av akutt allergisk lungeinflammasjon
Effekten av BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26), et anti-muse-IL-13 nøytraliserende antistoff, ble undersøkt i en andre musemodell med akutt allergisk lungeinflammasjon. Denne modell ble utført essensielt som beskrevet av McMillan et al. [85] og erkarakterisert veddets endepunkt ved øket BAL og lungevev IL-13, cellulær infiltrering inn i lungen og BAL, økede serum IgE nivåer og luftveishyperresponsivitet (AHR).
Modellprotokoll
Hunnlige Balb/C mus (Charles River UK) ble administrert med forskjellige doser anti-muse-IL-13 antistoff BAK209B11 eller et isotypetilpasset kontrollantistoff som følger. På dagene 0 og 12 så ble mus i hver gruppe sensitisert (SN) ved intraperitoneal injeksjon av 10 ug ovalbumin (Ova) i 0,2 ml av verktøyet (saltvann som inneholdt 2 mg Al (OH)3som et hjelpestoff [beregnet som beskrevet i eksempel 12]). En separat kontrollgruppe med ikke-sensitiserte mus (NS) mottok et likt volum av verktøyet. Mus ble utfordret med ovalbumin i 20 minutter på dagene 19, 20, 21, 22, 23 og 24. Ovalbumin ble fortynnet til 5 % (w/v) i saltvann før forstøvningen. Alle inhaleringsutfordringene ble administrert i et pleksiglasseksponeringskammer. Ova ble aerosolisert ved å anvende en deVilbiss Ultraneb 2000 forstøver (Sunrise Medical). På dagene 18, 19, 20, 21, 22, 23 og 24 ble mus administrert med forskjellig intraperitoneale doser (237 ug, 23,7 ug eller 2,3 7ug; angitt i figurene 21 ved H, M og L) av anti-muse-IL-13 antistoff BAK209B11 mulgGI eller et isotypetilpasse kontrollantistoff (237 ug). Luftveisfunksjon ble undersøkt på dagene 0 og 25 ved økende metakolinutfordringer og målt ved å anvende bevisst pletysmografi (Buxco). PC50(konsentrasjon av metakolin som er nødvendig for å øke grunnlinje PenH med 50 %) ble estimert for individuelle mus ved både dag 0 og dag 25 fra 4 parameter løse kurvetilpassede metakolin doseresponskurver.
Modellen sluttet ved dag 25, 24 timer etter siste utfordring. Blod, serum, BAL og lungevev ble samlet.
Resultater
Lungefunksjon ble evaluert for individuelle dyr ved dag 0 (før-behandling) og vddag 25 (etter-utfordring) og ble kvantitert ved å beregne PC50verdier (konsentrasjon av metakolin som kreves for å øke grunnlinje PenH med 50 %) (figur 21 A). Et individs luftveishyperresponsivitet (AHT) ble bestemt ved forandringen i log PC50ved dag 25 mot dag 0 (log dag 25 PC50- log dag 0 PC50). Denne delta logPCsovar ved primæte endepunkter av studien; PC50data log transformerte på grunn av kravene for endepunkt ANOVA. Individuelle forandringer var gjennomsnitt innen gruppen for å generere gruppegjennomsnitt delta log PC50(som vist i figur 21B).
Ovalbuminutfordring av sensitiserte mus forårsaket en signifikant AHR sammenlignet med ikke-sensitiserte og utfordrede mus (p<0,01). BAK 209B11 forårsaket en klar og dose-avhengig nedgang i AHR mens kontrollantistoffet ikke hadde noen effekt.
EKSEMPEL 14
Effektivitet av BAK209B11 i Gerard- musemodellen for akutt lungeinflammasjon
Musemodell for akutt allergisk lungeinflammasjon
Effekten av BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26), et anti-muse-IL-13 nøytraliserende humant IgG4 antistoff, ble undersøkt i en tredje musemodell for akutt allergisk lungeinflammasjon. Denne modell ble utført essensielt som beskrevet av Humbles et al. [86] og erkarakterisert veddets endepunkt ved øket BAL og lungevevs IL-13, cellulær infiltrering inn i lungen og BAL, økede serum IgE nivåer og luftveishyperresponsivitet (AHR).
Modellprotokoll
Hunnlige Balb/C mus (Charles River UK) ble administrert med forskjellige doser anti-muse-IL-13 antistoff BAK209B11 eller et isotypetilpasset kontrollantistoff. På dagene 0, 7 og 14 ble mus i hver gruppe sensitisert (SN) ved intraperitoneal injeksjon av 10 ug ovalbumin (Ova) i 0,2 ml av verktøyet (saltvann som inneholdt 1,125 mg Al (OH)3som et hjelpestoff [beregnet som beskrevet i eksempel 12]). En separat kontrollgruppe med ikke-sensitiserte mus (NS) mottok et likt volum av verktøyet. Mus ble utfordret med ovalbumin i 20 minutter på dagene 21, 22, 23 og 24. Ovalbumin ble fortynnet til 5 %
(w/v) i saltvann før forstøvning. Alle inhaleringsutfordringene ble administrert i et pleksiglasseksponeringskammer. Ova ble aerosolisert ved å anvende en deVilbiss Ultraneb 2000 forstøver (Sunrise Medical).
Modellen sluttet ved dag 25, 24 timer etter utfordring. Blod, serum, BAL og lungevev ble samlet.
EKSEMPEL 15
Effektivitet av BAK209B11 i den Lloyd kroniske modellen for lungeinlfammasjon
Musemodell for kronisk allergisk lungeinlfammasjon
Effekten av BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26), et anti-muse-IL-13 nøytraliserende humant IgG4 antistoff, ble undersøkt i en modell for kronisk allergisk lungeinflammasjon. Denne modell ble utført vesentlig som beskrevet av Temelkovski et al. [87] og erkarakterisert veddets endepunkt ved cellulær infiltrering inn i lungen og BAL, økede serum IgE nivåer og luftvei shyperresponsi vi tet (AHR).
Modellprotokoll
Hunnlige Balb/C mus (Charles River UK) ble dosert med forskjellige doser anti-muse-IL-13 antistoff BAK209B11 eller et isotypetilpasset kontrollantistoff. På dagene 0 og 11, så ble mus i hver gruppe sensitivisert (SN) ved intraperitoneal injeksjon av 10 ug ovalbumin (Ova) i 0,2 ml av verktøyet (saltvann som inneholdt 2 mg Al (OH)3som et hjelpestoff [beregnet som beskrevet i eksempel 12]). En separat kontrollgruppe med ikke-sensitiserte mus (NS) mottok et likt volum av verktøyet. Mus ble utfordret med ovalbumin i 20 minutter på dagene 18, 19, 20, 21, 22, 23, 28, 30, 32, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 49 og 51. Ovalbumin ble fortynnet til 5 % (w/v) i saltvann før forstøvning. Alle inhaleringsutfordringer ble administrert i et pleksiglasseksponeringskammer. Ova ble aerosolisert ved å anvende en deVilbiss Utraneb 2000 forstøver (Sunrise medical).
Modellen sluttet ved dag 52, 24 timer etter utfordring. Blod, serum, BAL og lungevev ble samlet.
EKSEMPEL 16
Effektivitet av anti- humane IL- 13 antistoffer mot eksogent humant IL- 13 gitt til muse-luftlommemodellen
Effekten av anti-humane IL-13 antistoffer på den pro-inflammatoriske virkningen til humant IL-13 ble undersøkt i en basal musemodell. Denne modell ble utført vesentlig som beskrevet av Edwards et al [93] og blekarakterisert veddets endepunkt ved cellulær infiltrering inn i luftlommen.
Modellprotokoll
En luftlomme ble skapt på ryggen til hunnlige Balb/C mus ved subkutan injeksjon av 2,5 ml steril luft ved dag 0. Luftlommen ble reoppblåst med en annen 2,5 ml steril luft ved dag 3. 2 ug huIL-13 i 0,75 % CMC ble injisert direkte inn i lungen ved dag 6. 24 timer senere ble musene drept og luftlommen ble skyllet med 1 ml heparinisert saltvann. Antistoffbehandlinger ble enten gitt med huIL-13 (inn i lommen) eller gitt systemisk.
Resultater
Humant IL-13, injisert inn i luftlommen (i.po.), forårsaket en signifikant øket infiltrering av totale leukocytter (p<0,01) og eosinofiler (p<0,01) ved 24 timer etter utfordring i forhold til verktøy (0,75 % karboksymetylcellulose (CMC) i saltvann i.po.) behandlede mus.
Lokalt administrert BAK502G9 (200 mg, 20 mg eller 2 mg inn i lommen) hemmet signifikant og doseavhengig den totale leukocytt (p<0,01) og eosinofil (p<0,01) infiltreringen inn i luftlommen forårsaket av 2 ug huIL-13 i 0,75 % CMC.
Systemisk administrering av BAK209B11 (30 mg/kg, 10 mg/kg og 1 mg/kg) hemmet også signifikant og doseavhengig den totale leukocytt (p<0,01) og eosinofile (p<0,01) infiltrering inn i luftlommen forårsaket av 2 ug huIL-13 i 0,75 % CMC.
EKSEMPEL 17
Generering av humane IL- 13 knock- in/ muse- IL- 13 knock out transgene mus for formålene med å evaluere effektiviteten av anti- humane IL- 13 antistoffer i modeller med lungeallergisk inflammasjon
De foreliggende oppfinnerne har generert mus som uttrykker humant i steden for muse-IL-13 ved genmålretting. Muse-IL-13 genet er blitt erstattet fra start til stoppkodon med den relevante delen av det human IL-13 genet. Denne musestamme uttrykker humant IL-13, heller enn muse-IL-13, som respons på den samme stimulien som vill-type mus, ettersom den endogene IL-13 promoteren og IL-13 pA halen forble uforandret. Dethar vært vist at humant IL-13 kan binde seg til å signalere gjennom muse-IL-13 reseptorer for å generere de samme fysiologiske konsekvensene som signalering forårsaket ved muse-IL-13 ligerte muse-IL-13 reseptorer. For eksempel så forårsaket eksogent humant IL-13 inflammatorisk cellerekruttering inn i muse-luftlommen (figur 18). Disse transgene mus tillater oss å evaluere ikke-mus kryssreaktive anti-humane IL-13 antistoffer i å etablere musemodeller for sykdom.
Denne mus er blitt anvendt i de akutte allergiske luftveisinflammasjonsmodellene (som beskrevet i eksemplene 18 og 19) og kroniske allergiske luftveisinflammasjonsmodeller (som beskrevet i eksempel 20) og tillater evalueringen av anti-humane IL-13 antistoff-farmakologi i allergisk luftvei ssykdom.
EKSEMPEL 18
Effektivitet av anti- humane IL- 13 antistoffer i den huIL- 13 transgene Lloyd musemodellen for akutt lungeinlfammasjon
Musemodell for akutt allergisk lungeinlfammasjon
Effekten av anti-humane IL-13 nøytraliserende humane IgG4 antistoffer ble undersøkt i en musemodell for akutt allergisk lungeinflammasjon ved å anvende de transgene mus som ble laget i eksempel 17. Denne modelle ble utført essensielt som beskrevet av McMillan et al. [85] og eksempel 13. Modellen blekarakterisert veddets endepunkt ved øket BAL og lungevevs IL-13, cellulær infiltrasjon inn i lungen og BAL, økede serum IgE nivåer og luftveishyperresponsivitet (AHR).
Modellprotokoll
Protokollen for denne modell var som beskrevet i eksempel 13 unntatt at anti-humane IL-13 antistoffer ble dosert i steden for BAK209B11.
EKSEMPEL 19
Effektivitet av anti- humane IL- 13 antistoffer i den huIL- 13 transgene Gerard musemodellen for akutt lungeinlfammasjon
Musemodell for akutt allergisk lungeinlfammasjon
Effekten av anti-humane IL-13 nøytraliserende humane IgG4 antistoffer ble undersøkt i en annen musemodell for akutt allergisk lungeinflammasjon ved å anvende den transgene musen som ble dannet i eksempel 17. Denne modell ble utført vesentlig som beskrevet av Humbles et al, [86] og i eksempel 14. Modellen erkarakterisert veddets endepunkt ved øket BAL og lungevev IL-13, cellulær infiltrering inn i lungen og BAL, økede serum IgE nivåer og luftvei shyperresponsi vitet (AHR).
Modellprotokoll
Protokollen for denne modell var som beskrevet i eksempel 14 unntatt fra at anti-humane IL-13 antistoffer ble dosert i steden for BAK209B11.
EKSEMPEL 20
Effektivitet av anti- humane IL- 13 antistoffer i den huIL- 13 transgene Lloyd kroniske modellen for lungeinflammasjon
Effekten av anti-humane IL-13 nøytraliserende humane IgG4 antistoffer ble undersøkt i en modell for kronisk allergisk lungeinflammasjon ved å anvende de transgene musene som ble laget i eksempel 17. Denne modell ble utført vesentlig som beskrevet av Temelovski et al. [87] og i eksempel 15 og erkarakterisert veddets endepunkt ved cellulær infiltrering inn i lungen og BAL, økede serum IgE nivåer og luftvei shyperresponi si vtet (AHR).
Modellprotokoll
Protokollen for denne modell var som beskrevet i eksempel 15 unntatt for at anti-humane IL-13 antistoffer ble dosert i steden for BAK209B11.
EKSEMPEL 21
Farmakokinetikk og farmakodynamikk for anti- humane IL- 13 antistoffer i Ascaris. suum- allergiske cynomolge aper.
Farmakokinetikker og farmakodynamikker til 502G9 ble evaluert i 4 allergiske, men ikke-utfordrede cynomolge primater (2 hannlige/2 hunnlige) etter en enkel 10 mg/kg i.v. bolusdose. Eksperimentet kjørte i 29 dager. Antistoffets farmakinetiske parametere ble bestemt fra en geogjennomsnittlig gjennomsnitts serummedikamentkonsentrasjonskurve og er gitt i dealjer under i tabell 4.
I den samme studien ble serum IgE konsentrasjoner også fulgt ved å anvende et humant IgE ELISA kit (Bethyl laboratories, USA).
Resultater
Serum IgE konsentrasjoner var signifikant redusert etter en enkel 10 mg/kg i.v. bolusdose av BAK502G9, fra 100 % kontrollnivåer (predose) til 66 ± 10 % av kontroll verdi er (p<0,05), ved 4 og 5 dager etter dosering. Denne nedgang i serum IgE konsentrasjon gjkk opp igjen til 88 ± 8 % av kontrollnivåer ved dag 22 (se figur 20). Igjen så ble disse dataene utledet ved å normalisere hvert dyrs serum IgE konsentrasjon til predosenivåer, hvor predosekonsentrasjoner var 100 %, og deretter lage gjennomsnittlige kurver fra de 4 dyrene som ble testet.
De to hannlige apekattene hadde relativt lave predose totalt serum IgE (60 ng/mL og 67 ng/mL). Disse IgE nivåene forandrer seg ikke på en måte som tydet på en trend etter behandling med BAK502G9 (figur 20B). De to hunnlige apekattene hadde relativt høyt predose totalt serum IgE (1209 ng/mL og 449 ng/mL). Disse IgE nivåene ble redusert etter behandling med BAK502G9, maksimalt med 60 % ved 7 dager, og returnerte til ca predosenivåer ved 28 dager etter administrering (figur 20B). Disse data tilveiebringer indikasjon om at BAK502G9 senker serum IgE konsentrasjoner i dyr med relativt høyt sirkulerende IgE av IgE.
EKSEMPEL 22
Effektivitet av anti- humane IL- 13 antistoffer i cynomolge modeller for hudallergi
Effektene av anti-humane IL-13nøytraliserende humane IgG4 antistoffer ble undersøkt i en primat modell for akutt allergisk hudinflammasjon. Denne modelle ble utført ved å injisere humant IL-13 og A. suum antigen intradermalt inn i cynomolge aper. 24-96 timer senere ble dermale biopsier og serumprøver tatt. Modellen varkarakterisert veddets endepunkt ved cellulær infiltrering inn i huden.
EKSEMPEL 23
Effektivitet av anti- humane IL- 13 antistoffer i cynomolge modeller for lungeallergi
Effekten av anti-humane IL-13 nøytraliserende humane IgG4 antistoffer ble undersøkt i en primatmodell for akutt allergisk lungeinflammasjon. Denne modell ble utført ved å eksponere asuum allergiske cynomolge primater for forstøvet asuum antigen, og dermed generere en allergisk reaksjon. Denne allergi blekarakterisert veddets endepunkt ved cellulær infiltrasjon inn i lungen og BAL, økede serum IgE nivåer og luftvei shyperresponsi vitet.
Farmakodynamikker ble i tillegg evaluert ex vivo ved å anvende en flow-sytometrisk fremgangsmåte. CD23 er høyaffinitets IgE reseptoren og kan uttrykkes på perifere humane blodmononukleære celler. CD23 uttrykk kan induseres, med hensyn til antallet celler som uttrykker CD23 og også i hvor mye CD23 hver celle uttrykker ved både IL-13 og IL-4. IL-13, men ikke IL-4 styrt respons kan hemmes ved anti-humane IL-13 antistoffer.
Dyrene var på forhånd selektert for å få være med i denne 2-fasestudien på basisien av tidligere etablerte AHR etter forstøvingsantigen ( ascaris suum ekstrakt) utfordring. I fase I ble luftveisfunksj on undersøkt i løpet av intravenøs histaminutfordring på dagene 1 og 11. PC30, histamindosen som er nødvendig for å generere en 30 % økning i lungeresistens (Rl) over grunnlinje, ble bestemt fra hver histamindose-responskurve. På dagene 9 og 10, ble dyr utfordret med individuelle skreddersydde doser av forstøvet antigen som tidligere var vist å generere en 40 % økning i RLsåvel som en 35 % nedgang i dynamisk oppfyllelse (Cdyn)-Historisk så var i denne modell en større Rlblitt observert etter den andre utfordring med en gitt allergen dose enn den første; dette er antigenpriming. De to antigenutfordringene forårsaket AHR, som målt ved et øket areal under histomaindose-responskurven og/eller et fall i PC30, og BAL, såvel som eosinofilia ved dag 11 sammenlignet med dag 1. Dyr som viste en AHR-fenotype ble selektert til å være med i fase II.
Fase II ble kjørt nøyaktig som fase I unntatt for at alle dyr mottok en 30 mg/kg BAK502G9 infusjon på dagene 1, 5 og 9. Effektene av BAK502G9 ble undersøkt ved å sammenligne forandringene som ble sett i fase II med forandringer sett i fase I for individuelle dyr.
Blod, serum, BAL og lungevev ble samlet. Serum IgE nivåer ble målt med ELISA. Serum fra BAK502G9 behandlede cynomolge aper ble vist å hemme uttrykket av CD23 på humane perifere blodmononukleære celler indusert ved IL-13, men ikke IL-4. Magnituden av denne hemming var i overensstemmelse med serum BAK502G9 nivåene forutsatt av PK ELISA.
Resultater
BAK502G9 hemmet signifikant AHR målt ved RLAUC (p<0,05) (figur 26A, tabell 7). En hemmende effekt av BAK502G9 på AHR, som målt ved PC30, ble observert, men nådde ikke statistisk signifikans (figur 26B; tabell 7). BAK502G9 hemmet også signifikant både antigenpriming (p<0,01) (figur 26C; tabell 7) og BAL inflammasjon. BAK502G9 hemmet signifikant total celle (p<0,05) og eosinofil (p<0,05) men ikke makrofag, lymfocytt eller mast celleinnstrømning inn i BAL (figur 26D; tabell 7).
EKSEMPEL 24
Effektivitet av anti- humane IL- 13 antistoffer mot den astmatiske fenotypen som utvikles når humant IL- 13 ble gitt til muselungen
Musemodellfor luftveishyperresponsivitet
Effektiviteten til det anti-humane IL-13 nøytraliserende antistoffet BAK502G9, mot utviklingen av luftveishyperresponsivitet (AHR) etter administrering av humant IL-13 til muselungen ble undersøkt. Denne modelle ble utført vesentlig som beskrevet av Yang et al [119] med unntaket av at humant IL-13 ble anvendt i steden for muse-IL-13.
Modellprotokoll
For å utvikle fenotypen, så ble hannlige Balb/C mus eksponert for to doser med humant IL-13 separert med et 48-timers intervall. I korthet så ble mus bedøvet med en intravenøs injeksjon av 1100 ul saffan løsning (1:4 fortynnet i vann). Mus ble intubert med en 22-gauge kateternål, som humant rekombinant IL-13 (25 ug løst i 20 ul fosfatbufret saltvann (PBS)) eller verktøykontroll (PBS) ble dryppet inn igjennom. Luftveisfunksjon ble undersøkt 24 timer etter den siste administreringen av IL-13 ved økede metakolinutfordringer og målt ved å anvende bevisst pletysmografi (Buxco). PC200(konsentrasjon av metakolin som er nødvendig for å øke grunnlinje penH med 200 %) ble bestemt fra 4 parameter ikke-fiksert kurvetilpassing av metakolin-doseresponskurver. Antistoffbehandlinger ble gitt ved intraperitoneal injeksjon 24 timer før hver dose av IL-13.
Resultater
Intratrakeal installasjon av humant IL-13 inn i naive vill-type mus resulterte i utvikling av signifikant (p<0,05) luftveishyperresponsivitet i forhold til kontrolldyr som bestemt ved PC200metakolinkonsentrasjoner. Systemisk administrrert BAK502G9 (lmg/kg) hemmet signifikant (p<0,01) utviklingen av AHR mens null kontrollantistoffet hadde ingen effekt (figur 23).
EKSEMPEL 25
Nøytraliseringspotens av BAK502G9 som et humant IgG4 mot humant IL- 13 avhengig IgE frigjøring fra humane B- celler
B- celleswitching analyseporotkoll
IL-13 har vært vist å indusere IgE syntese i humane B-celler in vitro [120]. Faktoravhengig IgE frigjøring fra humane B-celler ble bestemt ved ELISA. Nøytraliseringspotensen til BAK502G9 som et humant IgG4 ble undersøkt mot humant IL-13 avhengig IgE frigjøring fra humane B-celler.
Perifere blodmononukleære celler (PBMC) ble renset fra human buffy coat (Blood Transfusion Service) ved sentrifugering gjennom en 1,077 g/l tetthetsgradient. B-celler ble renset fra PBMC med et B-celleisoleringskit II (Miltenyi Biotec), ved å anvende reagenser og fremgangsmåter beskrevet av produsenten. Analysemedium omfattet Iscoves-modifiserte Dulbecco's-medium (Life Technologies) som inneholdt 10 % fetalt bovinserum og 20 ug/ml humant transferrin (Serologicals Proteins Inc). Etter rensing så ble B-celler resuspendert til en sluttkonsentrasjon på 10<6>/ml i analysemedium. 50 ul resuspenderte celler ble tilsatt til hvert analysepunkt i en 96 brønners analyseplate. 50 ul av 4 ug/ml av anti-CD40 antistoffet EA5 (Biosource) ble tilsatt til analysebrønnene ettersom det passet. Testløsninger av antistoffer (seks replikater) ble fortynnet til den ønskede konsentrasjonen i analysemedium. Et irrelevant antistoff som ikke var rettet mot IL-13 ble anvendt som en negativ kontroll. 50 ul/brønn av det passende test-antistoffet ble tilsatt til cellene. Rekombinant bakterielt utledet humant IL-13 (Peprotech) ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 30 ng/ml for å gi et totalt analysevolum på 200 ul/brønn. Konsentrasjonen av IL-13 anvendt i analysen ble valgt for å gi en maksimal respons. Analyseplater ble inkubert i 14 dager ved 37°C under 5 % CO2. IgE nivåer i supernatanten ble bestemt ved ELISA ved å anvende reagenser og protokoller levert av produsenten BD Biosciences, Bethyl Laboratories). Data ble analysert ved å anvende Graphpad prism software.
Resultater
Som vist i figur 24 så var BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16) i stand til å hemme human IL-13 avhengig IgE produksjon av humane B-celler. BAK502G9 som humant IgG4 hadde en IC50på 1,8 nM mot 30 ng/ml humant IL-13.
EKSEMPEL 26
Effekten av av BAK502G9 mot IL- 13 styrt potensiering av histaminindusert Ca<2+>signalering i primære humane bronkiale glatte muskelceller
IL-13 har vært vist å direkte modulere kontraktiliteten til glattmuskel i luftveier [121, 122]. Intracellulær kalsiummobilisering er en nødvendighet for sammentrekning av glatt muskel. Nylige studier har vist at IL-13's evne til å forandre kontraktiliteten til glattmuskel er styrt delvis gjennom modulering av kontraktil agonistindusert Ca<2+>signalering [123, 124]. Effekten av BAK502G9, et anti-humant IL-13 antistoff formatert som et IgG4, mot IL-13 styrte forandringer i måling av fasongforandring. Prøver ble tatt ved høystrømningshastighet og tilgang ble terminert etter 1000 eosinofile begivenheter eller 1 minutt, hvilket enn var det tidligste. Fasongforandring ble beregnet som en prosent FSC forårsaket av fasongforandring buffer alene (100 % blank fasongforandring). Data er blitt uttrykt som gjennomsnittet % blank fasongforandring + SEM fra 4 separate eksperimenter. Hvert eksperiment anvendte celler fra en individuell buffycoat (og dermed individuell donor), utført i duplikat for hvert punkt.
Resultater
NHLF-celler samtidig stimulert med 9,6 nM IL-13, 285,7 pM TNF- a og 160 pM TGF-Pl og dyrket i 48 timer utskilte 9,6 nM eotaksin-1 inn i dyrkningsmediet. I motsetning til dette så utskilte NHLF-celler som var dyrket kun med opprettholdelsesmedium 0,1 nM eotaksin-1 inn i dyrkningsmediet. Denne eotaksin-1 produksjon var IL-13 avhengig ettersom IL-13/TNF-a/TGF-pi samtidig stimulerte NHLF-cellers produksjon av eotaksin-1 var doseavhengig hemmet av BAK502G9 med en IC50på 32,4 nM (figur 29A).
Den primære hensikten av denne del av studien var å undersøke eosinofil fasongforandring. Størrelsen på eosinofil fasongforandring som respons på 3 nM eotaksin (positiv kontroll) var 122,2+2,1 % n=4). Eotaksin-1 indusert fasongforandring var fullstendig hemmet ved 100 nM av et anti-eotaksin antistoff CAT-213, gjennomsnittlig fasongforandring 101,0±1,0 % (n=4).
Medium fra NHLF-celler ko-stimulert med 9,6 nM IL-13, 285,7 pM TNF-a og 160 pM TGF-pi og dyrket i 48 timer (kondisjonert medium), induserte en klar eosinofil fasongforandring (figur 29B). I motsetning til dette så induserte medium fra NHLF dyrket i 48 timer i NHLF opprettholdelsesmedium alene ikke eosinofil fasongforandring (figur 29B).
Tilsetning av anti-IL-13 antistoff BAK502G9 til samtidig stimulert medium før NHLF dyrking, resulterte i en doseavhengig henning av eosinofil fasongforandring, med en geometrisk gjennomsnittlig IC50på 16,8 nM når det ble undersøkt ved 1:16 fortynning (figur 29B).
Evnene til stimulanter (TL-13, TNF-a og TGF-pi) som ikke ble dyrket med NHLF-celler til å indusere eosinofil og neutrofil fasonforandring ble også undersøkt. 9,6 nM IL-13, 285,7 pM TNF-a og 160 pM TGF-01 induserte ikke en klar eosinofil fasongforandring. Dette tyder på at den eosinofile fasongforandringsevnen til kondisjonert medium som utvikles i løpet av NHLF-celledyrkning med stimulantene ikke skyldes noen av stimulantene alene eller i kombinasjon (figur 29B).
EKSEMPEL 29
Kartlegging av anti- IL- 13 antistoffer på humant IL- 13
Epitopkartleggingen av et representativt IL-13 antistoff BAK502G9 ble utført ved å anvende en molekylær tilnærmingsmåte og standard peptidfjerning.
Molekylær tilnærming
IL-13 kimærer ble konstruert, hvor deler av den humane IL-13 sekvensen ble erstattet med muse-sekvens. Disse kimærene ble anvendt i bindingsstudier med representative IL-13 antistoffer for å hjelpe til med å identifisere den spesifikke epitopen.
To paneler med IL-13 kimærer ble produsert. Det første panelet inneholdt ni kimærer (figur 30) og ble anvendt for å lokalisere den generelle posisjonen til epitopet. Det andre panelet inneholdt ti kimærer (figur 31) og ble anvendt for å finkartlegge epitopen.
De kimære IL-13 sekvensene ble sammenstillet ved å anvende PCR og klonet inn i Gateway<®>inngangsvektor, som så ble rekombinert med en destinasjonsvektor pDEST8 (modifisert til å kode for en deteksjons- og affinitetstag i den C-terminale enden av det rekombinante proteinet). Disse ekspresjonsvektorene ble anvendt for å transformere DHlOBac™ kjemisk kompetente E. coli som tillot sete-spesifikk transposisjon av tagget kimært IL-13, inn i baculovirus shuttle-vektoren (bacmid). Rekombinant bacmid DNA ble isolert for hver IL-13 kimær og transfektert inn i SJ9 ( Spodoptera frugiperda) insektceller ved å anvende Cellfectin<®>reagens. Rekombinert baculovirus ble høstet 72 timer etter transfeksjon og passerte gjennom Sp insektceller to ganger til.
Insekt 2000-500 ml kultur-supernatant ble renset på en affinitetskolonne og eluert materiale ble konsentrert fra 16 til 1 ml ogladetpå en størrelseseksklusjons Superdex 200 HR10/300GL kolonne for sluttrensing og bufferutbytte.
En homogen konkurranseanalyse som anvendte biotinylert humant IL-13, streptavidin-antofyocynat og Europium-merket BAK502G9 ble utviklet. Analysen er som følger: Eu-BAK502G9 binder biotinyletr-humant IL-13, komplekset ble så gjenkjent ved streptavidin APC konjugatet og når et lysglimt benyttes så blir energien overført fra APC-merkingen til Europiumet ved umiddelbar nærhet, og tidsoppløst fluorescens kan måles. Konkurranse for denne binding blir introdusert ved hjelp av umerket humant IL-13 (som kontroll) og de kimære konstruksjonene. Denne konkurranse kvantifiseres for å beregne de relative affinitetene til de IL-13 mutantene for IL-13 antistoffer og muliggjør mutasjoner som forandrer binding som skal identifiseres.
Resultater
Kimær konstruksjon IL-13-Helix D (tabell 5) ble funnet å være den svakeste kompetitoren mot biotinylert humant IL-13 for binding av BAK502G9, noe som indikerte at helixD innen IL-13 molekylet var involvert i BAK502G9 epitopbinding (tabell 5). Redusert aktivitet ble også sett med 4041 og 3334 mutantene hvor henholdsvis residiene 40, 41 og 33, 34 til foreldresekvensen var forandret, noe som indikerte potensiell involvering av helixA i gjenkjenningen av BAK502G9. De reduserte aktivitetene til sløyfe3 ble sett bort fra ettersom denne sløyfe hadde et redusert antall aminosyrer i mutanten sammenlignet med det humane molekylet og sannsynligvis forandrer den totale strukturen av proteinet. Andre reduksjoner i evnen til de kimære IL-13 molekylene å konkurreremed BAK502G9 binding ble ikke betraktet signifikant for
slike aminosyreforandringer.
Et mer målrettet sett med mutasjoner innen helix D (figur 26) ble så testet. Resultater skaffet tilveie er vist i tabell 6 og er som følger: Resultater viser at kimære konstruksjoner 116117TK 8hvor lysin vd posisjon 116 var erstattet med treonin og aspartatet ved posisjon 117 var estattet med lysin), 123KA (hvor lysin ved posisjon 123 var erstattet) og 127RA (hvor arginin ved posisjon 127 var erstattet) var minst i stand til å konkurrere for binding til BAK502G (123KA og 127RA konkurrerte ikke ved 1 uM). Andre residier som var implisert i binding til BAK502G9 på grunn av deres reduserte effektivitet i konkurranseanalysen inkluderer helixD residiene 124Q (hvor lysin er blitt erstattet med glutamin) og 120121 SY (et leucin histidin-par er blitt forandret til et serin tyrosin-par). Mutasjoner av leucin ved posisjon 58L reduserer også binding og analyse av den 3-dimensjonale strukturen avslørt at dette residiet pakker seg mot helixD og kan enten direkte kontaktes av BAK502G9 elelr påvirke oppstillingen av helixD.
Disse eksperimentene viser at residier innen helixD er kritisk for bindingen av BAK509G9 til IL-13. Spesielt lysinet ved posisjon 123 og argjnitet ved posisjon 127 er kritisk for denne binding ettersom mutasjon av begge ødelegger binding til BAK502G9.
Epitopfferning
Epitopkartleggingen av BAK502G9 ble også utført ved å anvende standard peptidfjerningsprosedyren. Her blir IgG immobilisert på fast fase og tillater fangjng av IL-13 liganden. Det dannede komplekset ble så utført for å spesifikt proteolyttisk kutting, i løpet av dette så vil tilgjengelige peptidbindinger kløyves, imidlertid vil de som er beskyttet av IgG: ligand-interfasen forbli intakte. Et peptid som inneholder epitopen forblir dermed bundet til IgG. Dette kan så avgis, samles og identifiseres ved massespektrometri (ms).
To komplementære teknikker blir anvendt, den første gjør bruk av Ciphergen ProteinChip Reader MALDI-TOF massespektrometeret, hvor det var mulig å kovalent kople IgG til en massespektrometerchip og deretter utføre kuttingen og ekstraksjonen in situ. Den andre teknikken anvendte biotinylert BAK502G9 koplet til streptavidin-oveitrukne kuler og tillot samlingen av tilstrekkelig peptid for sekvensbekreftelse ved tandem massespektrometri (ms/ms).
Selv om de to prosedyrene er forskjellig i absolutt detalj og skala så involverte de essensielt de samme trinnene, kopling av IgG, blokkering av ureagerte bindingsseter, vasking, ligandfanging, fjerning av ubundet ligand, kutting og et siste vasketrinn.
MALDI-TOF ms tilnærmingsmåten gjorde bruk av eiendoms ms chips som var aktivert med karonyldiimdazol som kovalt binder til frie primære amingrupper som IgG ved 1-2 mg/ml i PBS ble koplet til over natt ved 4°C. Chipen ble deretter blokkert med en etanolaminløsning ved romtemperatur i 1 time og deretter vasket nøye med PBS eller HBS pluss en passende detergent. En en picomol aliquot av IL-13 ble så brukt på chipen i enten PBS eller HBS og fikk lov til å binde seg til det kjemisk-immobiliserte IgG i 2 timer ved romtemperatur. Dette ble fulgt av videre vasker i PBS eller HBS med eller uten detergent for å fjerne ethvert ikke-spesifikt bundet IL-13. En løsning med trypsin i området fra 200 til 3,1 ug/ml i PBS eller HBS ble så benyttet for IgG: ligandkomplekset og kutting fikk lov til å fortsette i 30 minutter ved romtemperatur, hvoretter chipen ble vasket i PBS eller HBS pluss detergent, PBS eller HBS og til slutt vann. Etter anvendelse av en passende MALDI-TOF ms matriks ble chipen så plassert direkte i massespektrometeret og analysert.
Den kulebaserte tilnærmingsmåten startet med biotinyleringen av IgG, ved å anvende en NHS biotinforbindelse, ved et molart forhold på 1 IgG til 4 biotinmolekyler. Fjerning av ikke-bundet biotin og biproduktene fra reaksjonen ved å anvende gelfiltrering etterfulgte dette. Det biotinylerte IgG fikk så binde seg til neutravidin-overtrukne agarosekuler, hvor det ble forsøkt å maksimalisere IgG fangingen. Aliquoter av IgG overtrukne kuler ble så fordelt i en konsentrator-spinnkolonne og vasket med Dulbecco's PBS + 0,05 % Tween 20 etterfulgt av resuspensjon i Dulbecco's PBS + 0,05 % Tween 20. En puls med IL-13 ble så påført til de resuspenderte IgG kulene og binding fikk lov til å skje i 10 minutter hvoretter den flytende fasen ble fjernet ved sentrifugering og kulene ble vasket med Dulbecco's PBS + 0,05 % Tween 20 etterfulgt av resuspensjon i Dulbecc's PBS + 0,05 % Tween 20.
Kule: IgG: ligandkomplekset ble så utsatt for proteolyse med enten trypsin eller kymotrypsin med inkubert ved romtemperatur eller 37°C. Deretter ble kulene igjen vasket i Dulbecco's PBS + 0,05 % Tween 20 etterfulgt av en videre vask i Dulbecco's PBS uten detergent. Kulene ble så resuspendert i vann, acetonitril, trifluoreddik-syreblanding og supernatanten ble gjenvunnet. Dette ble så enten analysert ved MALDI-TOF ms eller ved reversfase HPLC massespektrometri, inkludert tandem (ms/ms) fragmentering ved å anvende ThermoQuest LCQ ESI ione-fangingsmasse-spektrometer. Et forsøk ble så gjort på å treffe det resulterende fragmenteringsmønteret med den humane IL-13 sekvensen og den separate tunge og lette kjedesekvensen til BAK502G9 IgG.
I løpet av den eksperimentelle sekvensen så ble en rekke kontroller, primært blanke overflater, IgG alene og isotypekontroller benyttet for å demonstrere at de identifiserte peptidene var utledet spesifikt fra IgG fanget IL-13 og ikke et produkt av BAK502G9 eller ikke-spesifikt bundet IL-13 kutting.
Resultater
De eksperimentelle seriene ga konsekvent enkle IL-13 spesifikke peptider for hver kutting. Data fra LCQ ionefangingsinstrumentet avslørte at det tryptiske fragmentet hadde en monoisotopisk masse på 3258Da (MH+) og det kymotrypsinfragmentet en monoisotopisk masse på 3937Da (MH+).
Et søk på disse massene mot den passende in silico-kuttingen av humant IL-13 ga nære treff på relaterte peptider i den C-terminale delen av molekylet.
Treff for trypsinpeptidmasse: 3258Da
Ved en toleranse på 1000 ppm, så passer 3258Da sekvensen fra aspargjnsyre ved posisjon 106 til det C-terminale asparagjnet ved posisjon 132. Det er ingen andre treff med denne toleranse. Denne region er uthevet på sekvensen til forløperformen av det humane IL-13 under.
MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWS INLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHWDTKIE VAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
Treff for kymotrypsinpeptidmasse: 393 7Da
Ved en toleranse på 1000 ppm, så passer 3937Da til sekvensen fra serin ved posisjon 99 til det C-terminale asparagjn ved posisjon 132. Denne region er uthevet på sekvensen til forløperformen av humant IL-13 under.
MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWS imTAGMYCAALESLIWSGCSAffiKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKI EVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
Begge disse treff viser at BAK502G9 IgG bevarer den C-terminale delen av IL-13 molekylet i løpet av proteolyse av antistoff: ligandkompleks.
Identiteten til begge peptider ble vellykket bekreftet ved ms/ms, ingen viste noen signifikante sekvensparalleller med BAK502G9. Ms/ms fragmentkartlegging skreddersydd for å identifisere enten Y eller B ioner traff 26 av 104 mulige ioner i en ladet tilstand for trypsinpeptidet og 19 av 128 mulige ioner for kymotrypsinpeptidet. En oversikt over alle ladede tilstander viser identifikasjon av 23 av de 27 aminosyreresidiene for trypsinfragmentet og 29 av de 33 residiene for kymotrypsinfragmentet. Dette er tilstrekkelig til å bekrefte identitet.
Den eksperimentelle sekvensen som en helhet har identifisert den del av BAK502G9 epitopen på humant IL-13 til å ligge innen de 27 C-terminale aminosyreresidiene. Disse funnene understøtter funnet fra den molekylære tilnærmingen som er beskrevet i detalj over.
REFERANSER
1. McKenzie, A.N., et al. J Immunol, 1993. 150(12): p. 5436-44.
2. Minty, A., et al. Nature, 1993. 362(6417): p. 248-50.
3. Nakamura, Y., et al. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996. 15{5): p. 680-7. 4. Robinson, D.S., et al. N Engl J Med, 1992. 326(5): p. 298-304. 5. Walker, C, et al. Atti J Respir Crit Care Med, 1994. 150(4): p. 1038-48. 6. Humbert, M., et al. Am J Respir Crit Care Med, 1996. 154(5): p. 1497-504. 7. Corrigan, C.J. and A.B. Kay Int Arch Allergy Appl
Immunol, 1991. 94(1-4): p. 270-1. 8. Ben-tl-eyrA.M-. , - efe- a-l-r Am J Respir Ge-1-1- Mol- Bi-oi, 1993". 8(1): p. 35-42. 9. Murata, T., et al. Int J Hematol, 1999. 69(1): p. 13-20. 10. Andrews,' A.L., et al. J Biol Chem, 2002. 277(48): p. 46073-8. 11. Miloux, B., et al. FEBS Lett, 1997. 401(2-3): p. 163-6. 12. Hilton, D.J., et al. Proe Nati Acad Sei USA, 1996. 93(1): p. 497-501. 13. p- 939-48. 35. Yang, E.S., et al. J. Allergy Immunol., 2002. 109: p.
A168. 36. Blease, K., et al. J Immunol, 2001. 166(8): p. 5219-24. 37. Heinzmann, A., et al. Hum Mol Genet, 2000. 9(4): p. 549-59. 38. Howard, T.D., et al. Am JHum Genet, 2002. 70(1): p. 230-6.
39. Kauppi, P., et al. Genomics, 2001. 77(1-2): p. 35-42.
40. Graves, P.B.»et al. J Allergy Clin Immunol, 2000. 105(3): p. 506-13. 41. Arima, K., et al. J Allergy Clin Immunol, 2002. 109(6): p. 980-7. 42. van der Pouw Kraan, T.C., et al. Genes Immun, 1999. 1(1): p. 61-5. 43. Humbért, H., et al. J Allergy Clin Immunol, 1997. 99(5}: p. 657-65. 44. Kotsimbos, T.C., P. Ernst, andQ.A. Hantid, Proe Assoc Am
Physicians, 1996. 108(5): p. 368-73. 45. Komai-Koma, M.,F.Y. Liew, andP.C. Wilkinson, J Immunol, 1995. 155(3): p. 1110-6. 46. Naseer, T., et al. Am J Respir Crit Care Med,.1997. 155(3): p. 845-51. 47. Huang, S.K., et al. J Immunol, 1995. 155(5): p. 2688-94. 48. Kroegel, C, et al. Eur Respir J, 1996. 9(5): p. 899-904. 49. Ohshima, Y., et al. Pediatr Res, 2002. 51(2): p. 195-200. 50.- Hasegawa, M-.-/et al.- 3- Rheumato-ly 1997.- 24r|2)-: p. 32S-32. 51. Hancock, A., et al. Am J Respir Cell Mol Biol, 1998. 18(1): p. 60-5. 52. Lee, C.G., et al. JExp Med, 2001. 194(6): p. 609-21. 53. Jain-Vora, S., et al. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997. 17(5): p. 541-51. 54. Fallon, P.G., et al; J Immunol, 2000. 164(5): p. 2585-91. 55. Chiaramonte, M.G., et al. JClin Invest, 1999. 104(6): p. 777-85. 56. Chiaramonte, M.G., et al, Hepatology, 2001. 34(2): p. 273-82. 57. Sluiter, H.J., et al. Eur Respir J, 1991. 4(4): p. 479-89. 58. Zheng, T., et al, J Clin Invest, 2000. 106(9): p. 1081-93. 59. Tashkin, D.P., et al., Methacholine reactivity predicts changes in lung function over time in smokers with early chronic obstructive pulmonary disease. The Lung Health Study Research Group. Am J Respir Crit Care Med, 1996. 153(6 Pt 1): p. 1802-11. 60. Van Der Pouw Kraan, T.C, et al. Genes Immun, 2002. 3(7): p. 436-9. 61. Skinnider, B.F., et al. Blood, 2001. 07(1): p. 250-5. 62. Kapp, D., et al. J Exp Med, 1999. 189(12): p, 1939-46. 63. Fiumara, P., F. Cabanillas, and A. Younes, Blood, 2001. 98(9}: p. 2877-8. 64. Terabe, M,, et al. Mat Immunol, 2000. 1(6): p. 515-20. 65. Ahlers, J.D., et al. Proe Nati Acad Sei USA, 2002. 99(20} : p. 13020-5. 66. Hutchings, C., Generation of Naive Human Antibody Libraries, in AntiJbody Engineering, R. Kontermann and S. Dubel, Editors. 2001, Springer Laboratory Manuals,
Berlin, p. 93-108.
67. Vaughan, T.J., et al. Nat Biotechnol, 1996. 14(3): p. 309-14.
68. Kitamura, T., et al. Blood, 1989. 73(2): p. 375-80.
69. Lefort, S., et al. FEBS Lett, 1995. 366(2-3): p. 122-6. 70. O<g>bourn, J.K., et al. Immunotechnology, 1996. 2(3): p. 181-96. 71. Howard, T.D., et al. Am J Respir Cell Mol Biol, 2001. 25(3): p. 377-84. 72. Karlsson, R., A. Michaelsson, and L. Mattsson, J Immunol Methods, 1991. 145(1-2): p. 229-40. 73. Tomlinson, VBASB. 1997 , MRC Centre for Protein
EngineeringrCambridge, OK.
74. Altmann, F., et al. Glycoconj J, 1999. 16(2): p. 109-23, 75. Drexler, H.G., et al. Leuk Res, 1986. 10(5}: p. 487-500. 76. Skinnider, B,F., 0. Kapp, and T.W. Mak, Leuk Lymphoma, 2002. 43(6) : p. 1203-10. 77. Terada, N., et al. Clin Exp Allergy, 2000. 30(3): p. 348-55. 78. Wenzel, S.E., et al. J Immunol, 2002. 169(8): p. 4613-9. 79. Richter, A., et al. Am j Respir Cell Mol Biol, 2001. 25(3) : p. 385-91. 80. Bochner, B.S., et al. J Immunol, 1995. 154(2): p. 799-803. Bl. Kotowicz, K., et al. Int Immunol, 1996. 8(12): p. 1915-25. 82. McKenzie, A.N., et al. Journal of Immunology, 1993. 150(12) : p. 5436-44. 83. Bouteiller, C.L., et al. J Immunol Methods, 1995. 181(1): p. 29-36. 84. Riffo-Vasquez, Y., et al. Clin Exp Allergy, 2000. 30(5): p. 728-38. 85. McMillan, S.J., et al. J Exp Med, 2002. 195(1): p. 51-7. 86. Humbles, A. A., et al. ProeNati Acad Sei USA, 2002. 99(3): p. 1479-84. 87. Temelkovski, J., et al. Thorax, 1998. 53(10): p. 849-56. 88. Belvisi, M.G., et al., Pulin Pharmacol Ther, 2001, 14(3): p. 221-7. 89. Barnes, P.J., et al. Eur Respir J, 1996. 9(4): p. 636-42.
90. Barnes, P.J., Pharmacol Ther, 2003. 97(1): p. 87-94.
91. Wardlaw, A.J., Clin Med, 2001. 1(3): p. 214-8.
92. Edwards, J.C., et al. J Pathol, 1981. 134(2): p. 147-56. 93. McDonough, J.E., et al.W.M. Elliot, and J.C. Hogg. TGF-beta Isoform and IL- 13 Immvnostaining on Lxsng Tissue from Patlents with COPD. in ATS 99th International Conference. 2003. Seattle. 94. Wold, et al. Multivariate data analysis in cbemistry. Chemometrics - Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6). 95- Norman et al, Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998) ISBN: 0471170828 96. Abraham Kandel, Eric Backer. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis.Prentice Hall PTR?(May 11, 1995), ISBN: 0133418847 97. Wojtek Krzanowski. Principles ofMultivariate Analysis: A Dser's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (December 2000), ISBN: 0198507089 98 . lån H. 'WlttSnVETBé" Frank. Data"MihTng: PractlcaT Måchine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11, 1999), ISBN: 1558605525 99. David G, T. Denison (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F, M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics), John Wiley&Sons; (July 2002), ISBN: 0471490369
100. Arup K. Ghose, Vellarkad K. Viswanadhan. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-04B7-8
101. Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227,
799-817.
102. Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997)
273(4), 927-948.
103. Chothia, et al. Science, 233,755-758 (1986).
104. Whitelegg,N.R.J, and Rees, A.R (2000). Prot, Eng., 13,
819-824.
105. Available from Accelerys Inc.
106. Guex, N. and Peitsch, M.C. (1997). Electrophoresis
(1997) 18, 2714-2723.
107. Kabat E A et al (1991): Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5tt Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington.
108. Kontermann R and Dubel Stefan; (2001) Antibody
Engineering, Springer Laboratory Manuals.
109. Mendez et al (1997); Nature Genetics Vol. 2: 146-156.
110. Csonka E et al (2000) Journal of Cell Science, 113: 3207-3216.
111. Vanderbyl S et al (2002) Molecular Therapy, 5(5): 10.
112. Marasco WA (1997) Gene Therapy, 4(1): 11.
i
113. Hanes J et al (2000). Methods in Enzymology, Vol 328:24.
114. Li et al (2003). Abstract for poster [605] submitted at The American Thoracis Society Annual Meeting, 2003, Seattle.
115. Koide et al (1998). Journal of Molecular Biology, Vol
284:1141-1151.
116. Nygren et al (1997). Current Opinion in Structural
Biology, Vol 7:463-469.
117. Heller, F., et al. (2002) Immunity, 17(5):629-38.
118. Inoue, S., et al. (1999) Am J Gastroenterol, 94(9);2441-6.
119. Yang, M., et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2001. 25(4): p. 522-30
120. Punnonen J., et al 1993. Proe Nati Acad Sei. 96(8")":3730-4.
121 .Grunstein, M., et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2002. 282: p. L520-L528.
122. Laporte, J., et al. Am J Respir Crit Care Med 2001. 164: p. 141-148.
123. Tilba 0., et al. Br J Pharmacol 2Q03. 140(7): p. 1159-62.
124. Deshpande, D., et al. Am J Respir Cell Mol Biol 2004.
31(1): p. 36-42; Epub Feb 5 as doi:10.1165/rcmb.2003-0313OC.
125. Humbert et al. 1997. J. Allergy Clin. Immunol., 99:657.
126. Berry, M.A., Parker, D., Neale, N., Woodman, L. , Morgan, A. Monk, P.D.. Submitted to J.Allergy Clin Immunol.
127. Obase et al. Ann Allergy Asthma Immunol. 2001; 86(3):304-10.
128. Chu et al. 2000; J. Allergy Clin. Immunol. 106:1115
129. Terada et al. 2000. Clin. Exp. Allergy., 30: 348-55.
130. Wenzel et al. 2000. J. Immunol. 169: 4613-19.
Farmakokinetikker til BAK502G9 i 4 allergiske, men ikke utfordrede cynomolge primater (2 hannlige/2 hunnlige) etter en enkel 10 mg/kg i.v. bolusdose i løpet av 29 dager. BAK502G9 nivåer i serum ble målt ved ELISA (gjennomsnittlig data).
Andre sett med kimære konstruksjoner 21 dyr som viste AHR (PC30) i fase I og et tilleggsdyr med en antigen-primingfenotype ble trukket ut til testing i fase II (22 totalt). Hvert dyr hadde ikke AHR målt ved både AUC og PC30. Bare dyr som viste AHR i fase I og hvis AHR ble undersøkt i både fase I og fase II ble inkludert i AHR-resultatene. Statistisk testing ble utført ved å anvende InStat. Testing var en 2-veis students t-test mot nullhypotesen at endepunktet ikke inkluderte antallet 0 (dvs. det var ingen forandring i fase II sammenlignet med fase I);
<*>p<0,05,<**>p<0,01. Data er vist som aritmetisk gjennomsnitt + SEM (n=14-21).
<a>5 dyr ble ekskludert fra AUC-analysen ettersom de ikke viste AHR (øket AUC) i fase I. Videre 3 dyr ble ekskludert på grunn av en teknisk feil i fase II luftveisfunksjonsdatasamling.
<b>3 dyr ble ekskludert fra PC3o-analysen på grunn av en teknisk feil i fase II luftveisfunksjonsdatasamling (samme dyr som i a). Tilleggsdyret med antigenpriming fenotype ble ekskludert ettersom det ikke viste PC30AHR i fase I.
<c>2 dyr ble ekskludert fra antigen-priminganalysen ettersom det var en teknisk feil i fase I luftvei sfunksj onsdatasamling.
dl dyr ble ekskludert fra BAL-analysen på grunn av markert BAL inflammasjon ved starten av studien.
Claims (19)
1. Isolert spesifikt bindingsmedlem for humant IL-13,karakterisertv e d at det spesifikke bindingsmedlem binder til en epitop innenfor den humane IL-13 aminosyresekvensen fra fenylalanine ved posisjon 99 til det C-terminale asparagin ved posisjon 132 (FSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN) på humant IL-13 protein.
2. Spesifikt bindingsmedlem ifølge krav 1,karakterisert vedat det spesifikke bindingsmedlem binder til en epitop innenfor den humane IL-13 aminosyresekvensen fra asparginsyre ved posisjon 106 til det C-terminale asparagjnet ved posisjon 132 (DTKIEVAQFVKDLLLrILKKLFREGRFN) på humant IL-13 protein.
3. Isolert spesifikt bindingsmedlem for humant IL-13 ifølge krav 2,karakterisert vedat det spesifikke bindingsmedlem binder til et polypeptid bestående av DTKIEVAQFVKDLLLrILKKLFREGRFN.
4. Isolert spesifikt bindingsmedlem for humant IL-13 ifølge krav 3,karakterisert vedat det spesifikke bindingsmedlem binder til et polypeptid bestående av F S SLITVRDTKIEVAQFVKDLLLIILKKLFREGRFN.
5. Spesifikt bindingsmedlem ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat det omfatter et scFv antistoffmolekyl.
6. Spesifikt bindingsmedlem ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat det omfatter en antistoff konstantregi on.
7. Spesifikt bindingsmedlem ifølge krav 6,karakterisert vedat det omfatter et helt antistoff.
8.
Spesifikt bindingsmedlem ifølge krav 7,karakterisert vedat det hele antistoffet er IgG4.
9.
Isolert spesifikt bindingsmedlem ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat HCDRl, HCDR2 og HCDR3 i VH domenet er innenfor et kimlinjerammeverk og/eller LCDR1, LCDR2 og LCDR3 i VL-domenet er innenfor et kimlinjerammeverk.
10.
Isolert spesifikt bindingsmedlem ifølge krav 9,karakterisertv e d at HCDRl, HCDR2 og HCDR3 i VH domenet er innenfor kimlinjerammeverket VH1 DP14.
11.
Isolert spesifikt bindingsmedlem ifølge krav 9,karakterisertv e d at HCDRl, HCDR2 og HCDR3 i VH-domenet er innenfor kimlinjerammeverket VL y3 3H.
12.
Sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et spesifikt bindingsmedlem ifølge ethvert av de foregående krav og minst en tilleggskomponent.
13.
Sammensetning ifølge krav 12,karakterisert vedat den omfatter et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff, vehikkel eller bærer.
14.
Isolert nukleinsyre,karakterisert vedat den omfatter en nukleotidsekvens som koder for et spesifikt bindingsmedlem ifølge ethvert av kravene 1 til 11.
15.
Vertcelle,karakterisert vedat den er in vitro transformert med nukleinsyren ifølge krav 14.
16.
Fremgangsmåte for å produsere et spesifikt bindingsmedlem ifølge ethvert av kravene 1 til 11,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter å dyrke vertceller ifølge krav 15 under betingelser for produksjon av nevnte spesifikke bindingsmedlem, eventuelt ytterligere omfattende isolering og/eller rensing av nevnte spesifikke bindingsmedlem.
17.
Fremgangsmåte ifølge krav 16,karakterisert vedat den omfatter å formulere det spesifikke bindingsmedlemmet til en sammensetning som inkluderer minst en tilleggskomponent.
18.
Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 16 eller 17,karakterisertved at den omfatter binding av det spesifikke bindingsmedlem som binder humant IL-13 til IL-13 eller et fragment av IL-13, slik som humant IL-13 eller et fragment av IL-13.
19.
Spesifikt bindingsmedlem ifølge ethvert av kravene 1 til 11 eller sammensetning ifølge krav 12 eller 13 for anvendelse ved behandling av en sykdom eller forstyrrelse valgt fra gruppen som består av astma, atopisk dermatitt, allergisk rinitt, fibrose, inflammatorisk tarmsykdom og Hodgkin's lymfom.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US48751203P | 2003-07-15 | 2003-07-15 | |
US55821604P | 2004-03-31 | 2004-03-31 | |
GBGB0407315.1A GB0407315D0 (en) | 2003-07-15 | 2004-03-31 | Human antibody molecules |
US57379104P | 2004-05-24 | 2004-05-24 | |
PCT/GB2004/003059 WO2005007699A2 (en) | 2003-07-15 | 2004-07-15 | Human antibody molecules for il-13 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20160707A1 true NO20160707A1 (no) | 2016-04-27 |
NO342727B1 NO342727B1 (no) | 2018-07-30 |
Family
ID=44535047
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20060730A NO338853B1 (no) | 2003-07-15 | 2006-02-15 | Isolert spesifikt bindingsmedlem for humant IL-13, isolert antistoff VH og VL domene, sammensetning inneholdende disse og fremgangsmåter for å fremstille disse og anvendelse, samt isolert nukleinsyre og vertscelle. |
NO20160707A NO342727B1 (no) | 2003-07-15 | 2016-04-27 | Isolert spesifikt antistoffmolekyl mot humant IL-13, sammensetning inneholdende disse, fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse, samt isolert nukleinsyre og 30 vertscelle. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20060730A NO338853B1 (no) | 2003-07-15 | 2006-02-15 | Isolert spesifikt bindingsmedlem for humant IL-13, isolert antistoff VH og VL domene, sammensetning inneholdende disse og fremgangsmåter for å fremstille disse og anvendelse, samt isolert nukleinsyre og vertscelle. |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
JP (3) | JP5519567B2 (no) |
KR (1) | KR101073590B1 (no) |
AU (1) | AU2011200308B2 (no) |
CY (1) | CY1111467T1 (no) |
HK (3) | HK1097853A1 (no) |
MX (1) | MXPA06000258A (no) |
NO (2) | NO338853B1 (no) |
RU (1) | RU2009148270A (no) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102434588B1 (ko) * | 2014-06-18 | 2022-08-22 | 메디뮨 엘엘씨 | N-아세틸시스테인을 포함하는 세포 배양 방법 및 배지 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994004680A1 (en) * | 1992-08-21 | 1994-03-03 | Schering Corporation | Human interleukin-13 |
WO2003035847A2 (en) * | 2001-10-26 | 2003-05-01 | Centocor, Inc. | Il-13 mutein proteins, antibodies, compositions, methods and uses |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK1461428T3 (da) * | 2001-12-03 | 2012-06-04 | Alexion Pharma Inc | Fremgangsmåde til at fremstille hybridantistoffer |
WO2003086451A1 (en) * | 2002-04-05 | 2003-10-23 | Centocor, Inc. | Asthma-related anti-il-13 immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses |
AU2003259374A1 (en) * | 2002-08-30 | 2004-03-19 | Glaxo Group Limited | Vaccine comprising il-13 and an adjuvant |
GB0407315D0 (en) * | 2003-07-15 | 2004-05-05 | Cambridge Antibody Tech | Human antibody molecules |
TWI307630B (en) * | 2004-07-01 | 2009-03-21 | Glaxo Group Ltd | Immunoglobulins |
-
2004
- 2004-07-15 MX MXPA06000258A patent/MXPA06000258A/es active IP Right Grant
- 2004-07-15 KR KR1020067000933A patent/KR101073590B1/ko active IP Right Grant
-
2006
- 2006-02-15 NO NO20060730A patent/NO338853B1/no unknown
-
2007
- 2007-02-15 HK HK07101860.8A patent/HK1097853A1/xx unknown
-
2009
- 2009-12-24 RU RU2009148270/10A patent/RU2009148270A/ru not_active Application Discontinuation
-
2011
- 2011-01-25 AU AU2011200308A patent/AU2011200308B2/en active Active
- 2011-04-07 JP JP2011085689A patent/JP5519567B2/ja active Active
- 2011-05-16 CY CY20111100456T patent/CY1111467T1/el unknown
- 2011-09-07 HK HK11109456.5A patent/HK1155185A1/zh unknown
-
2014
- 2014-02-05 JP JP2014020292A patent/JP5922686B2/ja active Active
-
2015
- 2015-12-08 JP JP2015239450A patent/JP2016047843A/ja active Pending
-
2016
- 2016-04-19 HK HK16104446.4A patent/HK1216427A1/zh unknown
- 2016-04-27 NO NO20160707A patent/NO342727B1/no unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994004680A1 (en) * | 1992-08-21 | 1994-03-03 | Schering Corporation | Human interleukin-13 |
WO2003035847A2 (en) * | 2001-10-26 | 2003-05-01 | Centocor, Inc. | Il-13 mutein proteins, antibodies, compositions, methods and uses |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2011147454A (ja) | 2011-08-04 |
JP5922686B2 (ja) | 2016-05-24 |
HK1155185A1 (zh) | 2012-05-11 |
JP2016047843A (ja) | 2016-04-07 |
KR101073590B1 (ko) | 2011-10-14 |
NO342727B1 (no) | 2018-07-30 |
HK1097853A1 (en) | 2007-07-06 |
AU2011200308B2 (en) | 2011-07-28 |
KR20060054312A (ko) | 2006-05-22 |
JP5519567B2 (ja) | 2014-06-11 |
JP2014101372A (ja) | 2014-06-05 |
NO20060730L (no) | 2006-04-10 |
AU2011200308A1 (en) | 2011-02-17 |
HK1216427A1 (zh) | 2016-11-11 |
CY1111467T1 (el) | 2015-08-05 |
MXPA06000258A (es) | 2006-07-03 |
NO338853B1 (no) | 2016-10-24 |
RU2009148270A (ru) | 2011-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9856317B2 (en) | Human antibody molecules for IL-13 | |
MXPA06000240A (es) | Dispositivo para la medicion de procesos de caudal volumetricos distribuidos en el tiempo. | |
BG106027A (bg) | Човешки антитела, които свързват човешки il-12 и методи за получаване | |
NO20160707A1 (no) | Humane antistoffmolekyler fra IL-13 |