NO20023752L

NO20023752L - 2-carboxamide benzimidazoles useful in the treatment and prevention of ischemic reperfusion injury

Info

Publication number: NO20023752L
Application number: NO20023752A
Authority: NO
Inventors: Nicholas Nikolaides; Donatella Chianelli
Original assignee: Procter & Gamble
Priority date: 2000-02-09
Filing date: 2002-08-08
Publication date: 2002-10-09
Also published as: IL150525A0; CA2399795A1; EP1263736A1; AU2001236821A1; WO2001058878A1; NO20023752D0; JP2003522759A

Description

Kryssreferanse til beslektet søknadCross reference to related application

Foreliggende oppfinnelse krever prioritet fra US Provisional Application Serial No. 60/181,234, 7945P, innlevert 9. februar 2000. The present invention claims priority from US Provisional Application Serial No. 60/181,234, 7945P, filed Feb. 9, 2000.

Oppfinnelsens områdeField of the invention

Foreliggende oppfinnelse vedrører 2-karboksamid-benzimidazoler som er nyttige ved behandling eller forebygging av iskemisk reperfusjonsskade av myokardiale eller andre vev eller andre kardiovaskulære og inflammatoriske sykdommer og forstyrrelser. The present invention relates to 2-carboxamide-benzimidazoles which are useful in the treatment or prevention of ischemic reperfusion injury of myocardial or other tissues or other cardiovascular and inflammatory diseases and disorders.

Sammendrag av oppfinnelsenSummary of the invention

Foreliggende oppfinnelse inkluderer forbindelser med den generelle struktur: The present invention includes compounds with the general structure:

hvori: in which:

(a) RI er valgt fra gruppen bestående av alkyl, aryl, (a) R1 is selected from the group consisting of alkyl, aryl,

alkoksy og aryloksy, hvor alkyl og aryl i den foretrukne RI inneholder 1-14 karbonatomer, alkoxy and aryloxy, wherein alkyl and aryl in the preferred RI contain 1-14 carbon atoms,

(b) R3 og R4 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, alkyl, alkoksy, alkyl-aryloksy, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino, alkyldelene av de foretrukne R3 og R4 (b) R 3 and R 4 are independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, alkyl, alkoxy, alkyl-aryloxy, alkylthio, amino and mono- or dialkylamino, the alkyl moieties of the preferred R 3 and R 4

har 1-8 karbonatomer, bortsett fra når R3 og R4 begge er hydrogen, has 1-8 carbon atoms, except when R3 and R4 are both hydrogen,

(c) hver R5 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, cyano, alkyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino, alkyldelene av foretrukne R5 har 1-8 karbonatomer, og (c) each R 5 is independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, cyano, alkyl, hydroxy, alkoxy, thio, alkylthio, amino and mono- or dialkylamino, the alkyl moieties of preferred R 5 having 1-8 carbon atoms, and

en optisk isomer, diastereomer eller enantiomer eller blanding derav, et farmasøytisk akseptabelt salt, hydrat eller biohydrolyserbar ester, amid eller imid derav. an optical isomer, diastereomer or enantiomer or mixture thereof, a pharmaceutically acceptable salt, hydrate or biohydrolyzable ester, amide or imide thereof.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også farmasøytiske blandinger som inneholder slike forbindelser, samt fremgangsmåter for anvendelse av slike forbindelser for å behandle eller forhindre reperfusjonsskader av vev. The present invention also relates to pharmaceutical mixtures containing such compounds, as well as methods for using such compounds to treat or prevent tissue reperfusion damage.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsenDetailed description of the invention

Det er ca. 1,1 million myokardiale infarkter i USA hvert år og 350.000 mennesker dør. Myokardial infarkt (MI) eller hjerteattakk forekommer når blodkar som tilfører blod til hjertet blir fullstendig eller delvis okkludert. Behandling med trombolytiske midler for å gjenopprette blodstrømmen (reperfusjon) er den første behandling i mange tilfeller. Fordelen ved reperfusjon er imidlertid ledsaget av den akutte inflammatoriske responsen assosiert med den, hvilket fører til et syndrom kalt reperfusjonsskade. It is approx. 1.1 million myocardial infarctions in the United States each year and 350,000 people die. Myocardial infarction (MI) or heart attack occurs when blood vessels that supply blood to the heart become completely or partially occluded. Treatment with thrombolytic agents to restore blood flow (reperfusion) is the first treatment in many cases. However, the benefit of reperfusion is accompanied by the acute inflammatory response associated with it, leading to a syndrome called reperfusion injury.

Inflammasjonen tjener generelt som en beskyttende rolle. For eksempel vil posisjoner for bakteriell infeksjon, bakterielle endotoksiner indusere produksjon av inflammatoriske cytokiner som tiltrekker sirkulerende leukocytter, inkludert nøytrofiler og monocytter for å ødelegge bakteriene. Straks infeksjonen er stoppet vil inflammasjonen avta. Det finnes imidlertid betingelser hvor det inflammatoriske signal opprettholdes (reumatoid artritt) eller det er unødvendig alvorlig (iskemi-reperfusjonsskade). The inflammation generally serves a protective role. For example, positions of bacterial infection, bacterial endotoxins will induce the production of inflammatory cytokines that attract circulating leukocytes, including neutrophils and monocytes to destroy the bacteria. As soon as the infection is stopped, the inflammation will subside. However, there are conditions where the inflammatory signal is maintained (rheumatoid arthritis) or it is unnecessarily severe (ischemia-reperfusion injury).

Et vesentlig trekk ved inflammasjon er migrering av nevrofiler (PMNer) fra blod inn i vev. Denne migrering er forutgående for en kaskade av hendelser forårsaket av adhesjonsmolekyler. Vedhefting av PMNer til vaskulære endotelia celler krever samvirkning av adhesjonsmolekylene og overflaten av begge celletyper. Disse molekyler tilhører tre distinkte familier: seleksjons-, integins- og immunoglobulinsuperfamilien. Nevrofiler vil først "rulle" langs endoteliacellene, en prosess forårsaket av selektiner. Ved inflammasjonsstedene vil kraftig vedhefting forårsakes av samvirkning av 02 integriner på PMNer og ICAM-1 (intercellulært adhesjonsmolekyl-1) uttrykt på endoteliacellene. Endelig vil transendotelialmigrering av PMNer inn i vevene føre til vevødeleggelse. Forbindelser som er i stand til å blokkere vedhefting av nøytrofile til endotelium vil være nyttige ved behandling av et antall tilstander som inkluderer iskemi-reperfusjonsskade inkludert, men nødvendigvis ikke begrenset til myokardinfarkt, kransarterie bypass poding, angioplastikk, angina, slag, perifer vaskulær sykdom, inflammatorisk buksykdom, ulcerøs kolitt, forbrenninger, frostskader, pustestressyndrom hos voksne, astma, vev og organtransplantasjoner, generell kirurgi, replantasjon, akutt renalfeil, revmatoid artritt, psoriasis, hepatitt, pankreatitt, solforbrenning, stråling, svulst og sjokk. An essential feature of inflammation is the migration of neurophils (PMNs) from blood into tissue. This migration precedes a cascade of events caused by adhesion molecules. Adhesion of PMNs to vascular endothelial cells requires interaction of the adhesion molecules and the surface of both cell types. These molecules belong to three distinct families: the selectin, integrin and immunoglobulin superfamilies. Neurophils will first "roll" along the endothelial cells, a process caused by selectins. At the sites of inflammation, strong adhesion will be caused by the interaction of 02 integrins on PMNs and ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) expressed on the endothelial cells. Finally, transendothelial migration of PMNs into the tissues will lead to tissue destruction. Compounds capable of blocking the adhesion of neutrophils to endothelium will be useful in the treatment of a number of conditions that include ischemia-reperfusion injury including but not necessarily limited to myocardial infarction, coronary artery bypass grafting, angioplasty, angina, stroke, peripheral vascular disease, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, burns, frostbite, respiratory stress syndrome in adults, asthma, tissue and organ transplants, general surgery, replantation, acute renal failure, rheumatoid arthritis, psoriasis, hepatitis, pancreatitis, sunburn, radiation, tumor and shock.

(For nye oversikter se: C.Cornejo, J. Harlan, R. Winn, in Adhesion Molecules in Health&Disease, L. Paul and T. Issekutz, Eds., Marcel Dekker, 1997, kapittel 18; J. Prince, C. Ballantyne, Emerging Therapeutic Targets, 1999, 263-277.) (For new reviews see: C.Cornejo, J. Harlan, R. Winn, in Adhesion Molecules in Health&Disease, L. Paul and T. Issekutz, Eds., Marcel Dekker, 1997, chapter 18; J. Prince, C. Ballantyne , Emerging Therapeutic Targets, 1999, 263-277.)

Ordliste over betegnelserGlossary of terms

Hvis ikke annet er angitt, har de etterfølgende betegnelser den indikerte betydning anvendt i foreliggende beskrivelse. Betegnelsen "alkyl" betyr en hydrokarbonkjede som er lineær, forgrenet eller syklisk, mettet eller umettet (en ikke aromatisk), substituert eller usubstituert. Betegnelsen kan anvendes alene eller som en del av et annet ord hvor den kan være forkortet til "alk" (for eksempel alkoksy, alkylamino). Foretrukket lineær alkyl har 1-20 karbonatomer, mer foretrukket 1-8 karbonatomer og mest foretrukket 1-4 karbonatomer og aller mest foretrukket er metyl eller etyl. Foretrukket syklisk og forgrenet alkyl har 3-20 karbonatomer, mer foretrukket 3-10 karbonatomer og mest foretrukket 3-6 karbonatomer. Foretrukket syklisk alkyl har en hydrokarbonring, men kan ha to, tre eller flere sammensmeltede eller spirosykliske hydrokarbonringer. Alkyl kan være umettet kun med en eller flere dobbeltbindinger ("alkenyl")(ingen trippelbindinger), fortrinnsvis med en, to eller tre dobbeltbindinger, mer foretrukket med en dobbeltbinding. Alkyl kan være umettet med en eller flere trippelbindinger ("alkynyl"), fortrinnsvis med en trippelbinding. Mer foretrukket er mettet ("alkanyl"). Betegnelsen "alkylen" betyr en alkyl som er knyttet til 2 eller flere grupper. Fortrukne substituenter på alkyl inkluderer alkyl, aryl, halo, hydroksy, alkoksy, aryloksy, amino, alkylamino, arylamino, tio, alkyltio, aryltio, acyl, alkylacyl, arylacyl, karboksy, alkylester, arylester, amino, alkylamino, arylamino, sulfonyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, nitro, cyano, heterocykel. Foretrukket alkyl er usubstituert. If not stated otherwise, the subsequent designations have the indicated meaning used in the present description. The term "alkyl" means a hydrocarbon chain which is linear, branched or cyclic, saturated or unsaturated (non-aromatic), substituted or unsubstituted. The term can be used alone or as part of another word where it can be abbreviated to "alk" (for example alkoxy, alkylamino). Preferred linear alkyl has 1-20 carbon atoms, more preferably 1-8 carbon atoms and most preferably 1-4 carbon atoms and the most preferred is methyl or ethyl. Preferred cyclic and branched alkyl has 3-20 carbon atoms, more preferably 3-10 carbon atoms and most preferably 3-6 carbon atoms. Preferred cyclic alkyl has one hydrocarbon ring, but may have two, three or more fused or spirocyclic hydrocarbon rings. Alkyl may be unsaturated with only one or more double bonds ("alkenyl") (no triple bonds), preferably with one, two or three double bonds, more preferably with one double bond. Alkyl may be unsaturated with one or more triple bonds ("alkynyl"), preferably with a triple bond. More preferred is saturated ("alkanyl"). The term "alkylene" means an alkyl which is attached to 2 or more groups. Preferred substituents on alkyl include alkyl, aryl, halo, hydroxy, alkoxy, aryloxy, amino, alkylamino, arylamino, thio, alkylthio, arylthio, acyl, alkylacyl, arylacyl, carboxy, alkylester, arylester, amino, alkylamino, arylamino, sulfonyl, alkylsulfonyl , arylsulfonyl, nitro, cyano, heterocycle. Preferred alkyl is unsubstituted.

Betegnelsen "aryl" betyr en aromatisk hydrokarbonring som er substituert eller usubstituert. Betegnelsen kan anvendes alene eller som en del av et annet ord (aryloksy, arylamino). Foretrukket aryl har 6-14 karbonatomer i den aromatiske ring eller ringer, og totalt 6-20, fortrinnsvis ca. 12 karbonatomer. Foretrukket aryl er fenyl eller naftyl, mest foretrukket er fenyl. Betegnelsen "arylen" betyr aryl som er knyttet til to eller flere grupper. Foretrukne substituenter på aryl inkluderer alkyl, aryl, halo, hydroksy, alkoksy, aryloksy, amino, alkylamino, arylamino, tio, alkyltio, aryltio, acyl, alkylacyl, arylacyl, karboksy, alkylester, arylester, amino, alkylamino, arylamino, sulfonyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, nitro, cyano, heterocykel. The term "aryl" means an aromatic hydrocarbon ring which is substituted or unsubstituted. The term can be used alone or as part of another word (aryloxy, arylamino). Preferred aryl has 6-14 carbon atoms in the aromatic ring or rings, and a total of 6-20, preferably approx. 12 carbon atoms. Preferred aryl is phenyl or naphthyl, most preferred is phenyl. The term "arylene" means aryl which is attached to two or more groups. Preferred substituents on aryl include alkyl, aryl, halo, hydroxy, alkoxy, aryloxy, amino, alkylamino, arylamino, thio, alkylthio, arylthio, acyl, alkylacyl, arylacyl, carboxy, alkylester, arylester, amino, alkylamino, arylamino, sulfonyl, alkylsulfonyl , arylsulfonyl, nitro, cyano, heterocycle.

Betegnelsen "heteroatom" betyr et nitrogen, oksygen eller svovelatom. The term "heteroatom" means a nitrogen, oxygen or sulfur atom.

Betegnelsen "heterocykel" eller "heterocyklyl" betyr en cyklisk alkyl eller aryl hvor en eller flere karbonatomer er erstattet med heteroatomer i ringen eller ringene, fortrinnsvis en, to eller tre heteroatomer i ringen eller ringene. Foretrukne heterocykliske substituenter er de samme som for alkyl. Betegnelsen "heteroaryl" henviser til en undergruppe av heterocykliske forbindelser som omfatter en aromatisk ring. Foretrukket heteroaryl har 5-14, mer foretrukket 10 og mest foretrukket 5 eller 6 karbon pluss heteroatomer i ringen (e) og totalt 5-20, mer foretrukket ca. 12 karbon pluss heteroatomer. The term "heterocycle" or "heterocyclyl" means a cyclic alkyl or aryl in which one or more carbon atoms are replaced by heteroatoms in the ring or rings, preferably one, two or three heteroatoms in the ring or rings. Preferred heterocyclic substituents are the same as for alkyl. The term "heteroaryl" refers to a subgroup of heterocyclic compounds comprising an aromatic ring. Preferred heteroaryl has 5-14, more preferably 10 and most preferably 5 or 6 carbons plus heteroatoms in the ring (e) and a total of 5-20, more preferably approx. 12 carbons plus heteroatoms.

Betegnelsen "sikker og effektiv mengde" betyr en mengde av en farmakologisk aktiv forbindelse tilstrekkelig til i det vesentlige å indusere en positiv modifikasjon av tilstanden som skal behandles, men tilstrekkelig lav til å unngå alvorlige bivirkninger (et rimelig fordel-/risikoforhold) innen omfanget av sunn medisinsk vurdering. En sikker og effektiv mengde av en forbindelse vil variere med den spesielle tilstand som behandles, størrelse og alder og fysisk tilstand for pasienten, tilstandens alvorlighet, behandlingens varighet, type av samtidig terapi, den anvendte spesielle farmasøytisk akseptable bærer, samt lignende faktorer bestemt av den behandlende lege ut fra dennes kunnskap og ekspertise. The term "safe and effective amount" means an amount of a pharmacologically active compound sufficient to substantially induce a positive modification of the condition to be treated, but sufficiently low to avoid serious side effects (a reasonable benefit/risk ratio) within the range of sound medical judgment. A safe and effective amount of a compound will vary with the particular condition being treated, the size and age and physical condition of the patient, the severity of the condition, the duration of treatment, the type of concomitant therapy, the particular pharmaceutically acceptable carrier employed, and similar factors determined by the attending physician based on his knowledge and expertise.

Betegnelsen "farmasøytisk akseptabel bærer" eller "farmasøytisk akseptable eksipienter" betyr en eller flere forenlige faststoffer eller væskeeksipienter som er egnet for administrasjon til mennesker og lavere dyr. Betegnelsen "forenlig" betyr at eksipientene er i stand til å blandes med den farmakoligsk aktive forbindelse eller forbindelser og med hverandre, på en måte slik at det ikke er noen samvirkning som i det vesentlige nedsetter den farmasøytiske effekt av blandingen under vanlige anvendelsessituasjoner. Eksipientene har i seg selv ingen vesentlig farmakologisk aktivitet, men kan for eksempel fungere som fortynningsmidler, smøremidler, disintegreringsforsterkere, oppløsningsforsterkere, inkapsuleringsmaterialer, preserveringsmidler, fargestoffer, smaksstoffer og lignende. Farmasøytisk akseptable eksipienter må være av tilstrekkelig høy renhet og tilstrekkelig lav toksisitet for å gjøre dem egnet for administrasjon til mennesker og lavere dyr som behandles. The term "pharmaceutically acceptable carrier" or "pharmaceutically acceptable excipients" means one or more compatible solid or liquid excipients suitable for administration to humans and lower animals. The term "compatible" means that the excipients are capable of being mixed with the pharmacologically active compound or compounds and with each other, in such a way that there is no interaction which substantially reduces the pharmaceutical effect of the mixture under normal situations of use. The excipients themselves have no significant pharmacological activity, but can, for example, function as diluents, lubricants, disintegration enhancers, dissolution enhancers, encapsulation materials, preservatives, dyes, flavorings and the like. Pharmaceutically acceptable excipients must be of sufficiently high purity and sufficiently low toxicity to make them suitable for administration to humans and lower animals being treated.

Betegnelsen "enhetsdoseform" betyr at blandingen omfatter en mengde av en farmakologisk aktiv forbindelse som er egnet for administrasjon til et menneske eller et lavere dyr i en enkel doseform, i henhold til god medisinsk praksis. The term "unit dosage form" means that the composition comprises an amount of a pharmacologically active compound suitable for administration to a human or a lower animal in a single dosage form, according to good medical practice.

En "biohydrolyserbar ester" er en ester av en A "biohydrolyzable ester" is an ester of a

karboksylsyreinnholdende 2-karboksyamid benzimidazol ifølge foreliggende oppfinnelse som ikke innvirker på aktiviteten av 2-karboksyamid benzimidazolene eller som lett omdannes i et dyr for å gi en aktiv 2-karboksyamid benzimidazol ifølge oppfinnelsen. Slike estere inkluderer lavere alkylestere, lavere cykloalkylestere (slik som acetoksymetyl-, acetoksyetyl-, aminokarbonyloksymetyl-, pivaloyloksymetyl-og pivaloyloksyetylestere), laktonylestere (slik som ftalidyl- og tioftalidylestere). carboxylic acid-containing 2-carboxamide benzimidazole according to the present invention which does not affect the activity of the 2-carboxamide benzimidazoles or which is easily converted in an animal to give an active 2-carboxamide benzimidazole according to the invention. Such esters include lower alkyl esters, lower cycloalkyl esters (such as acetoxymethyl, acetoxyethyl, aminocarbonyloxymethyl, pivaloyloxymethyl and pivaloyloxyethyl esters), lactonyl esters (such as phthalidyl and thiophthalidyl esters).

ForbindelseneThe connections

Foreliggende oppfinnelse inkluderer 2-karboksamid benzimidazolforbindelser med strukturen: The present invention includes 2-carboxamide benzimidazole compounds with the structure:

I formel (I) er RI valgt fra alkyl, aryl, alkoksy og aryloksy. Alkyl- og aryldelene i foretrukne Rl-grupper inneholder 1-14 karbonatomer. In formula (I), R 1 is selected from alkyl, aryl, alkoxy and aryloxy. The alkyl and aryl moieties in preferred R1 groups contain 1-14 carbon atoms.

Mer foretrukket er RI valgt fra usubstituerte eller substituert alkyl med 1-12 karbonatomer og usubstituert eller substituert fenyl eller naftyl. Mer foretrukket alkyl RI inkluderer usubstituert eller substituert lineær alkyl med 2-8 karbonatomer, mer foretrukket 3-6 karbonatomer og ytterligere med foretrukket er n-propyl eller n-butyl eller n-pentyl. Mer foretrukket RI inkluderer forgrenet alkyl med 3-8 karbonatomer, mer foretrukket 3-6 karbonatomer og ytterligere mer foretrukket er isometyl eller isopentyl. Mer foretrukket RI inkluderer cyklisk alkyl med 3-8 karbonatomer, mer foretrukket 3-6 karbonatomer. Foretrukne substituenter for slik lineær, forgrenet eller cyklisk alkyl inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- og dialkylamino, tio, alkyltio, aryl (spesielt fenyl) og heterocykel; mer foretrukket er slik alkyl usubstituert. Foretrukket RI som er lineær, forgrenet eller cyklisk alkyl, er mettet eller umettet med en eller flere dobbeltbindinger, mer foretrukket er mettet. More preferably, RI is selected from unsubstituted or substituted alkyl with 1-12 carbon atoms and unsubstituted or substituted phenyl or naphthyl. More preferred alkyl RI includes unsubstituted or substituted linear alkyl with 2-8 carbon atoms, more preferably 3-6 carbon atoms and further preferred is n-propyl or n-butyl or n-pentyl. More preferred RI includes branched alkyl with 3-8 carbon atoms, more preferably 3-6 carbon atoms and even more preferred is isomethyl or isopentyl. More preferably R1 includes cyclic alkyl of 3-8 carbon atoms, more preferably 3-6 carbon atoms. Preferred substituents for such linear, branched or cyclic alkyl include halo, hydroxy, alkoxy, amino, mono- and dialkylamino, thio, alkylthio, aryl (especially phenyl) and heterocycle; more preferably such alkyl is unsubstituted. Preferred RI which is linear, branched or cyclic alkyl, is saturated or unsaturated with one or more double bonds, more preferably is saturated.

Mer foretrukket aryl RI inkluderer substituert eller usubstituert fenyl. Foretrukne substituenter for slik fenyl inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- og dialkyamino, også foretrukket for slik fenyl er at den er usubstituert. More preferred aryl R 1 includes substituted or unsubstituted phenyl. Preferred substituents for such phenyl include halo, hydroxy, alkoxy, amino, mono- and dialkylamino, also preferred for such phenyl is that it is unsubstituted.

Mer foretrukket aralkyl RI inkluderer substituert eller usubstituert fenyl. Foretrukne substituenter for slik benzyl inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- og dialkylamino, også foretrukket for slik benzyl er at den er umettet. More preferred aralkyl R 1 includes substituted or unsubstituted phenyl. Preferred substituents for such benzyl include halo, hydroxy, alkoxy, amino, mono- and dialkylamino, also preferred for such benzyl is that it is unsaturated.

I formelen (I) er R3 og R4 uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halo, alkyl, alkoksy, alkyl-aryloksy, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino, bortsett fra at R3 og R4 ikke begge er hydrogen. Alkyldelene av foretrukket R3 og R4 grupper kan ha 1-8 karbonatomer. Fortrinnsvis er R3 og R4 uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, haloalkylalkoksy, alkyltio og mono- eller dialkylamino, bortsett fra at R3 og R4 ikke begge er hydrogen. In formula (I), R 3 and R 4 are independently selected from the group consisting of hydrogen, halo, alkyl, alkoxy, alkyl-aryloxy, alkylthio, amino and mono- or dialkylamino, except that R 3 and R 4 are not both hydrogen. The alkyl parts of preferred R3 and R4 groups can have 1-8 carbon atoms. Preferably, R 3 and R 4 are independently selected from the group consisting of hydrogen, haloalkylalkoxy, alkylthio and mono- or dialkylamino, except that R 3 and R 4 are not both hydrogen.

Foretrukket R3 og R4 inkluderer hydrogen, alkoksy med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, alkyltio med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, monoalkylamino eller dialkylamino hvor hver alkyl har 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer og alkyl med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer. Foretrukne substituenter på alkyl av slike grupper inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- eller dialkylamino, tio, alkyltio, mer foretrukket er det for slik R3 og R4 grupper at de er usubstituerte. Ytterlige mer foretrukket er minst en av R3 og R4 etoksy og spesielt metoksy. Fortrinnsvis er en av R3 og R4 hydrogen, mer foretrukket er R3 hydrogen. Preferred R 3 and R 4 include hydrogen, alkoxy of 1-6, preferably up to about 3 carbon atoms, alkylthio of 1-6, preferably up to about 3 carbon atoms, monoalkylamino or dialkylamino where each alkyl has 1-6, preferably up to about 3 carbon atoms and alkyl of 1-6, preferably up to about 3 carbon atoms. Preferred substituents on alkyl of such groups include halo, hydroxy, alkoxy, amino, mono- or dialkylamino, thio, alkylthio, it is more preferred for such R3 and R4 groups that they are unsubstituted. Even more preferably, at least one of R3 and R4 is ethoxy and especially methoxy. Preferably one of R3 and R4 is hydrogen, more preferably R3 is hydrogen.

I formel (I) angir R5-grupper i posisjonene 4 og 7 av benzimidazolringene. Hver R5 er uavhengig valgt fra hydrogen, halo, cyano, alkyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino. Alkyldelene i foretrukne R5-grupper inneholder 1-8 karbonatomer. In formula (I), R5 denotes groups in positions 4 and 7 of the benzimidazole rings. Each R 5 is independently selected from hydrogen, halo, cyano, alkyl, hydroxy, alkoxy, thio, alkylthio, amino and mono- or dialkylamino. The alkyl parts in preferred R5 groups contain 1-8 carbon atoms.

Foretrukket R5 inkluderer hydrogen, halo, alkyl med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, alkoksy med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, monoalkyl- eller dialkylamino hvor hver alkyl inneholder 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer og alkyltio med 1-6, fortrinnsvis opp til 3 karbonatomer. Foretrukne substituenter for alkyl i slike R5 grupper inkluderer alkoksy, amino og alkyl, mer foretrukket er det at alkyl i slike grupper er ikke-substituerte. Preferred R5 includes hydrogen, halo, alkyl of 1-6, preferably up to about 3 carbon atoms, alkoxy of 1-6, preferably up to about 3 carbon atoms, monoalkyl- or dialkylamino where each alkyl contains 1-6, preferably up to about 3 carbon atoms and alkylthio with 1-6, preferably up to 3 carbon atoms. Preferred substituents for alkyl in such R5 groups include alkoxy, amino and alkyl, it is more preferred that alkyl in such groups is unsubstituted.

Mer foretrukket er det at hver R5 er uavhengig valgt fra hydrogen, halo og usubstituert alkyl med 1-3 karbonatomer. Mer foretrukket er det at ikke flere enn en R5 er hydrogen. Mest foretrukket er begge R5 hydrogen. More preferably, each R 5 is independently selected from hydrogen, halo and unsubstituted alkyl with 1-3 carbon atoms. It is more preferred that no more than one R5 is hydrogen. Most preferably, both R5 are hydrogen.

Foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen inkluderer følgende eksempler med strukturen (I) og med de indikerte substituenter: Preferred compounds according to the invention include the following examples with the structure (I) and with the indicated substituents:

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen inkluderer alle aktive optiske isomerer, diastereomerer og enantiomerer og blandinger derav av de ovennevnte forbindelser. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen inkluderer også farmasøytisk akseptable salter, hydrater og biohydrolyserbare estere, amider og imider av slike forbindelser. The compound according to the invention includes all active optical isomers, diastereomers and enantiomers and mixtures thereof of the above compounds. The compound of the invention also includes pharmaceutically acceptable salts, hydrates and biohydrolyzable esters, amides and imides of such compounds.

Fremstilling av forbindelsenePreparation of the compounds

I det følgende gis generelle skjemaer for fremstilling av foreliggende forbindelser og-spesielle fremgangsmåter for fremstilling av foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen. Hvis ikke noe annet er angitt er alle kommersielt tilgjenglige reaktanter anvendt uten ytterligere rensing. Reaksjonene blir generelt utført under en inert atmosfære (argon eller nitrogen). Saltlake henviser til mettet vandig natriumklorid. Restoppløsningsmiddel fjernes under vakuum (ca. 0,03 mm hg) ved romtemperatur (rt). In the following, general schemes for the preparation of the present compounds and special methods for the preparation of preferred compounds according to the invention are given. Unless otherwise stated, all commercially available reactants are used without further purification. The reactions are generally carried out under an inert atmosphere (argon or nitrogen). Brine refers to saturated aqueous sodium chloride. Residual solvent is removed under vacuum (approx. 0.03 mm hg) at room temperature (rt).

Strukturene for forbindelsene fremstilt er underbygget under anvendelse av de følgende analytiske redskaper. Proton NMR spektra ble tatt med et "GE QE-300" (300 MHz) spektrometer, et "Bruker AC-300" (300 MHz) kvad-kjernesondesystem eller mer en "Varian Unityplus" (300 MHz). Alle kjemiske skift er rapportert i liten 8-skala som ppm, nedfelt fra (CH3)4Si. Spektra opptatt med CDC13er betegnet enten som (CH3)4Si eller som rest-CHCl3(7,24 ppm). Spektra opptatt i D20 er referert som HOD (4,80 ppm), de som er opptatt i (CH3)2CO er betegnet som rest (CH3)2CO (2,04 ppm), de i CD30D er referert som rest CH3OH (3,30 ppm) og de i (CD3)2SO er referert til rest (CH3)2SO (2,49 ppm). Karbon-13 spektra blir tatt opp med "GE QE-300" (75 MHz) spektrometer eller "Bruker AC-300" (75 MHz) kvad-kjernesondesystem. Spektra tatt i CDD13er referert til oppløsningsmiddel (78 ppm), de i CD3OD er referert til oppløsningsmiddel (49 ppm), de i (CD3)2SO er referert til oppløsningsmiddel (39,7 ppm) og de i (CD3)2CO er referert til oppløsningsmiddel (206,5, 29,8 ppm). Massespektra blir bestemt på "Fision's Trio 2000" forsynt med en robotsonde eller en "Fison's Platform II Mass Spectrometer". Kjemiske ioniseringsspektra ble erholdt under anvendelse av metan og/eller ammoniakk som reaktantgass. ESI forbindelsesinnføring skjedde via "Hewlett Packard 1050 HPLC" autoprøvetaker under anvendelse av metanol, 0,2% maursyre og 0,2 mM ammoniumacetat som elueringsoppløsningsmiddel. Tynnsjiktskromatografi blir utført på silikagel 60-F254 forbelagte plater. Flash kromatografi blir utført -under anvendelse av silikagel 60 (Merck, 230-400 mesh). Smeltepunktet ble erholdt med en "Electrothermal 1A9200" eller en "MelTemp II" kapilærsmeltepunktsapparat og er ukorrigerte. The structures for the compounds produced are substantiated using the following analytical tools. Proton NMR spectra were taken with a "GE QE-300" (300 MHz) spectrometer, a "Bruker AC-300" (300 MHz) quad core probe system or more a "Varian Unityplus" (300 MHz). All chemical shifts are reported in small 8-scale as ppm, expressed from (CH3)4Si. Spectra taken with CDC13 are denoted either as (CH3)4Si or as residual CHCl3 (7.24 ppm). Spectra captured in D20 are referred to as HOD (4.80 ppm), those captured in (CH3)2CO are designated as residue (CH3)2CO (2.04 ppm), those in CD30D are referenced as residue CH3OH (3, 30 ppm) and those in (CD3)2SO are referred to residual (CH3)2SO (2.49 ppm). Carbon-13 spectra are recorded with "GE QE-300" (75 MHz) spectrometer or "Bruker AC-300" (75 MHz) quad core probe system. Spectra taken in CDD13 are referenced to solvent (78 ppm), those in CD3OD are referenced to solvent (49 ppm), those in (CD3)2SO are referenced to solvent (39.7 ppm) and those in (CD3)2CO are referenced to solvent (206.5, 29.8 ppm). Mass spectra are determined on "Fision's Trio 2000" equipped with a robotic probe or a "Fision's Platform II Mass Spectrometer". Chemical ionization spectra were obtained using methane and/or ammonia as reactant gas. ESI compound entry was via "Hewlett Packard 1050 HPLC" autosampler using methanol, 0.2% formic acid and 0.2 mM ammonium acetate as elution solvent. Thin-layer chromatography is performed on silica gel 60-F254 precoated plates. Flash chromatography is performed using silica gel 60 (Merck, 230-400 mesh). Melting points were obtained with an "Electrothermal 1A9200" or a "MelTemp II" capillary melting point apparatus and are uncorrected.

Skjema I er et generelt skjema nyttig for fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen: Scheme I is a general scheme useful for the preparation of many compounds according to the invention:

5-Metoksy-2-nitrofenol (B fra skjema I med R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en 2 1 rundbunnet flaske, forsynt med mekanisk rører og fylletrakt ble propionsyre (300 ml) og 3-metoksyfenol (37,2 g, 0,3 mol) tilsatt. Den resulterende blanding ble avkjølt til 0°C og en oppløsning av natriumnitritt (21 g, 0,304 mol) i vann (50 ml) ble langsomt tilsatt. Etter omrøring i 1 time ved 0°C ble rykende salpetersyre (40 ml) langsomt tilsatt. Den resulterende oppslemming ble omrørt ved 0°C i en time og deretter oppvarmet til romtemperatur i løpet av 2 timer. Vann (250 ml) ble tilsatt dråpevis ved romtemperatur og det resulterende faststoff ble filtrert og vasket med 300 ml 50% vandig propionsyre for å gi, etter tørking, 5-metoksy-2-nitrofenol som et faststoff. 5-Methoxy-2-nitrophenol (B from scheme I with R4 = methoxy and R3 and both R5 = H): To a 2 L round-bottom flask, equipped with a mechanical stirrer and addition funnel were added propionic acid (300 ml) and 3-methoxyphenol (37 .2 g, 0.3 mol) added. The resulting mixture was cooled to 0°C and a solution of sodium nitrite (21 g, 0.304 mol) in water (50 mL) was slowly added. After stirring for 1 hour at 0°C, fuming nitric acid (40 ml) was slowly added. The resulting slurry was stirred at 0°C for one hour and then warmed to room temperature over 2 hours. Water (250 ml) was added dropwise at room temperature and the resulting solid was filtered and washed with 300 ml of 50% aqueous propionic acid to give, after drying, 5-methoxy-2-nitrophenol as a solid.

N-Alkyl-5-metoksy-2-nitroanilin (C fra skjema I med RI = alkyl, R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H). Til en 1 1 rundbunnet flaske ble toluen (300 ml), 5-metoksy-2-nitrofenol (5,0 g, 0,03 mol) og trietylamin (6,68 g, 0,066 mol) tilsatt. Den resulterende oppløsning ble avkjølt til 0°C og trifluormetansulfonsyre anhydrid (Tf20) ble langsomt tilsatt via en pipette (9,3 g, 0,033 mol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 5 min., aminet (R1-NH2) (0,12 mol) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til refluks i 5,5 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble reaksjonsinnholdet filtrert gjennom en plugg silikagel (eluert med 90:10 heksan:etylacetat) og konsentrert via en roterende inndamper for å gi rå N-alkyl-5-metoksy-2-nitroa-nilin. Materialet ble anvendt i det neste syntesetrinn. N-Alkyl-5-methoxy-2-nitroaniline (C from Scheme I with R1 = alkyl, R4 = methoxy and R3 and both R5 = H). To a 1 L round bottom flask was added toluene (300 mL), 5-methoxy-2-nitrophenol (5.0 g, 0.03 mol) and triethylamine (6.68 g, 0.066 mol). The resulting solution was cooled to 0°C and trifluoromethanesulfonic anhydride (Tf 2 O) was slowly added via a pipette (9.3 g, 0.033 mol). The reaction mixture was stirred at 0°C for 5 min, the amine (R 1 -NH 2 ) (0.12 mol) was added and the reaction mixture was heated to reflux for 5.5 h. After cooling to room temperature, the reaction contents were filtered through a plug of silica gel (eluted with 90:10 hexane:ethyl acetate) and concentrated via a rotary evaporator to give crude N-alkyl-5-methoxy-2-nitroaniline. The material was used in the next synthesis step.

Nl-Alkyl-6-metoksybenzimidazol (D fra skjema I med RI = alkyl, R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en 250 ml rundbunnet flaske ble det tilsatt 88% maursyre (50 ml) og N-alkyl-5-metoksy-2-nitroanilin (0,02 mol). Til denne homogene blanding ble det tilsatt en etylacetatoppslemming av 10% Pd-C (600 mg). Den resulterende heterogene reaksjonsblanding ble oppvarmet til 100°C i 1 time, avkjølt til romtemperatur og filtrert gjennom "Celite" (eluert med vann). Filtratet ble gjort basisk ved tilsetting av 28% NH4OH oppløsning og deretter vasket med etylacetat (3 x 100 ml). De kombinerte organiske faser ble tørket (MgS04) , filtrert og konsentrert via en roterende inndamper til å gi en rest. Resten ble kromatografert (Si02, 50:50 heksan:etylacetat) til å gi Nl-alkyl-6-metoksybenzimidazol. N1-Alkyl-6-methoxybenzimidazole (D from Scheme I with RI = alkyl, R4 = methoxy and R3 and both R5 = H): To a 250 ml round bottom flask was added 88% formic acid (50 ml) and N-alkyl- 5-Methoxy-2-nitroaniline (0.02 mol). To this homogeneous mixture was added an ethyl acetate slurry of 10% Pd-C (600 mg). The resulting heterogeneous reaction mixture was heated to 100°C for 1 hour, cooled to room temperature and filtered through Celite (eluted with water). The filtrate was made basic by the addition of 28% NH 4 OH solution and then washed with ethyl acetate (3 x 100 ml). The combined organic phases were dried (MgSO 4 ), filtered and concentrated via a rotary evaporator to give a residue. The residue was chromatographed (SiO 2 , 50:50 hexane:ethyl acetate) to give N1-alkyl-6-methoxybenzimidazole.

Etyl l-alkyl-6-metoksy-lH-benzimidazol-2-karboksylat (E fra skjema I med RI = alkyl, R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): til en 250 ml rundbunnet flaske under argon, ble det tilsatt Nl-alkyl-6-metoksybenzimidazol (2,9 g, 0,014 mol) og THF (100 ml). Dette ble kjølt til -78°C og n-butyl litium (12,3 ml, 0,019 mol, i heksaner) ble tilsatt dråpevis, resulterende i en gul blanding. Omrøring fortsatte ved -78°C i 30 min, deretter ble etylklorformat (ECF) tilsatt rent (2,13 g, 0,019 mol). Reaksjonsblandingen ble varmet til romtemperatur og omrørt i 30 min. Vann (100 ml) ble tilsatt, og den resulterende blanding ble ekstrahert med etylacetat (3 x 100 ml). De kombinerte organiske faser ble tørket (MgSCM, filtrert og konsentrert for å gi en gul rest. Denne resten ble deretter kromatografert (flash, 70:30 heksan:etylacetat) for å gi etyl l-alkyl-6-metoksy-lH-benzimidazol-2-karboksylat. Ethyl 1-alkyl-6-methoxy-1H-benzimidazole-2-carboxylate (E from Scheme I with R1 = alkyl, R4 = methoxy and R3 and both R5 = H): to a 250 mL round bottom flask under argon, was added N1-alkyl-6-methoxybenzimidazole (2.9 g, 0.014 mol) and THF (100 mL). This was cooled to -78°C and n-butyl lithium (12.3 mL, 0.019 mol, in hexanes) was added dropwise, resulting in a yellow mixture. Stirring was continued at -78°C for 30 min, then ethyl chloroformate (ECF) was added neat (2.13 g, 0.019 mol). The reaction mixture was warmed to room temperature and stirred for 30 min. Water (100 mL) was added and the resulting mixture was extracted with ethyl acetate (3 x 100 mL). The combined organic phases were dried (MgSCM, filtered and concentrated to give a yellow residue. This residue was then chromatographed (flash, 70:30 hexane:ethyl acetate) to give ethyl 1-alkyl-6-methoxy-1H-benzimidazole- 2-carboxylate.

Nl-Alkyl-6-metoksybenzimidazol-2-karboksamid (F fra skjema I med RI = alkyl, RA - metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en ACE GLASS trykktube med omrører ble det tilsatt etyl 1-alkyl-6-metoksy-lH-benzimidazol-2-karboksylat (1,8 mmol), metanolammoniakk (10 ml, 2,0 M) og natrium eller kalsiumcyanid (8,8 mg, 0,18 mmol). Reaksjonsbeholderen ble deretter forseglet, oppvarmet til 80°C i 3 timer og deretter kjølt til romtemperatur. Den resulterende reaksjonsblandingen ble konsentrert med rotasjonsfordamping og residuet ble kromatografert (flash, 60:40 heksan:etylacetat) for å gi Nl-alkyl-6-metoksybenzimidazol-2-karboksamid. N1-Alkyl-6-methoxybenzimidazole-2-carboxamide (F from scheme I with RI = alkyl, RA - methoxy and R3 and both R5 = H): To an ACE GLASS pressure tube with stirrer was added ethyl 1-alkyl-6- methoxy-1H-benzimidazole-2-carboxylate (1.8 mmol), methanolic ammonia (10 mL, 2.0 M) and sodium or calcium cyanide (8.8 mg, 0.18 mmol). The reaction vessel was then sealed, heated to 80°C for 3 hours and then cooled to room temperature. The resulting reaction mixture was concentrated by rotary evaporation and the residue was chromatographed (flash, 60:40 hexane:ethyl acetate) to give N1-alkyl-6-methoxybenzimidazole-2-carboxamide.

Skjema II er et annet generelt skjema nyttig fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen. N-(Cyanometyl)-4-metoksy-2-nitroanilin (H fra skjema II med R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): til en 3-halset 1 1 rundbunnet flaske tilpasset med en mekanisk omrører, reflukskondenser og en fylletrakt ble det tilsatt 4-metoksy-2-nitroanilin (8,4 g, 0,05 mol), paraformaldehyd (4,5 g, 0,15 mol) kaliumcyanid (9,75 g, 0,15 mol) og sinkklorid (25 g, 0,18 mol). Til denne kraftig omrørte blandingen ble det langsomt tilsatt en blanding av H2S04(4 dråper) og iskald eddiksyre (250 ml). Den resulterende reaksjonsblandingen ble varmet til 50°C i 8 timer og deretter avkjølt til romtemperatur. Reaksjonsinnholdene ble helt over is/vann og det dannede faststoff ble oppsamlet via sugefiltrering, vasket med vann, tørket og rekrystallisert (abs. EtOH) for å gi N-(cyanometyl)-4-metoksy-2-nitroanilin som nåler. Scheme II is another general scheme useful for the preparation of many compounds according to the invention. N-(Cyanomethyl)-4-methoxy-2-nitroaniline (H from Scheme II with R4 = methoxy and R3 and both R5 = H): to a 3-necked 1 1 round-bottomed flask fitted with a mechanical stirrer, reflux condenser and a loading funnel 4-methoxy-2-nitroaniline (8.4 g, 0.05 mol), paraformaldehyde (4.5 g, 0.15 mol), potassium cyanide (9.75 g, 0.15 mol) and zinc chloride (25 g, 0.18 mol). To this vigorously stirred mixture was slowly added a mixture of H 2 SO 4 (4 drops) and glacial acetic acid (250 ml). The resulting reaction mixture was heated to 50°C for 8 hours and then cooled to room temperature. The reaction contents were poured over ice/water and the solid formed was collected via suction filtration, washed with water, dried and recrystallized (abs. EtOH) to give N-(cyanomethyl)-4-methoxy-2-nitroaniline as needles.

2-Cyano-6-metoksybenzimidazol-Nl-oksid (J fra skjema II med R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en 500 ml rundbunnet flaske ble det tilsatt N-(cyanometyl)-4-metoksy-2-nitroanilin (2,5 g, 0,012 mol) og 95% etanol (130 ml). Reaksjonsblandingen ble varmet til 60°C, fast kaliumkarbonat (1,77 g, 0,013 mol) ble tilsatt og den resulterende blanding ble deretter varmet til refluks i 4,5 timer, kjølt til romtemperatur og konsentrert i vakuum. Residuet ble oppløst i vann og deretter surgjort (kons. HC1) for å danne et hvitt faststoff som ble samlet sammen via filtrering, tørket og rekrystallisert (DMF) for å gi 2-cyano-6-metoksybenzimidazol-N-oksid som et faststoff. 2-Cyano-6-methoxybenzimidazole-Nl-oxide (J from Scheme II with R4 = methoxy and R3 and both R5 = H): To a 500 ml round-bottom flask was added N-(cyanomethyl)-4-methoxy-2- nitroaniline (2.5 g, 0.012 mol) and 95% ethanol (130 mL). The reaction mixture was heated to 60°C, solid potassium carbonate (1.77 g, 0.013 mol) was added and the resulting mixture was then heated to reflux for 4.5 hours, cooled to room temperature and concentrated in vacuo. The residue was dissolved in water and then acidified (conc. HCl) to form a white solid which was collected via filtration, dried and recrystallized (DMF) to give 2-cyano-6-methoxybenzimidazole-N-oxide as a solid.

2-cyano-l-isopropoksy-6-metoksybenzimidazol (K fra skjema II med RI = isopropyl, R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en 100 ml rundbunnet flaske ble det tilsatt 2-cyano-6-metoksybenzimidazol-N-oksid (457 mg, 2,41 mmol), tetrahydrofuran (THF) (50 ml), isopropylalkohol (145 mg, 2,41 mmol), trifenylfosfin (Ph3P)(632 mg, 2,41 mmol) og endelig dietylazodikarboksylat (DEAD)(444 mg, 2,55 mmol). Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer, deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble kromatografert (80:20 heksan:etylacetat) for å gi 2-cyano-l-isopropoksy-6-metoksybenzimidazol som et faststoff. l-Isopropoksy-6-metoksybenzimidazol-2-karboksamid (L fra skjema II med RI = isopropyl, R4 = metoksy og R3 og begge R5=H): Til en 25 ml rundbunnet flaske ble det tilsatt 2-cyano-l-isopropoksy-6-metoksybenzimidazol (100 mg, 0,43 mmol), t-butylalkohol (5 ml) og kaliumhydroksid (200 mg, 3,57 mmol). Denne blandingen ble refluksert i 1 timer, kjølt til romtemperatur, helt i saltsyre (50 ml) og ekstrahert med etylacetat (3 x 50 ml). De kombinerte organiske fraksjoner ble tørket (MgS04) , filtrert og konsenstrert i vakuum for å gi en gul olje. Denne oljen ble kromatografert (70:30 heksan:etylaceat) for å gi 1-isopropoksy-6-metoksybenzimidazol-2-karboksamid som et faststoff). 2-cyano-1-isopropoxy-6-methoxybenzimidazole (K from scheme II with RI = isopropyl, R4 = methoxy and R3 and both R5 = H): To a 100 ml round-bottom flask was added 2-cyano-6-methoxybenzimidazole- N -oxide (457 mg, 2.41 mmol), tetrahydrofuran (THF) (50 mL), isopropyl alcohol (145 mg, 2.41 mmol), triphenylphosphine (Ph3P) (632 mg, 2.41 mmol) and finally diethyl azodicarboxylate ( DEAD)(444 mg, 2.55 mmol). The resulting mixture was stirred at room temperature for 18 h, then concentrated in vacuo. The residue was chromatographed (80:20 hexane:ethyl acetate) to give 2-cyano-1-isopropoxy-6-methoxybenzimidazole as a solid. l-Isopropoxy-6-methoxybenzimidazole-2-carboxamide (L from Scheme II with RI = isopropyl, R4 = methoxy and R3 and both R5 = H): To a 25 ml round-bottom flask was added 2-cyano-l-isopropoxy- 6-Methoxybenzimidazole (100 mg, 0.43 mmol), t-butyl alcohol (5 mL) and potassium hydroxide (200 mg, 3.57 mmol). This mixture was refluxed for 1 hour, cooled to room temperature, poured into hydrochloric acid (50 mL) and extracted with ethyl acetate (3 x 50 mL). The combined organic fractions were dried (MgSO 4 ), filtered and concentrated in vacuo to give a yellow oil. This oil was chromatographed (70:30 hexane:ethyl acetate) to give 1-isopropoxy-6-methoxybenzimidazole-2-carboxamide as a solid).

Skjema III er enda et generelt skjema nyttig fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen: Scheme III is yet another general scheme useful for the preparation of many compounds according to the invention:

3-fluor-4-nitroanilin (N fra skjema III med R4 = amino og R3 og begge R5 = H): 3-Fluoranilin (5g; 1 ekvivalent) ble kombinert med benzaldehyd (5g; 1,05 ekvivalent). Blandingen ble omrørt ved 25°C i ^ time for å oppnå en mild refluks. 3-Fluoro-4-nitroaniline (N from Scheme III with R4 = amino and R3 and both R5 = H): 3-Fluoroaniline (5g; 1 equiv) was combined with benzaldehyde (5g; 1.05 equiv). The mixture was stirred at 25°C for ½ hour to achieve a gentle reflux.

Blandingen ble oppløst i konsentrert svovelsyre (20 ml) og kjølt til <5°C med et isbad. En blanding av konsentrert salpetersyre (3 ml) og konsentrert svovelsyre (10 ml) ble langsomt tilsatt og blandingen ble omrørt ved 25°C i 1^time. Reaksjonen ble bråkjølt ved å helle over vann (200 ml); den ble deretter vasket med etylacetat. De kombinerte etylacetatlagene ble tørket over magnesiumsulfat og fordampet til tørrhet. Produktet ble kromatografert på en silikagelkolonne ved å anvende 20% etylacetat-heksan som eluent for å gi tittelforbindelsen og en blanding av andre regioisomerer. The mixture was dissolved in concentrated sulfuric acid (20 mL) and cooled to <5°C with an ice bath. A mixture of concentrated nitric acid (3 ml) and concentrated sulfuric acid (10 ml) was slowly added and the mixture was stirred at 25°C for 1 hour. The reaction was quenched by pouring over water (200 mL); it was then washed with ethyl acetate. The combined ethyl acetate layers were dried over magnesium sulfate and evaporated to dryness. The product was chromatographed on a silica gel column using 20% ethyl acetate-hexane as eluent to give the title compound and a mixture of other regioisomers.

(3-Fluor-4-nitro-fenyl)-karbamidsyre tert-butylester (P fra skjema III med R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): Ditertbutyldikarbonat (1,4 g; 1 evkivalent) ble kombinert med 3-fluor-4-nitroanilin (1 g; 1 ekvivalent) i diklormetan (30 ml). Blandingen ble omrørt ved 25°C i 10 min. og dimetylaminopyrridin (0,08 g; 0,1 ekvivalent) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved 25°C i 24 timer. Blandingen ble fortynnet i etylacetat og vasket med 1 molar vandig sitronsyre; blandingen ble deretter vasket to ganger med vann. Etylacetatlaget ble tørket over magnesiumsulfat og fordampet til tørrhet. Produktet ble kromatografert på en silikagelkolonne ved å anvende 30% etylacetat-heksan som eluent for å gi en blanding av tittelforbindelsen (og den bis Boc-beskyttede forbindelsen). (3-Fluoro-4-nitro-phenyl)-carbamic acid tert-butyl ester (P from Scheme III with R4 = Boc-NH and R3 and both R5 = H): Ditert-butyl dicarbonate (1.4 g; 1 equiv) was combined with 3 -fluoro-4-nitroaniline (1 g; 1 equiv) in dichloromethane (30 mL). The mixture was stirred at 25°C for 10 min. and dimethylaminopyridine (0.08 g; 0.1 equivalent) was added. The mixture was stirred at 25°C for 24 hours. The mixture was diluted in ethyl acetate and washed with 1 molar aqueous citric acid; the mixture was then washed twice with water. The ethyl acetate layer was dried over magnesium sulfate and evaporated to dryness. The product was chromatographed on a silica gel column using 30% ethyl acetate-hexane as eluent to give a mixture of the title compound (and the bis Boc protected compound).

(3-Isobutylamino-4-nitro-fenyl)-karbamidsyre tert-butylester (Q fra skjema III med Ri = isobutyl, R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): Isobutylamin (0,29 g; 2 ekvivalenter) ble tilsatt langsomt til en løsning av (3-fluor-4-nitrofenyl)-karbamidsyre tert-butylester (0,5 g; 1 ekvivalent) i acetonitril (20 ml). Blandingen ble omrørt ved 25°C i 24 timer. Blandingen ble deretter fortynnet i diklormetan og vasket to ganger med vann. Diklormetanlaget ble tørket over natriumsulfat og fordampet til tørrhet for å gi tittelforbindelsen. (3-Isobutylamino-4-nitro-phenyl)-carbamic acid tert-butyl ester (Q from Scheme III with Ri = isobutyl, R4 = Boc-NH and R3 and both R5 = H): Isobutylamine (0.29 g; 2 equivalents) was added slowly to a solution of (3-fluoro-4-nitrophenyl)-carbamic acid tert-butyl ester (0.5 g; 1 equivalent) in acetonitrile (20 mL). The mixture was stirred at 25°C for 24 hours. The mixture was then diluted in dichloromethane and washed twice with water. The dichloromethane layer was dried over sodium sulfate and evaporated to dryness to give the title compound.

(4-Amino-3-isobutylamino-fenyl)-karbamidsyre tert-butylester (R fra skjema III med RI = isobutyl, R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): En løsning av (3-Isobutylamino-4-nitro-fenyl)-karbamidsyre tert-butylester (0,51 g; 1 ekvivalent) i etanol (15 ml) ble kombinert med en suspensjon av palladium på karbon (10 vekt%) (0,1 g; 2 ekvivalenter) i etanol (15 ml) mens den ble omrørt under en nitrogenatmosfære. Nitrogen ble deretter erstattet med et positivt trykk av hydrogen, og blandingen ble omrørt i 16 timer ved 25°C under hydrogenatmosfære. Blandingen ble deretter filtrert gjennom kiselgur, og presipitatet ble vasket med diklormetan. Filtratet ble fordampet til tørrhet for å gi tittelforbindelsen. (4-Amino-3-isobutylamino-phenyl)-carbamic acid tert-butyl ester (R from Scheme III with RI = isobutyl, R4 = Boc-NH and R3 and both R5 = H): A solution of (3-Isobutylamino-4- nitro-phenyl)-carbamic acid tert-butyl ester (0.51 g; 1 equiv) in ethanol (15 mL) was combined with a suspension of palladium on carbon (10 wt%) (0.1 g; 2 equiv) in ethanol ( 15 ml) while stirring under a nitrogen atmosphere. Nitrogen was then replaced with a positive pressure of hydrogen and the mixture was stirred for 16 hours at 25°C under a hydrogen atmosphere. The mixture was then filtered through diatomaceous earth and the precipitate was washed with dichloromethane. The filtrate was evaporated to dryness to give the title compound.

6-tert-Butoksykarbonylamino-1-isobutyl-lH-benzimidazol-2-karboksylsyreetylester (S fra skjema III med RI = isobutyl, R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): En 50% løsning etylglyoksylatpolymer i toluen (0,5 g; 1,5 ekvivalenter) ble kombinert med en løsning (4-amino-3-isobutylamino-fenyl)-karbamidsyre tert-butylester (0,46 g; 1 ekvivalent, forutsetter 100% utbytte fra tidligere trinn) i etanol (3 ml). Blandingen ble omrørt utildekket i H time. En løsning jodin (0,21 g; 0,5 ekvivalenter) i etanol (1,5 ml) ble tilsatt og blandingen ble deretter omrørt utildekket ved 25°C i 8 timer. Natriumtiosulfat (0,41 g; 1 ekvivalent) i vann (2 ml) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i ^ time ved 25°C. Blandingen ble fortynnet i etylacetat og vasket med vann og saltlake. Etylacetatlaget ble tørket over magnesiumsulfat og fordampet til tørrhet. Produktet ble kromatografert på en silikagelkolonne ved å anvende 50% etylacetat-heksan som ekstraksjonsmiddel for å gi tittelforbindelsen. 6-tert-Butoxycarbonylamino-1-isobutyl-1H-benzimidazole-2-carboxylic acid ethyl ester (S from Scheme III with RI = isobutyl, R4 = Boc-NH and R3 and both R5 = H): A 50% solution of ethyl glyoxylate polymer in toluene (0 .5 g; 1.5 equivalents) was combined with a solution of (4-amino-3-isobutylamino-phenyl)-carbamic acid tert-butyl ester (0.46 g; 1 equivalent, assuming 100% yield from previous step) in ethanol ( 3 ml). The mixture was stirred uncovered for H hour. A solution of iodine (0.21 g; 0.5 equivalents) in ethanol (1.5 mL) was added and the mixture was then stirred uncovered at 25°C for 8 hours. Sodium thiosulfate (0.41 g; 1 equivalent) in water (2 mL) was added and the mixture was stirred for 1 h at 25°C. The mixture was diluted in ethyl acetate and washed with water and brine. The ethyl acetate layer was dried over magnesium sulfate and evaporated to dryness. The product was chromatographed on a silica gel column using 50% ethyl acetate-hexane as the extractant to give the title compound.

6-Amino-l-isobutyl-lH-benzimidazol-2-karboksylsyreetylester (T fra skjema III med RI = isobutyl, R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): Trifluoreddiksyre (0,5 ml) ble tilsatt langsomt til en løsning av 6-tert-butoksykarbonylamino-l-isobutyl-lH-benzoimidazol-2-karboksylsyreetylester (0,12 g) 6-Amino-1-isobutyl-1H-benzimidazole-2-carboxylic acid ethyl ester (T from Scheme III with RI = isobutyl, R4 = Boc-NH and R3 and both R5 = H): Trifluoroacetic acid (0.5 mL) was added slowly to a solution of 6-tert-butoxycarbonylamino-1-isobutyl-1H-benzoimidazole-2-carboxylic acid ethyl ester (0.12 g)

i diklormetan (4,5 ml). Blandingen ble omrørt ved 25°C i 3 timer. Blandingen ble deretter fordampet til tørrhet og residuet ble oppløst i metanol. Løsningen i metanol ble fordampet til tørrhet; dette ble deretter oppløst i diklormetan og vasket med 2 M vandig kaliumkarbonat. Diklormetanlaget ble tørket over natriumsulfat og fordampet til tørrhet for å gi tittelforbindelsen. in dichloromethane (4.5 mL). The mixture was stirred at 25°C for 3 hours. The mixture was then evaporated to dryness and the residue was dissolved in methanol. The solution in methanol was evaporated to dryness; this was then dissolved in dichloromethane and washed with 2 M aqueous potassium carbonate. The dichloromethane layer was dried over sodium sulfate and evaporated to dryness to give the title compound.

6-Amino-1-isobutyl-lH-benzimidazol-2-karboksylsyreamid (U fra skjema III med RI = isobutyl, R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): En 25% vandig løsning av ammoniakk (5 ml) ble tilsatt til en løsning av 6-amino-l-isobutyl-lH-benzoimidazol-2-karboksylsyre etylester (0,02g) i tetrahydrofuran (0,5 ml) under omrøring. Blandingen ble omrørt ved 25°C i 72 timer. Blandingen ble deretter fortynnet i etylacetat og vasket med vann. Etylacetatfraksjonen ble tørket over magnseiumsulfat og fordampet til tørrhet for å gi tittelforbindelsen. 6-Amino-1-isobutyl-1H-benzimidazole-2-carboxylic acid amide (U from Scheme III with RI = isobutyl, R4 = Boc-NH and R3 and both R5 = H): A 25% aqueous solution of ammonia (5 mL) was added to a solution of 6-amino-1-isobutyl-1H-benzoimidazole-2-carboxylic acid ethyl ester (0.02g) in tetrahydrofuran (0.5ml) with stirring. The mixture was stirred at 25°C for 72 hours. The mixture was then diluted in ethyl acetate and washed with water. The ethyl acetate fraction was dried over magnesium sulfate and evaporated to dryness to give the title compound.

Skjema IV er enda et generelt skjema nyttig fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen: Scheme IV is yet another general scheme useful for the preparation of many compounds according to the invention:

N-(4-metoksy-2-nitrofenyl)-isobutyramid (W fra skjema IV med R3 = metoksy, R4 og begge R5 = H og R6 = iPr): 4-metoksy-2-nitroanilin (1,0 g; 1 ekvivalent) og isobutyrylklorid (0,634 g; 1 ekvivalent) ble kombinert i pyridin (60 ml) og omrørt i 4 timer. Blandingen ble konsentrert i vakuum til et residu og oppløst i diklormetan (DCM) (70 ml), vasket to ganger med IN HC1 (vandig), mettet Na2C03(vandig) vann og saltlake og tørket over MgS04. Oppløsningsmiddelet ble fjernet i vakuum for å gi 1,35 g av tittelforbindelsen. N-(4-Methoxy-2-nitrophenyl)-isobutyramide (W from Scheme IV with R3 = methoxy, R4 and both R5 = H and R6 = iPr): 4-methoxy-2-nitroaniline (1.0 g; 1 equiv ) and isobutyryl chloride (0.634 g; 1 equivalent) were combined in pyridine (60 mL) and stirred for 4 hours. The mixture was concentrated in vacuo to a residue and dissolved in dichloromethane (DCM) (70 mL), washed twice with 1N HCl (aq), saturated Na 2 CO 3 (aq), water and brine and dried over MgSO 4 . The solvent was removed in vacuo to give 1.35 g of the title compound.

Isobutyl-(4-metoksy-2-nitrofenyl)-amin (X fra skjema IV med R3 = metoksy, R4 og begge R5 = H og R6 = iPr) : Isobutyl-(4-metoksy-2-nitrofenyl)-amin (0,1 g; 1 ekvivalent) ble oppløst i THF (2 ml) og kombinert med en 1 M borantetrahydrofuran kompleksløsning i THF (1,25 ml; 3 ekvivalenter) og omrørt i 18 timer. Metanol (1 ml) ble langsomt tilsatt og oppløsningen ble varmet til 50°C i 2 timer. Oppløsningsmiddelet ble fjernet i vakuum og residuet ble kromatografert (silikagel, 0 til 30% EtOAc/heksaner) for å gi tittelforbindelsen. Isobutyl-(4-methoxy-2-nitrophenyl)-amine (X from Scheme IV with R3 = methoxy, R4 and both R5 = H and R6 = iPr) : Isobutyl-(4-methoxy-2-nitrophenyl)-amine (0 .1 g; 1 equiv) was dissolved in THF (2 mL) and combined with a 1 M boranetetrahydrofuran complex solution in THF (1.25 mL; 3 equiv) and stirred for 18 h. Methanol (1 mL) was slowly added and the solution was heated to 50°C for 2 hours. The solvent was removed in vacuo and the residue chromatographed (silica gel, 0 to 30% EtOAc/hexanes) to give the title compound.

l^-isobutyl-4-metoksy-benzen-l, 2-diamin (Y fra skjema IV med R3 = metoksy, R4 og begge R5 = H og R6 = iPr) : N<1->isobutyl-4-metoksy-benzen-l,2-diamin (0,054 g; 1 ekvivalent) ble oppløst i etanol (2 ml) og vann (0,1 ml), 10% palladium på karbon (50% våt) (0,011 g) ble tilsatt. Suspensjonen ble omrørt under en atmosfære av hydrogengass i 2 timer og deretter ble flasken renset med nitrogen. Suspensjonen ble filtrert gjennom en kiselgurpute, vasket grundig med DCM og de kombinerte organiske faser ble tørket in vacuo for å gi tittelforbindelsen. 1^-isobutyl-4-methoxy-benzene-1,2-diamine (Y from Scheme IV with R3 = methoxy, R4 and both R5 = H and R6 = iPr) : N<1->isobutyl-4-methoxy-benzene -1,2-diamine (0.054 g; 1 equivalent) was dissolved in ethanol (2 mL) and water (0.1 mL), 10% palladium on carbon (50% wet) (0.011 g) was added. The suspension was stirred under an atmosphere of hydrogen gas for 2 hours and then the bottle was purged with nitrogen. The suspension was filtered through a diatomaceous earth pad, washed thoroughly with DCM and the combined organic phases were dried in vacuo to give the title compound.

l-Isobutyl-5-metoksy-lH-benzoimidazol-2-karboksylsyre etylester { Z fra skjema IV med R3 = metoksy, R4 og begge R5=H og R6 = iPr): l-isobutyl-5-metoksy-lH-benzimidazol-2-karboksylsyre etylester (0,034 g; 1 ekvivalent i etanol (0,5 ml)) og en 50% løsning av etylglyoksalatpolymer i toluen (0,051 ml; 1,5 ekvivalent) ble kombinert og omrørt i H time. En løsning av jodin (0,022 g; 0,5 ekvivalent) i etanol (0,5 ml) ble tilsatt og reaksjonen ble videre omrørt i 20 timer. En løsning av natirumtiosulfat (0,044 g) i vann (0,5 ml) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 1 time, deretter fortynnet med EtOAc (20 ml). Blandingen ble vasket med vann (x 3) og saltlake, tørket med MgS04og oppløsningsmidlene ble fjernet i vakuum. Residuet ble renset ved kromatografi (silikagel, 5% metanol i DMC) for å gi tittelforbindelsen. l-Isobutyl-5-metoksy-lH-benzoimidazol-2-karboksylsyreamid ( AA fra skjema IV med R3 = metoksy og R4 og begge R5 = H og R6 = iPr): En 25 % vandig løsning av ammoniakk (1 ml) ble tilsatt under omrøring til en løsning av l-isobutyl-5-metoksy-lH-benzoimidazol-2-karboksylsyreetylester (0,0036 g) i THF (1 ml). Den organiske fase ble tørket med MgS04og fordampet in vakuum for å gi tittelforbindelsen. l-Isobutyl-5-methoxy-1H-benzoimidazole-2-carboxylic acid ethyl ester { Z from Scheme IV with R3 = methoxy, R4 and both R5=H and R6 = iPr): l-isobutyl-5-methoxy-1H-benzimidazol- 2-carboxylic acid ethyl ester (0.034 g; 1 equivalent in ethanol (0.5 mL)) and a 50% solution of ethyl glyoxalate polymer in toluene (0.051 mL; 1.5 equivalent) were combined and stirred for 1 h. A solution of iodine (0.022 g; 0.5 equivalent) in ethanol (0.5 mL) was added and the reaction was further stirred for 20 hours. A solution of sodium thiosulfate (0.044 g) in water (0.5 mL) was added and the mixture was stirred for 1 h, then diluted with EtOAc (20 mL). The mixture was washed with water (x 3) and brine, dried with MgSO 4 and the solvents were removed in vacuo. The residue was purified by chromatography (silica gel, 5% methanol in DMC) to give the title compound. l-Isobutyl-5-methoxy-1H-benzoimidazole-2-carboxylic acid amide (AA from Scheme IV with R3 = methoxy and R4 and both R5 = H and R6 = iPr): A 25% aqueous solution of ammonia (1 mL) was added with stirring to a solution of 1-isobutyl-5-methoxy-1H-benzoimidazole-2-carboxylic acid ethyl ester (0.0036 g) in THF (1 mL). The organic phase was dried with MgSO 4 and evaporated in vacuo to give the title compound.

Skjema V og VI er to generelle skjemaer nyttige ved fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen: 6-[[(4-Metoksy-fenyl)-metyl]amino]-1-isobutyl-l-H-benzimidazol-2-karboksylsyreamid (AB fra skjema RI = isobutyl, R3 og begge R5 = H og R7 = metoksy): Til en 200 ml rundbunnet flaske 6-amino-l-isobutyl-lH-benzimidazol-karboksylsyreamid (U; 0,1 g) ble oppløst i vannfri MeOH (10 ml). Reagenseddiksyre (0,1 ml) og 4-metoksybenzaldehyd (0,15 g) ble tilsatt og reaksjonen ble refluksert til fullstendig konvertering av utgangsmaterialet. På dette punkt ble reaksjonsblandingen kjølt til romtemperatur og natriumcyanoborhydrat (0,1 g) ble tilsatt porsjonsvis. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer. Blandingen ble deretter fordampet til tørrhet og residuet ble oppløst i etylacetat og vasket med 5% vandig natrium bikarbonat, vann og saltlake. Det organiske lag ble tørket over natriumsulfat og fordampet til tørrhet. Residuet ble kromatografert på en silikagelkolonne ved å anvende 25% etylacetat-heksan som ekstraksjonsmiddel for å gi tittelforbindelsen. Schemes V and VI are two general schemes useful in the preparation of many compounds according to the invention: 6-[[(4-Methoxy-phenyl)-methyl]amino]-1-isobutyl-1-H-benzimidazole-2-carboxylic acid amide (AB from Scheme RI = isobutyl, R3 and both R5 = H and R7 = methoxy): To a 200 mL round bottom flask 6-amino-1-isobutyl-1H-benzimidazole carboxylic acid amide (U; 0.1 g) was dissolved in anhydrous MeOH (10 mL ). Reagent acetic acid (0.1 mL) and 4-methoxybenzaldehyde (0.15 g) were added and the reaction was refluxed until complete conversion of the starting material. At this point the reaction mixture was cooled to room temperature and sodium cyanoborohydrate (0.1 g) was added portionwise. The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 hours. The mixture was then evaporated to dryness and the residue was dissolved in ethyl acetate and washed with 5% aqueous sodium bicarbonate, water and brine. The organic layer was dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. The residue was chromatographed on a silica gel column using 25% ethyl acetate-hexane as the extractant to give the title compound.

6-{[(2S)-2-(ft-Benzyloksykarbonyl)amino-l-okso-3-fenylpropyl]amino}-l-isobutyl-lH-benzimidazol-2-karboksamid ( AC fra skjema VI med RI - isobutyl, R3 og begge R5 = H og R9 = Z) : W-Benzyloksykarbonyl-L-fenylalanin (64,4 mg) ble oppløst i tørr diklormetan (1,5 ml) og N, N-diiosoporpyletylamin (41,2 jai). 1- (3-dimetylaminopropyl) -3-etylkarbodiimid (45,4 mg) og 4-dimetylaminopyridin (kat.) ble tisatt og blandingen ble omrørt i 10 minutter ved romtemperatur. 1-Hydroksybenzotriazol (32,0 mg) ble deretter tilsatt og omrøringen fortsatte i 5 minutter. Endelig ble 6-amino-l-isobutyl-l#-benzimidazol-2-karboksamid tilsatt og den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 5 dager. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med diklormetan og vasket med mettet natriumbikarbonatløsning (lx), vann (lx) og saltlake (lx). Det organiske lag ble tørket og konsentrert til et faststoff. Finmaling med metanol gav tittelforbindelsen som et faststoff. 6-{[(2S)-2-(ft-Benzyloxycarbonyl)amino-1-oxo-3-phenylpropyl]amino}-1-isobutyl-1H-benzimidazole-2-carboxamide ( AC from Scheme VI with RI - isobutyl, R3 and both R5 = H and R9 = Z): N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanine (64.4 mg) was dissolved in dry dichloromethane (1.5 ml) and N,N-diisosporpylethylamine (41.2 µl). 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide (45.4 mg) and 4-dimethylaminopyridine (cat.) were added and the mixture was stirred for 10 minutes at room temperature. 1-Hydroxybenzotriazole (32.0 mg) was then added and stirring continued for 5 minutes. Finally, 6-amino-1-isobutyl-1#-benzimidazole-2-carboxamide was added and the resulting mixture was stirred at room temperature for 5 days. The reaction mixture was diluted with dichloromethane and washed with saturated sodium bicarbonate solution (1x), water (1x) and brine (1x). The organic layer was dried and concentrated to a solid. Trituration with methanol gave the title compound as a solid.

6-{[(2S)-2-amino-l-okso-3-fenylpropyl]amino}-l-isobutyl-lff-benzimidazol-2-karboksamidhydroklorid (AD fra skjema med RI = isobutyl, R3, begge R5 og R9 - H). 6-{[(2S)-2-( N-Benzyloksykarbonyl)amino-1-okso-3-fenylpropyl]amino}-1-isobutyl-lH-benzimidazol-2-karboksamid (84,7 mg) og 10% Pd/C (17,0 mg) ble plassert i en flaske. I tørr etanol (3,5 ml) ble argontilførselen erstattet med en luftballong. Etter omrøring ved romtemperatur over natten ble hydrogen skylt fra systemet med argon og reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom en Celite®-propp med 1:1 etanol/vann (100 ml). Filtratet ble konsentrert gjennom en faststoffresidu. Det resulterende faststoff ble oppløst i et minimum av metanol og dryppet i overskytende eter for å gi en slurry. Filtrering ga tittelforbindelsen som et faststoff. 6-{[(2S)-2-amino-l-oxo-3-phenylpropyl]amino}-l-isobutyl-lff-benzimidazole-2-carboxamide hydrochloride (AD from scheme with RI = isobutyl, R3, both R5 and R9 - H). 6-{[(2S)-2-( N -Benzyloxycarbonyl)amino-1-oxo-3-phenylpropyl]amino}-1-isobutyl-1H-benzimidazole-2-carboxamide (84.7 mg) and 10% Pd/ C (17.0 mg) was placed in a bottle. In dry ethanol (3.5 mL), the argon supply was replaced by an air balloon. After stirring at room temperature overnight, hydrogen was flushed from the system with argon and the reaction mixture was filtered through a plug of Celite® with 1:1 ethanol/water (100 mL). The filtrate was concentrated through a solid residue. The resulting solid was dissolved in a minimum of methanol and dropped into excess ether to give a slurry. Filtration gave the title compound as a solid.

Komposisj onerCompositions

Foreliggende oppfinnelse inkluderer farmasøytiske sammensetninger som omfatter en sikker og effektiv mengde av en 2-karboksamidbenzimidazolforbindelse beskrevet over og farmasøytiske akseptable eksipienter. Sammensetningene kan også eventuelt inkludere andre farmakologisk aktive forbindelser, spesielt de med aktivitet som trombolytiker (for eksempel reteplase, streptokinase eller vevsplasminogenaktivatorer), antikoagulenter (for eksempel heparin), beta-blokkere (for eksempel karvedilol, propanalol), kalsiumkanalblokkere (for eksempel verapamil, nifedipin) og anti-blodplate forbindelser (for eksempel aspirin, abciximab). The present invention includes pharmaceutical compositions comprising a safe and effective amount of a 2-carboxamide benzimidazole compound described above and pharmaceutically acceptable excipients. The compositions may also optionally include other pharmacologically active compounds, especially those with activity as thrombolytics (for example reteplase, streptokinase or tissue plasminogen activators), anticoagulants (for example heparin), beta blockers (for example carvedilol, propanalol), calcium channel blockers (for example verapamil, nifedipine) and anti-platelet compounds (eg aspirin, abciximab).

Noen eksempler av farmasøytisk akseptable bærere eller komponenter derav er sukker, slik som laktose, glukose og sukrose; stivelser, slik som maisstivelse og potetstivelse; cellulose og dens derivater, slik som natriumkarboksymetylcellulose, etylcellulose, celluloseacetat; finmalt tragant; malt, gelatin, talkum, faste smøremidler, slik som stearinsyre, magnesiumstearat eller kalsiumsulfat; vegetabilske oljer, slik som peanøttolje, bomullsfrøolje, sesamolje, olivenolje, maisolje og olje fra teobrom; polyoler slik som propylenglykol, glyserin, sorbitol, mannitol og polyetylenglykol; alginsyre; emulgeringsmidler, slik som Tweens®; vætende midler slik som natriumlaurylsulfat; fargemidler; smakstilsetningsmidler; eksipineter; tabletthjelpemider; stabilisatorer; antioksidanter; konserveringsmidler; pyrogenfritt vann; isotonisk salt og fosfatbufferløsninger. Some examples of pharmaceutically acceptable carriers or components thereof are sugars, such as lactose, glucose and sucrose; starches, such as corn starch and potato starch; cellulose and its derivatives, such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose, cellulose acetate; finely ground tragacanth; malt, gelatin, talc, solid lubricants, such as stearic acid, magnesium stearate or calcium sulfate; vegetable oils, such as peanut oil, cottonseed oil, sesame oil, olive oil, corn oil, and tea brome oil; polyols such as propylene glycol, glycerin, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol; alginic acid; emulsifiers, such as Tweens®; wetting agents such as sodium lauryl sulfate; coloring agents; flavoring agents; excipients; tablet excipients; stabilizers; antioxidants; preservatives; pyrogen-free water; isotonic saline and phosphate buffer solutions.

Valget av en farmasøytisk akseptabel bærer for anvendelse sammen med en forbindelser blir egentlig bestemt ved måten forbindelsen skal administreres på. Forbindelsene og sammensetningene av foreliggende oppfinnelse kan administreres systematisk. Administrasjonsruter inkluderer topisk eller transdermal (plaster, salve, krem, pulver, etc), oral, parenteral, inkludert subkutant, intramuskulært eller intravenøs injeksjon, topisk, rektal, kolonisk, intraperitoneal, intraokkulær, sublingval, bukal, inhalasjon og/eller intranasal. Den foretrukne administrasjonsrute er parenteral, spesielt intravenøs injeksjon på en daglig eller nødvendig basis. The choice of a pharmaceutically acceptable carrier for use with a compound is essentially determined by the manner in which the compound is to be administered. The compounds and compositions of the present invention can be administered systematically. Routes of administration include topical or transdermal (patch, ointment, cream, powder, etc), oral, parenteral, including subcutaneous, intramuscular or intravenous injection, topical, rectal, colonic, intraperitoneal, intraocular, sublingual, buccal, inhalation and/or intranasal. The preferred route of administration is parenteral, particularly intravenous injection on a daily or as needed basis.

Den passende mengde av forbindelsen som skal anvendes kan bestemmes ved rutineeksperimentering med dyremodeller. Slike modeller inkluderer, men er ikke begrenset til frett, kanin og ikke-humane primatmodeller. Generelt blir en mengde mellom 0,01 (jg/kg til 100 mg/kg kroppsvekt per dag administrert avhengig av forbindelsen eller sammensetningene som er anvendt sitt potensial. The appropriate amount of compound to be used can be determined by routine experimentation with animal models. Such models include, but are not limited to, ferret, rabbit, and non-human primate models. Generally, an amount between 0.01 (jg/kg to 100 mg/kg body weight per day is administered depending on the potency of the compound or compositions used.

Foretrukket enhetsdoseform for injeksjon inkluderer sterile vannløsninger, fysiologisk salt eller blandinger derav. Parenterale enhetsdoseformsammesetninger kan være i form av løsninger klare for injisering eller tørre (for eksempel lyofiliserte) sammensetninger som er rekondisjonert med vann eller saltløsning før injeksjon. Løsningenes pH bør justeres til omkring 7,4. Passende bærere for injeksjon eller kirurgiske implantater inkluderer hydrogeler, kontrollerte eller uavbrutte løseanordninger, polyeddiksyre og kollagenmatriser. Andre passende bærere for injeksjon inkluderer dekstrose, mannitol, laktose, lecitin, albumin, natriumglutamat og lignende. Preferred unit dosage forms for injection include sterile aqueous solutions, physiological saline, or mixtures thereof. Parenteral unit dosage form compositions may be in the form of ready-to-inject solutions or dry (eg, lyophilized) compositions that have been reconstituted with water or saline prior to injection. The solutions' pH should be adjusted to around 7.4. Suitable carriers for injection or surgical implants include hydrogels, controlled or continuous release devices, polyacetic acid and collagen matrices. Other suitable carriers for injection include dextrose, mannitol, lactose, lecithin, albumin, monosodium glutamate and the like.

Sammensetninger av foreliggende oppfinnelse er foretrukket tilveiebrakt i enhetsdoseformer. En Compositions of the present invention are preferably provided in unit dosage forms. One

enhetsdoseformsammensetning inneholder foretrukket fra omkring 50 mg, mer foretrukket fra omkring 200 mg, også foretrukket fra omkring 500 mg, foretrukket til omkring 2000 mg, mer foretrukket til omkring 1000 mg, også foretrukket til omkring 500 mg av en 2-karboksamidbenzimidazolforbindelse beskrevet over. unit dosage form composition preferably contains from about 50 mg, more preferably from about 200 mg, also preferably from about 500 mg, preferably to about 2000 mg, more preferably to about 1000 mg, also preferably to about 500 mg of a 2-carboxamide benzimidazole compound described above.

Foreliggende sammensetninger kan være i et mangfold av passende former (for eksempel) for peroral, topisk eller parenteral administrasjon. Avhengig av den spesielt ønskede administrasjonsrute kan et mangfold av farmasøytisk akseptable bærere som er velkjente i teknikken anvendes. Disse inkluderer faste eller flytende fyllstoffer, fortynningsmidler, hydrotoper, overflateaktive midler og innkapslingssubstanser. Mengden av bærerkomponenter som er anvendt sammen med den aktive forbindelse er tilstrekkelig til å tilveiebringe en praktisk mengde av materialet for administrasjon per enhetsdose av den aktive forbindelse. Teknikker og sammensetninger for fremstilling av enhetsdoseformer i henhold til oppfinnelsen er beskrevet i følgende referanser: Modern Pharmaceutics, volum 7, kap. 9 og 10, Banker and Rhodes, editors, 1979; Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, 1981 og Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 2. utgave, 1976. The present compositions may be in a variety of suitable forms (for example) for oral, topical or parenteral administration. Depending on the particular route of administration desired, a variety of pharmaceutically acceptable carriers well known in the art may be used. These include solid or liquid fillers, diluents, hydrotopes, surfactants and encapsulants. The amount of carrier components used together with the active compound is sufficient to provide a practical amount of the material for administration per unit dose of the active compound. Techniques and compositions for preparing unit dosage forms according to the invention are described in the following references: Modern Pharmaceutics, Volume 7, Chapters 9 and 10, Banker and Rhodes, editors, 1979; Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, 1981 and Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 2nd ed., 1976.

En foretrukket doseringsform av foreliggende oppfinnelse er tiltenkt parenteral administrasjon. Foretrukket farmasøytisk akseptable bærere for slike sammensetninger inkluderer steril, pyrogenfritt vann og fysiologisk saltløsninger. Parenterale enhetsdoseformsammensetninger kan være i form av løsninger klare for injisering eller tørre (for eksempel lyofiliserte) sammensetninger som er rekondisjonert med vann eller saltløsning før injeksjon. A preferred dosage form of the present invention is intended for parenteral administration. Preferred pharmaceutically acceptable carriers for such compositions include sterile, pyrogen-free water and physiological saline solutions. Parenteral unit dosage form compositions may be in the form of ready-to-inject solutions or dry (eg, lyophilized) compositions that have been reconstituted with water or saline prior to injection.

Foretrukne sammensetninger av foreliggende oppfinnelse inkluderer de som er tiltenkt peroral administrasjon, slik som tabletter, kapsler, pulvere og væsker. Passende farmasøytiske akseptable eksipienter og anti-platelet forbindelser (for eksempel aspirin, abciximab)nts for slike sammensetninger inkluderer sukker, stivelser, cellulose og dets derivater, malt, gelatin, talkum, kalsiumsulfat, vegetabilske oljer, syntetiske oljer, polyoler, algesyre, fosfatbuffere, emulgatorer, alkoholer og vann. Preferred compositions of the present invention include those intended for oral administration, such as tablets, capsules, powders and liquids. Suitable pharmaceutically acceptable excipients and anti-platelet compounds (eg, aspirin, abciximab)nts for such compositions include sugars, starches, cellulose and its derivatives, malt, gelatin, talc, calcium sulfate, vegetable oils, synthetic oils, polyols, algal acid, phosphate buffers, emulsifiers, alcohols and water.

Metode for anvendelse av forbindelsene Method of application of the compounds

2-karboksamid-benzimidazolforbindelsene av foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved behandling av iskemi-reperfusjonsskade. Selv om de ikke begrenset til noen spesifikk mekanisme, tror man at forbindelsene virker via modulasjon av adhesjonsmolekylmetabolisme. Forbindelsene er derfor muligens anvendbare for behandling av iskemi-reperfusjonsskade som inkluderer: kardiovaskulær lidelse (myokardial iskemi, angina, hjertearytmi, hjertefeil, hypertensjon); for behandling for å redusere nevrotisk skade assosiert med anoksia eller iskemi som typisk kommer etter slag, hjertestans eller perinatal kvelning, for behandling for å redusere reperfusjonsskade etter organtransplantasjon, for behandling av forfrysning, inflammatorisk hjerteklaffsykdom, psoriasis, astma, pustevanskesyndrom hos voksne, for behandling av kronisk inflammatorisk lungesykdom inkludert emfysem, bronkitt og for behandling av fibrose, urtikaria, angioedema, vaskulitis, migarin, revmatoid artritt, gikt og allergi. The 2-carboxamide-benzimidazole compounds of the present invention can be used in the treatment of ischemia-reperfusion injury. Although not limited to any specific mechanism, the compounds are believed to act via modulation of adhesion molecule metabolism. The compounds are therefore potentially useful for the treatment of ischemia-reperfusion injury including: cardiovascular disorder (myocardial ischemia, angina, cardiac arrhythmia, heart failure, hypertension); for treatment to reduce neurotic damage associated with anoxia or ischemia typically following stroke, cardiac arrest or perinatal asphyxia, for treatment to reduce reperfusion injury after organ transplantation, for treatment of frostbite, inflammatory valvular heart disease, psoriasis, asthma, respiratory distress syndrome in adults, for treatment of chronic inflammatory lung disease including emphysema, bronchitis and for the treatment of fibrosis, urticaria, angioedema, vasculitis, migraine, rheumatoid arthritis, gout and allergy.

Det er kjent at et mangfold av prosesser er involvert i reperfusjonsskade, inflammasjon og relaterte prosesser. Ved å ikke være bundet ved teori er den følgende mekanisme interessant for foreliggende oppfinnelse. En viktig hendelse i reperfusjonskadeprosessen er oppregulering, uttrykk, aktivering av intracellulær adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) på endotelceller. ICAM-1 kan deretter samhandle med nøytrofile som resulterer ved transmigrasjon av nøytrofile inn i vevet med påfølgende frigjøring av skadelige enzymer og destruktive reaktive oksygenmolekyler. Derved har sannsynligvis forbindelser som kan forstyrre-oppregulering, uttrykk, aktivering av ICAM-1 fordelaktig effekt på iskemisk reperfusjonshendelser. Disse forbindelsene kan administreres oralt, intra-vaskulært, subkutant, intra-muskulært, intra-nasalt, intra-rektalt, intra-okkulært, sublingvalt/bukalt, ved inhalering og topisk (plaster, salve, pulver eller krem), så lenge en effektiv dose blir levert til ICAM-l-kilden. It is known that a multitude of processes are involved in reperfusion injury, inflammation and related processes. Not being bound by theory, the following mechanism is interesting for the present invention. An important event in the reperfusion injury process is the upregulation, expression, activation of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) on endothelial cells. ICAM-1 can then interact with neutrophils resulting in the transmigration of neutrophils into the tissue with subsequent release of harmful enzymes and destructive reactive oxygen molecules. Thereby, compounds that can disrupt the up-regulation, expression, activation of ICAM-1 probably have a beneficial effect on ischemic reperfusion events. These compounds can be administered orally, intra-vascularly, subcutaneously, intramuscularly, intra-nasally, intra-rectally, intra-ocularly, sublingually/buccally, by inhalation and topically (patch, ointment, powder or cream), as long as an effective dose is delivered to the ICAM-1 source.

2-karboksamid-benzimidazoler i henhold til oppfinnelsen reduserer ICAM-1 oppregulering, uttrykk eller aktivering signifikant. I andre prøver viser forbindelsene aktivitet som samsvarer med beskyttelse av hjertet. Heretter følger testmetoder anvendbare for å bestemme slike forbindelsers aktiviteter. 2-carboxamide-benzimidazoles according to the invention significantly reduce ICAM-1 up-regulation, expression or activation. In other tests, the compounds show activity consistent with protection of the heart. Following are test methods applicable to determining the activities of such compounds.

Test for hemming av ICAM-1-uttrykkAssay for inhibition of ICAM-1 expression

Vev: Uttrykket av molekyladhesjon (spesielt ICAM-1) ble utført på humane navlestreng endoteliaceller (HUVEC) erholdt fra Clonetics Corp. (Ca# CC2519), San Diego, CA. Tissue: The expression of molecular adhesion (specifically ICAM-1) was performed on human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) obtained from Clonetics Corp. (Ca# CC2519), San Diego, CA.

Endepunkt: Konsentrasjon av materiale som hemmer 50% av ICAM-l-uttrykket på overflaten av HUVECs oppregulert med 300 U/ml TNF-alfa (IC50) . End point: Concentration of material that inhibits 50% of ICAM-1 expression on the surface of HUVECs upregulated with 300 U/ml TNF-alpha (IC50).

Metode: Smelt 1 ampulle frossen HUVEC (raskt ved 37°C i~2 min (5 x 10<5->1 x 10<6>) celler i 1 ml medium), overfør deretter celler til 45 ml forvarmet vekstmedium (EGM for HUVEC) i en 225 cm<2>flaske (sådd ved 2500-5000 celler/cm<2>) og plasser dette i en fuktet 37°C inkubater med 5% C02. Skift medium etter 24-30 timer (for å fjerne døde celler og cytopreservativer) og skift deretter hver 2-3 dager - celler bør flyte sammen etter 5-7 dagers vekst. Trypsiner celler for å fjerne dem fra flasken - spinn (200 g, 5 min) til pelletceller - resuspender celler i 50 ml medium (behov~l-2 x IO<5>celler/ml) og plate 100 ml cellesuspensjon i 96-kum, kollagenbelagte plater (anvend~l-2 x. IO<4>celler/kum) - la vokse sammen (1-2 dager). Fjern gammelt næringsmedium (avfall) og tilsett 90 ml friskt medium som inneholder TNF-alfa (eller annen ICAM-1 stimulator i ønsket konsentrasjon) eller 90 ml medium alene (for ustimulerte kontrollkummer). Tilsett 10 ml medium (eller PBS eller PBS, 1% DMSO) som inneholder forbindelse som skal testes (ved 10 x ønsket konsentrasjon) eller i tillegg 10 ml medium alene (eller PBS eller PBS, 1% DMSO) for kontrollkummer - (endelig forbindelseskonsentrasjon = 1 x; endelig DMSO-konsentrasjon = 0,1%, dersom anvendt) - inkuber 4 timer ved 37°C. Fjern medium (avfall) og fest celler i 200 ml 80% aceton: 20% H2i 20 min ved (-20°C) . Fjern aceton: H20 (avfall) og tillat plater å tørke - og lagre ved (-20°C) over natten i eksikator. Vask plater med PBS (5 x 250 ml), tilsett deretter 200 ml BLOTTO-løsning for å hemme ikke-spesifikk binding - dyrk 1 time ved romtemperatur og fjern ICAM-1 antiserum (avfall) og vask plater med PBS (5 x 250 ml), tilsett deretter 100 ml geit anti-mus-HRP antiserumkonjugat (in BLOTTO) - dyrk 1 ved romtemperatur. Fjern antiserum-HRP-konjugat (avfall) og vask plater med PBS (5 x 250 ml), vask deretter med citratbuffer (1 x 300 (il; avfall) . Tilsett 100 ml HRP-substrat og la vokse i 5-20 min ved romtemperatur (tiden kan variere, se fargeutvikling), tilsett 50 ml IN H2S04til kummer for å stoppe reaksjonen. Avles plater ved 490 nm på plateleser. Method: Thaw 1 vial of frozen HUVEC (rapidly at 37°C for ~2 min (5 x 10<5->1 x 10<6>) cells in 1 ml medium), then transfer cells to 45 ml prewarmed growth medium (EGM for HUVEC) in a 225 cm<2> flask (seeded at 2500-5000 cells/cm<2>) and place this in a humidified 37°C incubator with 5% C02. Change medium after 24-30 hours (to remove dead cells and cytopreservatives) and then change every 2-3 days - cells should float together after 5-7 days of growth. Trypsinize cells to remove them from the flask - spin (200 g, 5 min) to pellet cells - resuspend cells in 50 ml medium (need~l-2 x 10<5> cells/ml) and plate 100 ml cell suspension in 96-well , collagen-coated plates (use ~l-2 x. 10<4>cells/well) - let grow together (1-2 days). Remove old nutrient medium (waste) and add 90 ml of fresh medium containing TNF-alpha (or other ICAM-1 stimulator at the desired concentration) or 90 ml of medium alone (for unstimulated control wells). Add 10 ml medium (or PBS or PBS, 1% DMSO) containing compound to be tested (at 10 x desired concentration) or additionally 10 ml medium alone (or PBS or PBS, 1% DMSO) for control wells - (final compound concentration = 1 x; final DMSO concentration = 0.1%, if used) - incubate 4 hours at 37°C. Remove medium (waste) and fix cells in 200 ml 80% acetone: 20% H2 for 20 min at (-20°C). Remove acetone:H20 (waste) and allow plates to dry - and store at (-20°C) overnight in a desiccator. Wash plates with PBS (5 x 250 ml), then add 200 ml of BLOTTO solution to inhibit non-specific binding - incubate for 1 hour at room temperature and remove ICAM-1 antiserum (debris) and wash plates with PBS (5 x 250 ml ), then add 100 ml goat anti-mouse-HRP antiserum conjugate (in BLOTTO) - culture 1 at room temperature. Remove antiserum-HRP conjugate (waste) and wash plates with PBS (5 x 250 ml), then wash with citrate buffer (1 x 300 (ul; waste)). Add 100 ml HRP substrate and allow to grow for 5-20 min at room temperature (time may vary, see color development), add 50 mL IN H2SO4 to wells to stop reaction Read plates at 490 nm on plate reader.

Løsninger for ICAM-1 ELISA:Solutions for ICAM-1 ELISA:

(1) 80% aceton: 20% H20 (vekt:vekt) - lagre ved (-20°C). (2) (lx) Dulbeccos fosfatbufferløsning (DPBS), vekt/o Ca<++>eller Mg<++>, pH 7,5 - (Sigma D-5652, lx pulver eller Sigma D-1408, 10 x væske, fortynne 1:10 før anvendelse). (3) BLOTTO - 5% (vekt:volum) skummet tørrmelk (Carnation eller annen) i DPBS. (4) Mus anti-humant ICAM-1 monoklonalt antise-rum (Research Diagnostics; katalog #RDI-CBL450-lx, anti CD54-klon 15,2) - lagerløsning (1 mg/ml) - fortynne 1:1000 i BLOTTO rett før anvendelse (1 mg/ml endelig antiserumkonsentrasjon). (5) Geit anti-mus IgG-pepperrot peroksidasekonjugat (IgG-HRP, DAKO Corp, katalog # P0447)-lagerløsning (1 mg/ml) - fortynne 1:1000 i BLOTTO rett før anvendelse (1 mg/ml endelig konsentrasjon). (6) Citratbuffer, pH 5,0 - 65,3 mM natriumfosfat (dibasisk, 12-hydrat, MW = 358,4, 23,4 g/l) og 34,7 mM sitronsyre (vannfri, syrefri, MW = 192,1, 6,67 g/l) - sjekk pH (5,0), lagre ved 4°C. (7) HRP-substrat - o-fenylendiamindihydroklorid (OPD, Sigma, P6912, 5 mg OPD/tablett) - tilsett 1 (1) 80% acetone: 20% H20 (wt:wt) - store at (-20°C). (2) (lx) Dulbecco's phosphate buffer solution (DPBS), w/o Ca<++>or Mg<++>, pH 7.5 - (Sigma D-5652, lx powder or Sigma D-1408, 10 x liquid, dilute 1:10 before use). (3) BLOTTO - 5% (w/v) skimmed dry milk (Carnation or other) in DPBS. (4) Mouse anti-human ICAM-1 monoclonal antiserum (Research Diagnostics; catalog #RDI-CBL450-lx, anti CD54 clone 15.2) - stock solution (1 mg/ml) - dilute 1:1000 in BLOTTO dish before use (1 mg/ml final antiserum concentration). (5) Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase conjugate (IgG-HRP, DAKO Corp, catalog # P0447) stock solution (1 mg/ml) - dilute 1:1000 in BLOTTO immediately before use (1 mg/ml final concentration). (6) Citrate buffer, pH 5.0 - 65.3 mM sodium phosphate (dibasic, 12-hydrate, MW = 358.4, 23.4 g/l) and 34.7 mM citric acid (anhydrous, acid-free, MW = 192, 1, 6.67 g/l) - check pH (5.0), store at 4°C. (7) HRP substrate - o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD, Sigma, P6912, 5 mg OPD/tablet) - add 1

tablett/10 ml citratbuffer (ved romtemperatur), tilsett deretter 4 ml 30% H202(Sigma, H1009)/10 ml substratløsning rett før anvendelse - endelig konsentrasjon = 0,5 mg OPD/ml og 0,012% H202. tablet/10 ml citrate buffer (at room temperature), then add 4 ml 30% H202 (Sigma, H1009)/10 ml substrate solution immediately before use - final concentration = 0.5 mg OPD/ml and 0.012% H202.

(8) Human tumornekrosefaktoralfa (TNF-alfa, Boehringer-Manheim, katalog # 1371843) - 10 mg/ampulle (i 1 ml) - 10<8>U aktivitet/mg = IO<6>U/10 mg - fortynnet til 20 ml endoteliaceller basalmedium (EBM) (50000 U/ml, 500 ng/ml) - alikvot 150 ml (7500 U, 75 ng) i eppendorftuber (x 133) - lagre ved 20°C - for hvert eksperiment, tilsett en alikvot til 25 ml EBM - endelig konsentrasjon = 300 U/ml eller 3 ng/ml TNF-alfa. (8) Human tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha, Boehringer-Manheim, catalog # 1371843) - 10 mg/ampoule (in 1 ml) - 10<8>U activity/mg = IO<6>U/10 mg - diluted to 20 ml endothelial cells basal medium (EBM) (50000 U/ml, 500 ng/ml) - aliquot 150 ml (7500 U, 75 ng) in eppendorf tubes (x 133) - store at 20°C - for each experiment, add an aliquot to 25 ml EBM - final concentration = 300 U/ml or 3 ng/ml TNF-alpha.

Test for hemming av human navlestreng (vein) endoteliacelle (HUVEC)/nøytrofil adhesjon Human umbilical cord (vein) endothelial cell (HUVEC)/neutrophil adhesion inhibition assay

Vev: Adhesjon blir utført på human navlestreng endoteliaceller (HUVEC) oppnådd fra Clonetics (Ca# CC2519). Tissue: Adhesion is performed on human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) obtained from Clonetics (Ca# CC2519).

Endepunkt: Konsentrasjon av materiale som hemmer 20% av PMN-adhesjon til HUVECer oppregulert med 300 U/ml av TNFalfa (IC20) Endpoint: Concentration of material that inhibits 20% of PMN adhesion to HUVECs upregulated with 300 U/ml of TNFalpha (IC20)

Metode:Method:

I. Celler:I. Cells:

A. EndoteliacellerA. Endothelial cells

Human navlestreng endoteliaceller (HUVEC) blir kjøpt som frosne celler i 1 ml alikvoter (Clonetic Corporation, San Diego, CA). Endotelia vekstmedia navlestreng (EGM-UV), "bullet kit" additiver, trypsiniseringsreagenser (trypsin nøytraliseringsløsning og HEPES buffer) blir også kjøpt fra Clonetics. Flasken blir plassert ved 37°C i en 5% C02+ 95% luft, 100% fuktighet inkubator. Human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) are purchased as frozen cells in 1 ml aliquots (Clonetic Corporation, San Diego, CA). Endotelia growth media umbilical cord (EGM-UV), "bullet kit" additives, trypsinization reagents (trypsin neutralization solution and HEPES buffer) are also purchased from Clonetics. The bottle is placed at 37°C in a 5% C02+ 95% air, 100% humidity incubator.

En ampulle med væske N2frossen celle blir tint i det 37°C vannbadet, hele ampullen blir plassert i en T-275 flaske med 50 ml friskt media og plassert i C02-inkubatoren. Mediene blir byttet ut 24-48 timer senere. Sammenløp bør finne sted innen 4-5 dager. Mediene blir byttet minst en gang i løpet av denne perioden. Monolaget i flasken blir fraskilt ved anvendelse av trypsinløsningen etter at monolaget er vasket med Hanks balanserte saltløsning (HBSS). De tysiniserte cellene blir sentrifugert ved 200 x Gs i 5 min og resuspendert i omkring 150 ml media. 100 ul alikvoter blir plassert i hvert kar av 96-kum plate som på forhånd ble belagt med kollagen. Monolaget i platen bør flyte sammen innen 48 timer. A vial of liquid N2 frozen cell is thawed in the 37°C water bath, the entire vial is placed in a T-275 bottle with 50 ml of fresh media and placed in the CO2 incubator. The media will be replaced 24-48 hours later. Confluence should take place within 4-5 days. The media is changed at least once during this period. The monolayer in the flask is separated using the trypsin solution after the monolayer is washed with Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). The tysinized cells are centrifuged at 200 x Gs for 5 min and resuspended in about 150 ml of media. 100 µl aliquots are placed in each well of a 96-cm plate that was previously coated with collagen. The monolayer in the plate should flow together within 48 hours.

B. Nøytrofil isoleringB. Neutrophil isolation

Perifere blodpolymorfonukleære nøytrofiler (PMNer) blir isolert ved etablert metodologi (1). Humant blod oppnås fra kubital vene ved venepunktur utført av kvalifisert flebotomist. Blodet blir samlet opp i heparinisert "vacutainer" (Vacutainer #6489, grønt deksel, 15 ml strekk, VWR). Tretti ml blod blir anvendt ved hver test. Det hepariniserte blodet blir fortynnet med okring ^ volum fosfatbufret salt inneholdende 0,2% glukose (PBS-G). En avbrutt gradient Histopaque (3 ml Histopaque-1119 i bunnen og 3 ml Histopaque-1077 på toppen)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) blir fremstilt i 6, 15 ml koniske sentrifugerør. Det fortynnede blodet blir forsiktig lagt på toppen av Histopaque-1077. Rørene blir sentrifugert ved 800 x G i 30 min ved romtemperatur. Etter sentrifugering blir PMNene fjernet ved aspirasjon fra området mellom Histopaque-1077/Histopaque-1119 mellomsjiktet og toppen av de pelleterte røde blodcellene. PMNene blir samlet fra alle rørene, deretter fortynnet til et totalt volum på 30 ml og sentrifugert ved 600 x G i 15 min. Supernatanten blir forkastet og pelleten (som inneholder PMNer og noen røde blodceller) blir behandlet med 6 ml kaldt vann i 30 sekunder til lyse forurensende RBC. Normal osmolaritet blir gjenopprettet ved å tilsette 3 ml 2,7% saltløsning. PMNene blir vasket enda to ganger med PBS-G. Levdyktighet og nummer på PMNene blir bestemt ved å anvende trypanblå eksklusjonstest i et emocytometer tellingsrom. Nå og da blir en liten alikvot av PMNenes suspensjon anvendt for en Cytofuge fremstilling. Cytofuge slide blir flekket med Wrights blodflekker (Sigma Chemical Co.) og en differensiell "court" blir utført for å evaluere prosenten PMNer i fremstillingen. Peripheral blood polymorphonuclear neutrophils (PMNs) are isolated by established methodology (1). Human blood is obtained from the cubital vein by venipuncture performed by a qualified phlebotomist. The blood is collected in a heparinized "vacutainer" (Vacutainer #6489, green lid, 15 ml stretch, VWR). Thirty ml of blood is used for each test. The heparinized blood is diluted with about ^ volume of phosphate-buffered saline containing 0.2% glucose (PBS-G). A discontinuous gradient of Histopaque (3 ml Histopaque-1119 on the bottom and 3 ml Histopaque-1077 on the top) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) is prepared in 6.15 ml conical centrifuge tubes. The diluted blood is carefully placed on top of the Histopaque-1077. The tubes are centrifuged at 800 x G for 30 min at room temperature. After centrifugation, the PMNs are removed by aspiration from the area between the Histopaque-1077/Histopaque-1119 interlayer and the top of the pelleted red blood cells. The PMNs are pooled from all tubes, then diluted to a total volume of 30 ml and centrifuged at 600 x G for 15 min. The supernatant is discarded and the pellet (containing PMNs and some red blood cells) is treated with 6 ml of cold water for 30 seconds to clear contaminating RBCs. Normal osmolarity is restored by adding 3 ml of 2.7% saline. The PMNs are washed twice more with PBS-G. Viability and number of the PMNs are determined by using the trypan blue exclusion test in a hemocytometer counting room. Every now and then a small aliquot of the PMN suspension is used for a Cytofuge preparation. The cytofuge slide is stained with Wright's blood stain (Sigma Chemical Co.) and a differential court is performed to evaluate the percentage of PMNs in the preparation.

II. Oppregulering av endoteliaceller:II. Upregulation of endothelial cells:

Monolagene av endoteliaceller i 96—kum platene blir oppregulert med 300 U/ml tumornekrosefaktor (TNF, Boehinger-Manheim katalog # 1371-843). TNF og forbindelsen blir tilsatt til hvert kar 4 timer før tilsettingen av PMNerPMNer. The monolayers of endothelial cells in the 96-cm plates are upregulated with 300 U/ml tumor necrosis factor (TNF, Boehinger-Manheim catalog # 1371-843). TNF and the compound are added to each vessel 4 hours prior to the addition of PMNs PMNs.

III. Fluorescerende merking av nøytrofiler:III. Fluorescent labeling of neutrophils:

Etter den siste vaskingen blir den nøytrofile pellet resuspendert i 5 ml PBS-G (omtrent 1-3 x lOVml) . 5 (og 6) karboksyfluoriserende diacetat suksinimidylester (CFSE, Molecular Probes, Eugene, OR). Et 20 mM lager av CFSE blir fremstilt ved å oppløse 25 mg i 2,24 ml (MW557, 5) DMSO. 5 (il av lageret tilsettes til 5 ml suspensjon av PMNer for en endelig konsentrasjon av 2 uM. Blandingen blir innkubert i kjøleskapet i 20 minutter. På slutten av denne perioden ble PMNene vasket fire ganger med PBS-G. Etter den siste vasken ble PMNene resuspendert i komplett EGM-UV media til den ønskede konsentrasjon (vanligvis får hvert kar av en 96-kum plate 0,6-1,2 x IO<5>PMNer). After the final wash, the neutrophil pellet is resuspended in 5 ml of PBS-G (approximately 1-3 x 10 ml). 5 (and 6) carboxyfluorescent diacetate succinimidyl ester (CFSE, Molecular Probes, Eugene, OR). A 20 mM stock of CFSE is prepared by dissolving 25 mg in 2.24 ml (MW557.5) DMSO. 5 µl of the stock is added to 5 ml suspension of PMNs for a final concentration of 2 µM. The mixture is incubated in the refrigerator for 20 minutes. At the end of this period, the PMNs were washed four times with PBS-G. After the last wash, the PMNs were resuspended in complete EGM-UV media to the desired concentration (typically each well of a 96-well plate receives 0.6-1.2 x IO<5>PMNs).

IV. Tilsetning av testforbindelserIV. Addition of test compounds

Et hundre (.ti media som inneholder TNF-forbindelsene anvendes for å erstatte mediene i kummene som inneholder monolagene med endoteliaceller 4 timer før tilsetting av PMNer. One hundred and ten media containing the TNF compounds are used to replace the media in the wells containing the monolayers of endothelial cells 4 hours before the addition of PMNs.

V. Adhesjonstest:V. Adhesion test:

A. Innsamling av data:A. Collection of data:

CFSE-merkede nøytrofiler (0,7 til 1,5 x IO<5>) i 10 (il volumer (se III) tilsettes til HUVEC monolagene. Platene inkuberes ved 37°C in en 5% C02+ 95% luft, 100% fuktighet inkubator i 30 min. Ikke-klebende celler fjernes ved sentrifugering i henhold til følgende protokoll: (1) En avlesing blir gjort i Cytofluor 2400 etter inkubering ved 37°C. Denne avlesingen blir vurdert som 100% av cellene som er tilsatt. (2) Kummene blir fylt med varmet (inkubator) media på toppen av kummen med en lett konveks menisk (vanligvis 260 ul (tillegg til de 100 ul eller så som allerede er i kummene)). (3) Kummene blir forseglet ved anvendelse av adhesiv forseglingsfilm for mikroplater (Rainin katalog # 96-SP-100). (4) Lokket erstattes på platen, og størrelsen og plasseringen av enhver boble blir registrert på lokkene med en markør. (5) Lokkene fjernes og foldes (4 bretter) og kuttede biter av papirhåndkle plasseres på toppen av den forseglede film. Platelokket blir deretter erstattet på toppen av papirhåndkleet og platen snues. (6) Platene plasseres på sentrifugens plateholdere (Sorvall Modell ROMTEMPERATUR 6000D) og sentrifugeres ved å skru faren ned til omkring 500 RPMer, deretter blir sentrifugen skrudd på med tidsknappen. Fartskontrollen justeres til takometeret avleser 1100 rpm (dette er ekvivalenten til 200 Gs). Når en fart på 1100 rpm er oppnådd blir en separat timer startet. Etter nøyaktig 2 minutter bringes sentrifugens timer til null for å stoppe motoren. Platene får komme til ro uten bremsing. (7) Platene fjernes og-enhver tom kum registreres. Lokket og det brettede papirhåndkleet fjernes (platene beholdes opp-ned). Den forseglende film fjernes deretter fra avfallsbeholderen for biologisk materiale og mediene ristes ut. Platen blottes deretter på papirhåndkleet og ethvert overskytende fluid suges av. (8) Platen vendes til stående stilling og studeres under mikroskop. (9) En andre avlesing utføres på Cytofluor. Denne andre avlesingen anvendes for å bestemme andelen PMNer som forble fastklebet til monolaget. (10) Informasjonen fra CSV-filene av Cytofluor nedlastes og dataene prosesseres i et EXCEL regneark der bakgrunn (PMNer klebet til ikke-oppregulert endotelium) subtraheres og andelen klebehemming bestemmes som følger: CFSE-labeled neutrophils (0.7 to 1.5 x 10<5>) in 10 µl volumes (see III) are added to the HUVEC monolayers. The plates are incubated at 37°C in a 5% C02+ 95% air, 100% humidity incubator for 30 min. Non-adherent cells are removed by centrifugation according to the following protocol: (1) A reading is taken in Cytofluor 2400 after incubation at 37°C. This reading is considered as 100% of cells added. (2 ) The wells are filled with heated (incubator) media on top of the well with a slightly convex meniscus (typically 260 µl (in addition to the 100 µl or so already in the wells)).(3) The wells are sealed using adhesive sealing film for microplates (Rainin catalog # 96-SP-100). (4) The lid is replaced on the plate and the size and position of any bubble is recorded on the lids with a marker. (5) The lids are removed and folded (4 folds) and pieces cut of paper towel is placed on top of the sealed film.The plate lid is then replaced on top of the paper towel leet and the plate is turned over. (6) The plates are placed on the plate holders of the centrifuge (Sorvall Model ROOM TEMPERATURE 6000D) and centrifuged by turning the speed down to around 500 RPM, then the centrifuge is turned on with the time button. The cruise control is adjusted until the tachometer reads 1100 rpm (this is the equivalent of 200 Gs). When a speed of 1100 rpm is reached a separate timer is started. After exactly 2 minutes, the centrifuge's timer is reset to zero to stop the motor. The plates are allowed to come to rest without braking. (7) The plates are removed and-any empty sumps are recorded. The lid and the folded paper towel are removed (the plates are kept upside down). The sealing film is then removed from the biological waste container and the media is shaken out. The plate is then blotted onto the paper towel and any excess fluid is suctioned off. (8) The plate is turned to an upright position and studied under a microscope. (9) A second reading is performed on Cytofluor. This second reading is used to determine the proportion of PMNs that remained adhered to the monolayer. (10) The information from the CSV files of Cytofluor is downloaded and the data is processed in an EXCEL spreadsheet where background (PMNs adhered to non-upregulated endothelium) is subtracted and the proportion of adhesion inhibition is determined as follows:

(11) EXCEL regnearket kalkulerer a) prosenten PMNer som kleber til monolaget, b) prosenten PMNer som kleber til monolaget minus bakgrunn (PMNer som kleber til ustimulerte endoteliaceller) og (11) The EXCEL spreadsheet calculates a) the percentage of PMNs that adhere to the monolayer, b) the percentage of PMNs that adhere to the monolayer minus background (PMNs that adhere to unstimulated endothelial cells) and

c) prosenten klebehemming for kummene som mottar TFN alene til 0% hemming (negativt c) the percentage of adhesion inhibition for the basins receiving TFN alone to 0% inhibition (negative

antall indikerer økning i klebing).number indicates increase in adhesion).

B. Statistikk, databehandling og lagring: Statistikk utføres ved å anvende den tosidige t-test med lik varians- i EXCEL, og resultatene registrert som P-verdien. B. Statistics, data processing and storage: Statistics are performed by applying the two-sided t-test with equal variance in EXCEL, and the results recorded as the P-value.

IV. Tilleggsinformasjon:IV. Additional information:

A. For å kle kummer med kollagen:A. To dress basins with collagen:

Løs opp 25 mg syreløselig rottehalekollagen 446 ml vann surgjort med få dråper HC1. Steriliser ved filtrering. Tilsett 50 ul til hver kum i 96-kum plate (,28 cm<2>) for 10 ug/kum. La dette inkubere over natten i 37°C inkubatoren. Blås bort væsken og lagre i kjøleskap til anvendelse. Dissolve 25 mg of acid-soluble rat tail collagen in 446 ml of water acidified with a few drops of HC1. Sterilize by filtration. Add 50 µl to each well in 96-well plate (.28 cm<2>) for 10 µg/well. Let this incubate overnight in the 37°C incubator. Blow away the liquid and store in the refrigerator until use.

B. For å fremstille PBS+0,2% glukose (dekstrose): Fremstill 2 liter PBS (Sigma) og tilsett 2 g glukose. Steriliser filter og lagre. B. To prepare PBS+0.2% glucose (dextrose): Prepare 2 liters of PBS (Sigma) and add 2 g of glucose. Sterilize filter and store.

Rottehjerteinfarkt/ reperfusjonsskademodellRat myocardial infarction/reperfusion injury model

Hann Sprague-Dawley rotter bedøves med uretan, 1,25 g/kg ip. En halsarterie og halsblodåre eksternaliseres og det innføres en kanyle med PE-50 tubing for å registrere blodtykket og for å lette intravenøs administrasjon av fargestoff eller medikament. En trakeotomi blir utført. Dyrene blir knyttet til en Harvard Roden Ventilator (Modell 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA) og ventilert ved 1,5 ml/100 g kroppsvekt ved 50 slag/minutt. Nålelektroder plasseres for et lede II elektrokardiogram. Dyrene beholdes ved 37°C ved hjelp av elektriske varmeputer justert til den ønskede temperatur og kontrollert via rektal termistor probe og kontroller. Hjertet blir forsiktig isolert ved en venstre torakotomi og ved femte interkostale rom, og den venstre ytre synkende koronærarterie (LAD) lokaliseres. En ligatur av 6-0 silke plasseres rundt LAD med endende trædde gjennom en liten lengde PE-320 rør for å lette rask okklusjon og reperfusjon av arterien. LAD okkluderes ved fastklemming av suturen og klemt tett rundt hjerteoverflaten ved å anvende 25 mm Schwarz aneurismeklemme. Okklusjon varer i 90 min og etterfølges av reperfusjon i 3,0-4,5 timer. Dyr doseres med medikament eller midler 10 min før reperfusjon av det angrepne området av hjertet ved intravenøs levering via halsblodåren. Simulert-opererte rotter underkastes ikke iskemi eller reperfusjon. Ved slutten av eksperimentet blir LAD permanent re-okkludert og en 10 mg/ml løsning Evans Blue Stain administreres via halsblodårekanylen for å identifisere området som er angrepet av iskemi, dvs. riskområdet (AAR). Det skadede hjertet blir raskt fjernet og plassert i 0,9% saltlake ved 4°C før Male Sprague-Dawley rats are anesthetized with urethane, 1.25 g/kg ip. A carotid artery and vein are externalized and a cannula with PE-50 tubing is inserted to record blood thickness and to facilitate intravenous administration of dye or drug. A tracheotomy is performed. Animals are attached to a Harvard Roden Ventilator (Model 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA) and ventilated at 1.5 ml/100 g body weight at 50 bpm. Needle electrodes are placed for a lead II electrocardiogram. The animals are kept at 37°C using electric heating pads adjusted to the desired temperature and controlled via rectal thermistor probe and controller. The heart is carefully isolated by a left thoracotomy and at the fifth intercostal space, and the left external descending coronary artery (LAD) is located. A ligature of 6-0 silk is placed around the LAD with the end threaded through a short length of PE-320 tubing to facilitate rapid occlusion and reperfusion of the artery. The LAD is occluded by clamping the suture and clamped tightly around the cardiac surface using a 25 mm Schwarz aneurysm clamp. Occlusion lasts for 90 min and is followed by reperfusion for 3.0-4.5 hours. Animals are dosed with drug or agents 10 min before reperfusion of the affected area of the heart by intravenous delivery via the jugular vein. Sham-operated rats are not subjected to ischemia or reperfusion. At the end of the experiment, the LAD is permanently re-occluded and a 10 mg/ml solution of Evans Blue Stain is administered via the carotid cannula to identify the area attacked by ischemia, i.e. the area at risk (AAR). The damaged heart is quickly removed and placed in 0.9% saline at 4°C before

kreatinfosfokinaseaktiviteten (CPK) avsluttes.creatine phosphokinase (CPK) activity is terminated.

Bestemmelse av kreatinfosfokinaseaktivitet:Determination of creatine phosphokinase activity:

Den venstre ventrikulærfrie veggen (LVFW) dissekeres fri fra hjertet og veies. AAR, som definert ved fravær av feil, dissekeres fra LVFW og veies også. AAR homogeniseres i 5 sekunder i 4 ml 0,25 M sukrose som inneholder 1 g i 30 min ved 4°C. Supernatanten dekanteres for å bestemme CPK-aktivitet og pelleten lagres frossen for isolering og test av myeloperoksidaseaktivitet. CPK-aktivitet testes spektrofotometrisk med et kommersielt levert substrat, CPK Assay Vial® (Sigma Diagnostics) ved en bølgelengde på 340 nm ved 24-26°C. The left ventricular free wall (LVFW) is dissected free from the heart and weighed. The AAR, as defined by the absence of defects, is dissected from the LVFW and also weighed. AAR is homogenized for 5 seconds in 4 ml of 0.25 M sucrose containing 1 g for 30 min at 4°C. The supernatant is decanted to determine CPK activity and the pellet is stored frozen for isolation and testing of myeloperoxidase activity. CPK activity is assayed spectrophotometrically with a commercially supplied substrate, the CPK Assay Vial® (Sigma Diagnostics) at a wavelength of 340 nm at 24-26°C.

Bestemmelse av myeloperoksidaseaktivitet:Determination of myeloperoxidase activity:

Myeloperoskidase (MPO) isoleres fra den frosne pelleten etter fremstilling av CPK. Pelleten suspenderes i 50 mM fosfatbuffer, pH6, som inneholder 0,5% heksadcyltrimetylammoniumbromid (HTAB) til en konsentrasjon på omkring 10% sonikert i 10 sekunder og frossen på tørr is. Tre fryse-tine sykluser gjøres med 10 sekunder sonikering mellom syklene. Prøvene kjøles på is i 30 min. etterfulgt av sentrifugering ved 12.500 x g i 15 min ved 4°C. En alikvot av supernatanten testes spektrometrisk for MPO-aktivitet i 50 mM natriumfosfatbuffer, pH6, som inneholder 0,167 mg/ml o-dianisidindihydroklorid og 0,113 ml hydrogenperoksid per 100 ml buffer ved en bølgelengde på 460 nm ved 24-26°C. Myeloperoskidase (MPO) is isolated from the frozen pellet after preparation of CPK. The pellet is suspended in 50 mM phosphate buffer, pH6, containing 0.5% hexadcyltrimethylammonium bromide (HTAB) to a concentration of about 10%, sonicated for 10 seconds and frozen on dry ice. Three freeze-thaw cycles are done with 10 seconds of sonication between cycles. The samples are cooled on ice for 30 min. followed by centrifugation at 12,500 x g for 15 min at 4°C. An aliquot of the supernatant is assayed spectrometrically for MPO activity in 50 mM sodium phosphate buffer, pH6, containing 0.167 mg/ml o-dianisidine dihydrochloride and 0.113 ml hydrogen peroxide per 100 ml buffer at a wavelength of 460 nm at 24-26°C.

Beregning og statistisk analyse:Calculation and statistical analysis:

Resultatene rapporteres som den midlere ± SEM. CPK- og MPO-aktivitet uttrykkes som enheter/g vev, hvor 1 enhet CPK-aktivitet er definert som mengden CPK anvendende 1 ujnol fosfokreatin per minutt. AAR kvantifiseres som vekt% av LVFW. Midlere arterieblodtrykk (MABP) beregnes som en tredjedel av forskjellen mellom systolisk og diastolisk blodtrykk tilsatt til diastolisk blodtrykk. Data analyseres for statistisk signifikans av behanlingsvirkningene ved 95% sikkerhetsnivået ved en koordinert t-test eller ved enveis analyse av varians. The results are reported as the mean ± SEM. CPK and MPO activity are expressed as units/g of tissue, where 1 unit of CPK activity is defined as the amount of CPK using 1 ujnol phosphocreatine per minute. AAR is quantified as wt% of LVFW. Mean arterial blood pressure (MABP) is calculated as one third of the difference between systolic and diastolic blood pressure added to diastolic blood pressure. Data are analyzed for statistical significance of the treatment effects at the 95% confidence level by a coordinated t-test or by one-way analysis of variance.

Oppfinnelsen vedrører metoder for behandling eller forebygging av enhver lidelse eller forstyrrelse som vist over, spesielt reperfusjonsskade, ved å administrere en sikker og effektiv mengde av en 2-karboksamid benzimidazolforbindelse som beskrevet over. Slike behandlingsmetoder kan involvere å administrere en enhetsdoseringsform av slike forbindelser parenteralt, peroralt eller topisk. Parenteral administrasjon inkluderer intravenøs, intramuskulær, sukutan, intraperitoneal eller annen injeksjon av doseringsformen. Peroral administrasjon involverer svelging av doseringsformen og absorpsjon av det aktive fra den gastrointestinale trakt. Topisk administrasjon involverer å kontakte doseringsformen med overflaten av hud eller mukosalt vev, inkludert, men ikke begrenset til de av den fordøyelseskanalen og respirasjonssystemet. The invention relates to methods of treating or preventing any disorder or disorder as shown above, particularly reperfusion injury, by administering a safe and effective amount of a 2-carboxamide benzimidazole compound as described above. Such methods of treatment may involve administering a unit dosage form of such compounds parenterally, orally, or topically. Parenteral administration includes intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal or other injection of the dosage form. Oral administration involves swallowing the dosage form and absorption of the active from the gastrointestinal tract. Topical administration involves contacting the dosage form with the surface of skin or mucosal tissue, including but not limited to those of the digestive tract and respiratory system.

For parenteral administrasjon er mengden 2-karboksamid benzimidazolforbindelse typisk administrert foretrukket fra omkring 2 mg/kg, mer foretrukket fra omkring 5 mg/kg, foretrukket til 2 mg/kg, mer foretrukket til omkring 10 mg/kg. Frekvensen av slik administrasjon er typisk en eller to ganger daglig. En behandlingskur er typisk en enkel dose eller varer fra omkring 1 dag, foretrukket fra omkring 5 dager, til omkring 30 dager, foretrukket til omkring 15 dager. For parenteral administration, the amount of 2-carboxamide benzimidazole compound typically administered is preferably from about 2 mg/kg, more preferably from about 5 mg/kg, preferably to 2 mg/kg, more preferably to about 10 mg/kg. The frequency of such administration is typically once or twice a day. A course of treatment is typically a single dose or lasts from about 1 day, preferably from about 5 days, to about 30 days, preferably to about 15 days.

For peroral administrasjon er mengden 2-karboksamid benzimidazolforbindelse typisk administrert foretrukket fra omkring 5 mg/kg, mer foretrukket fra omkring 10 mg/kg, foretrukket til 25 mg/kg, mer foretrukket til omkring 15 mg/kg. Frekvensen av slik administrasjon er typisk fra en til fire ganger daglig. En behandlingskur er typisk en enkel dose eller varer fra omkring 1 dag, foretrukket fra omkring 5 dager, til omkring 30 dager, foretrukket til omkring 15 dager. For oral administration, the amount of 2-carboxamide benzimidazole compound typically administered is preferably from about 5 mg/kg, more preferably from about 10 mg/kg, preferably to 25 mg/kg, more preferably to about 15 mg/kg. The frequency of such administration is typically from one to four times a day. A course of treatment is typically a single dose or lasts from about 1 day, preferably from about 5 days, to about 30 days, preferably to about 15 days.

Sammensetning og metodeeksemplerComposition and method examples

Følgende ikke-begrensende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Følgende sammensetning og metodeeksempler begrenser ikke oppfinnelsen, men er retningslinjer for fagmannen for fremstilling og anvendelse av forbindelsene, sammensetningene og metodene i henhold til oppfinnelsen. I hvert tilfelle kan andre forbindelser innen oppfinnelsen værer erstatning for esksempelforbindelsen vist under med samme resultater. The following non-limiting examples illustrate the invention. The following composition and method examples do not limit the invention, but are guidelines for the person skilled in the art for the preparation and use of the compounds, compositions and methods according to the invention. In each case, other compounds within the invention can be substituted for the example compound shown below with the same results.

Eksempel AExample A

Farmasøytiske sammensetninger i form av en intravenøs løsning fremstilles ved konvensjonelle metoder, slik som ved å blande følgende: Pharmaceutical compositions in the form of an intravenous solution are prepared by conventional methods, such as by mixing the following:

Når 1 ml av sammensetningen over administreres intravenøst, enten rett før eller rett etter en vevsskade (aneurismereparasjon, koronær bypass, transplantasjon, blødning, organiskemi grunnet hypoperfusjon, sepsis, etc), unngås eller reduseres vevsskade. When 1 ml of the composition above is administered intravenously, either immediately before or immediately after a tissue injury (aneurysm repair, coronary bypass, transplant, bleeding, organic anemia due to hypoperfusion, sepsis, etc.), tissue injury is avoided or reduced.

Eksempel BExample B

Parmasøytiske sammensetninger i væskeform fremstilles ved konvensjonelle metoder, formulert som følger: Pharmaceutical compositions in liquid form are prepared by conventional methods, formulated as follows:

Når 1,0 ml av sammensetningen over administreres intravenøst, enten rett før eller rett etter en vevsskade (aneurismereparasjon, koronær bypass, transplantasjon,<1>Forbindelse i henhold til eksempel 1 kan erstattes med et hvilket som helst av eksemplene 2-14.<2>Forbindelse i henhold til eksempel 1 kan erstattes med et hvilket som helst av eksemplene 2-14. When 1.0 ml of the above composition is administered intravenously, either immediately before or immediately after a tissue injury (aneurysm repair, coronary bypass, transplantation,<1>Compound according to Example 1 can be substituted for any of Examples 2-14.< 2>Compound according to Example 1 can be replaced by any of Examples 2-14.

blødning, organiskemi grunnet hypoperfusjon, sepsis, etc), unngås eller reduseres vevsskade. bleeding, organaemia due to hypoperfusion, sepsis, etc), tissue damage is avoided or reduced.

Mens enkelte utførelser av oppfinnelsen er beskrevet, er det klart for fagmannen at en rekke endringer og modifiseringer av sammensetningene inkludert heri kan gjøres uten å fravike fra oppfinnelsens ånd og virkeområde. While certain embodiments of the invention have been described, it is clear to those skilled in the art that a number of changes and modifications to the compositions included herein can be made without departing from the spirit and scope of the invention.

Claims

1. Forbindelse med strukturen: 1. Connection with the structure:

hvori: (a) RI er valgt fra gruppen bestående av alkyl, aryl, alkoksy og aryloksy, hvor alkyl og aryl i den foretrukne RI inneholder 1-14 karbonatomer, (b) R3 og R4 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, alkyl, alkoksy, alkyl-aryloksy, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino, alkyldelene av de foretrukne R3 og R4 har 1-8 karbonatomer, bortsett fra når R3 og R4 begge er hydrogen, (c) hver R5 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, cyano, alkyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino, alkyldelene av foretrukne R5 har 1-8 karbonatomer, og en optisk isomer, diastereomer eller enantiomer eller blanding derav, et farmasøytisk akseptabelt salt, hydrat eller biohydrolyserbar ester, amid eller imid derav.in which: (a) RI is selected from the group consisting of alkyl, aryl, alkoxy and aryloxy, wherein alkyl and aryl in the preferred RI contain 1-14 carbon atoms, (b) R 3 and R 4 are independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, alkyl, alkoxy, alkyl-aryloxy, alkylthio, amino and mono- or dialkylamino, the alkyl moieties of the preferred R 3 and R 4 having 1-8 carbon atoms, except when R3 and R4 are both hydrogen, (c) each R 5 is independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, cyano, alkyl, hydroxy, alkoxy, thio, alkylthio, amino and mono- or dialkylamino, the alkyl moieties of preferred R 5 having 1-8 carbon atoms, and an optical isomer, diastereomer or enantiomer or mixture thereof, a pharmaceutically acceptable salt, hydrate or biohydrolyzable ester, amide or imide thereof.

2. Forbindelse ifølge krav 1, hvori RI er alkyl eller aryl med fra 2 til 8 karbonatomer, foretrukket er RI alkyl med fra 3 til 8 karbonatomer, alkylet er usubstituert eller substituert med substituenter valgt fra gruppen bestående av halo, hydroksy, C1 -C3 alkoksy, tio, C1 -C3 alkyltio, amino, C1 -C3 mono- eller dialkylamino, fenyl og heterocykel med 5 eller 6 ringatomer, mer foretrukket er RI mettet eller umettet med en dobbelbinding, lineær eller forgrenet eller cyklisk alkyl med fra 3 til 6 karbonatomer.2. Compound according to claim 1, in which RI is alkyl or aryl with from 2 to 8 carbon atoms, preferably RI is alkyl with from 3 to 8 carbon atoms, the alkyl is unsubstituted or substituted with substituents selected from the group consisting of halo, hydroxy, C1 -C3 alkoxy, thio, C1 -C3 alkylthio, amino, C1 -C3 mono- or dialkylamino, phenyl and heterocycle with 5 or 6 ring atoms, more preferably RI is saturated or unsaturated with a double bond, linear or branched or cyclic alkyl with from 3 to 6 carbon atoms.

3. Forbindelse ifølge krav 2, hvori R3 og R4 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogenalkyl, alkoksy, alkyltio, amino og mono- eller dialkyamino, alkyldelene av slik R4 har fra 1 til 6 karbonatomer.3. Compound according to claim 2, in which R3 and R4 are independently selected from the group consisting of hydrogenalkyl, alkoxy, alkylthio, amino and mono- or dialkylamino, the alkyl parts of such R4 having from 1 to 6 carbon atoms.

4. Forbindelse ifølge krav 3, hvori hver R5 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halo, alkyl, alkoksy, alkyltio og mono- eller dialkylamino, alkyldelene av slik R5 har fra 1 til 6 karbonatomer.4. Compound according to claim 3, in which each R5 is independently selected from the group consisting of hydrogen, halo, alkyl, alkoxy, alkylthio and mono- or dialkylamino, the alkyl parts of such R5 having from 1 to 6 carbon atoms.

5. Forbindelse ifølge krav 4, hvori alkyldelene av R3, R4 og R5 delene uavhengig har fra 1 til 3 karbonatomer, usubstituert eller substituert med halo, hydroksy, C1 -C3 alkoksy, tio, C1 -C3 alkyltio, amino og C1 -C3 mono- eller dialkylamino, foretrukket er alkyldelene av R3/ R4 , R5 usubstituert.5. Compound according to claim 4, wherein the alkyl parts of R3, R4 and R5 parts independently have from 1 to 3 carbon atoms, unsubstituted or substituted with halo, hydroxy, C1 -C3 alkoxy, thio, C1 -C3 alkylthio, amino and C1 -C3 mono - or dialkylamino, preferably the alkyl parts of R3/R4, R5 are unsubstituted.

6. Forbindelse ifølge krav 5, hvori RI er fenyl eller benzyl, usubstituert eller substituert med substituenter valgt fra gruppen bestående av halo, C1 -C3 alkyl, hydroksy, C1 -C3 alkoksy, amino og C1 -C3 mono- eller dialkylamino, foretrukket er Ri mettet eller umettet og foretrukket er R3 metoksy eller etoksy.6. Compound according to claim 5, wherein RI is phenyl or benzyl, unsubstituted or substituted with substituents selected from the group consisting of halo, C1 -C3 alkyl, hydroxy, C1 -C3 alkoxy, amino and C1 -C3 mono- or dialkylamino, preferred is R is saturated or unsaturated and preferably R 3 is methoxy or ethoxy.

7. Forbindelse ifølge krav 6, hvori R4 er alkoksy, foretrukket metoksy eller etoksy, mer foretrukket metoksy og R3 og begge R5 er hydrogen.7. Compound according to claim 6, in which R 4 is alkoxy, preferably methoxy or ethoxy, more preferably methoxy and R 3 and both R 5 are hydrogen.

8. Forbindelse ifølge krav 7, hvori R3 er alkoksy og R4 og begge R5 er hydrogen.8. A compound according to claim 7, wherein R3 is alkoxy and R4 and both R5 are hydrogen.

9. Farmasøytisk sammensetning som omfatter: (a) en sikker og effektiv mengde av en forbindelse av et hvilket som helst av kravene 1 eller 6; og (b) farmasøytisk akseptable eksipienter.9. Pharmaceutical composition comprising: (a) a safe and effective amount of a compound of any one of claims 1 or 6; and (b) pharmaceutically acceptable excipients.

10. Fremgangsmåte av å forebygge eller behandle en iskemi-reperfusjonsskade som omfatter å administrere en sikker og effektiv mengde av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 6 til et menneske eller et lavere dyr med behov derav.10. A method of preventing or treating an ischemia-reperfusion injury comprising administering a safe and effective amount of a compound according to any one of claims 1 or 6 to a human or lower animal in need thereof.