NO175871B - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- NO175871B NO175871B NO863458A NO863458A NO175871B NO 175871 B NO175871 B NO 175871B NO 863458 A NO863458 A NO 863458A NO 863458 A NO863458 A NO 863458A NO 175871 B NO175871 B NO 175871B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- yeast
- dna
- fragment
- promoter
- gene
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 173
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 67
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 37
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 190
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 180
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 101
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N desirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 23
- 108010073652 desirudin Proteins 0.000 claims description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 claims description 13
- 108091026908 Downstream promoter element Proteins 0.000 claims description 9
- 108010031145 eglin proteinase inhibitors Proteins 0.000 claims description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 6
- -1 HBVsAg Proteins 0.000 claims description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 5
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 5
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 4
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 3
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims 1
- 102000047823 human PLAT Human genes 0.000 claims 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 34
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 8
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 139
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 104
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 30
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 27
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 24
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 23
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 22
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 22
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 22
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 22
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 21
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 20
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 19
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 18
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 206010033733 Papule Diseases 0.000 description 18
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 18
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 18
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 17
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 17
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 16
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 12
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 9
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 9
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 6
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 5
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 5
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 5
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 4
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 4
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 4
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- FKTJAQKUCINAIF-JNYDFHNISA-N 4-[(1r,2s,3s,4r)-4-(chloromethyl)-4-hydroxy-2-methoxy-3-[(2r,3r)-2-methyl-3-(3-methylbut-2-enyl)oxiran-2-yl]cyclohexyl]oxy-4-oxobutanoic acid Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](OC(=O)CCC(O)=O)CC[C@](O)(CCl)[C@H]1[C@]1(C)[C@@H](CC=C(C)C)O1 FKTJAQKUCINAIF-JNYDFHNISA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 2
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 101100062121 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cyc-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 2
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-benzamido-3-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGNTUZCMJBTHOG-UHFFFAOYSA-N 3-[3-(2,3-dihydroxypropoxy)-2-hydroxypropoxy]propane-1,2-diol Chemical compound OCC(O)COCC(O)COCC(O)CO AGNTUZCMJBTHOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- 101000887163 Gallus gallus Gallinacin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000887166 Gallus gallus Gallinacin-7 Proteins 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000741445 Homo sapiens Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000950847 Homo sapiens Macrophage migration inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 101000851058 Homo sapiens Neutrophil elastase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical group NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010012543 amino-terminal parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001036 exonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 108010087005 glusulase Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940045644 human calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108010008429 immunoglobulin-binding factors Proteins 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003017 in situ immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N trihydridoboron Substances B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Alcoholic Beverages (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Gyroscopes (AREA)
- Led Devices (AREA)
- Graft Or Block Polymers (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstillingen av fremmede polypeptider i gjærverter ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen gjærhybridpromotorer, gjærhybridvektorer, Saccharomyces spec-vert, samt fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid heterologt med gjær.
I løpet av de siste årene har det foregått en stor utvikling innenfor feltet genetisk teknikk, og noen systemer som anvender genetisk manipulerte mikroorganismer, spesielt stammer av enterobakterien Escherichia coli og bakegjær (Saccharomyces cerevisiae), er nå i arbeid. Imidlertid foreligger det et behov for ytterligere og forbedrede systemer, spesielt eukaryotiske systemer, så som gjær, som er egnede for økonomisk og storskalafremstilling av proteiner innenfor industrien. I dag er forskjellige gjærvektorer tilgjengelige for genkloning. For effektiv ekspresjon av fremmede gener i gjær må strukturelt kodende sekvenser kombineres med sterke gjærpromotorer som, fortrinnsvis, bør vise regulatoriske trekk som tillater eksogen kontroll av genekspresjonen. Siden effektivitet og ekspresjon (produkt-dannelse) antas å være en funksjon av, og proporsjonal med, styrken av promotoren som anvendes har forskere innenfor feltet genetisk teknikk vist utviklingen av kraftige promotorsystemer spesiell oppmerksomhet.
In vitro mutagenese av klonede gjærgener som koder for proteiner og deres gjeninnførelse tilbake i gjærceller for funksjonell analyse har tillatt identifikasjon av forskjellige viktige cis-virkende promotorelementer [for en oversikt, se L. Guarente, Cell 36, 799 (1984)]. Dersom man begynner med elementene som flankerer det proteinkodende området ved 5' enden av genet innbefatter disse elementene: et 5' transkribert lederområde, relativt A-T-rikt, noen ganger inneholdende et CAACAACAA (eller beslektet sekvens) motiv,
transkripsjonsinitieringspunkter, anbragt 40 til 60 bp
(enkelte ganger mer) fra translasjonsstartkodonet ATG, som vanligvis viser til et stort antall mRNA-startseter av
forskjellige styrker,
en TATA-boks (i enkelte tilfeller mer enn en), anbragt 40
til 80 bp fra transkripsjonsinitieringspunktene, som antakelig virker som essensielt RN-polymerase II gjenkjenningssete,
oppstrøms aktiveringssete(r) (UAS), antatte målseter for regulatoriske proteiner, anbragt 100 til 300 bp oppstrøm fra TATA-boksen.
UAS virker på en måte som adskiller seg fra de regulatoriske setene som finnes i prokaryoter og ligner mer på forsterker-setene i pattedyrsystemer. Relativt detaljerte data er tilgjengelige fra gjær GAL 1, GAL 7, GAL 10 klyngen hvor et positivt virkende regulatorisk protein (GAL 4 genprodukt) vekselvirker direkte med UAS'en av GAL 1-GAL 10 [Giniger et al, Cell 40, 767 (1985)].
Ved å smelte sammen promotorsekvenser som koder for UAS'en av GAL 1-GAL 10 foran TATA-boksen av gjær CYC 1 genet ble det generert en hybridpromotor hvis transkripsjon nå står under kontroll av UAS'en av GAL 1-GAL 10, dvs. den er GAL-4 genavhengig [L. Guarente et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79, 7410 (1984)]. En tilsvarende konstruksjon ble dannet ved å sammensmelte promotorelementer av CYC 1 og LEU 2 [L. Guarente et al., Cell 36, 503(1984)]. Begge disse eksemplene innbefatter promotorelementer og proteinkodende sekvenser fra gjær, og det finnes ingen indikasjoner som tyder på at disse systemene også fungerer med gener som er fremmede for gjær.
EP-B-0 144 408 og US 4 898 823, beskriver et UAS-element av gjær PGK-genet. Nærværet av et essensielt promotorelement anbragt mellom posisjonene -324 og -4 55 (fra ATG) er vist. Det hevdes at tilsats av dette elementet foran andre promotorer ville potensiere styrken av en hvilken som helst annen gjærpromotor. Imidlertid finnes ikke noe eksempel som støtter denne påstanden, argumentene bygger i sin helhet på negative data (ødeleggelse av en promotor) . Det er meget mulig at elementet er en essensiell del av PGK-promotoren, men det er tvilsomt om et slikt element ville virke som del av en hybridpromotor. I tillegg er UAS'en av PGK ikke knyttet sammen med et regulatorisk signal, dvs. det tillater ikke kontroll av ekspresjonen (transkripsjon av den nedstrøms kodende sekvensen ved et spesifikt fysiologisk signal.
Noen av promotorene for glykolytiske gener innføres i nærvær av glukose. De kan potensielt "slås av" dersom cellene dyrkes i et glukosefritt medium. Dette betyr at gjær-vertsceller ville måtte transformeres og regenereres i et medium hvor glukosen er erstattet med andre karbonkilder (acetat, glycerol, laktat, osv.) for å beskytte cellene mot et potensielt skadelig eller dødelig genprodukt som akkumulerer inne i cellene. Siden akkumulering av protoplaster [A. Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)] eller et salt behandlet med hele celler [Ito et al., J. Bacteriol. 153, 163 (1983)] generelt utføres i et rikt medium for å tillate rask regenerering av cellene og dannelse av kolonier, anvender alle de transformasjonsfremgangsmåtene som i dag benyttes glukose som en karbonkilde. Det er ventet at regenerering og utvinning i et glukosefritt medium fungerer meget dårlig (dersom det i det hele fungerer).
Det er generelt kjent innen teknikken at tidspunktet for ekspresjonen må reguleres for å sikre at proteinet dannes i høye nivåer bare når cellen best kan tåle de store mengdene fremmede proteiner, dvs. utenfor vekstperioden. Det er også ønskelig at regulering av ekspresjonen ikke avhenger av nærværet eller fraværet av den viktigste karbonkilden for mikrobiell vekst, dvs. glukose. Regulerbare og sterke promotorsystemer som oppfyller disse kravene for hensiktsmessig og teknisk anvendelig ekspresjon av fremmede gener fra gjær er knapt kjente innen teknikken. Det foreligger følgelig et behov for utvikling av slike promotorsystemer.
Det er nå overraskende funnet at kombinasjon av TATA-boksområdet av promotorer som kontrollerer ekspresjonen av enzymer innbefattet i den glukolytiske fremgangsmåten som generelt antas å høre til de sterkeste promotorene som i dag er kjent, med øvre promotorelementer av en regulerbar promotor hvis represjon og derepresjon ikke avhenger av nærværet eller fraværet av en viktig komponent av vekstmediet, så som en viktig karbon- eller nitrogenkilde, fører til sterke hybridpromotorer som oppfyller hovedkravene som stilles til teknisk anvendelige promotorsystemer.
Det er et formål ved foreliggende oppfinnelse å anvende hybridpromotorer, spesielt promotorer av glykolytiske gener, bragt under kontroll av UAS'en av syrefosfatase PH05-genet for effektiv ekspresjon av fremmede gener i gjær.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en gjærhybridpromotor, kjennetegnet ved at den innbefatter
(A) et 5' oppstrøms promotorelement innbefattende (i) et DNA-molekyl valgt fra gruppen bestående av BamHI-BstEII-fragmentet mellom nukleotider -274 til -541 av gjær PH05-genet innbefattende oppstrømsaktiveringssekvensen UAS1( PH05), og subfragmenter derav hvori UAS-funksjonen er bevart, og 31 bp DNA-fragmentet av formelen
GAATATATATTAAATTAG CACGTTTT CGCA
CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT
og/eller (ii) et DNA-molekyl valgt fra gruppen bestående av Clal-BstEII-fragmentet mellom nukleotider -174 til -273 av gjær PH05-genet innbefattende oppstrømsaktiveringssekvensen UAS2( PH05) og subfragmenter derav hvori UAS-funksjonen er bevart, og
(b) et 3' nedstrøms promotorelement av gjær GAPDH-genet med start ved nukleotid -300 til -180 og slutt ved nukleotid
-1 av gjær GAPDH-genet.
Før foreliggende oppfinnelse var det innen teknikken ikke kjent om det eksisterer et eller flere oppstrøms aktiveringsseter (eller sekvenser, "UAS") som modulerer transkripsjon av gjær-PH05-genet. PH05-genet koder for en undertrykkbar gjærsyrefosfatase. Den undertrykkes ved høy konsentrasjon av uorganisk fosfat og "derepreseres" under uorganisk fos-fatuthungring [B. Meyhack et al., EMBO-J. 1, 675(1982)].
Analysen av 5'-området av PH05-genet har nå ført til identifikasjon av cis-virkende elementer som modulerer transkripsjonen av PH05-genet. Et 623 bp BamHI-Sall-fragment av 5' området av PH05-genet klonet inne i fagvektoren M13mp9 (rekombinant vektor M13mp9/PH05 Bam-Sal, se europeisk patentpublikasjon nr. 143,081) nedbrytes med eksonuklease Bal31 med utgangspunkt fra Bam-setet og, i et annet forsøk, fra Sal-setet. Følgelig genereres en serie av forkortede PH05-promotorfragmenter som underkastes sekvensanalyse og utstyres med syntetiske EcoRI-forbindelsesledd ved de forkortede endene. Ved kombinasjon av fragmenter forkortet med Sal-setet ("venstrearms promotorfragmenter") med fragmenter som er forkortet ved Bam-setet ("høyrearms promotorfragmenter") dannes en serie utelatelsesmutanter av PH05-promotorområdet som undersøkes vedrørende deres evne til å bevirke ekspresjon av PH05-strukturgenet. Det er også fastslått at utelatelse mellom nukleotidene -225 til -263 fører til en fem gangers reduksjon av syrefosfataseaktiviteten og utelatelse mellom nukleotidene -3 61 til -392 eller mellom nukleotidene -346 til -369 fører til en ti gangers reduksjon av syrefosfataseaktiviteten (for nummerering av nukleotidene se figur 1 i de vedlagte tegningene). Disse virkningene tilskrives oppstrøms aktiveringsseter (UAS) som er essensielle for PH05-ekspresjon. UAS'en i nærheten av nukleotid -365 inneholdes i et 268 bp BamHI-Clal fragment
(nukleotider -274 til -541) av 5' området av PH05-genet og er betegnet UAS' (PH05), mens et UAS-område i nærheten av nukleotid -245 inneholdes i 100 bp Clal-BstEII-fragmentet (nukleotider -174 til -273) av 5'-området av PH05-genet og er betegnet UAS2(PH05).
Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt oppstrøms aktiveringssekvensene UAS1(PH05) og UAS2(PH05) som inneholdes i BamHI-BstEII-fragmentet mellom nukleotidene -174 og -541 av PH05-genet.
Oppfinnelsen vedrører videre oppstrøms aktiveringssekvensen UAS1(PH05) som inneholdes i BamHI-Clal-fragmentet mellom nukleotidene -274 til -541 av PH05-genet og oppstrøms aktiveringssekvensen UAS2(PH05) inneholdt i Clal-BstEII-fragmentet mellom nukleotidene -174 til -273 av PH05-genet.
Spesielt foretrukket er oppstrøms aktiveringssekvensen UAS1 (PH05). Den nøyaktige plasseringen av det UASl regulatoriske signalet innenfor BamHI-Clal-fragmentet kunne bestemmes. Følgelig inneholdes det UASl regulatoriske signalet i et 31 bp DNA-fragment (posisjon -381 til -351 av PH05-promotorområdet). Fortrinnsvis er fragmentet utstyrt på hver side med forbindelsesledd med butte ender inneholdende egnede restriksjonsseter eller med taggete ender som er spesifikke for en restriksjonsendonuklease, så som EcoRI. 31 bp fragmentet har følgende sekvens:
Fremgangsmåten for fremstilling av DNA-fragmenter som inneholder UAS1(PH05) og/eller UAS2/PH05) sekvensene innbefatter spaltning av en DNA som inneholder PH05-genet, PH05-genet eller den 5' terminale delen derav med egnede restriksjonsendonukleaser og isolering av de ønskede fragmentene. For eksempel nedbrytes 623 bp BamHI-Sall-fragmentet av PH05 (supra) inneholdende PH05-promotoren og del av det PH05-kodende området med restriksjonsendo-nukleasene BamHI og BstEII, og det resulterende 368 bp underfragmentet som inneholder begge oppstrøms aktiveringsseter isoleres. På analog måte gir spaltning av det ovenfor nevnte BamHI-Sall-fragmentet med BamHI og Clal eller med Clal og BstEII hhv. 268 bp BamHI-Clal-underfragmentet som inneholder UAS1(PH05) og 100 bp Clal-BstEII-underfragmentet inneholdende UAS2(PH05). Isolering og rensing av fragmentene og underfragmentene utføres ved konvensjonelle fremgangsmåter, f.eks. ved agarosegelelektroforese eller polyakrylamid-gelelektroforese.
DNA-fragmentene som inneholder oppstrøms aktiveringssetene kan forkortes på i og for seg kjent måte, f.eks. ved delvis nedbrytning med en eksonuklease, f.eks. Bal31, på en slik måte at UAS-funksjonen i det forkortede fragmentet bevares. Forkortning kan bevirkes ved 5' enden eller ved 3' enden av fragmentene eller ved begge ender. Seleksjon av de underfragmentene som inneholder UAS-funksjonen bevart utføres som ovenfor, dvs. ved å erstatte de opprinnelige sekvensene inneholdende UAS'ene med de forkortede fragmentene og undersøke de resulterende PH05 promotorutelatelsesmulighetene vedrørende deres evne til å bevirke ekspresjon av PH05-strukturgenet. Fragmentene og de forkortede derivatene derav, som inneholder det ene eller begge oppstrøms aktiveringssetene for PH05-genet kan utstyres med syntetiske forbindelses-sekvenser knyttet til en hvilken som helst ende for å lette konstruksjonen av hybridpromotorer og tilknytning til en vektor.
DNA-fragmentene, så vel som de forkortede derivatene derav, inneholdende oppstrøms aktiveringssetet (setene) av PH05 kan også fremstilles ved kjemisk DNA-syntese ved å anvende konvensjonelle teknikker som er velkjente innen teknikken. Egnede teknikker er samlet av S.A. Narang [Tetrahedron 39, 3
(1983)]. Spesielt kan fremgangsmåtene beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 146,785 benyttes.
Oppfinnelsen er spesielt rettet mot gjærhybridpromotorer innbefattende, spesielt bestående av, et 5' oppstrøms promotorelement innbefattende oppstrøms aktiveringssete(r) av gjær PH05-genet og et 3' nedstrøms promotorelement av et annet gjærgen enn gjær PH05-genet innbefattende transkripsjonsinitieringsseter inneholdende en funksjonell TATA-boks og som slutter nær translasjonsstartkodonet.
5' oppstrøms promotorelementet er spesielt et av DNA-fragmentene angitt ovenfor, spesielt 368 bp BamHI-BstEII-fragmentene inneholdende UAS1(PH05) og UAS2(PH05), eller 268 bp BamHI-Clal-fragmentet inneholdende UAS1(PH05), eller forkortede derivater derav hvori UAS-funksjonen er bevart, så som 31 bp fragmentet inneholdende UAS1(PH05) eller også mindre underfragmenter derav.
3' nedstrøms promotorelementet er fortrinnsvis av avledet fra promotoren av et sterkt eksprimert gjærgen, spesielt fra promotoren av et gjærgen som koder for et glykolytisk enzym, så som promotoren av enolase, glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), 3-fosfoglyceratkinase (PGK), hekso-kinase, pyruvat dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyceratmutase, pyruvatkinase (PyK), triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase-gener. 3' promotorelementene innbefatter TATA-boksen som er involvert i posisjoneringen av enzymet RNA-polymerase II for korrekt transkripsjonsinitiering og de korrekte startpunktene av transkripsjon (hoved mRNA-startpunkter). Nedstrøms for TATA-boksen strekker 3' promotorelementet seg til området mellom hoved mRNA-start- og translasjonsstartkodonet (ATG), fortrinnsvis nær translasjonsstartkodonet. Ved oppstrømssiden av TATA-boksen innbefatter 3' promotorelementene 50 til 150 opprinnelige basepar. Den nøyaktige lengden av denne oppstrøms DNA-sekvensen er ikke vesentlig, i det synes å
være en viss fleksibilitet i avstanden mellom UAS'ene og TATA-boksen.
Det foretrukne 3' promotorelementet ved foreliggende oppfinnelse er avledet fra GAPDH-promotoren som er kjent for å være en av de sterkeste kjente gjærpromotorene innen teknikken [enzymet GAPDH kan utgjøre ca. 5% av tørrvekten av S.cerevisiae, kfr. E.G. Krebs, J. Biol. Chem. 200, 471
(1953)]. Fortrinnsvis starter 3' GAPDH-promotorelementet ved nukleotid -300 til -180 og ender ved nukleotid -1 av GAPDH-genet. I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen innbefatter 3' promotorelementet nukleotider -199 til -1 av GAPDH-genet. I en annen foretrukket utførelse av oppfinnelsen innbefatter 3' promotorelementet nukleotider -263 til -1 av GAPDH-genet.
Hybridpromotorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan inneholde et enkelt UAS(PH05) eller flere UAS(PH05) av samme type, så som UAS1(PH05) , fortrinnsvis arrangert i hode til haleorientering. Med hensyn til 3' promotorelementet kan UAS'ene ha den samme eller den omvendte orienteringen sammenlignet med orienteringen i den genuine PH05-promotoren.
Bestanddelene av hybridpromotorene ifølge foreliggende oppfinnelse, dvs. promotorelementet inneholdende UAS'en(e) av PH05 og promotorelementet inneholdende TATA-boksen, er bundet sammen ved hjelp av syntetiske forbindelsesledd, ved buttendet ligering eller, om mulig, ved hjelp av naturlig forekommende kompatible restriksjonsseter. 5' og 3' ter-minalene av hybridpromotorene ifølge foreliggende oppfinnelse er hensiktsmessig utstyrt med syntetiske forbindelsesledd som tillater ligering til en vektor DNA og, ved 3' enden, tilknytning til et heterologt proteinkodende område.
Hybridpromotorene ifølge oppfinnelsen oppfyller alle kravene som stilles til promotorer som skal kunne anvendes innen bioteknologi. De er sterke, kan induseres av stoffer som er forskjellige fra essensielle karbon- eller nitrogenkilder i vekstmediet, og kan lett håndteres på laboratorieskala og i industriell målestokk.
Fremstillingen av hybridpromotorer inneholdende et 5' oppstrøms promotorelement innbefattende oppstrøms aktiveringssete(r) av gjær PH05-genet og et 3' nedstrøms promotorelement av et annet gjærgen enn gjær PH05-genet innbefattende transkripsjonsinitieringsseter inneholdende en funksjonell TATA-boks og med avslutning nær translasjonsstartkodonet, kan foregå ved forbindelse av et 5' oppstrøms promotorelement inneholdende oppstrøms aktiveringssete(r) av gjær PH05-genet til et 3' nedstrøms promotorelement av et annet gjærgen enn PH05-genet innbefattende en funksjonell TATA-boks og med avslutning nær translasjonsstartkodonet.
I en fordelaktig utførelsesform bevirkes ligering av promotorelementene ved hjelp av syntetiske forbindelsesledd.
De ovenfor nevnte nedstrøms promotorelementene av et annet gjærgen enn PH05-genet fremstilles ved delvis nedbrytning av 5' -enden av en sterk gjærpromotor, f. eks. en av de som er angitt ovenfor, som strekker seg i området mellom hoved mRNA-start- og translasjonsstartkodonet, med en eksonuklease, f.eks. Bal31, og forbindelse av de resulterende 5' butte endene til et syntetisk forbindelsesledd DNA. Det velges promotorelementer som opprettholder transkripsjonsstartsete-(ne) og TATA-boks inneholdende 50 til 150 basepar av sekvenser 5' til TATA-boksen. Seleksjon utføres f.eks. ved å spalte de resulterende promotorelementene med restriksjonsendonuklease som gjenkjenner den syntetiske forbindelses-sekvensen ved 5'-enden og med restriksjonsendonukleasen som gjenkjenner den syntetiske forbindelsesleddsekvensen ved 3'-enden av promotorelementet, og bestemmelse av lengden av det resulterende DNA-fragmentet ved hjelp av agarosegelelektroforese. 3' promotorelementene kan også fremstilles ved kjemisk syntese ved å anvende fremgangsmåter som er kjent innen teknikken.
Hybridpromotorene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for forøket og regulert ekspresjon av pattedyrgener i gjær.
Oppfinnelsen vedrører videre gjærhybridvektorer, kjennetegnet ved at de innbefatter et eller flere DNA-innskudd som hvert innbefatter et DNA-segment som koder for et polypeptid som er heterologt med gjær under transkripsjonskontroll av en gjærhybridpromotor som omtalt ovenfor.
Hybridvektorene ifølge oppfinnelsen er valgt fra gruppen bestående av et hybridplasmid og en lineær DNA-vektor.
Et DNA-segment som koder for et polypeptid som er heterologt til gjær er et DNA (gen) som koder for en lang rekke polypeptider, innbefattende glukosylerte polypeptider, spesielt en høyere eukaryotisk, spesielt pattedyr-, så som dyre- eller spesielt menneskelig opphav, så som enzymer som kan benyttes f.eks. for fremstilling av næringsmidler og for å utføre enzymatiske reaksjoner innen kjemi, eller ikke-enzymatiske polypeptider, som er nyttige og verdifulle for behandling av sykdommer hos mennesker og dyr eller for å forebygge disse, f.eks. hormoner, polypeptider med immun-modulatorisk, anti-viral og anti-tumoregenskaper, anti-stoffer, virale antigener, vaksiner, koaguleringsfaktorer, matvarer o.l.
Eksempler på slike polypeptider er insulin, vekstfaktorer, så som epidermisk, insulinlignende-, mastcelle-, nerve- eller transformerende vekstfaktorer, veksthormoner, så som humane eller bovine veksthormoner, interleukin, så som interleukin-1 eller - 2 , human makrofagmigreringsinhiberingsfaktor (MIF), interferoner, så som humant a-interferon, f.eks. interferon-aA, aB, aD eller aF, P-interf eron, "Y-interferon eller et hybridinterferon, f.eks. et aA-aD- eller et aB-aD-hybridinterferon, hepatitvirusantigener, så som hepatit B over-flate- eller kjerneantigen eller hepatit A virusantigen, plasminogenaktivatorer, så som vevsplasminogenaktivator eller urokinase, tumornekrosefaktor, somatostatin, renin, e-endorfin, immunoglobuliner, så som de lette og/eller tunge kjedene av immunoglobulin D, E eller G, immunoglobulinbin-dingsfaktorer, så som immunoglobulin E bindingsfaktor, kalcitonin, humant kalcitonin beslektet peptid, blodkoagule-ringsfaktorer, så som faktor IX eller VIIIc, eglin, så som eglin C, desulfatohirudin, så som desulfatohirudin variant HVI, HV2 eller PA, eller humant superoksyddismutase. Foretrukne gener er de som koder for et humant a-interferon eller hybridinterferon, human vevplasminogenaktivator (t-PA) , hepatit B virus overflateantigen (HBVsAg) , insulin-lignende vekstfaktor I, eglin C og desulfatohirudin variant
HVI.
Hybridpromotoren er spesielt en av de som er angitt ovenfor.
Hybridvektorene ifølge oppfinnelsen kan inneholde et eller flere DNA-innskudd som hvert innbefatter, bl.a., hybridpromotoren og et DNA-segment som koder for et polypeptid som er heterologt til gjær. Dersom hybridvektorene inneholder flere DNA-innskudd, fortrinnsvis 2 til 4 DNA-innskudd, kan disse være tilstede i en tandemrekke eller ved forskjellige plasseringer i hybridvektoren. Foretrukne hybridvektorer inneholder et DNA-innskudd eller flere DNA-innskudd i en tandemrekke.
I hybridvektorene ifølge foreliggende oppfinnelse, er gjærhybridpromotoren operabelt forbundet med det polypeptidkodende området slik at det sikres effektiv ekspresjon av polypeptidet. I en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse er gjærhybridpromotoren direkte forbundet til det kodende området av det modne polypeptidet med et transla-sjonsstartsignal (ATG) innført ved forbindelsesstedet. Et foretrukket område for sammenføyning av gjærhybridpromotoren til det polypeptidkodende området er området i umiddelbar nærhet til den endogene ATG'en.
I en annen foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse er en signalsekvens innbefattet i konstruksjonen. Egnede signalsekvenser er, f.eks., PH05-signalsekvensen, den for gjærinvertasegenet, eller a-faktor pre-pro sekvensen, og signalsekvenser naturlig forbundet til det polypeptidkodende området som skal eksprimeres. Alternativt kan sammensmeltede signalsekvenser konstrueres. De kombinasjonene foretrekkes som tillater en presis spaltning mellom signalsekvensen og den modne polypeptidsekvensen. Ytterligere sekvenser, så som pro- eller avstandsgiver-sekvenser som kan, eller som ikke kan, bære spesifikke prosesseringssignaler kan også innbefat-tes i konstruksjonene for å lette nøyaktig bearbeidelse av forløpermolekyler. Alternativt kan sammensmeltede proteiner genereres inneholdende interne prosesseringssignaler som tillater egnet modning in vivo eller in vitro. Fortrinnsvis inneholder prosesseringssignalene en Lys-Arg-rest, som gjenkjennes ved hjelp av et gjærendopeptidase anbragt i sekresj onsveien.
Ved ekspresj on av genet, trer genproduktet inn i sekresjonsveien og transporteres til det periplasmiske rommet.. Dersom ytterligere utskillelse gjennom celleveggen i kulturmediet kan oppnås, bør en betydelig økning av utbyttene være mulig. Videre kan utvinningsprosessen forenkles uten at celler brytes. Videre kan polypeptidet utvinnes uten et ytterligere metionin ved N-terminalen, fordi det ikke foreligger noe behov for en ATG som et translasjonsstartsig-nal foran den modne kodende sekvensen. Siden glykosylering er forbundet med sekresjonsveien ventes det fremstilte polypeptidet å være glykosylert (forutsatt at glykosyleringsseter er til stede). Det er flere trekk som gjør glykosylerte polypeptider fordelaktige sammenlignet med uglykosylerte polypeptider: det glykosylerte polypeptidet ligner mer på det genuine polypeptidet fra pattedyrceller enn det uglykosylerte polypeptidet gjør. Videre er den tertiære strukturen av slike proteiner sannsynligvis til en viss grad avhengig av nærværet
av glykosylrester. Det er antatt at karbohydratrester som er tilstede i disse molekylene har en fordelaktig innvirkning på kjemisk stabilitet og på farmakologisk aktivitet.
Fortrinnsvis innbefatter hybridvektorene ifølge oppfinnelsen også den 3' flankerte sekvensen av et gjærgen som inneholder de egnede signalene for transkripsjonsterminering og polyadenylering. Den foretrukne 3' flankerende sekvensen er den for gjær PH05-genet.
Oppfinnelsen vedrører spesielt et lineært DNA-molekyl som i det vesentlige består av en hybridpromotor bestående av et 5' oppstrøms promotorelement med UAS(ene) av gjær PH05-genet og et 3' nedstrøms promotorelement av et annet gjærgen enn PH05-genet innbefattende transkripsjonsinitieringsseter inneholdende en funksjonell TATA-boks, et DNA-segment som koder for et polypeptid som er heterologt til gjær, dette segmentet kontrolleres ved hjelp av nevnte hybridpromotor, og et DNA-segment inneholdende egnet plasserte transkripsjonstermineringssignaler for gjær PH05-genet.
Ved hjelp av de homologe 3' og 5' flankerende sekvensene, er hele den lineære DNA-vektoren innbefattende det polypeptidkodende området stabilt integrert ved PH05-posisjonen i gj ærkromosomet.
Oppfinnelsen vedrører spesielt sirkulære hybridplasmider som bortsett fra hybridpromotoren, det polypeptidkodende området og 3' flankeringssekvensene inneholder ytterligere DNA-sekvens(er) som er ikke-essensielle eller mindre viktige for funksjonen av promotoren, dvs. for ekspresjonen av det polypeptidkodende området, men som kan utføre viktige funksjoner, f.eks. ved formeringen av gjærceller transformert med nevnte hybridvektorer. Den ytterligere DNA-sekvensen (eller sekvensene) kan være avledet fra prokaryotiske og/eller eukaryotiske celler, og kan innbefatte kromosomale og/eller ekstra-kromosomale DNA-sekvenser. For eksempel kan de ytterligere DNA-sekvensene stamme fra (eller bestå av) plasmid DNA, så som bakterielt eller eukaryotisk plasmid DNA, viral DNA og/eller kromosomal DNA, så som bakteriell, gjær eller høyere eukaryotisk kromosomal DNA. Foretrukne hybridplasmider inneholder ytterligere DNA-sekvenser avledet fra bakterielle plasmider, spesielt Escherichia coli plasmid pBR322 eller beslektede plasmider, bakteriofag X, gjær 2\ x plasmid og/eller gjærkromosomal DNA.
Spesielt bærer de ytterligere DNA-sekvensene et gjærreplike-ringsopphav og en selektiv genetisk markør for gjær. Hybridplasmider inneholdende et gjærreplikasjonsopphav, f.eks. et kromosomalt autonomt replikerende segment (ars), opprettholdes ekstrakromosomalt inne i gjærcellen etter transformasjon og replikeres autonomt ved mitose. Hybridplasmider inneholdende sekvenser som er homologe til gjær 2jj plasmid DNA kan også benyttes. Disse hybridplasmidene vil bli integrert ved rekombinasjon inn i 2jj plasmider som allerede er tilstede i cellen eller som vil replikere autonomt. 2\ i sekvenser er spesielt egnede for høyfrekvens-transformasjonsplasmider og gir opphav til et høyt kopian-tall.
Når det gjelder selektive genmarkører for gjær, kan en hvilken som helst genmarkør benyttes som letter seleksjonen for transformanter forårsaket av den fenotypiske ekspresjonen av markøren. Egnede markører for gjær er spesielt de som eksprimerer antibiotisk resistens eller, i tilfelle aukso-trope gjærmutanter, gener som komplementerer vertslesjoner. Tilsvarende gener gir f.eks. resistens til antibiotisk cykloheksimid eller tilveiebringer prototropi i en auksotrop gjærmutant, f.eks. URA3, LEU2, HIS3 eller TRPl-genet. Det er også mulig å anvende som markører strukturgener som er knyttet sammen med et autonomt replikerende segment, forutsatt at verten som skal transformeres er auksotrop for produktet som eksprimeres av markøren.
Med fordel inneholder de ytterligere DNA-sekvensene som er tilstede i hybridplasmidene ifølge oppfinnelsen også et replikeringsopphav og en selektiv genetisk markør for en bakterievert, spesielt Escherichia coli. Det er nyttige trekk som er forbundet med nærværet av et E. coli replikeringsopphav og en E. coli markør i en vertshybridvektor: for det første kan store mengder av hybridvektor DNA oppnås ved vekst og forsterkning i E. coli og, for det andre, utføres konstruksjonen av hybridvektorer hensiktsmessig i E. coli ved anvendelse av hele repertoaret av kloningsteknologi basert på E. coli. E. coli plasmider, så som pBR322 o.l. , inneholder både E. coli replikeringsopphav og E. coli genetiske markører som gir resistens til antibiotika, f.eks. tetracyklin og ampicillin, og anvendes fortrinnsvis som del av gjærhybridvektorene.
Den ytterligere DNA-sekvensen som inneholder, f.eks. replikeringsopphav og genetiske markører for gjær og en bakteriell vert (se ovenfor) betegnes heretter som "vektor DNA" som sammen med gjærpromotoren og det polypeptidkodende området danner et hybridplasmid.
En fordelaktig utnyttelse av foreliggende oppfinnelse er hybridplasmider som er i stand til replikering og fenotypisk seleksjon i en gjærvertsstamme innbefattende en gjærhybridpromotor og en DNA-sekvens kodende for et heterologt polypeptid, hvor DNA-sekvensen er anbragt sammen med transkripsjonsstart- og termineringssignaler så vel som translasjonsstart- og stoppsignaler i hybridplasmidet under kontroll av hybridpromotoren, slik at det i den transformerte gjærstammen eksprimeres slik at polypeptidet dannes.
Hybridvektorene ifølge oppfinnelsen fremstilles ved i og for seg kjente fremgangsmåter, f.eks. ved forbindelse av en hybridpromotor bestående av et 5' oppstrøms promotorelement med UAS av gjær PH05-genet og et 3' nedstrøms promotorelement av et annet gjærgen enn PH05-genet innbefattet transkripsjonsinitieringsseter inneholdende en funksjonell TATA-boks, et DNA-segment som koder for et polypeptid som er heterologt til gjær og 3' flankerende sekvenser av et gjærgen slik at det nevnte DNA-segmentet er under transkripsjonskontroll av nevnte hybridpromotor, og eventuelt innføring av en eller flere fremstilte lineære DNA'er inn i en vektor DNA.
Hensiktsmessig kartlagt lineær eller, fortrinnsvis, sirkulær vektor DNA, f.eks. bakterielt plasmid DNA e.l. (se ovenfor), som inneholder minst et restriksjonssete, fortrinnsvis to eller flere restriksjonsseter, kan anvendes. Fortrinnsvis inneholder vektor DNA allerede replikeringsopphav og genmarkører for gjær og/eller en bakterievert. Vektor DNA spaltes ved anvendelse av en egnet restriksjonsendonuklease. Det begrensede DNA ligeres til det lineære DNA-fragmentet som inneholder, bl.a. gjærhybridpromotoren og DNA-segmentet som koder for polypeptidet. Før eller etter sammenbinding av hybridpromotoren og det polypeptidkodende området (eller også samtidig) er det også mulig å innføre replikeringsopphav og/eller markører for gjær eller en bakterievert. I alle tilfeller bør restriksjons- og rekombineringsbetingelsene velges på en slik måte at det ikke forekommer interferens med de essensielle funksjonene av vektor DNA og av hybridpromotoren. Hybridvektoren kan være oppbygget trinnvis eller ved ligering av to DNA-segmenter som innbefatter alle sekvenser av interesse.
Forskjellige teknikker kan benyttes for å sammenføye DNA-segmenter in vitro. Butte ender (fullstendig base-parede DNA-duplekser) produsert ved hjelp av visse restriksjonsendonukleaser kan direkte ligeres med T4 DNA-ligase. Vanligere er DNA-segmenter forbundet ved deres enkeltkjedede koesive ender og kovalent lukket ved hjelp av DNA-ligase, f.eks. T4 DNA-ligase. Slike enkeltkjedede "koesive terminaler" kan dannes ved spaltning av DNA med en annen klasse endonukleaser som gir taggete ender (de to kjedene av DNA-duplekset spaltes ved forskjellige punkter i en avstand på få nukleotider). Enkle kjeder kan også dannes ved tilsatsen av nukleotider til butte ender eller taggete ender ved å anvende terminal transferase ("homopolymeric tailing" eller ved enkelt å tygge tilbake en kjede av et buttendet DNA-segment med en egnet endonuklease, så som X-eksonuklease. En ytterligere foretrukket fremgangsmåte til fremstillingen av taggete ender består i ligering til de butt-endede DNA-segmentene av et kjemisk syntetisert forbindelsesledd DNA som inneholder et gjenkjenningssete for en tagget ende dannede endonuklease og nedbrytning av det resulterende DNA med den respektive endonukleasen.
For å bli effektivt eksprimert, må genet være egnet plassert med hensyn til sekvenser inneholdende transkripsjons-(gjærhybridpromotor) og translasjonsfunksjoner. For det første må ligeringen av DNA-segmentet innbefattende hybridpromotoren med det polypeptidkodende området oppnås i riktig orientering. Dersom to orienteringer er mulige, bestemmes den korrekte ved konvensjonelle restriksjonsanalyser. Hybridvektorer inneholdende et ukorrekt polypeptidgeninnskudd reorienteres ved å skjære ut geninnskuddet med en egnet restriksjonsendonuklease og å religere genet med hybridvek-torfragmentet. I et hvert tilfelle unngås uriktig orientering ved å ligere to DNA-segmenter, hvert med forskjellige restriksjonsseter ved endene. Videre bør konstruksjonen av hybridvektoren utføres på en slik måte at den tillater korrekt transkripsjonsinitiering og -terminering. Når det gjelder det sistnevnte punktet bør transkriptet fortrinnsvis slutte i en DNA-sekvens avledet fra gjærkromosomalt DNA eller gjær 2\ i plasmid. Det er fordelaktig at transkriptet ender i en DNA-sekvens inneholdende transkripsjonstermineringssignaler av et gjærgen, f.eks. av PH05 eller TRP1. For det andre må en egnet leseramme opprettes. Vanligvis er nukleotidsekvensen av promotorområdet og det polypeptidkodende området kjent før ligering, eller kan lett bestemmes, slik at det ikke forekommer noen problemer ved etablering av den korrekte leserammen.
Dersom den direkte ekspresjonen av modent polypeptid er ønsket, må signalsekvenser eller deler derav som eventuelt følger etter hybridpromotorområdet og/eller som eventuelt følger foran det modne polypeptidkodende området elimineres, f.eks. ved nedbrytning med en eksonuklease, f.eks. med Bal3l. Et foretrukket område for direkte sammenføyning av en gjærpromotor til den polypeptidkodende sekvensen er mellom hoved mRNA-start- og ATG-translasjonsstartkodonet. For en sammenføyning i dette området bør den polypeptidkodende sekvensen ha sin egen ATG for translasjonsinitiering, eller den må ellers utstyres med et ytterligere syntetisk oligonukleotid. Gjærhybridpromotoren kan også være forbundet til den polypeptidkodende sekvensen ved hjelp av et syntetisk oligodeoksynukleotid som et sammenføyende molekyl.
Følgelig kan hybridpromotorområdet, om mulig, være begrenset nær 3'-terminalen slik at det mangler et forhåndsbestemt antall basepar. Analogt kan den polypeptidkodende sekvensen være begrenset nær 5'-terminalen. Et syntetisk oligodeoksynukleotid kan da konstrueres på en slik måte at gjærhybridpromotoren og den polypeptidkodende sekvensen ved sammenføyning via det forbindende oligodeoksynukleotidet gjenoppretter de manglende baseparene innbefattende et ATG-translasjonsinitieringssignal og den polypeptidkodende sekvensen befinner seg i den riktige leserammen relativt til promotoren.
Ligeringsblandingen inneholdende den ønskede hybridvektoren anvendes direkte i transformasjonstrinnet eller anrikes først for hybridvektoren, f.eks. ved gelelektroforese, og anvendes deretter for transformasjon.
Mellomprodukter, så som vektorer som fremdeles mangler en eller flere essensielle funksjoner, såvel som de endelige hybridvektorene ifølge oppfinnelsen transformeres eventuelt i en bakterievert, spesielt E. coli, av ovenfor nevnte grunner
(f.eks. fremstilling av store mengder av hhv. mellomprodukter og hybridplasmider). Bakterieverter, så som E. coli plasmidet pBR322 og de fragmentene derav som inneholder et bakterielt replikeringsopphav og genmarkører er de mest foretrukne vektorene av denne grunn. Ved anvendelse av en slik bakteriell vektor, innbefatter de endelige trinnene for fremstillingen av gjærhybridvektorene fortrinnsvis også innføringen av en genmarkør og et replikeringsopphav for gjær.
Nyttige gjærtyper innbefatter spesies av genera Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Rhodoturula, Torulopsis og beslektede genera (kfr. J. Lodder, "The Yeasts", Amsterdam 1971) , spesielt stammer av Saccharomyces cerevisiae.
Transformasjonen av gjær med hybridvektorene kan oppnås ved fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, f.eks. ved fremgangsmåten beskrevet av Hinne et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)]. Denne fremgangsmåten kan inndeles i tre trinn:
(1) Fjernelse av gjærcelleveggen eller deler derav.
(2) Behandling av de "nakne" gjærcellene (sfæroplaster) med det transformerende DNA'et i nærvær av PEG (polyetylenglykol) og CA<2+->ioner. (3) Regenerering av celleveggen og seleksjon av de transformerte cellene i et fast lag av agar.
Foretrukne fremgangsmåter:
ad (1): Gjærcelleveggen fjernes enzymatisk ved å anvende forskjellige preparater av glukosidaser, så som snegletarm-safter (f.eks. "Glusulase" eller "Helicase") eller enzymblan-dinger oppnådd fra mikroorganismer (f.eks. "Zymolyase") i osmotisk stabiliserte oppløsninger (f.eks. IM sorbitol).
ad (2) : Gjærsfæroplastene aggregerer i nærvær av PEG og lokale sammensmeltninger av de cytoplasmiske membranene induseres. Genereringen av "smeltelignende" betingelser er
avgjørende og mange transformerte gjærceller blir diploide eller også triploide under transformasjonsprosessen. Fremgangsmåter som tillater seleksjon av smeltede sfæroplaster kan anvendes for å anrike transformantene, dvs. transformerte celler kan lett utvelges blant på forhånd selek-terte fusj onsprodukter.
ad (3) : Siden gjærceller uten cellevegg ikke deler seg må celleveggen regenereres. Denne regenereringen utføres hensiktsmessig ved å neddykke sfæroplastene i agar. For eksempel blandes smeltet agar (ca. 50°C) med sfæroplastene. Ved avkjøling av oppløsningen til gjærveksttemperaturer (ca. 30°C) oppnås et fast lag. Dette agarlaget forhindrer rask diffusjon og tap av viktige makromolekyler fra sfæroplastene og derved lettes regenereringen av celleveggen. Imidlertid kan celleveggregenerering også oppnås (riktignok med lavere effektivitet) ved å belegge sfæroplastene på overflaten av på forhånd fremstilte agarlag.
Fortrinnsvis fremstilles regnereringsagaren på en slik måte at regenerering og seleksjon av transformerte celler tillates samtidig. Siden gjærgener som koder for enzymer av den aminosyrebiosyntetiske fremgangsmåten generelt benyttes som selektive markører (supra) utføres regenereringen fortrinnsvis i en gjær-minimalt-mediumagar. Dersom svært høye effektiviteter ved regenereringen er påkrevet, er den følgende to-trinns fremgangsmåten fordelaktig: (1) regenerering av celleveggen i et rikt komplekst medium, og (2) seleksjon av de transformerte cellene ved replikabelegging av cellelaget på selektive agarplater.
Dersom hybridvektoren ikke inneholder noe markørgen kan de transformerte cellene også identifiseres ved hjelp av alternative fremgangsmåter. Slike fremgangsmåter innbefatter f.eks. in situ hybridisering med et merket DNA-fragment som er homologt med sekvenser av hybridvektor (f.eks. ifølge Hinnen et al., supra), in situ immunoanalyser forutsatt at et antistoff for produktet av det innførte genet er tilgjen-gelig, eller andre sorteringsfremgangsmåter som måler genprodukter kodet av det transformerende plasmidet (plasmidene) .
Alternativt kan gjæren samtransformeres med en hybridvektor ifølge oppfinnelsen og en andre vektor inneholdende en genetisk markør for gjæren. Dersom de to forskjellige vektorene har DNA-sekvenser til felles (disse kan være bakterielle sekvenser til stede på vektorene), finner rekombinasjon sted, hvilket fører til et sammensmeltet selekterbart hybridmolekyl.
Gjæren kan også samtransformeres med en lineær DNA-vektor bestående av gjærhybridpromotoren, det heterologe polypeptidkodende område kontrollert ved hjelp av hybridpromotoren og transkripsjonstermineringssignaler for gjær PH05-genet, og en vektor inneholdende en selektiv markør for gjær. Samtransfor-mas jon tillater anrikning av de gjærcellene som har tatt opp DNA som ikke direkte kan selekteres. Idet kompetente celler tar opp en hvilken som helst type DNA vil en høy prosentandel celler transformert ved en selektiv vektor også romme eventuelt ytterligere DNA (så som det ovenfor nevnte lineære DNA) . På grunn av tilstrekkelig lange homologe sekvenser (f.eks. 20 til 100 deoksynukleotider i lengde) vil polypep-tidgenet være stabilt integrert i vertskromosomet. Den spesifikke konstruksjonen av foreliggende oppfinnelse vil føre til en stabil integrering av det heterologe genet ved den kromosomale plasseringen ved PH05-genet, dvs. i gjær-kromosom II.
De oppnådde gjærstammene inneholdende hybridplasmidene kan forbedres når det gjelder fremstilling av heterologe polypeptider ved mutasjon og seleksjon ved å anvende fremgangsmåter som er kjent innen teknikken. Mutasjonen kan f.eks. bevirkes ved U.V. bestråling eller ved hjelp av egnede kjemiske reagenser.
Det er funnet at transformasjon med hybridvektorene ifølge oppfinnelsen og regenerering av celleveggene i rikt medium inneholdende glukose som karbonkilde hensiktsmessig kan utføres og er vesentlig enklere enn de tilsvarende trinnene utført med hybridvektorer som inneholder konvensjonelle promotorer som kan induseres ved hjelp av glukose som på forhånd må være fremstilt i glukosefritt medium for å forhindre akkumulering av potensielt letalt genprodukt inne i cellene.
Oppfinnelsen vedrører videre Saccharomyces spee.-verter, kjennetegnet ved at den er transformert med en hybridvektor som omtalt ovenfor, og i stand til å uttrykke genet som koder for polypeptidet som er heterologt med gjær.
Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid heterologt med gjær kjennetegnet ved at en transformert Saccharomyces vert som omtalt ovenfor dyrkes, produksjon av det heterologe polypeptidet induseres og polypeptidet isoleres.
De transformerte gjærcellene kultiveres ved fremgangsmåter som er kjent innen teknikken i et flytende medium inneholdende assimilerbare kilder av karbon, nitrogen, uorganiske salter og, om nødvendig, vekstfremmende stoffer.
Forskjellige karbonkilder kan benyttes. Eksempler på foretrukne karbonkilder er assimilerbare karbohydrater, så som glukose, maltose, mannitol eller laktose, eller et acetat, så som natriumacetat, som kan benyttes alene eller i egnede blandinger. Egnede nitrogenkilder innbefatter, f.eks., aminosyrer, så som casaminosyrer, peptider og proteiner og deres nedbrytningsprodukter, så som trypton, pepton eller kjøttekstrakter, videre gjærekstrakt, maltekstrakt, maisut-trekksvæske, så vel som ammoniumsalter, så som ammoniumklo-rid, sulfat eller nitrat, som kan benyttes enten alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salter som kan benyttes innbefatter f.eks. sulfater, klorider, fosfater og karbonater av natrium, kalium, magnesium og kalsium. I tillegg kan næringsmediet også inneholde vekstfremmende stoffer. Stoffer som fremmer vekst innbefatter f.eks. vekstpromotorer, sporelementer, så som jern, sink, mangan o.l., eller individuelle aminosyrer.
Siden hybridpromotorene ifølge foreliggende oppfinnelse er regulerte, må sammensetningen av næringsmediet også tilpasses til vekstfasene. Under vekstperioden vil konsentrasjonen av hybridpromotorene ifølge oppfinnelsen reduseres under høy fosfatkonsentrasjon. For eksempel vil den mest foretrukne hybridpromotoren ifølge oppfinnelsen som innbefatter et 5' oppstrøms promotorelement av PH05 med UAS'ene av PH05 og et 3' nedstrøms promotorelement av GAPDH med TATA-boksen, reduseres med en faktor på ca. 50 under disse betingelsene. Derfor vil potensielt toksiske genprodukter syntetiseres i svært lave mengder og uheldige virkninger på cellemetabolis-men minimaliseres. Når en tilstrekkelig celletetthet er nådd, reduseres fortrinnsvis de uorganiske fosfatnivåene i næringsmediet (lavt P<1> medium). Deretter forøkes ("derepres-sed") hybridpromotorene ifølge oppfinnelsen og maksimale nivåer av mRNA-transkripter oppnås.
Kultiveringen utføres ved å anvende konvensjonelle teknikker. Kultiveringsbetingelsene, så som temperatur, pH for mediet og fermenteringstiden velges på en slik måte at maksimale nivåer av det ønskede polypeptidet fremstilles. Generelt utføres vekst under aerobe betingelser i neddykkede kulturer med risting eller omrøring ved en temperatur på 25° C til 35° C, ved en pH-verdi på fra 4 til 8, f.eks. ca. pH 7 og i 4 til 20 timer, fortrinnsvis inntil maksimale utbytter av de ønskede proteinene oppnås.
Isoleringen og rensingen av de eksprimerte polypeptidet, utføres, om ønsket, ifølge kjente fremgangsmåter innen teknikken.
Etter at de transformerte cellene er dyrket til en tilfreds-stillende celletetthet består det første trinnet for utvinningen av det eksprimerte proteinet i frigjøring av proteinet fra det indre av cellen. Ved de fleste fremgangsmåtene fjernes celleveggen først ved enzymatisk nedbrytning, f.eks. med glukosidaser. Deretter behandles de resulterende sfæroplastene med rensemidler, så som "Triton". Alternativ er mekaniske krefter, så som skjærkrefter (f.eks. "X-press", "French-press") eller risting med glassperler, egnet for nedbrytning av celler. Den resulterende blandingen anrikes med det ønskede polypeptidet ved konvensjonelle fremgangsmåter, så som fjernelse av det meste av det ikke-proteinholdige materialet ved behandling med polyetylenimin, utfelling av proteinene ved metning av oppløsningen med ammoniumsulfat eller trikloreddiksyre, gelelektroforese, dialyse, kromatografi, f.eks. ionevekslingskromatograf i, størrelsesutelukkelseskromatografi, HPLC eller reversfase HPLC, molekylær sikting på en egnet "Sephadex" kolonne, e.l. Den endelige rensingen av det på forhånd rensede produktet oppnås, f.eks. ved hjelp av antistoffaffinitetskromatografi.
I det tilfelle hvor det ønskede polypeptidet utskilles ved hjelp av gjærcellen i det periplasmatiske rommet, kan en forenklet fremgangsmåte benyttes: Polypeptidet kan utvinnes uten cellelyse ved enzymatisk fjernelse av celleveggen eller ved behandling med kjemiske midler, f.eks. tiolreagenser eller EDTA, som gir opphav til celleveggskader som tillater at polypeptidet frigis. I det tilfelle hvor polypeptider utskilles i kulturbuljongen kan det utvinnes direkte fra denne.
En blanding av glykosylerte og uglykosylerte proteiner som er oppnådd kan separeres f.eks. ved kromatografi på en conkana-valin-A "Sepharose" kolonne. Uglykosylerte produkter vil passere gjennom kolonnen mens glykosylerte produkter selektivt vil absorberes og kan elueres ved hjelp av konvensjonelle midler, f.eks. a-metylenmannosid sammen med et kaotropt middel, så som KSCN.
Det er også mulig å fjerne glykosylrester enzymatisk, f.eks.
ved virkningen av endoglykosydase H eller F. Denne fremgangsmåten tillater fremstilling av uglykosylerte produkter i det vesentlige ren form.
I den følgende eksperimentelle delen er forskjellige utførelser av foreliggende oppfinnelse beskrevet med referanse til de vedlagte tegningene, hvori: Figur 1 viser DNA-sekvensen av BamHI-Sall fragmentet av PH05-promotorområdet.
Figur 2 gjengir DNA-sekvensen av promotorområdet av GAPDH
[klon 491, kfr. G.A. Bitter et al., Gene 32, 263 (1984)].
Figur 3 viser skjematisk fremstillingen av plasmid pGAPDH-EL. Figur 4 viser 3' promotorelementer av GAPDH-genet anvendt ved foreliggende oppfinnelse. Figur 5 er et diagram som viser fremstillingen av plasmid pJDB207R/ PH05-EGL. Figur 6 viser konstruksjonen av plasmidet pJDB207/PAPEL-EGL (UASl). Figur 7 er et skjematisk diagram som viser isoleringen av et DNA-fragment som koder for modent desulfatohirudin. Figur 8 viser skjematisk fremstillingen av plasmid pJDB207/ PH05-HIR. Figur 9 viser skjematisk konstruksjonen av plasmid pJDB207/ PH05(Eco)-HIR. Figur 10 er et skjematisk diagram som viser konstruksjonen av plasmid pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1+UAS2).
Følgende eksempler tjener til å illustrere foreliggende oppfinnelse.
EKSEMPEL 1: KONSTRUKSJON AV PH05 PROMOTORUTSLETTELSER
a) Bal31 nedbrytning
Rekombinant fag M13mp9/PH05 Bam-Sal inneholdende BamHI-Sall-fragmentet av PH05 angitt i fig. 1 benyttes som en kilde for PH05-promotoren (se europeisk patentpublikasjon nr. 143,081). 20 pg av fag DNA' et (RF: replikativ form) nedbrytes med restriksjonsendonuklease Sali, hvilket resulterer i en lineær DNA på ca. 9 kb. Etter ekstraksjon med fenol/kloroform utfelles DNA med etanol. DNA resuspenderes i 10 mM Tris pH 8,0 ved en konsentrasjon på 0,5 pg/ml. 16 pg av Sali spaltet DNA nedbrytes med 2 U eksonuklease Bal31 (BRL) i 100 pl av 20 mM Tris pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl2, 12 mM CaCl2 og 1 mM EDTA. Porsjoner på 2 pg DNA fjernes etter 1, 2, 3, 4, 5 og 6 minutters inkubering ved 30°C og blandes øyeblikkelig med 50 pl fenol og 60 pl TNE. Etter ekstraksjon med fenol/kloroform og etanolutfelling resuspenderes DNA i 10 mM Tris pH 8,0 ved en konsentrasjon på 100 pg/ml. For å analysere omfanget av eksonukleolytisk spaltning ved hjelp av Bal31 nedbrytes 0,5 pg DNA fra hvert tidspunkt med endonuklease BamHI og analyseres på en 1,5% agarosegel i Tris-boratbuffer pH 8,3 (90 mM Tris-HCl, pH 8,3, 90 mM borsyre, 2,5 mM EDTA). Gjennomsnittlig 100 bp fjernes fra hver ende av fragmentet pr. minutt Bal31 nedbrytning.
b) Tilsats av EcoRI- forbindelsesledd til den Bal31- behandlede
DNA
To A260 enheter av EcoRI-forbindelsesledd (5'-GGAATTCC-3', BRL) resuspenderes i 250 pl 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA. 2 pg av EcoRI-f orbindelsesledd kinaseres i 75 pl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 15 mM DDT, 10 pM ATP og 33 U av T4 polynukleotidkinase (Boehringer) . Etter 1 time ved 37"C får blandingen avkjøles til romtemperatur og lagres deretter ved -20'C.
De rekombinerte, dobbeltkjedede EcoRI-forbindelsesleddene ligeres med deres butte ender til de Bal31-behandlede DNA-fragmentene. Et halvt mikrogram Bal31-behandlet DNA (se eksempel la) inkuberes i 16 timer ved romtemperatur med et 50 gangers overskudd av kinaserte EcoRI-forbindelsesledd i 20 pl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP og 600 U T4 DNA-ligase (Biolabs.). Etter inaktivering av T4 DNA-ligasen (10 minutter ved 65°C) avspaltes overskuddet av EcoRI-f orbindelsesledd ved hjelp av 50 U av EcoRI (Boehringer) i et volum på 50 pl. DNA ekstraheres ved fenol/kloroform, utfelles med etanol og resuspenderes i 10 mM Tris, 1 mM EDTA (= TE). Deretter avspaltes DNA med 5 enheter BamHI (Biolabs) og blandingen påføres på en 1,5% lavtsmeltende agarosegel (Sigma) i Tris-boranbuffer (se ovenfor). Båndene farges med etidiumbromid og visualiseres under langbølget UV-lys ved 3 66 nm. De brede diffuse båndmønsterne mellom 100 bp og 600 bp skjæres ut av gelen og DNA ekstraheres på følgende måte: Stykket av agarose flytendegjøres ved 65"C, reguleres til 500 mM NaCl og inkuberes ved 65 °C i 20 minutter. En volumdel fenol (bragt til likevekt med 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl) tilsettes. Den vandige fasen gjenekstraheres to ganger med fenol og en gang med kloroform. DNA utfelles med 2,5 volumdeler kald absolutt etanol og samles ved sentrifugering. DNA-pelleten vaskes med kald 80% etanol og tørkes deretter i vakuum. DNA resuspenderes i 10 pl TE.
c) Ligerin<g> i M13mp9
3 pg av RF av M13mp9 nedbrytes med 15 enheter EcoRI (Biolabs)
og 15 enheter BamHI (Boehringer) i et volum på 50 pl. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling resuspenderes DNA i 50 pl TE. 5 pl av utskåret vektor DNA (ca. 200 ng) blandes med 10 pl av de ovenfor nevnte prøvene (DNA-fragmenter som er
oppnådd ved forskjellige Bal31-nedbrytninger som beskrevet i eksempel lb) og ligeres i et samlet volum på 20 pl i nærvær av 60 mM Tris/HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP og 200 U T4 DNA-ligase i 15 timer. Transduksjon av intakte celler av stammen E. coli JB101 utføres ifølge manualen "M13 cloning and sequencing system" publisert av New England Biolabs. Fager fra et antall hvite plater dyrkes og analyseres med henblikk på størrelsen av deres DNA-innskudd ved spaltning med restriksjonsenzymene EcoRI og BamHI.
d) Bestemmelse av Bal31- utslettelsesendepunkter ved Sanqer-sekvenserinq ( utslettelser fra Sall- setet)
Sekvensering utføres ved å anvende dideoksy DNA-sekvense-ringssystemet ifølge Sanger et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74 , 5463 (1977)] som beskrevet i den ovenfor nevnte manualen. Utslettelsesendepunktene er angitt nedenfor:
e) Bestemmelse av Bal31- utslettelsesendepunkter ved Sanger-sekvenserinq ( utslettelser fra BamHI- setet)
En tilsvarende serie Bal31-utslettelser utføres som beskrevet under a-c, bortsett fra at M13mp9 PH05 Bam-Sal skjæres ved hjelp av BamHI. De Bal31-nedbrutte molekylene skjæres ved hjelp av EcoRI og Sali, og de genererte fragmentene klones inn i M13mp9 nedbrutt med EcoRI og Sali. Utslettelsesendepunktene er angitt nedenfor:
f) Konstruksjon av indre PH05- promotorutslettelser
Bal31-utslettelsesserien beskrevet under d) gir et "venstre
arms" PH05-promotorfragment som ender med et EcoRI-sete og Bal31-utslettelsesserien beskrevet under e) gir et "høyre
arms" PH05-promotorfragment som ender med et EcoRI-sete. Ved å kombinere "venstre armer" og "høyre armer" av forskjellige posisjoner dannes interne utslettelser som inneholder et EcoRI-forbindelsessegment ved setet for den utslettende DNA. De individuelle interne utslettelsene konstrueres ved å skjære "venstre armene" og "høyre armene" fra M13mp9-derivatene ved hjelp av restriksjonsendonukleaser EcoRI og BamHI (venstre armer) eller CoRI og Sali (høyre armer) og isolere de korresponderende fragmentene ved hjelp av myk agarosegelelektroforese som beskrevet under b) . Ekvimolare mengder av "venstre armer", "høyre armer" og 200 ng BamHI og Sali nedbrutt M13mp9 vektor DNA ligeres som beskrevet under
c). Etter transduksjon i E. coli JM101 utplukkes hvite plater, RF dannes og analyseres ved hjelp av restriksjonsanalyse (BamHI, Sali, EcoRI). Følgende armer kombineres slik at det dannes spesifikke interne utslettelser (for nummerering av nukleotidene, se fig. 1):
EKSEMPEL 2: IN VIVO ANALYSE AV DE INTERNE UTSLETTELSENE AV PH05-PROMOTOREN
De forskjellige utslettelsene beskrevet i eksempel lf) klones inn i plasmid pJDB207/PHO5 "R. Haguenauer-Tsapis og A. Hinnen, Molecular and Cellular Biology, 4, 2668-2675 (1984)" ved å erstatte den ville typen av PH05 Bam-Sal-fragment med den utslettede versjonen. Etter transformasjon av gjærstamme S. cerevisiae AH216 (kfr. europeisk patentpublikasjon nr. 143,081) bestemmes syrefosfataseaktiviteten som beskrevet av Toh-e et al. [J. Bacteriol. 113, 727 (1973)]. Utslettelser All og A12 viser en ca. 10 gangers reduksjon av PH05-aktivitet og definerer et oppstrøms område ("oppstrøms aktiveringssete", UAS) som er essensielt for PH05-ekspresjon. En tilsvarende reduksjonseffekt observeres for utslettelse A17 (ca. 5 gangers reduksjon) og for TATA-boksutslettelsene A23-A26 (ca. 30 gangers reduksjon. Alle andre utslettelser viser aktiviteter av tilnærmet vild type nivå. Disse resultatene tyder på at tre områder for essensiell informa-sjon for PH05-ekspresjon finnes ved følgende posisjoner:
1. mellom posisjonene -349 og -383 (UASl)
2. mellom posisjonene -225 og -263 (UAS2)
3. mellom posisjonene - 87 og -125 (TATA-boks) DNA-fragmenter inneholdende UASl eller UAS 2 eller UASl og UAS2 av PH05 kan fremstilles fra rekombinant fag M13mp9/PH05 Bam-Sal (kfr. eksempel 1) ved spaltning med egnede restriksjonsendonukleaser. UASl inneholdes i et 268 bp BamHI-Clal-fragment som har formelen • UAS2 inneholdes i et 100 bp Clal-BstEII-fragment som har formelen
og både UASl og UAS2 er tilstede i det 368 bp BamHI-BstEII-fragmentet som har formelen
EKSEMPEL 3: KONSTRUKSJON AV SAMMENSMELTEDE PH05-GAPDH-HYBRIDPROMOTORER
Eksempel 1 og 2 gjør et område rundt posisjon -365 [UAS1(PH05)] og et annet område rundt posisjon -180 [UAS2(PH05)] av PH05-genet til mulige kandidater for UAS med regulerende funksjoner. UAS1(PH05) inneholdes i et 268 bp BamHI-Clal-fragment, mens både UAS1(PH05) og UAS2(PH05) inneholdes i et 368 bp BamHI-BstEII-fragment. Disse to fragmentene sammensmeltes begge med to forskjellige GAPDH nedstrøms promotorelementer som innbefatter TATA-boksen og transkripsjonsinitieringsseter for GAPDH.
a) Konstruksjon av et gjærgenbibliotek
30 pg av gjær DNA med høy molekylvekt [M.V. Olsen et al., J.
Mol. Biol. 132, 387 (1979)] fra vild type Saccharomyces cerevisiae stamme S288C inkuberes i 30 minutter ved 37°C med to enheter EcoRI metylase (New England Biolabs) i 250 pl av EcoRI metyleringsbuffer som anbefalt av fabrikanten. DNA utfelles med etanol, resuspenderes i 500 pl av 25 mM Tris*HCl pH 8,5, 2 mM MgCl2 (EcoRI* buffer) [H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1979)] og nedbrytes med EcoRI (Boehringer) inntil størrelsesfordelingen av DNA-fragmenter har et maksimum i 30-50 kb området (en Xhol-nedbrytning av X DNA gir egnede 33 kb og 17 kb markører). Gjær DNA nedbrutt under EcoRI*-betingelser størrelses-fraksjoneres på en sukrosegradient (5-20% sukrose i 10 mM Tris'HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) i 6 timer ved
38 000 opm i en "SW 40" rotor. Tretti fraksjoner på 0,4 ml samles fra toppen av gradienten. Fraksjon 16 inneholder DNA-fragmenter av størrelse 30-40 kb. DNA i denne fraksjonen (3
g) utf elles med etanol og ligeres i 16 timer ved 15 "C i et samlet volum på 15 pl til 1 pg av kosmidvektor pYcl [B. Hohn
et al. , i "Genetic Engineering", Vol. 2, side 169, New York 1980] linearisert ved hjelp av EcoRI. Ligering utføres med 300 U T4 DNa-ligase (New England Biolabs) ved å anvende buffersystemet beskrevet av fabrikanten. DNA pakkes in vitro i bakteriofag X [B. Hohn i "Methods in Enzymology", bind 68, side 299, New York 1979] og de sammensatte fagene benyttes for å transduktere E. coli stamme HB101 [r®k> 21<v>k' leu<®, >pro<®>, recA) . Effektiviteten av transduksjonen er ca. 5 000 ampicillin-resistente kolonier pr. pg av pYcl-vektor. 3 000 amp<R->kolonier utplukkes og dyrkes individuelt i brønnene av mikrotiterplater i LB-medium [10 g "Bacto-Tryptone" (Difco), 5 g "Bacto Yeast Extract" (Difco, 10 g NaCl] inneholdende 100 pg/ml ampicillin.
b) Isolering av gjær GAPDH- genet
Genbiblioteket beskrevet ovenfor gjennomsøkes med et
syntetisk oligonukleotid [fremstilt ved å anvende fosfotriesterfremgangsmåten: K. Itakura et al. , J. Am. Chem.
Soc. 97, 7327 (1975); J.F.M. de Rooij et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537 (1979)] av følgende struktur: 5'-GCTCCATCTTCCÅCCGCCCC-3'. 10 pg av oligonukleotidet kinaseres ved anvendelse av 10 pl \-<32>P-ATP (3 000 Ci/mmol, 10 pCi/1 Amersham) med T4 polynukleotidkinase (Boehringer) i et samlet volum på 50 pl som beskrevet av Maniatis et al. ["Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982, side 125]. Kolonihy-bridisering utføres som beskrevet av den samme forfatteren (side 312). Positive kloner detekteres ved hjelp av auto-radiografi ved anvendelse av Kodak X-5 røntgenfilm. Plasmid DNA-isolering (se europeisk patentpublikasjon nr. 100,561) gir en hybridklone som inneholder et 2 100 bp Hindlll-fragment som koder for GAPDH [J.P. Holland et al. , J. Biol. Chem. 254, 9839 (1979)]. Endelig bevis for autentisiteten av det klonede DNA kommer fra DNA-sekvenseringsforsøk ved anvendelse av ovenfor nevnte oligonukleotid i kombinasjon med dideoksysekvenseringsfremgangsmåten som beskrevet av G.F. Hong [Bioscience Reports 1, 243 (1981)] for dobbeltkjedet DNA. Det klonede GAPDH-genet har den samme sekvensen som p aap491 publisert av Holland et al., [J. Biol. Chem. 255, 2596 (1980)]. c) Fremstilling av GAPDH nedstrøms promotorelementen fse fig.
2 oq 3)
649 bp Taql-fragmentet som innbefatter posisjon -27 til -675 fra ATG'en av GAPDH-genet (se fig. 2) isoleres ved nedbrytning av det ovenfor nevnte hybridplasmidet med Taql (New England Biolabs), separering av DNA-fragmentene på en 1,2% myk agarosegel og ekstrahering av DNA ved hjelp av varm fenol (se eksempel 1) . Kloning av Taql-fragmentet utføres inn på Clal-setet av pBR322: 1 pg av pBR322 spaltes med 3 enheter Clal (New England Biolabs) som beskrevet av fabrikanten. 300 ng av den fenolbehandlede og kuttede vektoren ligeres til ca. 300 ng av innskutt DNA (649 bp Taq-fragment) ved å anvende 200 U av T4 DNA-ligase i et samlet volum på 20 pl (se eksempel lb) . Transformasjonen utføres i E. coli HB101 for ampicillinresistens, plasmid DN fremstilles og analyseres ved
hjelp av restriksjonsanalyse [Taql, Dral]. Orienteringen av Taql-fragmentet fastslås ved å anvende restriksjonsendonuklease Dral i kombinasjon med BamHI-setet av plasmidene og et plasmid velges som har Taql-setet av posisjon -675 nær Hindlll-setet av pBR322. Dette plasmidet betegnet pBR322/GAPDH lineariseres ved å anvende BamHI (New England Biolabs), og en nedbrytning med Bal31 utføres som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at BglII-forbindelsesledd (5'-CAGATCTG-3' , New England Biolabs) anvendes, og det nedbrutte plasmidet sirkulariseres direkte ved en konsentrasjon på 5 pg/ml i et samlet volum på 20 pl. Størrelsen av det Bal31-forkortede Taql-fragmentet bestemmes ved restriksjonsanalyse (ved å anvende Bglll og Hindlll). Det velges to kloner som inneholder DNA-fragmenter som strekker seg ca. 200 bp og 265 bp fra ATG'en oppstrøm inn i GAPDH-promotoren. Begge fragmenter inneholder den antatte TATA-boksen ved ca. -140 bp. Disse klonene inneholder fremdeles opphavet for replika-sjon i den pBR322 avledede delen av DNA og betegnes hhv. pGAPDH-F og pGAPDH-E.
d) Kombinasjon av nedstrøms GAPDH- elementet med UASKPH05) av
PH05 og det proteinkodende området av eglin C
I) GAPDH-elementer (se fig. 3)
For å utvide GAPDH-promotorelementene fra Taql-setet ved posisjon -27 til en posisjon nær inntil ATG'en av GAPDH-genet syntetiseres to syntetiske komplementære oligonukleotider av følgende struktur:
Disse oligonukleotidene tilveiebringer den genuine GAPDH-promotorsekvensen fra posisjon -2 6 til posisjon -5 med generering av et terminalt EcoRI-sete. 2 pg av hvert av plasmidene pGAPDH-E og -F nedbrytes med 6 enheter Taql i 50 pl og de resulterende blandingene fenolyseres, etanutfelles og resuspenderes i 10 pl vann. De syntetiske oligonukleotidene rekombineres ved å blande 2 pl av hver enkelt kjede i 100 pl av en oppløsning inneholdende 10 mM Tris*HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, oppvarming i 3 minutter til 90<*>C og langsom avkjøling av oppløsningen til romtemperatur (i løpet av ca. 3 timer). 1 pg av hvert av de Taql-nedbrutte plasmidene blandes med et ca. 20 gangers molart overskudd av de rekombinerte oligonukleotidene i et volum på 20 1 i ca. 18 timer ved å anvende 800 U av T4 DNA-ligase. Hele blandingen nedbrytes med 3 enheter Bglll (New England Biolabs). DNA-fragmentene separeres på en 1,5% myk agarosegel. Bglll-EcoRI-fragmentene på hhv. ca. 200 bp og 265 bp, skjæres fra gelen, ekstraheres og etanolutfelles.
Plasmid pGAPDH-E nedbrytes med Bglll og EcoRI og det store (ca. 3,5 kb) fragmentet isoleres. Dette fragmentet benyttes som vektor for å klone 265 bp og 200 bp Bglll-EcoRI-fragmentene ved å anvende ligerings-, transformasjons- og plasmid-isoleringsbetingelser som beskrevet ovenfor. Plasmidene som fremstilles betegnes pGAPDH-EL og pGAPDH-FL. DNA-sekvensene av Bglll-EcoRI-fragmentene klonet inn i pGAPDH-EL og pGAPDH-FL er vist i fig. 4. Den nøyaktige størrelsen av fragmentene er hhv. 266 bp og 201 bp.
II) Det UAS1(PH05) regulatoriske elementet:
3 pg plasmid p31/Y (se europeisk patentpublikasjon nr. 100,561) nedbrytes med 6 enheter Clal (New England Biolabs). De 3' innskårne endene fylles i en reaksjon med Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymerase I (Bethesda Research Laboratories) ifølge Maniatis (supra). Bglll-forbindelsesledd (5'-CAGATCTG-3') tilsettes som beskrevet i eksempel 1. DNA nedbrytes med Sali og Bglll (New England Biolabs) og føres på en 1% myk agarosegel. 548 bp fragmentet skjæres fra gelen, fenoliseres og etanolutfelles som beskrevet ovenfor.
III) Konstruksjon av plasmid pJDB207R/PHO5-EGL (se fig. 5): Dette plasmidet er en kilde for et DNA-fragment bestående av det eglin C-kodende området og PH05-transkripsjonster-minatoren.
A) Isolering av pJDB207 vektorfragmentet:
6 pg plasmid pJDB207R/IF(a-3) (europeisk patentpublikasjon nr. 100,561) nedbrytes fullstendig med restriksjonsendonuklease BamHI. De resulterende DNA-fragmentene av størrelse 6,85 kb og 1,15 kb utfelles ved hjelp av etanol og resuspenderes i 400 pl 50 mM Tris'HCl pH 8,0, 4,5 enheter kalvetarm alkalisk fosfatase (Boehringer, Mannheim) tilsettes. Blandingen inkuberes i 1 time ved 37'C. Deretter inaktiveres fosfatasen ved inkubering ved 65'C i 1 time. Oppløsningen reguleres til 150 mM NaCl. DNA-oppløsningen påføres på et 100 pl sjikt av "DE 52" (Whatman) anionveksler bragt til likevekt med 10 mM Tris*HCl pH 7,5, inneholdende 150 mM NaCl og 1 mM EDTA. Etter vasking med den samme bufferen elueres DNA med 400 pl 1,5 M NaCl, 10 mM Tris'HCl pH 7,5, 1 mM EDTA og utfelles med etanol. Det store 6,85 kb BamHI-fragmentet separeres fra det lille fragmentet på en 0,6% lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3.
B) Isolering av et 534 bp PH05-promotorfragment:
10 pg av plasmid p31/R europeisk patentpublikasjon nr. 100,561) nedbrytes med restriksjonsendonukleaser EcoRI og BamHI. De resulterende 3 fragmentene separeres på en 0,6% lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3. Et 534 bp BamHI-EcoRI-fragment isoleres som inneholder PH05-promotoren innbefattende mRNA-startsetene.
C) Isolering av et 221 bp DNA-fragment inneholdende den
kodende sekvensen for eglin:
8 pg av plasmid pML147 (europeisk patentpublikasjon nr. 146,785) nedbrytes med restriksjonsendonukleaser BamHI og EcoRI. De resulterende to DNA-fragmentene separeres på en 0,6% lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3. Det 221 bp fragmentet isoleres.
D) Ligering av DNA-fragmenter:
3 DNA-fragmenter beskrevet ovenfor (eksempler 3dIIIA-C) med egnede klebrige ender ligeres i en reaksjon: 0,1 pmol (0,45 pg) av 6,85 kb BamHI-vektorfragmentet, og 0,2 pmol (29 ng) av 221 bp EcoRI-BamHI-fragmentet av pML147 ligeres. Alle tre DNA-fragmenter finnes i små gelblokker av lavtsmeltende agarose. De tre stykkene av agarosegel samles, flytendegjøres ved 65°C og fortynnes to ganger. Ligeringen utføres i et samlet volum på 270 pl av 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP med 16 enheter av T4 DNA-ligase (Boehringer, Mannheim) ved 15°C i 16 timer. En porsjon på 10 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl av kalsiumbehandlede, transformasjonskompetente E. coli HBlOl-celler. 24 transformerte, amp<R->kolonier dyrkes individuelt i LB-medium inneholdende 100 pg/ml ampicillin. Plasmin DNA fremstilles ved fremgangsmåten ifølge Holmes et al. [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)] og analyseres ved Hindlll/EcoRI dobbel nedbrytning. Tilsynekomsten av et 600 bp EcoRI-Hindlll-fragment indikerer at det spesielle klonet har PH05-promotor - eglin C - DNA - fragmentet innført i ekspre-sjonsvektoren i korrekt orientering. Som ventet har ca. 50% av klonene et innskudd i riktig orientering. Et av disse klonene isoleres og betegnes som pJDB207/PHO5-EGL. 6 pg av plasmid pJDB207R/PHO5-EGL nedbrytes fullstendig med restriksjonsendonukleaser Hindlll og Sali. Det store 6,1 bp (vektordel) fragmentet isoleres ved myk agarosegelelektroforese, fenolekstraksjon og etanolutfelling. Vektor DNA resuspenderes i 20 pl vann. Eglinfragmentet dannes ved nedbrytning av pJDB207R/PHO5-EGL med Hindlll og EcoRI. Det resulterende 600 bp fragmentet separeres ved myk agarosegelelektroforese, fenolekstraheres og etanolutfelles. Eglinfragmentet resuspenderes i 20 pl H20.
IV) Ligering av fragmentene ved anvendelse av UAS1(PH05)-elementer (se fig. 6): Ligering utføres ved anvendelse av følgende fire komponenter: 0,5pg av 6,1 kb Hindlll-Sall-vektorf ragmentet, 100 ng av 600 bp EcoRI-Hindlll eglin C-fragmentet, 200 ng av 266 bp Bglll-EcoRI-fragmentet av pGAPDH-EL og 100 ng av 548 bp Sall-Bglll-fragmentet innbefattende UAS1(PH05). Ligering utføres som ovenfor. Transformasjon av E. coli HB101 for ampicillinresistens, plasmidisolasjon og en restriksjonsanalyse av positive kloner utføres som beskrevet ovenfor ved å anvende restriksjonsendonukleaser Hindlll, EcoRI, Bglll og Sali. Et positivt klon utvelges og betegnes pJDB207/PAPEL-EGL (UASl).
En analog konstruksjon utføres med 201 bp Bglll-EcoRI-fragmentet av pGAPDH-FL. Det fremstilt plasmidet betegnes PJDB207/PAPFL-EGL (UASl).
V) Konstruksjon av hybrider med UAS1(PH05)- og UAS2(PH05)-elementer: 3 jig av plasmidene ovenfor (se IV) nedbrytes med Bglll. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling resuspenderes DNA i vann. De 3' innskårne endene fylles ved hjelp av Klenow DNA-polymerase som beskrevet under II). Plasmidene oppvarmes til 70°C i 10 minutter for å inaktivere enzymet. Etter nedbrytning med Sali (Biolabs) isoleres de store fragmentene (ca. 7,2 kb) ved myk agarosegelelektroforese og fenolekstraksjon og det etanolutfelte DNA resuspenderes i vann.
På tilsvarende måte nedbrytes plasmid p31/Y med BstEII, behandles med DNA-polymerase (Klenow-fragment) og spaltes med Sali. 651 bp fragmentet isoleres som beskrevet ovenfor. Ligering av 200 ng av de ovenfor nevnte vektor DNA'ene med 652 bp fragmentet gir følgende plasmider: PJDB207/PAPEL-EGL (UASl + UAS2) (innbefattende 266 bp Bglll-EcoRI-fragment fra pGAPDH-EL)
PJDB207/PAPFL-EGL (UASl + UAS2) (innbefattende 201 bp Bglll-EcoRI-fragment fra pGAPDH-FL)
EKSEMPEL 4
a) Transformasjon av Saccharomyces cerevisiae GRF18
De fire plasmidene fra eksempel 3dIV og 3dV innføres alle i Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 (a, his3-112. his-3-15, leu-2-3. leu-2-112. can<R>) ved å anvende transformasjonsfremgangsmåten beskrevet av Hinnen et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)]. Transformerte gjærceller selekteres på gjær-minimalt mediumplater som har underskudd av leucin. Enkle transformerte gjærkolonier isoleres og betegnes som Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-EGL (UAS'),
/PAPFL-EGL (UASl), /PAPEL-EGL (UASl + UAS2) og /PAPFL-EGL
(UASl + UAS2).
b) Fermentering av transformantene
Celler av de fire S. cerevisiae GRF18-transformantene dyrkes
i 10 ml av gjær-minimalt medium (Difco "Yeast Nitrogen Base" uten aminosyrer hvortil 2% glukose og 20 mg/l L-histidin er tilsatt) i en 50 ml Erlenmeyer-kolbe med risting ved 30°C i 24 timer til en tetthet på 3 x IO<7> celler/ml. Cellene vaskes i 0,9% NaCl og benyttes til å inokulere 50 ml av et høyt Pj_-medium (som ovenfor) og et lavt P<1->minimalt medium fremstilt ifølge oppskriften av Difco "Yeast Nitrogen Base" medium (uten aminosyrer) med 0,03 g/l KH2P04, 1 g/l KC1, 10 g/l L-asparagin i steden for (NH4)2S04, 2% glukose og 1 g/l L-histidin. Mediet inokuleres til en utgangs ODggo 0,03. Cellene dyrkes i en 500 ml kolbe ved 3 0°C i 24 timer (OD60onm =1,8 for lavt P^-medium, OD600nm = 3»° for høyt P^-medium).
c) Bestemmelse av eglin C- titere
Når cellene har nådd en celletetthet (OD) som angitt ovenfor,
ristes cellene, sentrifugeres og brytes opp ved hjelp av glassperler. Blandingene analyseres med henblikk på eglin-aktivitet ved å måle inhiberingen av human leukocytelastase ved fremgangsmåte ifølge U. Seemueller et al. [Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 358, 115 (1977)]. Følgende aktiviteter oppnås.
EKSEMPEL 6: EKSPRESJON AV DESULFATOHIRUDIN UNDER KONTROLL AV PH05-GAPDH-HYBRIDPROMOTOR
I. Regulering av nukleotidsekvensene ved 5' enden av
desulfatohirudin HVl- genet
Nukleotidsekvensen som koder for desulfatohirudin (se europeisk patentpublikasjon nr. 168,342) starter med GTT som står for det NH2~terminale valinet i det endelige genproduktet. For hensiktsmessig underkloning og ekspresjon i E. coli er den kodende sekvensen utvidet ved 5' enden med 8 nukleotider innbefattende et EcoRI-restriksjonssete og et ATG-initieringskodon. For den nøyaktige sammensmeltningen i rammen av den hirudinkodende sekvensen, til sekvensen som koder for PH05-signalpeptidet må disse ekstra nukleotidene fjernes. Dette oppnås ved å omvandle EcoRI-restriksjonssetet til et fullt endesete, tilsetning av et syntetisk oligonukleotid inneholdende et Hgal-gjenkjenningssete i en slik posisjon at etterfølgende spaltning med Hgal finner sted umiddelbart.
Innføring av et Hgal- restriksionssete foran desulfatohirudin-<g>enet (se fig. 7) 8 pg plasmid pML310 (se EP 168,342) nedbrytes fullstendig med restriksjonsendonuklease EcoRI. DNA (pML310/EcoRI) ekstraheres med fenol/kloroform og utfelles med etanol. 5' overhengende ender fjernes ved hjelp av nuklease S^. 4 pg pML310/EcoRI DNA nedbrytes i 100 pl 250 mM NaCl, 1 mM ZnS04, 30 mM natriumacetat pH 4,6 med 20 U/ml nuklease S± (Sigma) i
45 minutter ved 37°C.
DNA ekstraheres med fenol/kloroform og utfelles med etanol.
DNA (pML310/EcoRI/S];) resuspenderes i 100 pl av 50 mM Tris*HCl pH 8,0 og inkuberes med 2 enheter av kalvetarm alkalisk fosfatase ("CIAP", Boehringer) i en time ved 37 °C. Enzymet inaktiveres ved 65°C i 1,5 timer.
NaCl-konsentrasjonen i inkuberingsblandingen reguleres til 150 mM. Defosforylert DNA (PML.310/EC0RI/S3/CIAP) renses ved absorpsjon til en "DE52" (Whatman) ionevekslingskolonne i en svak saltbuffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) og elueres deretter med en sterk saltbufferoppløsning (1,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). DNA utfelles med etanol og resuspenderes i H20 ved en konsentrasjon på 0,8 mg/ml.
Et oligonukleotid av formelen
5'-AGCGTCGACGCT-3'
syntetiseres ved hjelp av fosfotriesterfremgangsmåten [Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)]. Sekvensen av oligonukleotidet er selv-komplementær inneholdende gjenkjenningssetet -GACGC- for restriksjonsendonuklease Hgal. Rekombinasjon av to enkeltkjeder fører til et dobbeltkjedet DNA forbindelsesledd på 12 basepar.
1,2 g av det syntetiske enkeltkjedede oligodeoksynukleotidet fosforyleres i 10 pl 60 mM Tris'HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 30 Ci av [T-<32>p] ATP (3 000 Ci-mmol-<1>, Amersham) og 6 enheter T4 polynukleotidkinase (Boehringer) i 30 minutter ved 37"C, etterfulgt av 15 minutter ved 37°C i nærvær av 0,5 mM ATP. Blandingen inkuberes videre i 10 minutter ved 75°C for å inaktivere enzymet og får deretter avkjøles til romtemperatur for rekombinasjon.
0,6 pg (170 pmol) av det <32>P-merkede forbindelsesledd DNA blandes med 2,4 pg (1,75 pmol ender) av PML310/EC0RI/S3/CIAP og ligeres i 20 pl 60 mM Tris'HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM
DTT, 3,5 mM ATP, 800 enheter av T4 DNA-ligase (Biolabs) i 20 timer ved 15°C. Ligasen inaktiveres ved 85°C i 10 minutter og overskuddet av forbindelsesleddmolekyler fjernes ved utfelling av DNA'et i nærvær av 10 mM EDTA pH 7,5, 300 mM natriumacetat pH 6,0 og 0,54 volumdeler isopropanol. Etter 30 minutter ved romtemperatur pelletiseres DNA, resuspenderes i 45 pl av ligeringsblanding (angitt ovenfor) og ligeres i 6 timer ved 15°C for dannelse av sirkulært DNA.
Porsjoner på 1 pl og 3 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl av kalsiumbehandlede, transformasjonskompetente E. coli HBlOl-celler [fremstilt ved fremgangsmåten ifølge D. Hanahan, J. Biol. Chem. 166, 557 (1983)]. Cellene får stå på is i 30 minutter, inkuberes deretter i 3 minutter ved 42°C, avkjøles på is i 2 minutter og inkuberes deretter i 1 time ved 37°C i 400 pl av SOC-medium. Cellene konsentreres i 100 pl hver og belegges på LB-agarplater inneholdende 50 pg/ml ampicillin. 12 transformerte, amp<R->kolonier dyrkes individuelt i LB-medium inneholdende 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles ved fremgangsmåten ifølge D.S. Holmes et al. [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)]. Nærværet av det syntetiske oligonukleotidforbindelsesleddet bekreftes ved hjelp av DNA-sekvensering ved anvendelse av et enkeltkjedet DNA-fragment som primer som hybridiseres til den kodende kjeden av hirudin. Et klon som inneholder forbindelsesledd DNA ved den korrekte posisjonen foran hirudingenet betegnes pML310L. II. Fusjon av PH05- siqnalsekvensen og desulfatohirudinstrukturgenet a) Isolering av 0. 2 kb desulfatohirudinfragmentet ( se fig. 7) 12 pg av plasmid pML310L nedbrytes fullstendig med restrik-sjonsendonukleasene BamHI og Pvul. Etter ekstraksjon av DNA ved hjelp av fenol/kloroform og etanolutfelling separeres de to restriksjonsfragmentene på en 1,2% agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3. Det etidiumbromid-fargede 0,84 kb Pvul-BamHI-fragmentet isoleres i et gelstykke. DN elektroelueres i en dialysebeholder fyllt med 3 ml 0,2 x TBE-buffer. Den lukkede beholderen neddykkes i TBE-buffer, pH 8,3 (90 mM Tris-base, 90 mM borsyre, 2,5 mM EDTA). Etter 30 minutter ved 100 mA snus polariteten av strømmen i 45 sekunder for å avstøte DNA fra dialysemembranen. Bufferen som omgir gelstykket i dialysebeholderen utvinnes, reguleres til 150 mM NaCl og føres gjennom en "DE52" (Whatman) ionevekslingskolonne. DNA elueres med en sterk saltbuffer (1,5 M NaCl, 10 mM Tris'HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), utf elles med etanol og gjenoppløses i H20 ved en konsentrasjon på 0,1 mg/ml.
0,84 kb PvuI-BamHI-fragmentet av pML310L nedbrytes videre med restriksjonsendonuklease Hgal. Denne nedbrytningen genererer en 198 bp Hgal-BamHI-fragment som inneholder den fullstendige kodende sekvensen for modent desulfatohirudin. Ytterligere Alul-nedbrytning berører ikke 198 bp Hgal-BamHI-fragmentet, men eliminerer et annet Hgal-fragment av lignende størrelse.
0,2 kb Hgal-BamHI-fragmentet separeres fra andre fragmenter på en 1,5% agarosegel i TBE-buffer og isoleres ved elektroeluering (som beskrevet ovenfor). DNA'et renses ved hjelp av "DE52" ionevekslingskromatografi og etanolutfelling. DNA resuspenderes i H20 ved en konsentrasjon på 30 pg/ml (0,2 pmol/pl).
b) Isolering av PH05- promotorområdet med del av PH05-signalsekvensen (se fig. 8)
Plasmid p31/PH05-TPA18 (se europeisk patentpublikasjon nr. 143,081) har PH05-promotor- og PH05-signalsekvensen sammensmeltet i ramme til et fremmed strukturgen (t-PA). Et 584 bp BamHI-BalII-fragment inneholder PH05-promotoren og hele PH05-signalsekvensen, men 8 nukleotider ved 3' enden.
8 <p>g av p31/PH05-TPA18 DNA nedbrytes med restriksjonsendonuklease Ball (16 timer ved 37°C). DNA renses ved hjelp av
fenol/kloroformekstraksjon og etanolutfelling. DNA resuspenderes i H2O ved en konsentrasjon på 0,7 mg/ml. Den korrekte sammenføyningen mellom PH05-signalsekvensen og det kodende området for desulfatohirudin tilveiebringes ved hjelp av et syntetisk forbindelsesledd av formelen 8 nukleotider ved 5' enden av forbindelsesleddet (5'-CCAATGCA) representerer del av PH05-signalsekvensen fra Ball-setet til bearbeidelsessetet. De 5' overhengende 5 nukleotidene av oligonukleotid (2) passer inn i Hgal-spaltnings-sete ved 5' enden av den desulfatohirudinkodende sekvensen.
De individuelle enkeltkjedede oligonukleotidene (1) og (2) syntetiseres ved hjelp av fosfotriesterfremgangsmåten (Itakura et al., supra) hhv. 1,1 pg og 1,8 pg av oligonukleotid (1) og (2) , fosforyleres individuelt ved 5' endene, blandes i ekvimolare mengder og rekombineres som beskrevet i eksempel 51.
1,3 pg (200 pmol) av det fosforylerte, dobbeltkjedede forbindelsesledd DNA ligeres til 7 pg (1,8 pmol) av Ball-spaltet p31/PH05-TPA18 i 40 pl av 60 mM Tris<*>HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT og 1 400 enheter av T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 16 timer. Ligasen inaktiveres i 10 minutter ved 85"C. Overskuddet av forbindelsesledd fjernes ved utfelling av DNA i nærvær av 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat og nedbrytes videre med restriksjonsendonuklease BamHI. Etter ekstraksjon av DNA ved hjelp av fenol/kloroform og etanolutfelling separeres de to restriksjonsfragmentene på en 1,2% agarosegel i Tris-borat-EDTA-buf f er pH 8,3. 0,6 kb fragmentet isoleres fra gelen. DNA elektroelueres og renses videre ved hjelp av "DE52" ionevekslingskromatografi og etanolutfelling. 0,6 kb BamHI-Hgal DNA-fragmentet resuspenderes i H20 ved en konsentrasjon på 40 pg/ml.
c) Isolering av et pJDB207- giærvektorfragment (se fig. 8)
9 pg av plasmid pJDB207R/PHO5-TPA(12-2) DNA (se europeisk
patentpublikasjon nr. 143,081) nedbrytes med restriksjonsendonuklease BamHI. Etter fullstendig nedbrytning ekstraheres DNA ved hjelp av fenol/kloroform og etanolutfelling. DNA resuspenderes i 50 mM Tris'HCl pH 8,0 ved en konsentrasjon på 0,1 mg/ml og nedbrytes med 7 enheter kalvetarm alkalisk fosfatase i 1 time ved 37°C. Fosfatasen inaktiveres i 1,5 timer ved 65°C og DNA renses ved hjelp av "DE52" ionevekslingskromatografi (se eksempel 51) og etanolutfelling. Det 6,8 kb store BamHI-fragmentet separeres på en 1,2% agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3. DNA elektroelueres og renses ved hjelp av "DE52" ionevekslingskromatografi og etanolutfelling. DNA oppløses i H20 ved en konsentrasjon på 0,4 mg/ml (0,1 pmol/pl).
d) Ligering av PH05- promotorfragmentet og desulfatohirudinstrukturgenet til pJDB207- gjærvektorfragmentet (se fig. 8)
pJDB207-gjærvektoren, PH05-promotorfragmentet med PH05-signalsekvensen og desulfatohirudinstrukturgenet isoleres alle som DNA-f ragment er (se eksempel 511 a-c) som ligeres slik at det dannes et ekspresjonsplasmid.
0,3 pmol av 0,6 kb BamHI-Hgal-fragmentet av p31/PH05-TPA18 og 0,3 pmol av 0,2 kb Hgal-BamHI-fragmentet av pML310L ligeres til 0,1 pmol av et 6,8 kb BamHI-fragment av pJDB207R/PHO5-TPA (12-2) i 10 pl av 60 mM Tris*HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enheter av T4 DNA-ligase i 20 timer ved 15°C.
En 1 pl porsjon av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl av transformasjonskompetente E. coli HBlOl-celler fremstilt ifølge Hanahan (supra). Transformasjonsfremgangsmåten er også hentet fra denne publikasjonen. Cellene belegges på LB-agarplater inneholdende 50 pg/ml ampicillin. 24 amp<R->kolonier dyrkes individuelt i LB-medium med 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA analyseres med henblikk på størrelse og orientering av innskuddet ved spaltning med restriksjonsendonuklease Pstl. Et enkelt klon med den korrekte orienteringen av innskuddet betegnes som pJDB207/PHO5-HIR. III. Fremstillin<g> av plasmid pJDB207/ PHO5( Eco)- HIR (se fig.
9)
For hensiktsmessig sammenføyning av UAS(PH05)-GAPDH-hybrid-promotorelementene til det kodende området av desulfatohirudin innbefattende PH05-signalsekvensen (som i plasmid pJDB207/PHO5-HIR) innføres et EcoRI-restriksjonssete i det 5' utranslaterte området mellom mRNA-startsetene og ATG for det kodende området. 15 pg av plasmid pJDB207/PHO-HIR nedbrytes med restriksjonsendonuklease Dral (Boehringer). De resulterende 4 fragmentene separeres på en 0,8% agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3. 4,2 kb DNA-fragmentet utvinnes fra gelen, elektroelueres og utf elles med etanol. DNA resuspenderes i H20 ved en konsentrasjon på 0,6 mg/ml.
To syntetiske oligonukleotider av formelen
(hhv. 2,3 <p>g og 2,9 pg) kinaseres begge i 20 pl av 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP og 20 U T4 polynukleotidkinase (Boehringer). Etter 45 minutter ved 37°C blandes begge reaksjonsblandingene, oppvarmes i 10 minutter til 75°C og får avkjøles til romtemperatur. De rekombinerte oligonukleotidforbindelsesleddet lagres ved -20°C. 6,5 pg (2,3 pmol) av 4,2 kb Dral DNA-f ragmentet inkuberes i 16 timer ved 15 °C med et 70 gangers overskudd av det kinaserte og rekombinerte oligonukleotidforbindelsesleddet i 50 pl av 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og 800 U av T4 DNA-ligase (Biolabs). Etter inaktivering av T4 DNA-ligasen i 10 minutter ved 85°C fjernes overskuddet av forbindelsesledd ved utfelling av DNA i nærvær av 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat pH 6,0 og 0,54 volumdeler isopropanol. DNA nedbrytes med EcoRI og Hindlll. De resulterende fragmentene separeres på en 1% agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3. 643 bp fragmentet utvinnes fra gelen ved elektroeluering og etanolutfelling. DNA resuspenderes i en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl. EcoRI-Hindll I-fragmentet inneholder PH05-signalsekvensen, den kodende sekvensen for desulfatohirudin og PH05-transkripsj onsterminatoren. 534 bp PH05-promotorfragmentet isoleres fra plasmid p31/R (europeisk patentpublikasjon nr. 100,561). 10 pg av p31/R nedbrytes med restriksjonsendonukleaser EcoRI og BamHI. De resulterende 3 fragmentene separeres på en 0,6% lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3. Et 534 bp BamHI-EcoRI-fragment isoleres som inneholder PH05-promotoren innbefattende mRNA-startsetene.
Vektorfragmentet isoleres fra plasmid pJDB207/PHO5-HIR. 6 pg av dette plasmidet nedbrytes med BamHI og Hindlll. Det store 6,5 kb BamHI-HindiII-fragmentet separeres fra det lille fragmentet på en 0,6% lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA-buf f er pH 8,3. 3 DNA-fragmenter beskrevet ovenfor med de egnede klebrige endene ligeres i følgende reaksjon: 0,2 pmol (70 ng) av 534 bp BamHI-EcoRI PH05-promotorf ragmentet, 0,2 pmol (85 ng) av 643 bp EcoRI-HindIII-fragmentet (hirudinkodende sekvens) og 0,1 pmol (0,4 pg) av 6,5 kb BamHI-Hindi 11-vektorfragmentet ligeres i 10 pl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 U T4 DNA-ligase i 6 timer ved 15°C. En porsjon på 1 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl av kalsiumbehandlede, transformasjonskompetente E. coli HB 101-celler. 12 transformerte, amp<R->kolonier dyrkes individuelt i LB-medium inneholdende 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles ved fremgangsmåten ifølge Holmes et al. [Anal. Biochem. 114 (1981) 193] og analyseres ved EcoRI og BamHI-restriksjonsnedbrytning. Et klon med de ventede restriksjonsfragmentene isoleres og betegnes pJDB207/PHO5(Eco)-HIR. IV. Ligering av UAS1( PH05)- GAPDH hybridpromotorene til det
proteinkodende området av desulfatohirudin
15 pg av plasmid pJDB207/PHO5(Eco)-HIR nedbrytes med EcoRI og Hindlll. DNA-fragmentene separeres på en 1% agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3. 643 bp fragmentet isoleres fra gelen, elektroelueres og utfelles med etanol. DNA resuspenderes i H2O ved en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl. 6 pg plasmid pJDB207/PHO5-HIR nedbrytes fullstendig med restriksjonsendonukleaser Hindlll og Sali. Det store 6,3 kb fragmentet (vektordel) isoleres med myk agarosegelelektroforese, fenolekstraksjon og etanolutfelling. Vektor DNA-fragmentet resuspenderes i H20 ved en konsentrasjon på 0,05 pmol/pl. 10 pg av plasmid pGAPDH-EL (se eksempel 3dl) nedbrytes med Bglll og EcoRI. 266 kb Bglll-EcoRI-fragmentet separeres på en 1,2% agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3, elektroelueres fra gelen og utfelles med etanol. DNA resuspenderes i H20 ved en konsentrasjon på 0,3 pmol/pl.
0,3 pmol av 548 bp SalI-BglII-fragmentet innbefattende UASl (PH05) (eksempel 3dII) , 0,3 pmol av 266 bp Bglll-EcoRI-fragmentet av pGAPDH-EL, 0,3 pmol av 643 bp EcoRI-Hindlll-f ragmentet av pJDB207/PHO5 (Eco)-HIR og 0,12 pmol av 6,3 kb Sall-Hindlll vektorfragmentet ligeres i 20 pl av 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 U av T4 DNA-ligase (Biolabs) i 6 timer ved 15°C. Porsjoner på 1 pl og 3 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl av kalsiumbehandlede E. coli HBlOl-celler. Plasmidisolering fra amp<R->
kolonier og restriksjonsanalyse med Sali, Bglll, EcoRI og Hindlll utføres som beskrevet ovenfor (se eksempel 3dIII). Et positivt klon velges og betegnes pJDB207/PAPEL-HIR(UASl). En analog konstruksjon utføres med 201 bp Bglll-EcoRI-fragmentet isolert fra pGAPDH-FL. Et utvalgt plasmid betegnes pJDB207/PAPFL-HIR(UASl).
V. Liaerina av UASl( PH05)- UAS2( PH05)- GAPDH- hvbridpromotorene
til det proteinkodende området av desulfatohirudin
3 pg av hvert av plasmidene pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) og pJDB207/PAPFL-HIR(UASl) nedbrytes med Bglll. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling innfylles de 3' innskårne endene av DNA reaksjon med E. coli DNA-polymerase (Klenow fragment; Bethesda Research Laboratories) ifølge Maniatis et al. (supra). Enzymet inaktiveres ved 70°C i 10 minutter. DNA'ene nedbrytes videre med Sali og de store 7,2 kb fragmentene isoleres ved myk agarosegelelektroforese, fenolekstraksjon og etanolutfelling. Hvert fragment resuspenderes i H20 i en konsentrasjon på 0,05 pmol/pl. Fragmentene inneholder det hirudinkodende området, det meste av vektor-sekvensene og det ene av de to forskjellige GAPDH-promotorelementene isolert fra pGAPDH-EL eller pGAPDH-FL.
Plasmid p31/Y (europeisk patentpublikasjon nr. 100,561) nedbrytes med BstEII, inkuberes med E. coli DNA-polymerase (Klenow fragment) som beskrevet ovenfor og spaltes med Sali. 649 bp fragmentet separeres på en myk agarosegel og utvinnes ved hjelp av fenolekstraksjon og etanolutfelling.
0,3 pmol av 649 bp fragmentet av p31/Y innbefattende UAS1-UAS2 (PH05) promotorelementet og 0,15 pmol av et av 7,2 kb fragmentene og ligeres og transformeres i E. coli HB101 som beskrevet ovenfor. Plasmider fremstilles fra amp<R->kolonier og analyseres ved restriksjonsnedbrytninger. Enkle kloner utfelles og deres plasmid DNA<7>er betegnes som pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2) og pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2).
EKSEMPEL 6
En 31 bp DNA- sekvens er tilstrekkelig til å virke som et fosfatkontrollelement
En 31 bp sekvens fra oppstrømsområdet av PH05-promotoren (posisjon -381 til -351), definert ved de to flankerende utslettelsene A10 og A13 (se eksempel lf) , kan potensielt inneholde et regulatorisk signal. Dette kan undersøkes ved kjemisk syntetisering av to komplementære oligonukleotider av følgende struktur:
Denne sekvensen inneholder 31 bp sekvensen flankert av EcoRI-restriksjonsseter. EcoRI-setene tillater enkel polymerisasjon av sekvensen slik at det dannes multimerer.
a) Kloning av 31 bp elementet inn i vektor LT98
50 pmol av de to syntetiske oligonukleotidene kineres begge i 20 ml 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP og 20 U av T4 polynukleotid kinase (Boehringer). Etter 45 minutter ved 37 "C blandes begge reaksjonsblandingene, oppvarmes i 10 minutter til 75 °C og får avkjøles til romtemperatur. De rekombinerte oligonukleotidene lagres ved-20°C. 7,5 pmol av de kinaserte og rekombinerte oligonukleotidene ligeres i 30 minutter som beskrevet ovenfor (eksempel 5III) i et samlet volum på 15 pl. Deretter tilsettes 5 pl av EcoRI skåret LT98 vektor DNA [Dixon et al., Gene 25, 189
(1983)] (0,075 pmol) og inkuberingen fortsettes i totalt 6 timer. Etter transformasjon i E. coli HB101 isoleres plasmider og analyseres ved nedbrytning med BamHI. Denne analysen gir resultater vedrørende den samlede lengden av innskuddet og tillater estimering av antallet EcoRI-fragmenter som er klonet. Individuelle plasmider med 1, 2, 3, 4 eller 5 EcoRI-fragmenter utvelges og DNA-sekvensering (Sanger-fremgangsmåten) viser at de mange 31 bp elementene er klonet inn i hode til hale orientering.
b) Klonin<g> i pJDB207
31 bp oligomerene undersøkes vedrørende promotorkontrollfunk-sjonen ved å innføre dem oppstrøm for F-elementet av GAPDH-promotoren. Plasmid pJDB207/PAPFL-EGL(UASl) forkortes for å fremstille et plasmid som har utslettet UASl-elementet: plasmidet nedbrytes med Sali og Bglll, gelrenses og det store vektorfragmentet isoleres. I en uavhengig reaksjonsblanding nedbrytes det samme plasmidet med BamHI. De innskårne 3' endene fylles med Klenow DNA-polymerase ved å anvende alle fire dNTP'er. De buttendede setene utvides med fosforylerte BglII-forbindelsesledd (CAGATCTG, Biolabs), og etter nedbrytning med Sali og Bglll isoleres et DNA-fragment som har en tilnærmet lengde på 400 bp ved gelrensing. Det store vektorfragmentet ligeres med det ca. 400 bp Sall-Bglll-fragmentet ved å anvende T4 DNA-ligase. Etter E. coli HB101 transformasjon og plasmidisolering oppnås et plasmid uten en PH05 UAS. Dette plasmidet betegnes pJDB207/GAPFL-EGL. Dette plasmidet nedbrytes med Bglll og tjener som en vektor for kloning av 31 bp oligomerene. LT98 inneholdende 1, 2, 3, 4 eller 5 oligonukleotidinnskudd nedbrytes med BamHI. De forskjellige størrelsesfragmentene isoleres ved gelrensing og ligeres uavhengig til den Bglll-skårne pJDB2 07/GAPFL-EGL. Ligeringsblandingen nedbrytes med Bglll for å fjerne uønsket religert vektor uten DNA-innskudd og benyttes deretter til å transformere E. coli HB101. Plasmidene som oppnås analyseres ved restriksjonsanalyse med Sali og Dral (et sete innenfor GAPDH-promotordelen). Etter transformasjon av gjærstamme GRF18 ble eglin C titere bestemt som beskrevet i eksempel 4c. Følgende spesifikke aktiviteter ble målt etter 46 timers fermentering:
EKSEMPEL 7
Ekspresjon av insulinli<g>nende vekstfaktor 1 fIGF- 1) fra en PAPFL- promotor
Plasmid pAB113-IGF-l som beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 123,228 nedbrytes med Pstl. To syntetiske oligonukleotider (50 pmol) begge av formelen
kinaseres og rekombineres som beskrevet ovenfor. Den rekombinerte dobbeltkjedede adapteren ligeres til det Pstl-skårne plasmidet, nedbrytes med EcoRI og BamHI og det ca. 800 bp EcoRI-BamHI-fragmentet isoleres ved gelrensing. Plasmid pJDB207/PAPFL-EGL(UASl) nedbrytes med Sali og EcoRI og det ca. 700 bp fragmentet isoleres ved gelrensing. I en trippel-ligering ligeres 0,5 pg av plasmid pCl/1 (europeisk patentpublikasjon nr. 123,228; nedbrudt med BamHI og Sali, vektorgelrenset) med 100 ng av hhv. hvert av de mindre genene og promotordelene. Etter E. coli transformasjon analyseres plasmidene ved EcoRI, BamHI og Sall-nedbrytning. Transformasjon av gjærstamme AB103 [deponert ved ATCC som nr. 20,673; abort fra pYIGF-1-10/1 ved dyrking av gjærceller i et komplekst medium over natten og undersøkelse av individuelle
kolonier vedrørende nærværet av IGF-1 plasmid ved kolonihy-bridisering som beskrevet av Hinnen et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)] gir transformanter som produserer bare IGF-1 under induserte (lav Pj^) betingelser (1 mg/l) bestemt ved konvensjonell kompetitiv radioimmunoanalyse ved anvendelse av radiomerket IGF-1 (Anderson et al. , i: "Somatomedins/Insulin-Like Growth Factors", Spencer, E.M., red., Walter de Gruyther, Berlin). Klonene betegnes
pCl/l/PAPFL-IGF-l(UASl).
EKSEMPEL 8
Ekspresjon av vevsplasmino<q>enaktivator ft- PA) under kontroll av PH05- GAPDH hybrid<p>romotor (se fig. 10) 12 pg av plasmid pJDB207/PHO5-TPA18 (europeisk patentpublikasjon nr. 143,081) nedbrytes fullstendig med restriksjonsendonukleaser Sali og Hindlll. De resulterende to DNA-fragmentene separeres på en 0,8% agarosegel i Tris-borat-EDTA-buf f er pH 8,3. Det lille 2,6 kb SalI-HindIII-fragmentet isoleres ved elektroeluering, fenolekstraksjon og etanolutfelling. DNA nedbrytes videre med Ball. Det 1,8 kb fragmentet med en del av PH05-signalsekvensen, den kodende sekvensen for t-PA og PH05-terminatoren isoleres og renses som angitt ovenfor, og resuspenderes i H2O ved en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl.
Hybridpromotorfragmentet isoleres fra plasmid pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2) (se eksempel 5V). 12 pg plasmid DNA nedbrytes med Sali og Hindlll. Det resulterende 1,5 kb fragmentet nedbrytes videre med Ball. Et 920 bp fragment innbefattende hybridpromotoren og del av PH05-signalsekvensen isoleres på en 1,5% agarosegel. DNA elektroelueres, fenolekstraheres, utfelles med etanol og resuspenderes i H20 ved en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl.
0,2 pmol av 920 bp Sall-Ball-f ragmentet, 0,2 pmol av 1,8 kb BalI-HindIII-fragmentet og 0,1 pmol av den Sali, Hindlll
spaltede vektoren pJDB207 ligeres i 16 timer ved 15°C i et samlet volum på 10 pl. En porsjon på 1 pl av ligeringsblandingen tilsettes til 100 pl av kalsiumbehandlede, transformasjonskompetente E. coli HBlOl-celler. 12 transformerte, amp<R->kolonier dyrkes individuelt i LB-medium inneholdende 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles ved fremgangsmåten ifølge Holmes et al. [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)] og analyseres ved Pstl og BamHI/EcoRI-restriksjonsnedbrytning. Et klon med de ventede restriksjonsfragmentene isoleres og betegnes som pJDB207/PAPFL-TPA(UASl + UAS2).
En analog konstruksjon utføres for UASl(PH05)-elementet:
Et 820 bp Sall-Ball-fragment av pJDB207/PAPFL-HIR(UASl)
(eksempel 5IV) isoleres og ligeres til 1,8 kb Ball-Hindlll-fragmentet og den Sali, Hindlll-spaltede vektoren. Det resulterende plasmidet betegnes som pJDB207/PAPFL-TPA(UASl).
Analoge konstruksjoner utføres med tilsvarende fragmenter isolert fra pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) eller
pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) (eksempel 5). Resulterende plasmider betegnes som pJDB207/PAPEL-TPA(UASl) og pJDB207/PAPEL-TPA(UASl + UAS2).
EKSEMPEL 9
Ekspresjon av polypeptider under kontroll av PH05- GAPDH-hybridpromotorer a) Transformasjon av Saccharomyces cerevisiae GRF18: Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 ( , his3-ll, his-3-15.
leu2-3, leu2-112, can<R>) transformeres med plasmidene
pJDB2 0 7/PAPEL-HIR(UASl)
pJDB2 07/PAPFL-HIR(UASl)
pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2)
pJDB2 07/PAPFL-HIR(UASl + UAS2)
pJDB20 7/PAPFLI(+)-EGL
pJDB2 0 7/PAPFLI(-)-EGL
pJDB207/PAPFLII(+)-EGL
pJDB2 0 7/PAPFLI11(-)-EGL
pJDB207/PAPFLIV(+)-EGL
pJDB207/PAPFLV(-)-EGL
pJDB2 0 7/PAPEL-TPA(UASl)
pJDB2 0 7/PAPFL-TPA(UASl)
pJDB2 07/PAPEL-TPA(UASl + UAS2)
pJDB207/PAPFL-TPA(UASl + UAS2)
pCl/l/PAPFL-IGF-l(UASl)
ved å anvende transformasjonsfremgangsmåter beskrevet av Hinnen et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929, (1978)]. Transformerte gjærceller utvelges på gjær minimalt mediumplater som har underskudd av leucin. Enkle transformerte gjærkolonier isoleres og betegnes som
Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB2 0 7/PAPFL-HIR(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB2 0 7/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFLI(+)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFLI(-)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFLII(+)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLIII(-)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFLIV(+)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFLV(-)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPEL-TPA(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFL-TPA(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPEL-TPA(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFL-TPA(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pCl/l/PAPFL-IGF-l(UASl)
b) Fermentering av transformantene
Celler av S. cerevisiae GRF18-transformantene dyrkes alle i 10 ml av gjær minimalt medium (Difco "Yeast Nitrogen Base" uten aminosyrer hvortil 2% glukose og 20 mg/l L-histidin tilsettes) i en 50 ml Erlenmeyer-kolbe under risting ved 30°C i 24 timer til en tetthet på 3 x IO<7> celler/ml. Cellene vaskes i 0,9% NaCl og benyttes til å inokulere 50 ml av et lavt P^-minimalt medium fremstilt ifølge oppskriften for "Difco Yeast Nitrogen Base" medium (uten aminosyrer), men inneholdende 0,03 g/l KH2P04, 1 g/l KC1 og 10 g/l L-asparagin i stedet for (NH4)2S04, 2% glukose og 1 g/l L-histidin. Kulturene inokuleres til en celletetthet på 4 x IO<6> celler/ml og ristes ved 30°C i opp til 42 timer ved 200 omdreininger/- minutt.
c) Titere av eksprimerte <g>enprodukter
Gjær utskiller desulfatohirudinforbindelser i kulturbuljongen. Etter fermentering i 22 timer tas en 10 ml prøve fra kulturmediet og anrikes på proteiner ved avsalting og oppkonsentrering på en "Bond Elut C-18" kolonne (1 ml, Analytichem International). Kolonnen vaskes to ganger med 1,5 ml vann-acetonitril (9:1)-0,1% trifluoreddiksyre. Desulfatohirudinforbindelser elueres fra kolonnen med vann-acetonitril-0,1% trifluoreddiksyre (6:4 volum/volum). 2 ml eluat konsentreres på en "Speed Vac"-konsentrator (Savant) til et endelig volum på 400 pl. Desulfatohirudin identifiseres ved hjelp av HPLC-analyse, ved sammenligning med autentisk desulfatohirudin og ved hjelp av thrombin-inhiberingsanalysen [kfr. M.U. Bergmeyer (red.), "Methods in Enzymatic Analysis", bind II, side 314-316, Verlag Chemie, Weinheim (BRD) 1983].
Resultatene er gjengitt i tabell 1.
Vevsplasminogenaktivator (t-PA) akkumuleres i gjærcellene. Celleekstrakter fremstilles og t-PA-aktiviteten bestemmes på følgende måte: Celler fra 35 ml lav P^-kultur-medium [B. Meyhack et al., EMBO-J. 1, 675 (1982)] ved en celletetthet på 1-2 x 10<7>/ml samles ved sentrifugering i en "Sorvall SS34"-rotor i 10 minutter ved 3 000 opm. Cellene vaskes i en buffer inneholdende saltkomponenter fra kulturmedier (dvs. uten aminosyrer, glukose, vitaminer, sporelementer). Cellene sentrifugeres ved romtemperatur i 5 minutter ved 3 000 opm. De sedimenterte cellene resuspenderes i et samlet volum på 4 ml av kald 66 mM natriumfosfatbuffer pH 7,4 og 0,1% (volum/- volum) "Triton X-100". Cellesuspensjonen overføres til et 30 ml "Corex" rør, 8 g glassperler (diameter 0,4 mm) tilsettes og suspensjonen ristes på "Vortex Mixer" (Scientific Instruments Inc., USA) ved topphastighet i 4 minutter og avkjøles deretter i et isbad. Celleavfall og glassperler sedimenteres ved hjelp av sentrifugering i 10 minutter ved 800 opm ved 4°C i en "Sorvall HB-4" rotor. Supernatanten overføres til "Eppendorf" rør, nedfryses i flytende nitrogen og lagres ved -60°C.
t-PA aktivitet bestemmes ved fremgangsmåten ifølge Rånby [Biochem. Biophys. Acta 704, 461 (1982)] med visse modifika-sjoner. D-Val-Leu-Lys-pNA (Kabi S-2251) benyttes som
substrat. Absorpsjonen ved 405 nm korrigeres ved uspesifikk spaltning og relateres til en urokinasestandard. Resultatene er gjengitt i tabell 2.
EKSEMPEL 10
Isolering og karakterisering av IGF- 1 fra en transformert gj ærstamme
a) Isolering av IGF- 1 fra kulturmediet
Gjærstamme pCl/l/PAPFL-IGF-1(UASl) kultiveres i 60 timer. 3 1
kulturbuljong høstes og sentrifugeres som beskrevet i eksempel 9. Analyse ved reversert fase HPLC av 2 ml super-natant (1:10 kons.) gir en titer på 1 mg/l IGF-1. Supernatanten behandles med 20 ml "SP-Sephadex C-25" (Pharmacia) ved pH 3,0 og omrøres i 60 minutter ved 4°C. Det absorberte IGF-1 isoleres fra den vaskede harpiksen ved hjelp av en natrium-acetatbuffergradient (50 mM, pH 3,0 til pH 8,0) og renses ytterligere ved hjelp av to ionevekslingstrinn. Det første trinnet utføres på en "CM-52" kolonne (Whatman, 1,5 cm x 8,5 cm, gradient, buffer A 20 mM NH40Ac pH 4,0; buffer B 100 mM NH40Ac, pH 6,8). Det andre trinnet utføres på en "DE-53" anionutvekslingskolonne (Whatman) (betingelser: 1,5 cm x 10,5 cm kolonne, strømning 1 ml/min., gradient, buffer A 20 mM NH4OAC pH 9,0; buffer B 200 mM NH40Ac pH 6,5). Den endelige rensingen utføres på en semipreparativ RP-HPLC-kolonne. Den aktive fraksjonen elueres med retensjonstid 21,3 minutter og gir 1,1 mg av 95% rente IGF-1.
Eksperimentelle betingelser: "Vydac 218 TP 510" RP-HPLC-kolonne, 10 x 250 mm; like store porsjoner (200 pl kon-sentrert 1:10) pr. separasjon; AUFS 0,5 ved 220 nm; strøm-ningshastighet: 3 ml/min. Elueringsmiddel: A: 0,1% trifluoreddiksyre, B: acetonitril/vann 8:2 + 0,7% trifluoreddiksyre, 3 minutter 35% B, deretter økes i løpet av 30 minutter til 45% B. De resulterende fraksjonene fortynnes 1:1 med vann og lyofiliseres.
b) Karakterisering av IGF- 1 fra fermentering av stammen
PCI/ I/ PAPFL- IGF- I( UASl)
Ifølge RP-HPLC-analyse er IGF-1 'isolert fra kulturmediet (kfr. eksempel 10a) identisk med autentisk IGF-1 fra serum.
Isoelektrisk punkt pl: 8,6 (isoelektrisk fokusering, TCA-utfelling av proteinet).
Bestemmelse av aminosyresammensetning
Ca. 2,5 pg av det rene IGF-1 hydrolyseres i 24 timer med 6 N HC1 ved 110"C og analyseres deretter som beskrevet av Chang et al. [DABS-C1 fremgangsmåte: Methods in Enzymology 91, 41
(1983)]. Hydrolysatet har følgende sammensetning:
Partiell sekvensanalyse
70 pg (10 nmol) av det rene IGF-1 underkastes en konvensjonell sekvensanalyse ifølge Edman. De N-terminale PTH-aminosyrene bestemmes ved hjelp av RP-HPLC.
Resultater:
n.d.: ikke bestemt
* : Cys (6) og Cys (18) bestemmes separat ved karboksy-metylering med jodacetamid.
Den partielle sekvensen fra aminosyre 1 til 50 er følgelig identisk med den publiserte primære sekvensen for autentisk IGF-1.
C- terminalanalyse
Det rene IGF-1 nedbrytes med karboksypeptidase Y og de frigitte aminosyrene bestemmes i aminosyreanalysatoren (kfr. J.Y. Chang, R. Knedel, D.G. Braun, Biochem. J. 199, 547).
Resultater:
Tilsynelatende molekylvekt
IGF-1 (30 pg) analyseres på en SDS-ureagel [SUDS gel; kfr. Kyte et al., Anal. Biochem. 133, 515 (1983)]. Et enkelt bånd tilsvarende til en tilsynelatende molekylvekt på 6 000 til 7 000 dalton observeres.
Molekylvektbesteromelse ved hielp av FAB- MS
IGF-1 underkastes positiv ionemassespektrometri med hurtig atombombardement (FAB-MS). Instrument: "ZAB-HF" massespektro-meter fra VG-Analytical Ltd., Manchester; matrise: triglyce-rol; Xenon bombardement; ioneenergi 3 KeV; eksternt kalibre-ring: CS30<J>29 (molekylvekt: 7 667,4).
Claims (9)
1.
Gjærhybridpromotor, karakterisert ved at den innbefatter: (a) et 5' oppstrøms promotorelement innbefattende (i) et DNA-molekyl valgt fra gruppen bestående av BamHI-BstEII-fragmentet mellom nukleotider -274 til -541 av gjær PH05-genet innbefattende oppstrømsaktiveringssekvensen UAS1(PH05),
og subfragmenter derav hvori UAS-funksjonen er bevart, og 31 bp DNA-fragmentet av formelen
og/eller (ii) et DNA-molekyl valgt fra gruppen bestående av Clal-BstEII-fragmentet mellom nukleotider -174 til -273 av gjær PH05-genet innbefattende oppstrømsaktiveringssekvensen UAS2( PH05) og subfragmenter derav hvori UAS-funksjonen er bevart, og (b) et 3' nedstrøms promotorelement av gjær GAPDH-genet med start ved nukleotid -300 til -180 og slutt ved nukleotid -1 av gjær GAPDH-genet.
2.
Gjærhybridpromotor ifølge krav 1, karakterisert ved at den som komponent (b) innbefatter nukleotider -199 til -1 av gjær GAPDH-genet.
3.
Gjærhybridpromotor ifølge krav 1, karakterisert ved at den som komponent (b) innbefatter nukleotider -263 til -1 av gjær GAPDH-genet.
4.
Gjærhybridvektor, karakterisert ved at den innbefatter et eller flere innskudd hvert innbefattende et DNA-segment som koder for et polypeptid som er heterologt med gjær under transkripsjonskontroll av en gjærhybridpromotor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3.
5.
Gjærhybridvektor ifølge krav 4, karakterisert ved at den innbefatter et DNA-segment som koder for et polypeptid av høyere eukaryotopphav.
6.
En Saccharomyces spee.-vert, karakterisert ved at den er transformert med en hybridvektor ifølge et hvilket som helst av kravene 4 og 5, og i stand til å uttrykke genet som koder for polypeptidet som er heterologt med gjær.
7.
Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid heterologt med gjær, karakterisert ved at en transformert Saccharom<y>ces vert ifølge krav 6 dyrkes, produksjon av det heterologe polypeptidet induseres og polypeptidet isoleres.
8.
Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det heterologe polypeptidet er av høyere eukaryotopphav .
9.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 7 eller 8, karakterisert ved at polypeptidet velges fra gruppen bestående av humant a-interferon, et humant hybridinterferon, humant t-PA, HBVsAg, desulfatohirudin, eglin C og insulin-lignende vekstfaktor.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB858521496A GB8521496D0 (en) | 1985-08-29 | 1985-08-29 | Repressible yeast promoters |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO863458D0 NO863458D0 (no) | 1986-08-28 |
NO863458L NO863458L (no) | 1987-03-02 |
NO175871B true NO175871B (no) | 1994-09-12 |
NO175871C NO175871C (no) | 1994-12-21 |
Family
ID=10584428
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO863458A NO175871C (no) | 1985-08-29 | 1986-08-28 | Gjærhybridpromotor, gjærhybridvektor, Saccharomyces spec.-vert, samt fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid heterologt med gjær |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5436136A (no) |
EP (1) | EP0213593B1 (no) |
JP (1) | JPH07110233B2 (no) |
AT (1) | ATE62510T1 (no) |
AU (1) | AU599329B2 (no) |
CA (1) | CA1318616C (no) |
DD (2) | DD254212A5 (no) |
DE (1) | DE3678647D1 (no) |
DK (1) | DK175093B1 (no) |
ES (3) | ES2001618A6 (no) |
FI (1) | FI91280C (no) |
GB (1) | GB8521496D0 (no) |
GR (1) | GR862209B (no) |
HU (1) | HU211207B (no) |
IE (1) | IE58844B1 (no) |
IL (1) | IL79837A (no) |
NO (1) | NO175871C (no) |
NZ (1) | NZ217388A (no) |
PH (1) | PH24715A (no) |
PT (1) | PT83273B (no) |
SU (1) | SU1630616A3 (no) |
ZA (1) | ZA866535B (no) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU621277B2 (en) * | 1985-11-13 | 1992-03-12 | Xoma Corporation | Shortened phosphoglycerate kinase promoter |
GB8530631D0 (en) | 1985-12-12 | 1986-01-22 | Ciba Geigy Ag | Thrombin inhibitors |
MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
GB8620926D0 (en) * | 1986-08-29 | 1986-10-08 | Delta Biotechnology Ltd | Yeast promoter |
GB8907110D0 (en) * | 1988-05-04 | 1989-05-10 | Ciba Geigy Ag | Improvements in the production of polypeptides |
NO177065C (no) * | 1988-09-26 | 1995-07-12 | Labofina Sa | Framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt humant lysozym |
JPH06500470A (ja) * | 1990-09-04 | 1994-01-20 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生 |
US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
ATE220105T1 (de) * | 1991-04-01 | 2002-07-15 | Merck & Co Inc | Gene, die die proteolytische aktivitaet von pichia beeinflussen und deren verwendung |
US5674728A (en) * | 1993-11-03 | 1997-10-07 | Novartis Corporation | Aspergillus niger vacuolar aspartyl protease |
JPH08173170A (ja) * | 1994-05-25 | 1996-07-09 | Kirin Brewery Co Ltd | キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換系、およびそれによる異種遺伝子の発現 |
ATE284972T1 (de) * | 1996-09-24 | 2005-01-15 | Cadus Pharmaceutical Corp | Verfahren und zusammensetzungen für die identifizierung von receptor effectoren |
US6265186B1 (en) | 1997-04-11 | 2001-07-24 | Dsm N.V. | Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal RNA encoding domain, particularly with Kluyveromyces |
US6890730B1 (en) | 1999-12-10 | 2005-05-10 | The Salk Institute | Sequence and method for increasing protein expression in cellular expression systems |
US8008459B2 (en) * | 2001-01-25 | 2011-08-30 | Evolva Sa | Concatemers of differentially expressed multiple genes |
EP2571991A1 (en) | 2010-05-20 | 2013-03-27 | Evolva SA | Method of producing isoprenoid compounds in yeast |
PE20231212A1 (es) | 2020-04-20 | 2023-08-17 | Vestaron Corp | Polipeptidos variantes proteoliticamente estables de u1-agatoxina-ta1b para el control de plagas |
TW202205956A (zh) | 2020-05-01 | 2022-02-16 | 美商韋斯塔隆公司 | 殺蟲組合 |
CA3215602A1 (en) | 2021-04-01 | 2022-10-06 | Vestaron Corporation | Av3 mutant polypeptides for pest control |
WO2023122805A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Vestaron Corporation | Sorbitol driven selection pressure method |
WO2023225555A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Vestaron Corporation | Pesticidal actx peptide variants |
WO2023245100A1 (en) | 2022-06-17 | 2023-12-21 | Vestaron Corporation | Antimicrobial ncr13 variant peptides |
WO2024026406A2 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Vestaron Corporation | Next Generation ACTX Peptides |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
US4876197A (en) * | 1983-02-22 | 1989-10-24 | Chiron Corporation | Eukaryotic regulatable transcription |
NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
DE3485810T2 (de) * | 1983-05-27 | 1992-12-10 | Texas A & M University Syst | Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors. |
GB8314961D0 (en) * | 1983-05-31 | 1983-07-06 | Kingsman A J | Dna sequence |
DE3479520D1 (en) * | 1983-11-21 | 1989-09-28 | Ciba Geigy Ag | Synthesis of tissue plasminogen activator(tpa) by yeast |
EP0164556B1 (en) * | 1984-05-11 | 1994-03-02 | Chiron Corporation | Enhanced yeast transcription employing hybrid promoter region constructs |
EP0164566A3 (de) * | 1984-05-11 | 1986-10-29 | LGA Gastechnik GmbH | Sicherheitseinrichtung für Flüssiggastanks |
US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
-
1985
- 1985-08-29 GB GB858521496A patent/GB8521496D0/en active Pending
-
1986
- 1986-08-25 FI FI863430A patent/FI91280C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-08-25 IL IL79837A patent/IL79837A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-08-26 AT AT86111820T patent/ATE62510T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-26 DE DE8686111820T patent/DE3678647D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-26 EP EP86111820A patent/EP0213593B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-27 GR GR862209A patent/GR862209B/el unknown
- 1986-08-27 DD DD29389486A patent/DD254212A5/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-27 CA CA000516879A patent/CA1318616C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-27 DD DD31325586A patent/DD267739A5/de unknown
- 1986-08-28 PT PT83273A patent/PT83273B/pt unknown
- 1986-08-28 NZ NZ217388A patent/NZ217388A/xx unknown
- 1986-08-28 PH PH34192A patent/PH24715A/en unknown
- 1986-08-28 NO NO863458A patent/NO175871C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-08-28 ZA ZA866535A patent/ZA866535B/xx unknown
- 1986-08-28 IE IE230786A patent/IE58844B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-08-28 HU HU863720A patent/HU211207B/hu unknown
- 1986-08-28 DK DK198604096A patent/DK175093B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-08-28 AU AU62032/86A patent/AU599329B2/en not_active Expired
- 1986-08-28 SU SU864028035A patent/SU1630616A3/ru active
- 1986-08-29 ES ES8601490A patent/ES2001618A6/es not_active Expired
- 1986-08-29 JP JP61201924A patent/JPH07110233B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-03-16 ES ES8800794A patent/ES2006382A6/es not_active Expired
- 1988-03-16 ES ES8800795A patent/ES2006383A6/es not_active Expired
-
1991
- 1991-12-20 US US07/811,898 patent/US5436136A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO175871B (no) | ||
EP0100561B1 (en) | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides | |
US5102789A (en) | Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells | |
EP0123544A2 (en) | Process for expressing heterologous protein in yeast, expression vehicles and yeast organisms therefor | |
EP0088632B1 (en) | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast | |
Chang et al. | Saccharomyces cerevisiae secretes and correctly processes human interferon hybrid proteins containing yeast invertase signal peptides | |
CZ284251B6 (cs) | Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce | |
JPH07503368A (ja) | 新規な生物活性ポリペプチド類,ならびにそれらの製造および含有薬学組成物 | |
FI94773B (fi) | Menetelmä trombiini-inhibiittorien tuottamiseksi | |
JPS6236183A (ja) | サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌 | |
CN113423836A (zh) | 重组宿主细胞中碳源调节的蛋白的产生 | |
US5939287A (en) | Method for production of proteins in yeast | |
US7198919B1 (en) | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems | |
NO179046B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktivt human enkelt kjede urokinase-type plasminogenaktivator | |
EP0264118B1 (en) | Novel method for preparing proteins | |
Goodey et al. | Expression and secretion of foreign polypeptides in yeast | |
KR940011534B1 (ko) | 억제성 효모 프로모터의 제조방법 | |
PH26266A (en) | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |