NO175182B - - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte og et middel for konservering av høy. Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Hvert år høstes det ca. 150 millioner tonn høy i USA. Produksjonstapet er kanskje større enn for noen annen type avling. Disse tap skyldes ugunstig, alfalfamodning, regnskader, samt tap under innhøsting og lagring. Normalt ligger tapene på mellom 20-40 %, men under ugunstige værforhold kan de også være så store som 70 %. Tapene er et resultat av kontinuerlig planterespirasjon, av at bladene smuldrer og ødelegges mekanisk og av utvasking grunnet regn. Fremstilling av høyballer med en fuktighet som er høyere enn normalt

(25-30 %), reduserer risikoen for regnskader og tap grunnet maskinmessige skader på bladene, men fremstilling av høyballer med en fuktighet over 20 % innebærer imidlertid økt risiko for større tap under lagring, grunnet oksydasjon og mugg.

Tapet av næring under lagring er betydelig, men det lar seg likevel kontrollere. Høy som lagres i en bygning med et fuktighetsnivå under 2 0 %, har normalt et tørrstoffstap på mellom 5-10 %. Høy fuktighet stimulerer aktiviteten av aerobe, oksy-derende mikroorganismer, og dette utvikler varme. Usedvanlig høye temperaturer fører til tap av tørrstoff på grunn av respirasjon, som gir C02 og vann. Varmen forårsaker også næringstap grunnet ikke-enzymatiske bruningsreaksjoner. Den varmemengde som utvikles avhenger av vannkonsentrasjonen i høyet, omgivelsestemperaturen, mikrobielle populasjoner samt ballenes størrelse og tetthet.

Usedvanlig store varmeskader reduserer fordøybart protein og tilgjengelig energi. Varmeskadet protein måles ved å bestemme nitrogeninnholdet i fiberen i form av syre-detergent-fiber-nitrogen (ADIN eller ADF-N), dvs. nitrogen som er bundet til fiber og hvor høye nivåer generelt indikerer at høyet er varmet opp slik at proteinet således ikke er tilgjengelig for dyret. Under normale forhold bør fiberen inneholde mindre enn 7 % av totalt nitrogen. Når denne verdien når 15 %, har det forekommet usedvanlig store varmeskader.

Muggskader under lagring kan også forårsake store tap. Kun ca. 5 % av muggen utvikler mycotoksiner. De kan imidlertid ha en ugunstig effekt på smak og forinntak. Dersom dyrene fores med muggent høy, spiser de mindre tørrstoff og går ned i vekt. Dette resulterer også i dårligere omdanning av for. Slike tap kan være så store som 25 %, sammenlignet med kontrollfor som ikke er muggent.

Lagret høy har naturlige og passende forekomster av epifytter. Disse epifyttene kan ha en gunstig eller ugunstig virkning på høyets kvalitet, og de konkurrerer innbyrdes om å dominere økologien i det lagrede høyet. Epifyttene er enten bakterier eller sopp. De vanlige bakterielle, ødeleggende organismer hører til slektene Sporosarcina og Bacillus. Soppskader forårsakes ofte av medlemmer av slektene Aspergillus, Penicillium og Mucor.

Det er blitt foretatt atskillige forsøk med sikte på å begrense formeringen av de epifytter som er ansvarlig for skade på jordbruksprodukter. En metode har vært å sprøyte en mugg-inhibitor som f.eks. propionsyre på jordbruksprodukter på lagringstidspunktet. Den store ulempen ved denne metoden er utgiftene, da det skal store mengder syre til for å behandle jordbruksproduktene på riktig måte. På grunn av toksisiteten og korrosjonene som er forbundet med syre, må gårdbrukeren dessuten benytte spesielle teknikker for å beskytte arbeiderne som bruker syren. Videre må alt utstyr som kommer i kontakt med syren vaskes grundig, slik at korrosjonsskader unngås. Det har tidligere vært foreslått bruk av en uorganisk salt-blanding med sinkoksyd, magnesiumoksyd samt en vannoppløselig kobberionkilde, kombinert med en organisk syre, som f.eks. eddiksyre, propionsyre eller sorbinsyre [C6H802] .

Til tross for at dette området er grundig utforsket når det gjelder utviklingen av diverse produkter til bruk for inoku-lering av landbruksprodukter, er imidlertid ødelagt høy et vedvarende problem.

Et av formålene med den foreliggende oppfinnelse er følgelig å tilveiebringe et middel for konservering av høy med en sam-mensetning som kun tilfører høyet naturlig forekommende organismer på nivåer som hemmer veksten av ødeleggende organismer, samtidig som det reduserer varmen i meget fuktig høy.

Middelet gir forbausende nok en effektiv varmereduksjon i svært fuktig høy uten at det er nødvendig å tilføre kunstige tilsetningsmidler.

Videre er et av formålene med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et middel for konservering av høy med en sammen-setning som ikke representerer noen risiko for forurensninger.

Et av formålene med den foreliggende oppfinnelse er likeledes å tilveiebringe et middel for konservering av høy som sikrer høyprodukter med god kvalitet som målt ved temperatur, gjen-vinning av tørrstoff, nitrogenprofil, farge og forekomst av mikroorganismer inklusive gjær og mugg.

Nok et formål med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for konservering av høy hvor konserve-rende mengder av en eller flere stammer av mikroorganismen Bacillus pumilus tilføres høyet.

Likeledes er et av formålene med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et middel for konservering av høy som ved påføring på høyet reduserer risikoen for varmenedbrytning av høyet samtidig som de hemmer veksten av ødeleggende organismer som f.eks. Aspergillus flavus.

En mer detaljert beskrivelse av oppfinnelsen er gitt i det etterfølgende.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for konservering av høy som er kjennetegnet ved at det til friskt høy tilsettes fra IO<5> til IO<15> levedyktige mikroorganismer pr. tonn høy av en eller flere stammer av mikroorganismen Bacillus pumilus valgt fra dem med henholdsvis ATCC nr. 53682, 53 683, 53684, 53685, 53686, 53687, 53688 og 53689.

Oppfinnelsen vedrører også et middel for konservering av høy som er kjennetegnet ved at middelet pr. gram inneholder fra IO<2> til IO<12> levedyktige mikroorganismer valgt fra en eller flere av Bacillus pumilus-stammer med henholdsvis ATCC nr. 53682, 53683, 53684, 53685, 53686, 53687, 53688 og 53689, og at middelet dessuten inneholder en bærer og eventuelt kjente tilsetningsstoffer.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse behandles høy med en eller flere stammer av mikroorganismen Bacillus pumilus for å bevare høykvaliteten. Bacillus pumilus er i stand til å inhibere ødeleggende organismer som er ansvarlig for at høy nedbrytes når det lagres over lengre perioder.

Høy som ødelegges grunnet nedbryting forårsaket av vekst av ødeleggende organismer er et stort problem blant gårdbrukere. Blant typiske ødeleggende organismer er slekten Aspergillus og arten Aspergillus flavus, så vel som slektene Penicillium og Mucor.

Ifølge undersøkelser som er foretatt er det ca. 97 % sannsyn-lighet for at høyballer med et vanninnhold på mer enn 25 % vil utvikle varme og mugne. Slike oppvarmede høyballer har en påfallende dårligere farge og næringsverdi og har mere synlig mugg.

Undersøkelser har vist at Bacillus pumilus-stammer bevarer høyets kvalitet. Uten å ville binde seg til en funksjonsteori antas det at Bacillus pumilus produserer en eller flere inhiberende forbindelser som hemmer veksten av sopp og bakterier, som f.eks. den isolerte bakterien Sporosarcina. Sporosarcina forårsaker de uønskede hvite ansamlinger som kan ses på høystråene etter få dagers lagring. Disse organismene observeres typisk i svært varme baller. Det virker også som om de stimulerer veksten av sopp, enten samtidig med sin egen vekst eller på et senere stadium.

Forståelse av mikrobielle interaksjoner er et meget viktig element i bruken av disse stammer ved forbedring av kvaliteten på lagret høy. I begynnelsen idet høyballene fremstilles finner man store ansamlinger av én gruppe av mikroorganismer (den Gram-positive gruppen). Bacillus pumilus hører til denne gruppen, dvs. den Gram-positive gruppen. Dersom den utvalgte Bacillus pumilus forekommer i store mengder, som beskrevet i det etterfølgende, vil høyet på dette stadiet ikke varmes opp eller mugne. Senere, etter hvert som Bacillus pumilus-popula-sjonen avtar, dominerer andre mikrofloragrupper. På slutten av lagringsperioden når høyet brukes til for, inngår Bacillus pumilus som en del av mikrofloraen. Igjen ønsker ikke søkeren å binde seg til noen teori. Det er imidlertid mulig at Bacillus pumilus kan innvirke på høykvaliteten ved ganske enkelt å konkurrere med andre tilstedeværende organismer om næringsstoffene.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen behandles høy med en høykonserverende effektiv mengde mikroorganismer av Bacillus pumilus-stammer for å forbedre konserveringen og for å opp-rettholde kvaliteten på høyet, samt for å begrense formeringen av ødeleggende organismer.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttig ved at organismene som anvendes er ikke-patogene og forekommer naturlig i små mengder i høy, og de forårsaker derfor ikke sykdommer hos dyr som inntar det konserverte landbrukspro-duktet. I motsetning til mange typer konserveringsmidler som benytter dyre og ofte farlige kjemikalier, beror fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen istedet på en økt kolonisering av

ønskede, naturlig forekommende organismer, gjennom å øke deres evne til å konkurrere med naturlig forekommende og ødeleggende organismer som f.eks. Aspergillus flavus. Det er meget viktig

å kontrollere disse skadelige organismene da mange av dem er sopper som ødelegger konserverte landbruksprodukter og som er kjent for å produsere kraftige mycotoksiner. Disse mycotok-sinene er kjent for å forårsake sykdom og til og med død blant dyr som inntar for som er forurenset av disse soppene.

Visse foretrukne stammer av Bacillus pumilus er isolert og funnet mest fordelaktige for anvendelse. Disse stammene er tilgjengelige og er identifisert som stamme nr. 288, 289, 290, 296, 299, 302, 305 og 307. Stammene er deponert hos The American Type Culture Collection i Rockville, Maryland, og de er videre identifisert med henholdsvis ATCC nr. 53682, 53683, 53684, 53685, 53686, 53687, 53688 og 53689. Det kan anvendes en blanding av disse foretrukne stammer eller det kan anvendes en mindre kombinasjon derav eller ganske enkelt én stamme.

Bacillus pumilus-stammer ble isolert fra lagret høy ved hjelp av vel kjente teknikker innen fagområdet som beskrevet generelt ovenfor. Andre Bacillus pumilus-stammer kan isoleres og testes ved rutineforsøk for å bedømme virkningen derav for bevaring av høyets kvalitet.

Med "høy" menes alle typer høy slik ordet vanligvis forstås innen landbruket. Høy består vanligvis av alfalfa, gress eller blandinger av alfalfa og gress. Det er mulig at middelet for konservering av høy ifølge den foreliggende oppfinnelse også kan benyttes som et effektivt inokulerings-middel i siloer, slik at ødeleggelsen av ensilasjen reduseres. En annen klar mulighet er at middelet kan fungere effektivt når det gjelder å konservere korn, som f.eks. mais, hvete, ris og soyabønner.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse inhiberes organismene som ødelegger høyet ved å tilføre en eller flere stammer av mikroorganismen Bacillus pumilus eller et middel som inneholder en eller flere av disse til høyet.

Middelet som benyttes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan enten være i fast eller flytende form, og kan eventuelt inneholde ytterligere bakteriestammer. Når middelet er i fast form kan det inneholde en eller flere Bacillus pumilus-stammer sammen med en bærer. Bæreren kan være en vannholdig eller ikke-vannholdig væske eller et faststoff. I fast form kan middelet inneholde faste bærere eller fysiske ekstendere. Eksempler på slike faste bærere, faste fortynningsmidler eller fysiske ekstendere er maltdekstrin, stivelser, kalsiumkar-bonat, cellulose, myse, malte maiskolber og silisiumdioksyd. Bæreren kan foreligge i form av en organisk eller en uorganisk, fysisk ekstender. Det faste middelet kan direkte påføres på høyet i form av et lett pulver, eller dersom det er fordelt i en flytende bærer, kan høyet sprøytes med et vellykket resultat.

Middelet ifølge oppfinnelsen som anvendes for behandling av høy inneholder 10<2->10<12> levedyktige organi smer/gram middel, fortrinnsvis 10<4->10<10> levedyktige organismer/gram middel og særlig 10s<->10<7> levedyktige organismer/gram middel.

Behandlingsområdet for høy er typisk 10<5->10<15> levedyktige organismer/tonn høy, fortrinnsvis 10<7->10<13> levedyktige organismer/tonn høy, og særlig 10<8->10<10> levedyktige organismer/tonn høy.

Middelet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan i tillegg til en eller flere Bacillus pumilus-stammer omfatte andre vanlige organismer som benyttes til konservering av landbruksprodukter, som f.eks. Lactobacillus, Streptococcus og Pediococcus og visse enzymer fra sopp eller bakterier.

Den fagkyndige på området kjenner til andre egnede bærere og doseringsformer eller er i stand til å innhente kunnskap om slike ved å foreta rutineforsøk. Videre kan de forskjellige midler administreres ved hjelp av standardteknikker som er ålment kjent på fagområdet.

Redegjørelsen ovenfor gir en generell beskrivelse av den foreliggende oppfinnelse. De etterfølgende spesifikke eksempler er kun gitt for å belyse oppfinnelsen. Det vises til disse eksemplene for en mer fullstendig forståelse av oppfinnelsen.

EKSEMPLER

Høy ble inokulert med en blanding bestående av Bacillus pumilus-stammer nr. 288, 289, 290, 296, 299, 302, 305 og 307.

Kvaliteten på høyet ble fastsatt ved analyse av temperatur, mikroflora og næringsverdi. Alle behandlingene ble tillagt en verdi basert på visuelle undersøkelser av farge, forekomster av hvite ansamlinger og muggsporer.

Alfalfa ble slått med en slåmaskin og tørket på marken under normale forhold. Høyet som var slått ble hesjet og raket kun én gang før fremstilling av høyballer. Tørketid, modning og værforhold ble notert. I alle undersøkelsene ble høyballene fremstilt med et fuktighetsnivå på 22-34 %, men innen hver undersøkelse varierte fuktigheten på høyet kun 2-5 % mellom behandlings- og kontrollballer.

Følgende protokoll ble fulgt for eksperimenter med mindre, firkantede baller. Høyet ble sprøytebehandlet med vannopp-løselige konserveringsmidler. I de mer omfattende forsøkene ble behandlingen gjennomført på 15-20 baller som hver var på 45 kg. Ikke-inokulerte kontrollballer ble også tilberedt. I alt ble det tilberedt 15-20 baller i kontrolløyemed. Høyet ble kjørt fra jordet, stakket og lagret på trepaller på et sementgulv i et lukket skur. Temperaturmålere ble plassert midt i hver stakk, og temperaturen ble registrert hver. time.

Et mindre modellsystem ble også utviklet for å simulere større undersøkelser av baller. Høy i en mengde på 0,45 kg ble pakket inn i en beholder av isoleringsmaterial ["styrofoam"]

(med 50,8 mm tykke vegger), som målte 152,4 mm x 254,0 mm x 152,4 mm. Høyet ble sammenpresset ved hjelp av en mursten plassert på toppen av høyet, etter at en termistor var blitt

plassert midt i høymassen. "Styrofoam"-lokket ble lagt lett på toppen, og hele beholderen ble plassert i en inkubator med en temperatur på 37"C, for å starte oppvarmingen. Høyet ble så behandlet med f.eks. et apparat som vanligvis anvendes til spraying av kromatografiplater og som kalles en glass-TLC-sprayer.

En anordning som f.eks. en "Penn State Forage Sampler" ble anvendt for å ta ut seks kjerneprøver/prøvetid fra høyballene. Innen hver stakk tok man prøver av to baller nederst, to i midten og to på toppen, for å minimalisere variasjoner i stakken. Kjerneprøvene ble plassert i sterile poser, gruppert for hver behandling, lagt på is og kjørt til laboratoriet. En prøve ble tatt fra midten av modellballene i beholderne av "styrofoam". Prøvetidene var på ca. 0, 2, 7, 14, 21, 3 0 og 60 dager.

Etter at høyet var sprøytebehandlet lå mikroorganismetallet for Bacillus pumilus på lOVgram høy. Dette tilsvarer et organismetall på IO<9>/tonn høy. Organismene besto av en blanding av like deler av Bacillus pumilus-stammer nr. 288, 289, 290, 296, 299, 302, 305 og 307. Behandlingene med Bacillus pumilus ble forberedt ved separat dyrking av de åtte stammene i et tryptisk soyamedium i 24 timer ved en temperatur på 37'C. Cellene ble fjernet ved sentrifugering ved en temperatur på 4'C, og cellepelleten ble resuspendert i 0,04 M fosfatbuffer. Cellene ble lagt på is og kjørt til jordet og påført umiddelbart, eller de ble frosset til -70'C for senere bruk. Før påføring på høyet ble cellene dispergert i 19 1 vann og påført (19 1 pr. tonn) med en sprøyte festet til høyballepressen. De kolonidannende enheter ble bestemt ved tidspunktet for påføring.

Prøvene ble analysert for innhold av tørrstoff, ADF, ADF-N, NDF og N. Temperaturen ble målt hver time ved hjelp av temperaturtermistorer med en nøyaktighet på inntil ± 0,2'C. Dataene ble analysert ved anvendelse av en kovariantanalyse i forbindelse med tørrstoffet (DM) og ved anvendelse av temperaturen på dag 0.

Høyet ble observert visuelt i hele prøvetiden og på slutten av hver lagringsperiode slik at man kunne fastslå om det var dekket av mugg og hvit, ødeleggende mikroflora. Høyet ble evaluert for mugg og hvit, ødeleggende mikroflora med en skala fra 1 til 10, hvor 10 representerte den dårligste kvalitet. Fargeforskjellene ble fastlagt på slutten av lagringsperioden og sammenlignet ved hjelp av et fargekart. Fargene varierte fra grønn 1 til brun 23.

I det mindre modellsystemet gir temperaturforandringene mellom forsøkene de mest informative resultater, da termistorene har en nøyaktighet på opp til ± 0,2'C og avlesningene ble foretatt hver time. Dette ga et resultat på ca. 500 datapoeng (idivi-duell observasjon av data)/behandling/forsøk. Totalt sett var Bacillus den behandlingen med desidert laveste temperatur i de eksperimentelle modellene (tabellene 1 og 2). Denne behandlingen hadde en tendens til lavere gjær- og muggforekomster. Baeillus-behandlingen ga også betydelig høyere næringsverdier (lavere ADF). NDF, ADF-N, WSC, N og de tilgjengelige protein-bestemmelser hadde også en tendens til å vise høyere næringsverdier, skjønt disse forskjellene ikke var signifikante. Baeillus-behandlingen ga også betydelig høyere visuelle verdier, med mindre synlig mugg. Fargeverdiene var mindre konsekvente, og viste ingen forskjell mellom behandlingene i disse små modellballene.

De samme tendensene som vist for modellsystemet i tabell 1 og 2 ble observert i de større høyballene, som angitt i tabell 3 og 4 nedenfor. Med andre ord var Bacillus-behandlet høy kaldere enn kontrollene. Gjær- og muggforekomstene var like i alle ballene, men synlig mugg var redusert i forbindelse med Bacillus pumilus-behandlingen og fargen var grønnere. Næringsanalyser viste også lignende tendenser som observert i modellsystemet, tabell 1 og 2. Tilgjengelig protein (AP) var høyere i ballene behandlet med Bacillus pumilus-stammer, og ADF og NDF (nøytral detergent fiber) verdiene viste høyest næringskvalitet i disse behandlede ballene.

Behandling av høy med Bacillus pumilus-stammer resulterte i kaldere, mindre mugne og grønnere baller enn ikke-inokulerte kontrollballer. Behandling med Bacillus pumilus-stammer ga også baller med høyere disponibelt proteininntak, totalt fordøyelig næringsinntak og daglig energiinntak.

Når besprøytningen i eksemplene ovenfor erstattes av pulver-behandling, slik at man oppnår det organismenivået som ligger innenfor verdiene spesifisert i disse spesifikke eksemplene, oppnås lignende resultater i og med at ballene blir kalde, dvs. man oppnår en varmereduksjon, veksten blant de ødeleggende organismene i mikrofloraen hemmes, og høyets næringsverdi stiger.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for konservering av høy, karakterisert ved at det til friskt høy tilsettes fra IO<5> til IO<15> levedyktige mikroorganismer pr. tonn høy av en eller flere stammer av mikroorganismen Bacillus pumilus valgt fra dem med henholdsvis ATCC nr. 53 682, 53683, 53684, 53685, 53686, 53687, 53688 og 53689.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at mikroorganismen tilsettes ved påsprøyting på høyet.

3. Middel for konservering av høy, karakterisert ved at middelet pr. gram inneholder fra IO<2> til IO<12> levedyktige mikroorganismer valgt fra en eller flere av Bacillus pumilus-stammer med henholdsvis ATCC nr. 53682, 53683, 53684, 53685, 53686, 53687, 53688 og 53 689, og at middelet dessuten inneholder en bærer og eventuelt kjente tilsetningsstoffer.

4. Middel som angitt i krav 3, karakterisert ved at middelet pr. gram inneholder fra IO<4> til IO<10> levedyktige mikroorganismer og særlig fra IO<5> til IO<7> levedyktige mikroorganismer valgt fra en eller flere av Bacillus pumilus-stammer med henholdsvis ATCC nr. 53682, 53683, 53684, 53685, 53686, 53687, 53688 og 53689.