NO172459B - Stabil immobilisert haptenreagens for anvendelse i heterogene immunometriske analyser, samt anvendelse derav - Google Patents
Stabil immobilisert haptenreagens for anvendelse i heterogene immunometriske analyser, samt anvendelse derav Download PDFInfo
- Publication number
- NO172459B NO172459B NO874937A NO874937A NO172459B NO 172459 B NO172459 B NO 172459B NO 874937 A NO874937 A NO 874937A NO 874937 A NO874937 A NO 874937A NO 172459 B NO172459 B NO 172459B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hapten
- reagent
- immobilized
- gel particle
- bound
- Prior art date
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 166
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 15
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 claims abstract description 57
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 50
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims abstract description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims abstract description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- XZTUSOXSLKTKJQ-CESUGQOBSA-N digitoxigenin Chemical compound C1([C@H]2CC[C@]3(O)[C@H]4[C@@H]([C@]5(CC[C@H](O)C[C@H]5CC4)C)CC[C@@]32C)=CC(=O)OC1 XZTUSOXSLKTKJQ-CESUGQOBSA-N 0.000 claims description 46
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- XZTUSOXSLKTKJQ-UHFFFAOYSA-N Uzarigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C1(O)CCC2C1=CC(=O)OC1 XZTUSOXSLKTKJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 claims description 28
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 claims description 27
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 claims description 27
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 19
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 8
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- -1 acyclic alkyl ethers Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 5
- XQUPVDVFXZDTLT-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]methyl]phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(C=C1)=CC=C1CC1=CC=C(N2C(C=CC2=O)=O)C=C1 XQUPVDVFXZDTLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- WDJUZGPOPHTGOT-OAXVISGBSA-N Digitoxin Natural products O([C@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@@](C)([C@H](C6=CC(=O)OC6)CC5)CC4)CC3)CC2)C[C@H]1O)[C@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 WDJUZGPOPHTGOT-OAXVISGBSA-N 0.000 claims description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 4
- WDJUZGPOPHTGOT-XUDUSOBPSA-N digitoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)CC5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O WDJUZGPOPHTGOT-XUDUSOBPSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000648 digitoxin Drugs 0.000 claims description 4
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 1-[1-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(CCCCC)N1C(=O)C=CC1=O AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- SUTWPJHCRAITLU-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexan-1-ol Chemical compound NCCCCCCO SUTWPJHCRAITLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 claims description 2
- FOOPZYBJIJNBLQ-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanamine Chemical compound NCCOCCOCCOCCOCCOCCN FOOPZYBJIJNBLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- YOOSAIJKYCBPFW-UHFFFAOYSA-N 3-[4-(3-aminopropoxy)butoxy]propan-1-amine Chemical compound NCCCOCCCCOCCCN YOOSAIJKYCBPFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 22
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 18
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 abstract description 16
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 72
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 72
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 34
- 241000894007 species Species 0.000 description 31
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 29
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 18
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 16
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 15
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 11
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 11
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 9
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 8
- ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N p-methoxybenzaldehyde Chemical compound COC1=CC=C(C=O)C=C1 ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- QULZFZMEBOATFS-DISONHOPSA-N 7-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyphenoxazin-3-one Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C(N=C2C(=CC(=O)C=C2)O2)C2=C1 QULZFZMEBOATFS-DISONHOPSA-N 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) carbonochloridate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(Cl)=O)C=C1 NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N Acolongiflorosid K Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1CC2(O)CCC3C4(O)CCC(C=5COC(=O)C=5)C4(C)CC(O)C3C2(CO)C(O)C1 LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N Ouabain Natural products O([C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1)[C@H]1C[C@@H](O)[C@@]2(CO)[C@@](O)(C1)CC[C@H]1[C@]3(O)[C@@](C)([C@H](C4=CC(=O)OC4)CC3)C[C@@H](O)[C@H]21 LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000166550 Strophanthus gratus Species 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N ouabain Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@@]2(O)CC[C@H]3[C@@]4(O)CC[C@H](C=5COC(=O)C=5)[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@@H]3[C@@]2(CO)[C@H](O)C1 LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N 0.000 description 3
- 229960003343 ouabain Drugs 0.000 description 3
- 229920003192 poly(bis maleimide) Polymers 0.000 description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000002522 swelling effect Effects 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- IPFDTWHBEBJTLE-UHFFFAOYSA-N 2h-acridin-1-one Chemical compound C1=CC=C2C=C3C(=O)CC=CC3=NC2=C1 IPFDTWHBEBJTLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010936 aqueous wash Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- DJVKJGIZQFBFGS-UHFFFAOYSA-N n-[2-[2-(prop-2-enoylamino)ethyldisulfanyl]ethyl]prop-2-enamide Chemical compound C=CC(=O)NCCSSCCNC(=O)C=C DJVKJGIZQFBFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000020004 porter Nutrition 0.000 description 2
- REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N procainamide Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000244 procainamide Drugs 0.000 description 2
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- LOUPRKONTZGTKE-LHHVKLHASA-N quinidine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@H]2[C@@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-LHHVKLHASA-N 0.000 description 2
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N (16alpha,17betaOH)-Estra-1,3,5(10)-triene-3,16,17-triol Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(C(O)C4)O)C4C3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- CFMZSMGAMPBRBE-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyisoindole-1,3-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N(O)C(=O)C2=C1 CFMZSMGAMPBRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- BYMMIQCVDHHYGG-UHFFFAOYSA-N Cl.OP(O)(O)=O Chemical compound Cl.OP(O)(O)=O BYMMIQCVDHHYGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- HCYAFALTSJYZDH-UHFFFAOYSA-N Desimpramine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2N(CCCNC)C2=CC=CC=C21 HCYAFALTSJYZDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 description 1
- 108010014663 Glycated Hemoglobin A Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KEECCEWTUVWFCV-UHFFFAOYSA-N N-acetylprocainamide Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=CC=C(NC(C)=O)C=C1 KEECCEWTUVWFCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- URWAJWIAIPFPJE-UHFFFAOYSA-N Rickamicin Natural products O1CC(O)(C)C(NC)C(O)C1OC1C(O)C(OC2C(CC=C(CN)O2)N)C(N)CC1N URWAJWIAIPFPJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- KIPLYOUQVMMOHB-MXWBXKMOSA-L [Ca++].CN(C)[C@H]1[C@@H]2[C@@H](O)[C@H]3C(=C([O-])[C@]2(O)C(=O)C(C(N)=O)=C1O)C(=O)c1c(O)cccc1[C@@]3(C)O.CN(C)[C@H]1[C@@H]2[C@@H](O)[C@H]3C(=C([O-])[C@]2(O)C(=O)C(C(N)=O)=C1O)C(=O)c1c(O)cccc1[C@@]3(C)O Chemical compound [Ca++].CN(C)[C@H]1[C@@H]2[C@@H](O)[C@H]3C(=C([O-])[C@]2(O)C(=O)C(C(N)=O)=C1O)C(=O)c1c(O)cccc1[C@@]3(C)O.CN(C)[C@H]1[C@@H]2[C@@H](O)[C@H]3C(=C([O-])[C@]2(O)C(=O)C(C(N)=O)=C1O)C(=O)c1c(O)cccc1[C@@]3(C)O KIPLYOUQVMMOHB-MXWBXKMOSA-L 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000005396 acrylic acid ester group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000001780 adrenocortical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 description 1
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- KRMDCWKBEZIMAB-UHFFFAOYSA-N amitriptyline Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2C(=CCCN(C)C)C2=CC=CC=C21 KRMDCWKBEZIMAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000836 amitriptyline Drugs 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- CQIUKKVOEOPUDV-IYSWYEEDSA-N antimycin Chemical compound OC1=C(C(O)=O)C(=O)C(C)=C2[C@H](C)[C@@H](C)OC=C21 CQIUKKVOEOPUDV-IYSWYEEDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical group OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 description 1
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N carbamazepine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000623 carbamazepine Drugs 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N cinchonine Natural products C1C(C(C2)C=C)CCN2C1C(O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQIUKKVOEOPUDV-UHFFFAOYSA-N citrinine Natural products OC1=C(C(O)=O)C(=O)C(C)=C2C(C)C(C)OC=C21 CQIUKKVOEOPUDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N cytochalasin Natural products N1C(=O)C2(C(C=CC(C)CC(C)CC=C3)OC(C)=O)C3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 229960003914 desipramine Drugs 0.000 description 1
- UVTNFZQICZKOEM-UHFFFAOYSA-N disopyramide Chemical compound C=1C=CC=NC=1C(C(N)=O)(CCN(C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 UVTNFZQICZKOEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001066 disopyramide Drugs 0.000 description 1
- ODQWQRRAPPTVAG-GZTJUZNOSA-N doxepin Chemical compound C1OC2=CC=CC=C2C(=C/CCN(C)C)/C2=CC=CC=C21 ODQWQRRAPPTVAG-GZTJUZNOSA-N 0.000 description 1
- 229960005426 doxepin Drugs 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N estriol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H]([C@H](O)C4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960001348 estriol Drugs 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- HAPOVYFOVVWLRS-UHFFFAOYSA-N ethosuximide Chemical compound CCC1(C)CC(=O)NC1=O HAPOVYFOVVWLRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002767 ethosuximide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004801 imipramine Drugs 0.000 description 1
- BCGWQEUPMDMJNV-UHFFFAOYSA-N imipramine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2N(CCCN(C)C)C2=CC=CC=C21 BCGWQEUPMDMJNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013198 immunometric assay Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000012633 leachable Substances 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- PNKLMTPXERFKEN-ZIOSACBISA-N mycotoxin ht 2 Chemical compound C([C@]12[C@]3(C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@]3(COC(C)=O)C[C@@H](C(=C1)C)OC(=O)CC(C)C)O2 PNKLMTPXERFKEN-ZIOSACBISA-N 0.000 description 1
- 229960000808 netilmicin Drugs 0.000 description 1
- ZBGPYVZLYBDXKO-HILBYHGXSA-N netilmycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@]([C@H](NC)[C@@H](O)CO1)(C)O)NCC)[C@H]1OC(CN)=CC[C@H]1N ZBGPYVZLYBDXKO-HILBYHGXSA-N 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003791 organic solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 1
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- DQMZLTXERSFNPB-UHFFFAOYSA-N primidone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NCNC1=O DQMZLTXERSFNPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002393 primidone Drugs 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 229960003712 propranolol Drugs 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229960001404 quinidine Drugs 0.000 description 1
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- URWAJWIAIPFPJE-YFMIWBNJSA-N sisomycin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC=C(CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N URWAJWIAIPFPJE-YFMIWBNJSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M sodium valproate Chemical compound [Na+].CCCC(C([O-])=O)CCC AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010557 suspension polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- NOTOVTQRFFVBSB-VZPCOZJFSA-N t-2 acetate Chemical compound C([C@@]12[C@]3(C)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](OC(C)=O)[C@H]1O[C@H]1[C@]3(COC(C)=O)C[C@@H](C(=C1)C)OC(=O)CC(C)C)O2 NOTOVTQRFFVBSB-VZPCOZJFSA-N 0.000 description 1
- 229940063650 terramycin Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 description 1
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 description 1
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 description 1
- 229940102566 valproate Drugs 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/96—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en stabil, immobilisert haptenreagens for bruk i den spesifikke bindingsanalysebestemmelsen av en hapten eller bindingsanalog derav i en væskeformig testprøve, hvor reagensen omfatter en gelpartikkel som er svellbar i vann og har flere haptendeler bundet dertil. Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av den nevnte reagensen i analyse av hapten, eller en analog derav,
i en væskeformig testprøve.
Forskjellige heterogene spesifikke bindingsanalyser har blitt utviklet som generelt innbefatter spesifikke bindende vekselvirkninger mellom analytten som skal detekteres, en spesifikk bindende partner for analytten og en merket reagens, som kan være lik eller forskjellig fra den bindende partneren for analytten. Når slike analyser utføres blir den merkede reagens bundet til den tilsvarende bindende partner slik at det genereres et bundet spesies, eventuelle deler av den merkede reagensen som ikke bindes på denne måten blir de frie spesies, hvori omfanget av binding er en funksjon av mengden analytt tilstede. Der hvor den detekterbare respon-sen av den merkede reagensen er i det vesentlige uadskillelig fra de bundne spesies og de frie spesies er det nødvendig å fysisk separere slike bundne og frie spesies fra hverandre for effektivt å bestemme mengden analytt tilstede. Når følgelig først de bundne og frie spesies av den merkede reagensen er separert fra hverandre bestemmes mengden av merket tilstede i en hvilken som helst fraksjon derav ved å måle aktiviteten av det spesielle merket av den merkede reagensen og korrelere slik aktivitet med mengden analytt tilstede.
Den fysikalske separasjonen av de bundne spesies fra de frie spesies kan utføres på mange måter. I den heterogene spesifikke bindingsanalysen som er kjent som den immunometriske analysen innbefatter den merkede reagensen en merket form av et anti-analytt antistoff. Ifølge en slik fremgangsmåte oppnås separasjon av den frie merkede reagensen fra den bundne merkede reagensen ved tilsats av en immobilisert form av analytten som skal bestemmes eller en analog derav som vil binde seg med antistoffet av den frie merkede reagensen. For eksempel beskriver "U.S. patent 4,200,436 en immunoanalyse for deteksjon av antigen ved anvendelse av en immobilisert form av antigenet som skal måles for å separere de bundne og frie formene av et merket enverdig antistoff til antigenet. Den immobiliserte formen av antigenet fremstilles ved kjemisk binding eller fysikalsk absorpsjon av antigenet til faste bærere eller bærermaterialer, så som polysakkarider eller plaster, ved fremgangsmåter som er kjente innen teknikken.
Tilsvarende beskriver U.S. patent 4,551,426 en heterogen immunoanalyse for haptenet digoksin ved anvendelse av en immobilisert form av ouabain (en digoksin analog) for å separere de bundne og frie formene av et anti-digoksin merket antistoff. Den immobiliserte formen av ouabain fremstilles ved å kople ouabain, enten direkte eller via en avstandsgiverarm, så som et protein, en polyaminosyre, eller syntetisk linker, til et bærermateriale, så som agarose-perler, dekstranperler, polyakrylamid eller glass, ifølge fremgangsmåter som er kjente innen teknikken.
Slike bærermaterialer resulterer imidlertid, sammen med fremgangsmåtene som anvendes for å koble den ønskede analytten eller analogen derav (ligand) til slike bærermaterialer, i relativt ustabile reagenser, reagenser som viser betydelig frigivelse eller lekkasje av liganden inne i den omgivende væsken når det benyttes i en immunoanalyse som beskrevet ovenfor. Slik instabilitet antas å være resultatet av en instabilitet i bindingen mellom liganden og bæreren, så vel som ikke-spesifikk binding av liganden til bærermaterialet. Slik instabilitet av bindingen og ikke-spesifikk binding av ligand resulterer i at en betydelig mengde av liganden langsomt frigis eller lekker inn i det omgivende mediet. Slik lekkasje av liganden inn i forsøksmediet finner hovedsa-kelig sted som et resultat av at liganden er ikke-spesif ikt bundet til indre eller ytre deler av bærermaterialet. Selv om det er uheldig kan ligand som er ikke-spesifikt bundet til den ytre overflaten fjernes ved vasking av bærermaterialet med en vandig vaskeoppløsning før anvendelse i en analyse-prosedyre. Imidlertid kan ligand som er ikke-spesifikt bundet til indre deler ikke effektivt fjernes og slik internalisert ligand lekker ut fra det indre av bærermaterialet og inn i forsøksmediet hvor det kan være i det vesentlige uadskillelig fra analytten fra en forsøksprøve og fritt til å binde seg med den merkede reagensen, hvilket resulterer i en unøyaktig måling av mengden analytt som virkelig er tilstede i prøven.
Syntesen og anvendelsen av bærermaterialer, spesielt tverrbundne polymerbærere, som har kjemiske strukturer som er fysiokjemisk kompatible med ryggradstrukturen for et peptid er også beskrevet for anvendelse i peptidsyntese i fast fase. Spesielt har teknikken for kobling av peptider til en polymer (Stahl, et al., J. Amer. Chem. Soc, bind 101 (18) side 5383
(1979)) og kryssbinding av forskjellige polymerer (Varadara-jan, et al., Bioplymers, bind 22, s. 839 (1983)) ved anvendelse av revers-fase suspensjonspolymerisasjon i vandige organiske oppløsningsmiddelblandinger vært anvendt for å oppnå fordelaktige svellingsegenskaper av slike bærermaterialer for å tilveiebringe forøkede ytre og indre reaksjons-seter.
Følgelig er det et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en immobilisert haptenreagens som er stabil i vandige oppløsninger og som ikke langsomt frigir eller lekker ut hapten i en omgivende vandig oppløsning.
Et annet formål ved foreliggende oppfinnelse er å gi anvisninger til anvendelse av den omtalte reagensen ved analyser.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en stabil, immobilisert haptenreagens for bruk i den spesifikke bindingsanalysebestemmelsen av en hapten eller bindingsanalog derav i en væskeformig testprøve, hvor reagensen omfatter en gelpartikkel som er svellbar i vann og har flere haptendeler bundet dertil, kjennetegnet ved at reagensen er fremstilt ved trinnene: (a) omsetning av en haptendel med en polyakrylamidgelpartikkel innbefattende flere ytre og indre kjemisk aktive funksjonelle grupper, hvor reaksjonen utføres i et organisk oppløsningsmiddel som er vesentlig fritt for vann og hvori gelpartikkelen er i det vesentlige ikke-svellet og under slike betingelser at det dannes en kovalent binding mellom haptendelen og nevnte ytre aktive funksjonelle grupper som er vesentlig stabile i vandig oppløsning; (b) vasking av gelpartikkelen fra trinn (a) med et organisk oppløsningsmiddel som er vesentlig fritt for vann og hvori gelpartikkelen er vesentlig ikke-svellet; (c) vasking av gelpartikkelen fra trinn (b) med en vandig oppløsning; og (d) isolering av den immobiliserte haptenreagensen fra trinn (c) innbefattende nevnte gelpartikkel og nevnte haptendeler bundet dertil hvor vesentlig alle nevnte bundne haptendeler er kovalent bundet til de funksjonelle gruppene på den ytre overflaten ved hjelp av en bindingsgruppe som er vesentlig stabil i vandige oppløsninger.
Den immobiliserte haptenreagensen er i det vesentlige stabil i vandig omgivelse for anvendelse i en spesifikk bindingsanalyse, spesielt en immunoanalyse, for bestemmelse av en hapten eller bindende analog derav i en flytende prøve. Den immobiliserte haptenreagensen innbefatter et bærermateriale bestående av en polyakrylamid gelpartikkel og et stort antall haptenenheter bundet dertil. Gelpartikkelen innbefatter et stort antall ytre og indre funksjonelle grupper på de indre og ytre overflatene av gelpartiklene, hvori i det vesentlige alle de bundne haptenenhetene er kovalent bundet til de funksjonelle gruppene på den ytre overflaten ved hjelp av en forbindende gruppe som er i det vesentlige stabil i vandige oppløsninger, spesielt immunoanalyseforsøksmedier, og en analytisk ubetydelig mengde av hapten enheten forblir ikke-spesifikt bundet til bærermaterialet. Følgelig forblir i det vesentlige all haptenenhet kovalent bundet til bærermaterialet under utførelsen av en immunoanalyse, og bare en ubetydelig mengde, om noen, av haptenenheten dissosierer eller lekker fra bærermaterialet inn i forsøksmediet.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av den ovenfor omtalte reagensen i analyse av hapten, eller en analog derav, i en væskeformig testprøve.
Gelpartikkelen er i det vesentlige usvellbar når den omsettes med hapten-enheten i nærvær av det ikke-svellende oppløs-ningsmiddelet og er følgelig i det vesentlige ugjennomtrengelig for hapten-enheten, og den kovalente bindingen derav er i det vesentlige begrenset bare til de funksjonelle gruppene på den ytre overflaten av gelpartikkelen. Eventuelle deler av hapten-enheten som blir ikke-spesifikt bundet til den ytre overflaten av gelpartikkelen i trinn (a) fjernes med de ikke-svellende og vandige vaskeoppløsningene fra henholdsvis (b) og (c).
Den immobiliserte haptenreagensen er spesielt nyttig i en heterogen spesifikk bindingsanalyse innbefattende binding mellom en hapten eller bindende analog derav og en merket reagens innbefattende en merket bindende partner for haptenen eller analog derav, hvori det er nødvendig å fysikalsk separere eventuelt merket reagens som blir bundet til haptenen eller bindende analog derav fra den merkede reagensen som ikke bindes på denne måten. Eventuelle deler av den merkede reagensen som ikke bindes til haptenen eller den bindende analogen derav fra forsøksmediet separeres fra den bundne merkede reagensen ved binding til haptenen av den immobiliserte haptenreagensen hvori omfanget av binding er en
o
funksjon av mengden hapten eller bindende analog derav tilstede i en flytende prøve. Figur 1 er en grafisk fremstilling som illustrerer doseresponsen på digoksin generert i en immunoanalyse ved anvendelse av digitoksingenin som hapten-enheten i en immobilisert haptenreagens ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 2 er en grafisk fremstilling som illustrerer reaktiviteten av en immobilisert glykopeptidreagens ifølge foreliggende oppfinnelse i en immunoanalyse for bestemmelse av mengden av glykosylert hemoglobin HbAlc i en prøve av fullblod.
Den immobiliserte haptenreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i konvensjonelle heterogene spesifikke bindingsanalysemetoder, spesielt heterogene enzym-immunoanalyser, innbefattende binding mellom en hapten eller bindende analog derav og en merket reagens innbefattende en merket form av en spesifikk bindende partner for haptenen eller bindende analog derav. Videre kan haptenkomponenten av den immobiliserte haptenreagensen varieres for anvendelse i slike spesifikke bindingsanalyser for deteksjon av enhver hapten eller bindende analog derav for hvilken det finnes en spesifikk bindende partner i biologiske systemer, eller hvor en slik kan syntetiseres. I tilfeller hvor den spesifikke bindende partneren for haptenen eller bindende analog derav er en anti-hapten, så som et antistoff til haptenen eller fragment derav, betegnes en slik bindingsanalysefremgangsmåte som en immunometrisk fremgangsmåte.
Ifølge slike heterogene spesifikke bindingsanalysefremgangs-måter, spesielt den immunometriske fremgangsmåten, er haptenen eller den bindende analogen derav som detekteres generelt kombinert med den merkede reagensen slik at det dannes en reaksjonsblanding hvori den merkede reagensen bindes til haptenen som detekteres. Omfanget av slik binding bestemmes deretter og relateres med haptenen som bestemmes.
Forholdet mellom mengden av merket reagens bundet til haptenen som detekteres (det vil si bundet spesies) og mengden av merket reagens som ikke er bundet på denne måten (det vil si frie spesies) er en funksjon av mengden av hapten tilstede. Idet signalene som genereres av merket av den merkede reagensen fra både bundet og frie spesies derav ikke kan skilles fra hverandre er det nødvendig å fysikalsk separere de frie spesies fra de bundne spesies for å tillate uavhengig bestemmelse av mengden merke tilstede i den ene eller den andre, denne bestemmelsen kan deretter korreleres med mengden hapten tilstede.
Den immobiliserte haptenreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt nyttig for separasjonen av de frie spesies av et merket anti-hapten antistoff fra de bundne spesies av et slikt anti-hapten antistoff i en spesifikk bindingsanalyse hvori de frie spesies bindes til, og immobi-liseres av, den immobiliserte haptenreagensen slik at det nødvendige separasjonstrinnet oppnås. Spesielt omfatter den immobiliserte haptenreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse et bærermateriale i form av en egnet funksjonalisert polyakrylamid-genpartikkel og et stort antall hapten-enheter bundet dertil. Gelpartikkelen innbefatter et stort antall ytre og indre funksjonelle grupper, og i det vesentlige alle de bundne hapten-enhetene er kovalent bundet i det vesentlige bare til de ytre overf lategruppene av gelpartikkelen ved hjelp av en forbindende gruppe. Den forbindende gruppen tilveiebringer en kovalent binding som er i det vesentlige stabil i vandige oppløsninger, spesielt i vandige oppløs-ninger innbefattende det flytende forsøksmediet av en immunoanalyse, hvori hapten-enheten forblir kovalent bundet til bærermaterialet under utførelsen av en immunoanalyse for effektivt å separere de frie spesies fra de bundne spesies. Det skal understrekes at slik stabilitet i vandige omgivelser forhindrer dissosiering av hapten-enheten fra bærermaterialet, og følgelig, utlekking av hapten-enheten inn i forsøks-mediet hvilket resulterer i nedsatt analysefølsomhet og nøyaktighet, hvilket skal beskrives i større detalj nedenfor.
Ifølge en foretrukket utførelse er den immobiliserte haptenreagensen spesielt nyttig i en immunoanalyse for deteksjon av digoksin i en flytende prøve. Den merkede reagensen innbefatter et enzym-merket enverdig antistoff-fragment avledet fra et monoklonalt antistoff mot digoksin, fortrinnsvis Fab' fragmentet av et monoklonalt IgG antistoff til digoksin, generelt ved oppnådd ved fremgangsmåter som er kjente innen teknikken, og merket med et enzym, fortrinnsvis e-D-galaktosidase. Fortrinnsvis er den merkede reagensen elektroforetisk renset på en elektroforetisk polyakrylamidgel slik at det oppnås et i det vesentlige rent monokonjugatpreparat derav innbefattende en enkelt enverdig antistoff-fragmentkomponent kovalent bundet til en enkelt enzymkompo-nent ifølge fremgangsmåten beskrevet i U.S. patent 5,047,324.
Immunoanalysen for digoksin utføres ved å omsette den merkede reagensen, fortrinnsvis monokonjugatpreparater derav, med en prøve inneholdende digoksin, og deretter tilsette den immobiliserte haptenreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse innbefattende digoksin eller en analog derav, så som digitoksigenin, kovalent bundet til amingruppene på den ytre overflaten av et amin av et amin-funksjonalisert polyakryl-amidbærermateriale ved hjelp av en forbindende gruppe, hvilket skal beskrives i større detalj nedenfor. Hapten-enheten av slik immobilisert haptenreagens kan innbefatte digoksin eller en analog derav, så som digitoksigenin. Digoksin fra den flytende prøven bindes til antistoff-fragmentet av den merkede reagensen slik at det bundne spesies derav dannes, og eventuelt fritt spesies fra den merkede reagensen som ikke bindes til digoksin fra prøven bindes til den immobiliserte haptenreagensen for immobilisering og etterfølgende separasjon derav fra de bundne spesies, hvorved de bundne spesies forblir i oppløsning og de frie spesies sedimenterer ut fra oppløsningen. Mengden digoksin i prøven bestemmes deretter ved å måle enzymaktiviteten av de bundne spesies av den merkede reagensen.
Ifølge en annen foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse innbefatter den immobiliserte haptenreagensen en glykosylert peptidsekvens, for eksempel svarende til den glykosylerte N-terminale peptidsekvensen i P-underheten av human hemoglobin (glykopeptid), kovalent bundet til de ytre overflate sulfhydrylgruppene av et polyakrylamid-sulfhydryl avledet bærermateriale, for eksempel som beskrevet i europeisk patent 270,949, som er nyttig i en immunoanalyse for bestemmelse av HbAlc. Den merkede reagensen innbefatter et enverdig antistoff-fragment avledet fra et monoklonalt antistoff som er spesifikt for den glykosylerte N-terminale peptidsekvensen i p<->underenheten av humant hemoglobin (se europeisk patentpublikasjon nr. 185,870) merket med p-D-galaktosidase og renset til et monokonjugat preparat derav som beskrevet ovenfor, og mengden HbAlc i den flytende prøven bestemmes ved å måle enzymaktiviteten av de bundne spesies av den merkede reagensen.
Måling av enzymaktiviteten i slike immunoanalyser utføres ved å fjerne en porsjon av supernatant og avsette porsjonen på en reagenspute inkorporert med et kromogent substrat for enzymmerket, så som resorufin-p<->D-galaktopyranosid, o-nitro-fenol-p<->D-galaktopyranosid eller, mer foretrukket, et kromogent akridinon enzymsubstrat for P-D-galaktosidase innbefattende en 7-hydroksy-9H-akridin-l-on kromogen avledet med en p-D-galaktose rest, så som beskrevet i europeisk patent 270,946. Det detekterbare signalet som genereres ved interaksjonen mellom enzymet og det kromogene substratet måles deretter for eksempel med et reflektansfotometer, og korreleres med mengden hapten tilstede i den flytende prøven.
Det skal understrekes at for å tilveiebringe en meget følsom immunoanalyse for nøyaktig bestemmelse av mengden hapten tilstede i en flytende prøve bør ikke-spesifikk binding av hapten-enheten til bærermaterialet minimaliseres. Slik ikke-spesifikk bundet hapten-enhet vil ellers resultere i dissosiering av hapten-enheten fra bærermaterialet og langsom frigivelse eller utlekking derav i det flytende immunoana-lyseforsøksmediet som et fritt haptenspesies som konkurrerer med haptenen fra prøven om binding til den merkede reagensen. Følgelig tilveiebringer merket av den merkede reagensen bundet til slik dissosiert hapten-enhet et bakgrunnsignal som vil interferere med deteksjonen av signalet som tilveiebringes av merket av den merkede reagensen bundet til haptenen fra prøven, hvilket resulterer i en unøyaktig bestemmelse av haptenen som detekteres i prøven.
Følgelig er et viktig trekke ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en immobilisert haptenreagens som er i det vesentlige stabil i vandige oppløsninger og som innbefatter en hapten-enhet kovalent bundet i det vesentlige bare til den ytre overflaten av et egnet bærermateriale i form av funksjonalisert polyakrylamidgelpartikkel, med bare en analytisk ubetydelig mengde, om noe, av hapten-enheten ikke-spesifikk bundet dertil.
Ifølge foreliggende oppfinnelse oppnås kontroll av ikke-spesifikt bundet hapten til akseptable grenser ved å omsette hapten-enheten med et bærermateriale innbefattende en egnet funksjonalisert eller avledet polyakrylamidharpiks i et ikke-svellende oppløsningsmiddel i nærvær av en forbindende gruppe som danner en i det vesentlige stabil, kovalent binding derimellom slik at det tilveiebringes en immobilisert haptenreagens som er i det vesentlige stabil i vandige oppløsninger. Det ikke-svellende oppløsningsmiddelet begrenser omfanget av kovalent binding i det vesentlige bare til de funksjonelle gruppene på den ytre overflaten av bærermaterialet, hvilket skal beskrives i større detalj nedenfor.
(a) Bærermateriale.
Ifølge en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse er bærermaterialet for den immobiliserte haptenreagensen en aminoetyl-avledet polyakrylamidharpiks, som generelt er svellbar i vandige oppløsninger og som kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innen teknikken. Ifølge slike fremgangsmåter fremstilles en polyakrylamidharpiks først ved kopolymerisasjon av akrylamid og N,N'-metylenbisakrylamid [S. Hjerten og R. Mosbach, Anal. Chem., bind 3, s. 109 (1962)], slik at det, under egnede betingelser, dannes tverrbundne polyakrylamidkjeder, etterfulgt av behandling med vannfritt etylen-diamin [J.K. Inman og H.M. Dintzis, Biochemistry, bind. 8, s. 4074 (1969)] slik at det oppnås en aminoetyl-avledet polyakrylamidgel innbefattende et stort antall aminfunksjonelle grupper for anvendelse som bærermateriale for den immobiliserte haptenreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse. I tillegg til avledningen av polyakrylamidet med amin-funksjonelle grupper ved direkte aktivering av polyakrylamidharpiksen som beskrevet ovenfor, kan akrylamid og metylenbisakrylamid kopolymeriseres med for eksempel akrylsyre-estere av N-hydroksysuksinimid eller N-hydroksyft-alimid som deretter lett kan omsettes med haptener inneholdende primære aminofunksjoner, så som en aminoheksylgruppe, som erstatter den aktive esteren i harpiksen slik at den immobiliserte haptenreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes [se J.K. Inman, Methods in Enzymology, bind 34B, s. 30-58 (1974); G.L. Stahl, et al., J. Org. Chem. bind 44, s. 3424 (1979); G.L. Stahl, et al., J. Amer. Chem. Soc, bind 101, s. 5383 (1979)].
Den aminoetyl-avledede polyakrylamidgelen er spesielt foretrukket på grunn av dens høye kapasitet for binding eller immobilisering av hapten, så vel som de lave ikke-spesifikke adsorpsjonsegenskapene. Videre er gelen også kommersielt tilgjengelig (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, U.S.A.) og har forskjellige aminoetyl kapasiteter, generelt fra mellom 1.0 til 2.0 milli-ekvivalenter pr. gram av tørr harpiks. Gelen har også et foretrukket pH område fra pE 2.0 til pH 10.0, og er mottagelig for hydrolyse av amidsidégrupper ved høyere eller lavere pH-verdier.
Ifølge en annen utførelse er bærermaterialet for den immobiliserte haptenreagensen en ny polyakrylamid-sulfhydryl-gel som, som funksjonelle grupper, har et stort antall sulfhydrylgrupper, som beskrevet i større detalj i U.S. patentsøknaden med tittelen "Tverrbundet polyakrylamid-sulfhydrylgel og sulfhydryl-funksjonaliserte derivater derav"
(Sak nr. MS-1478), inngitt samtidig med foreliggende søknad. Polyakrylamid-sulfhydrylgelen fremstilles ved fri radikal polymerisasjon av akrylamid, bisakrylamid og N,N'-bisakrylyl-cystamin og er spesielt nyttig for fremstillingen av en immobilisert glykopeptidreagens for anvendelse i immuno-analysebestemmelsen av den glykosylerte formen av hemoglobin kjent som HbAlc. Det skal også understrekes at polyakrylamid-sulfhydrylgelen er tilsvarende svellbar i vandige oppløs-ninger. Svellingsegenskapene kan kontrolleres ved forholdet mellom monomerer som anvendes, graden av tverrbinding og den spesielle tverrbindingsgruppen, og de aktive funksjonelle gruppene.
Generelt innbefatter den fysikalske strukturen av polyakrylamid-gelpartiklene tverrbundne polyakrylamid-kjeder som definerer et ytre overflateareal og et indre overflateareal hvori tilgjengeligheten av hapten-enheten og andre reagenser til det indre overflatearealet er begrenset når gelpartikkelen er usvellet som beskrevet tidligere. Det skal understrekes at svellingsegenskapen for gelpartikkelen er resultater av det strukturelle nettverket av de tverrbundne polyakrylamidkjedene som resulterer i en generelt porøs natur for gelpartikkelen. Når følgelig gelpartikkelen er usvellet holdes polyakrylamidkjedene tett sammen ved hjelp av tverr-bindingsgruppene slik at det oppstår en effektiv porestørr-else som er mindre enn, og ugjennomtrengelig for, hapten-enheten eller andre reagenser slik at gjennomtregning og internalisering derav i det indre overflatearealet av gelpartikkelen forhindres. Partiklene innbefatter videre et stort antall av deres respektive kjemisk aktive funksjonelle grupper ved den ytre og den indre overflaten som er essensi-elle for dannelsen av en stabil, kovalent binding mellom hapten-enheten og partikkelen ved hjelp av en forbindelsesgruppe, hvilket skal beskrives i større detalj nedenfor. Det skal understrekes i tilfeller hvor en kovalent binding ikke dannes mellom hapten-enheten og en funksjonell gruppe av partikkelen er det sannsynlig at en slik hapten-enhet blir ikke-spesifikt bundet til partikkelen ved hjelp av ikke-spesif ikke bindende vekselvirkninger, så som ved ioniske og hydrofobe bindingsvekselvirkninger og lignende. Slik ikke-spesifikk binding av hapten-enhet til en partikkel resulterer i en høy grad av dissosiering av slik ikke-spesifikk bundet hapten-enhet fra bærermaterialet og etterfølgende utlekking eller langsom frigivelse derav under forsøksbetingelsene for immunoanalysen eller andre vandige omgivelser.
Selv om en i det vesentlige stabil, kovalent binding kan dannes mellom hapten-enheten og de funksjonelle gruppene som beskrevet ovenfor i enten vandige omgivelser eller organiske omgivelser, er anvendelsen av et ikke-svellende oppløsnings-middel foretrukket ved foreliggende oppfinnelse for å oppnå det minst mulige omfanget av ikke-spesifikk binding av hapten-enheten til gelpartikkelen og, nærmere bestemt, i det vesentlige bare til den ytre overflaten derav. Spesielt resulterer den høye hydrofilisiteten av partikkelen i uønsket svelling av gelen og økning av gjennomtrengningen eller internaliseringen av hapten-enheten og andre reagenser i gelpartikkelen i en vandig oppløsning, mens det forekommer i det vesentlige ingen oppsvelling eller medfølgende økning i slik gjennomtrengning eller internalisering i en organisk oppløsning eller i et oppløsningsmiddel som inneholder lite eller intet vann. Følgelig forhindrer anvendelsen av et ikke-svellende oppløsningsmiddel vesentlig oppsvelling av gelpartikkelen, hvilket begrenser den kovalente bindingen av hapten-enheten i betydelig grad bare til de funksjonelle gruppene på den ytre overflaten av gelpartikkelen ved at gjennomtrengningen eller internaliseringen av hapten-enheten og andre reagenser inn i partikkelen minimaliseres. Slik internalisering ville ellers resultere i uønsket dannelse av kovalente bindinger mellom hapten-enheten og funksjonelle grupper som er tilstede på det indre overflatearealet av gelpartikkelen som beskrevet tidligere. Slik internalisering av hapten-enheten og andre reagenser resulterer også i større sannsynlighet for ikke-spesifikk adsorpsjon av slik internalisert hapten-enhet som ville være vanskelig å fjerne med en vaskeoppløsning, og som senere kunne lekke ut fra gelpartikkelen under utførelsen av en immunoanalyse og derved resultere i nedsatt analysefølsomhet og nøyaktighet.
Følgelig utføres immobiliseringen av hapten-enheten til gelpartikkelen i et ikke-svellende organisk oppløsningsmiddel så som dimetylsulfoksyd, dimetylformamid, aceton, klorerte hydrokarboner, cykliske og acykliske alkyletere og lignende, fortrinnsvis inneholdende lite eller intet vann, hvilket resulterer i i det vesentlige ingen oppsvelling av gelpartikkelen og, følgelig, i det vesentlige ingen derav følgende økning i gjennomtrengeligheten eller internaliseringen av hapten-enheten eller andre reagenser inne i partikkelen. Siden den neglisjerbare økningen i partikkelstørrelse vil resultere i en gelpartikkel som er i det vesentlige ugjennomtrengelig for, og som effektivt utelukker gjennomtrengningen av en hapten-enhet og andre reagenser inne i gelpartikkelen, er eventuell ikke-spesifikk binding av hapten-enheten begrenset i det vesentlige bare til den ytre overflaten av gelpartikkelen. Eventuelle deler av hapten-enheten som blir ikke-spesifikt bundet til den ytre overflaten av gelpartikkelen fjernes effektivt med en ikke-svellende vaskeoppløsning etterfulgt av en egnet bufret rense- eller vaskeoppløsning, så som med en sur saltoppløsning. Etter fjernelse av slik ytre, ikke-spesifikt bundet hapten-enhet innbefatter den resulterende immobiliserte haptenreagensen i det vesentlige all hapten-enheten kovalent bundet til den ytre overflaten av gelpartikkelen. Reagensen er følgelig i det vesentlige stabil i vandige oppløsninger som et resultat av den ubetyde-lige mengden av hapten-enheten som er ikke-spesifikt bundet til bærermaterialet. Spesielt skal det understrekes at ifølge foreliggende oppfinnelse vil mindre enn fra 1 x IO-<12 >mol av hapten-enheten/gram av harpiksen vanligvis mindre enn fra 1 x 10~<13> mol av hapten-enheten/gram av harpiksen, fortrinnsvis mindre enn 1 x 10~<14> mol av hapten-enheten/gram av harpiksen, dissosiere fra gelpartikkelen etter å ha stått i en vandig væske, så som en buffer oppløsning, f.eks. fosfat-klorid analysebufferen beskrevet i eksempel 5, slik at det potensielt bare kan oppstå en ubetydelig liten lekkasje derav under utførelsen av en immunoanalyse.
(b) Hapten-enhet.
Hapten-enheten av den immobiliserte haptenreagensen kan være haptenen som skal bestemmes, eller en analog derav som er i stand til binding til den spesifikke bindende partneren derav av den merkede reagensen, og hvor haptenen eller den bindende analogen derav kovalent kan bindes til de funksjonelle gruppene på den ytre overflaten av en bærermaterialpartikkel. Spesielt kan hapten-enheten av den immobiliserte haptenreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse velges for bestemmelsen av en hvilken som helst hapten for hvilken det finnes en bindende partner i et biologisk system, eller hvor en slik kan syntetiseres, og innbefatter, men er ikke begrenset til, digoksin, digitoksigenin, digitoksin, digoksigenin, 12-0-actyldigoksigenin, og glykosylerte peptidsekvenser så som den glukosylerte N-terminale peptidsekvensen i beta-underheten av humant hemoglobin, så vel som andre klasser av legemidler, metabolitter, hormoner, vitaminer, toksiner og lignende organiske forbindelser. Hapteniske hormoner innbefatter tyroksin og trijodotyronin. Vitaminer innbefatter vitaminene A, B, f.eks. B12» c» D, E og K, folinsyre og tiamin. Legemidler innbefatter antibiotika så som aminoglykosider, f.eks. gentamicin, tobramycin, amikacin, sisomicin, kanamycin, og netilmicin, penicillin, tetracyklin, terramycin, klormycetin, og actinomycetin; nukleosider og nukleotider så som adenosin-difosfat (ADP), adenosin-trifosfat (ATP), flavin-mononukleotid (FMN), nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) og dets fosfatderivater (NADP), tymidin, guanosin og adenosin; prostaglandiner; steroider så som østrogener; f.eks. estriol og estradiol, sterogener, androgener og adrenokortiske steroider; og andre, så som fenobarbital, fenytoin, primidon, etosuksimid, karbamazepin, valproat, teofyllin, kaffein, propranolol, prokainamid, kinidin, amitryptilin, kortisol, desipramin, disopyramid, doksepin, doksorubisin, notryptilin, meto-treksat, imipramin, lidokain, prokainmid, N-acetylpro-kainamid, amfetaminer, katekolaminer og antihistaminer. Toksiner innbefatter acetyl T-2-toksin, alfatoksin, kolera-toksin, citrinin, cytochalasiner, stafylokokkisk entertoksin B, HT-2 toksin og lignende.
(c) Forbindende grupper.
Den forbindende gruppen for den immobiliserte haptenreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av den aminoetyl-avledede polyakrylamid-gelpartikkelen kan velges fra et antall forbindende grupper som er kjent innen teknikken og som innbefatter bifunksjonelle rester av 1,6-heksametylendiamin, 6-aminoheksanol, 1,12-diamino-4,5-dioksadekan, 1,17-diamino-3,6,9,12-15-pentaoksaheptadekan, bovinserumalbumin og 6-aminokaproidsyre.
Tilsvarende kan den forbindende gruppen av den immobiliserte haptenreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av den nye polyakrylamid-sulfhydrylgelen beskrevet ovenfor også være valgt fra et antall forbindelsesgrupper som er kjent innen teknikken, og som innbefatter bifunksjonelle rester av bismaleimid (1,1'-[metylenedi-4,1-fenylen]-bismaleimid), bismaleimido-heksan og bismaleimido-heksaetylenglykol.
Det skal understrekes at viktige overveininger ved valg av en egnet forbindelsesgruppe for å tilveiebringe en stabil, kovalent binding mellom hapten-enheten og gelpartikkelen ved foreliggende oppfinnelse er den korrekte romlige oriente-ringen og friheten fra sterisk hindring mellom den immobiliserte haptenreagensen og de frie spesies av den merkede reagensen under bindingsvekselvirkningen dem imellom. Spesielt er det sannsynlig at haptener som er tett bundet til et fast bærermateriale vekselvirker meget svakt med den spesifikke bindende partneren for den merkede reagensen fordi det aktive setet for et biologisk stoff kan være plassert dypt inne i molekylstrukturen derav, og er derfor utilgjenge-lig for bindende vekselvirkninger. På den den annen side er det, ved binding av slik hapten til et fast bærermateriale ved hjelp av en fleksibel avstandsgiverarm eller forbindende gruppe av egnet lengde, sannsynlig at en betydelig økning i bindingen finner sted. • Imidlertid er det demonstrert at vesentlig lengre avstandsgiverarmer vil binde stoffer i en flytende prøve ved hjelp av hydrofobe bindingsvekselvirkninger [P. 0'Carra, et al., Biochem. Soc. Trans., bind 1, s. 289-290 (1973)]. Dersom den bindende gruppen følgelig er for kort, kan haptenen ikke bindes til den spesifikke bindende partneren for denne, og dersom den er for lang blir ikke-spesifikke bindingseffekter uttalte og reduserer selektivite-ten av separasjonen av de bundne spesies av en merket reagens fra de frie spesies derav.
Følgelig kan forbindelsesgruppen velges av fagmannen på bakgrunn av de foregående betraktningene slik at de nye trekkene ved foreliggende oppfinnelse ikke påvirkes betydelig i negativ retning. Valg av en egnet forbindelsesgruppe og binding av hapten-enheten på en måte som i det vesentlige forhindrer internalisering tilveiebringer en immobilisert haptenreagens ifølge foreliggende oppfinnelse som er i det vesentlige stabil i vandige oppløsninger.
Spesielt oppnås dannelsen av en stabil kovalent binding mellom en hapten-enhet og den aminoetyl-avledede polyakrylamid-gelpartikkelen ved at det dannes en amidbinding mellom amingruppene på den ytre overflaten av gelpartikkelen og en N-hydroksysuksinimid-aktivert karboksy-funksjonalisert form av hapten-enheten i flytende reaksjonsomgivelser i form av et ikke-svellende oppløsningsmiddel, så som et organisk oppløs-ningsmiddel beskrevet tidligere som fortrinnsvis er vannfritt. Spesielt aktiveres hapten-enheten først med p-nitrofenylkloroformat og karboksy-funksjonaliseres deretter med 6-aminokapriodsyre som avstandsgiverarmen eller forbindelsesgruppen. Den karboksy-funksjonaliserte hapten-enheten aktiveres deretter med N-hydroksysuksinimid slik at esteren derav dannes, denne omsettes deretter med den aminoetyl-avledede polyakrylamidgelen i vannfrie reaksjonsomgivelser i form av organisk væske innbefattende dimetylformamid.
Spesielt omsettes esteren av den aktiverte hapten-enheten med gelen i mengder fra mellom 50 jjmol av hapten-enheten pr. gram av den tørre harpiksen til 0.0005 pmol av hapten-enheten pr. gram av den tørre harpiksen, fortrinnsvis 0.05 jjmol av hapten-enheten pr. tørt gram av harpiksen, hvori konsentrasjonen av hapten-enheten i reaksjonsblandingen er mellom 10 mp og 1 jjM, fortrinnsvis 10 jjM. En eventuell del av hapten-enheten som er ikke-spesifikt bundet til den ytre overflaten av gelpartikkelen vil fjernes med en organisk vaskeoppløsning som beskrevet ovenfor, etterfulgt av en vandig vaskeopp-løsning innbefattende, for eksempel, en 2M NaCl og 0.1M eddiksyreoppløsning (pH 2.3), hvori hapten-enheten kovalent bundet til amingruppene forblir bundet dertil, så vel som under den etterfølgende gjennomføringen av en immunoanalyse ved anvendelse av slik immobilisert haptenreagens.
I tilfellet med den immobiliserte glykopeptidreagensen ved foreliggende oppfinnelse oppnås dannelsen av en stabil kovalent binding mellom den glykosylerte N-terminale peptidsekvensen i beta-underheten av humant hemoglobin (det vil si glykopeptid) og den nye polyakrylamid-sulfhydrylgelen ved at det dannes en sulfidbinding mellom sulfhydrylgruppene på den ytre overflaten av gelpartikkelen og en aktivert form av glykopeptidet. Spesielt aktiveres glykopeptidet først ved hjelp av en bismaleimidforbindelse, så som 1,1'-[metylen-4,1-fenylen]bismaleimid, bismaleimido-heksan eller bismaleimido-heksaetylenglykol som den forbindende gruppen. Det aktiverte glykopeptidet omsettes deretter med polyakrylamid-sulfhydrylgelen, som på forhånd er redusert med f.eks. ditiotreitol, i det ikke-svellende oppløsningsmiddelet for å generere de sulfhydryl-funksjonelle gruppene.
Reagenssystem.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et reagenssystem innbefattende alle de grunnleggende elementene som er påkrevet for å gjennomføre en ønsket immunoanalysefremgangs-måte. Reagenssystemet foreligger i en kommersielt forpakket form, som en sammensetning eller blanding hvor kompatibilite-ten av reagensene tillater dette, i en forsøksinnretnings-konfigurasjon, eller vanligvis som et forsøkssett, det vil si en forpakket kombinasjon av en eller flere beholdere, innret-ninger eller lignende som inneholder de nødvendige reagensene, og vanligvis innbefattende trykte instruksjoner for gjennomføringen av immunoanalyser.
Spesielt vil reagenssystemet minst innbefatte (1) den immobiliserte haptenreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse og (2) en merket reagens, fortrinnsvis et i det vesentlige rent monokonjugatpreparat derav som beskrevet ovenfor, innbefattende en merket form av en spesifikk bindende partner for haptenen, fortrinnsvis et enverdig antistoff-fragment avledet fra et monoklonalt antistoff til haptenen som skal bestemmes, merket med et enzym. Fortrinnsvis innbefatter reagenssystemet også indikatoranordninger, så som et forsøks-bånd innbefattende en reagenspute inkorporert med en indika-tor for den merkede reagensen, fortrinnsvis et kromogent akridinonenzymsubstrat som beskrevet ovenfor hvor merket av den merkede reagensen er et enzym, som genererer et detekter-bart signal som kan måles og korreleres med mengden hapten tilstede.
Oppfinnelsen skal nedenfor beskrives ved hjelp av de følg-ende eksemplene:
Eksempel 1
Syntese og rensing av digitoksigenin.
En oppløsning av 765 mg (1 mmol) digitoksin (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, U.S.A.; kvalitetnr. JM02624ML) og 40 ml av en 1:1 (volum/volum) blanding av etanol og 0.1 N EC1 ble omrørt ved 80°C i 60 minutter og deretter avkjølt til romtemperatur. Oppløsningsmiddelet ble avdampet under redusert trykk til et volum på ca. 10 ml oppløsningsmiddel som inneholdt et fast, hvitt bunnfall, og blandingen ble ekstrahert med tre volumer på 20 ml kloroform. Ekstraktene ble kombinert og vasket med 20 ml vann, tørket med magnesium-sulfat, og oppløsningsmiddelet ble inndampet under redusert trykk slik at det ble oppnådd et hvitt, fast materiale.
Det hvite, faste materialet ble oppløst i 4 ml av en 1:1 (volum/volum) blanding av kloroform og etanol, og deretter påført på en f lammekromatograf ikolonne (2.5 cm x 60 cm) inneholdende 40 g silikagel (200-400 mesh) og eluert med en 1:1 (volum/volum) blanding av heksan og etylacetat. Fraksjonene som ble eluert fra kolonnen ble samlet og analysert ved tynnskiktkromatografi [9:1 (volum/volum) kloroform/metanol], og fraksjonene inneholdende digitoksigeninproduktet ble bestemt med en p-anisaldehyd sprayreagens (900 ml 95$ etylalkohol, 50 ml p-anisaldehyd, 50 ml konsentrert svovel-syre og 50 ml eddiksyre) ved å observere en blåfarging ved oppvarming som indikerte nærværet av det ønskede digitoksigenin produktet. Produktfraksjonene ble kombinert og oppløsningsmiddelet ble avdampet under redusert trykk slik at det ble oppnådd et hvitt, fast materiale som deretter ble rekrystallisert fra en 1:1 (volum/volum) blanding av etanol og vann slik at det ble oppnådd 300 mg digitoksigenin i form av skinnende hvite krystaller.
Eksempel 2
Syntese av 3-digitoksigeninyl-p-nitrofenylkarbonat.
Aktivert digitoksigenin ble fremstilt ved å danne en reak-sjonsoppløsning av 749 mg (2 mmol) digitoksigenin (fremstilt ifølge eksempel 1) oppløst i 20 ml vannfritt pyridin inneholdende 61 mg (0.5 mmol) 4-dimetylaminopyridin som ble omrørt med 524 mg (2.6 mmol) p-nitrofenylkloroformat under argon ved romtemperatur i 5 timer, og tilsetning av ytterligere 60 mg (0.3 mmol) p-nitrofenylkloroformat som ble omrørt under de samme betingelsene i 15 timer. Oppløsningsmiddelet ble avdampet under redusert trykk. Resten ble suspendert i 4 ml kloroform, og suspensjonen ble påført på en flammekromatografikolonne (3 cm x 60 cm) inneholdende 100 g silikagel (230-400 mesh) og eluert med en 1:1 (volum/volum) blanding av heksan og etylacetat. Fraksjonene som ble eluert fra kolonnen ble samlet og analysert ved hjelp av tynnskiktkromatografi [9:1 (volum/volum) kloroform/metanol], og fraksjonene inneholdende 3-digitoksigeninyl-p-nitrofenylkarbonat ble bestemt med p-anisaldehyd sprayreagens ved å observere en blåfarging ved oppvarming som indikerte nærværet av det ønskede produktet. Produktfraksjonene ble samlet og oppløs-ningsmiddelet ble inndampet under redusert trykk slik at det ble oppnådd et fast produkt som deretter ble rekrystallisert fra en blanding av heksan og kloroform slik at det ble oppnådd 279 mg av' 3-digitoksigeninyl-p-nitrofenylkarbonat i form av bleke, gule krystaller.
Eksempel 3
Syntese av 3-0-(5-karboksypentan-l-karbamoyl)digitoksigenin. Aktivert digitoksigenin ble karboksy-funksjonalisert ved at det ble dannet en reaksjonsoppløsning av 1.08 g (2 mmol) 3-digitoksigeninyl-p-nitrofenylkarbonat (fremstilt ifølge eksempel 2) oppløst i 50 ml vannfri pyridin som ble omrørt ved romtemperatur mens en oppløsning av 315 mg (2.4 mmol) 6-aminokaprionsyre og 337 pl (2.4 mmol) trietylamin i 10 ml av en 1:1 (volum/volum) blanding av pyridin og vann langsomt ble tilsatt i løpet av et tidsrom på 5 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt ved romtemperatur i 21 timer, og oppløsningsmidlene ble avdampet under redusert trykk. Resten ble deretter oppløst i 25 ml vannfritt toluen, og oppløs-ningsmiddelet ble indampet under redusert trykk.
Resten ble oppløst i 5 ml av en 200:10:1 (volum/volum) blanding av metylenklorid, metanol og eddiksyre og deretter påført på en flammekromatografikolonne (5 cm x 60 cm) inneholdende 200 g silikagel (230-400 mesh) og eluert med en 200:10:1 blanding av metylenklorid, metanol og eddiksyre. Fraksjonene som ble eluert fra kolonnen ble samlet og analysert ved hjelp av tynnskiktkromatografi [200:10:1 (volum/volum) metylenklorid, metanol og eddiksyre] og fraksjonene inneholdende 3-0-(5-karboksypentan-l-karbamoyl)-digitoksigenin ble bestemt med p-anisaldehyd sprayreagens ved å observere en blåfarging ved oppvarming som indikerte nærvær av det ønskede produktet. Produktfraksjonene ble samlet og oppløsningsmidlene ble avdampet under redusert trykk slik at det ble oppnådd et klart oljeprodukt som deretter ble krystallisert med 10 ml vannfri etyleter slik at det ble oppnådd et hvitt, fast produkt som ble samlet ved filtrering og tørket under høyvakuum ved 40°C i 1 time slik at det ble oppnådd 568 mg av 3-0-(5-karboksypentan-l-karbamoyldigitok-sigenin i form av et hvitt, fast stoff.
Eksempel 4
Aktivering av 3-0-(5-karboksypentan-l-karbamoyl)digitoksigenin med N-hydroksysuksinimid.
Esteren av karboksy-funksjonalisert digitoksigenin ble fremstilt ved å danne en reaksjonsoppløsning av 64 mg (117 pmol) av 3-0-(5-karboksypentan-l-karbamoyl )digitoksigenin (fremstilt ifølge eksempel 3) oppløst i 2 ml vannfritt N,N-dimetylformamid (DMF) som ble omrørt under argon ved romtemperatur og 28 pl (200 pmol) trietylamin, 15 mg (130 pmol) N-hydroksysuksinimid og 27 mg (130 pmol) av N,N-dicykloheksyl-karbodiimid ble tilsatt. Etter 24 timer ble dicykloheksyl-ureaen som ble utfelt fjernet ved filtrering, og filtratet inneholdende N-hydroksysuksinimidesteren av 3-0-(5-karboksy-pentan-l-karbamoyl )digitoksigenin ble fortynnet til 11.111 ml med DMF. Typisk forløper denne reaksjonen ikke fullstendig.
Eksempel 5
Syntese av N-hydroksysuksinimidester av 3-0-(5-karboksypen-tan-l-karbamoyl ) )digitoksigenin kovalent bundet til aminoetyl "BIO-GEL P-2" harpiks.
En immobilisert haptenreagens ifølge foreliggende oppfinnelse innbefattende digitoksigenin kovalent bundet til de ytre amingruppene av en aminoetyl-avledet polyakrylamid gelpartikkel ble fremstilt ved først å danne en suspensjon av 2 g aminoetyl "BIO-GEL P-2" harpiks (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA; Kvalitetnr. 28945, 1.39 milliekvivalent aminfunksjonelle grupper/gram tørr harpiks) i 10 ml DMF som ble inkubert ved romtemperatur i 48 timer. En porsjon på 10 ml av supernatanten fra den aminoetyl-avledede "BIO-GEL P-2" harpiksen i DMF-oppløsningen ble fjernet og erstattet med 10 ml av det aktiverte digitoksigeninet i DMF fremstilt ifølge eksempel 4 slik at det ble dannet en reaksjonsoppløsning innbefattende 50 pmol aktivert digitoksigenin pr. gram av den tørre harpiksen, og dette ble forsiktig blandet på ^n rotasjonsblander (omrystet) ved romtemperatur i 48 timer.
Tilsvarende ble fremgangsmåten beskrevet ovenfor fulgt for fremstilling av reaksjonsoppløsninger innbefattende 5 pmol, 0.5 pmol, og 0.05 pmol av aktivert digitoksigenin pr. gram tørr harpiks ved å fjerne 1.0 ml, 0.1 ml og 0.01 ml av supernatanten av tilsvarende preparert "BIO-GEL P-2" harpiks i DMF, og erstatte de fjernede volumene med 1.0 ml, 0.1 ml, og 0.01 ml av det aktiverte digitoksigeninet i DMF oppløsning fremstilt ifølge eksempel 4.
De fire prøvene av den immobiliserte haptenreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse innbefattende digitoksigenin kovalent knyttet til den aminoetyl-avledede "BIO-GEL P-2" harpiksen fremstilt som beskrevet ovenfor ble samlet ved filtrering og vasket med ti 10 milliliters volumer av DMF, og deretter med fem 10 milliliters volumer av en bufret vaske-oppløsning (i det følgende betegnet som "vaskebuffer") innbefattende 2M NaCl og 0.1 M eddiksyre (pH 2.3). De vaskede reagensprøvene ble helt i kolonner og ytterligere vasket med 14 sjiktvolumer av vaskebufferen. En porsjon på 2-3 ml fra hver av de vaskede reagensoppløsningene ble helt i små kolonner og vasket med 50 ml vann etterfulgt av 50 ml av en analysebuffer (pH 7.4) inneholdende 0.05 M natriumfosfat, 0.05 M natriumklorid, 0.001 M magnesiumklorid, 100 pg/ml bovinserumalbumin, og 0.0256 natriumacid (i det følgende betegnet som "analysebuffer"), og endelig resuspendert i en tilstrekkelig mengde av analysebufferen til å gi en suspensjon som hadde et volum som var dobbelt så stort som volumet av den sedimenterte harpiksen (det vil si 5056). De gjen-værende 7-8 ml av de vaskede harpiksprøvene ble deretter vasket med 60 ml vann og lyofilisert fra en 5056 kritisk mengde.
Eksempel 6
Eksperimentelle resultater.
De immobiliserte digitoksigeninreagensharpiksene fremstilt ifølge eksempel 5 ble sammenlignet med digitoksigenin kontrollharpikser fremstil på tilsvarende måte med karboksy-funksjonalisert digitoksigenin som ikke var aktivert med N-hydroksysuksinimid (NOS), for å demonstrere omfanget av kovalent binding og ikke-spesifikk binding i den immobiliserte digitoksigenin-reagensen når den ble fremstilt som ved foreliggende oppfinnelse. Slike kontroller ble anvendt fordi dannelsen av NOS-esteren av digitoksigenin ikke forløper til 10056 og følgelig er ikke-aktivert digitoksigenin fremdeles tilstede og kan bindes ikke-spesifikt til harpiksen.
a. Evaluering av kovalent binding av digitoksigenin til harpiks.
Kontrollharpiksene ble fremstilt ved først å fjerne 10.0 ml, 1.0 ml og 0.01 ml supernatant fra de respektive suspensjonene av 2 gram aminoetyl-avledet "BIO-GEL P-2" harpiks i 10 ml DMF ifølge eksempel 5, og erstatte de respektive volumene med oppløsninger av ikke-aktivert karboksy-funksjonalisert digitoksigenin fremstilt ifølge eksempel 3. Den samme fremgangsmåten som i eksempel 5 ble deretter benyttet for å fremstille de respektive kontrollharpiksene innbefattende digitoksigenin ikke-spesifikt bundet til aminoetyl-avledet "BIO-GEL P-2" harpiks. De fire immobiliserte digitoksigenin reagensharpiksene fremstilt ifølge eksempel 5, og de fire digitoksigenin-kontrollharpiksene fremstilt ifølge foreliggende eksempel, ble deretter vurdert i en heterogen immunoanalyse ved anvendelse av en 1.0 nM oppløsning av enverdig antistoff-fragment (Fab') av et monoklonalt antistoff (se for eksempel Porter, Biochem. J. , bind 73, s. 119 [1959] og Nisonoff, Methos Med. Res., bind 10, s. 132 [1964]) til digoksin merket med p<->galaktosidase (se for eksempel Ishikawa, J. Biochem., bind 96, s. 659 [1984]; Kato et al., J. Immunol, bind 116, s. 1554 [juni 1976]; og Yoshitake et al., Euro. J. Biochem., bind 101, s. 395 [1977] i analysebuf f er-oppløsningen (pH 7.4) fra eksempel 5 som den merkede reagensen, sammen med en normal human serumprøve (analyse I) og en normal human serumprøve inneholdende 300 ng/ml digoksin (analyse II) som kontrollprøver, ifølge følgende immunoana-lysef remgangsmåter.
(i) Analyse I.
(1) En første reaksjonsblanding innbefattende 200 pl av den merkede reagensen og 30 pl av den normale humane serumprøven ble inkubert i 5 minutter ved romtemperatur; (2) en andre reaksjonsblanding innbefattende 100 pl fra den første reaksjonsblandingen fra trinn (1) av foreliggende analyse og 100 pl harpiks (oppnådd fra harpiksblandingen med 50% av et sedimentert harpiksvolum (det vil si 5056 krit.) ble rotert (30 opm) i 10 minutter ved romtemperatur; og (3) harpiksen fra (2) av foreliggende analyse fikk sedimentere i 1 minutt, og en porsjon på 30 pl av supernatanten ble påført på en reagenspute inkorporert med resorufin-p-D-galaktopyranosid (Hoffman et al., Analytica Chimica Acta, bind 163, s. 67 [1984]) for å bestemme enzymaktiviteten av p-D-galaktosidasen av den merkede reagensen.
(ii) Analyse II.
(1) En første reaksjonsblanding innbefattende 200 pl av den merkede reagensen og 30 pl av den normale humane serumprøven inneholdende 300 ng av digoksin/ml ble inkubert i 5 minutter ved romtemperatur; (2) en andre reaksjonsblanding innbefattende 100 pl fra den første reaksjonsblanding fra trinn (1) av foreliggende analyse og 100 pl av harpiks (5056 krit.) ble rotert (30 opm) i 10 minutter ved romtemperatur; og (3) harpiksen fra trinn (2) av foreliggende analyse fikk sedimentere i 1 minutt, og en porsjon på 30 pl av supernatanten ble påført på en reagenspute inkorporert med resorufin-p<->D-galaktopyranosid.
Hastigheten for fargedannelsen som oppsto ved interaksjonen mellom p-D-galaktosidasen og resorufin-P-D-galaktopyranosidet ble målt ved 560 nM mellom 60 og 80 sekunder etter prøve-påføringen på reagensputen, for å bestemme p<->D-galaktosidaseaktiviteten av den merkede reagensen fra supernatanten, det vil si de bundne spesies. Reaktivitetsmålingene (tabell 1) ble utført på et "Seralyzer" reflektansfotometer (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN, USA) koblet til en HP-85 datamaskin (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA, USA) via et flerports grensesnitt, hvorved omfanget av binding av konjugatet til harpikspartikkelen ble bestemt ved å beregne omfanget av bakgrunnssignalet (56 bakgrunn) ifølge følgende ligning: resultatene er sammenfattet i tabell 1. Det skal understrekes at en lav verdi for % bakgrunn indikerer god binding av konjugatet ved harpiksen, hvilket bare kan finne sted i fravær av utlekkbart, ikke-spesifikt adsorbert hapten.
Tilsvarende ble den lyofiliserte harpiksen undersøkt ved følgende analysefremgangsmåter:
(i ) Analyse III.
(1) En første reaksjonsblanding innbefattende 375 pl av den merkede reagensen og 30 pl av den normale humane serumprøven ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur; (2) en andre reaksjonsblanding innbefattende 200 pl av den første reaksjonsblandingen fra trinn (1) av foreliggende analyse og 10 mg lyofilisert harpiks ble rotert i 5 minutter ved romtemperatur; og (3) harpiksen fra trinn (2) av foreliggende analyse fikk sedimentere i 1 minutt, og en porsjon på 30 pl av supernatanten ble påført på en reagenspute inkorporert med resorufin-p-D-galaktopyranosid (Hoffman et al., Analytica Chimica Acta, bind 163, s. 67 [1984]) for å bestemme enzymaktiviteten av p-D-galaktosidasen av den merkede reagensen.
(ii) Analyse IV.
(1) En første reaksjonsblanding innbefattende 375 pl av den merkede reagensen og 30 pl av den normale humane serumprøven inneholdende 300 ng av digoksin/ml ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur; (2) en andre reaksjonsblanding innbefattende 200 pl fra den første reaksjonsblandingen i trinn (1) av foreliggende analyse og 10 mg lyofilisert harpiks ble rotert i 5 minutter ved romtemperatur; og (3) harpiksen fra trinn (2) av foreliggende analyse fikk sedimentere i 1 minutt, og en porsjon på 30 pl av supernatanten ble påført på en reagenspute inkorporert med resorufin-p-D-galaktopyranosid.
Hastigheten for fargedannelse som oppsto fra interaksjonen mellom p-D-galaktosidasen og resorufin-P-D-galaktosidasen ble målt som beskrevet ovenfor. Omfanget av bindingen av konjugat til harpikspartikkelen ble bestemt ved å beregne omfanget av bakgrunnssignal (# bakgrunn) ifølge følgende ligning: resultatene er sammenfattet i tabell 2.
Den betydelige forskjellen i bakgrunnssignal mellom den immobiliserte digitoksinreagensharpiksen ifølge foreliggende oppfinnelse og kontrollharpiksen indikerer at digitoksigenin-enheten var sterkt bundet til harpiksen ved en stabil, kovalent binding. Evnen av kontrollharpiksene som er behandlet med den frie karboksylsyreformen av haptenen til å binde noe av konjugatet indikerer at det foreligger en sterkt ikke-spesifikk absorbsjon av forbindelsen til harpiksen. Ettersom konsentrasjonen av den frie syreformen reduseres avtar også slik ikke-spesif ikk absorbsjon. Det er ved slike lave haptenkonsentrasjoner at den immobiliserte haptenrea-gensharpiksen ifølge foreliggende oppfinnelse som virker optimalt i den lyofiliserte formen kan oppnås (tabell 2).
b. Vurdering av stabiliteten av immobilisert digitoksigenin-reagens.
"Utlekkingen av digitoksigenin fra den immobiliserte digitok-sigeninreagensen fremstilt som ved foreliggende oppfinnelse ble vurdert ved følgende analyse ved anvendelse av prøver på 170 pl analysebuffer (lav reaktivitetskontroll), 150 nM digoksin i analysebuffer (høy reaktivitetskontroll), eller 170 pl av supernatantene fra 50 pmol/gram tørrvekt av harpiksen, 5 pmol/gram tørrvekt av harpiksen, 0.5 pmol/gram tørrvekt av harpiksen og 0.05 pmol/gram tørrvekt av harpiksen som var lagret i analysebuf rene i 1 uke ved 4°C (etter lagring ble harpiksene først resuspendert å tillatt å sedimentere før supernatanten ble fjernet):
(i) En første reaksjonsblanding innbefattende 30 pl av normalt humant serum og 30 pl av en 6.7 nM oppløsning av konjugatet ble blandet med en av de tidligere nevnte prøvene og inkubert i 5 minutter ved romtemperatur; (ii) en andre reaksjonsblanding innbefattende 100 pl av den første reaks jonsb land ingen og 100 pl av en 50$ kritisk konsentrasjon av en nyvasket "Sephadex G10-BSA"-ouabainhar-piks som beskrevet ovenfor (fra duPont "Digoxin Assay Eeagent piks som beskrevet ovenfor (fra duPont "Digoxin Assay Reagent Kit", Katalog nr. 705797901, E.I. DuPont de Nemours and Company, Inc., Wilmington, USA) ble rotert omhyggelig (30 opm) i 20 minutter ved romtemperatur; og (iii) harpiksen fra trinn (ii) fikk sedimentere i 1 minutt, og en porsjon på 30 pl av supernatanten ble påført på en reagenspute inkorporert med resorufin-p<->D-galaktopyranosid, og hastigheten for fargedannelse ble målt på et "Seralyzer" reflektansfotometer som beskrevet ovenfor. Omfanget av interferens i forhold til konjugatbinding ved digitoksigenin som ble vasket inn i analysemediet ble bestemt ved hjelp av følgende beregninger:
hvori resultatene er sammenfattet i tabell 3.
Resultatene indikerer at utvasking av digitoksigenin, det vil si ikke-spesifikt adsorbert, fra de fremstilte harpiksene ved konsentrasjoner på 0.5 og 0.05 pmol digitoksigen/gram harpiks spesielt ved 0.05 pmol digitoksigenin/gram harpiks var minimalisert. Den minimale mengden utvasking, spesielt ved 0.5 pmol/gram og 0.05 pmol/gram demonstrerer klart, som det fremgår av resultatene ovenfor-, at harpiksene fremstilt som ved foreliggende oppfinnelse, det vil si i et vannfritt organisk oppløsningsmiddel med en reaksjonsblandingfortynning som beskrevet ovenfor, har en i det vesentlige stabil kovalent binding mellom digitoksigeninet og harpiksen, og viser en minimal mengde løst eller ikke-spesifikt bundet digitoksigenin hvori mengden digitoksigenin som utvaskes reduseres i betydelig grad ved slike høyere fortynninger.
c. Doserespons på digoksin.
0.05 pmol digitoksigenin/gram av harpiksen fremstilt som ved foreliggende oppfinnelse ble vasket med en bufferoppløsning (2 M NaCl og 0.1 M eddiksyre, pH 2.3), etterfulgt av vann, og deretter tørket ved lyofilisering. Den lyofiliserte harpik-
sen ble deretter anvendt i en Immunoanalyse for bestemmelse av digoksin fra en flytende prøve ved anvendelse av et i det vesentlige rent monokonjugatpreparat innbefattende et enkelt enverdig antistofffragment (Fab') avledet fra et monoklonalt antistoff mot digoksin kovalent koblet til en enkelt p-D-galaktosidasekomponent som merket reagens. Monokonjugatet ble oppnådd fra en konjugat-reaksjonsblanding innbefattende enverdige og flerverdige konjugater, frie p<->D-galaktosidase-komponenter og frie Fab' komponenter, som var elektroforetisk renset på en elektroforetisk polyakrylamidgel som beskrevet i U.S. patentsøknaden med tittelen "Substantially Pure Enzyme-Antibody Monoconjugate Preparation" (sak nr. MS-1477), inngitt samtidig med foreliggende søknad. Immunoanalysen anvendte også, som det kromogene enzymsubstratet, et akridinon-p-D-galaktopyranosid innbefattende et 7-hydroksy-9,9-dimetyl-9E-akridin-2-on avledet ved 7-posisjonen med en 3-D-galaktose-rest som beskrevet i europeisk patent 270,946 på følgende måte: (i) En reaksjonsblanding innbefattende 875 pl av en 0.30 nM oppløsning av den monokonjugat-merkede reagensen og 35 pl av en serumprøve inneholdende digoksin ble inkubert ved romtemperatur i 6 minutter; (ii) en reaksjonsblanding innbefattende 780 pl av reaksjonsblandingen fra trinn (i) og 30 mg lyofilisert 0.05 pmol digitoksigenin/gram harpiks ble omrørt i 4 minutter, og harpiksen ble separert fra oppløsningen ved hjelp av et porøst plastfilter; og (iii) en porsjon på 30 pl ble fjernet fra filtratet av reaksjonsblandingen fra trinn (ii) og påført på et reagens-bånd inkorporert med akridinon-p-D-galaktopyranosid.
Omfanget av fargedannelse som oppsto ved interaksjonen mellom p-D-galaktosidasen og akridinon-p-D-galaktopyronosid ble målt ved 630 nm mellom 60 til 80 sekunder etter prøvepåføring på reagensputen, for å bestemme p-D-galaktosidaseaktiviteten av den monokonjugat-merkede reagensen fra filtratet, det vil si de bundne spesies (tabell 4). Den resulterende doseresponsen til digoksin basert på data vist i tabell 4 er gjengitt i figur 1.
Eksempel 7
Syntese av tverrbundne polyakrylamid-sulfhydryl kopolymer gelpartikler.
Under argon ble akrylamid (40$), bisakrylamid ( 10%) og N,N'-bisakrylylcystamin (3.456) blandet med 30 ml vann. Tempera-turen av blandingen ble øket til 45-50°C for oppløse alt det faste stoffet. Etter at 100 pl N,N,N',N'-tetrametyletylendi-amin var tilsatt ble blandingen avkjølt til 40"C og 25 mg ammoniumpersulfat ble tilsatt og oppløsningen fikk polymeri-sere i form av en bulkpolymer i et isbad. Etter 3 timer ble bulkpolymeren fjernet fra beholderen som et transparent fast materiale, og blandet med vann og homogenisert i en mekanisk blander slik at det ble oppnådd en gelsuspensjonen. Gelsuspensjonen ble først siktet på en 85 mesh sikt (USC betegn-else) slik at det ble oppnådd gelpartikler med diametere mindre enn 150 pm, som deretter ble siktet på en 400 mesh sikt slik at det ble oppnådd partikler med diameter 38 pm-150 pm. De resulterende 38 pm - 150 pm partiklene ble vasket godt med vann, og gelen filtrert og vasket med etanol og endelig tørket ved avsugning og vakuum.
Eksempel 8
Syntese av immobilisert glykopeptidreagens.
En immobilsert haptenreagens innbefattende et glykopeptid kovalent bundet til de ytre sulfhydryl-funksjonelle gruppene av polyakrylamidgelen fremstilt ifølge eksempel 7 ble fremstilt på følgende måte: (a) 2.0 g av den tverrbundne polyakrylamidsulfhydryl-ko-polymergelen fremstilt ifølge eksempel 7 ble først vasket (4 x 5 ml) med dimetylf ormamid (DMF), fikk renne av seg og ble blandet med 400 mg ditiotreitol (DTT) og 0.5 ml DMF. Blandingen ble omrørt og virvlet periodisk ved romtemperatur. Etter 1 time fikk væsken renne av og gelen ble holdt under argon og vasket med argon-renset DMF inntil intet DTT kunne detekteres i vaskevannet. (b) I en separat beholder ble en 800 pl oppløsning av et glykopeptid (den glykosylerte N-terminale peptidsekvensen i beta-underheten av hemoglobin som beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 185,870) ved en konsentrasjon på 1.0 mg/100 pl vann blandet med en oppløsning av 200 pl bismaleimido-heksaetylenglykol (1.0 mg i 100 pl DMF) og 600 pl DMF. Etter 10 minutter ved romtemperatur ble oppløsningen tilsatt til den aktiverte gelen fra trinn (a) av foreliggende eksempel. Gelblandingen ble omrørt og virvlet periodisk i 2 timer. Gelen fikk dryppe av seg og ble vasket med DMF (8x2 ml), en oppløsning av 2M NaCl og 0.1N eddiksyre (6 x 5 ml), vann (150 ml) og etanol (4 x 10 ml). Gelen ble deretter tørket ved avsugning og under vakuum slik at det ble oppnådd 2.0 g av den immobiliserte glykopeptidreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse innbefattende glykopeptidet kovalent bundet i det vesentlige bare til de ytre sul f hydryl-funksjonelle gruppene av den tverrbundne kopolymer gelpartikkelen.
Eksempel 9
Reaktivitetsanalyse for immobilisert glykopeptidreagens.
Den immobiliserte glykopeptid-reagensen (harpiks) fremstilt ifølge eksempel 8 ble vurdert for å bestemme nivået av ubundet merke (bakgrunn) ved anvendelse av et monokonjugatpreparat av et enverdig antistoff-fragment (Fab') merket med P-D-galaktosidase, som en merket reagens. Det enverdige antistoff-fragmentet var avledet fra et monoklonalt antistoff spesifikt for den glykosylerte N-terminale peptidsekvensen (8 aminosyrer) i beta-underheten av humant hemoglobin (se europeisk patentpublikasjon nr. 185,870) ved fremgangsmåtene beskrevet av Porter og Nisonoff, supra, og merket med p-D-galaktosidase ved fremgangsmåtene beskrevet av Ishikawa, Kata et al., og Yoshitake et al., supra. Det enverdige antistoff-fragmentet p<->D-galaktosidasekonjugat ble elektroforetisk renset på en polyakrylamidgel slik at det ble oppnådd et i det vesentlige rent monokonjugatpreparat innbefattende en enkelt Fab' komponent og en enkelt 3-D-galaktosidase komponent, som beskrevet i U.S. patent 5,047,324 beskrevet ovenfor. (a) Til en oppløsning av 250 pl av den monokonjugat-merkede reagensen ble det tilsatt 30 pl buffer (pH 7.4, 0.05M natriumfosfat, 0.05 natriumklorid, 1 mM magnesiumklorid, 100 pg/ml bovinserumalbumin, og 0.02 % natriumazid); (b) En porsjon på 270 pl av oppløsningen fra trinn (a) ifølge foreliggende eksempel ble blandet med 10-20 mg av den immobiliserte glykopeptidreagensen (harpiks) og suspensjonen ble rotert omhyggelig i 30 minutter ved romtemperatur; og (c) harpiksen ble fjernet ved filtrering og en porsjon på 30 pl av filtratet ble påført på en reagenspute inkorporert med resorufin-B-D-galaktopyranosid.
Reaktivitetsmålingene ble utført med "Seralyzer" reflektans-fotometeret beskrevet ovenfor, og forholdet mellom reaktivitetene målt på denne måten og reaktiviteten av den merkede reagensen uten behandling av harpiksen ble angitt som % bakgrunn (se tabell 5).
Eksempel 10
Immunoanalyse for bestemmelsen av HbAlc.
(a) 30 pl av varierende konsentrasjoner av denaturert blod, det vil si HbAlc (fig. 2), ble tilsatt til 250 pl oppløs-ninger av den merkede reagensen (eksempel 9) og blandingene fikk stå i 10 minutter ved romtemperatur; (b) En porsjon på 270 pl fra hver blanding ble blandet med 15 mg av den immobiliserte glykopeptidreagensen (eksempel 8) og rotert omhyggelig i 10 minutter ved romtemperatur; (c) Harpiksen ble fjernet ved filtrering og 30 pl av filtratet ble påført på en reagenspute inkorporert med resorufin-p-D-galaktopyranosid.
Eeaktivitetsmålingene ble utført med et "Seralyzer" reflektansfotometer som beskrevet ovenfor og reaktivitetene ble funnet å være direkte proporsjonale med konsentrasjonene av HbAlc tilstede i fullblod (se figur 2).
Claims (7)
1.
Stabil, immobilisert haptenreagens for bruk i den spesifikke bindingsanalysebestemmelsen av en hapten eller bindingsanalog derav i en væskeformig testprøve, hvor reagensen omfatter en gelpartikkel som er svellbar i vann og har flere haptendeler bundet dertil, karakterisert ved at reagensen er fremstilt ved trinnene: (a) omsetning av en haptendel med en polyakrylamidgelpartikkel innbefattende flere ytre og indre kjemisk aktive funksjonelle grupper, hvor reaksjonen utføres i et organisk oppløsningsmiddel som er vesentlig fritt for vann og hvori gelpartikkelen er i det vesentlige ikke-svellet og under slike betingelser at det dannes en kovalent binding mellom haptendelen og nevnte ytre aktive funksjonelle grupper som er vesentlig stabile i vandig oppløsning; (b) vasking av gelpartikkelen fra trinn (a) med et organisk oppløsningsmiddel som er vesentlig fritt for vann og hvori gelpartikkelen er vesentlig ikke-svellet; (c) vasking av gelpartikkelen fra trinn (b) med en vandig oppløsning; og (d) isolering av den immobiliserte haptenreagensen fra trinn (c) innbefattende nevnte gelpartikkel og nevnte haptendeler bundet dertil hvor vesentlig alle nevnte bundne haptendeler er kovalent bundet til de funksjonelle gruppene på den ytre overflaten ved hjelp av en bindingsgruppe som er vesentlig stabil i vandige oppløsninger.
2.
Stabil, immobilisert haptenreagens ifølge krav 1, karakterisert ved at de ikke-svellende organiske oppløsningsmidlene er valgt fra dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, aceton, klorerte hydrokarboner og cykliske og acykliske alkyletere.
3.
Stabil, immobilisert haptenreagens ifølge krav 1, karakterisert ved at haptendelen er valgt fra gruppen bestående av digoksin, digitoksigenin, digitoksin, digoksigenin, 12-0-acetyldigoksigenin, og at bindingsgruppen er valgt fra gruppen bestående av bifunksjonelle rester av 1,6-heksametylendiamin, 6-aminoheksanol, 1,12-diamino-4,9-dioksadodekan, 1,17-diamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekan, 6-aminokaproinsyre og bovinserumalbumin.
4.
Stabil, immobilisert haptenreagens ifølge krav 3, karakterisert ved at bindingsgruppen er en bifunksjonell rest av 6-aminokaproinsyre og at haptendelen er digitoksigenin.
5.
Stabil, immobilisert haptenreagens ifølge krav 1, karakterisert ved at haptendelen er en glykosylert peptidsekvens og at bindingsgruppen er valgt fra bifunksjonelle rester av 1,1'-[metylendi-4,1-fenylen]bismaleimid, bismaleimido-heksan og bismaleimido-heksaetylenglykol.
6.
Stabil, immobilisert haptenreagens ifølge krav 5, karakterisert ved at den glykosylerte peptidsekvensen tilsvarer den glykosylerte N-terminale peptidsekvensen i beta-underenheten av humant hemoglobin, og at bindingsgruppen er bismaleimido-heksaetylenglykol.
7.
Anvendelse av reagensen ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6 i analyse av hapten, eller en analog derav, i en væskeformig testprøve.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/939,902 US4822747A (en) | 1986-12-09 | 1986-12-09 | Polyacrylamide gel particles having hapten moieties bound thereto as immunoassay reagent |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO874937D0 NO874937D0 (no) | 1987-11-26 |
NO874937L NO874937L (no) | 1988-06-10 |
NO172459B true NO172459B (no) | 1993-04-13 |
Family
ID=25473911
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO874937A NO172459B (no) | 1986-12-09 | 1987-11-26 | Stabil immobilisert haptenreagens for anvendelse i heterogene immunometriske analyser, samt anvendelse derav |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4822747A (no) |
EP (1) | EP0270937B1 (no) |
JP (1) | JPH063449B2 (no) |
AT (1) | ATE80950T1 (no) |
AU (1) | AU585470B2 (no) |
CA (1) | CA1288691C (no) |
DE (1) | DE3781870T2 (no) |
DK (1) | DK643987A (no) |
ES (1) | ES2044896T3 (no) |
IL (1) | IL83894A (no) |
NO (1) | NO172459B (no) |
ZA (1) | ZA878430B (no) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5237016A (en) * | 1989-01-05 | 1993-08-17 | Siska Diagnostics, Inc. | End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids |
US5045480A (en) * | 1989-02-09 | 1991-09-03 | Miles Inc. | Gel particles having hapten moieties bound thereto as immunoassay reagent |
JP3607289B2 (ja) * | 1993-03-29 | 2005-01-05 | ミネソタ マイニング アンド マニュファクチャリング カンパニー | 多孔質支持体(p.e.アズラクトン)の内部にリガンドをカップリングする方法及びその使用法 |
US5613190A (en) * | 1995-05-01 | 1997-03-18 | Bell Atlantic Network Services, Inc. | Customer premise wireless distribution of audio-video, control signals and voice |
US6177282B1 (en) | 1997-08-12 | 2001-01-23 | Mcintyre John A. | Antigens embedded in thermoplastic |
US6066446A (en) * | 1997-12-19 | 2000-05-23 | Nen Life Science Products, Inc. | Assay member and method for its manufacture |
CA2283597C (en) | 1998-10-02 | 2008-02-05 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Reduced cortisol conjugates |
JP2002372539A (ja) * | 2001-06-13 | 2002-12-26 | Towns:Kk | 非蛋白性物質に対する抗体の検出方法及び装置 |
JP2007240509A (ja) * | 2006-03-12 | 2007-09-20 | Ultizyme International Ltd | 分子認識ポリマー及びその製造方法、分子認識ポリマーを用いた固相抽出方法 |
CA2786465C (en) | 2010-01-15 | 2018-09-25 | Suzhou Neupharma Co., Ltd. | Bufalin derivatives for the treatment of cancer |
US9018197B2 (en) | 2010-08-28 | 2015-04-28 | Suzhou Neupharma Co. Ltd. | Tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene compounds, compositions, and related methods of use |
WO2012103810A1 (en) * | 2011-02-02 | 2012-08-09 | Suzhou Neupharma Co., Ltd | Certain chemical entities, compositions, and methods |
WO2013165924A1 (en) | 2012-04-29 | 2013-11-07 | Neupharma, Inc. | Certain chemical entities, compositions, and methods |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3793445A (en) * | 1970-04-29 | 1974-02-19 | Wisconsin Alumni Res Found | Reagent for radioimmunoassay |
US3966897A (en) * | 1973-04-02 | 1976-06-29 | Marine Colloids, Inc. | Medium for use in bioassay and method of using same |
US3925017A (en) * | 1973-05-01 | 1975-12-09 | Wisconsin Alumni Res Found | Preparation of dry, porous gel particles having high water regain for liquid sampling |
FR2334106A1 (fr) * | 1975-12-02 | 1977-07-01 | Pasteur Institut | Gel magnetique convenant pour dosages immunoenzymatiques |
AU533026B2 (en) * | 1979-10-26 | 1983-10-27 | Dynasciences Corp. | Passively adsorbing immuno-reactive haptens to solid phases |
US4446232A (en) * | 1981-10-13 | 1984-05-01 | Liotta Lance A | Enzyme immunoassay with two-zoned device having bound antigens |
JPS58214854A (ja) * | 1982-06-08 | 1983-12-14 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | 免疫用分析素材 |
US4551426A (en) * | 1983-10-03 | 1985-11-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Heterogeneous immunoassay for digoxin using ouabain as a separation means |
CA1339952C (en) * | 1984-10-29 | 1998-07-14 | William J. Knowles | Immunoassays for denatured protein analytes, particularly hb alc, and monoclonal antibodies thereto |
-
1986
- 1986-12-09 US US06/939,902 patent/US4822747A/en not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-09-14 IL IL83894A patent/IL83894A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-09-28 CA CA000548010A patent/CA1288691C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-10 ZA ZA878430A patent/ZA878430B/xx unknown
- 1987-11-26 ES ES87117463T patent/ES2044896T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-26 NO NO874937A patent/NO172459B/no unknown
- 1987-11-26 AT AT87117463T patent/ATE80950T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-26 DE DE8787117463T patent/DE3781870T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-26 EP EP87117463A patent/EP0270937B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 AU AU81906/87A patent/AU585470B2/en not_active Ceased
- 1987-12-08 DK DK643987A patent/DK643987A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-12-08 JP JP62308812A patent/JPH063449B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0270937A3 (en) | 1990-09-19 |
ZA878430B (en) | 1988-05-05 |
DE3781870D1 (de) | 1992-10-29 |
AU8190687A (en) | 1988-06-09 |
EP0270937A2 (en) | 1988-06-15 |
DE3781870T2 (de) | 1993-02-11 |
IL83894A (en) | 1991-06-10 |
US4822747A (en) | 1989-04-18 |
EP0270937B1 (en) | 1992-09-23 |
IL83894A0 (en) | 1988-02-29 |
JPS63163166A (ja) | 1988-07-06 |
NO874937D0 (no) | 1987-11-26 |
DK643987A (da) | 1988-05-10 |
DK643987D0 (da) | 1987-12-08 |
NO874937L (no) | 1988-06-10 |
CA1288691C (en) | 1991-09-10 |
ATE80950T1 (de) | 1992-10-15 |
JPH063449B2 (ja) | 1994-01-12 |
AU585470B2 (en) | 1989-06-15 |
ES2044896T3 (es) | 1994-01-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4434236A (en) | Immunoassay wherein labeled antibody is displaced from immobilized analyte-analogue | |
JP3358737B2 (ja) | 改良された投与量応答曲線を有するアッセイ | |
JP2930426B2 (ja) | 一又は複数種の競合イムノアッセイを実施するための器具 | |
US5013669A (en) | Mass producible biologically active solid phase devices | |
EP0191640B1 (en) | Concentrating immunochemical test strip | |
DK172179B1 (da) | Testmetode og reagenssæt dertil | |
JP2807565B2 (ja) | いき値リガンド‐レセプター検定 | |
NO166818B (no) | Forsoeksinnretning bestaaende av et flerlagselement for spesifikk bestemmelse ved bindingsanalyse av en analytt i et flytende forsoeksmedium. | |
US5629164A (en) | Enzyme immunoassay device | |
DK149908B (da) | Fremgangsmaade, analysesaet og biotin-maerket antistof til paavisning og/eller kvantitativ bestemmelse af et biologisk stof i en proeve. | |
JPH0566547B2 (no) | ||
US5045480A (en) | Gel particles having hapten moieties bound thereto as immunoassay reagent | |
FI102921B (fi) | Menetelmä biologisesti aktiivisten reagenssien valmistamiseksi sukkiin i-imidiä sisältävistä polymeereistä, analyysielementti ja menetelmiä n iiden käyttämiseksi | |
NO172459B (no) | Stabil immobilisert haptenreagens for anvendelse i heterogene immunometriske analyser, samt anvendelse derav | |
JPH01227061A (ja) | イオン捕捉イムノアッセイ法および装置 | |
EP0297292A2 (en) | Method and test device for separating labeled reagent in an immunometric binding assay | |
US5738986A (en) | Analytical reagent particle with covalently-bound enzyme | |
WO1990008957A1 (en) | Avidin-biotin assisted immunoassay | |
NO882299L (no) | Fremgangsmaate for magnetisk separering av merket reagens i en immunometrisk bindings-analyse. | |
JPH0731197B2 (ja) | 低級アルコールスルフェート洗浄液,試験キットおよび免疫リガンドの測定方法 | |
JPH0220068B2 (no) | ||
EP0287731A2 (en) | Dry test strips having a red blood cell exclusion layer | |
JP3282129B2 (ja) | 固相非分離酵素分析 | |
CA1301646C (en) | Method for diagnostic immunoassay by solid phase separation | |
CA2143831A1 (en) | Water soluble polymers for use in immunoassays and dna hybridization assays |