NO172051B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive karboksylsyreesterderivater og deglukoteicoplanin - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av derivater

av peptiddelen i det antibiotiske stoff som er betegnet teicoplanin med følgende formel I

hvor R er valgt fra: (C1-<C>12)alkyl, halogen(C1-C12)<a>lky1' (cl"c3 )alkoksy( C^ C^ )-alkyl, f enyl (C^-C^, )alkyl, ( C2~ clo) alkanoyloksymetyl, gruppen hvor R<2> og R<3> sammen med det tilsvarende nitrogenatom representerer morfolino; gruppen med formelen:

hvor m er det hele tallet 2 eller 3, n er et helt tall fra 2

til 10, idet et av hydrogenatomene i en av -CH2~gruppene kan erstattes med en metylgruppe, eller R- betyr en gruppe med formelen:

hvor m er det hele tallet 2 eller 3, n er et helt tall fra 1 til 10, idet ett av hydrogenatomene i en av -CH2-gruppene kan erstattes med en metylgruppe, og farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav. Disse derivatene med formel (I) fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved at man enten a) for fremstilling av en forbindelse med formel (I) hvor R er valgt fra (C4-C12)<a>lkyl, (C^-Cs)alkoksy(C1-C12)alkyl» fenyl (C^-C^) alkyl, halogen( )alkyl, unntatt p-poly-halogen(C4~C^2)alkyl, eller en gruppe med formelen: hvor m er det hele tallet 2 eller 3, n er et helt tall fra 2 til 10, idet ett av hydrogenatomene i en av -CH2-gruppene kan erstattes med en metylgruppe, eller en gruppe med formelen: hvor m er det hele tallet 2 eller 3, n er et helt tall fra 1 til 10 og, idet ett av hydrogenatomene i en av -CH2-gruppene kan erstattes med en metylgruppe; underkaster en r-forbindelse med formelen: hvor R<1> representerer hydrogen eller en aminobeskyttende gruppe, A representerer hydrogen eller en N-[(C^q-)allfatisk acyl]-p<->D-glukosaminylgruppe, B representerer hydrogen eller en N-acetyl-p<->D-glukosaminylgruppe, Z representerer hydrogen eller en a-D-mannosylgruppe, forutsatt at alle sukkergruppene er bundet til peptidkjernen gjennom O-glykosidbindinger, for en regulert forestring ved omsetning derav med et overskudd av en alkohol med formel ROE, hvor R har den ovenfor angitte betydning, i nærvær av en syrekatalysator, fortrinnsvis hydrogenklorid, ved en temperatur mellom 50 og 80°C; eller b) for fremstilling av en forbindelse med formel (I) hvor R har den ovenfor angitte betydning, men unntatt halogenCC^-Ci2)alkyl, omsetter et N-beskyttet deglukoteicoplaninderivat av formel II med en forbindelse med formel RX hvor R har den ovenfor angitte betydning og X representerer et klor-, brom- eller jodatom, i et inert organisk oppløs-ningsmiddel og ved en temperatur fra -5 til 50"C; eller c) for fremstilling av en forbindelse med formel (I) hvor R er halogen(C^-C^2)alkyl eller p<->poly-halogen<C1-C12)alkyl,

omsetter et N-beskyttet deglukoteicoplaninderivat av formel II i et inert organisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis et karbodiimid, med et kondensasjonsmiddel i nærvær av et overskudd av en alkohol med formel ROH hvor R har den ovenfor angitte betydning, ved en temperatur mellom -5°C og romtemperatur;

og, om nødvendig, fjerner en N-beskyttende gruppe og, om ønsket, omdanner en således erholdt forbindelse til et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav.

Den her benyttede betegnelse "alkyl" innbefatter både rette og forgrenede hydrokarbongrupper; mer spesielt representerer "(C1-C12)alkyl" en rett eller forgrenet alifatisk hydro-karbonkjede med 1-12 karbonatomer slik som metyl, etyl, propyl, 1-metyl-etyl, butyl, 1-metylpropyl, 1,1-dimetyletyl,-pentyl, 1-metylbutyl, 2-metylbutyl, 1-heksanyl, 2-heksanyl, 3-heksanyl, 3,3-dimetyl-l-butanyl, 4-metyl-l-pentanyl; 3-metyl-l-pentanyl, 2,2-dimetyl-3-pentanyl, 2,4-dimetyl-3-pentanyl, 4,4-dimetyl-2-pentanyl, 5-metyl-2-heksanyl, 1-heptanyl, 2-heptanyl, 5-metyl-l-heksanyl, 2-etyl-l-heksanyl, 2-metyl-3-heksanyl, 1-oktanyl, 2-oktanyl, 2-cyklopentyl-etanyl, 1-nonanyl, 2-nonanyl, 1-dekanyl, 2-dekanyl og 3-dekanyl, 1-undecyl, 2-dodecyl og lignende, og betegnelsen ("cl~c3)alkoksy" representerer en alkoksygruppe med 1-3 karbonatomer, dvs. metoksy, etoksy, 1-propyloksy og isopro-poksy.

Betegnelsen "halogen(C^-Cj^)alkyl" representerer mono- eller poly-halogenert alkylgruppe med 1-12 karbonatomer, hvor halogenatomet er klor, fluor eller brom. Eksempler på halogen (cl~c12)alkylgrupper er: monokloretyl, dikloretyl, tri-kloretyl, diklorfluoretyl, difluorkloretyl, difluoretyl, trifluoretyl, diklorpropyl, 1,1,1,3,3,3-heksafluor-2-propyl, monokloretyl, difluorbutyl eller trifluorbutyl, og tetra-fluorbutyl og lignende.

Betegnelsen "P-poly-halogen( C$- C±2)alkyl" refererer spesielt til halogen ()alkylderivater som har minst ett halpgenatom i 3-stillingen i alkylkjeden.

Betegnelsene i foreliggende sammenheng "teicoplaninkjerne", "deglukoteicoplanin", "teicoplanin aglykondel", "degluko-teicoplanindel" refererer til heptapeptidresten i det antibiotiske stoff betegnet teicoplanin, og kan representeres ved den ovenfor angitte formel I hvor R og R-^- er hydrogenatomer .

Forbindelsene med formel I har en basisk funksjon som kan danne salter, og derfor kan de omdannes til deres farmasøy-tisk akseptable syreaddisjonssalter ifølge i og for seg kjente metoder.

Representative og egnede syreaddisjonssalter av forbindelsene med formel I innbefatter de salter som er dannet ved standard omsetning med både organiske og uorganiske syrer slik som f.eks. saltsyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, ravsyre, sitronsyre, melkesyre, maleinsyre, fumarsyre, palmitinsyre, kolinsyre, pamoinsyre, slimsyre, glutaminsyre, kamfersyre, glutarsyre, glycolsyre, ftalsyre, vinsyre, laurinsyre, tearinsyre, salicylsyre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre, sorbinsyre, pikrinsyre, benzosyre, kanelsyre og lignende syrer.

Omdannelsen av de frie aminoforbindelsene til de tilsvarende syreaddisjonssalter, og omvendt, dvs. omdannelsen av et syreaddisjonssalt av en forbindelse med formel I til ikke-saltet eller fri aminoform omfattes av oppfinnelsen.

I betraktning av likheten for egenskapene til forbindelsene med formel I og deres salter, så vil det som er angitt i foreliggende sammenheng angående de biologiske aktivitetene til forbindelsene med formel I også gjelde deres farmasøytisk akseptable salter, og vice versa.

Forbindelsene med formel I er nyttige som semi-syntetiske antibakterielle midler. De er derivater av aglukon-kjernen i teicoplaninantibiotika; mer spesielt er forbindelsene med formlen I esterderivater ved karboksyfunksjonen i teicoplanin aglykondelen, (dvs. deglukoteicoplaninestere), N-beskyttet deglukoteicoplanin eller N-beskyttet deglukoteicoplaninestere. Alle disse forbindelsene er i besittelse av anti-mikrobiell aktivitet.

Teicoplanin er det internasjonale ikke-beskyttede navn (INN) for det antibiotiske stoff som tidligere ble betegnet teicomycin som oppnås ved dyrking av stammen Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121 i et kulturmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter (se US patent 4.239.751). Ifølge fremgangsmåten beskrevet i nevnte patent utvinnes et antibiotisk kompleks inneholdende teicomycin A^, A2, og A3 fra den separerte fermenteringsbuljongen ved ekstraksjon med et egnet vannuoppløselig organisk oppløsningsmiddel og utfelling fra det ekstraherende oppløsningsmiddel ifølge vanlige metoder. Teicomycin A2, som er hovedfaktoren i det isolerte antibiotiske kompleks, separeres deretter fra de andre faktorene ved hjelp av kolonnekromatografi på Sephadex®.

GB patentsøknad publ.nr. 2121401 angir at antibiotikum teicomycin A2 er en blanding av fem nær beslektede koprodu-serte hovedkomponenter.

Ifølge nylige strukturelle studier representeres teicoplanin A2 (tidligere Teicomycin A2)-hovedkomponenter 1, 2, 3, 4 og 5 ved den ovenfor angitte formel II hvor R og R^ er hydrogen, A er en N-[(Cio-Cll)alifatisk acyl]-p<->D-glukosaminylgruppe, B er en N-acetyl-P-D-glukosaminylgruppe, og Z er en oc-D-mannosylgruppe. Alle disse sukkerdelene er, når de er til stede, bundet til teicoplaninkjernen gjennom o-glykosidbindinger.

I tillegg er det funnet at det er mulig å omdanne teicoplanin, en ren faktor derav eller en blanding av hvilken som helst av nevnte faktorer i ethvert mengdeforhold, til antibiotiske enhetsprodukter ved hjelp av selektiv hydrolyse av en eller to sukkerdeler. De benevnes antibiotikum L 17054 og antibiotikum L 17046 og er beskrevet i EP-patentsøknader publ.nr. 0119575 og 0119574, respektivt.

Foretrukne hydrolysebetingelser for fremstilling av antibiotikum L 17054 er: Ca. 0,5 N saltsyre ved en temperatur mellom 70 og 90°C og i en tid som vanligvis er mellom 15 og 90 minutter.

Antibiotikum L 17054 er representert ved den ovenfor angitte formel II hvor R og R^ er hydrogenatomer, og A er et hydrogenatom, B er N-acetyl-p<->D-glykosaminyl, og Z er a-D-mannosyl, hvor sukkerdelene er bundet til peptidkjernen gjennom en O-glykosidbinding.

Foretrukne hydrolysebetingelser for fremstilling av antibiotikum L 17046 er: 1-3 N saltsyre, ved en temperatur mellom 50 og 90°C og i et tidsrom som vanligvis er mellom 30 og 60 minutter. Antibiotikum L17046 er representert ved den ovenfor angitte formel II hvor R og R<1> er hydrogenatomer, A og Z hver individuelt representerer en hydrogengruppe, og B er N-acetyl-p<->D-glykosaminyl hvor sukkerdelen er bundet til peptidkjernen gjennom en O-glykosidbinding.

Den fullstendige, selektive spalting av alle sukkerdelene i teicoplaninforbindelsene gir et aglykonmolekyl som er betegnet antibiotikum L 17392, eller deglukoteicoplanin, og er representert ved den ovenfor angitte formel II hvor R og Ri er hydrogenatomer, og A, B og Z hver enkeltvis representerer et hydrogenatom.

Et stoff som har den samme strukturelle formel, er beskrevet i EP patentsøknad publ.nr. 0090578 og er betegnet antibiotikum A 41030 faktor B. Dette stoff oppnås ved hjelp av en mikrobiologisk prosess som innebærer fermentering av stammen Streptomyces virginiae NRRL 12525 eller Streptomyces virginiae NRRL 15156 i et egnet medium, isolering, rensing og separering i dens komponenter inkludert antibiotikum A 41030, et antibiotisk kompleks av minst 7 faktorer, antibiotikum A 41030 faktor B.

Alle de ovenfor navngitte forbindelser, dvs. teicoplanin, en teicoplaninfaktor, en blanding av hvilken som helst av nevnte faktorer i et hvilket som helst mengdeforhold, antibiotikum L 17054, antibiotikum L 17046, og antibiotikum L 17392 er utgangsmaterialer for fremstilling av esterderivatene med formel I. For å lette diskusjonen vil i foreliggende sammenheng hvilket som helst av de ovenfor angitte utgangsmaterialer, dvs. teicoplaninkompleks som oppnådd ifølge US patent 4.239.751, enhver ytterligere rensing derav, en forbindelse med den ovenfor angitte formel II hvor R og R<1> er hydrogen, A representerer hydrogen eller en [(clO~cll)~ alifatisk acyl]<p>D-glukosaminyl, B representerer hydrogen eller en N-acetyl-P-D-glukosaminyl, og Z representerer hydrogen eller a-D-mannosyl, eller enhver blanding derav, i et hvilket som helst mengdeforhold, generelt bli referert til som en "teicoplaninlignende forbindelse" eller et "teicoplaninlignende stoff". Representative og foretrukne eksempler på (<C>iø<->Cll)alifatiske acylgrupper er n-decanoyl-, 8-metyl-nonanoyl-, Z-4-decenoyl-, 8-metyldekanoyl- og 9-metyl-dekanoylgrupper.

Deglukoteicoplaninesterene med formel I fremstilles ved å underkaste et egnet teicoplaninlignende stoff for forestring under regulerte betingelser. Disse forestringsbetingelser avhenger av beskaffenheten av det spesielle teicoplaninlignende stoff som anvendes som utgangsmateriale og, i en viss grad, av den spesielle ester som ønskes.

Generelt er reaksjonsbetingelsene for forestringsmetoden slik at "teicoplaninkjernen" ikke modifiseres, og i det tilfelle substituentene A, B og C i det teicoplaninlignende utgangsmaterialet ikke alle er hydrogenatomer, er reaksjonsbetingelsene for forestringsmetoden slik at alle sukkerdelene i utgangsmaterialet hydrolyseres før hovedreaksjonen er full-ført .

En fagmann vil forstå at "de teicoplaninlignende substratene" har en fri aminfunksjon som kan forstyrre reaksjonsforløpet, og det vil derfor i noen tilfeller være nødvendig å beskytte denne aminfunksjonen før forestringsprosessen starter.

Den N-beskyttende gruppen som kan benyttes i foreliggende fremgangsmåte, er en av de N-beskyttende gruppene som er kjent innen teknikken slik som de som er beskrevet i litteraturen (se f-eks- T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, 1981, side 323-326, og M. Mc. Omie "Protecting Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973), og som kan danne en "binding med aminiogruppene i det teicoplaninlignende derivat, som er stabil ved betingelsene for reaksjonsprosessen, ikke på ugunstig måte forstyrrer hovedforestringsreak-sjonen, og lett kan spaltes og fjernes fra reaksjonsmediene, uten å endre den nylig dannede deglukoteicoplaninesterbindin-gen, ved slutten av reaksjonsprosessen.

Representative eksempler på N-beskyttende grupper som med fordel kan benyttes i foreliggende fremgangsmåte, er karbamatdannende reagenser kjennetegnet ved følgende oksy-karbonylgrupper: 1,1-dimetylpropynyloksykarbonyl, t-butylok-sykarbonyl, vinyloksykarbonyl, allyloksykarbonyl, cinnamyl-oksykarbonyl, 4,5-difenyl-3-oksazolin-2-on, benzyloksykarbonyl, p-nitrobenzyloksykarbonyl, 3,4-dimetoksy-6-nitrobenzyloksykarbonyl, 2,4-diklorbenzyloksykarbonyl, 5-benzisoksazo-lylmetyloksykarbonyl, 9-antrylmetyloksykarbonyl, difenylmet-yloksykarbonyl, isonikotinyloksykarbonyl, S-benzyloksykarbonyl, og lignende.

Andre egnede N-beskyttende grupper er aldehyder eller ketoner eller derivater derav, som kan danne Schiff-baser med aminogruppen i teicoplaninkjernen som skal beskyttes.

Foretrukne eksempler på slike midler som danner Shiff-baser er benzylaldehyder og spesielt foretrukket er 2-hydroksy-benzylaldehyd (salicylaldehyd).

Som en fagmann vil forstå, avhenger det endelige valg av den spesifikke N-beskyttende gruppen av egenskapene til den spesielle ester som er ønsket. Denne ester bør faktisk være stabil ved betingelsene for fjerning av de N-beskyttende gruppene. Siden betingelsene for fjerning av de forskjellige N-beskyttende gruppene er kjent, kan en fagmann velge den riktige beskyttelsesgruppen. F.eks., når en benzylester er ønsket, bør de N-beskyttende gruppene som kan fjernes ved katalytisk hydrogenering, slik som benzyloksykarbonylgruppen, unngås, mens de N-beskyttende grupper som kan fjernes under sure betingelser, slik t.butoksykarbonyl, hensiktsmessig kan benyttes.

Generelle metoder for fremtilling av forbindelsene med formel I innbefatter derfor omsetning av et N-beskyttet- eller friamino-teicoplaninlignende substrat med en alkohol i et surt medium, eller et N-beskyttet deglukoteicoplaninderivat med et alkylhalogenid (fortrinnsvis bromid, klorid eller iodid) samt omsetning av et N-beskyttet deglukoteicoplanin-substrat som har en aktivert karboksylfunksjon med den valgte alkohol. Betegnelsen "aktivert karboksylfunksjon" betyr en derivatisering av karboksyfunksjonen i det teicoplaninlignende ubstrat som gjør denne karboksyfunksjon reaktiv med henblikk på kobling med alkoholen som er reaktiv for dannelse av esterbindingen I forbindelsene med formel I.

Foretrukne "aktiverende midler" for den karboksyliske funksjonen innbefatter karbonyldiimidderivater slik som N,N'-dicykloheksylkarbodiimid, N, N'-diisopropylkarbodiimid o.l., som kan gi et reaktivt mellomprodukt som, p.g.a. dets ustabilitet, vanligvis ikke isoleres, men omsettes in situ med den valgte alkohol for dannelse av den ønskede ester.

Regulerte forestringsmetoder egnet for fremstilling av deglucoteicoplaninesterderivatene med formel I innbefatter mer spesielt forestringsreaksjoner som benytter sure alkoholiske betingelser, enten i nærvær av et N-beskyttet teicoplaninlignende derivat eller fortrinnsvis i nærvær av et fritt teicoplaninlignende derivat; forestringsreaksjoner hvori det teicoplaninlignende substrat bringes sammen med et overskudd av den valgte alkanol, som må være væskeformige ved reaksjonstemperaturen, i nærvær av konsentrert saltsyre, og hvor reaksjonsblandingen holdes under vakuum, og fra tid til annen tilsettes en liten mengde av et oppløsningsmiddel minimum azeotrope blandinger med vann dertil, og den resulterende azeotrop avdestilleres under redusert trykk; forestringsreaksjoner for et N-beskyttet deglucoteicoplaninderivat med et egnet alkoholisk substrat slik som fenol eller substituert fenol i nærvær av et karbodiimid som aktiverende middel for karboksyfunksjonen; og forestringsmetoder hvori et alkalimetall-, sølv- eller blysalt av et N-beskyttet deglucoteicoplaninderivat i et inert organisk oppløsnings-middel omsettes med et halogenid med formel R-X, hvor R har den tidligere angitte betydning, men med unntagelse av halogen alkylgruppene, og X er et klor- eller fortrinnsvis brom- eller iodatom, eventuelt i nærvært av et tertiært amin slik som trietylamin, picolin og lignende.

En generell metode for fremstilling av estere med formel I hvor den alkoholiske rest er en rest av en voluminøs alkohol som er en væske ved reaksjonstemperaturen og svakt vann-oppløselig eller praktisk talt vannuoppløselig, omfatter derfor omsetning av en teicoplaninlignende forbindelse med formel II med en oppløsning av den hensiktsmessige valgte alkohol ROH i nærvær av en mineralsyre, -fortrinnsvis et hydrogenhalogenid. Reaksjonstemperaturen er fortrinnsvis mellom 50 og 80°C. Foretrukne hydrogenhalogenider er hydrogenbromid og hydrogenklorid, idet hydrogenklorid er foretrukket.

Representative eksempler på estere med formel I som kan fremstilles ved denne fremgangsmåten, er angitt i det ovenfor definerte fremgangsmåtealternativ (a). De voluminøse alkoholene som kan anvendes i dette fremgangsmåtealterna-tivet er alkoholderivater med formel ROH hvor R representerer (C4-<C>12)alkyl, (<C>1-C3)alkoksy (C1-<C>12)alkyl, med fire karbonatomer eller mer, halogen (C4-Ci2 )alkyl, fenyl(C-[-C^,)alkyl, polyoksyglykoler eller polyoksyglykolmonoalkyletere som definert ovenfor med unntagelse av (C2-C3)glykoler som definert i det nedenstående. Enhver av de ovenfor angitte teicoplaninlignende forbindelser med formel II, og enhver blanding derav kan benyttes som utgangsmateriale ifølge denne metode.

For fremstilling av estere med formel I hvor alkoholresten er en rest av en alkohol som er en væske ved reaksjonstemperaturen, men med unntagelse av p<->polyhalogen(C4-C^2)alkanoler, (C2~C3)glykoler, dvs. de glykoler med formel ROH hvor R representerer en gruppe med formelen:

H-[0(CH2)m]-n

hvor m er 2 eller 3, og n er 2-10, innbefatter omsetning av forbindelse II med et overskudd av den egnede alkohol med formel ROH, hvor R har den tidligere angitte betydning, med de angitte unntagelser, i nærvær av en syrekatalysator slik som 37 <£> saltsyre. Alkoholen med formel ROH er fortrinnsvis en væske ved reaksjonstemperaturen slik at den også kan virke som reksjonsmedium, uten tilsetning av et annet passende oppløsningsmiddel. Reaksjonen foretas fortrinnsvis under redusert trykk. Reaksjonstemperaturen er mellom 50 og 80°C, når reaksjonstrykket er ca. 20 mm Hg. Når det er nødvendig, blir porsjoner av en blanding av nevnte 3756 saltsyre med den egnede alkoholen tilsatt fra tid til annen for å reintegrere porsjonene av reaksjonsmedium som fordamper. Porsjoner av et egnet inert oppløsningsmiddel som kan danne minimum azeotrop blanding med vann, tilsettes også, og deretter avdestilleres azeotropen som dannes under vakuum.

Representative eksempler på oppløsningsmidler som kan danne minimum azeotrope blandinger med vann er benzen, toluen, butyleter, karbontetraklorid, kloroform, cykloheksan, 2,5-dimetylfuran, heksan, nonan, m-xylen og lignende.

Disse vekselvise utførelser med tilsetning av saltsyre/- alkoholblanding, tilsetning av minimum vann-azeotropdannende inert oppløsningsmiddel og destillasjon av den vandige azeotrop, gjentas flere ganger inntil reaksjonen er fullstendig (dvs. det ønskede esterderivat er fremstilt i akseptable eller optimale utbytter). Representative eksempler på esterderivater med formel I som kan fremstilles ifølge disse metoder er: Deglukoteicoplanin-n-butylester, deglukoteicoplanin-l-metylpropylester, deglukoteicoplanin-1,1-dimetyl-etylester, deglukoteicoplanin-pentylester, deglukoteicoplanin-l-metylbutylester, deglukoteicoplanin-2-metylbutylester, deglukoteicoplanin-l-heksanylester, deglukoteicoplanin-2-heksanylester, deglukoteicoplanin-3-heksanylester, deglukoteicoplanin- 3 , 3-dimetyl-l-butanyles ter ,deglukotei coplanin-4-metyl-l-pentanylester, deglukoteicoplanin-3-metyl-l-pentanylester, deglukoteicoplanin-2,2-dimetyl-3-pentanylester, deglukoteicoplanin-2,4-dimetyl-3-pentanylester, deglukoteicoplanin-4,4-dimetyl-2-pentanylester, deglukoteicoplanin-5-metyl-2-heksanylester, deglukoteicoplanin-l-heptanylester, (jeglucoteicoplanin-2-heptanylester, deglukoteicoplanin-5-metyl-l-heksanylester, deglukoteicoplanin-2-etyl-l-heksanylester, deglukoteicoplanin-2-metyl-3-heksanylester, deglukoteicoplanin-l-oktanylester, deglukoteicoplanin-2-oktanyl-ester, deglukoteicoplanin-2-cyklopentyletanylester, deglukoteicoplanin-l-nonanylester, deglukoteicoplanin-2-nonylester, deglukoteicoplanin-l-dekanylester, deglukoteicoplanin-2-dekanylester og deglukoteicoplanin-3-dekanylester, deglukoteicoplanin-l-undecylester, deglukoteicoplanin-2-dodecyl-ester, deglukoteicoplanin-benzylester, deglukoteicoplanin-m-klorbenzylester, deglukoteicoplanin-o-fluorbenzylester, deglukoteicoplanin-m-fluorbenzylester, deglukoteicoplanin-p-fluorbensylester, deglukoteicoplanin-m-metylbenzylester, deglukoteicoplanin-m-metoksybenzylester, deglukoteicoplanin-o-etoksybenzylester, deglukoteicoplanin-m-butoksybenzylester, deglukoteicoplanin-p-tert.butoksybenzylester, deglukoteicoplanin-p-tert.butylbenzylester, deglukoteicoplanin-fenetyl-ester, deglukoteicoplanin-p-klorfenetylester, deglukoteicoplanin-m-klorfenetylester, deglukoteicoplanin-o-metoksyfenetylester ,deglukoteicoplanin-m-metoksyfenetylester, deglukoteicoplanin-o-propylfenetylester, deglukoteicoplanin-o-etoksyfenetylester, deglukoteicoplanin-p-fluorfenetylester, deglukoteicoplanin-p-bromfenetylster, deglukoteicoplanin-o-propoksyfenetylester deglukoteicoplanin-o-butoksyfenylester, deglukoteicoplanln-l-(p-lsopropylfenyl)etylester, deglukoteicoplanin-3-fenyl-l-propylester, deglukoteicoplanin-2-fenyl-1-propylester, deglukoteicoplanin-4-fenyl-l-butylester, deglukoteicoplanin-3-fenyl-l-butylester, deglukoteicoplanin-2-kloretylester, deglukoteicoplanin-2-brometylester, deglukoteicoplanln-3-klorpropylester, deglukoteicoplanin-3-fluorpro-pylester,deglukoteicoplanin-4-brombutylester, deglukoteicoplanln-4-fluorbutylester, deglukoteicoplanin-5-iodpentyl-ester, deglukoteicoplanin-2-brom-2-metylpropylester, deglukotelcoplanln-3-klor-2-metylpropylester, deglukoteicoplanin-4-klor-3-metylbutylester, og syreaddisjonssaltene derav.

En ytterligere alternativ metode (kfr. metode (b) ovenfor) for fremstilling av forbindelser med formel I, med unntagelse av de hvor R er en halogen(C^-C^2)alkylgruppe, omfatter omsetning av en N-beskyttet deglukoteicoplanin, enten i ikke-saltformen og i nærvær av hydrogenhalogenid-akseptor eller i form av alkalimetall (K, Na, Cs)-, sølv-, og blysaltet, med et halogenidderivat med formel RX hvor R har den ovenfor angitte betydning med unntagelse av halogen (C^-C^)alkyl, og X er klor eller fortrinnsvis brom eller iod, i et inert organisk oppløsningsmiddel. Reaksjonstemperaturen er fra -5 til 50°C, og fortrinnsvis 15-20°C. Det N-beskyttede deglukoteicoplanin-esterderivatet behandles deretter for fjerning av N-beskyttelsesgruppen ifølge teknikkene som omtalt ovenfor, eller på annen kjent måte. Eksempler på egnede inerte organiske oppløsningsmidler er polare aprotiske oppløs-ningmidler slik som dimetylformamid, dimetoksyetan, heksa-metylfosforamid, dimetylsulfoksyd, benzen, toluen og lignende. Eksempler på egnede hydrogenhalogenid-akseptorer er tertiære organiske aminer slik som trietylamin, picolin og lignende, samt uorganiske baser slik som alkalimetallbikarbo-nater, f.eks. natrium- eller kaliumbikarbonat. Representative eksempler på esterderivatene med formel I som kan fremstilles ifølge denne metode er: deglukoteicoplanin-metylester, deglukoteicoplaninetylester, deglukoteicoplanin-propylester, deglukoteicoplanin-l-metyletylester, deglukoteicoplanin-n-metylpropylester, deglukoteicoplanin-1,1 dimet-yletylester, deglukoteicoplaninpentylester, deglukoteicoplanin-l-metylbutylester, deglukoteicoplanin-2-metylbutylester, deglukoteicoplanin-l-heksanylester, deglukoteicoplanin-2-heksanylester, deglukoteicoplanin-3-heksanylester, deglukoteicoplanin-3,3-dimetyl-l-butanylester, deglukoteicoplanin-4-metyl-l-pentanylester; deglukoteicoplanin-3-metyl-l-pentanylester, deglukoteicoplanin-2,2-dimetyl-3-pentanylester, deglukoteicoplanin-2,4-dimetyl-3-pentanylester, deglukoteicoplanin-4,4-dimetyl-2-pentanylester, deglukoteicoplanin-5-metyl-2-heksanylester, deglukoteicoplanin-l-heptanylester, deglukoteicoplanin-2-heptanylester, deglukoteicoplanin-5-metyl-l-heksanylester, deglukoteicoplanin-2-etyl-l-heksanylester, deglukoteicoplanin-2-metyl-3-heksanylester, deglukoteicoplanin-l-oktanylester, deglukoteicoplanin-2-oktanylester, deglukoteicoplanin-2-cyklopentyletanylester, deglukoteicoplanin-l-nonanylester, deglukoteicoplanin-2-nonanylester, deglukoteicoplanin-l-decanylester, deglukoteicoplanin-2-decanyl-ester og deglukoteicoplanin-3-dekanylester, deglukoteicoplanin-l-undecylester, deglukoteicoplanin-2-dodecylester, deglukoteicoplaninbenzylester, deglukoteicoplanin-m-klorbenz-ylester, deglukoteicoplanin-o-fluorobenzylester, deglukoteicoplanin-m-fluorbenzylester, deglukoteicoplanin-p-fluorbenzylester, deglukoteicoplanln-m-metylbenzylester, deglukotel-coplanin-m-metoksybenzylester, deglukoteicoplanin-o-etoksy-benzylester, deglukotelcoplanln-m-butoksybenzylester, deglukotelcoplanln-p.tert.butoksybenzylester, deglukotelcoplanln-p-tert.butylbenzylester, deglukotelcoplaninfenetyl-ester, deglukoteicoplanln-p-klorfenetylester, deglukoteicoplanln-m-klorfenetylester, deglukoteicoplanin-o-metoksyfenetylester , declukoteicoplanln-m-metoksyfenetylester, deglukoteicoplanin-o-propylfenetylester, deglukoteicoplanin-o-etoksyfenetylester, deglukotelcoplanln-p-fluorfenetylester, deglukotelcoplanln-p-bromfenetylester, deglukoteicoplanin-o-propoksyfenetylester, deglukoteicoplanin-o-butoksyfenetyl-ester, deglukoteicoplanin-l-(p-isopropylfenyl)etylester, deglukoteicoplanin-3-fenyl-l-propylester, deglukoteicoplanin-4-fenyl-l-butylester, deglukoteicoplanin-3-fenyl-l-butylester, og syreaddisjonssaltene derav.

En annen metode for fremstilling av forbindelser med formel I omfatter omsetning av et karboksyaktivert N-beskyttet deglukoteicoplaninderivat med en egnet alkohol i et inert oppløsningsmiddel og representeres av fremgangsmåtealternativ (c). Denne metoden er særlig nyttig for fremstilling av forbindelser med formel I hvor R er halogen (C^-C^g) alkyl, p-poly-halogen (C^-C^g) alkyl, og generelt sterisk hindrede grupper som fremstilles med vanskelighet eller i meget lave utbytter med de ovenfor beskrevne prosesser.

Ifølge denne metode oppnås en N-beskyttet deglucoteicoplanin-ester som kan behandles for fjerning av beskyttelsesgruppen ifølge i og for seg kjente teknikker. "Aktiveringstrinnet" for det N-beskyttede deglucoteicoplaninderivatet utføres ifølge i og for seg kjente teknikker som beskrevet ovenfor og som kjent på det tekniske området. Alternativt blir det N-beskyttede deglukoteicoplaninderivatet og den egnede alkoholen oppløst i et inert organisk oppløsningsmiddel, og kondensasjonsmiddelet, oppløst i det samme oppløsnings-middelet, tilsettes dertil. Ihvertfall er reaksjonstemperaturen vanligvis mellom -5°C og romtemperatur, fortrinnsvis mellom 0 og 15-20°C. Inerte organiske oppløsningsmidler er polare, aprotiske oppløsningsmidler som definert ovenfor, mens egnede kondensasjonsmidler er som beskrevet ovenfor i forbindelse med "aktiveringen" av karboksyfunksjonen i deglukoteicoplaninkjernen. Representative eksempler på esterderivater av formel I som kan fremstilles ifølge denne metode er: deglukoteicoplanin-fenylester, deglukoteicoplanin-4-klorfenylester, deglukoteicoplanin-4-bromfenylester, deglukoteicoplanin-4-fluorfenylester, deglukoteicoplanin-3,4-dibromfenylester, deglukoteicoplanin-3,4-difluorfenylester, deglukoteicoplanin-3,4-diklorfenylester, deglukoteicoplanin-3-brom-4-klorfenylester, deglukoteicoplanin-2, 4-diklorfenyl-ester, deglukoteicoplanin-2,4-dibromfenylester, deglukoteicoplanin-2 ,4-dif luorfenylester , deglukoteicoplanin-2,4,6-tribromfenylester, deglukoteicoplanin-2,4,6-triklorfenyl-ester, deglukoteicoplanin-4-metyl-2-klorfenylester, deglukoteicoplanin-4-metyl-2-bromfenylester, deglukoteicoplanin-4-metoksy-2-klorfenylester, deglukoteicoplanin-l-brometylester, deglukoteicoplanin-1,1-dikloretylester, deglukoteicoplanin-1-fluoretylester, deglukoteicoplanin-1,1-difluoretylester, deglukoteicoplanin-l-brom-2-kloretylester, deglukoteicoplanin-1 ,1-diklorpropylester, deglukoteicoplanin-1-klor-1-metyletylester, deglukoteicoplanin-1,l-diklor-2-metylpropyl-ester, deglukoteicoplanin-l-brom-2-metylpropylester, deglukoteicoplanin-1 ,1,1-trifluormetylester, deglukoteicoplanin-1-klormetylester; og syreaddisjonssaltene derav.

Det vil forstås av fagmannen på området at reaksjonstiden i de ovenfor omtalte forestringsmetoder varierer avhengig av de spesifikke reaksjonsbetingelsene og av utgangsmaterialene som benyttes, men siden forbindelsene med formel I samt de teicoplaninlignende utgangsmaterialene lett kan detekteres ved hjelp av TLC- eller HPLC-metoder, er fagmannen også i stand til å overvåke reaksjonsforløpet og bestemme når det er fullført.

Et eksempel på den måte hvorved reaksjonsforløpet kan overvåkes ved hjelp av HPLC er som følger: Prøver på ca. 20 pl trekkes fra reaks jonsblandingen ved bestemte tider, fortynnes til en sluttkonsentrasjon på ca. 2 mg/ml i en blanding av 0,2 % vandig ammoniumformiat/azetonitril, 50:50 (v/v) og injiseres i HPLC-systemet. HPLC-systemet er en kromatograf Varlan 5000 utstyrt med 20 pl sløyfeinjektor Rheodyne 7125; en UV-detektor ved 254 nm og prekolonne pakket med Perisorb RP-8 Merck (30-40 pm) fulgt av en Hibar Merck-kolonne (25 cm) for-pakket med LiCrosorb RP-8 (10 pm). Elueringsmidler: lineær gradient fra 5$ B i A til 60$ i B i A i 30 min., ved en strømningshastighet på ca. 3 ml/min.;

oppløsning A: 0, 2% vandig ammoniumformiat,

oppløsning B: azetonitril.

De relative retensjonstider for noen representative forbindelser med formel I i ovennevnte system er angitt i nedenstående tabell I. Verdiene som er merket med en stjerne, er oppnådd ifølge den ovenfor angitte fremgangsmåte, men ved anvendelse av følgende elueringssystem: oppløsning A: 0,02 M oppløsning NaHgPC^ i vann oppløsning B: azetonitril

Gradient: B# i A

t 0 -5éB 15, t 10 - % B 30, t 20 - % B 60,

t 25 - 5éB 80, t 30 - #B 15

strømningshastighet: 2,0 ml/min.

Det vil forstås av fagmannen på området at forbindelsene med formel I kan fremstilles enten fra et vesentlig rent teicoplaninlignende stoff eller fra et urent teicoplaninlignende stoff.

I det første tilfelle kan det oppnås en forbindelse med formel I som ikke krever ytterligere rensing, mens i det siste tilfelle er det nødvendig med et sluttlig rensetrinn. Når en ytterligere rensing er nødvendig eller ønskelig, kan dette imidlertid foretas i overensstemmelse med vanlige renseteknikker og, spesielt, ved kolonnekromatografi.

En foretrukken rensemetode innebærer bruken av en reversfase-kolonnekromatografi. Et foretrukket adsorpsjonsmiddel i dette tilfelle er den silanerte silisiumdioksydgel som har et område for partikkelfordeling på 0,06-0,2 mm. Eluerings-middelet kan være en av de hydrofile blandingene som benyttes i denne renseteknikk. Representative eksempler på slike hydrofile elueringsmidler er blandingene av fortynnete vandige oppløsninger av ammoniumsalter av organiske syrer, azetonitril eller vannoppløselige lavere alkanoler. Representative eksempler på fortynnede vandige oppløsninger av ammoniumsalter av organiske syrer er vandige 0,1-6$ ammoniumformiatoppløsninger, mens eksempler på egnede alkanoler er metanol, etanol, propanol og lignende. Foretrukne elueringsmidler er en blanding av vandig ammoniumformiat og azetonitril ved en pH-verdi mellom 6 og 8 eller en blanding av vandig ammoniumformiat og metanol. En foretrukket metode innbefatter en første reversfase-kromatografi på silanert silisiumdioksydgel (0,06-0,2 mm), utvikling med en lineær trinn-gradient på 5-60$ acetonitril i 0,2$ vandig ammoniumformiat og en annen kolonnekromatografi som be-nytteren blanding av azetonitril/vann, 6:4 (v/v), som elueringsmiddel.

En annen foretrukken metode innbefatter:

a) Anbringelse av en oppløsning av det urene antibiotikum i 0,2$ vandig ammoniumformiat/metanol/butanol, 1:2:3, i

kontakt med silanert silisiumdioksydgel og stripping av oppløsningsmidlene,

b) anbringelse av resten på toppen av en silanert silisiumdioksydgel (0,06-0,2 mm)-kolonne, utvikling med 0,6$

vandig ammoniumf ormiat og azetonitril, 9:1, kassering av eluatet og fortsettelse av elueringen med en lineær gradient av acetonitril i vann, oppnådd ved blanding av azetonitril/- vann 1:9 og azetonitril/vann 7:3 ved en hastighet på 200 ml/time.

Betegnelsen "vesentlig renfsom benyttet i forbindelse med et antibiotisk stoff heri, refererer til stoffer som har en HPLC-titer større enn 95$ (prosent topparealer, ved den bestemte - 254 nm - UV-bølgelengde), et vann- og oppløsnings-middelinnhold fra 10 til 15$ (beregnet på vekt) og en uorganisk rest mindre enn 0,5$ (beregnet på vekt).

De fysikalsk-kjemiske egenskapene til representative forbindelser (forbindelsene med formel I hvor R har den i nedenstående tabell I angitte betydning) er oppsummert i følgende tabeller I, II, III. Det er også medtatt nyttige mellomprodukter for deres fremstilling hvorved betydningen for R<*> er angitt i tabell I. De sistnevnte gjelder forbindelsene 4, 5, 7, 10, 11, 13, 15, 17 og 19.

Den antibakterielle aktiviteten til forbindelsene med formel I kan demonstreres in vivo ved hjelp av standard agar-for-tynningstester.

Isosensitest-buljong (Oxoid) og Todd-Hewitt-buljong (Difco) benyttes for dyrking av stafylokokker og streptokokker, respektivt. Buljongkulturer fortynnes slik at det endelige inokulum er ca. IO<4> kolonidannende enheter/ml (CFU/ml). Minimal inhiberende konsentrasjon (MIC) anses som den laveste konsentrasjon som ikke viser noen synlig vekst etter 18-24 timers inkubering ved 37°C. Resultatene fra den antibakterielle testting av representative forbindelser med formel I er oppsummert i nedenstående tabell IV. I tillegg til den antimikrobielle aktiviteten mot gram-positive bakterier, har representative forbindelser i foreliggende oppfinnelse en viss grad av aktivitet mot gram-negative bakterier.

I betraktning av det som er angitt ovenfor kan forbindelsene i foreliggende oppfinnelse på effektiv måte benyttes som aktiv bestanddel i antimikrobielle preparater benyttet i human- og veterinærmedisin for hindring og behandling av infeksjonssykdommer forårsaket av patogene bakterier som er mottagelige for nevnte aktive bestanddeler.

Forbindelsene med formel I er generelt effektive ved en daglig dose omfattende mellom 0,5 og 30 mg aktiv bestanddel pr. kilo legemsvekt, fortrinnsvis delt i 2-4 administrasjoner pr. dag. Særlig egnede preparater er de som er fremstilt i form av doseringsenheter inneholdende fra 20 til 300 mg pr. enhet.

Foruten deres aktivitet som legemidler kan forbindelsene med formel I anvendes som vekstfremmende midler for dyr. For dette formål administreres en eller flere av forbindelsene med formel I oralt i et egnet for. Den eksakte konsentrasjon som benyttes, er den som skal til for å gi det aktive middel i en vekstfremmende effektiv mengde når normale mengder for konsumeres. Tilsetningen av de aktive forbindelsene med formel I til dyrefor oppnås fortrinnsvis ved fremstilling av en passende for-forblanding inneholdende de aktive forbindelsene i en effektiv mengde og inkorporering av forblandingen i den fullstendige rasjonen. Alternativt kan et intermediært konsentrat eller forsupplement inneholdende den aktive bestanddel, innblandes i foret. Den måte hvilken slike for-forblandinger og komplette rasjoner kan fremstilles og administreres på, er beskrevet i litteraturen (slik som "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman og Co., S. Francisco, USA, 1969 eller "Livestock Feeds and Feeding", 0. and B. Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977).

Fvsikalsk- kjemiske karakteristika for antibiotikum L17054

Antibiotikum L 17054 har følgende karakteristika:

a) den spesifikke rotasjon [a]])<20> er -34° (c = 1$, DMF)

b) det er fritt oppløselig i vann ved pH > 8,0, i dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, propylenglykol og metyl-cellosolve; tungt oppløselig i metanol; nesten uoppløselig i etyleter og aceton. c) Et ultrafiolett absorpsjonsspektrum som har følgende ab-sorpsj onsmaks ima:

i 0,1 N saltsyre:

Xmaks278 nm (E1^ = 60,6)

i 0,1 N natriumhydroksyd:

Xmaks297 nm (E<1>^ = 118,8)

i fosfatbuffer pH 7,4:

*maks277 nm (E<1>^ = 70,3)

d) et infrarødt absorpsjonsspektrum i nujol med følgende absorpsjonsmaksima (cm-<1>): 3700-2000, 2970-2850 (nujol), 1655, 1610, 1595, 1515, 1490, 1460 (nujol), 1375 (nujol) 1300, 1230, 1145, 1060, 1020, 970. 890, 850, 820, 720 (nujol). e) en elementanalyse, etter at prøven på forhånd har blitt tørket ved ca. 140°C under inert atmosfære (vekttap = 7,8$), som indikerte følgende omtrentlige prosentvise sammensetning (gjennomsnitt): karbon 55,46$; hydrogen 4,50$; nitrogen 7,20$; klor 4,67; aske 0,2$, g) det har følgende Rf-verdier i de nedenfor angitte TLC-systemer:

Visualisering: UV-lys ved 254 nm; 3$ etanolisk ninhydrin;

1$ metanolisk fluorescamin,

g) en retensjonstid (tjj) på 8,3 min. ved analyse med HPLC ved anvendelse av en 150 x 4,0 mm Zorbaks® ODS (5,6-jjm)-kolonne (Zorbax er varemerke til Dupont Co. for en oktadecylsilan-silisiumdioksydgelmatrise), og eluering med en lineær gradient fra 0 til 50$ oppløsning B i oppløsning A i 40 min. (oppløsning Å 25 ni vandig NaHgPO^acetonitril (9:1) bufret ved pH 6,0 med 0,lNaOE; oppløsning B: 25 mM NaH2P04/acetonitril (3:7) bufret ved pH 6,0 med 0,1 N NaOE), med en strømningshastighet på 2 ml/min; (indre standard: 3,5-dihydroksytoluen tjj 5,60 min), h) I-E NMR-spekteret registreres ved 270 MEz med et Bruker WE-270 spektrometer, i DMSO-d^ ved 60°C og med en prøvekon-sentrasjon på 20 mg/ml (indre standard TMS, S = 0,00 ppm).

Noen av lE NMR-dataene oppnådd etter DgO-utvekslingsforsøk og selektive dekoblingseksperimenter er som følger (Sppm, multiplisitet): 1,88, s; 2,85, d; -3,5, dd; 3-4; 4,20, d; 4,48, d; 4,50, d; 4,62, s; 4,96, ddd; 5,18 d; 5,31, s; 5,35, d; 5,39, s; 5,68, d; 5,71, s; 6,20, d; 6,41, s; 6,51, s; 6,56, s; 6,74, d; 6,77, s; 6,80, s; 6,80, d; 6,98, d; 7,08, s; 7,15, d; 7,21, d; 7,28, d; 7,35, d; 7,50, d; 7,56, d; 7,64, d; 7,773, d; 7,86, s; 8,42, d.

i) en potensiometrisk titreringsprofil som viser tre titrer-ingshellinger med pHl/2-verdier lik 5,0 (enekvivalent) 7,9 (en ekvivalent), og 11 (fem ekvivalenter) i metyl-cellosolve/vann 4:1 ved titrering av en oppløsning av testforbindelsen inneholdende et overskudd 0,01N HC1 i metylcellosolve/vann 4:1 med 0,01 N NaOH i den samme oppiøsningsmiddelblanding,

1) en sur funksjon som kan danne salter,

m) en basisk funksjon som kan danne salter,

n) to sukkerrester som er oc-D-mannosyl og N-acetyl-p<->D-glukosaminyl.

Fysikalsk- kjemiske karakteristika for antibiotikum L 17046

Antibiotikum L 17046 har følgende karakteristika:

a) den spesifikke rotasjon ]a§20j) er -44° (c = 1$, DMF)

b) det er fritt oppløselig i vann ved pH > 8,0, i dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, propylenglykol og metylcello-solve; tungt oppløselig i metanol; nesten uoppløselig i n.heksan, etyleter og aceton, c) det har et ultrafiolett absorpsjonsspektrum som viser følgende absorpsjonsmaksima:

i 0,1 N saltsyre:

Xmaks 278 nm (1* =67,1)

i 0,1 N natriumhydroksyd:

xmaks 297 nm (E<1*> = 124,1)

i forfatbuffer pH 7,4:

xmaks277 nm (E<1*> = 75,0)

d) et infrarødt absorpsjonsspektrum i nujol med følgende observerbare absorpsjonsmaksima (cm-<1>): 3700-2000, 2970-2850 (nujol), 1655, 1610, 1595, 1515, 1490, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1145, 1060, 1010, 890, 850, 820, 720 (nujol),

e) en elementanalyse, etter at prøven på forhånd har blitt tørket ved ca. 140°C under inert atmosfære (vekttap lik

8,4$^, som viser følgende omtrentlige prosentvise sammensetning (gjennomsnitt): karbon 56,74$; hydrogen 4,27$; nitrogen 7,99$; klor 5,11$; aske 0,6$,

f) følgende Rf-verdier iTLC-systemene angitt nedenfor:

Visualisering: UV-lys ved 254 mnm; 3$ etanolisk

ninhydrin; 1$ metanolisk fluorescamine;

g) en retensjonstid (tjj) på 10,8 min. ved analyse ved reversfase-HPLC ved anvendelse av en 150 x 4,0 mm Zorbax®

ODS (5-6 >jm)-kolonne (Zorbax er varemerket til Dupont Co. for en oktadecylsilan-silisiumdioksydgelmatrise) og eluering med en lineær gradient fra 0 til 50$ oppløsning B i oppløsning A i 40 minutter (oppløsning A: 25 mM NaH2P04/acetonitrile (9:1) bufret ved pH 6,0 med 0,1 N NaOE, oppløsning B: 25 mM NaH2P04/acetonitril (3:7) bufret ved pH 6,0 med 0,1N NaOH), med en strømningshastighet på 2 ml/min; indre standard: 3,5-dihydroksytoluen tg 5,60 min.) h) % NMR-spekteret registrert ved 270MHz med et Bruker WH-270-spektrometer, i DMSO-d^ ved 60°C og med en prøve-konsentrasjon på 20 mg/ml (indre standard TMS, S = 0,00 ppm).

Noen av ^H NMR-dataene oppnådd etter DgO-utvekslingsforsøk og selektive dekoblingseksperimenter er som følger (S ppm, multiplisitet): 1,87, s; 2,81, d; 3,5, dd; -3-4; 4,12, d; 4,32, d; 4,37, d; 4,56, s; 4,95, ddd; 5,07, s: 5,31, d; 5,39, s; 5,51, s; 5,66, d; 6,12, d; 6,29, s; 6,32, s; 6,37, s; 6,42, s; 6,60, d; 6,62, s; 6,64, d; 6,92, d; 7,09, s; 7,12, d; 7,21, d; 7,25, d; 7,43, d; 7,64, d; 7,66, d; 7,70, d; 7,85, s; 8,12, d; 8,42, d; ~9,5, s.

i) en potensiometrisk titreringsprofil som viser tre titrer-ingshellinger med pHl/2-verdier lik 5,0 {en ekvivalent), 7,0 (en ekvivalent), og 11 (fem ekvivalenter) i metyl-cellosolve/vann 4:1 ved titrering av en oppløsning av testforbindelsen inneholdende et overskudd av 0,01 N HC1 i metylcellosolve/vann 4:1 med 0,01 N NaOH i den samme oppløsningsmiddelblanding,

1) en sur funksjon som kan danne salter,

m) en basisfunksjon som kan danne salter,

n) en sukkerrest som er N-acetyl-p<->D-glukosaminyl.

Fvsikalsk- k. iemiske karakteristika for antibiotikum L 17392

Antibiotikum L 17392 har følgende karakteristika:

a) det er oppløselig i vann ved en pH-verdi over 9 og vandig metanol, etanol og aceton; tungt oppløselig i etylalkohol

og dimetylformamid,

b) et ultrafiolett absorpsjonsmaksimum som viser følgende absorpsjonsmaks ima:

i 0,1 N saltsyre:

Xmaks279 nm (E<1>^ = 82,9)

i 0,1 N natriumhydroksyd:

*maks297 nm (E<1*> = 82,9)

c) et infrarødt absorpsjonsspektrum i nujol med følgende hovedsakelig signifikante absorpsjonsmaksima (cm-<1>):

3250 (v NH og fenolisk vOE)

1645 (amid I)

1610 (v C00~)

1595 (S NH3<+>)

1520 (amid II)

d) 1-H NMR-spekteret registrert ved 270 MHz med et Bruker WH-270 spektrometer, i DMSO-d^ ved 50°C (indre standard TMS, S = 0,00 ppm); noen av ^-H NMR-dataene oppnådd etter DgO-utvekslingsforsøk og selektive dekoblingseksperimenter er som følger (å ppm, multiplisitet): 2,85-3,20. 2dd; 4,12, dd; 4,37, d; 4,45, d; 4,50, s; 5,50, ddd; 5,11, d; 5,14, d; 5,35, d; 5,56, d; 5,60, d; 6,3-7,9, m; 6,55, d; 7,37, d; 7,50, d; 7,61, d; 8,16, d; 8,28, d;8,5-10,2, br;

d = dublett

dd = dubletter i dubletter

ddd = dubletter i dubletter i dubletter s = singlet

m = multiplet

br = bred

e) en elementanalyse som viser følgende omtrentlige prosentvise sammensetning (gjennomsnitt): karbon 58,27$; hydrogen

3,73$; nitrogen 7,86$; klor 6,04$; (etter korreksjon for vekttap, målt ved termisk gravimetrisk analyse - og for uorganisk rest, bestemt etter å ha oppvarmet prøvene til 900°C i oksygenatmosfære,

f) en molekyl vekt på 1199 er også bekreftet ved FAB-MS-analyse, g) formel [beregnet på basis av de tilgjengelige data]: h) en retensjonstid (tg) på 12,2 min. analysert ved HPLC ved bruk av en for-kolonne (5 cm) pakket med Perisorb RP8 (30 pm Merck) fulgt en kolonne Hibar RT250-4 (Merck) for-pakket med LiChrosorb RP8 (10 pm) og eluering med en lineær trinn-gradient varierende fra 10 til 30$ acetonitril i 0,2$ vandig ammoniumformiat; strømningshastighet: 2 ml/min (indre standard: teicoplanin A2 komponent 2 i publisert britisk patentsøknad 2121401, tg = 22,4 min.,

i) en sur funksjon som kan danne salter,

1) en basisk funksjon som kan danne salter,

m) ingen sukkerrest.

Fremstilling av utgangsmaterialene:

a) Fremstilling av antibiotikum L 17054

5 g teicoplanin tilsettes til 60 ml0,5 N vandig saltsyre forvarmet til 80°C under kraftig omrøring. Omrøring fortsettes, og temperaturen holdes ved ca. 80°C i 30 min. Deretter filtreres blandingen hurtig, filtratet avkjøles til 0-5°C og 6N saltsyre (10 ml) tilsettes. Den resulterende suspensjon omrøres i ca. 15 min. mens temperaturen holdes ved 0-5°C. Bunnfallet oppsamles, vaskes med 20 ml kald 1 N HC1 og deretter med etyleter, og tørkes under redusert trykk ved romtemperatur, hvilket resulterer i urent antibiotikum L 17054 hydroklorid (4,5 g).

Urent antibiotikum L 17054 hydroklorid (3 g) som oppnådd ovenfor, suspenderes i en blanding av 0,2$ vandig HCOONH4/CH3CN 95:5 (v/v) (150 ml). pE-verdien bringes til ca. pH 7,5 med 1 N NaOH og produktet oppløses. Den resulterende oppløsning anbringes på en kolonne inneholdende 150 g 0,06-0,2 mm silanert silisiumdioksydgel (Merck) preparert i den samme oppløsningsmiddelblanding. Kolonnen utvikles med en lineær gradienteluering, fra 5 til 21$ acetonitril i 0,2$ vandig ammoniumformiat (v/v), oppsamling av 20 ml fraksjoner som overåkes ved HPLC. L 17054-holdige fraksjoner (70-96) kombineres, og acetonitrilen fjernes under vakuum. Den resterende vandige oppløsning anbringes på en kolonne med 10 g silanert silisiumdioksydgel i destillert vann. Etter vasking med destillert vann inntil saltene er fullstendig fjernet elueres produktet med en 1:1 (v/v) CH3CN:H20-blanding. Den oppsamlede oppløsning konsentreres under vakuum til et lite volum, og antibiotikumet utfelles ved tilsetning av aceton. Etter tørking ved romtemperatur oppnås 0,9 g vesentlig rent antibiotikum L 17054.

b) Fremstilling av antibiotikum L 17046

Teicoplanin (10 g) tilsettes til 1 N saltsyre (150 ml),

forvarmet til 80°C under omrøring.

Etter ca. 45 min. avkjøles reaksjonsblandingen til 0-5°C og 37$ saltsyre (-30 ml) tilsettes. Omrøring opprettholdes i ca. 10 min., hvoretter det utfelte faste stoff utvinnes ved filtrering og vaskes med 20 ml 2 NEC1, deretter med etyleter, og tørkes over natten over kaliumhydroksyd-pellets ved romtemperatur, hvilket resulterer i urent antibiotikum L 17046 hydroklorid (8,3 g).

Nevnte urene produkt (6,2 g) oppløses i 80$ metanol (500 ml) og silisiumdioksydgel (30 g, Merck 0,06-0,2 mm) tilsettes. Etter tilsetningen av N-butanol (200 ml) fjernes oppløsnings-middelet under vakuum. Resten anbringes på en silisiumioksyd-gel-kromatografikolonne (300 g) i acetonitril. Kolonnen utvikles ved i rekkefølge å benytte 300 ml hver av følgende oppløsningsmiddelblandinger: Acetonitril, -acetonitril:vann 95:5, acetonitril: vann 90:10; acetonitril:vann, 85:15. Eluatene kasseres, og kolonnen utvikles med et lineært gradient-elueringsmiddel oppnådd ved blanding av 3,5 liter hver av følgende blandinger: acetonitril:vann, 83:17 og acetonitril:vann, 70:30 ved en hastighet på 375 ml/time.

Fraksjoner på 25 ml hver oppsamles og overvåkes ved HPLC. Fraksjonene som inneholder antibiotikum L 17046, (fraksjoner 170-200) kombineres, n-butanol (400 ml) tilsettes til de kombinerte fraksjonene, og den resulterende blanding konsentreres til et lite volum. Aceton tilsettes deretter til den uklare oppløsningen og, etter avkjøling til 10°C, begynner et bunnfall å dannes. Etter en passende tid er utfellingen fullstendig, og det faste stoffet oppsamles deretter ved filtrering, vaskes med aceton, deretter med eter, tørkes over vakuum ved romtemperatur, og dette gir tittelforbindelsen i vesentlig ren form (1,9 g).

c ) Fremstilling av deglukoteicoplanin

Teicoplanin (10 g) oppløses i 90$ vandig trifluoreddiksyre (250 ml) og oppvarmes til ca. 80°C i ca. 2 timer. Etter avkjøling til romtemperatur helles reaksjonsblandingen i isavkjølt etyleter (1 liter). Det oppnådde bunnfall oppsamles ved filtrering, vaskes med etyleter og tørkes i luft for oppnåelse av det urene trifluoreddiksyre-addisjonssaltet av antibiotikum deglukoteicoplanin (6,3 g).

5,3 g av dette urene materialet oppløses i 1 liter av en blanding av 0,2$ ammoniumformiat/metanol/n-butanol, 1:2:3, og silanert silisiumdioksydgel 60 Merck (0,06-0,2 mm) (20 g) tilsettes dertil. Etter passende omrøring strippes opp-løsnlngsmidlene under vakuum, og resten anbringes på toppen av en kromatografikolonne preparert med 750 g silanert silisiumdioksydgel (0,06-0,2 mm, Merck) i vann. Kolonnen utvikles med en blanding av 0,6$ vandig HCOONH4 og CH3CN, 9:1. Eluatet kasseres, deretter fortsettes elueringen med en lineær gradient av acetonitril i vann fra 1:9- til 3:7 i en hastighet på 200 ml/time i ca. 30 timer. Fraksjoner på 25 ml hver oppsamles og overvåkes ved HPLC. De deglukoteicoplanin-holdige fraksjonene (200-250) oppsamles, og n-butanol tilsettes. Etter omrøring konsentreres blandingen til et lite volum, etyleter tilsettes, og det faste stoffet som utskilles, oppsamles ved filtrering, vaskes med etyleter og tørkes ved 40°C under vakuum, og dette gir 0,5 g av vesentlig rent antibiotikum deglukoteicoplanin.

d) Fremstilling av teicoplanin

Teicoplanin fremstilles ved dyrking av stammen Actinoplanes

teichomyceticus ATCC 31121 som beskrevet i US patent 4.239.751 og renses ved hjelp av Sephadex®-kolonnekromatografi eller en annen ekvivalent renseteknikk.

Følgende eksempler Illustrerer den måte på hvilken oppfinnelsen utføres.

Eksempel 1

Fremstilling av av deglukoteicoplanin- n- butylesterhydroklorid

a) Fra antibiotikum L 17046

Til en omrørt suspensjon av 1,75 g antibiotikum L 17046 i 56

ml n-butanol, tilsettes 4,5 ml butanolisk 6,5 M hydrogenklorid ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen oppvarmes til 60-65°C og omrøres i 12 timer. Den klare oppløsningen som dannes, holdes ved romtemperatur natten over og konsentreres deretter under vakuum til et lite volum (-30 ml). Vann (200 ml) tilsettes, og den resulterende blanding ekstraheres med etylacetat (200 ml). Det organiske laget separeres, butanolisk 1 M hydrogenklorid (1,2 ml) tilsettes, og oppløsningen konsentreres til et lite volum (-gO nil) under vakuum. Ved tilsetning av en blanding av eter/aceton 3:1- (v/v) utskilles et fast stoff som oppsamles, vaskes med eter og tørkes ved 40°C under vakuum i 8 timer, og dette gir 0,93 g antibiotikum deglukoteicoplanin n-butylesterhydroklorid.

Ved i det vesentlige å følge fremgangsmåten i foregående eksempel 1, men ved å benytte teicoplanin, teicoplanin Ag komponent 2, antibiotikum L 17054 eller en hvilken som helst blanding derav istedenfor antibiotikum L 17046 som utgangsmateriale, oppnås den samme forbindelsen i lignende utbytter (fra 0,80 til 1,1 g, ved anvendelse av den samme molare mengde reaktant som i foregående eksempel.

Eksempel 2

Fremstilling av antibiotikum deglukoteicoplanin- n- oktylester-hvdroklorid

a) Fra antibiotikum L 17046

En suspensjon av 0,93 g antibiotikum L 17046 i 180 ml 1 M

oktanolisk hydrogenklorid omrøres ved 70°C i 10 timer. Den klare oppløsningen som dannes, avkjøles til 15°C, 800 ml eter tilsettes, og det faste stoffet som utskilles, oppsamles, vaskes med eter og tørkes under vakuum ved romtemperatur natten over, og dette gir 0,72 g av den urene tittel-esteren, som oppløses i 60 ml av en blanding av CH3OH/H2O 80:20 (v/v). Vann (400 ml) og 1 ml IN EC1 tilsettes til denne oppløsnin-gen, og den resulterende uklare blanding ekstraheres 2 ganger med 400 ml etylacetat. De organiske ekstraktene kombineres, og 1 mil N HC1 i 100 ml n-butanol tilsettes. Oppløsningen konsentreres til et sluttvolum på ca. 80 ml, og 100 ml av en blanding av etylacetat/eter 3:2 (v/v) -tilsettes. Den resulterende uklare oppløsning holdes ved 10°C i 3 dager. Et fast stoff utskilles og oppsamles, vaskes med eter og tørkes under vakuum ved romtemperatur natten over, og dette gir 0,16 g av den i tittelen angitte n-oktylester.

b) Fra antibiotikum deglukoteicoplanin

En suspensjon av 0,7 g deglukoteicoplanin i 40 ml 1 M

oktanolisk hydrogenklorid omrøres ved 65°C i 1 time. Den klare oppløsningen som dannes, opparbeides som beskrevet ovenfor, og dette gir 0,41 g av den i tittelen angitte n-oktylester.

Ved i det vesentlige å følge fremgangsmåten i foregående eksempel 2 a), men ved å benytte teicoplanin, teicoplanin Ag komponent 2, eller antibiotikum L 17054 istedenfor L 17046 som utgangsmateriale, oppnås den samme tittelforbindelsen i lignende utbytter (fra ca. 0,15 til ca. 0,2 g, under anvendelse av den samme molare mengde av reaktant som i det foregående eksempel).

Eksempel 3

A) Fremstilling av antibiotikum deglukoteicoplanin-benzvlesterhvdroklorid

a) Ved behandling av antibiotikum L 17046 med benzylalkohol 1 M hydroklorid

En suspensjon av 18 g vesentlig rent antibiotikum L 17046 i 600 ml 1 M hydrogenklorid i benzylalkohol omrøres ved 60°C. Etter 15 min. dannes en klar oppløsning som omrøres i ytterligere 3 timer ved den samme temperaturen, deretter avkjøles oppløsningen til 15°C, og omrøring fortsettes ved romtemperatur i ytterligere 12 timer. Ved tilsetning av 4 liter av en blanding av n-heksan/eter 4:3 (v/v) utskilles et fast stoff som oppsamles, vaskes med 1 liter-eter og oppløses på nytt i 150 ml metanol. Oppløsningen fortynnes med 1 liter HgO og ekstraheres (pH 2,5) to ganger med 2 liter etylacetat. De organiske lagene kombineres, og en blanding av 10 ml 1 N HC1 i 200 ml n-butanol tilsettes, deretter konsentreres oppløsningen til et lite volum. Ved tilsetning av 1 liter av en blanding av n-heksan/eter 3:2 (v/v) utskilles et fast stof som oppsamles, vaskes med eter og tørkes under vakuum ved 40°C i 8 timer, og dette gir 8,5 g deglukoteicoplanin-benzylesterhydroklorid (analyse deglukoteicoplaninbenzyl-esterhydroklorid 70$, vann og oppløsningsmidler 15$, udefinerte urenheter 15$).

b) Ved behandling av antibiotikum L 17054 med 1 M hydrogenklorid i 90$ vandig benzylalkohol

Til en omrørt suspensjon av 10 g vesentlig rent antibiotikum L 17054 i 90 ml benzylalkohol, tilsettes 10 ml 37$ saltsyre ved 40°C. Reaksjonsblandingen oppvarmes til 70°C og omrøring fortsettes i 30 min, deretter fjernes vann under vakuum (ca. 20 mm Hg) ved 70°C (badtemperatur). Benzen tilsettes, og deretter inndampes blandingen under redusert trykk for å fjerne eventuell vandig rest ved hjelp av azeotrop destillasjon. Deretter fortynnes blandingen med 100 ml 1 M hydrogenklorid i vandig benzylalkohol (fremstilt som angitt ovenfor). Den således oppnådde klare oppløsning omrøres ved 65°C i 6 timer avkjøles deretter til 15°C og opparbeides som beskrevet i foregående eksempel (eksempel 3 b), og dette gir 4,85 g deglukoteicoplanin-benzylesterhydroklorid (analyse: deglukoteicoplanin-benzylesterhydroklorid 75$, vann og oppløsnings-midler 15$, udefinerte urenheter 10$).

c) Ved behandling av teicoplanin med 2 M saltsyre i 80$ vandig benzylalkohol under vakuum og med gjentatte tilsetninger av benzen og 37$ saltsyre

Til en omrørt suspensjon av 10 g vesentlig ren teicoplanin i 80 ml benzylalkohol, tilsettes 20 ml 37$ saltsyre ved 40c. Blandingen holdes under vakuum (ca. 20 mm Hg) i ca. 60 min. under oppvarming til ca. 65°C (badtemperatur), deretter tilsettes 50 ml benzen, og blandingen inndampes under vakuum ved ca. 65°C. Etter 30 min. tilsettes en blanding av 5 ml 37$ saltsyre og 25 ml benzylalkohol til reaksjonsblandingen som deretter utsettes på nytt for anbringelsen under vakuum (ca. 20 mmHg, ca. 65°C) i 30 min. Deretter tilsettes 50 ml benzen, og det foretas inndampning som tidligere beskrevet. Skiftevise tilsetninger av blandinger av 5 ml 37$ saltsyre og 15 ml benzylalkohol og av 50 ml benzen utskilt ved behandlin-gen under vakuum, gjentas hver 30 min. i 8 timer. Deretter tilsettes 20 ml 37$ saltsyre og 100 ml benzen, mens vann og benzen inndampes under vakuum, og den resulterende klare oppløsning omrøres ved romtemperatur og -trykk under argonatmosfaere i 12 timer, og deretter helles reaksj ons-blandingen i 1,5 liter eter. Et fast stoff utskilles, og oppsamles, vaskes med eter og tørkes under vakuum ved romtemperatur natten over, og dette gir 10 g av den i tittelen angitte ester i uren form. Dette produkt oppløses i 150 ml metanol og 300 ml vann og 300 ml etylacetat tilsettes dertil under kraftig omrøring. Etter noen minutter tilsettes ytterligere 300 ml vann, 300 ml etylacetat og en blanding av 300 ml n-butanol/vann 1:2 (v/v). pE-verdien til det vandige laget justeres til 3,5, og den organiske fasen separeres. Den vandige fasen ekstraheres to ganger med etylacetat (600 ml hver gang). De organiske lagene kombineres, vaskes med 400 ml vann og konsentreres til et lite volum under vakuum. Ved tilsetning av eter utskilles et fast stoff som oppsamles, vaskes med eter og tørkes under vakuum ved romtemperatur natten over, og dette gir 6,1 g uren deglukoteicoplanin-benzylesterhydroklorid (analyse: deglukoteicoplanin-benzylesterhydroklorid 75$; vann og oppløsningsmiddel 15$;

udefinerte urenheter 10$).

B) Rensing av deglukoteicoplanin- benzylester ved

silisiumdioksvdgelkolonnekromatografi

Silisiumdioksydgel 60 (0,06-0,2 mm Merck) (10 g) tilsettes til en oppløsning av 2,5 g uren deglukoteicoplanin-benzylester (titer 65$) i 100 ml 90$ vandig metanol. Oppløsnings-middelet inndampes fullstendig under vakuum, og resten anbringes på en kromatografisk kolonne inneholdende 250 g silisiumdioksydgel oppslemmet i acetonitril (CH3CN).

Kolonnen utvikles ved i rekkefølge å benytte følgende oppløsningsmiddelblandinger

Eluatene kasseres, deretter elueres kolonnen med en lineær gradient av acetonitril i vann oppnådd ved blanding av 1,5 liter hver av oppløsningsmiddelblandingene CE3CN/H2O 94:6

(v/v) og CH3CN/H20 70:30 (v/v) i en hastighet på 200 ml/time. Fraksjoner på 25 ml oppsamles og analyeres ved EPLC. Fraksjoner inneholdende deglukoteicoplanin-benzylester kombineres (700 ml), n-butanolisk 0,05 M hydrogenklorid (250 ml) tilsettes dertil, og oppløsningsmidlene inndampes til et sluttvolum på ca. 30 ml. Ved tilsetning av eter (300 ml) utskilles et fast stoff som oppsamles, vaskes med eter og tørkes under vakuum ved 40°C i 48 timer, og dette gir 1,6 g vesentlig rent deglukoteicoplanin-benzylesterhydroklorid.

Ved i det vesentlige å følge fremgangsmåten i det foregående eksempel 3 a), men ved å benytte teicoplanin, teicoplanin Ag komponent 2, deglukoteicoplanin eller antibiotikum L 17054 istedenfor antibiotikum L 17046 som utgangsmateriale, oppnås den samme tilttelforbindelsen i lignende utbytter (ved benyttelse av den samme molare mengde reaktant som i foregående eksempel).

Forbindelsen i tittelen oppnås også ved å starte med et materiale valgt fra teicoplanin Ag komponent- 2, antibiotikum L 17047 eller deglukoteicoplanin og ved vesentlig å følge fremgangsmåten i eksemplene 3b) eller 3 c) i vesentlig samme utbytter som eksemplifisert ovenfor.

Eksempel 4

a) N- benzvloksykarbonyl- deglukoteicoplanin ( N- CBZ- deglukoteicoplanin)

En oppløsning av 0,45 ml benzylklorformiat i 10 ml aceton tilsettes dråpevis til en omrørt oppløsning av 2,5 g deglukoteicoplanin og 0,5 g natriumbikarbonat i 150 ml av blandingen vann/aceton 1:2 (v/v) ved 0-3°C. Etter 30 min. tilsettes 500 ml vann, og den resulterende oppløsning ekstraheres med 500 ml etyleter. Det organiske laget kasseres mens den vandige fasen justeres til pE 3,5 med 1 N EC1 og ekstraheres med 600 ml av blandingen etylacetat/n-butanol 2:1

(v/v). Det organiske laget separeres, vaskes med 200 ml vann og konsentreres deretter til et lite volum under redusert trykk. Ved tilsetning av etyleter utskilles et fast stoff som oppsamles, vaskes med eter og tørkes under vakuum ved 40°C natten over, og dette gir 2,7 g av vesentlig ren n-benzyloksykarbonyldeglukoteicoplanin.

b) N- benzyloksykarbonyldeglukoteicoplanin- pivaloyloksymetylester

Til en omrørt oppløsning av 0,7 g N-benzyloksykarbonyl-deglukoteicoplanin i 20 ml dimetylformamid tilsettes 0,1 ml trietylamin (TEA), 0,1 ml klormetylpivalat og 35 mg natrium-iodid ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen oppvarmes til 45°C i 4 timer, og deretter tilsettes ytterligere 0,1 ml TEA og 0,15 ml klormetylpivalat. Etter å ha holdt denne blanding i ca. 4 timer ved 45°C og natten over ved romtemperatur, tilsettes ytterligere 0,1 ml TEA og 0,1 ml klormetylpivalat. Denne blanding omrøres deretter i ca. 24 timer ved romtemperatur, og deretter tilsettes 400 ml eter under kraftig omrøring. Den oljeaktive forbindelser som utskilles, behandles med 200 ml av blandingen aceton/eter 1:9 (v/v), deretter foretas oppsamling, vasking med eter og tørking natten over under vakuum ved romtemperatur, og dette gir 0,72 g uren n-benzyloksykarbonyldeglukoteicoplanin-pivaloyloksymetylester. Dette produktet er rent nok til å kunne underkastes reaksjon med fjerning av beskyttelsesgruppe. En prøve renses ved silisiumdioksydgel-kolonnekromatografi og eluering med en lineær gradient av metylenklorid/metanol fra 95:5 til 50:50 (v/v), og dens analytiske data er rapportert i

tabellene I-III.

c) Deglukoteicoplanin- pivaloyloksymetylester

i) Til en oppløsning av 1,6 g uren n-benzyloksykarbonyl-deglukoteicoplanin-pivaloyloksymetylester oppnådd ifølge b) ovenfor i 400 ml metanol, tilsettes 1,2 g 5$ palladium på

karbon. Den resulterende suspensjon underkastes hydrolyse ved romtemperatur og omgivelsestrykk. Etter 30 min. er ca. 96 ml hydrogen absorbert. Reaksjonen er fullstendig. Katalysatoren frafUtreres, vaskes med 600 ml av blandingen metanol/0,1 N HC1 8:2 (v/v) og kasseres. Til det kombinerte filtrat tilsettes 400 ml N-butanol, og den resulterende oppløsning konsentreres til et lite volum under redusert rykk. Ved tilsetning av etyleter utskilles et fast stoff som oppsamles, vaskes med eter og tørkes under vakuum ved romtemperatur natten over, hvilket gir 1,33 g uren deglukoteicoplanin-pivaloyloksymetylester.

i i ) Rensing av deglukoteicoplanin- pivalovloksvmetvlester

Produktet oppnådd i 4 c) (i) ovenfor (1,33 g) oppløses i 100 ml av blandingen metanol/acetonitril 15:85 (v/v), og den resulterende oppløsning anbringes på en kolonne med 300 g silisiumdioksydgel 60 Merck (0,06-0,20 mm) i acetonitril. Kolonnen utvikles i rekkefølge med 500 ml hver av følgende oppløsningsmiddelblandinger:CH3CN/CH30E 90:10, 85:15, 80:20, 75:25 70:30 og 65:35 (v/v), mens fraksjoner på 150 ml hver oppsamles i en hastighet på 450 ml/time. De produktholdige fraksjonene (fraksjoner 24-19) kombineres, n.butanolisk 0,05 M hydrogenklorid tilsettes, og oppløsningsmidlene inndampes ved 35°C under vakuum til et sluttvolum på -150 ml. Det faste stoffet som utskilles, oppsamles, vaskes med etyleter og tørkes under vakuum ved romtemperatur natten over, og dette gir 0,44 g vesentlig rent antibiotikum deglukoteicoplanin-pivaloyloksymetylesterhydroklorid.

Eksempel 5

a) N- benzvloksvkarbonvldeglukoteicoplaninetvIester

N-benzyloksykarbonyl-deglukoteicoplanin oppnådd ifølge

eksempel 4 a) (lg) oppløses i dimetylf ormamid (30 ml), og finpulverisert kaliumkarbonat (70 mg) tilsettes dertil.

Blandingen omrøres inntil en oppløsning oppnås, og deretter tilsettes etylbromid (0,2 ml). Blandingen omrøres ved romtemperatur inntil reaksjonen er fullført, og deretter helles reaksjonsblandingen i vann (500 ml), og pH-verdien justeres til ca. 8 med kaliumbikarbonat. Denne blanding ekstraheres med etylacetat (3 x 300 ml), og den organiske fasen kombineres, vaskes med vann og konsentreres til tørrhet under redusert trykk. Resten oppløses i etylacetat (50 ml), og reaksjonsproduktet utfelles ved tilsetning av etyleter. Når utfellingen er fullstendig, utvinnes det faste stoffet ved filtrering og tørkes, hvilket gir 0,8 g N-benzyloksykarbonyldeglukoteicoplaninetylester.

b) Deglukoteicoplaninetylester

N-benzyloksykarbonyldeglukoteicoplaninetylester (544 mg)

oppnådd i 5 a) ovenfor oppløses i etanol (5 ml). Til denne oppløsning tilsettes 5$ palladium på karbon (50 mg). Hydrogen bobles i den omrørte blanding ved omgivelsestrykk og-temperatur. Når reaksjonen er fullstendig, filtreres reaksjonsblandingen, den oppsamlede katalysatoren vaskes med etanol og kasseres, og etyleter (200 ml) tilsettes til den kombinerte etanoliske oppløsning. Et bunnfall dannes, og oppsamles ved filtrering og tørkes i luften, og dette gir 450 mg av et hvitaktig produkt som er deglukoteicoplaninetylester.

Eksempel 6

Fremstilling av deglukoteicoplanin- 4- klorbutvlester

Tørr hydrogenklorid bobles inn i en omrørt suspensjon av 10 g (ca. 5,4 mmol) teicoplanin i 400 ml tørr tetrahydrofuran under opprettholdelse av temperaturen ved 45-50°C. Etter 36 timer konsentreres den resulterende oppløsning til et lite volum under redusert trykk ved 35°C, deretter tilsettes eter, og det faste stoffet som utskilles, oppsamles, vaskes med eter og oppløses på nytt i 1 liter av en blanding av acetonitril:vann 20:80 (v/v). Den resulterende oppløsning anbringes på en kolonne inneholdende 0,6 kg silanert silisiumdioksydgel (0,06-0,2 mm) Merck preparert i 0,2$ vandig ammoniumformiat. Kolonnen utvikles med en lineær gradient fra 30 til 90$ CH3CN i E20 i 20 timer i en hastighet på ca. 300 ml/time, og 20 ml fraksjoner oppsamles. Fraksjonene inneholdende den i tittelen angitte forbindelse, kombineres, n-butanol (v/v) tilsettes, og oppløsningsmidlene inndampes under vakuum ved 45°C. Den faste resten tritureres med eter, blir deretter oppsamles, vasket med eter og tørket i vakuum ved 40°C natten over, og dette gir 3,2 g av tittelforbindelsen i ren form, og som fri base.

Eksempel 7

a) Fremstilling av N- BOC- deglukoteicoplanin

Til en omrørt oppløsning av deglukoteicoplaninhydroklorid

(1,25 g, 1 mmol) i DMF (20 ml) tilsettes 2,4,5-triklor-t-butylkarbonat (340 mg, 1,1 mmol, Janssen) og trietylamin (0,7 ml). Blandingen holdes natten over ved romtemperatur, og deretter tilsettes vann (200 ml) og pH-verdien justeres til pH 2 ved tilsetning av N HC1. Produktet ekstraheres med 150 ml etylacetat:n-butanol 3:1 (v/v). De organiske lagene oppsamles og konsentreres til ca. 40 ml, og deretter tilsettes eter (250 ml). Etter henstand natten over ved 0°C filtreres suspensjonen, det utvunnede produkt vaskes med eter og tørkes i vakuum ved 50°C. Utbytte 1,1 g av den rene tittelforbindelsen.

b) Fremstilling av metvlester av N- BOC- deglukoteicoplanin

Til en omrørt oppløsning av N-BOC-deglukoteicoplanin (500 mg, 0385 mmol) i DMF (10 ml), tilsettes finmalt KHC03 (40 mg) og metyliodid (30 pl). Blandingen omrøres ved romtemperatur inntil reaksjonen er fullstendig (3 timer), deretter tilsettes vann (100 ml), og blandingen ekstraheres 3 ganger med n-butanol (100 ml). De organiske ekstraktene vaskes med vann og konsentreres til 20 ml i vakuum ved 50°C. Reaksjonsproduktet utfelles ved tilsetning av eter (200 ml). Etter henstand natten over ved 0°C oppsamles produktet ved filtrering, vaskes med eter og tørkes i vakuum ved 50°C, og dette gir 320 mg av tittelforbindelsen.

c) Fremstilling av deglukoteicoplanin- metylestertri-fluoracetatsalt

Metylester av N-BOC-deglukoteicoplanin oppnådd i 7 b) ovenfor, omrøres med 2 ml trifluoreddiksyre. Etter 30 min. utfelles produktet ved tilsetning av eter, filtreres, vaskes med eter og tørkes. Utbytte 300 mg av tittelforbindelsen.

Eksempel 8

a) Fremstilling av N- B0C- deglukoteicoplanin- 2-( N-morfolinvl) etvlester

I en kolbe utstyrt med en magnetisk rører og en tørkeventil, oppløses N-BOC-deglukoteicoplanin (430 mg, 0,331 mmol), KEC03 (132,5 mg, 1,32 mmol) og N-(2-kloretyl)morfolinhydroklorid (123,1 mg, 0,662 mmol) suksesivt i DMF (4 ml). Oppløsningen omrøres ved romtemperatur i 50 timer, deretter tilsettes ytterligere 60 mg N-(2-kloretyl)-morfolinhydroklorid og 30 mg KHCO3, idet reaksjonen fortsettes i ytterligere 15 timer. Reaksjonsblandingen fortynnes med vann (30 ml), og ekstraheres med n-butanol (2 x 50 ml). De organiske lagene kombineres og inndampes i vakuum ved 50°C. Resten behandles med 100 ml eter, oppsamles og tørkes i luften, og dette gir 450 mg uren tittelforbindelse som renses ved "flamme-kromatografi" på 100 g silisiumdioksydgel (20-400 mesh, Merck) og eluering med en blanding av CHgClg/MeOH/NHs 37$-80:20:1. Fraksjonene inneholdende det rene produkt kombineres og inndampes i vakuum. Den faste resten behandles med eter, filtreres og tørkes i luften, og dette gir 150 mg av tittelforbindelsen.

b) Fremstilling av deglukoteicoplanin- 2-( N- morfolinyl )-etylester, bis- trifluoracetat

N-B0C-deglukoteicoplanin-2-(N-morfolinyl)etylester (150 mg), fremstilt i 8 a) ovenfor, suspeneres i CHgClg (1 ml) og 1 ml trifluoreddiksyre tilsettes under omrøring. Etter 20 min. fortynnes blandingen med etyleter (60 ml), og etter henstand i 30 min. oppsamles det faste stoffet, vaskes med eter og tørkes i vakuum ved 40°C natten over. Utbytte 150 mg av tittelforbindelsen.

Eksempel 9

a) Fremstilling av N- B0C- deglukoteicoplanin- 2- hydroksy-etylester

N-BOC-deglukoteicoplanin (450 mg, 0,346 mmol) oppløses i 5 ml DMF, KHCO3 (105 mg, 1,05 mmol) og 2-brometanol (430 mg, 346 mmol) tilsettes suksessivt, hvoretter omrøring fortsettes ved romtemperatur natten over. KHCO3 (50 mg) tilsettes igjen, og deretter holdes blandingen ved 50°C i 4 timer. Suspensjonen avkjøles, fortynnes med vann (60 ml) og ekstraheres med n-butanol (2 x 50 ml), deretter kombineres de organiske fasene, vaskes med vann og konsentreres i vakuum ved 50°C. Resten, oppløst i 1 ml med etanol, utfelles ved tilsetning av 100 ml eter. Peroduktet filtreres, vaskes med eter og tørkes i luften, hvilket gir 455 mg uren tittelforbindelse som renses gjennom en "f lammekromatografikolonne" inneholdende 60 g Lichroprep RP-8 (40-63 pm Merck) preparert i HgO/acetonitril 90:10. Kolonnen utvikles med en lineær gradient fra 10 til 40$ av CH3CN ved et trykk på 0,5 atmosfærer, hvorved 15 ml fraksjoner oppsamles. Fraksjoner inneholdende den rene forbindelsen kombineres, tilsettes n-butanol (v/v), og oppløsningsmiddelet inndampes under vakuum ved 50°C. Resten tritureres med eter, filtreres og tørkes i vakuum ved 50°C, og dette gir 190 mg ren tittelforbindelse.

b) Fremstilling av deglukoteicoplanin- 2- hydroksyetyl-estertrifluoracetat

N-B0C-deglukoteicoplanin-2-hydroksyetylester (190 mg), oppnådd som i 9 a) ovenfor, suspenderes i 1 ml CEgClg, og under omrøring tilsettes 1 ml CF3COOH. Etter 10 minutter inndampes oppløsningsmiddelet, og resten tritureres med eter, filtreres, vaskes med eter og tørkes i vakuum ved 50°C natten over. Utbytte 155 mg ren tittelforbindelse.

Eksempel 10

a) Fremstilling av deglukoteicoplanin- N- benzyloksykarbonyl- 2- brometyIester

N-CBZ-deglukoteicoplanin (1,5 g) oppløses i- 50 ml DMF. Til denne oppløsning tilsettes KHCO3 (150 mg) og 1,2-dibrommetan (1 ml), og deretter omrøres blandingen i 25 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen dryppes i 900 ml etyleter, og det faste stoffet som dannes, filtreres, vaskes med eter og tørkes i luften, og dette gir 1,5 g urent materiale. Dette materiale oppløses i en minimum mengde MeOH og fortynnes med etylacetat (500 ml); den organiske oppløsningen vaskes med 5 00 ml vann inneholdende NaHC03 (0,5 g) og NaCl (1,5 g). Den organiske fasen tilsettes noe n-butanol og konsentreres til 10 ml, etyleter tilsettes og det faste stoffet filtreres, vaskes og tørkes under vakuum ved 50°C. Utbytte 1,2 g ren tittelforbindelse.

b) Fremstilling av deglukoteicoplanin- 2- brometylesterhydroklorid

Deglukoteicoplanin-N-benzyloksykarbonyl-2-brommetylester (1

g), fremstilt ifølge 10 a) ovenfor, oppløses i en blanding av N HC1 (30 ml) og MeOE (120 ml). Til denne oppløsning

tilsettes 5$ palladium på BaS04 (1 g). Hydrogen bobles i den omrørte blanding ved omgivelsestrykk og -temperatur. Når hydrogeneringen er fullført (3 timer), filtreres reaksjonsblandingen, den oppsamlede katalysator vaskes med metanol (150 ml) og kasseres, silanert silisiumdioksydgel 60 (10 g, Merck) tilsettes, og blandingen inndampes til tørrhet under vakuum. Den faste resten anbringes på toppen av en kolonne inneholdende 250 g av den samme silisiumdioksydgel, preparert i H2O/CH3CN 75:25, beregnet på volum. Kolonnen utvikles med en lineær gradient fra 25 til 70$ CH3CN i HgO mens 20 ml fraksjoner oppsamles. Fraksjoner inneholdende den rene tittelforbindelsen kombineres, n-butanol(v/v) tilsettes, og oppløsningsmidlene inndampes under vakuum ved 45°C, den faste resten triturerer med eter, oppsamles deretter ved filtrering, vaskes med eter og tørkes i vakuum ved 40°C natten over. Utbytte 100 mg av ren tittelforbindelse.

Eksempel 11

a) Fremstilling av deglukoteicoplanin- N- benzyloksykarbonyl- 2- fluoretylester

Til en oppløsning av N-CBZ-deglukoteicoplanin (1,5 g g, 1 mmol) i 50 ml DMF, tilsettes KHCO3 (150 mg, 1,5 mmol) og 1-brom-2-fluoretan (0,2 ml, 2,68 mmol) suksessivt.

Blandingen omrøres ved romtemperatur i 48 timer og helles deretter i en oppløsning av 600 ml etyleter og 300 ml heksan. Bunnfallet filtreres, vaskes med eter og tørkes i luften, og dette gir 1,75 g urent produkt. Dette oppløses i en minimum-mengde MeOH, og helles i 500 ml etylacetat, deretter vaskes den organiske oppløsning først med 500 ml vann inneholdende NaBC03 (1 g) og NaCl (5 g), deretter med rent vann (200 ml). Den organiske fasen fortynnes med n-butanol (100 ml) og inndampes under vakuum til et sluttvolum på 20 ml. Ved tilsetning av eter utskilles et fast stoff som oppsamles, vaskes med eter og tørkes i luften, og dette gir 1 g halvren forbindelse. Rensingen foretas på en kolonne inneholdende 250 g silanert silisiumdioksydgel 60 (Merck) preparert i CE3CN 35$ i vann. Kolonnen utvikles med 4 liter lineær gradient fra 35 til 55$ av CH3CN i vann under oppsamling av 20 ml fraksjoner. Fraksjoner inneholdende den rene tittelforbindelsen kombineres, n-butanol (v/v) tilsettes, og oppløsnings-midlene inndampes under vakuum ved 45°C. Resten tritureres med eter, filtreres, vaskes og tørkes i vakuum ved 45°C natten over. Utbytte 0,5 g ren tittelforbindelse.

b ) Fremstilling av deglukoteicoplanin- 2- fluoretylester-hvdroklorid

N-benzyloksykarbonyldeglukoteicoplanin-2-fluoretylester (400 mg) oppnådd ifølge 11 a) ovenfor, oppløses i 50 ml (0,1 N HCl/MeOH 3:7 (v/v), og 400 mg 5$ palladium på BaS04 tilsettes. Den resulterende suspensjon underkastes hydrogeno-lyse ved romtemperatur og omgivelsestrykk. Etter 2 timer frafUtreres katalysatoren, vaskes med 50 ml MeOH, og kasseres. De organiske oppløsningsmidlene kombineres, og silanert silisiumdioksydgel 60 (5 g) tilsettes dertil. Etter passende omrøring strippes oppløsningmiddelet under vakuum, og resten anbringes på toppen av en kromatografisk kolonne preparert med 50 g silanert silisiumdioksydgel 60 preparert i CH3CN 50$ i vann ved pH 3. Kolonnen utvikles med 1 liter av en lineær gradient fra 5 til 25$ av CE3CN i vann ved pE 3 (EC1 10$), under oppsamling av 20ml fraksjoner. Fraksjoner inneholdende den rene tittelforbindelsen (36-70) kombineres, n-butanol (v/v) tilsettes, og oppløsningsmidlene inndampes under vakuum ved 45°C. Resten tritureres med eter, blir deretter oppsamlet, vasket og tørket i vakuum ved 40°C natten over, og dette gir 50 g ren tittelforbindelse.

Eksempel 12

Fremstilling av deglukoteicoplanin- 2- brometylesterhydroklorid via " N- sal ievl iden"- beskyttelse

Til en oppløsning av deglukoteicoplanin (3 g, 2 mmol) i 50 ml DMF, tilsettes salicylaldehyd (0,5 ml, 4,7 mmol), og oppløsningen omrøres i 24 timer ved romtemperatur. Blandingen helles i 500 ml eter, og bunnfallet oppsamles og vaskes med eter. Den således oppnådde N-salicylidendeglukoteicoplanin oppløses i 100 ml DMF, KHC03 (300 mg) og 1,2-dibrommetan (2 ml) tilsettes. Blandingen omrøres i 18 timer ved romtemperatur, og helles deretter i en oppløsning av eter (1,5 1) og n-heksan (0,5 1). Det faste stoffet som utfelles, oppsamles ved filtrering, vaskes med eter og oppløses i 50 ml MeOH. Denne oppløsning fortynnes med etylacetat (500 ml) og vaskes med vann (2 x 0,5 1). Den organiske fasen separeres, n-butanol tilsettes, og oppløsningsmidlene inndampes til ca. 30 ml, hvoretter eter tilsettes. Det faste stoffet som utfelles, oppsamles, vaskes med eter og tørkes i luften. Utbytte 3 g uren N-salicylidendeglukoteicoplanin-2-brometylester. Ved rensing av dette produktet på en kolonne inneholdende 300 g silisiumdioksydgel preparert i CHgClg og utvikling med en gradient 1/15$ MeOH i CEClg under oppsamling av 20 ml fraksjoner oppnås først n-salicylidenester og deretter tittelforbindelsen. (Dette produktet viser den samme tg-verdien i EPLC-analyse som forbindelsen fremstilt ifølge eksempel 18).

IR-, NMR- og massedata er i overensstemmelse med strukturen gitt for forbindelsene i de ovenfor angitte eksempler 1-20.

Claims (3)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive karboksylsyreesterderivater av deglukoteicoplanin med den generelle formel: hvor R er valgt fra: ( C1- C12 )alkyl, halogentC-^-C^ )alkyl, ( C^ Cq JalkoksyfC^^-Cig )- alkyl, fenyl)alkyl, (<C>g-C^o) alkanoyloksymetyl, gruppen hvor R<2> og R<3> sammen med det tilstøtende nitrogenatom representerer morfolino; en gruppe med formelen: hvor m er det hele tallet 2 eller 3, n er et helt tall fra 2 til 10, idet et av hydrogenatomene i en av -CHg-gruppene kan erstattes med en metylgruppe, eller R- betyr en gruppe med formelen: hvor m er det hele tallet 2 eller 3, n er et helt tall fra 1 til 10, idet ett av hydrogenatomene i en av -CH2-gruppene kan erstattes med en metylgruppe, og farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav, karakterisert ved at man enten a) for fremstilling av en forbindelse med formel (I) hvor R er valgt fra (C4-C12)alkyl, (C1-C3)alkoksy(Ci-C12)<a>lkyl, fenyl (C^-C^)alkyl, halogen(C4-C^2 )alkyl, unntatt 3-poly-halogen(C4-C^2)alkyl, eller en gruppe med formelen: hvor m er det hele tallet 2 eller 3, n er et helt tall fra 2 til 10, idet ett av hydrogenatomene- i en av -CH2-gruppene kan erstattes med en metylgruppe, eller en gruppe med formelen: hvor m er det hele tallet 2 eller 3, n er et helt tall fra 1 til 10 og, idet ett av hydrogenatomene i en av -CH2-gruppene kan erstattes med en metylgruppe; underkaster en forbindelse med formelen: hvor R<1> representerer hydrogen eller en aminobeskyttende gruppe, A representerer hydrogen eller en N-[(C^q-C-q )alifatisk acyl]-p<->D-glukosaminylgruppe, B representerer hydrogen eller en N-acetyl-p<->D-glukosaminylgruppe, Z representerer hydrogen eller en a-D-mannosylgruppe, forutsatt at alle sukkergruppene er bundet til peptidkjernen gjennom O-glykosidbindinger, for en regulert forestring ved omsetning derav med et overskudd av en alkohol med formel ROH, hvor R har den ovenfor angitte betydning, i nærvær av en syrekatalysator, fortrinnsvis hydrogenklorid, ved en temperatur mellom 50 og 80°C; eller b) for fremstilling av en forbindelse med formel (I) hvor R har den ovenfor angitte betydning, men unntatt halogen(C^-Cigjalkyl, omsetter et N-beskyttet deglukoteicoplaninderivat av formel II med en forbindelse med formel RX hvor R har den ovenfor angitte betydning og X representerer et klor-, brom- eller jodatom, i et inert organisk oppløs-ningsmiddel og ved en temperatur fra -5 til 50"C; eller c) for fremstilling av en forbindelse med formel (I) hvor R er halogen(C^-C^2)<a>lkyl eller p<->poly-halogen{C^-C^g)alkyl, omsetter et N-beskyttet deglukoteicoplaninderivat av formel II i et inert organisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis et karbodiimid, med et kondensasjonsmiddel i nærvær av et overskudd av en alkohol med formel ROH hvor R har den ovenfor angitte betydning, ved en temperatur mellom -5°C og romtemperatur; og, om nødvendig, fjerner en N-beskyttende gruppe og, om ønsket, omdanner en således erholdt forbindelse til et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav la), karakterisert ved at syrekatalysatoren er 37 $ saltsyre, reaksjonen utføres under redusert trykk, den sure alkoholen som inndampes, tilbakeføres, og vannet som er til stede fjernes fra reaksjonsmediet ved hjelp av azeotrop destillasjon med et egnet vandig azeotropdannende inert oppløsnings-middel .

3. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1 b), karakterisert ved at det N-beskyttede deglukoteicoplaninderivatet fortrinnsvis er et alkalimetall, sølv- eller blysalt av en N-beskyttet deglukoteicoplanin.