NO170890B - CHAINED OIGONUCLEOTIDES WITH DEFINED SEQUENCE, RELATIONSHIPS FOR USE AS INTERMEDIATE IN THE PREPARATION OF THE OIGONUCLEOTIDES AND PROCEDURES FOR CHEMICAL SYNTHESE SEAVED WITH A SINGLE OLIGONUCLEOTIDE WITH - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører enkjedede oligonucleotider bestående hovedsakelig av en nøyaktig lik sekvens av ikke mer enn 200 nucleotider og som inneholder én eller flere nucleotidenheter hvor det til basen er festet en linkerarm hvortil det er bundet én eller flere påvisbare markører; idet slike oligonucleotider kan brukes ved identifiseringen, lokaliseringen og påvisningen av interessante, komplementære nucleinsyresekvenser i cellulære eller cellefrie systemer. The present invention relates to single-stranded oligonucleotides consisting mainly of an exactly identical sequence of no more than 200 nucleotides and containing one or more nucleotide units where a linker arm is attached to the base to which one or more detectable markers are attached; since such oligonucleotides can be used in the identification, localization and detection of interesting, complementary nucleic acid sequences in cellular or cell-free systems.

Den enzymatiske fremstilling av merkede, dobbeltkjedede deoxypolynucleotider har vært gjennomført med tidligere kjente teknikker som omfatter inkorporeringen av radioisotoper i dobbeltkjedet DNA ved hjelp av fremgangsmåten ved "nick"-translasjon ifølge P. Rigby et al, J. Mol. Biol. 113; 237-251 (1977), eller den åpnings-igjenfyllende reaksjon beskrevet av G. Bourguignon et al, J. Virol. 20: 290-306 The enzymatic production of labeled double-stranded deoxypolynucleotides has been carried out using previously known techniques which include the incorporation of radioisotopes into double-stranded DNA using the method of "nick" translation according to P. Rigby et al, J. Mol. Biol. 113; 237-251 (1977), or the gap-filling reaction described by G. Bourguignon et al, J. Virol. 20: 290-306

(1976). Nærmere bestemt innføres et innsnitt via DNase og deretter translateres det langs DNA-kjeden ved å bruke en DNA-polymerase. Under fremgangsmåten med nick-translasjonen vil DNA-polymerase fra E. coli (Pol I), i nærvær av tilsatte deoxynucleosid-trifosfater, kondensere nucleotider til 3'-hydroxyl-enden i et enkjedet nick-område i dobbeltkjedet DNA. Samtidig vil enzymet fjerne nucleotider fra 5'-enden i inn-snittet. Dersom ett eller flere av de tilsatte trifosfater (1976). Specifically, a cut is introduced via DNase and then translated along the DNA chain using a DNA polymerase. During the process of nick translation, DNA polymerase from E. coli (Pol I), in the presence of added deoxynucleoside triphosphates, will condense nucleotides to the 3'-hydroxyl end of a single-stranded nick region in double-stranded DNA. At the same time, the enzyme will remove nucleotides from the 5' end of the incision. If one or more of the added triphosphates

32 32

er merket, f.eks. med et - P-fosfat, vil markøren innlemmes i den nye kjede av Pol I. Ved å følge fremgangsmåten med åpnings-igjenfylling kan ender hvor det er dannet en inn-skjæring etter kutting med restriksjons-endonuclease, fylles igjen med Klenow-fragmenter fra DNA-polymerase Pol I eller T4. is marked, e.g. with a - P-phosphate, the marker will be incorporated into the new chain of Pol I. By following the opening-refilling procedure, ends where an incision has formed after restriction endonuclease cutting can be filled again with Klenow fragments from DNA polymerase Pol I or T4.

Både fremgangsmåten med nick-translasjon og fremgangsmåten med åpnings-igjenfylling vil gi dobbeltkjedet, merket DNA. Produktets lengde avhenger av hvor mye DNase I som til-føres reaksjonen. Dette optimaliseres vanligvis slik at 30% av markøren innlemmes og at kjedene er 400 til 800 nucleotidenheter lange. Produktlengden er uforutsigelig heterogen innenfor området 400 til 800 enheter. For å bevare enzym såvel som merket nucleotid merkes vanligvis bare 1^ug DNA Both the nick-translation method and the gap-filling method will yield double-stranded, labeled DNA. The length of the product depends on how much DNase I is added to the reaction. This is usually optimized so that 30% of the marker is incorporated and the chains are 400 to 800 nucleotide units long. The product length is unpredictably heterogeneous within the range of 400 to 800 units. To preserve the enzyme as well as the labeled nucleotide, usually only 1 µg of DNA is labeled

i hvert reaksjonskar. in each reaction vessel.

Dobbeltkjedede polynucleotider som omfatter pyrimidin-baser modifisert av carbonkjeder i C-5-stillingen, er blitt fremstilt enzymatisk på en lignende måte. Dette er blitt gjort ved hjelp av enzymatisk forlengelse av en homopolymer primer-templett slik som rapportert av J. Sagi et al, Biochem. Biophys. Acta., 606; 196-201 (1980), eller ved nick-translasjon/åpnings-igjenfylling med DNA-polymeraser ved å bruke 2<1->deoxyuridin-5<1->trifosfat covalent bundet til biotin slik som rapportert av P. Langer et al, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 78; 6633-6637 (1981), idet biotin er i stand til å virke som et igjenkjenningssted for avidin. Double-stranded polynucleotides comprising pyrimidine bases modified by carbon chains at the C-5 position have been prepared enzymatically in a similar manner. This has been done by enzymatic extension of a homopolymer primer template as reported by J. Sagi et al, Biochem. Biophys. Acta., 606; 196-201 (1980), or by nick-translation/gap-replenishment with DNA polymerases using 2<1->deoxyuridine-5<1->triphosphate covalently bound to biotin as reported by P. Langer et al, Pro. Nat. Acad. Pollock. United States 78; 6633-6637 (1981), in that biotin is capable of acting as a recognition site for avidin.

Enzymatiske fremgangsmåter beskrevet av Rigby et al, Bourguignon et al. og Langer et al., gir produkter med lignende fysiske karakteristika. Slike enzymatisk frem-stilte polynucleotider har en lengde på 400-800 enheter, krever dobbeltkjedede polynucleotider som utgangsstoffer, Enzymatic methods described by Rigby et al, Bourguignon et al. and Langer et al., provide products with similar physical characteristics. Such enzymatically produced polynucleotides have a length of 400-800 units, require double-stranded polynucleotides as starting materials,

gir dobbeltkjedede polynucleotider i alle tilfeller og tillater ikke merking i på forhånd utvalgte steder. gives double-stranded polynucleotides in all cases and does not allow labeling in pre-selected sites.

Dertil modifiserer alle enzymatiske fremgangsmåter begge kjedene i polynucleotidet, og slike produktkjeder kan ikke isoleres fra hverandre. Under slike fremgangsmåter erstatter enzymer enten alle enhetene med modifiserte enheter eller, når de forsynes med en blanding av modifiserte og naturlig forekommende nucleosid-trifosfater, innfører modifiserte enheter tilfeldig. Videre er den enzymatiske fremgangsmåte beskrevet av Langer et al., ikke i stand til å produsere polynucleotider som omfatter slike påvisbare mar-kører som fluorescerende, luminescerende eller antigene påvisbare markører. Ingen av denne type er i stand til å gi oligonucleotider med definert lengde, definert sekvens eller enkjedet karakter, hverken med eller uten påvisbare markører. Ved de tidligere kjente fremgangsmåter kan videre modifiserte baser med påvisbare markører festet til seg, ikke inkorporeres In addition, all enzymatic methods modify both chains in the polynucleotide, and such product chains cannot be isolated from each other. Under such methods, enzymes either replace all of the units with modified units or, when provided with a mixture of modified and naturally occurring nucleoside triphosphates, introduce modified units at random. Furthermore, the enzymatic method described by Langer et al. is unable to produce polynucleotides comprising such detectable markers as fluorescent, luminescent or antigenic detectable markers. None of this type is capable of providing oligonucleotides of defined length, defined sequence or single-chain character, either with or without detectable markers. In the previously known methods, further modified bases with detectable markers attached to them cannot be incorporated

i et polynucleotid i på forhånd utvalgte steder. in a polynucleotide in preselected locations.

Dobbeltkjedede polynucleotider som inkorporerer adeninbaser modifisert i C-8-stillingen, er også blitt fremstilt enzymatisk. Dette er blitt gjort ved å føye 8-aminohexyl-amino-ATP (et ribonucleotid) til DNA-fragmenter, slik som rapportert av C. Vincent et al., Nucl. Acids Res. 10: 6787-6796 (1982). Fremgangsmåten er imidlertid begrenset i omfang idet den bare tillater 3'-endemerking med trifosfater av adeninribonucleotider. Det kan ikke innlemmes noen modifiserte pyrimidinnucleosider. Som med andre enzymatiske fremgangsmåter, merkes videre begge kjeder i et dobbeltkjedet polynucleotid, og det kan ikke fremstilles noen korte (< 100 enheter) oligonucleotider med definert sekvens. Double-stranded polynucleotides incorporating adenine bases modified at the C-8 position have also been prepared enzymatically. This has been done by adding 8-aminohexyl-amino-ATP (a ribonucleotide) to DNA fragments, as reported by C. Vincent et al., Nucl. Acids Res. 10: 6787-6796 (1982). However, the method is limited in scope as it only allows 3'-end labeling with triphosphates of adenine ribonucleotides. No modified pyrimidine nucleosides can be incorporated. As with other enzymatic methods, both chains of a double-stranded polynucleotide are further labeled, and no short (< 100 units) oligonucleotides with defined sequence can be produced.

De tidligere kjente enzymatiske fremgangsmåter henvist til ovenfor, krever den kjemiske syntese av et substituert nucleosid-5'-trifosfat, og fordrer derpå følgende enzymatisk gjenkjenning og innlemmiiig av det ikke-naturlige substrat i dobbeltkjedet DNA hvor det er dannet innsnitt. Slike fremgangsmåter er ute av stand til å gi polynucleotider med hvilken som helst på forhånd utvalgt lengde eller sekvens, The previously known enzymatic methods referred to above require the chemical synthesis of a substituted nucleoside-5'-triphosphate, and then require the following enzymatic recognition and incorporation of the non-natural substrate into double-stranded DNA where incisions have been made. Such methods are unable to provide polynucleotides of any preselected length or sequence,

og polymerasene og DNasene som brukes, er kostbare. Videre er disse fremgangsmåter tidkrevende, ineffektive, fordrer vesentlig enzymatisk aktivitet og er begrenset til dobbeltkjedet DNA. Bare små mengder, dvs. <y>ug, av dårlig definerte polynucleotider, vanligvis restriksjonsfragmenter, fremstilles, og disse må langsommelig isoleres fra naturlige kilder. Videre er omfanget av modifikasjoner som lar seg oppnå i polynucleotidproduktet, alvorlig begrenset ettersom DNA-polymerasen ikke kan gjenkjenne eller innlemme potensielt nyttige påvisbare markører -slik som fluorescein eller dinitrofenyl. and the polymerases and DNases used are expensive. Furthermore, these methods are time-consuming, inefficient, require substantial enzymatic activity and are limited to double-stranded DNA. Only small amounts, i.e. <y>ug, of ill-defined polynucleotides, usually restriction fragments, are produced, and these must be slowly isolated from natural sources. Furthermore, the extent of modifications that can be achieved in the polynucleotide product is severely limited as the DNA polymerase cannot recognize or incorporate potentially useful detectable markers - such as fluorescein or dinitrophenyl.

Binding av et fluorescerende molekyl til 3'-enden i lange polyribonucleotidmolekyler (RNA) for begrenset biologisk anvendelse er beskrevet av J.G.J. Bauman et al., Attachment of a fluorescent molecule to the 3' end of long polyribonucleotide (RNA) molecules for limited biological application is described by J.G.J. Bauman et al.,

J. Histochem. Cytochem. _2j3: 238 (1981) . Denne fremgangsmåte brukte også svært små mengder (^ug kvantiteter) av RNA som var langsommelig isolert fra naturlige kilder ved å bruke enzymatiske metoder, og kan ikke anvendes på DNA ettersom både 2<1-> og 3<1->hydroxylene kreves til dette. Den mye større kjemiske ustabilitet til RNA sammenlignet med DNA gjør også anvendelsesomfanget for polyribonucleotidet fremstilt ved hjelp av denne fremgangsmåte, minimal. J. Histochem. Cytochem. _2j3: 238 (1981). This method also used very small amounts (^ug quantities) of RNA that were slowly isolated from natural sources using enzymatic methods, and cannot be applied to DNA as both the 2<1-> and 3<1->hydroxyls are required for this . The much greater chemical instability of RNA compared to DNA also makes the scope of application for the polyribonucleotide produced by this method minimal.

Den ikke-enzymatiske syntese av oligonucleotider med definert sekvens som omfatter naturlig forekommende nucleinsyrebaser, er blitt rapportert eller blitt gjort rede for av S.A. Narang et al., Meth. Enzymol. 65: 610 (1980), The non-enzymatic synthesis of oligonucleotides of defined sequence comprising naturally occurring nucleic acid bases has been reported or disclosed by S.A. Narang et al., Meth. Enzymol. 65: 610 (1980),

R. Letsinger, J. Org. Chem., 45_: 2715 (1980), M. Matteucci R. Letsinger, J. Org. Chem., 45_: 2715 (1980), M. Matteucci

et al., J. Amer. Chem. Soc. 103: 3185 (1982) og G. Alvarado-Urbina et al., Science, 214: 270 (1981). Slike synteser omfattet vanligvis kjedeutvidelse ved å koble sammen en aktivert nucleotidmonomer og en ende-enhet med fritt hydroxyl i en voksende nucleotidkjede. Sammenkoblingen bevirkes gjennom en fosforholdig gruppe slik som i fosfat-triesterfremgangs-måten redegjort for av Narang et al., eller en av fosfitt-triesterfremgangsmåtene. Blant de sistnevnte brukes ved fremgangsmåten ifølge Letsinger et al. og Alvarado-Urbina et al. fosfokloriditt, og i fremgangsmåten ifølge Matteucci et al., fosfoamiditt. et al., J. Amer. Chem. Soc. 103: 3185 (1982) and G. Alvarado-Urbina et al., Science, 214: 270 (1981). Such syntheses usually involved chain extension by linking an activated nucleotide monomer and a free hydroxyl end unit into a growing nucleotide chain. The connection is effected through a phosphorus-containing group such as in the phosphate-triester method described by Narang et al., or one of the phosphite-triester methods. Among the latter, used in the method according to Letsinger et al. and Alvarado-Urbina et al. phosphochloridite, and in the method according to Matteucci et al., phosphoamidite.

De tidligere nevnte kjemiske synteser av oligonucleotider har bare omfattet ikke-modifiserte eller naturlig forekommende nucleinsyrebaser, og sluttproduktet derav foreligger i korte fragmenter og ligner ikke-modifiserte eller naturlig forekommende RNA eller DNA. Det er også verdt å legge merke til at sluttproduktet i slike synteser ikke omfatter noen påvisbare markører. The previously mentioned chemical syntheses of oligonucleotides have only included unmodified or naturally occurring nucleic acid bases, and the end product thereof exists in short fragments and resembles unmodified or naturally occurring RNA or DNA. It is also worth noting that the final product in such syntheses does not include any detectable markers.

Direkte modifikasjon av homopolymere polynucleotider er blitt rapportert i systemer av polyuridylsyre [Bigge, et al., J. Carb., Nucleosides, Nucleotides 8:259 (1981)]. Den rapporterte fremgangsmåte er begrenset i omfang og gir ikke nyttige produkter. Behandlinger beskrevet, forårsaker ut-strakt polynucleotidspalting og -nedbrytning, resulterer i produkter som er irreversibelt forurenset med metallioner og er i stand til å modifisere bare cytosinrester i et DNA-polynucleotid. Fremgangsmåten er ute av stand til å gi oligonucleotider med bestemt lengde og med definert sekvens, kan ikke modifisere thymin- eller purin-baser og kan ikke modifisere i tidligere utvalgte steder. Direct modification of homopolymeric polynucleotides has been reported in polyuridylic acid systems [Bigge, et al., J. Carb., Nucleosides, Nucleotides 8:259 (1981)]. The reported method is limited in scope and does not provide useful products. Treatments described cause extensive polynucleotide cleavage and degradation, result in products that are irreversibly contaminated with metal ions and are capable of modifying only cytosine residues in a DNA polynucleotide. The method is unable to provide oligonucleotides of specific length and of defined sequence, cannot modify thymine or purine bases and cannot modify in previously selected sites.

Ut fra det ovenfor nevnte, vil det være åpenbart at merkede polynucleotider med definert sekvens hittil bare er blitt fremstilt ved hjelp av enzymatiske fremgangsmåter som har de her understrekede ulemper, særlig de som vedrører tid, kostnad, produktlengde, sekvens og utbytte. Slike metoder er videre virksomme bare på dobbeltkjedede produkter. Slike dobbeltkjedede polynucleotider kan denatureres med alkali eller varme for å forårsake spontan korttidsseparasjon av kjeder i oppløsning. De enkelte enkjedene kan imidlertid ikke isoleres fysisk fra hverandre, og fjerning av de denaturerende betingelser resulterer i hurtig renaturering til dobbeltkjedet form. Ettersom betingelser som fremkaller hybridisering også fremkaller renaturering, resulterer det å utsette det denaturerte polynucleotid for hybridiserings-betingelser i tilbakevending for polynucleotidet til dets opprinnelige dobbeltkjedede konfigurasjon hvor hybridisering av hvilke som helst av kjedene til et mål-polynucleotid er begrenset av konkurranse fra den andre kjede. Based on the above, it will be obvious that labeled polynucleotides with defined sequence have so far only been produced using enzymatic methods which have the disadvantages emphasized here, especially those relating to time, cost, product length, sequence and yield. Furthermore, such methods are only effective on double-chained products. Such double-stranded polynucleotides can be denatured with alkali or heat to cause spontaneous short-term separation of chains in solution. However, the individual single chains cannot be physically isolated from each other, and removal of the denaturing conditions results in rapid renaturation to the double-chain form. Since conditions that induce hybridization also induce renaturation, subjecting the denatured polynucleotide to hybridization conditions results in the return of the polynucleotide to its original double-stranded configuration where hybridization of either strand of a target polynucleotide is limited by competition from the other strand .

Modifisering av nucleosider er blitt foretatt f.eks. i syntesen av antivirale C-5-substituerte pyrimidinnucleosider beskrevet av Bergstrom et al., J. Amer. Chem. Soc. 98;1587-1589 (1976); Ruth et al., J. Org. Chem., 43:2870-2876 (1978) og Bergstrom et al., US patent nr. 4 247 544 og 4 267 171 eller i syntesen av C-8-substituerte adeninderivater beskrevet av Zappelli et al., US patent nr. 4 336 188 og 4 199 498. Disse nucleosider og andre rapportert av Langer et al. og D. Ward, EP-patentsøknad nr. 0063879, kan ikke anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike rapporterte nucleosider er svært reaktive på uønskede steder og ville, dersom de ble brukt i oligonucleotidsyntese ved kjemiske fremgangsmåter, resultere i uønskede biprodukter, ukontrollerbar syntese og ikke noe ønsket produkt. Videre inneholder slike rapporterte nucleosider ikke noen passende steder i substituentgruppen, kan ikke modifiseres ved bindingen av påvisbare markører, de inneholder heller ikke blokkerte, reaktive grupper. Ingen slike nucleosider kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Modification of nucleosides has been carried out e.g. in the synthesis of antiviral C-5-substituted pyrimidine nucleosides described by Bergstrom et al., J. Amer. Chem. Soc. 98;1587-1589 (1976); Ruth et al., J. Org. Chem., 43:2870-2876 (1978) and Bergstrom et al., US Patent Nos. 4,247,544 and 4,267,171 or in the synthesis of C-8-substituted adenine derivatives described by Zappelli et al., US Patent No. 4 336,188 and 4,199,498. These nucleosides and others reported by Langer et al. and D. Ward, EP Patent Application No. 0063879, cannot be used in the method according to the present invention. Such reported nucleosides are highly reactive at undesired sites and, if used in oligonucleotide synthesis by chemical methods, would result in undesired by-products, uncontrollable synthesis and no desired product. Furthermore, such reported nucleosides do not contain any suitable sites in the substituent group, cannot be modified by the binding of detectable labels, nor do they contain blocked, reactive groups. No such nucleosides can be used in the method according to the present invention.

Det er i den tidligere kjente teknikk ikke blitt beskrevet noen kjemisk syntese av oligonucleotider med definert sekvens som omfatter modifiserte baser av noe slag, hverken med eller uten påvisbare markører. No chemical synthesis of oligonucleotides with a defined sequence comprising modified bases of any kind, either with or without detectable markers, has been described in the prior art.

Det foreligger et påtrengende behov for merkede enkjedede oligonucleotider med definert sekvens og av høy kvalitet som ikke omfatter farlige og ustabile radioisotoper, og tilfredsstillelse av dette behov er et hovedformål ved foreliggende oppfinnelse. Dette formål oppnåes ved hjelp av en kjemisk, dvs. ikke-enzymatisk, fremgangsmåte som tilveie-bringer et forutsibart, utmerket produkt i høyt utbytte. Nærmere bestemt gjennomfører fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse den kjemiske innlemming av nucleotider modifisert med en lang rekke utvalgte, påvisbare påvisbare markører i oligonucleotider med definert sekvens, idet slike oligonucleotider er nyttige, f.eks. for identifiseringen, lokaliseringen, isoleringen og/eller kvantifiseringen av interessante komplementære sekvenser. There is an urgent need for labeled single-chain oligonucleotides with a defined sequence and of high quality that do not include dangerous and unstable radioisotopes, and satisfying this need is a main purpose of the present invention. This purpose is achieved by means of a chemical, i.e. non-enzymatic, method which provides a predictable, excellent product in high yield. More specifically, the method according to the present invention carries out the chemical incorporation of nucleotides modified with a wide variety of selected, detectable detectable markers into oligonucleotides of defined sequence, such oligonucleotides being useful, e.g. for the identification, localization, isolation and/or quantification of complementary sequences of interest.

Et annet formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe nye nucleosider som er nyttige i den kjemiske syntese av merkede, enkjedede oligonucleotider med definert sekvens. Another object of the invention is to provide new nucleosides which are useful in the chemical synthesis of labeled, single-stranded oligonucleotides with defined sequence.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse oppnår den de novo kjemiske syntese av merkede oligonucleotider med definert sekvens og er overlegen de tidligere kjente enzymatiske fremgangsmåter i en rekke henseender. Nærmere bestemt muliggjør fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse syntesen av merkede, enkjedede oligonucletider med definert sekvens og med homogen, forutsibar definert lengde med ikke mer enn 200 nucleotider, i motsetning til fremstillingen av heterogene, ikke-forutsibare bestander av 400 til 10.000 baseenheter med dobbeltkjedet karakter fremstilt ved tidligere kjente enzymatiske fremgangsmåter. The method according to the present invention achieves the de novo chemical synthesis of labeled oligonucleotides with defined sequence and is superior to the previously known enzymatic methods in a number of respects. More specifically, the method of the present invention enables the synthesis of labeled, single-stranded oligonucleotides of defined sequence and of homogeneous, predictable defined length of no more than 200 nucleotides, as opposed to the preparation of heterogeneous, non-predictable stocks of 400 to 10,000 base units of double-stranded character produced by previously known enzymatic methods.

Produktutbyttet som fremstilles ved fremgangsmåten The product yield produced by the method

ifølge foreliggende oppfinnelse, er av størrelsesorden flere hundre til flere titusener <y>ug, i motsetning til utbyttet på noen få <y>ug tilveiebragt ved de tidligere kjente enzymatiske fremgangsmåter. Videre er oligonucleotidproduktene ifølge according to the present invention, is of the order of several hundred to several tens of thousands <y>ug, in contrast to the yield of a few <y>ug provided by the previously known enzymatic methods. Furthermore, the oligonucleotide products are according to

foreliggende oppfinnelse enkjedede, istedenfor de dobbeltkjedede produkter av enzymatiske fremgangsmåter. Den én-kjedede konfigurasjon av produkt-oligonucleotidene unngår konkurransen fra en komplementær kjede som følger naturlig med ved rehybridisering av dobbeltkjedede polynucleotider. present invention single-chain, instead of the double-chain products of enzymatic methods. The single-stranded configuration of the product oligonucleotides avoids the competition from a complementary strand that naturally accompanies rehybridization of double-stranded polynucleotides.

Oppfinnelsen omfatter et enkjedet oligonucleotid bestående hovedsakelig av en nøyaktig lik sekvens av ikke mer enn 200 nucleotider, som er kjennetegnet ved at nucleotidene har formelen: The invention comprises a single-stranded oligonucleotide consisting essentially of an exactly identical sequence of no more than 200 nucleotides, which is characterized in that the nucleotides have the formula:

hvor where

B er en pyrimidin- eller purinbase, B is a pyrimidine or purine base,

R er en linkerarm som er bundet til en forbindelse valgt fra gruppen bestående av en blokkerende gruppe, en påvisbar markør og en fast overflate, og R is a linker arm attached to a compound selected from the group consisting of a blocking group, a detectable label and a fixed surface, and

Rt = blokkerende gruppe, og Rt = blocking group, and

R5 = reaktiv fosforholdig gruppe eller R5 = reactive phosphorus-containing group or

= H dersom 5'-OH-gruppen i 5'-endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en reaktiv fosforholdig gruppe eller = H if the 5'-OH group in the 5'-end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a reactive phosphorus-containing group or

R5 = blokkerende gruppe, og R5 = blocking group, and

R4 = reaktiv fosforholdig gruppe eller R4 = reactive phosphorus-containing group or

= H dersom 3<1->OH-gruppen i 3'-endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en reaktiv fosforholdig gruppe, og = H if the 3<1->OH group in the 3'-end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a reactive phosphorus-containing group, and

R8 = H eller blokkert hydroxylgruppe, R8 = H or blocked hydroxyl group,

og at minst ett av nucleotidene har en linkerarm bundet til basen i nucleotidet og hvor linkerarmen videre er bundet til en forbindelse valgt fra gruppen bestående av en reaktiv funksjonell gruppe, en blokkert funksjonell gruppe, en påvisbar markør og en fast overflate. and that at least one of the nucleotides has a linker arm bound to the base in the nucleotide and where the linker arm is further bound to a compound selected from the group consisting of a reactive functional group, a blocked functional group, a detectable marker and a fixed surface.

Oppfinnelsen omfatter videre en forbindelse for anvendelse som mellomprodukt i den kjemiske syntese av et enkjedet oligonucleotid, som er kjennetegnet ved at den har formelen: The invention further comprises a compound for use as an intermediate in the chemical synthesis of a single-chain oligonucleotide, which is characterized by having the formula:

hvor where

B er en pyrimidin eller purinbase, B is a pyrimidine or purine base,

R er en linkerarm som er bundet til en forbindelse valgt fra gruppen bestående av en blokkerende gruppe, en påvisbar markør og en fast overflate, og R is a linker arm attached to a compound selected from the group consisting of a blocking group, a detectable label and a fixed surface, and

R4 = blokkerende gruppe, og R4 = blocking group, and

R5 = reaktiv fosforholdig gruppe eller R5 = reactive phosphorus-containing group or

= H dersom 5'-OH-gruppen i 5'-endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en reaktiv fosforholdig gruppe, eller = H if the 5'-OH group in the 5'-end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a reactive phosphorus-containing group, or

R5 = blokkerende gruppe og R5 = blocking group and

R4 = reaktiv fosforholdig gruppe eller R4 = reactive phosphorus-containing group or

= H dersom 3'-OH-gruppen i 3'-endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en reaktiv fosforholdig gruppe, og = H if the 3'-OH group in the 3'-end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a reactive phosphorus-containing group, and

R8 = H eller blokkert hydroxylgruppe. R8 = H or blocked hydroxyl group.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for kjemisk syntese av et enkjedet oligonucleotid med en påvisbar rest som er kjennetegnet ved at en mellomproduktforbindelse tilsettes til et reaktivt nucleotid eller reaktivt oligonucleotid under reaktive betingelser, hvor mellomproduktforbindelsen har formelen: The invention also includes a method for the chemical synthesis of a single-chain oligonucleotide with a detectable residue which is characterized by the addition of an intermediate compound to a reactive nucleotide or reactive oligonucleotide under reactive conditions, where the intermediate compound has the formula:

hvor B er en pyrimidin- eller purinbase, where B is a pyrimidine or purine base,

R er en linkerarm bundet til en forbindelse valgt fra gruppen bestående av en blokkerende gruppe, en påvisbar markør og en fast overflate, og R is a linker arm attached to a compound selected from the group consisting of a blocking group, a detectable label and a fixed surface, and

R4 = blokkerende gruppe og R4 = blocking group and

R5 = en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, eller = H dersom 5' -OH-gruppen i 5' -endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, eller R5 = er en blokkerende gruppe og R5 = a group containing reactive phosphorus, or = H if the 5' -OH group in the 5' -end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a group containing reactive phosphorus, or R5 = is a blocking group and

R4 = en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, eller H dersom 3' -OH-gruppen i 3' -endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, og R4 = a group containing reactive phosphorus, or H if the 3' -OH group in the 3' end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a group containing reactive phosphorus, and

R8 = H eller blokkert hydroxylgruppe, og R8 = H or blocked hydroxyl group, and

hvor de reaktive betingelser omfatter en temperatur i området fra -20 til 50°C i et tidsrom i området 1 til 60 minutter, where the reactive conditions comprise a temperature in the range from -20 to 50°C for a period of time in the range of 1 to 60 minutes,

den blokkerende gruppe fjernes og deretter tilsettes en påvisbar markør som kan reagere med den ublokkerte linkerarm under reaktive betingelser, hvor de reaktive betingelser omfatter en temperatur i området -20 opp til 50°C i et tidsrom i området 1 til 24 timer. the blocking group is removed and then a detectable marker is added which can react with the unblocked linker arm under reactive conditions, the reactive conditions comprising a temperature in the range of -20 up to 50°C for a period of time in the range of 1 to 24 hours.

Oppfinnelsen omfatter dertil en fremgangsmåte for kjemisk syntese av et enkjedet oligonucleotid med en påvisbar rest som er kjennetegnet ved at en mellomproduktforbindelse tilsettes til et reaktivt nucleotid eller reaktivt oligonucleotid under reaktive betingelser, hvor mellomproduktforbindelsen har formelen: The invention also includes a method for the chemical synthesis of a single-chain oligonucleotide with a detectable residue which is characterized by the fact that an intermediate compound is added to a reactive nucleotide or reactive oligonucleotide under reactive conditions, where the intermediate compound has the formula:

hvor B er en pyrimidin- eller purinbase, where B is a pyrimidine or purine base,

R er en linkerarm bundet til en forbindelse valgt fra gruppen bestående av en blokkerende gruppe, en påvisbar markør og en fast overflate, og R is a linker arm attached to a compound selected from the group consisting of a blocking group, a detectable label and a fixed surface, and

R4 = blokkerende gruppe og R4 = blocking group and

R5 = som inneholder reaktivt fosfor, eller R5 = containing reactive phosphorus, or

H dersom 5' -OH-gruppen i 5' -endenucleotidet H if the 5' -OH group in the 5' end nucleotide

i et voksende oligonucleotid inneholder en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, eller R5 = blokkerende gruppe og in a growing oligonucleotide contains a group containing reactive phosphorus, or R5 = blocking group and

R4 = en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, eller = H dersom 3' -OH-gruppen i 3' -endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en gruppe som inneholder et reaktivt fosfor, og R8 = H eller blokkert hydroxylgruppe, R4 = a group containing reactive phosphorus, or = H if the 3' -OH group in the 3' end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a group containing a reactive phosphorus, and R8 = H or blocked hydroxyl group,

hvor den påvisbare markør ikke forhindrer oligonucleotidsyntese, og wherein the detectable marker does not prevent oligonucleotide synthesis, and

hvor de reaktive betingelser omfatter en temperatur i området -20 opp til 50 °C i et tidsrom i området 1-60 minutter. where the reactive conditions comprise a temperature in the range -20 up to 50 °C for a period of time in the range 1-60 minutes.

Linkerarmene R som er bundet til basene B og The link arms R which are bound to the bases B and

som er i stand til å binde påvisbare markører, kan generelt karakteriseres som de som oppviser nucleofile egenskaper overfor slike markører. Eksempler på slike linkerarmer er de som inneholder primære og aromatiske aminer, carboxylsyrer, hydroxylgrupper og lignende. which are capable of binding detectable labels can generally be characterized as those which exhibit nucleophilic properties towards such labels. Examples of such linker arms are those containing primary and aromatic amines, carboxylic acids, hydroxyl groups and the like.

Basene i nucleotidmonomeren og ende-enheten velges The bases in the nucleotide monomer and end unit are selected

for å gi den på forhånd bestemte sekvens av nucleotid- to provide the predetermined sequence of nucleotide

enheter som er ønsket i sluttprodukt-oligonucleotidet. Slike baser kan utgjøres, av purinene adenin (A), guanin (G) eller hypoxanthin (H), eller av pyrimidinene uracil (U), cyto- units that are desired in the final product oligonucleotide. Such bases can be made up of the purines adenine (A), guanine (G) or hypoxanthine (H), or of the pyrimidines uracil (U), cyto-

sin (C) eller thymin (T). sin (C) or thymine (T).

Et sterisk tolerant sted på en nucleotidenhet kan defineres som en posisjon på nucleinsyrebasen i enheten hvor modifisering av enheten kan bevirkes ved binding av linkerarmen uten å forårsake noen betydelig gjensidig på-virkning med hybridisering av produkt-oligonucleotidet og komplementære nucleinsyrebestanddeler, og uten sterisk å forhindre linkerarmen i å binde én eller flere påvisbare markører. Sterisk tolerante steder finnes i C-8-stillingen i puriner og i C-5-stillingen i pyrimidiner. Ettersom oligonucleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse er særlig anvendbare som hybridiseringssonder, bør ikke modifikasjoner som binder substituenter og/eller påvisbare markører, være på steder på pyrimidin- eller purin-basene som er nødvendige for spesifikk hybridisering. Steder som ikke bør modifiseres, omfatter N"*" og N i adeninbaser, N^, N<2> og 0^ i guaninbaser, A sterically tolerant site on a nucleotide unit can be defined as a position on the nucleic acid base of the unit where modification of the unit can be effected by binding of the linker arm without causing any significant interaction with hybridization of the product oligonucleotide and complementary nucleic acid constituents, and without sterically hindering the linker arm in binding one or more detectable markers. Sterically tolerant sites are found at the C-8 position in purines and at the C-5 position in pyrimidines. As the oligonucleotides according to the present invention are particularly useful as hybridization probes, modifications that bind substituents and/or detectable markers should not be at sites on the pyrimidine or purine bases that are necessary for specific hybridization. Sites that should not be modified include N"*" and N in adenine bases, N^, N<2> and 0^ in guanine bases,

N 3 og N 4 i cytosinbaser. Generelt bør substituering ved N 3 and N 4 in cytosine bases. In general, substitution should by

alle heteroatomer (N eller 0) unngåes. all heteroatoms (N or 0) are avoided.

En påvisbar markør.kan defineres som en kjemisk gruppe som kan være aromatisk og/eller polycyclisk og som har et fysisk eller kjemisk kjennetegn som lett kan måles eller påvises ved passende fysiske eller kjemiske påvisningssys-terner eller -fremgangsmåter. Påvisbare markører som kan anvendes i oligonucleotider ifølge foreliggende oppfinnelse, er lett påvisbare. Lett påvisbarhet kan tilveiebringes ved hjelp av slike kjennetegn som fargeendring, luminescens, fluorescens eller radioaktivitet, eller den kan tilveiebringes ved markørens evne til å tjene som et ligand-gjenkjenningssted. Slike grupper benevnes funksjonelt som koiorimetriske, lumineseerende, fluorescerende, radioaktive eller ligand-gjenkjenningsgrupper. Blant slike grupper er de som egner seg for hurtig påvisning ved hjelp av vanlig kjente påvisningsteknikker, slik som kolorimetrisk, spektrofotometrisk, fluorometrisk eller radioaktiv påvisning, såvel som de som er i stand til å delta i dannelsen av bestemte ligand-ligand-komplekser som inneholder grupper som er påvisbare ved hjelp av slike vanlig kjente påvisningsfremgangsmåter. A detectable marker can be defined as a chemical group which may be aromatic and/or polycyclic and which has a physical or chemical characteristic which can be easily measured or detected by suitable physical or chemical detection systems or methods. Detectable markers that can be used in oligonucleotides according to the present invention are easily detectable. Easy detectability can be provided by such characteristics as color change, luminescence, fluorescence or radioactivity, or it can be provided by the ability of the label to serve as a ligand recognition site. Such groups are functionally referred to as coiorimetric, luminescent, fluorescent, radioactive or ligand recognition groups. Among such groups are those suitable for rapid detection using commonly known detection techniques, such as colorimetric, spectrophotometric, fluorometric or radioactive detection, as well as those capable of participating in the formation of specific ligand-ligand complexes containing groups that are detectable using such commonly known detection methods.

En påvisbar markør kan karakteriseres som en markør som har fysiske, kjemiske eller andre kjennetegn som lett . kan måles eller påvises ved bruk av passende måle- eller påvisningsfremgangsmåter. En påvisbar markør omfatter, A detectable marker can be characterized as a marker that has physical, chemical or other characteristics such as light . can be measured or detected using appropriate measurement or detection procedures. A detectable marker includes,

slik den her er definert, også ligandgjenkjenningsgrupper som er i stand til å initiere én eller flere gjensidige ligand-ligandpåvirkninger som til sist gir et reaksjons-produkt eller et kompleks med fysiske, kjemiske eller andre kjennetegn som lett kan måles eller påvises ved bruk av passende måle- eller påvisningsfremgangsmåter. as defined herein, also ligand recognition groups capable of initiating one or more mutual ligand-ligand interactions that ultimately yield a reaction product or complex with physical, chemical, or other characteristics that can be readily measured or detected using appropriate measurement or detection procedures.

Eksempler på slike målbare eller påvisbare kjennetegn som slike grupper, reaksjonsprodukter eller komplekser kan oppvise eller indusere, er en fargeendring, luminescens, fluorescens eller radioaktivitet. Slike kjennetegn kan måles eller påvises ved bruk av vanlig kjent kolorimetrisk, spektrofotometrisk, fluorometrisk eller radioaktivitetsfølende ins trumentering. Examples of such measurable or detectable characteristics that such groups, reaction products or complexes can exhibit or induce are a color change, luminescence, fluorescence or radioactivity. Such characteristics can be measured or detected using commonly known colorimetric, spectrophotometric, fluorometric or radioactivity-sensing instrumentation.

De gjensidige påvirkninger som med nytte kan initieres av den her definerte^påvisbare markør, omfattende passende spesifikke og selektive gjensidige ligand-ligand-påvirkninger forårsaket av grupper eller komplekser som er lett påvisbare, f.eks. ved kolorimetriske, spektrofotonietriske, fluorometriske eller radioaktive påvisningsfremgangsmåter. Slike gjensidige påvirkninger kan utgjøres av reaksjoner mellom protein og ligand, enzym og substrat, antistoff og antigen, carbo-hydrat og lectin, protein og cofaktor, protein og effektor, nucleinsyre og nucleinsyre eller nucleinsyre og ligand. Eksempler på slike gjensidige påvirkninger mellom ligand og ligand er reaksjonen mellom dinitrofenyl og dinitrofenyl-antistoff, biotin og avidin, oligonucleotid og komplementært oligonucleotid, DNA og DNA, RNA og DNA og NADH og dehydro-genase. Enten den ene eller den andre i hvert slikt ligand-ligandpar kan tjene som en påvisbar markør av ligandgjenkjenningstype. The interactions usefully initiated by the detectable label defined herein include suitably specific and selective ligand-ligand interactions caused by groups or complexes that are readily detectable, e.g. by colorimetric, spectrophotonimetric, fluorometric or radioactive detection methods. Such mutual influences can be constituted by reactions between protein and ligand, enzyme and substrate, antibody and antigen, carbohydrate and lectin, protein and cofactor, protein and effector, nucleic acid and nucleic acid or nucleic acid and ligand. Examples of such mutual influences between ligand and ligand are the reaction between dinitrophenyl and dinitrophenyl antibody, biotin and avidin, oligonucleotide and complementary oligonucleotide, DNA and DNA, RNA and DNA and NADH and dehydrogenase. Either one or the other in each such ligand-ligand pair can serve as a detectable marker of ligand recognition type.

Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan en utvalgt, påvisbar markør eller markører eventuelt bindes til nucleotidmonomeren før sammenkobling av monomeren og ende-enheten i nucleotidkjeden, eller den kan bindes til produkt-oligonucleotidet etter dannelsen av dette. Rekke-følgen av nucleotidenheter i produkt-oligonucleotidet velges på forhånd for å gi et slikt oligonucleotid med nøyaktig spesifisitet for sin endelige anvendelse. Oligonucleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige redskaper i rekombinant DNA og andre fremgangsmåter som omfatter re-hybridiseringsteknikker for nucleinsyre. Blant slike anvendelser er identifisering, lokalisering, isolering og/eller kvantifisering av interessante komplementære sekvenser i cellulære eller cellefrie systemer. Nærmere bestemt kan slike anvendelser omfatte diagnostiske anvendelser eller enhver grunnleggende biologisk hendelse som omfatter hybridisering av nucleinsyrebestanddeler, eller rensning av komplementære sekvenser ved affinitetskromatografering når produkt-oligonucleotidet bindes til en fast bærer gjennom modifiseringer av et sterisk tolerant sted, med eller uten derpå følgende påvisning. In the method according to the present invention, a selected, detectable marker or markers can optionally be bound to the nucleotide monomer before connecting the monomer and the terminal unit in the nucleotide chain, or it can be bound to the product oligonucleotide after its formation. The sequence of nucleotide units in the product oligonucleotide is selected in advance to provide such an oligonucleotide with precise specificity for its final application. The oligonucleotides according to the present invention are useful tools in recombinant DNA and other methods that include nucleic acid re-hybridization techniques. Among such applications are the identification, localization, isolation and/or quantification of complementary sequences of interest in cellular or cell-free systems. More specifically, such applications may include diagnostic applications or any fundamental biological event involving hybridization of nucleic acid constituents, or purification of complementary sequences by affinity chromatography when the product oligonucleotide is bound to a solid support through modifications of a sterically tolerant site, with or without subsequent detection.

Nucleotidenhetene i produkt-oligonucleotidet kan være purin- eller pyrimidin-baserte og kan omfatte enheter med naturlig forekommende baser blandet sammen med enheter med modifiserte baser. Slike enheter kan være ribonucleotider eller deoxyribonucleotider. Sammenkoblingstrinnet omfatter fortrinnsvis sammenkobling av en monomerenhet aktivert i 3'-stillingen med en fri 5'-hydroxylgruppe i ende-enheten til den voksende nucleotidkjede. Eventuelt kan slik sammenkobling omfatte sammenkobling av en monomerenhet aktivert i 5<1->stillingen med en fri 3'-hydroxylgruppe i ende-enheten i nucleotidkjeden. Ende-enheten kan være den første eller den eneste enhet i den voksende nucleotidkjede på tidspunktet for tilkoblingen av nucleotidmonomeren, eller den kan være den terminale av en rekke nucleotidenheter. The nucleotide units in the product oligonucleotide may be purine- or pyrimidine-based and may comprise units with naturally occurring bases mixed together with units with modified bases. Such units can be ribonucleotides or deoxyribonucleotides. The coupling step preferably comprises coupling of a monomer unit activated in the 3' position with a free 5'-hydroxyl group in the terminal unit of the growing nucleotide chain. Optionally, such coupling may comprise coupling of a monomer unit activated in the 5<1->position with a free 3'-hydroxyl group in the end unit of the nucleotide chain. The terminal unit may be the first or only unit in the growing nucleotide chain at the time of attachment of the nucleotide monomer, or it may be the terminal of a series of nucleotide units.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse frem-stiller oligonucleotider med definert sekvens og med den følg-ende generelle formel: The method according to the present invention produces oligonucleotides with a defined sequence and with the following general formula:

hvor n er 1 til 199, fortrinnsvis 5 til 60, og mest foretrukket 10 til 40, R' er hydrogen eller hydroxy og B er en hvilken som helst av de naturlig forekommende purin- eller pyrimidin-baser adenin, guanin, cytosin, uracil eller thymin, idet nucleotidenhetene med naturlig forekommende baser er uavhengig blandet sammen med én eller flere nucleotidenheter med modifiserte baser (B<m>). De modifiserte pyrimidinbaser (Py<m>) er substituerte i C-5-stillingen, og typiske eksempler på disse er uracil- og cytosin-basene illustrert med de følg-ende generelle formler: where n is 1 to 199, preferably 5 to 60, and most preferably 10 to 40, R' is hydrogen or hydroxy and B is any of the naturally occurring purine or pyrimidine bases adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine, the nucleotide units with naturally occurring bases being independently mixed together with one or more nucleotide units with modified bases (B<m>). The modified pyrimidine bases (Py<m>) are substituted in the C-5 position, and typical examples of these are the uracil and cytosine bases illustrated with the following general formulas:

De modifiserte purinbaser (Pu<m>) er substituert i C-8-stillingen, og typiske eksempler på disse er de modifiserte adenin- og guanin-baser illustrert ved de følgende generelle formler: The modified purine bases (Pu<m>) are substituted in the C-8 position, and typical examples of these are the modified adenine and guanine bases illustrated by the following general formulas:

Linkerarmen R er kjennetegnet ved sin evne The link arm R is characterized by its ability

til å binde én eller flere påvisbare markører. I de modifiserte pyrimidinbaser omfatter linkerarmen R to eller flere carbonatomer, mens i de modifiserte purinbaser omfatter R ett eller flere carbonatomer. I denne sammenheng inntar R fortrinnsvis formen av en av de følgende funksjonaliserte carbonkjeder: to bind one or more detectable markers. In the modified pyrimidine bases the linker arm R comprises two or more carbon atoms, while in the modified purine bases R comprises one or more carbon atoms. In this context, R preferably takes the form of one of the following functionalized carbon chains:

hvor R-j^ er hydrogen eller alkyl, R2 er alkyl, alkenyl, aryl eller funksjonalisert alkyl, alkenyl, aryl hvor funksjonelle grupper omfatter ett eller flere aminer, amider, nitriler, carboxylsyrer eller estere, hydroxy, dinitrofenyl, amino- where R-j^ is hydrogen or alkyl, R2 is alkyl, alkenyl, aryl or functionalized alkyl, alkenyl, aryl where functional groups comprise one or more amines, amides, nitriles, carboxylic acids or esters, hydroxy, dinitrophenyl, amino-

benzensulfonater eller lignende, og Z er et flerverdig hetero-atom slik som nitrogen, oxygen eller svovel. I tillegg kan R2 være bundet til en fast bærer eller til én eller flere påvisbare markører som virker f.eks. som en kolorimetrisk, fluorescerende, luminescerende, radioaktiv eller ligand-gjen-kjenningsgruppe. Funksjonelt fluorescerende grupper omfatter fluoresceiner, rhodaminer og lignende eller addukter derav, funksjonelt luminescerende grupper omfatter luminoler, acridiner, luciferiner, dioxetaner, dioxamider og lignende eller addukter derav. Ligand-gjenkjenningsgrupper omfatter vitaminer (slik som biotin eller addukter derav, inkludert iminobiotin og desthiobiotin), antigener slik som dinitro-fenoler, carbohydrater og andre funksjonelle grupper eller addukter av slike grupper som kan gjenkjennes ved hjelp av ligand-lignende reaksjoner med proteiner, eller hvorfra slike ligand-lignende reaksjoner kan utløses. Et annet oligonucleotid som er i stand til å reagere med nucleinsyrer, er illustrerende for en gruppe hvorfra en ligand-lignende reaksjon kan utløses. Ligandgjenkjenningsgrupper kan også tjene som funksjonelle kolorimetriske påvisbare markører når gjenkjenning resulterer i fargedannelse. F.eks. kan det når dinitrofenyl brukes som en påvisbar markør, brukes kjente på-visningssystemer som anvender et antidinitrofenyl-antistoff koblet til peroxydase som et påvisningssystem, noe som resulterer i en fargeendring. Funksjonelle radioaktive grupper omfatter et radioaktivt grunnstoff i den valgte, påvisbare markør. benzene sulphonates or the like, and Z is a polyvalent heteroatom such as nitrogen, oxygen or sulphur. In addition, R2 can be bound to a fixed carrier or to one or more detectable markers that act e.g. as a colorimetric, fluorescent, luminescent, radioactive or ligand recognition group. Functionally fluorescent groups include fluoresceins, rhodamines and the like or adducts thereof, functionally luminescent groups include luminols, acridines, luciferins, dioxetanes, dioxamides and the like or adducts thereof. Ligand recognition groups include vitamins (such as biotin or adducts thereof, including iminobiotin and desthiobiotin), antigens such as dinitrophenols, carbohydrates and other functional groups or adducts of such groups which can be recognized by ligand-like reactions with proteins, or from which such ligand-like reactions can be triggered. Another oligonucleotide capable of reacting with nucleic acids is illustrative of a group from which a ligand-like reaction can be triggered. Ligand recognition moieties can also serve as functional colorimetrically detectable markers when recognition results in color formation. E.g. when dinitrophenyl is used as a detectable marker, known detection systems using an anti-dinitrophenyl antibody coupled to peroxidase as a detection system are used, resulting in a color change. Functional radioactive groups comprise a radioactive element in the selected, detectable marker.

Når det her henvises til bruken av purin- eller pyrimidin-baser, er slike uttrykk ment å omfatte analoger av slike baser. Blant slike analoger er analogene av purin-baser, slik som deazaadenosiner (tubercidiner, formyciner og lignende), og analogene av pyrimidinbaser, slik som deaza-uracil, deazacytosin, azauraciler, azacytosiner og lignende. When reference is made here to the use of purine or pyrimidine bases, such expressions are intended to include analogues of such bases. Among such analogs are the analogs of purine bases, such as deazaadenosines (tubercidins, formycins, and the like), and the analogs of pyrimidine bases, such as deaza-uracil, deazacytosine, azauracils, azacytosines, and the like.

Oligonucleotider med formel I fremstilles best ved kjemisk syntese fra analoge enheter av monomernucleotid med formelen: Oligonucleotides of formula I are best prepared by chemical synthesis from analogous units of monomeric nucleotide of the formula:

hvor R3 er trityl (trifenylmethyl), dimethoxytrityl eller en annen passende blokkerende gruppe for 5'-hydroxyl, where R 3 is trityl (triphenylmethyl), dimethoxytrityl or another suitable blocking group for 5'-hydroxyl,

B og R' er, om nødvendig, blokkerte, og (?) er en fosforholdig gruppe egnet for dannelse av internucleotidbinding under kjedeforlengelse i syntese av et produkt-oligonucleotid. De fosforholdige grupper (<p>) egnet for internucleotidbindings-dannelse, er fortrinnsvis alkylfosfomonokloriditter eller alkylfosfomonoamiditter. Eventuelt kan fosfattriestere anvendes til dette formål. Monomerenheten kan eventuelt ha R^ bundet til 3'-hydroxylgruppen og (<p>) bundet til 5'-hydroxylgruppen. B and R' are, if necessary, blocked, and (?) is a phosphorous group suitable for internucleotide bond formation during chain extension in synthesis of a product oligonucleotide. The phosphorus-containing groups (<p>) suitable for internucleotide bond formation are preferably alkylphosphomonochloridites or alkylphosphomonoamidites. Optionally, phosphate triesters can be used for this purpose. The monomer unit may optionally have R 1 bound to the 3'-hydroxyl group and (<p>) bound to the 5'-hydroxyl group.

Generelt er uttrykket "blokkerende gruppe" et funksjonelt uttrykk som henviser til den kjemiske modifisering eller "blokkering" av en vesentlig funksjonell gruppe ved binding av en andre rest for å skjule den kjemiske reaktivitet til den funksjonelle gruppe og forhindre den fra å reagere på en uønsket måte. Slik modifikasjon er reversibel og tillater derpå følgende omdannelse tilbake til den opprinnelige funksjonelle gruppe ved hjelp av egnet behandling. I mange tilfeller omdanner slik blokkering formelt sett grupper gjensidig, f.eks. blir et primært amin som er blokkert ved acetylering, et substituert amid som senere kan omdannes tilbake til det primære amin ved hjelp av passende hydrolyse. In general, the term "blocking group" is a functional term that refers to the chemical modification or "blocking" of an essential functional group by the attachment of a second residue to hide the chemical reactivity of the functional group and prevent it from reacting to an undesired manner. Such modification is reversible and then allows subsequent conversion back to the original functional group by means of suitable treatment. In many cases, such blocking formally transforms groups mutually, e.g. becomes a primary amine that is blocked by acetylation, a substituted amide that can later be converted back to the primary amine by appropriate hydrolysis.

Forbindelsene med formel I omfatter de akseptable kon-jugatsyresaltene derav. Konjugatsyrer som kan brukes for å fremstille slike salter, er de som inneholder ikke-reaktive kationer, og omfatter f.eks. nitrogenholdige baser slik som ammoniumsalter, mono-, di-, tri- eller tetra-substituerte aminsalter, og lignende, eller egnede metallsalter slik som de av natrium, kalium og lignende. The compounds of formula I include the acceptable conjugate acid salts thereof. Conjugate acids that can be used to prepare such salts are those that contain non-reactive cations, and include e.g. nitrogenous bases such as ammonium salts, mono-, di-, tri- or tetra-substituted amine salts, and the like, or suitable metal salts such as those of sodium, potassium and the like.

Fremgangsmåtetrinnene ifølge foreliggende oppfinnelse skal nå beskrives generelt og illustreres ved hjelp av dia-gram. Deretter vil oppfinnelsen bli illustrert nærmere, og detaljerte eksempler vil bli gitt. Ettersom oppfinnelsen ved-rører oligonucleotider som omfatter både pyrimidinbaserte og purinbaserte nucleotidenheter, vil bruken av både pyrimidin-og purinbaserte forbindelser i syntesefremgangsmåten bli illustrert. De bestemte pyrimidin- og purinbaserte forbindelser som er illustrert, er bare eksempler på de respektive pyrimidin- og purinklasser, og det skal forståes at et hvilket som helst annet medlem av de respektive klasser kan erstatte de nevnte i fremgangsmåten og produkt-oligonucleotidet når det er passende eller ønsket. Mens det for den største delen er vist deoxyribonucleotidforbindelser, skal det forståes at også ribonucleotidforbindelser er omfattet av oppfinnelsen og kan erstatte deoxyribonucleotidforbindelsene når ribonucleotidforbindelser er ønsket i produkt-oligonucleotidet. The procedural steps according to the present invention will now be described in general and illustrated by means of diagrams. Next, the invention will be illustrated in more detail, and detailed examples will be given. As the invention relates to oligonucleotides comprising both pyrimidine-based and purine-based nucleotide units, the use of both pyrimidine- and purine-based compounds in the synthesis method will be illustrated. The particular pyrimidine- and purine-based compounds illustrated are only examples of the respective pyrimidine- and purine-based classes, and it should be understood that any other member of the respective classes may be substituted for those mentioned in the method and product oligonucleotide when appropriate or desired. While for the most part deoxyribonucleotide compounds have been shown, it should be understood that ribonucleotide compounds are also covered by the invention and can replace the deoxyribonucleotide compounds when ribonucleotide compounds are desired in the product oligonucleotide.

En av de viktigste sider ved oppfinnelsen er tilveie-bringelsen av en ny klasse nucleosider som er vesentlige som mellomprodukter i fremgangsmåten for å syntetisere de nye oligonucleotider. Slike nucleosider har hver en base som er modifisert av en substituentgruppe som omfatter en funksjonalisert carbonkjede og ett eller flere amider, idet nitrogenatornet i amidene er bundet til et sterisk tolerant sted på basen gjennom carbonkjeden. I tilfellet med pyrimidin-baserte nucleosider er carbonkjeden bundet til C-5-stillingen, og i tilfellet med de purinbaserte nucleosider er carbonkjeden bundet til C-8-stillingen gjennom et flerverdig hetero-atom, slik som nitrogen, oxygen eller svovel. I tillegg er slike nucleosider kjemisk blokkert i 5<1->stillingen (eller 3'-stillingen) med en gruppe, slik som dimethoxytrityl, som er formålstjenlig for den kjemiske syntese av oligonucleotider. One of the most important aspects of the invention is the provision of a new class of nucleosides which are essential as intermediate products in the process for synthesizing the new oligonucleotides. Such nucleosides each have a base that is modified by a substituent group comprising a functionalized carbon chain and one or more amides, the nitrogen atom in the amides being bound to a sterically tolerant site on the base through the carbon chain. In the case of pyrimidine-based nucleosides, the carbon chain is attached to the C-5 position, and in the case of the purine-based nucleosides, the carbon chain is attached to the C-8 position through a polyvalent heteroatom, such as nitrogen, oxygen or sulfur. In addition, such nucleosides are chemically blocked at the 5<1->position (or 3'-position) with a group, such as dimethoxytrityl, which is useful for the chemical synthesis of oligonucleotides.

I den nye klasse av nucleosider kan linkerarmen være valgt fra -CH„CHR.1C H„ Y, -CH=CR, C H0 Y, -CHR,C H, Y, In the new class of nucleosides, the linker arm can be selected from -CH„CHR.1C H„ Y, -CH=CR, C H0 Y, -CHR,C H, Y,

2 1 n 2n 1 n 2n 1 n 2n ' 2 1 n 2n 1 n 2n 1 n 2n '

og hvor R1 er hydrogen eller C1-6 alkyl, n er 0 - 20 og Y inneholder en blokkert amino- eller blokkert carboxyl- eller blokkert hydroxy-eller blokkert thiogruppe, eller en påvisbar markør eller en fast bærer. Nærmere bestemt kan Y omfatte én eller flere hvor X er hydrogen, fluor eller klor. Syntese av disse nucleosider, så vel som de blokkerte former derav, er beskrevet nedenunder i eksemplene 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12 og 13. Foretrukne nucleosider omfatter substituent- i C-5 i pyrimidinnucleosider hvor n = 3 til 12 og Y er and where R 1 is hydrogen or C 1-6 alkyl, n is 0 - 20 and Y contains a blocked amino or blocked carboxyl or blocked hydroxy or blocked thio group, or a detectable label or a solid support. More specifically, Y may comprise one or more where X is hydrogen, fluorine or chlorine. Synthesis of these nucleosides, as well as the blocked forms thereof, is described below in Examples 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12 and 13. Preferred nucleosides include substituents at C-5 of pyrimidine nucleosides where n = 3 to 12 and Y is

Mest foretrukken er slike Most preferred are such

nucleosider hvor pyrimidinbasen er uracil. nucleosides where the pyrimidine base is uracil.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan starte opp med fremstillingen av det utvalgte nucleosid. Vanligvis fremstilles de mest foretrukne nucleosider best på følgende måte. 5-(methyl-3-acrylyl)-2<1->deoxyuridin fremstilles fra 2'-deoxyuridin ved fremgangsmåten ifølge Bergstrom og Ruth [J. Amer. Chem. Soc., 9j>:1587 (1976)]. Nucleosidet behandles så med 1,05 ekvivalenter dimethoxytritylklorid i pyridin i 4 timer for å blokkere 5'-hydroxyl med dimethoxytrityl (DMT). Det oppnådde produkt renses ved hjelp av kromatografering på siliciumdioxydgel hvor det elueres med en gradient på 0-10% methanol i kloroform som inneholder 2% triethylamin. Det rensede 5<1->DMT-5-(methyl-3-acrylyl)-2<1->deoxyuridin behandles med IN KOH i 24 timer ved omgivelsestemperatur for å hydrolysere methylesteren. Det resulterende 5'-DMT-5-(3-acrylyl)-2'-deoxyuridin behandles med overskudd av dicyclohexylcarbodiimid og hydroxybenztriazol i pyridin. Etter 4 timer tilsettes et 2-5 ganger overskudd av 1,7-diaminoheptan, og reaksjonsblandingen omrøres over natten. Etter 12-20 timer tilsettes et 10-20 gangers overskudd med trifluoreddiksyreanhydrid, og reaksjonsblandingen omrøres ved værelsetemperatur i 4 timer. Produktet renses ved hjelp av kromatografering på siliciumdioxydgel hvor det elueres med en gradient på 0-10% methanol i kloroform som inneholder 2% triethylamin, etterfulgt av utelukkelseskromatografering under anvendelse av Sephadex^LH-20 og eluering med 1% triethylamin i methanol. Hensiktsmessige fraksjoner slåes sammen/ hvorved man får 5<1->DMT-5-[N-(7-trifluoracetylamino-heptyl)-1-acrylamido]-2'-deoxyuridin; et slikt produkt er formålstjenlig for oligonucleotidsyntese ved fosfokloriditt-fremgangsmåten beskrevet i eksemplene 15 og 18. Eventuelt kan en slik forbindelse fremstilles ved kombinasjonen av fremgangsmåter beskrevet i eksemplene 2 og 3. Erstatning av diaminoheptan i denne fremgangsmåte med andre diaminoalkaner (f.eks. diaminopropan, diaminohexan/ diaminododecan) gir andre forbindelser med varierende substituentlengde hvor The method according to the present invention can start with the preparation of the selected nucleoside. Generally, the most preferred nucleosides are best prepared in the following manner. 5-(methyl-3-acrylyl)-2<1->deoxyuridine is prepared from 2'-deoxyuridine by the method according to Bergstrom and Ruth [J. Amer. Chem. Soc., 9j>:1587 (1976)]. The nucleoside is then treated with 1.05 equivalents of dimethoxytrityl chloride in pyridine for 4 hours to block the 5'-hydroxyl with dimethoxytrityl (DMT). The product obtained is purified by means of chromatography on silicon dioxide gel, where it is eluted with a gradient of 0-10% methanol in chloroform containing 2% triethylamine. The purified 5<1->DMT-5-(methyl-3-acrylyl)-2<1->deoxyuridine is treated with IN KOH for 24 hours at ambient temperature to hydrolyze the methyl ester. The resulting 5'-DMT-5-(3-acrylyl)-2'-deoxyuridine is treated with excess dicyclohexylcarbodiimide and hydroxybenztriazole in pyridine. After 4 hours, a 2-5 times excess of 1,7-diaminoheptane is added, and the reaction mixture is stirred overnight. After 12-20 hours, a 10-20 times excess of trifluoroacetic anhydride is added, and the reaction mixture is stirred at room temperature for 4 hours. The product is purified by means of chromatography on silicon dioxide gel where it is eluted with a gradient of 0-10% methanol in chloroform containing 2% triethylamine, followed by exclusion chromatography using Sephadex^LH-20 and elution with 1% triethylamine in methanol. Appropriate fractions are combined to give 5<1->DMT-5-[N-(7-trifluoroacetylamino-heptyl)-1-acrylamido]-2'-deoxyuridine; such a product is suitable for oligonucleotide synthesis by the phosphochloridite method described in examples 15 and 18. Optionally, such a compound can be prepared by the combination of methods described in examples 2 and 3. Replacement of diaminoheptane in this method with other diaminoalkanes (e.g. diaminopropane , diaminohexane/diaminododecane) give other compounds with varying substituent length where

n = 3, 6 eller 12, og n = 3, 6 or 12, and

To slike Two such

nucleosider/ det ene pyrimidin (uracil)-basert og det andre purin (adenin)-basert, er vist øverst på diagrammet nedenunder som illustrerer fremgangsmåten. Reaktive steder på basene til nucleosidene blokkeres så slik som vist i reaksjon 1 ved binding av f.eks. en benzoylgruppe (Bz) til aminet i 6-stillingen i det adeninbaserte nucleosid. Slik blokkering beskrives generelt i "Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry", vol. 1, W. Zorbach og R. Tipson, forf., (Wiley - Interscience, N. Y.) (1968). Ubeskyttede aminer på substituentgruppen blokkeres f.eks. ved å binde trifluoracetylgrupper (Ac) til disse, slik som også vist i reaksjon 1. nucleosides/ one pyrimidine (uracil)-based and the other purine (adenine)-based, are shown at the top of the diagram below which illustrates the procedure. Reactive sites on the bases of the nucleosides are then blocked as shown in reaction 1 by binding e.g. a benzoyl group (Bz) to the amine in the 6-position of the adenine-based nucleoside. Such blocking is generally described in "Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry", vol. 1, W. Zorbach and R. Tipson, Eds., (Wiley - Interscience, N.Y.) (1968). Unprotected amines on the substituent group are blocked, e.g. by binding trifluoroacetyl groups (Ac) to these, as also shown in reaction 1.

Den utvalgte 3'- eller 5'-hydroxylgruppe i nucleosidet blokkeres så ved å binde en dimethoxytrityl (DMT)-gruppe til denne. I reaksjon 2 illustrert nedenunder, blokkeres 5'-hydroxylgruppen, mens 3'-hydroxylgruppen forblir fri eller tilgjengelig for reaksjon. Alternativt kunne 3'-hydroxylgruppen blokkeres, mens 5<1->hydroxylgruppen forble fri. The selected 3'- or 5'-hydroxyl group in the nucleoside is then blocked by binding a dimethoxytrityl (DMT) group to it. In reaction 2 illustrated below, the 5'-hydroxyl group is blocked, while the 3'-hydroxyl group remains free or available for reaction. Alternatively, the 3'-hydroxyl group could be blocked, while the 5<1->hydroxyl group remained free.

Nucleosidet omdannes så til en aktivert nucleotidmonomer, fortrinnsvis ved å binde en fosforholdig gruppe som omfatter en aktiverende rest, til dens 3'-hydroxylgruppe. The nucleoside is then converted to an activated nucleotide monomer, preferably by attaching a phosphorus-containing group comprising an activating residue to its 3'-hydroxyl group.

Når det modifiserte nucleosid er passende blokkert, kan modifikasjoner av fremgangsmåtene beskrevet av Letsinger et al., Matteucci et al., eller redegjort for av Narang et al., benyttes til oligonucleotidsyntese. Bruken av fosfokloriditt-kjemi slik som den beskrevet av Letsinger et al., er nærmere omtalt i eksemplene 16 til 18. For å bruke fosfoamiditt-kjemi brukes en modifikasjon av fremgangsmåten ifølge Matteucci et al., hvor det beskyttede, modifiserte nucleosid fosfityleres med methylklor-(N,N-diisopropyl)-fosfoamiditt eller methylklorfosfomorfoliditt, slik som i den forbedrede fremgangsmåte ifølge Dorper et al., [Nucleic Acids Res. 11:2575 (1983)]. Eventuelt kan det beskyttede, modifiserte nucleosid fosforyleres med 1,2 ekvivalenter klorfenyldiklor-fosfat i trimethylfosfat ved værelsetemperatur etterfulgt av bråkjøling med vann, hvorved man får 3'-klorfenylfosfat-adduktet av det modifiserte nucleosid, slike addukter kan anvendes i en modifikasjon av fosfotriesterfremgangsmåten slik det illustrerende er redegjort for av Narang et al. Diagrammet illustrerer i reaksjon 3 syntesen av aktiverte monomer-nucleotidenheter med formel II ved å binde en fosfomono-kloridittgruppe til 3'-hydroxylgruppen i nucleosidet, hvor kloratomet virker som en aktiverende rest. When the modified nucleoside is appropriately blocked, modifications of the methods described by Letsinger et al., Matteucci et al., or described by Narang et al., can be used for oligonucleotide synthesis. The use of phosphochloridite chemistry as described by Letsinger et al. is discussed in more detail in Examples 16 to 18. To use phosphoamidite chemistry, a modification of the method according to Matteucci et al. is used, where the protected, modified nucleoside is phosphitylated with methyl chlorine -(N,N-diisopropyl)-phosphoamidite or methylchlorophosphomorpholidite, as in the improved method of Dorper et al., [Nucleic Acids Res. 11:2575 (1983)]. Optionally, the protected, modified nucleoside can be phosphorylated with 1.2 equivalents of chlorophenyldichlorophosphate in trimethylphosphate at room temperature followed by quenching with water, thereby obtaining the 3'-chlorophenylphosphate adduct of the modified nucleoside, such adducts can be used in a modification of the phosphotriester method as follows the illustrative is explained by Narang et al. The diagram illustrates in reaction 3 the synthesis of activated monomer nucleotide units of formula II by binding a phosphomonochloridite group to the 3'-hydroxyl group in the nucleoside, where the chlorine atom acts as an activating residue.

Sammenkobling eller kondensasjon av den utvalgte, aktiverte nucleotidmonomer, dvs. den uracilbaserte monomer eller den adeninbaserte monomer, til ende-enheten i en voksende nucleotidkjede er illustrert i reaksjon 4 i diagrammet. Nucleotidkjeden er i sin høyre ende vist med en nucleosidenhet som har en naturlig forekommende base og med en fast støtte- eller blokkeringsgruppe R^ bundet til 3'-hydroxylgruppen. Den illustrerte kjede omfatter også én eller flere (n<1>) nucleotidenheter med naturlig forekommende baser, idet enhetene er bundet til 5'-hydroxylgruppen i nucleosid-enheten, og idet den terminale nucleotidenhet har en fri hydroxylgruppe i 5<1->stillingen. I sammenkoblingsreaksjonen reagerer kloratomet i monomeren med hydrogenatomet i den frie hydroxylgruppe i ende-enheten og erstattes slik at oxygen-atomet i ende-enheten kobles til fosforatomet i monomeren slik som vist, og monomeren blir derved den nye ende-enheten i nucleotidkjeden. Coupling or condensation of the selected activated nucleotide monomer, i.e. the uracil-based monomer or the adenine-based monomer, to the terminal unit of a growing nucleotide chain is illustrated in reaction 4 in the diagram. The nucleotide chain is shown at its right end with a nucleoside unit that has a naturally occurring base and with a fixed support or blocking group R^ attached to the 3'-hydroxyl group. The illustrated chain also comprises one or more (n<1>) nucleotide units with naturally occurring bases, the units being bound to the 5'-hydroxyl group in the nucleoside unit, and the terminal nucleotide unit having a free hydroxyl group in the 5<1->position . In the coupling reaction, the chlorine atom in the monomer reacts with the hydrogen atom in the free hydroxyl group in the end unit and is replaced so that the oxygen atom in the end unit is connected to the phosphorus atom in the monomer as shown, and the monomer thereby becomes the new end unit in the nucleotide chain.

Den DMT 5<1->blokkerende gruppe fjernes så for å tillate ytterligere utvidelse av nucleotidkjeden ved i rekkefølge å tilkoble ytterligere aktiverte nucleotid-monomerenheter. Nucleotidenhetene som tilsettes kjeden, kan velges ut på forhånd og kan ha enten naturlig forekommende eller modifiserte baser. Diagrammet viser i reaksjon 4a den videre utvidelse av kjeden ved tilføyelsen av én eller flere (n") nucleotidenheter med naturlig forekommende baser. The DMT 5<1>-blocking group is then removed to allow further extension of the nucleotide chain by sequentially attaching additional activated nucleotide monomer units. The nucleotide units added to the chain can be selected in advance and can have either naturally occurring or modified bases. The diagram shows in reaction 4a the further extension of the chain by the addition of one or more (n") nucleotide units with naturally occurring bases.

Når et oligonucleotid med den utvalgte lengde og sekvens er blitt syntetisert, fjernes DMT-gruppen fra ende-enheten, og de blokkerte, reaktive grupper avblokkeres. Eksempler på modifiserte uracil- og adeninbaser med deres reaktive grupper avblokkert er også vist skjematisk i reaksjon 5. Dersom den første nucleotidenhet i kjeden bindes til en fast bærer , fjernes så kjeden fra den faste bærer. Den hensiktsmessige avblokkeringsorden kan bestemmes på forhånd. When an oligonucleotide of the selected length and sequence has been synthesized, the DMT group is removed from the terminal unit, and the blocked, reactive groups are unblocked. Examples of modified uracil and adenine bases with their reactive groups unblocked are also shown schematically in reaction 5. If the first nucleotide unit in the chain is bound to a solid support, the chain is then removed from the solid support. The appropriate unblocking order can be determined in advance.

Påvisbare markører Rj. som er hensiktsmessige for den påtenkte bruk av produkt-oligonucleotidet, kan så bindes til slike linkerarmer som eksemplifisert i reaksjon 6 som illustrerer de respektive baser med påvisbare markører R^ bundet til de respektive linkerarmer. Detectable markers Rj. which are appropriate for the intended use of the product oligonucleotide, can then be attached to such linker arms as exemplified in reaction 6 which illustrates the respective bases with detectable markers R 2 attached to the respective linker arms.

Illustrasjon av syntesefremgangsmåte Illustration of synthesis procedure

hvor f.eks. Bm i produkt-oligonucleotidet (side 23) er: where e.g. The Bm of the product oligonucleotide (page 23) is:

En rekke anvendbare, påvisbare markører (R^) kan bindes til produkt-oligonucleotidet. F.eks.: A variety of useful detectable labels (R₂) can be attached to the product oligonucleotide. For example:

PRODUKT-OLIGONUCLEOTIDER MED PÅVISBARE MARKØRER (hvor PRODUCT OLIGONUCLEOTIDES WITH DETECTABLE MARKERS (where

Rc = biotin eller fluorescein) Rc = biotin or fluorescein)

Etter at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ovenfor er blitt omtalt i generelle vendinger og illustrert skjematisk, vil nå hver av reaksjonene som det er henvist til, bli omtalt nærmere. After the method according to the present invention has been described above in general terms and illustrated schematically, each of the reactions referred to will now be described in more detail.

Når det gjelder reaksjon 1, kan blokkering av kjemisk 4 6 2 reaktive aminer slik som N i cytosin, N i adenin, N i guanin og alkyl- eller arylaminer i de modifiserte baser, ut-føres på vanlig kjent måte med passende blokkeringsgrupper i egnede oppløsningsmidler slik som alkoholer, pyridiner, lutidiner, kloroform og lignende, ved omsetning av nucleosidene med et overskudd av passende syreanhydrider i ca. 1 til 24 timer ved temperaturer i området fra 0°C til 110°C, vanligvis 20°C til 80°C. Passende syreanhydrider omfatter eddiksyreanhydrid, trifluoreddiksyreanhydrid, benzoylanhydrid, anisoylanhydrid og lignende. Foretrukket er acetyl-, trifluoracetyl-, benzoyl- og isobutyryl-anhydrid. As regards reaction 1, blocking of chemically 4 6 2 reactive amines such as N in cytosine, N in adenine, N in guanine and alkyl or aryl amines in the modified bases can be carried out in a commonly known manner with suitable blocking groups in suitable solvents such as alcohols, pyridines, lutidines, chloroform and the like, by reacting the nucleosides with an excess of suitable acid anhydrides for approx. 1 to 24 hours at temperatures ranging from 0°C to 110°C, typically 20°C to 80°C. Suitable acid anhydrides include acetic anhydride, trifluoroacetic anhydride, benzoyl anhydride, anisoyl anhydride and the like. Acetyl, trifluoroacetyl, benzoyl and isobutyryl anhydride are preferred.

Blokkering av 5<1->hydroxygruppen i reaksjon 2 kan utføres på vanlig kjent måte ved omsetning av nucleosidene med et lite overskudd hensiktsmessige syrelabile blokkeringsreagenser slik som tritylklorider, monomethoxytritylklorid, dimethoxytritylklorid, (DMTC1), trimethoxytritylklorid og lignende. Dimethoxytritylklorid er foretrukket. Reaksjonene utføres vanligvis i egnede oppløsningsmidler, slik som pyridin, lutidiner, trialkylaminer og lignende, ved temperaturer i området fra -20°C til 120°C, vanligvis 20°C til 100°C, i ca. 1 til 48 timer. Den foretrukne reaksjon benytter 1,1 ekvivalenter DMTC1 i pyridin ved værelsetemperatur i 2 timer. Blocking of the 5<1->hydroxy group in reaction 2 can be carried out in a commonly known manner by reacting the nucleosides with a small excess of appropriate acid-labile blocking reagents such as trityl chlorides, monomethoxytrityl chloride, dimethoxytrityl chloride, (DMTC1), trimethoxytrityl chloride and the like. Dimethoxytrityl chloride is preferred. The reactions are usually carried out in suitable solvents, such as pyridine, lutidines, trialkylamines and the like, at temperatures in the range from -20°C to 120°C, usually 20°C to 100°C, for approx. 1 to 48 hours. The preferred reaction uses 1.1 equivalents of DMTC1 in pyridine at room temperature for 2 hours.

Det er generelt foretrukket at de respektive produkter fra hver reaksjon beskrevet ovenfor, fraskilles og/eller isoleres før bruk som et utgangsmateriale for en derpå følg-ende reaksjon. Separering og isolering kan utføres ved hjelp av en hvilken som helst egnet rensingsfremgangsmåte slik som f.eks. inndamping, filtrering, krystallisering, kolonnekromatografering, tynnskiktskromatografering, etc. Spesifikke illustreringer av typiske separasjons- og isolasjons-fremgangsmåter kan fåes ved henvisning til de passende eksempler beskrevet nedenunder; imidlertid kan selvfølgelig også andre ekvivalente separasjonsfremgangsmåter brukes. Det skal også forståes at, når typiske reaksjonsbetingelser (f.eks. temperaturer, molforhold, reaksjonstider) er gitt, kan betingelser både over og under de vanlige områder også brukes, It is generally preferred that the respective products from each reaction described above are separated and/or isolated before use as a starting material for a subsequent reaction. Separation and isolation can be carried out using any suitable purification method such as e.g. evaporation, filtration, crystallization, column chromatography, thin layer chromatography, etc. Specific illustrations of typical separation and isolation procedures may be obtained by reference to the appropriate examples described below; however, of course, other equivalent separation methods can also be used. It should also be understood that, when typical reaction conditions (eg, temperatures, molar ratios, reaction times) are given, conditions both above and below the usual ranges may also be used,

selv om det generelt sett er mindre beleilig. although it is generally less convenient.

Aktivering av fosfittanalogen belyst i reaksjon 3, kan mest beleilig utføres ved behandling av nucleosidforbindelsene med egnede fosfitylerende midler i hensiktsmessige oppløs-ningsmidler ved temperaturer i området fra -90°C til 60°C i 1 minutt til 2 timer. Egnede fosfityleringsmidler omfatter methylfosfodikloriditt, o-klorfenylfosfodikloriditt, p-klorofenylfosfodikloriditt, methylfosfo-(dialkylamino)-mono-kloridittog lignende. Hensiktsmessige oppløsningsmidler omfatter pyridin, lutidiner, acetonitril, tetrahydrofuran, dioxan, kloroform og lignende som inneholder 0-20% hensiktsmessig base (vanligvis 1-5 vol%) slik som lutidiner, collidiner, trialkylaminer og lignende. Foretrukne fosfityleringsmidler er methylfosfodikloriditt, o-klorfenylfosfodikloriditt og methylfosfo-(diisopropylamino)-monokloriditt. Foretrukne fosfityleringsbetingelser er med 0,9 ekvivalenter methylfosfodikloriditt i pyridin eller acetonitril som inneholder 5% 2,6-lutidin i 5 til 10 minutter ved værelsetemperatur eller lavere. Activation of the phosphite analog illustrated in reaction 3 can most conveniently be carried out by treating the nucleoside compounds with suitable phosphitylating agents in suitable solvents at temperatures in the range from -90°C to 60°C for 1 minute to 2 hours. Suitable phosphitylating agents include methylphosphodichloridite, o-chlorophenylphosphodichloridite, p-chlorophenylphosphodichloridite, methylphospho-(dialkylamino)-monochloridite, and the like. Suitable solvents include pyridine, lutidines, acetonitrile, tetrahydrofuran, dioxane, chloroform and the like containing 0-20% of appropriate base (usually 1-5 vol%) such as lutidines, collidines, trialkylamines and the like. Preferred phosphitylating agents are methylphosphodichloridite, o-chlorophenylphosphodichloridite and methylphospho-(diisopropylamino)-monochloridite. Preferred phosphitylation conditions are with 0.9 equivalents of methylphosphodichloridite in pyridine or acetonitrile containing 5% 2,6-lutidine for 5 to 10 minutes at room temperature or lower.

Den kjemiske inkorporering av de modifiserte nucleotid-analogmonomerer i en voksende nucleotidkjede for å fremstille nucleotider med definert sekvens, er illustrert i reaksjonene 4 og 4a. Vanlige kondensasjoner er i hensiktsmessige oppløsningsmidler ved temperaturer i området fra -20°C til 50°C, fortrinnsvis ved omgivelsestemperatur, i ca. 1 til 60 minutter. Hensiktsmessige oppløsningsmiddelblandinger omfatter pyridin, lutidiner, acetonitril, tetrahydrofuran, dioxan, kloroform og lignende som inneholder 0-20% hensiktsmessig base (vanligvis 1 til 5 volum%) slik som lutidiner, collidiner, trialkylaminer og lignende. Den voksende kjede kan være oppløselig, uoppløselig eller bundet til en egnet fast bærer ved hjelp av hensiktsmessige kjemiske fremgangsmåter som er kjent innen teknikken. Foretrukket er binding til en fast bærer. Den voksende kjede kan videre, eller behøver ikke, tidligere å være blitt inkorporert med én eller flere modifiserte nucleosidanaloger. The chemical incorporation of the modified nucleotide analog monomers into a growing nucleotide chain to produce nucleotides of defined sequence is illustrated in reactions 4 and 4a. Common condensations are in suitable solvents at temperatures in the range from -20°C to 50°C, preferably at ambient temperature, for approx. 1 to 60 minutes. Suitable solvent mixtures include pyridine, lutidines, acetonitrile, tetrahydrofuran, dioxane, chloroform and the like containing 0-20% of appropriate base (usually 1 to 5% by volume) such as lutidines, collidines, trialkylamines and the like. The growing chain may be soluble, insoluble or bound to a suitable solid support by suitable chemical methods known in the art. Bonding to a solid carrier is preferred. Furthermore, the growing chain may or may not have previously been incorporated with one or more modified nucleoside analogues.

Etter kondensering av den aktiverte monomer til den voksende kjede i reaksjon 4, behandles utgangsproduktet med egnede reagenser for å oppnå oxydering av mellomprodukt-fosfitt-triesteren, eventuelt tildekkes for å blokkere ikke-omsatte 5<1->hydroxylgrupper på oligonucleotidkjeden, og fjerning av 5'-DMT-gruppen. Oxydering av fosfitt-triesteren kan oppnåes ved behandling med 0,1-5 vekt/volum% jod i egnede oppløsningsmidler, f.eks. tetrahydrofuran/vann/lutidin-blandinger. Kjemisk blokkering av ikke-omsatte 5'-hydroxylgrupper kan oppnåes ved acetylering eller acylering med f.eks. eddiksyreanhydrid og 4-dimethylaminopyridin i tetrahydrofuran/lutidinblandinger. Fjerning av den 5'-blokkerende gruppe, vanligvis DMT, utføres mest bekvemt ved behandling med svake organiske syrer i ikke-protiske oppløsningsmidler, slik som svake syrer omfattende f.eks. 1-5 volum% dikloreddik-eller trikloreddik-syre i kloroform eller diklormethan. Den voksende nucleotidkjede kan, etter fjerning av DMT, nå tjene som akseptor for etterfølgende forlengelse ved hjelp av omsetning i rekkefølge med aktiverte monomerer for eventuelt å fremstille oligonucleotidet med ønsket lengde og sekvens slik som vist i reaksjon 4a. After condensation of the activated monomer to the growing chain in reaction 4, the starting product is treated with suitable reagents to achieve oxidation of the intermediate phosphite triester, optionally capping to block unreacted 5<1->hydroxyl groups on the oligonucleotide chain, and removal of the 5'-DMT group. Oxidation of the phosphite triester can be achieved by treatment with 0.1-5% by weight/volume of iodine in suitable solvents, e.g. tetrahydrofuran/water/lutidine mixtures. Chemical blocking of unreacted 5'-hydroxyl groups can be achieved by acetylation or acylation with e.g. acetic anhydride and 4-dimethylaminopyridine in tetrahydrofuran/lutidine mixtures. Removal of the 5'-blocking group, usually DMT, is most conveniently carried out by treatment with weak organic acids in non-protic solvents, such as weak acids comprising e.g. 1-5 vol% dichloroacetic or trichloroacetic acid in chloroform or dichloromethane. The growing nucleotide chain can, after removal of DMT, now serve as an acceptor for subsequent elongation by means of reaction in sequence with activated monomers to possibly produce the oligonucleotide of the desired length and sequence as shown in reaction 4a.

Etter at et oligonucleotid med ønsket sekvens er fremstilt, gjennomføres reaksjon 5 for å tilveiebringe produkt-oligonucleotidet. For dette formål brukes thiofenolbehandling for å fjerne methylblokkerende grupper fra fosfat-triestere, og egnet vandig alkali- eller ammoniakk-behandling brukes for å fjerne benzoyl, acetyl, isobutyl, trifluoracetyl eller andre grupper fra de beskyttede aminer og/eller for å fjerne produktet fra den faste bærer. Fjerning av DMT fra oligo-nucleotidproduktet oppnåes ved den passende behandling med en svak syre, slik som vandig eddiksyre ved omgivelsestemperatur til 40°C i 10 til 60 minutter. Slike reaksjoner kan utføres før eller under sluttrensinger. Sluttrensing oppnåes ved hjelp av passende fremgangsmåter, slik som polyacrylamidgel-elektroforese, høytrykks-væskekromatografi (HPLC), revers fase-eller anion-bytting på DEAE-cellulose, eller kombinasjoner av disse fremgangsmåter. After an oligonucleotide of the desired sequence has been prepared, reaction 5 is carried out to provide the product oligonucleotide. To this end, thiophenol treatment is used to remove methyl blocking groups from phosphate triesters, and suitable aqueous alkali or ammonia treatment is used to remove benzoyl, acetyl, isobutyl, trifluoroacetyl or other groups from the protected amines and/or to remove the product from the permanent bearer. Removal of DMT from the oligonucleotide product is achieved by the appropriate treatment with a weak acid, such as aqueous acetic acid at ambient temperature to 40°C for 10 to 60 minutes. Such reactions can be carried out before or during final purifications. Final purification is achieved by suitable methods, such as polyacrylamide gel electrophoresis, high pressure liquid chromatography (HPLC), reverse phase or anion exchange on DEAE cellulose, or combinations of these methods.

Fremgangsmåten som her er beskrevet for syntese av oligonucleotider, kan benytte modifiserte deoxyribonucleo-sider (hvor R' er H) eller modifiserte ribonucleosider (hvor R' er hydroxyl). Når ribonucleosider brukes, er 2'-hydroxylgruppen blokkert ved hjelp av en hensiktsmessig blokkeringsgruppe slik som f.eks. den som avgis av silylethere. Andre riboseanaloger inkludert arabinose og 3'-deoxyribose, kan også være behjelpelig til å gi det ønskede oligonucleotid i f r emgan gsmå ten. The method described here for the synthesis of oligonucleotides can use modified deoxyribonucleosides (where R' is H) or modified ribonucleosides (where R' is hydroxyl). When ribonucleosides are used, the 2'-hydroxyl group is blocked by means of an appropriate blocking group such as e.g. that given off by silyl ethers. Other ribose analogues, including arabinose and 3'-deoxyribose, can also be helpful in providing the desired oligonucleotide in the first step.

Linkerarmen som modifiserer en nucleotidbase, må være The linker arm that modifies a nucleotide base must be

i stand til å binde én eller flere påvisbare markører enten før eller etter sammenkoblingsreaksjonen for kjedeforlengelse. I sistnevnte tilfelle omsettes utvalgte produkt-oligonucleotider med egnede midler for å binde slike påvisbare markører. Når modifiserte baser inkorporeres i oligonucleotidet og R2capable of binding one or more detectable labels either before or after the chain extension coupling reaction. In the latter case, selected product oligonucleotides are reacted with suitable means to bind such detectable markers. When modified bases are incorporated into the oligonucleotide and R2

i substituentgruppen inneholder ett eller flere primære aminer, gir f.eks. kobling med aminreaktive grupper slik som isocyanat, isothiocyanat, aktive carboxylsyrekonjugater, epoxyder eller aktive, aromatiske forbindelser under anvendelse av egnede, milde betingelser, amid-, urinsyre-, thio-urinsyre-, amin- eller aromatiske aminbindinger. F.eks. kan, som vist i skjemaet for reaksjon 5, et oligonucleotid som inneholder en uracil- eller adeninbase som er modifisert ved hjelp av en linkerarm med et primært amin, omsettes med et egnet reagens, slik som fluorescein-isothiocyanat eller N-hydroxysuccinimidyl-6-biotinylaminokapronsyre, hvorved det fåes en påvisbar markør R^ (henholdsvis fluorescein eller biotin) bundet til linkerarmen slik som vist i reaksjon 6. Andre påvisbare markører som kan bindes på lignende måte, omfatter en lang rekke organiske rester slik som fluoresceiner, rhodaminer, acridinsalter, dinitrofenyler, benzensulfonyler, luminoler, luciferiner, biotiner, in the substituent group contains one or more primary amines, gives e.g. coupling with amine-reactive groups such as isocyanate, isothiocyanate, active carboxylic acid conjugates, epoxides or active aromatic compounds using suitable, mild conditions, amide, uric acid, thio-uric acid, amine or aromatic amine linkages. E.g. As shown in the scheme for reaction 5, an oligonucleotide containing a uracil or adenine base modified by means of a linker arm with a primary amine can be reacted with a suitable reagent, such as fluorescein isothiocyanate or N-hydroxysuccinimidyl-6- biotinylaminocaproic acid, whereby a detectable marker R^ (respectively fluorescein or biotin) is obtained bound to the linker arm as shown in reaction 6. Other detectable markers that can be bound in a similar way include a wide range of organic residues such as fluoresceins, rhodamines, acridine salts, dinitrophenyls, benzenesulfonyls, luminols, luciferins, biotins,

vitaminer, carbohydrater og lignende. Egnede aktive, påvisbare markører er tilgjengelige kommersielt eller kan syntetiseres f.eks. ved fremgangsmåter av den type som er generelt be- vitamins, carbohydrates and the like. Suitable active, detectable markers are available commercially or can be synthesized e.g. by methods of the type that are generally

skrevet i "Bioluminescence and Chemiluminescence", [M. DeLuca og W. McElroy, forf., Acad. Press, New York (1981)], av D. Roswell et al., eller H. Schroeder et al., [Meth. Enzymol. LXII, (1978)], og der angitte litteraturhenvisninger. written in "Bioluminescence and Chemiluminescence", [M. DeLuca and W. McElroy, Prof., Acad. Press, New York (1981)], by D. Roswell et al., or H. Schroeder et al., [Meth. Enzymol. LXII, (1978)], and the literature references indicated there.

Binding av påvisbare markører oppnåes vanligvis bekvemt i overveiende vandige oppløsningsmidler ved omsetning av linkerarmene i modifiserte baser hvor R~ = C H~ NH„ med over-øs n zn 2. Binding of detectable markers is usually conveniently achieved in predominantly aqueous solvents by reaction of the linker arms in modified bases where R~ = C H~ NH„ with over-øs n zn 2.

skudd av den utvalgte, påvisbare markør ved temperaturer i området fra ca. -20°C til 50°C (fortrinnsvis 20°C til 40°C) i 1 til 24 timer. Egnede oppløsningsmidler er en vandig buffer og 0-50% organiske oppløsningsmidler slik som lavere alkoholer, tetrahydrofuran, dimethylformamid, pyridin og lignende. Foretrukne, påvisbare markørreaktanter omfatter fluorescein-isothiocyanater, dinitrofenylisothiocyanater, fluordinitro-benzen, N-hydroxysuccinimidylbiotin, N-hydroxysuccinimidyl-dinitrobenzoat, isothiocyanater slik som aminobutyl-ethyl-isoluminol-isothiocyanat, aktive estere av carboxyfluorescein, rhodamin, biotinaddukter, dioxetaner, dioxamider, carboxy-acridiner, carbohydrater og lignende. shot of the selected, detectable marker at temperatures in the range from approx. -20°C to 50°C (preferably 20°C to 40°C) for 1 to 24 hours. Suitable solvents are an aqueous buffer and 0-50% organic solvents such as lower alcohols, tetrahydrofuran, dimethylformamide, pyridine and the like. Preferred detectable marker reactants include fluorescein isothiocyanates, dinitrophenyl isothiocyanates, fluorodinitrobenzene, N-hydroxysuccinimidyl biotin, N-hydroxysuccinimidyl dinitrobenzoate, isothiocyanates such as aminobutyl ethyl isoluminol isothiocyanate, active esters of carboxyfluorescein, rhodamine, biotin adducts, dioxetanes, dioxamides, carboxy -acridines, carbohydrates and the like.

Når produkt-oligonucleotidet omfatter modifiserte baser hvor R inneholder én eller flere carboxylsyrer, gir dertil milde kondensasjoner med f.eks. primære alkylaminer amid-bindinger. Vanligvis bevirkes dette bekvemt i overveiende vandige oppløsningsmidler ved omsetning av oligonucleotidet med overskudd av påvisbare markører som inneholder et primært amin i nærvær av egnede kondenseringsmidler, slik som vann-oppløselige carbodiimider, ved temperaturer i området fra ca. -20°C til 50°C (fortrinnsvis 20°C til 40°C) i 6 til 72 timer. Foretrukne, påvisbare markører i denne klasse omfatter (aminoalkyl)-aminonafthalen-1, 2-dicarboxylsyrehydrazider, aminofluoresceiner, aminorhodaminer, aminoalkylluminoler, aminoalkylaminobenzensulfonyladdukter, aminosukkere og lignende. Videre kan den kjemiske syntese av utgangs-oligo-nucleotidproduktet utføres med modifiserte nucleotidmonomerer hvor slike påvisbare markører bindes til linkerarmen før sammenkoblingsreaksjonen. Dersom en slik påvisbar markør påvirker sammenkoblingsreaksjonen ugunstig, blokkeres den hensiktsmessig for å avverge en slik ugunstig virkning. På den annen side er visse andre påvisbare markører praktisk talt ikke-reaktive når det gjelder sammenkoblingsreaksjonen og krever derfor ikke blokkering. F.eks. kan nitrofenyl-addukter bindes til linkerarmen før sammenkoblingsreaksjonen og være til stede uten blokkering på den modifiserte nucleotidmonomer under sammenkoblingsreaksjonen uten alvorlig virkning. When the product oligonucleotide comprises modified bases where R contains one or more carboxylic acids, mild condensations with e.g. primary alkylamines amide bonds. Typically, this is conveniently accomplished in predominantly aqueous solvents by reacting the oligonucleotide with an excess of detectable labels containing a primary amine in the presence of suitable condensing agents, such as water-soluble carbodiimides, at temperatures ranging from about -20°C to 50°C (preferably 20°C to 40°C) for 6 to 72 hours. Preferred detectable markers in this class include (aminoalkyl)aminonaphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrazides, aminofluoresceins, aminorhodamines, aminoalkylluminols, aminoalkylaminobenzenesulfonyl adducts, aminosugars, and the like. Furthermore, the chemical synthesis of the starting oligo-nucleotide product can be carried out with modified nucleotide monomers where such detectable markers are attached to the linker arm prior to the coupling reaction. If such a detectable marker adversely affects the coupling reaction, it is appropriately blocked to prevent such an adverse effect. On the other hand, certain other detectable markers are virtually unreactive with respect to the coupling reaction and therefore do not require blocking. E.g. nitrophenyl adducts can be attached to the linker arm prior to the coupling reaction and be present without blocking the modified nucleotide monomer during the coupling reaction without serious effect.

Påvisbare markører som kan anvendes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter vanligvis aromatiske, polyaromatiske, cycliske og polycycliske organiske rester som er ytterligere funksjonalisert ved innlemmingen av heteroatomer slik som nitrogen, oxygen, svovel og lignende. Detectable markers that can be used in the method according to the present invention usually comprise aromatic, polyaromatic, cyclic and polycyclic organic residues which are further functionalized by the incorporation of heteroatoms such as nitrogen, oxygen, sulfur and the like.

Produkt-oligonucleotider kan omfatte mer enn én type modifikasjon eller mer enn én modifisert base. Et belysende eksempel på et oligonucleotid av denne type er et med strukturformelen: Product oligonucleotides may comprise more than one type of modification or more than one modified base. An illustrative example of an oligonucleotide of this type is one with the structural formula:

hvor Cm er 5-(3-aminopropyl)-cytosin, er 5-[N-(4-aminobutyl)-1-acrylamido]-uracil og Am er 8-[6-2,4-dinitrofenyl)-aminohexyl]-aminoadenin. Dette produkt modifiseres ytterligere ved omsetning med fluorescein-isothiocyanat, hvorved det fåes en påvisbar fluoresceinmarkør på Cm og U™. where Cm is 5-(3-aminopropyl)-cytosine, 5-[N-(4-aminobutyl)-1-acrylamido]-uracil and Am is 8-[6-2,4-dinitrophenyl)-aminohexyl]-aminoadenine . This product is further modified by reaction with fluorescein isothiocyanate, whereby a detectable fluorescein marker is obtained on Cm and U™.

Et slikt produkt-oligonucleotid illustrerer variasjonen i utvelgelsen av modifiserte og ikke-modifiserte nucleotidenheter i et produkt-oligonucleotid som er muliggjort ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Nærmere bestemt illustrerer et slikt oligonucleotid bruken av mere enn én type nucleotidenhet hvor basen er modifisert med linkerarmer hvortil det er bundet påvisbare markører som gir den samme eller andre typer påvisbar markørvirkning. Det er også vist enheter hvor basene er modifisert ved hjelp av linkerarmer som det er bundet påvisbare markører til etter sammen-koblingsreaks jonen, dvs. Cm og U 111, mens Am er illustrerende for en enhet hvor basen er modifisert med en linkerarm hvortil det ble bundet en dinitrofenylmarkør før sammenkoblingsreaksjonen. Et slikt oligonucleotid viser i tillegg at det kan omfatte mer enn én nucleotidenhet av den samme type, og at det kan omfatte enheter med ikke-modifiserte baser blandet innimellom enheter med modifiserte baser. Such a product oligonucleotide illustrates the variation in the selection of modified and unmodified nucleotide units in a product oligonucleotide made possible by the method according to the present invention. More specifically, such an oligonucleotide illustrates the use of more than one type of nucleotide unit where the base is modified with linker arms to which detectable markers are attached which give it the same or other types of detectable marker action. Also shown are units where the bases are modified by means of linker arms to which detectable markers are attached after the coupling reaction, i.e. Cm and U 111, while Am is illustrative of a unit where the base is modified with a linker arm to which it was attached a dinitrophenyl label prior to the coupling reaction. Such an oligonucleotide also shows that it can comprise more than one nucleotide unit of the same type, and that it can comprise units with unmodified bases interspersed with units with modified bases.

Istedenfor å binde påvisbare markører til de primære aminer i linkerarmene slik som vist i reaksjon 6, kan eventuelt slike amingrupper eller andre grupper sammenkobles med egnede aktiverte, faste bærere. Dette gir et oligonucleotid med definert sekvens som er covalent bundet til slike bærere over de modifiserte baser. Slike faste bærere kan anvendes ved påvisningen og isoleringen av komplementære nucleinsyrebestanddeler. Eventuelt kan de modifiserte nucleosidmonomerene sammenkobles med faste bærere før den kjedeutvidende sammenkoblingsreaksjon 4 for derved å gi faste bærere for slike monomerer under sammenkoblingsreaksjonen. Instead of binding detectable markers to the primary amines in the linker arms as shown in reaction 6, such amine groups or other groups can optionally be connected with suitable activated, solid supports. This gives an oligonucleotide with a defined sequence which is covalently bound to such carriers via the modified bases. Such solid carriers can be used for the detection and isolation of complementary nucleic acid constituents. Optionally, the modified nucleoside monomers can be coupled with solid supports before the chain-extending coupling reaction 4 to thereby provide solid supports for such monomers during the coupling reaction.

De følgende spesifikke eksempler gis for å gjøre det mulig for fagfolk innen teknikken å utøve oppfinnelsen. Eksemplene er illustrerende og representative for omfanget av oppfinnelsen. For å hjelpe til med den strukturelle presisering er det vist til reaksjonene som er illustrert i det tidligere nevnte fremgangsmåteskjerna. The following specific examples are provided to enable those skilled in the art to practice the invention. The examples are illustrative and representative of the scope of the invention. To assist with the structural clarification, reference is made to the reactions illustrated in the aforementioned method core.

Eksempel 1 Example 1

Dette eksempel illustrerer syntesen av en modifisert nucleosidforløper- 5-(3-trifluoracetylaminopropenyl)-2' - deoxyuridin. This example illustrates the synthesis of a modified nucleoside precursor 5-(3-trifluoroacetylaminopropenyl)-2'-deoxyuridine.

5-klormercuri-2'-deoxyuridin (3,6 g, 7,8 mmol) suspen-deres i 200 ml methanol. N-allyltrifluoracetamid (6,8 ml, 5-chloromercuri-2'-deoxyuridine (3.6 g, 7.8 mmol) is suspended in 200 ml of methanol. N-allyl trifluoroacetamide (6.8 ml,

55 irimol) tilsettes etterfulgt av tilsetning av 41 ml 0,2N lithiumtetraklorpalladat i methanol. Etter 18 timers omrør-ing ved værelsetemperatur gravitetsfiltreres reaksjonsblandingen for å fjerne det svarte, faste palladium, og det gule methanolholdige filtrat behandles med fem 200 mg porsjoner natriumborhydrid, deretter oppkonsentreres det under redusert trykk til en fast rest. Resten renses ved hurtig kolonnekromatografering på siliciumdioxydgel under eluering med 15 volum% methanol i kloroform. Passe rene produktfraksjoner blandes og oppkonsentreres under redusert trykk, hvorved man får krystallinsk 5-(3-trifluoracetylaminopropenyl)-2 * - deoxyuridin (2,4 g) . UV A maks, 291 nm (£ 7800), Amin# 55 irimol) is added followed by the addition of 41 ml of 0.2N lithium tetrachloropalladate in methanol. After 18 hours of stirring at room temperature, the reaction mixture is gravity filtered to remove the black, solid palladium, and the yellow methanol-containing filtrate is treated with five 200 mg portions of sodium borohydride, then concentrated under reduced pressure to a solid residue. The residue is purified by rapid column chromatography on silicon dioxide gel, eluting with 15 vol% methanol in chloroform. Suitable pure product fractions are mixed and concentrated under reduced pressure, whereby crystalline 5-(3-trifluoroacetylaminopropenyl)-2*-deoxyuridine (2.4 g) is obtained. UV A max, 291 nm (£7800), Amin#

266 nm, (£ 4400); TLC (siliciumdioxyd, eluering med 15 volum% methanol i kloroform) Rf = 0,4. 266nm, (£4400); TLC (silicon dioxide, elution with 15 vol% methanol in chloroform) Rf = 0.4.

Eksempel 2 Example 2

Dette eksempel illustrerer syntesen av en modifisert nucleosidforløper 5-[N-(trifluoracetylaminoheptyl)-1-acryl-amido]-2<1->deoxyuridin. This example illustrates the synthesis of a modified nucleoside precursor 5-[N-(trifluoroacetylaminoheptyl)-1-acrylamido]-2<1->deoxyuridine.

5-klormercuri-2'-deoxyuridin (3,6 g, 7,8 mmol) suspen-deres i 200 ml methanol. N-(7-trifluoracetylaminoheptyl)-acrylamid (55 mmol) tilsettes etterfulgt av tilsetning av 41 ml 0,2N lithiumtetraklorpalladat i methanol. Etter 18 timers omrøring ved værelsetemperatur gravitetsfiltreres reaksjonsblandingen for å fjerne det svarte, faste palladium, og det gule methanolholdige filtrat behandles med fem 200 mg store porsjoner natriumborhydrid, deretter oppkonsentreres det under redusert trykk til en fast rest. Resten renses ved hurtig kolonnekromatografering på siliciumdioxydgel hvor det elueres med 10 volum% methanol i kloroform. Passe rene fraksjoner av produktet blandes og oppkonsentreres under redusert trykk, hvorved man får krystallinsk 5-[N-(7-tri-fluoracetylaminoheptyl)-1-acrylamino]-2'-deoxyuridin (2,8 g). UV ^ t, 302 nm (£, 18000), A. „ 230 nm, 280 nm; 5-chloromercuri-2'-deoxyuridine (3.6 g, 7.8 mmol) is suspended in 200 ml of methanol. N-(7-trifluoroacetylaminoheptyl)-acrylamide (55 mmol) is added followed by the addition of 41 ml of 0.2N lithium tetrachloropalladate in methanol. After stirring for 18 hours at room temperature, the reaction mixture is gravity filtered to remove the black, solid palladium, and the yellow methanol-containing filtrate is treated with five 200 mg portions of sodium borohydride, then concentrated under reduced pressure to a solid residue. The residue is purified by rapid column chromatography on silicon dioxide gel, where it is eluted with 10 volume% methanol in chloroform. Suitable pure fractions of the product are mixed and concentrated under reduced pressure, whereby crystalline 5-[N-(7-trifluoroacetylaminoheptyl)-1-acrylamino]-2'-deoxyuridine (2.8 g) is obtained. UV ^ t, 302 nm (£, 18000), A. „ 230 nm, 280 nm;

TLC (siliciumdioxydgel, eluering med 15 volum% methanol i kloroform) R^ = 0,3. TLC (silicon dioxide gel, elution with 15 vol% methanol in chloroform) R 1 = 0.3.

Eksempel 3 Example 3

Dette eksempel illustrerer blokkering av 5'-hydroxyl This example illustrates blocking of 5'-hydroxyl

for å fremstille 5<1->dimethoxytrityl-5-(3-trifluoracetylamino-propenyl)-2 *-deoxyuridin slik som illustrert i reaksjon 2. to prepare 5<1->dimethoxytrityl-5-(3-trifluoroacetylamino-propenyl)-2*-deoxyuridine as illustrated in reaction 2.

5-(3-trifluoracetylaminopropenyl)-2'-deoxyuridin 5-(3-trifluoroacetylaminopropenyl)-2'-deoxyuridine

(2,4 g) inndampes fullstendig to ganger fra pyridin, deretter omrøres det i 40 ml pyridin. Dimethoxytrityl (DMT)-klorid (2,3 g, 6,6 mmol) tilsettes, og blandingen omrøres ved værelsetemperatur i 4 timer. Etter at tynnskiktskromatografi (TLC) på siliciumdioxydgel hvor det elueres med 10 volum% methanol i kloroform indikerer at omsetningen er fullstendig, oppkonsentreres reaksjonsblandingen til en fast rest. Denne rest renses ved hjelp av kolonnekromatografi på siliciumdioxydgel hvor det elueres med kloroform inntil alle uren-heter som passerer hurtig gjennom kolonnen, er blitt eluert, deretter bringes produktet ut med 5 volum% methanol i kloroform. Resten oppkonsentreres så, hvorved man får 5<1->dimethoxytrityl-5- (3-trifluoracetylaminopropen-l-yl)-21-deoxyuridin som et hvitt, dunaktig, fast stoff (4 g). Produktet dekomponerer etter oppvarming; UV A^^g 291 nm, ^min 266 nm; TLC R^ 0,6 på siliciumdioxyd med 10 volum% methanol i kloroform som elueringsmiddel. (2.4 g) is completely evaporated twice from pyridine, then stirred in 40 ml of pyridine. Dimethoxytrityl (DMT) chloride (2.3 g, 6.6 mmol) is added and the mixture is stirred at room temperature for 4 hours. After thin-layer chromatography (TLC) on silicon dioxide gel eluting with 10 volume% methanol in chloroform indicates that the reaction is complete, the reaction mixture is concentrated to a solid residue. This residue is purified by means of column chromatography on silicon dioxide gel, where it is eluted with chloroform until all impurities that pass quickly through the column have been eluted, then the product is brought out with 5 vol% methanol in chloroform. The residue is then concentrated to give 5<1->dimethoxytrityl-5-(3-trifluoroacetylaminopropen-1-yl)-21-deoxyuridine as a white, fluffy, solid (4 g). The product decomposes after heating; UV A^^g 291 nm, ^min 266 nm; TLC R^ 0.6 on silicon dioxide with 10 volume% methanol in chloroform as eluent.

Eksempel 4 Example 4

Dette eksempel illustrerer hydrogenering av exocyclisk dobbeltbinding og 51 -hydroxylblokkering for å fremstille 5'-dimethoxytrityl-5-(3-trifluoracetylaminopropyl)-2'-deoxyuridin. This example illustrates exocyclic double bond hydrogenation and 51 -hydroxyl blocking to prepare 5'-dimethoxytrityl-5-(3-trifluoroacetylaminopropyl)-2'-deoxyuridine.

Ved å gjenta syntesen av nucleosidforløper og fremgangsmåten for blokkering av 5' -hydroxyl ifølge eksemplene 1 By repeating the synthesis of nucleoside precursor and the procedure for blocking the 5'-hydroxyl according to Examples 1

og 3, men utsette det rensede 5-(3-trifluoracetylamino-propenyl) -2 ' -deoxyuridin for to atmosfærer hydrogentrykk mens det omrøres ved værelsetemperatur i methanol over 10% palladium-på-carbon-katalysator før tilsetningen av DMT-kloridet, fåes det 5<1->dimethoxytrityl-5-(3-trifluoracetyl-aminopropy1)-2'-deoxyuridin. and 3, but subjecting the purified 5-(3-trifluoroacetylamino-propenyl)-2'-deoxyuridine to two atmospheres of hydrogen pressure while stirring at room temperature in methanol over 10% palladium-on-carbon catalyst prior to the addition of the DMT chloride, is obtained the 5<1->dimethoxytrityl-5-(3-trifluoroacetyl-aminopropyl)-2'-deoxyuridine.

Eksemplene 5 til 8 illustrerer syntesen av ytterligere modifiserte uracilnucleosider, og deretter blokkering av 5'-hydroxylgrupper slik som vist ved reaksjon 2. Examples 5 to 8 illustrate the synthesis of further modified uracil nucleosides, followed by blocking of 5'-hydroxyl groups as shown in reaction 2.

Eksempel 5 Example 5

Ved å gjenta nucleosidforløpersyntesen og fremgangsmåten for blokkering av 5 1-hydroxylgruppe ifølge eksemplene 1 og 3, men ved å erstatte N-allyltrifluoracetamid med forbindelser nummerert 1 til 8^ nedenunder, fåes det hhv. forbindelsene nummerert 1' til 8' nedenunder, dvs. innsetting av By repeating the nucleoside precursor synthesis and the procedure for blocking 5 1-hydroxyl group according to examples 1 and 3, but by replacing N-allyltrifluoroacetamide with compounds numbered 1 to 8^ below, it is obtained respectively the connections numbered 1' to 8' below, i.e. insertion of

1 N-(3-butenyl)-trikloracetamid 1 N-(3-butenyl)-trichloroacetamide

2 N-(5-hexenyl)-trifluoracetamid 2 N-(5-hexenyl)-trifluoroacetamide

3_ N- (2-methyl-2-propenyl) -trif luoracetamid 3_ N-(2-methyl-2-propenyl)-trifluoroacetamide

A_ N- (4-ethenylf enylmethyl) -trif luoracetamid A_ N-(4-ethenylphenylmethyl)-trifluoroacetamide

5_ N- (1-methyl-3-butenyl) -trifluoracetamid 5_ N-(1-methyl-3-butenyl)-trifluoroacetamide

6^ N- (12-trikloraminododecyl) -acrylamid 6^ N-(12-trichloroaminododecyl)-acrylamide

1_ N- (pertrif luoracetylpolylysyl) -acrylamid 1_ N-(pertrifluoroacetylpolylysyl)-acrylamide

8 N-(3-trifluoracetylamidopropyl)-acrylamid gir 8 N-(3-trifluoroacetylamidopropyl)-acrylamide gives

1' 5'-dimethoxytrityl-5-(4-trikloracetylaminobuten-l-yl)-2'-deoxyuridin 1' 5'-dimethoxytrityl-5-(4-trichloroacetylaminobuten-1-yl)-2'-deoxyuridine

2' 5'-dimethoxytrityl-5-(6-trifluoracetylaminohexen-l-yl)-2'-deoxyuridin 2' 5'-dimethoxytrityl-5-(6-trifluoroacetylaminohexen-1-yl)-2'-deoxyuridine

3' 5 * -dimethoxytrityl-5- (3-trif luoracetylamino-2-methyl-propen-l-yl)-2<1->deoxyuridin 3' 5 * -dimethoxytrityl-5-(3-trifluoroacetylamino-2-methyl-propen-1-yl)-2<1->deoxyuridine

4_" 5' -dimethoxytrityl-5- [2- (4-trifluoracetylaminomethyl-fenyl)-ethen-l-yl]-2 *-deoxyuridin 4_" 5'-dimethoxytrityl-5-[2-(4-trifluoroacetylaminomethyl-phenyl)-ethen-1-yl]-2*-deoxyuridine

5<_>' 5' -dimethoxytrityl-5- (4-trifluoracetylamino-4-methyl-buten-l-yl)-2<1->deoxyuridin 5<_>' 5' -dimethoxytrityl-5-(4-trifluoroacetylamino-4-methyl-buten-1-yl)-2<1->deoxyuridine

6<*> 5'-dimethoxytrityl-5-[N-(12-trikloracetylaminododecyl)-1-acrylamino]-2<1->deoxyuridin 6<*> 5'-dimethoxytrityl-5-[N-(12-trichloroacetylaminododecyl)-1-acrylamino]-2<1->deoxyuridine

2' 5'-dimethoxytrityl-5-[N-(pertrifluoracetylpolylysyl)-1-acrylamido]-2 *-deoxyuridin 2' 5'-dimethoxytrityl-5-[N-(pertrifluoroacetylpolylysyl)-1-acrylamido]-2*-deoxyuridine

8' 5'-dimethoxytrityl-5-[N-(3-trikloracetylaminopropyl)-acrylamido]-2'-deoxyuridin 8' 5'-dimethoxytrityl-5-[N-(3-trichloroacetylaminopropyl)-acrylamido]-2'-deoxyuridine

Eksempel 6 Example 6

Ved å gjenta blokkei&ngsfremgangsmåten for 5'-hydroxylgruppen ifølge eksempel 3, men erstatte 5-(3-trifluoracetyl-aminopropenyl)-2'-deoxyuridin med de 5-substituerte-2'-deoxyuridiner nummerert 9_ til 18_ nedenunder, fåes produktene nummerert hhv. 9/ til 18</> nedenunder, dvs. innsetting av By repeating the blocking procedure for the 5'-hydroxyl group according to example 3, but replacing 5-(3-trifluoroacetyl-aminopropenyl)-2'-deoxyuridine with the 5-substituted-2'-deoxyuridines numbered 9_ to 18_ below, the products numbered respectively 9/ to 18</> below, i.e. insertion of

9 5-(propen-l-yl)-2'-deoxyuridin 9 5-(propen-1-yl)-2'-deoxyuridine

10 5-(carbmethoxyethyl)-2'-deoxyuridin 10 5-(carbmethoxyethyl)-2'-deoxyuridine

11 5-(3-carbmethoxyprop-l-yl)-2'-deoxyuridin 11 5-(3-carbmethoxyprop-1-yl)-2'-deoxyuridine

12 5-(4-carbmethoxy-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxyuridin 12 5-(4-carbmethoxy-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxyuridine

13 5-(3-cyanopropen-l-yl)-2'-deoxyuridin 13 5-(3-cyanopropen-1-yl)-2'-deoxyuridine

14 5-(4-cyano-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxyuridin 14 5-(4-cyano-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxyuridine

15 5-[2-(4-carbmethoxyfenyl)-ethen-l-yl]-2'-deoxyuridin 15 5-[2-(4-carbmethoxyphenyl)-ethen-1-yl]-2'-deoxyuridine

16 5-(4-acetoxybuten-l-yl)-2'-deoxyuridin 16 5-(4-acetoxybuten-1-yl)-2'-deoxyuridine

17 5-(4-acetoxybut-l-yl)-2'-deoxyuridin 17 5-(4-acetoxybut-1-yl)-2'-deoxyuridine

18 5-[4-(2,4-dinitrofenyl)-butyl]-2'-deoxyuridin gir de følgende 5'-dimethoxytrityl-5-alkyl-2'-deoxyuridiner 9/ 5<1->dimethoxytrityl-5-(propen-l-yl)-2'-deoxyuridin 18 5-[4-(2,4-dinitrophenyl)-butyl]-2'-deoxyuridine gives the following 5'-dimethoxytrityl-5-alkyl-2'-deoxyuridines 9/ 5<1->dimethoxytrityl-5-(propene -1-yl)-2'-deoxyuridine

10' 5'-dimethoxytrityl-5-(2-carbmethoxyethyl)-2'-deoxyuridin 10' 5'-dimethoxytrityl-5-(2-carbmethoxyethyl)-2'-deoxyuridine

11' 5'-dimethoxytrityl-5-(3-carbmethoxyprop-l-yl)-2'-deoxyuridin 11' 5'-dimethoxytrityl-5-(3-carbmethoxyprop-1-yl)-2'-deoxyuridine

12' 5'-dimethoxytrityl-5-(4-carbmethoxy-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxyuridin 12' 5'-dimethoxytrityl-5-(4-carbmethoxy-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxyuridine

13' 5'-dimethoxytrityl-5-(3-cyanopropen-l-yl)-2'-deoxyuridin 13' 5'-dimethoxytrityl-5-(3-cyanopropen-1-yl)-2'-deoxyuridine

14' 5'-dimethoxytrityl-5-(4-cyano-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxyuridin 14' 5'-dimethoxytrityl-5-(4-cyano-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxyuridine

15' 5'-dimethoxytrityl-5-[2-(4-carbmethoxyfenyl)-ethen-l-yl ] - 2 ' -deoxyuridin 15' 5'-dimethoxytrityl-5-[2-(4-carbmethoxyphenyl)-ethen-1-yl]-2'-deoxyuridine

16' 5'-dimethoxytrityl-5-(4-acetoxybuten-l-yl)-2'-deoxyuridin 16' 5'-dimethoxytrityl-5-(4-acetoxybuten-1-yl)-2'-deoxyuridine

17' 5'-dimethoxytrityl-5-(4-acetoxybut-l-yl)-2'-deoxyuridin 17' 5'-dimethoxytrityl-5-(4-acetoxybut-1-yl)-2'-deoxyuridine

18' 5'-dimethoxytrityl-5-[4-(2,4-dinitrofenyl)-butyl]-2'-deoxyuridin 18' 5'-dimethoxytrityl-5-[4-(2,4-dinitrophenyl)-butyl]-2'-deoxyuridine

Eksempel 7 Example 7

Gjentagelse av nucleosidforløpersyntesen og 5'-hydroxyl-blokkeringsfremgangsmåtene ifølge eksemplene 1 til 6, men erstatning av 5-klormercuri-2<1->deoxyuridin med 5-klormercuri-uridin, gir de tilsvarende 5<1->dimethoxytrityl-5-substituerte uridiner. Repeating the nucleoside precursor synthesis and 5'-hydroxyl blocking procedures of Examples 1 to 6, but replacing 5-chloromercuri-2<1->deoxyuridine with 5-chloromercuri-uridine, gives the corresponding 5<1->dimethoxytrityl-5-substituted uridines .

Eksemplene 8 til 11 illustrerer syntesen av modifiserte cytosinnucleosider. Ettersom cytosinnucleosider såvel som adenosinnucleosider, har reaktive grupper på sine baser som skiller seg fra uracilnucleosidene, blokkeres slike reaktive grupper for å forhindre uønskede reaksjoner med disse. Disse eksempler illustrerer blokkering av reaktive grupper på cyto-sinbaseresten slik som i reaksjon 1, såvel som blokkering av 5<1->hydroxylgruppen slik som i reaksjon 2. Examples 8 to 11 illustrate the synthesis of modified cytosine nucleosides. As cytosine nucleosides as well as adenosine nucleosides have reactive groups on their bases that differ from the uracil nucleosides, such reactive groups are blocked to prevent unwanted reactions with them. These examples illustrate blocking of reactive groups on the cytosine base residue as in reaction 1, as well as blocking of the 5<1->hydroxyl group as in reaction 2.

Eksempel 8 Example 8

5-( 3- trifluoracetylaminopropenyl)- N 4- benzoyl- 2'- deoxycytidin 5-( 3- trifluoroacetylaminopropenyl)- N 4- benzoyl- 2'- deoxycytidine

Gjentagelse av fremgangsmåten for nucleosidforløper-syntesen ifølge eksempel 1, men erstatning av 5-klormercuri-2<1->deoxyuridin med 5-klormercuri-2<1->deoxycytidin gir 5-(3-trifluoracetylaminopropenyl)-2'-deoxycytidin (UV /\ maks 287 nm). Renset 5-(3-trifluoracetylaminopropenyl)-2<1->deoxycytidin (1,3 g, 4,6 mmol) omrøres i 80 ml vannfri ethanol, benzoylanhydrid (1,5 g, 7 mmol) tilsettes, og reaksjonsblandingen kokes under tilbakeløp. Ytterligere fem 1,5 g store porsjoner benzoylanhydrid tilsettes hver time. Etter at reaksjonen bedømmes til å være fullstendig ved hjelp av Repeating the procedure for the nucleoside precursor synthesis according to Example 1, but replacing 5-chloromercury-2<1->deoxyuridine with 5-chloromercury-2<1->deoxycytidine gives 5-(3-trifluoroacetylaminopropenyl)-2'-deoxycytidine (UV /\ max 287 nm). Purified 5-(3-trifluoroacetylaminopropenyl)-2<1->deoxycytidine (1.3 g, 4.6 mmol) is stirred in 80 mL of anhydrous ethanol, benzoyl anhydride (1.5 g, 7 mmol) is added, and the reaction mixture is refluxed . A further five 1.5 g portions of benzoyl anhydride are added every hour. After the reaction is judged to be complete using

tynnskiktkromatografi (siliciumdioxydgelplater og eluering med n-butanol/methanol/konsentrert NH4OH/H20 (60:20:1:20)) thin-layer chromatography (silica gel plates and elution with n-butanol/methanol/concentrated NH4OH/H20 (60:20:1:20))

i 6 til 10 timer, avkjøles reaksjonsblandingen og oppkonsentreres under redusert trykk til et halvfast stoff. Det faste stoff tritureres med ether tre ganger, dekanteres og for 6 to 10 hours, the reaction mixture is cooled and concentrated under reduced pressure to a semi-solid. The solid is triturated with ether three times, decanted and

tørkes. Råproduktet utkrystalliseres fra vann hvorved det fåes kromatografisk rent N<4->benzoyl-5-(3-trifluoracetylamino-propenyl)-2'-deoxycytidin som et hvitt, fast stoff. Produktet dekomponerer over 120°C; UV A maks 311 nm. be dried. The crude product is crystallized from water whereby chromatographically pure N<4->benzoyl-5-(3-trifluoroacetylamino-propenyl)-2'-deoxycytidine is obtained as a white solid. The product decomposes above 120°C; UV A max 311 nm.

Eksempel 9 51-dimethoxytrityl-5-(3-trifluoracetylaminopropenyl)-N 4-benzoyl- 2'- deoxycytidin Example 9 51-dimethoxytrityl-5-(3-trifluoroacetylaminopropenyl)-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidine

Gjentagelse av fremgangsmåten for 5'-hydroxylmaskering ifølge eksempel 3, men erstatning av 5-(3-trifluoracetyl-aminopropenyl) -2 1 -deoxyuridin med 5-(3-trifluoracetylamino-propenyl)-N 4-benzoyl-21-deoxycytidin gir 5<1->dimethoxytrityl-5-(3-trifluoracetylaminopropenyl)-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidin. Repeating the procedure for 5'-hydroxyl masking according to Example 3, but replacing 5-(3-trifluoroacetyl-aminopropenyl)-2 1 -deoxyuridine with 5-(3-trifluoroacetylamino-propenyl)-N 4-benzoyl-21-deoxycytidine gives 5 <1->dimethoxytrityl-5-(3-trifluoroacetylaminopropenyl)-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidine.

Eksempel 10 Example 10

Gjentagelse av nucleosidforløpersyntesen og fremgangsmåten for 5'-hydroxylblokkering ifølge eksemplene 8 og 9, men erstatning av N-allyltrifluoracetamid med N-alkyltrifluor-acetamidene ifølge eksempel 5, gir de tilsvarende 5<1->dimethoxytrityl-5-(trifluoracety1)-aminoalky1)-N 4-benzoyl-2'-deoxy-cytidiner, dvs.: 5'-dimethoxytrityl-5-(4-trifluoracetylaminobuten-l-yl)-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidin Repeating the nucleoside precursor synthesis and the 5'-hydroxyl blocking procedure of Examples 8 and 9, but replacing N-allyltrifluoroacetamide with the N-alkyltrifluoroacetamides of Example 5, gives the corresponding 5<1->dimethoxytrityl-5-(trifluoroacety1)-aminoalkyl) -N 4-benzoyl-2'-deoxy-cytidines, ie: 5'-dimethoxytrityl-5-(4-trifluoroacetylaminobuten-1-yl)-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidine

5'-dimethoxytrityl-5-(6-trifluoracetylaminohexen-l-yl)-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidin 5'-dimethoxytrityl-5-(6-trifluoroacetylaminohexen-1-yl)-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidine

5'-dimethoxytrityl-5-(3-trifluoracetylamino-2-methylpropen)-l-yl)-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidin 5'-dimethoxytrityl-5-(3-trifluoroacetylamino-2-methylpropen)-1-yl)-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidine

5'-dimethoxytrityl-5-[2-(4-trifluoracetylaminomethylfenyl)-ethen-l-yl]-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidin 5'-dimethoxytrityl-5-[2-(4-trifluoroacetylaminomethylphenyl)-ethen-1-yl]-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidine

5'-dimethoxytrityl-5-(4-trifluoracetylamino-4-methylbuten-l-yl)-N 4-benzoyl-21-deoxycytidin 5'-dimethoxytrityl-5-(4-trifluoroacetylamino-4-methylbuten-1-yl)-N 4-benzoyl-21-deoxycytidine

5<1->dimethoxytrityl-5-[N-(12-trifluoracetylaminododecyl)-1-acrylamido]-N 4-benzoyl-21-deoxycytidin 5<1->dimethoxytrityl-5-[N-(12-trifluoroacetylaminododecyl)-1-acrylamido]-N 4-benzoyl-21-deoxycytidine

5'-dimethoxytrityl-5-[N-(pertrifluoracetylpolylysyl) -1-acrylamido]-N 4-benzoyl-21-deoxycytidin 5'-dimethoxytrityl-5-[N-(pertrifluoroacetylpolylysyl)-1-acrylamido]-N 4-benzoyl-21-deoxycytidine

Eksempel 11 Example 11

Syntese av 5'-dimethoxytrityl-N 4-benzoyl-5-(2-carbmethoxy-ethenyl) - 2' - deoxycytidin Synthesis of 5'-dimethoxytrityl-N 4-benzoyl-5-(2-carbmethoxy-ethenyl)-2'-deoxycytidine

5-(2-carbmethoxyethenyl)-2'-deoxycytidin (0,82 g, 5-(2-carbmethoxyethenyl)-2'-deoxycytidine (0.82 g,

2,6 mmol) omrøres i 50 ml vannfri ethanol. Benzosyreanhydrid (500 mg, 2,2 mmol) tilsettes, og reaksjonsblandingen opp- 2.6 mmol) is stirred in 50 ml of anhydrous ethanol. Benzoic anhydride (500 mg, 2.2 mmol) is added, and the reaction mixture

varmes inntil tilbakeløp. Ytterligere fem 500 mg store porsjoner benzosyreanhydrid tilsettes hver time. Etter at omsetningen bedømmes til å være fullstendig ved hjelp av tynnskiktskromatografi (vanligvis 6-8 timer), avkjøles reaksjonsblandingen og inndampes under redusert trykk til et gult, halvfast stoff. Kromatografering på siliciumdioxydgel ved eluering med en lineær 1:19 til 1:3 methanol/kloroform-blanding etterfulgt av fullstendig inndampning av passende blandede fraksjoner gir N 4-benzoyl-5-(2-carbmethoxyethenyl)-2 * -deoxycytidin som et amorft, hvitt, fast stoff. UV Amaks 296 nm, A • 270 nm. Det faste stoff tørkes grundig og oppløses i 20 ml pyridin. Dimethoxytritylklorid (1,1 ekvivalent) tilsettes, og reaksjonsblandingen omrøres ved omgivelsestemperatur i 6 timer. Oppkonsentrering til et fast stoff etterfulgt av kolonnekromatografering på siliciumdioxydgel ved eluering med 10% methanol i kloroform gir 5'-dimethoxytrityl-N 4-benzoyl-5-(2-carbmethoxyethenyl)-21-deoxycytidin som et dunaktig, gulhvitt, fast stoff. heated until reflux. A further five 500 mg portions of benzoic anhydride are added every hour. After the reaction is judged to be complete by thin layer chromatography (typically 6-8 hours), the reaction mixture is cooled and evaporated under reduced pressure to a yellow semi-solid. Chromatography on silica gel eluting with a linear 1:19 to 1:3 methanol/chloroform mixture followed by complete evaporation of appropriately mixed fractions gives N 4-benzoyl-5-(2-carbmethoxyethenyl)-2*-deoxycytidine as an amorphous, white solid. UV Amax 296 nm, A • 270 nm. The solid is thoroughly dried and dissolved in 20 ml of pyridine. Dimethoxytrityl chloride (1.1 equivalent) is added and the reaction mixture is stirred at ambient temperature for 6 hours. Concentration to a solid followed by column chromatography on silica gel eluting with 10% methanol in chloroform gives 5'-dimethoxytrityl-N 4-benzoyl-5-(2-carbmethoxyethenyl)-21-deoxycytidine as a fluffy, yellowish-white solid.

Eksempel 12 Example 12

Gjentagelse av fremgangsmåten for nucleosidforløper-syntese ifølge eksempel 11, men erstatning av 5-(2-carb-methoxyethenyl ) -2 * -deoxycytidin med de følgende forbindelser nummerert 19 til 27 nedenunder, gir de tilsvarende forbindelser nummerert hhv. 19_" til 27* nedenunder, dvs. innsetting av: Repeating the procedure for nucleoside precursor synthesis according to Example 11, but replacing 5-(2-carb-methoxyethenyl)-2*-deoxycytidine with the following compounds numbered 19 to 27 below, gives the corresponding compounds numbered respectively 19_" to 27* below, i.e. insertion of:

19 5-(2-carbmethoxyethyl)-2'-deoxycytidin 19 5-(2-carbmethoxyethyl)-2'-deoxycytidine

20 5-(3-carbmethoxyprop-l-yl)-2<1->deoxycytidin 20 5-(3-carbmethoxyprop-1-yl)-2<1->deoxycytidine

21 5-(4-carbmethoxy-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxycytidin 21 5-(4-carbmethoxy-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxycytidine

22 5-(3-cyanopropen-l-yl)-2<*->deoxycytidin 22 5-(3-cyanopropen-1-yl)-2<*->deoxycytidine

23 5-(4-cyano-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxycytidin 23 5-(4-cyano-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxycytidine

24 5-[2-(4-carbmethoxyfenyl)-ethen-l-yl]-2'-deoxycytidin 24 5-[2-(4-carbmethoxyphenyl)-ethen-1-yl]-2'-deoxycytidine

25 5-(4-acetoxybuten-l-yl)-2<1->deoxycytidin 25 5-(4-acetoxybuten-1-yl)-2<1->deoxycytidine

26 5-(4-acetoxybut-l-yl)-2<1->deoxycytidin 26 5-(4-acetoxybut-1-yl)-2<1->deoxycytidine

27 5-[4-(2,4-dinitrofenyl)-butyl]-2'-deoxycytidin gir de følgende 5'-dimethoxytrityl-N 4-benzoyl-5-alkyl-2'-deoxycytidiner: 19' 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(2-carbmethoxyethen-l-yl)-2'-deoxycytidin 27 5-[4-(2,4-dinitrophenyl)-butyl]-2'-deoxycytidine gives the following 5'-dimethoxytrityl-N 4-benzoyl-5-alkyl-2'-deoxycytidines: 19' 5'-DMT- N 4-benzoyl-5-(2-carbmethoxyethen-1-yl)-2'-deoxycytidine

20' 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-carbmethoxyprop-l-yl)-2 *-deoxycytidin 20' 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-carbmethoxyprop-1-yl)-2*-deoxycytidine

21' 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(4-carbmethoxy-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxycytidin 21' 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-(4-carbmethoxy-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxycytidine

22' 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(3-cyanopropen-l-yl)-2'-deoxycytidin 22' 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-(3-cyanopropen-1-yl)-2'-deoxycytidine

23' 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(4-cyano-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxycytidin 23' 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-(4-cyano-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxycytidine

24' 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-[2-(4-carbmethoxyfenyl)-ethen-l-yl]-2'-deoxycytidin 24' 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-[2-(4-carbmethoxyphenyl)-ethen-1-yl]-2'-deoxycytidine

25' 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(4-acetoxybuten-l-yl)-2'-deoxycytidin 25' 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(4-acetoxybuten-1-yl)-2'-deoxycytidine

26' 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(4-acetoxybut-l-yl)-2'-deoxycytidin 26' 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-(4-acetoxybut-1-yl)-2'-deoxycytidine

_27' 5' -DMT-N4-benzoyl-5- [4- (2,4-dinitrof enyl) -butyl]-2'-deoxycytidin _27' 5'-DMT-N4-benzoyl-5-[4-(2,4-dinitroenyl)-butyl]-2'-deoxycytidine

På samme måte gir bruken av de andre syreanhydridene, f.eks. eddiksyreanhydrid, anisoylanhydrid eller tolyl-anhydrid, de tilsvarende N 4 -acyl- eller N 4-acetyl-5-alkyl-2'-deoxycytidiner ifølge eksemplene 10 og 11 hvor benzoyl er erstattet med acetyl eller acyl. Similarly, the use of the other acid anhydrides, e.g. acetic anhydride, anisoyl anhydride or tolyl anhydride, the corresponding N 4 -acyl- or N 4-acetyl-5-alkyl-2'-deoxycytidines according to examples 10 and 11 where benzoyl is replaced by acetyl or acyl.

Eksempel 13 Example 13

Gjentagelse av fremgangsmåtene for nucleosidforløper-syntese og 5'-hydroxylblokkering ifølge eksempel 8 til 10, men erstatning av 5-klormercuri-2'-deoxycytidin med 5-klor-mercuricytidin, gir de tilsvarende 5'-dimethoxytrityl-N 4-benzoyl-5-substituerte cytidiner. Repeating the procedures for nucleoside precursor synthesis and 5'-hydroxyl blocking according to Examples 8 to 10, but replacing 5-chloromercuri-2'-deoxycytidine with 5-chloromercuricytidine, gives the corresponding 5'-dimethoxytrityl-N 4-benzoyl-5 -substituted cytidines.

Eksempel 14 Example 14

Dette er et typisk eksempel på blokkeringen av reaktive baserester og blokkeringen av 5'-hydroxyl i adeninnucleo-sider. This is a typical example of the blocking of reactive base residues and the blocking of 5'-hydroxyl in adenine nucleosides.

N -benzoyl-8- (6-aminohexyl) -amino-2 '-deoxyadenosin N -benzoyl-8-(6-aminohexyl)-amino-2'-deoxyadenosine

(4 mmol) omrøres i 60 ml vannfri ethanol. Trifluoreddiksyreanhydrid (6 mmol) tilsettes, og reaksjonsblandingen omrøres ved værelsetemperatur. To ytterligere porsjoner trifluoreddiksyreanhydrid tilsettes hver time. Etter 4 timer oppkonsentreres reaksjonsblandingen til en fast rest, og det lyofiliseres over natten. Det rå N -benzoyl-8-(6-trifluor-acety laminohexyl)-amino-2'-deoxyadenosin tørkes grundig og oppkonsentreres til en fast rest to ganger fra pyridin. Det faste stoff omrøres i 40 ml pyridin, og dimethoxytritylklorid (6,5 mmol) tilsettes. Etter 4 timer oppkonsentreres reaksjonsblandingen hvorved det fåes en fast rest. Rensning ved hjelp av kolonnekromatografering på siliciumdioxydgel ved eluering med en flertrinnsgradient på 0 til 15% methanol i kloroform gir 5'-dimethoxytrityl-N -benzoyl-8-(6-trifluor-acetylaminohexyl)-amino-2'-deoxyadenosin som et gulhvitt, fast stoff. (4 mmol) is stirred in 60 ml of anhydrous ethanol. Trifluoroacetic anhydride (6 mmol) is added, and the reaction mixture is stirred at room temperature. Two additional portions of trifluoroacetic anhydride are added every hour. After 4 hours, the reaction mixture is concentrated to a solid residue, and it is lyophilized overnight. The crude N -benzoyl-8-(6-trifluoro-acety laminohexyl)-amino-2'-deoxyadenosine is thoroughly dried and concentrated to a solid residue twice from pyridine. The solid is stirred in 40 ml of pyridine, and dimethoxytrityl chloride (6.5 mmol) is added. After 4 hours, the reaction mixture is concentrated, whereby a solid residue is obtained. Purification by column chromatography on silica gel eluting with a multistep gradient of 0 to 15% methanol in chloroform affords 5'-dimethoxytrityl-N-benzoyl-8-(6-trifluoroacetylaminohexyl)-amino-2'-deoxyadenosine as a yellow-white, solid.

Eksemplene 15 til 17 er typiske for aktiveringen av 5'-blokkerbe 5-substituerte og naturlig forekommende nucleosider, til deres respektive fosfomonokloriditter, slik som illustrert i reaksjon 3 i skjemaet. Examples 15 to 17 are typical of the activation of 5'-blockerbe 5-substituted and naturally occurring nucleosides, to their respective phosphomonochloridites, as illustrated in reaction 3 of the scheme.

Eksempel 15 Example 15

Fremstilling av 3'-fosfomonokloriditt av 5 *-DMT-5-(3-tri-fluoracetylaminoprop- l- yl)- 2'- deoxyuridin . Preparation of 3'-phosphomonochloridite from 5*-DMT-5-(3-tri-fluoroacetylaminopropyl-1-yl)-2'-deoxyuridine.

Tørt 5'-DMT-5-(3-trifluoracetylaminoprop-l-yl)-2'-deoxyuridin (1,54 g, 2,2 mmol) lyofiliseres fra 20 ml benzen tre ganger i mer enn 12 timer hver for å fjerne restvann og faste stoffer. Det resulterende svært dunaktige hvite pulver overføres til en nitrogenatmosfære mens det fortsatt er under vakuum og oppløses i vannfri acetonitril som inneholder 5 volum% 2,6-lutidin inntil en sluttkonsentrasjon for nucle-sid på 30 mM. Mens det hvirvles kraftig under nitrogen tilsettes en stor klump methylfosfodikloriditt (1,0 ekvivalent) hurtig ved hjelp av en sprøyte. Reaksjonsblandingen hvirvles i ca. 1 minutt under nitrogen. Den resulterende rå reak-sjonsoppløsning av 5<*->DMT-5-(3-trifluoracetylaminoprop-l-yl)-2<1->deoxyuridin-3'-methylfosfomonokloriditt brukes deretter direkte til deoxyoligonucleotidsyntese (eksempel 18) uten noen ytterligere rensning, [ 31P-NMR(CH^CN/CDCl^) indikerer vanligvis 40-70 mol% av det ønskede produkt (167,5 ppm); Dry 5'-DMT-5-(3-trifluoroacetylaminoprop-1-yl)-2'-deoxyuridine (1.54 g, 2.2 mmol) is lyophilized from 20 mL of benzene three times over 12 h each to remove residual water and solids. The resulting very fluffy white powder is transferred to a nitrogen atmosphere while still under vacuum and dissolved in anhydrous acetonitrile containing 5% by volume of 2,6-lutidine to a final concentration of the nucleoside of 30 mM. While vigorously swirling under nitrogen, a large lump of methylphosphodichloridite (1.0 equivalent) is quickly added using a syringe. The reaction mixture is swirled for approx. 1 minute under nitrogen. The resulting crude reaction solution of 5<*->DMT-5-(3-trifluoroacetylaminoprop-1-yl)-2<1->deoxyuridine-3'-methylphosphomonochloridite is then used directly for deoxyoligonucleotide synthesis (Example 18) without any further purification , [ 31 P-NMR(CH^CN/CDCl^) usually indicates 40-70 mol% of the desired product (167.5 ppm);

det gjenværende er sammensatt av bis-3',31 -[5'-DMT-5-(3-trifluoracetylaminoprop-l-yl)-2'-deoxyuridylyl]-methylfosfitt (140 ppm) og 5'-DMT-5-(3-trifluoracetylaminoprop-l-yl)-2'-deoxyuridin-3<1->methylfosfonat (9,5 ppm), idet det sistnevnte produkt dannes i mengder som gjenspeiler tilstedeværelsen av vann i reaksjonsblandingen.] the remainder is composed of bis-3',31-[5'-DMT-5-(3-trifluoroacetylaminoprop-1-yl)-2'-deoxyuridylyl]-methylphosphite (140 ppm) and 5'-DMT-5-( 3-trifluoroacetylaminoprop-1-yl)-2'-deoxyuridine-3<1->methylphosphonate (9.5 ppm), the latter product being formed in amounts reflecting the presence of water in the reaction mixture.]

Eksempel 16 Example 16

Fremstilling av 3'-fosfomonokloriditter av de naturlig forekommende 2' - deoxynucleosider Preparation of 3'-phosphomonochloridites from the naturally occurring 2'-deoxynucleosides

Gjentagelse av fremgangsmåten ifølge eksempel 15, men erstatning av 5'-DMT-5-(3-trifluoracetylaminoprop-l-yl)-21 - deoxyuridin med: Repeating the procedure according to example 15, but replacing 5'-DMT-5-(3-trifluoroacetylaminoprop-1-yl)-21-deoxyuridine with:

5<1->DMT-2'-deoxythymidin 5<1->DMT-2'-deoxythymidine

5'-DMT-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidin 5'-DMT-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidine

5'-DMT-N c-benzoyl-21-deoxyadenosin 5'-DMT-N c -benzoyl-21-deoxyadenosine

5'-DMT-N 2-isobutyryl-2'-deoxyguanosin 5'-DMT-N 2-isobutyryl-2'-deoxyguanosine

gir de tilsvarende fosfomonokloriditter, dvs.: 5<1->DMT-2'-deoxythymidin-3'-methylfosfomonokloriditt 5'-DMT-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidin-3'-methylfosfomonokloriditt gives the corresponding phosphomonochloridites, i.e.: 5<1->DMT-2'-deoxythymidine-3'-methylphosphomonochloridite 5'-DMT-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidine-3'-methylphosphomonochloridite

5'-DMT-N -benzoyl-2'-deoxyadenosin-31-methylfosfomonokloriditt 5'-DMT-N-benzoyl-2'-deoxyadenosine-31-methylphosphomonochloridite

5'-DMT-N 2-isobutyryl-2'-deoxyguanosin-3'-methylfosfomonokloriditt 5'-DMT-N 2-isobutyryl-2'-deoxyguanosine-3'-methylphosphomonochloridite

Eksempel 17 Example 17

Gjentagelse av fremgangsmåtene for fosfomonokloriditt-syntesen ifølge eksempel 15 og 16, men erstatning av methylfosfodikloriditt med o-klorfenylfosfodikloriditt, gir de tilsvarende 5'-DMT-nucleosid-3'-fosfomonokloriditter, dvs.: 5'-DMT-5-(3-trifluoracetylaminopropyl)-2'-deoxyuridin-3'-o-klorfenylfosfomonokloriditt 5'-DMT-2 *-deoxythymidin-3'-o-klorfenylfosfomonokloriditt 5'-DMT-N 4-benzoyl-21-deoxycytidin-31-o-klorfenylfosfono-monokloriditt Repeating the procedures for the phosphomonochloridite synthesis according to Examples 15 and 16, but replacing methylphosphodichloridite with o-chlorophenylphosphodichloridite, gives the corresponding 5'-DMT-nucleoside-3'-phosphomonochloridites, i.e.: 5'-DMT-5-(3- trifluoroacetylaminopropyl)-2'-deoxyuridine-3'-o-chlorophenylphosphomonochloridite 5'-DMT-2 *-deoxythymidine-3'-o-chlorophenylphosphomonochloridite 5'-DMT-N 4-benzoyl-21-deoxycytidine-31-o-chlorophenylphosphono- monochloridite

51-DMT-N -benzoyl-2'-deoxyadenosin-3'-o-klorfenylfosfono-monokloriditt 51-DMT-N -benzoyl-2'-deoxyadenosine-3'-o-chlorophenylphosphono-monochloridite

51-DMT-N 2-isobutyryl-2'-deoxyguanosin-31-o-klorfenylfosfono-monokloriditt 51-DMT-N 2-isobutyryl-2'-deoxyguanosine-31-o-chlorophenylphosphono-monochloridite

På samme måte gir bruken av p-klorfenylfosfodikloriditt de analoge 3<1->p-klorfenylfosfomonokloridittaddukter. Similarly, the use of p-chlorophenylphosphodichloridite gives the analogous 3<1->p-chlorophenylphosphomonochloridite adducts.

[<32>P]NMR (CH3CNCDC13) av o-klorfenylfosfomonokloriditt-produkter 160,7, 160,5 ppm (diastereomerer). [<32>P]NMR (CH3CNCDC13) of o-chlorophenylphosphomonochloridite products 160.7, 160.5 ppm (diastereomers).

Eksempel 18 til 24 er typiske for den kjemiske syntese av oligonucleotider som omfatter modifiserte baser slik som illustrert ved reaksjon 4 og 5 i skjemaet. Examples 18 to 24 are typical of the chemical synthesis of oligonucleotides comprising modified bases as illustrated by reactions 4 and 5 in the scheme.

Eksempel 18 Example 18

Syntese av deoxyoligonucleotider som inneholder 5-(3-amino-propyl)- uracil og naturlig forekommende nucleotidenheter Synthesis of deoxyoligonucleotides containing 5-(3-amino-propyl)-uracil and naturally occurring nucleotide units

Fremgangsmåtene for fosfomonokloridittsyntese ifølge eksempel 15 og 16 utføres umiddelbart før deoxyoligonucleotidsyntesen, og de resulterende produkter brukes direkte som 30 mM rå 3<1->methylfosfomonokloriditter i vannfri acetonitril/5 volum% 2,6-lutidin. The phosphomonochloridite synthesis procedures of Examples 15 and 16 are carried out immediately prior to the deoxyoligonucleotide synthesis, and the resulting products are used directly as 30 mM crude 3<1->methylphosphomonochloridites in anhydrous acetonitrile/5 vol% 2,6-lutidine.

Fast bærer (5-DMT-N^-benzoyl-2'-deoxyadenosin-3<1->succinamidpropyl-siliciumdioxyd, 250 mg, 20y.uekv.) plasseres 1 et egnet kar for reaksjonsgjennomstrømning (glass- eller (Po Solid carrier (5-DMT-N^-benzoyl-2'-deoxyadenosine-3<1->succinamidepropyl-silicon dioxide, 250 mg, 20y.equiv.) is placed in a suitable vessel for reaction flow (glass or (Po

Teflon^-kolonne eller -trakt). Den faste bærer bringes i passende stand på forhånd ved hjelp av på hverandre følgende behandlinger med acetonitril/5 volum% lutidin, 2 vekt/volum% jod i tetrahydrofuran/vann/lutidin i 2 minutter, acetonitril/5 % lutidin, kloroform, 4 volum% dikloreddiksyre i kloroform i 2,5 minutter og acetonitril/5% lutidin, idet behandlingene utgjøres av totale volumer på 5-15 ml i enten 2 eller 3 porsjoner eller ved konstant gjennomstrømning, ettersom det ønskes. Teflon^ column or funnel). The solid support is conditioned beforehand by successive treatments with acetonitrile/5% by volume lutidine, 2% w/v iodine in tetrahydrofuran/water/lutidine for 2 minutes, acetonitrile/5% lutidine, chloroform, 4% by volume % dichloroacetic acid in chloroform for 2.5 minutes and acetonitrile/5% lutidine, the treatments being total volumes of 5-15 ml in either 2 or 3 portions or by constant flow, as desired.

Deoxyoligonucleotidet syntetiseres i henhold til reaksjon 4 ved fortløpende tilsetning av den ønskede aktiverte 5'-DMT-nucleosid-3'-methylfosfomonokloridittmonomeren og sammenkobling av denne med den frie 5'-hydroxylgruppe i ende-enheten i den voksende nucleotidkjede, hvilken enhet opp-rinnelig er den eneste enhet i kjeden, dvs. den debxy-adenosinbaserte enhet som omfatter den faste bærer. Tilset-ningene skjer ved omsetning av 10 ml av de rå 30 mM mono-kloriditter valgt fra eksempel 15 og 16 med den nå ikke beskyttede 5<1->hydroxylgruppe i kjeden enten i 2 eller 3 porsjoner eller ved konstant gjennomstrømning i 2 til 6 minutter. Den første fosfomonokloriditt-tilsetning etterfulgt av en fullstendig reagenssyklus består av fortløpende behandlinger med: 5-DMT-5-(3-trifluoracetylaminopropyl)-2'-deoxyuridin-3'-methylfosfomonokloriditt The deoxyoligonucleotide is synthesized according to reaction 4 by successive addition of the desired activated 5'-DMT nucleoside-3'-methylphosphomonochloridite monomer and linking this with the free 5'-hydroxyl group in the end unit of the growing nucleotide chain, which unit originally is the only unit in the chain, i.e. the debxy-adenosine-based unit comprising the fixed support. The additions take place by reaction of 10 ml of the crude 30 mM monochloridites selected from examples 15 and 16 with the now unprotected 5<1->hydroxyl group in the chain either in 2 or 3 portions or by constant flow through for 2 to 6 minutes. The first phosphomonochloridite addition followed by a complete reagent cycle consists of consecutive treatments with: 5-DMT-5-(3-trifluoroacetylaminopropyl)-2'-deoxyuridine-3'-methylphosphomonochloridite

acetonitril/lutidin-vask acetonitrile/lutidine wash

"capping" i 5 minutter med 0,3M 4-dimethylaminopyridin i eddiksyreanhydrid/lutidin/tetrahydrofuran (1:3:2) acetonitril/5% lutidin-vask "capping" for 5 minutes with 0.3M 4-dimethylaminopyridine in acetic anhydride/lutidine/tetrahydrofuran (1:3:2) acetonitrile/5% lutidine wash

oxydasjon med 2% jod i tetrahydrofuran/vann/lutidin (6:2:1) oxidation with 2% iodine in tetrahydrofuran/water/lutidine (6:2:1)

i 2 minutter for 2 minutes

acetonitril/5% lutidin-vask acetonitrile/5% lutidine wash

kloro form-va sk chloro form-va sk

fjerning av DMT ved 2,5 minutters behandling med 4 volum% dikloreddiksyre i kloroform removal of DMT by 2.5 minute treatment with 4 vol% dichloroacetic acid in chloroform

kloroform-vask chloroform wash

acetonitril/lutidin-vask acetonitrile/lutidine wash

Den trinnvise fremgangsmåte ovenfor gjentaes 13 ganger, hver gang ved å erstatte 5<1->DMT-5-(3-trifluoracetylamino-propyl) -21-deoxyuridin-31-methylfosfomonokloriditt med et annet av de følgende 3'-methylfosfomonokloriditter: 5'-DMT-2<1->deoxythymidin-3<1->methylfosfomonokloriditt 51-DMT-5-(3-trifluoracetylaminopropyl)-21-deoxyuridin-31 - methylfosfomonokloriditt The stepwise procedure above is repeated 13 times, each time replacing 5<1->DMT-5-(3-trifluoroacetylamino-propyl)-21-deoxyuridine-31-methylphosphomonochloridite with another of the following 3'-methylphosphomonochloridites: 5' -DMT-2<1->deoxythymidine-3<1->methylphosphomonochloridite 51-DMT-5-(3-trifluoroacetylaminopropyl)-21-deoxyuridine-31 - methylphosphomonochloridite

51-DMT-N g-benzoyl-2'-deoxyadenosin-31-methylfosfomonokloriditt 51-DMT-N g-benzoyl-2'-deoxyadenosine-31-methylphosphomonochloridite

5'-DMT-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidin-31-methylfosfomonokloriditt 5'-DMT-N 4-benzoyl-2'-deoxycytidine-31-methylphosphomonochloridite

51-DMT-N 2-isobutyryl-21-deoxyguanosin-3'-methylfosfomonokloriditt 51-DMT-N 2-isobutyryl-21-deoxyguanosine-3'-methylphosphomonochloridite

51-DMT-5-(3-trifluoracetylaminopropyl)-2'-deoxyuridin-31 - methylfosfomonokloriditt 51-DMT-5-(3-trifluoroacetylaminopropyl)-2'-deoxyuridine-31-methylphosphomonochloridite

5'-DMT-2'-deoxythymidin-3 *-methylfosfomonokloriditt 5'-DMT-5-(3-trifluoracetylaminopropyl)-2'-deoxyuridin-3'-methylfosfomonokloriditt 5'-DMT-2'-deoxythymidine-3*-methylphosphomonochloridite 5'-DMT-5-(3-trifluoroacetylaminopropyl)-2'-deoxyuridine-3'-methylphosphomonochloridite

5'-DMT-deoxythymidin-3'-methylfosfomonokloriditt 5'-DMT-5-(3-trifluoracetylaminopropyl)-2'-deoxyuridin-3'-methylfosfomonokloriditt 5'-DMT-deoxythymidine-3'-methylphosphomonochloridite 5'-DMT-5-(3-trifluoroacetylaminopropyl)-2'-deoxyuridine-3'-methylphosphomonochloridite

5'-DMT-N~ o-isobutyryl-2'-deoxyguanosin-3'-methylfosfomonokloriditt 5'-DMT-N~o-isobutyryl-2'-deoxyguanosine-3'-methylphosphomonochloridite

5'-DMT-N -benzoyl-2'-deoxyadenosin-3'-methylfosfomonokloriditt 5'-DMT-N-benzoyl-2'-deoxyadenosine-3'-methylphosphomonochloridite

5'-DMT-N 4-benzoyl-2 *-deoxycytidin-3'-methylfosfomonokloriditt 5'-DMT-N 4-benzoyl-2*-deoxycytidine-3'-methylphosphomonochloridite

i respektiv rekkefølge, idet man utelot dikloreddiksyrebehand-ling under den siste reagenssyklus. Bæreren overføres og behandles med 2 ml konsentrert ammoniumhydroxyd i 4 timer ved omgivelsestemperatur for å frigjøre produktet fra bæreren. Supernatanten fjernes, det faste stoff vaskes tre ganger med 0,5 ml konsentrert ammoniumhydroxyd, og de blandede super-natanter lukkes inne og oppvarmes ved 50°C over natten. Den klare, gule supernatant lyofiliseres grundig. Den første rensing utføres ved hjelp av reversfase høytrykksvæskekromato-grafi (HPLC) på en "RP-8 (C-8)"-kolonne ved eluering med en 60 minutters lineær gradient på 0 til 30 volum% acetonitril i in respective order, omitting dichloroacetic acid treatment during the last reagent cycle. The support is transferred and treated with 2 ml of concentrated ammonium hydroxide for 4 hours at ambient temperature to release the product from the support. The supernatant is removed, the solid is washed three times with 0.5 ml of concentrated ammonium hydroxide, and the mixed supernatants are sealed and heated at 50°C overnight. The clear, yellow supernatant is thoroughly lyophilized. The first purification is performed by reverse phase high pressure liquid chromatography (HPLC) on an "RP-8 (C-8)" column eluting with a 60 minute linear gradient of 0 to 30% by volume acetonitrile in

25 mM ammoniumacetat, pH 6,8. Det 5<1->DMT-avsluttede produkt som eluerer som en skarp topp ved ca. 40 minutter, samles opp; alle kortere kjeder, både beskyttede og ubeskyttede, eluerer før 25 minutter. Det oppsamlede produkt inndampes til en fast rest, behandles med 80% eddiksyre ved omgivelsestemperatur i 20 minutter (for å fjerne DMT), lyofiliseres til en fast rest og oppløses i en liten mengde vandig buffer. Produktet som vanligvis er mer enn 90% homogent etter HPLC, renses ytterligere ved hjelp av vanlig elektroforese på 20% polyacrylamidgeler (1 til 6 mm tykk) ved utskjæring og eks- 25 mM ammonium acetate, pH 6.8. The 5<1->DMT-terminated product eluting as a sharp peak at ca. 40 minutes, collected; all shorter chains, both protected and unprotected, elute before 25 minutes. The collected product is evaporated to a solid residue, treated with 80% acetic acid at ambient temperature for 20 minutes (to remove DMT), lyophilized to a solid residue and dissolved in a small amount of aqueous buffer. The product, which is usually more than 90% homogeneous by HPLC, is further purified by conventional electrophoresis on 20% polyacrylamide gels (1 to 6 mm thick) by excision and ex-

straksjon av vedkommende produktbånd (produktet forflytter seg vanligvis saktere enn ikke-modifiserte deoxyoligonucleotider av lik lengde). Det rensede 5-aminopropyl-ureacil-holdige pentadecadeoxyoligonucleotidprodukt illustrert skjematisk nedenunder, hvor = 5-(3-aminopropyl)-uracil, fremstilles på denne måte. stretching of the relevant product band (the product usually moves more slowly than unmodified deoxyoligonucleotides of equal length). The purified 5-aminopropyl-ureacil-containing pentadecadeoxyoligonucleotide product illustrated schematically below, where = 5-(3-aminopropyl)-uracil, is prepared in this manner.

Legg merke til at den vanlige fjerning av beskyttelsesgruppe fra oligonucleotidet med ammoniakk også har fjernet den tri-fluoracetylblokkerende gruppe på substituenten. Note that the usual deprotection of the oligonucleotide with ammonia has also removed the trifluoroacetyl blocking group on the substituent.

Lengden av og sekvensen til dette oligonucleotid kan så The length and sequence of this oligonucleotide can then

32 32

bestemmes ved hjelp av P-kinasebehandling og sekvensering ved å bruke egnede fremgangsmåter, f.eks. fremgangsmåtene som hittil har vært brukt til å bestemme lengden av og sekvensen til de tidligere kjente oligonucleotider hvor basene til nucleotidenhetene ikke er modifiserte. determined by P-kinase treatment and sequencing using suitable methods, e.g. the methods which have hitherto been used to determine the length and sequence of the previously known oligonucleotides where the bases of the nucleotide units are not modified.

Likeledes gir tilsiktet variasjon i rekkefølgen og antallet av methylfosfomonokloriditt-tilsetninger som anvendes, andre 5-(modifiserte) uracil-holdige deoxyoligonucleotider som varierer i valgt lengde og baserekkefølge. Dertil gir erstatning av nucleosid-3<1->methylfosfomonokloriditt-adduktene ifølge eksempel 15 og 16 med de tilsvarende 3'-o-eller p-klorfenylfosfomonokloridittadduktene ifølge eksempel 17 og innlemming av pyridiniumoximatbehandling for å fjerne klorfenylblokkerende grupper (ved slutten av deoxyoligonucleotidsyntesen og før behandling med konsentrert ammoniumhydroxyd) de samme deoxyoligonucleotidprodukter. Likewise, deliberate variation in the order and number of methylphosphomonochloridite additions used provides other 5-(modified) uracil-containing deoxyoligonucleotides that vary in chosen length and base order. In addition, replacing the nucleoside 3<1->methylphosphomonochloridite adducts according to examples 15 and 16 with the corresponding 3'-o- or p-chlorophenylphosphomonochloridite adducts according to example 17 and incorporating pyridinium oximate treatment to remove chlorophenyl blocking groups (at the end of the deoxyoligonucleotide synthesis and before treatment with concentrated ammonium hydroxide) the same deoxyoligonucleotide products.

Eksempel 19 Example 19

Gjentagelse av fremgangsmåtene for fosfomonokloriditt-og deoxyoligonucleotidsyntesen ifølge eksempel 15 til 18, men erstatning av 5'-DMT-5-(3-trifluoracetylaminopropyl)-2'-deoxyuridin med 5 '-DMT-5-alkyl-2'-deoxyuridinene nummerert 28_ til 36, gir de tilsvarende oligonucleotider med uracilbaser U111 nummerert hhv. 2_8' til 3_6* nedenunder, dvs. innsetting av: 28 5 *-dimethoxytrityl-5-(3-trifluoracetylaminopropen-l-yl)-deoxyuridin 29 51-dimethoxytrityl-5-(4-trifluoracetylaminobut-l-yl)-21 - deoxyuridin 30 5'-dimethoxytrityl-5-(4-trifluoracetylaminobuten-l-yl)-2'-deoxyuridin 31 5<1->dimethoxytrityl-5-(6-trifluoracetylaminohex-l-yl)-2<1->deoxyuridin 32 5<1->dimethoxytrityl-5-(6-trifluoracetylaminohexen-l-yl)-2'-deoxyuridin 33 5'-dimethoxytrityl-5-(2-trifluoracetylaminoprop-2-yl)-2<1->deoxyuridin 34 5<1->dimethoxytrityl-5-(3-trifluoracetylamino-2-methyl-propen-l-yl)-2<1->deoxyuridin 35 5<1->dimethoxytrityl-5-(3-trifluoracetylamino-2-methyl-prop-l-yl)-2<1->deoxyuridin 36 5<1->dimethoxytrityl-5-[2-(4-trifluoracetylaminomethyl-fenyl)-ethen-l-yl]-2'-deoxyuridin 37 5<1->dimethoxytrityl-5-[N-(pertrifluoracetylpolylysyl)-1-acrylamido]-2<1->deoxyuridin 38 5 *-DMT-5-[N-(7-trifluoracetylaminoheptyl)-1-acrylamido]-2'-deoxyuridin Repetition of the procedures for the phosphomonochloridite and deoxyoligonucleotide synthesis according to examples 15 to 18, but replacing 5'-DMT-5-(3-trifluoroacetylaminopropyl)-2'-deoxyuridine with the 5'-DMT-5-alkyl-2'-deoxyuridines numbered 28_ to 36, they give the corresponding oligonucleotides with uracil bases U111 numbered respectively. 2_8' to 3_6* below, i.e. insertion of: 28 5 *-dimethoxytrityl-5-(3-trifluoroacetylaminopropen-1-yl)-deoxyuridine 29 51-dimethoxytrityl-5-(4-trifluoroacetylaminobut-1-yl)-21 - deoxyuridine 30 5'-dimethoxytrityl-5-(4-trifluoroacetylaminobuten-1-yl)-2'-deoxyuridine 31 5<1->dimethoxytrityl-5-(6-trifluoroacetylaminohex-1-yl)-2<1->deoxyuridine 32 5<1->dimethoxytrityl-5-(6-trifluoroacetylaminohexen-1-yl)-2'-deoxyuridine 33 5'-dimethoxytrityl-5-(2-trifluoroacetylaminoprop-2-yl)-2<1->deoxyuridine 34 5< 1->dimethoxytrityl-5-(3-trifluoroacetylamino-2-methyl-propen-l-yl)-2<1->deoxyuridine 35 5<1->dimethoxytrityl-5-(3-trifluoroacetylamino-2-methyl-prop- 1-yl)-2<1->deoxyuridine 36 5<1->dimethoxytrityl-5-[2-(4-trifluoroacetylaminomethyl-phenyl)-ethen-1-yl]-2'-deoxyuridine 37 5<1->dimethoxytrityl -5-[N-(pertrifluoroacetylpolylysyl)-1-acrylamido]-2<1->deoxyuridine 38 5 *-DMT-5-[N-(7-trifluoroacetylaminoheptyl)-1-acrylamido]-2'-deoxyuridine

gir deoxynucleotidene som svarer til produktet ifølge eksempel 18, hvor Um er: gives the deoxynucleotides corresponding to the product of Example 18, where Um is:

28' 5-(3-aminopropen-l-yl)-uracil 28' 5-(3-aminopropen-1-yl)-uracil

29' 5-(4-aminobut-l-yl)-uracil 29' 5-(4-aminobut-1-yl)-uracil

30' 5-(4-aminobuten-l-yl)-uracil 30' 5-(4-aminobuten-1-yl)-uracil

31' 5-(6-aminohex-l-yl)-uracil 31' 5-(6-aminohex-1-yl)-uracil

32' 5-(6-arainohexen-l-yl)-uracil 32' 5-(6-arainohexen-1-yl)-uracil

33' 5-(3-aminoprop-2-yl)-uracil 33' 5-(3-aminoprop-2-yl)-uracil

34' 5-(3-amino-2-methylpropen-l-yl)-uracil 34' 5-(3-amino-2-methylpropen-1-yl)-uracil

35' 5-(3-amino-2-methylprop-l-yl)-uracil 35' 5-(3-amino-2-methylprop-1-yl)-uracil

36' 5-[2-(4-aminoethylfenyl)-ethen-l-yl]-uracil 37' 5-[N-(polylysyl)-1-acrylaraido]-uracil 36' 5-[2-(4-aminoethylphenyl)-ethen-1-yl]-uracil 37' 5-[N-(polylysyl)-1-acrylaraido]-uracil

38' 5-[N-(7-aminoheptyl)-1-acrylamido]-uracil 38' 5-[N-(7-aminoheptyl)-1-acrylamido]-uracil

Ved å anvende andre 5'-DMT-5-(acylaminoalkyl)-2'-deoxyuridiner fremstilles likeledes de analoge deoxyoligonucleotider. By using other 5'-DMT-5-(acylaminoalkyl)-2'-deoxyuridines, the analogous deoxyoligonucleotides are likewise prepared.

Eksempel 20 Example 20

Gjentagelse av fremgangsmåtene for fosfomonokloriditt-og deoxyoligonucleotidsyntese ifølge eksempel 15 til 18, men erstatning av 5'-DMT-5-(3-acetylaminopropyl)-2'-deoxyuridin med 5-substituerte 2'-deoxyuridiner nummerert 3_7 til 4_6 nedenunder, gir de tilsvarende oligonucleotider med Um-ura-cilbasene nummerert hhv. 37' til 4_6', dvs. innsetting av: Repeating the procedures for phosphomonochloridite and deoxyoligonucleotide synthesis of Examples 15 to 18, but replacing 5'-DMT-5-(3-acetylaminopropyl)-2'-deoxyuridine with 5-substituted 2'-deoxyuridines numbered 3_7 to 4_6 below, gives the corresponding oligonucleotides with the Um-ura-cil bases numbered respectively. 37' to 4_6', i.e. insertion of:

37 5'-DMT-5-(propen-l-yl)-2'-deoxyuridin 37 5'-DMT-5-(propen-1-yl)-2'-deoxyuridine

38 5'-DMT-5-(2-carbmethoxyethyl)-2'-deoxyuridin 38 5'-DMT-5-(2-carbmethoxyethyl)-2'-deoxyuridine

39 5'-DMT-5-(3-carbmethoxyprop-l-yl)-2'-deoxyuridin 39 5'-DMT-5-(3-carbmethoxyprop-1-yl)-2'-deoxyuridine

40 5'-DMT-5-(4-carbmethoxy-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxyuridin 40 5'-DMT-5-(4-carbmethoxy-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxyuridine

41 5'-DMT-5-(3-cyanopropen-l-yl)-2'-deoxyuridin 41 5'-DMT-5-(3-cyanopropen-1-yl)-2'-deoxyuridine

4 2 5'-DMT-5-(4-cyano-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxyuridin 4 2 5'-DMT-5-(4-cyano-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxyuridine

43 5'-DMT-5-[2-(4-carbmethoxyfenyl)-ethen-l-yl)-2<1->deoxyuridin 43 5'-DMT-5-[2-(4-carbmethoxyphenyl)-ethen-1-yl)-2<1->deoxyuridine

44 5'-DMT-5-(4-acetoxybuten-l-yl)-2'-deoxyuridin 44 5'-DMT-5-(4-acetoxybuten-1-yl)-2'-deoxyuridine

45 5'-DMT-5-(4-acetoxybut-l-yl)-2'-deoxyuridin 45 5'-DMT-5-(4-acetoxybut-1-yl)-2'-deoxyuridine

46 5'-DMT-5-[4-(2,4-dinitrofenyl)-butyl]-2'-deoxyuridin gir produktene hvor er: 46 5'-DMT-5-[4-(2,4-dinitrophenyl)-butyl]-2'-deoxyuridine gives the products where is:

37' 5-(propen-l-yl)-uracil 37' 5-(propen-1-yl)-uracil

38' 5-(2-carboxyethyl)-uracil 38' 5-(2-carboxyethyl)-uracil

39' 5-(3-carboxyprop-l-yl)-uracil 39' 5-(3-carboxyprop-1-yl)-uracil

40' 5-(4-carboxy-2-methylbuten-l-yl)-uracil 40' 5-(4-carboxy-2-methylbuten-1-yl)-uracil

41' 5-(3-cyanopropen-l-yl)-uracil 41' 5-(3-cyanopropen-1-yl)-uracil

42' 5-(4-cyano-2-methylbuten-l-yl)-uracil 42' 5-(4-cyano-2-methylbuten-1-yl)-uracil

43' 5-[2-(4-carboxyfenyl)-ethen-l-yl]-uracil 44' 5-(4-hydroxybuten-l-yl)-uracil 43' 5-[2-(4-carboxyphenyl)-ethen-1-yl]-uracil 44' 5-(4-hydroxybuten-1-yl)-uracil

45' 5-(4-hydroxyybut-l-yl)-uracil 45' 5-(4-hydroxybut-1-yl)-uracil

46' 5-[4-(2,4-dinitrofenyl)-butyl]-uracil 46' 5-[4-(2,4-dinitrophenyl)-butyl]-uracil

Anmerkning: I 4<_>6<*> er dinitrofenyl en påvisbar markør av ligandgjenkjenningstype, dvs. anvendelse av antidinitrofenyl-antistoff som liganden. Ved å anvende andre passende 5'-DMT-5-alkyl-2<1->deoxyuridiner fremstilles likeledes de analoge deoxyoligonucleotider. Note: In 4<_>6<*>, dinitrophenyl is a detectable marker of ligand recognition type, i.e. using anti-dinitrophenyl antibody as the ligand. By using other suitable 5'-DMT-5-alkyl-2<1->deoxyuridines, the analogous deoxyoligonucleotides are likewise prepared.

Eksempel 21 Example 21

Gjentagelse av fremgangsmåtene ifølge eksempel 15 til 18, men erstatning av 5<1->DMT-5-(3-trifluoracetylaminopropyl)-2<1->deoxyuridin med 5 *-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-trikloracetylamino-propyl)-2<1->deoxycytidin gir deoxyoligonucleotider slik som i eksempl 18 hvor Um [5-(3-aminopropyl)-uracil] erstattes av 5-(3-aminopropyl)-cytosiner. F.eks. Repeating the procedures according to examples 15 to 18, but replacing 5<1->DMT-5-(3-trifluoroacetylaminopropyl)-2<1->deoxyuridine with 5 *-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-trichloroacetylamino -propyl)-2<1->deoxycytidine gives deoxyoligonucleotides such as in example 18 where Um [5-(3-aminopropyl)-uracil] is replaced by 5-(3-aminopropyl)-cytosines. E.g.

hvor Cm = 5-(3-aminopropyl)-cytosin. where Cm = 5-(3-aminopropyl)-cytosine.

Eksempel 22 Example 22

Gjentagelse av fremgangsmåten for deoxyoligonucleotidsyntesen ifølge eksempel 21, men erstatning av 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-trikloracetylaminopropyl)-2 *-deoxycytidin med forbindelser nummerert 4_7 til 5_7 nedenunder, gir de tilsvarende oligonucleotider med Cm-cytosinbasene nummerert hhv. Repeating the procedure for the deoxyoligonucleotide synthesis according to Example 21, but replacing 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-trichloroacetylaminopropyl)-2*-deoxycytidine with compounds numbered 4_7 to 5_7 below, gives the corresponding oligonucleotides with the Cm-cytosine bases numbered or

47' til _57' nedenunder, dvs. innsetting av: 47' to _57' below, i.e. insertion of:

47 5-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-trifluoracetylaminopropen-l-yl)-2'-deoxycytidin 48 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(4-trifluoracetylaminobut-l-yl)-2'-deoxycytidin 49 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(4-trifluoracetylaminobuten-l-yl)-2<1->deoxycytidin 50 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(6-trifluoracetylaminohex-l-yl)-2'-deoxycytidin 51 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(6-trifluoracetylaminohexen-l-yl)-2'-deoxycytidin 52 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-trifluoracetylaminoprop-2-yl)-2'-deoxycytidin 53 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(3-trifluoracetylamino-2-methyl-propen-l-yl)-2'-deoxycytidin 54 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-trifluoracetylamino-2-methylprop-1-yl)-2'-deoxycytidin 55 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-[2-(4-trifluoracetylaminomethyl-fenyl)-ethen-l-yl]-2'-deoxycytidin 56 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-[N-(pertrifluoracetylpolylysyl)-1-acrylamido)-2'-deoxycytidin 57 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-[N-(trifluoracetylaminoheptyl)-acrylamido]-2'-deoxycytidin 47 5-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-trifluoroacetylaminopropen-1-yl)-2'-deoxycytidine 48 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(4-trifluoroacetylaminobut-1-yl)-2 '-deoxycytidine 49 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(4-trifluoroacetylaminobuten-1-yl)-2<1->deoxycytidine 50 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(6-trifluoroacetylaminohex- 1-yl)-2'-deoxycytidine 51 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(6-trifluoroacetylaminohexen-1-yl)-2'-deoxycytidine 52 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-( 3-trifluoroacetylaminoprop-2-yl)-2'-deoxycytidine 53 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(3-trifluoroacetylamino-2-methyl-propen-1-yl)-2'-deoxycytidine 54 5 '-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-trifluoroacetylamino-2-methylprop-1-yl)-2'-deoxycytidine 55 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-[2-(4-trifluoroacetylaminomethyl- phenyl)-ethen-1-yl]-2'-deoxycytidine 56 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-[N-(pertrifluoroacetylpolylysyl)-1-acrylamido)-2'-deoxycytidine 57 5'-DMT -N 4-benzoyl-5-[N-(trifluoroacetylaminoheptyl)-acrylamido]-2'-deoxycytidine

gir produktene hvor Cm er: gives the products where Cm is:

47' 5-(3-aminopropen-l-yl)-cytosin 47' 5-(3-aminopropen-1-yl)-cytosine

48' 5-(4-aminobut-l-yl)-cytosin 48' 5-(4-aminobut-1-yl)-cytosine

49' 5-(4-aminobuten-l-yl)-cytosin 49' 5-(4-aminobuten-1-yl)-cytosine

50' 5-(6-aminohex-l-yl)-cytosin 50' 5-(6-aminohex-1-yl)-cytosine

51' 5-(6-aminohexen-l-yl)-cytosin 51' 5-(6-aminohexen-1-yl)-cytosine

52' 5-(3-aminoprop-2-yl)-cytosin 52' 5-(3-aminoprop-2-yl)-cytosine

53' 5-(3-amino-2-methylpropen-l-yl)-cytosin 53' 5-(3-amino-2-methylpropen-1-yl)-cytosine

54 ' 5- (3-amino-2-itiethylprop-l-yl) -cytosin 54' 5-(3-amino-2-ethylprop-1-yl)-cytosine

55' 5-[2-(4-aminomethylfenyl)-ethen-l-yl]-cytosin 56' 5-[N-(polylysyl)-1-acrylamido]-cytosin 55' 5-[2-(4-aminomethylphenyl)-ethen-1-yl]-cytosine 56' 5-[N-(polylysyl)-1-acrylamido]-cytosine

57' 5-[N-(7-aminoheptyl)-1-acrylamido]-cytosin 57' 5-[N-(7-aminoheptyl)-1-acrylamido]-cytosine

Ved å anvende andre N 4-acyl-5-(acylaminoalkyl)-2'-deoxycytidiner fremstilles likeledes de analoge deoxyoligonucleotider. By using other N 4-acyl-5-(acylaminoalkyl)-2'-deoxycytidines, the analogous deoxyoligonucleotides are likewise prepared.

Eksempel 23 Example 23

Gjentagelse av fremgangsmåten for deoxyoligonucleotidsyntesen ifølge eksempel 21, men erstatning av 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-trifluoracetylaminopropyl)-2<1->deoxycytidin med forbindelsene nummerert 58 til j>8_ nedenunder, gir de tilsvarende oligonucleotider med Cm<->cytosinbasene nummerert hhv. Repeating the procedure for the deoxyoligonucleotide synthesis according to Example 21, but replacing 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(3-trifluoroacetylaminopropyl)-2<1->deoxycytidine with the compounds numbered 58 to j>8_ below, gives the corresponding oligonucleotides with the Cm<->cytosine bases numbered respectively.

58<1> til 6_8" nedenunder, dvs. innsetting av: 58<1> to 6_8" below, i.e. insertion of:

58 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(propen-l-yl)-21-deoxycytidin 58 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(propen-1-yl)-21-deoxycytidine

59 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-(2-carbmethoxyethyl)-2'-deoxycytidin 60 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(2-carbmethoxyethen-l-yl)-2'-deoxycytidin 61 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(3-carbmethoxyprop-l-yl)-2'-deoxycytidin 62 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(4-carbmethoxy-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxycytidin 63 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(3-cyanopropen-l-yl)-2'-deoxycytidin 64 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-(4-cyano-2-methylbuten-l-yl)-2'-deoxycytidin 65 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-[2-(4-carbmethoxyfenyl)-ethen-l-yl]-2' -deoxycytidin 66 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(4-acetoxybuten-l-yl)-2'-deoxycytidin 67 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(4-acetoxybut-l-yl)-21-deoxycytidin 68 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-[4-(2,4-dinitrofenyl)-butyl]-deoxycytidin 59 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-(2-carbmethoxyethyl)-2'-deoxycytidine 60 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-(2-carbmethoxyethen-1-yl)- 2'-deoxycytidine 61 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(3-carbmethoxyprop-1-yl)-2'-deoxycytidine 62 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(4 -carbmethoxy-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxycytidine 63 5'-DMT-N <4->benzoyl-5-(3-cyanopropen-1-yl)-2'-deoxycytidine 64 5'-DMT -N<4->benzoyl-5-(4-cyano-2-methylbuten-1-yl)-2'-deoxycytidine 65 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-[2-(4-carbmethoxyphenyl) )-ethen-1-yl]-2'-deoxycytidine 66 5'-DMT-N 4-benzoyl-5-(4-acetoxybuten-1-yl)-2'-deoxycytidine 67 5'-DMT-N 4-benzoyl -5-(4-acetoxybut-1-yl)-21-deoxycytidine 68 5'-DMT-N<4->benzoyl-5-[4-(2,4-dinitrophenyl)-butyl]-deoxycytidine

gir produktene hvor Cm er: gives the products where Cm is:

58' 5-(propen-l-yl)-cytosin 58' 5-(propen-1-yl)-cytosine

59' 5-(2-carboxyethyl)-cytosin 59' 5-(2-carboxyethyl)-cytosine

60' 5-(2-carboxyethen-l-yl)-cytosin 60' 5-(2-carboxyethen-1-yl)-cytosine

61' 5-(3-carboxyprop-l-yl)-cytosin 61' 5-(3-carboxyprop-1-yl)-cytosine

62' 5-(4-carboxy-2-methylbuten-l-yl)-cytosin 63' 5-(3-cyanopropen-l-yl)-cytosin 62' 5-(4-carboxy-2-methylbuten-1-yl)-cytosine 63' 5-(3-cyanopropen-1-yl)-cytosine

64' 5-(4-cyano-2-methylbuten-l-yl)-cytosin 64' 5-(4-cyano-2-methylbuten-1-yl)-cytosine

65' 5-[2-(4-carboxyfenyl)-ethen-l-yl]-cytosin 66' 5-(4-hydroxybuten-l-yl)-cytosin 65' 5-[2-(4-carboxyphenyl)-ethen-1-yl]-cytosine 66' 5-(4-hydroxybuten-1-yl)-cytosine

67' 5-(4-hydroxybut-l-yl)-cytosin 67' 5-(4-hydroxybut-1-yl)-cytosine

68' 5-[4-(2,4-dinitrofenyl)-butyl]-cytosin 68' 5-[4-(2,4-dinitrophenyl)-butyl]-cytosine

Ved å anvende andre passende 5'-DMT-N4-acyl-5-alkyl-2* - deoxycytidiner fremstilles likeledes de analoge deoxyoligonucleotider. By using other suitable 5'-DMT-N4-acyl-5-alkyl-2*-deoxycytidines, the analogous deoxyoligonucleotides are likewise prepared.

Eksempel 24 Example 24

Gjentagelse av fremgangsmåtene for fosfomonokloriditt-og deoxyoligonucleotidsyntesen ifølge eksempel 15 til 23, men erstatning av 5<1->DMT-5-(3-trifluoracetylaminopropyl)-2<1->deoxyuridin med 5'-DMT-N -benzoyl-8-(6-trifluoracetylamino-hexyl)-amino-2'-deoxyadenosin gir deoxyoligonucleotider slik som i eksempel 18, med unntak at u erstattes av A t og A = 8-(6-aminohexyl)-amino-2'-deoxyadenosin. Repeating the procedures for the phosphomonochloridite and deoxyoligonucleotide synthesis according to examples 15 to 23, but replacing 5<1->DMT-5-(3-trifluoroacetylaminopropyl)-2<1->deoxyuridine with 5'-DMT-N -benzoyl-8- (6-trifluoroacetylaminohexyl)-amino-2'-deoxyadenosine gives deoxyoligonucleotides as in example 18, with the exception that u is replaced by A t and A = 8-(6-aminohexyl)-amino-2'-deoxyadenosine.

Eksempel 25 til 28 er typiske for bindingen av påvisbare markører til oligonucleotider som inneholder passende modifiserte baser slik som illustrert i reaksjon 6. Examples 25 to 28 are typical of the binding of detectable labels to oligonucleotides containing appropriately modified bases as illustrated in reaction 6.

Eksempel 25 Example 25

Fluoresceinerte deoxyoligonucleotider Fluoresceinated deoxyoligonucleotides

Et renset pentadecanucleotid (fra eksempel 28) med strukturformelen: [hvor Um er 5-[N-(7-aminoheptyl)-1-acrylamido]-uracil] opp-løses ved 25 A2gQ-enheter pr. ml i vandig 300 mM natriumborat-elier natriumcarbonatbuffer, pH 9,5, som inneholder 30 mM natriumklorid. Fast fluorescein-isothiocyanat (0,5 mg pr. ml) tilsettes, og blandingen lukkes inne og rystes forsiktig ved 4°C til 25°C over natten. Reaksjonsblandingen kromatograferes direkte på en kolonne av G-50 Sephadex^ for å fraskille ikke-bundne fluoresceinaddukter som holdes tilbake; de fluoresceinerte deoxyoligonucleotidadduktene eluerer like før væskemengden tar slutt. Tidlige fraksjoner som inneholder betydelige A2gQ-enheter, slåes sammen og lyofiliseres til et fast produkt med en struktur som svarer til utgangs-pentadeca-deoxyoligonucleotidet hvor Um nå er enten A purified pentadecanucleotide (from Example 28) with the structural formula: [where Um is 5-[N-(7-aminoheptyl)-1-acrylamido]-uracil] dissolves at 25 A2gQ units per ml in aqueous 300 mM sodium borate or sodium carbonate buffer, pH 9.5, containing 30 mM sodium chloride. Solid fluorescein isothiocyanate (0.5 mg per ml) is added, and the mixture is sealed and shaken gently at 4°C to 25°C overnight. The reaction mixture is chromatographed directly on a column of G-50 Sephadex^ to separate unbound fluorescein adducts that are retained; the fluoresceined deoxyoligonucleotide adducts elute just before the amount of liquid runs out. Early fractions containing significant A2gQ units are pooled and lyophilized to a solid product with a structure corresponding to the starting pentadecadeoxyoligonucleotide where Um is now either

eller ikke-omsatt 5-[N-(7-aminoheptyl)-1-acrylamido]-uracil. or unreacted 5-[N-(7-aminoheptyl)-1-acrylamido]-uracil.

*maks. (H20) 262 m' 498 m- *max. (H20) 262 m' 498 m-

Gjentagelse av fremgangsmåten på forbindelser beskrevet i eksempel 19, 21, 22 og 24, gir de tilsvarende fluoresceinerte eller polyfluoresceinerte deoxyoligonucleotider på lignende måte. Repeating the procedure on compounds described in examples 19, 21, 22 and 24 gives the corresponding fluoresceinated or polyfluoresceinated deoxyoligonucleotides in a similar manner.

Eksempel 26 Example 26

Binding av andre påvisbare markører enn fluorescein kan utføres ved å gjenta fremgangsmåten ifølge eksempel 25, men erstatning av fluorescein-isothiocyanat med f.eks.: Binding of detectable markers other than fluorescein can be carried out by repeating the procedure of Example 25, but replacing fluorescein isothiocyanate with e.g.:

2,4-dinitrofenyl-isothiocyanat 2,4-dinitrophenyl isothiocyanate

1-fluor-2,4-dinitrobenzen 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene

aminoethyl-isoluminol-isothiocyanat aminoethyl isoluminol isothiocyanate

aminoethylaminonafthalen-1,2-carboxylsyre-hydrazid-isothiocyanat aminoethylaminonaphthalene-1,2-carboxylic acid hydrazide isothiocyanate

N,N'-bis-(alkylsulfonyl)-N-aryl-N<1->isothiocyanatoaryl-dioxamid N,N'-bis-(alkylsulfonyl)-N-aryl-N<1->isothiocyanatoaryl-dioxamide

m-sulfonyl-anilin-isothiocyanat m-sulfonyl-aniline isothiocyanate

N-hydroxysuccinimidyl-biotin N-hydroxysuccinimidyl-biotin

9-(N-hydroxysuccinimidyl-carboxy)-N-methylacridin 9-(N-hydroxysuccinimidyl-carboxy)-N-methylacridine

(r) (s)

eller cyanobromid-aktivert Sepharose^ or cyanobromide-activated Sepharose^

gir de tilsvarende addukter hvor gruppen som er bundet, er forskjellig fra fluorescein. give the corresponding adducts where the group that is attached is different from fluorescein.

Eksempel 27 Example 27

Binding av påvisbare markører som inneholder isoluminol og fritt, primært amin Binding of detectable markers containing isoluminol and free, primary amine

Et renset pentadecanucleotid fra eksempel 18 med strukturformelen: [hvor er 5-(2-carboxyethenyl)-uracil] oppløses i vann ved 30 A2gQ-enheter pr. ml og fortynnes med 1 volumdel pyridin. Aminobutyl-ethyl-isoluminol tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml, etterfulgt av tilsetning av et 5-ganger molart overskudd med l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbo-diimid. Reaksjonsblandingen lukkes inne og rystes forsiktig i mørket fra 12 til 48 timer. Reaksjonsblandingen oppkonsentreres under redusert trykk til en fast rest og kromatograferes direkte på en kolonne av G-50 Sephadex^; isoluminol-deoxyoligonucleotidkonjugatene eluerer like før væskemengden tar slutt. Tidlige fraksjoner som inneholder betydelige mengder A2gQ_enheter, slåes sammen og lyofiliseres til fast produkt med en lignende struktur som utgangs-deoxyoligonucleotidet hvor Um nå er enten A purified pentadecanucleotide from example 18 with the structural formula: [where is 5-(2-carboxyethenyl)-uracil] dissolves in water at 30 A2gQ units per ml and dilute with 1 part by volume of pyridine. Aminobutyl-ethyl-isoluminol is added to a final concentration of 1 mg/ml, followed by the addition of a 5-fold molar excess of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide. The reaction mixture is sealed and shaken gently in the dark from 12 to 48 hours. The reaction mixture is concentrated under reduced pressure to a solid residue and chromatographed directly on a column of G-50 Sephadex^; the isoluminol-deoxyoligonucleotide conjugates elute just before the amount of liquid runs out. Early fractions containing significant amounts of A2gQ_units are pooled and lyophilized to solid product with a similar structure to the starting deoxyoligonucleotide where Um is now either

eller ikke-omsatt 5-(2-carboxyethenyl)-uracil. or unreacted 5-(2-carboxyethenyl)-uracil.

Gjentagelse av fremgangsmåten på forbindelser fra eksempel 15 og 23 hvor R2 inneholder carboxyl, gir de tilsvarende deoxyoligonucleotid-isoluminoladdukter på lignende måte. Repeating the procedure on compounds from examples 15 and 23 where R 2 contains carboxyl gives the corresponding deoxyoligonucleotide-isoluminol adducts in a similar manner.

Gjentagelse av fremgangsmåten, men erstatning av aminobutyl-isoluminol med andre påvisbare markører som inneholder et fritt, primært amin, gir de tilsvarende deoxyoligonucleotid-markøraddukter på lignende måte. Repeating the procedure but replacing the aminobutyl isoluminol with other detectable labels containing a free primary amine gives the corresponding deoxyoligonucleotide label adducts in a similar fashion.

Eksempel 28 Example 28

Binding av dinitrofenyl- markører Binding of dinitrophenyl markers

Et renset nonanucleotid med strukturformelen: A purified nonanucleotide with the structural formula:

hvor Am = 8-(6-aminohexyl)-aminoadenin, oppløses med 20 A2gQ-enheter pr. ml i 250 mM natriumcarbonatbuffer, pH 9, og det tilsettes l-fluor-2,4-dinitrobenzen. Reaksjonsblandingen rystes ved omgivelsestemperatur over natten, deretter kromatograferes det direkte på en kolonne med Sephadex®G-50. Tidlige fraksjoner som inneholder betydelige mengder A2g0-enheter, slåes sammen og oppkonsentreres, hvorved man får et oligonucleotidprodukt svarende til utgangs-decanucleotidet hvor Am nå er enten where Am = 8-(6-aminohexyl)-aminoadenine, dissolves with 20 A2gQ units per ml in 250 mM sodium carbonate buffer, pH 9, and 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene is added. The reaction mixture is shaken at ambient temperature overnight, then chromatographed directly on a Sephadex®G-50 column. Early fractions containing significant amounts of A2g0 units are pooled and concentrated, yielding an oligonucleotide product corresponding to the starting decanucleotide where Am is now either

eller ikke-omsatt 8-(6-aminohexyl)-aminoadenin. or unreacted 8-(6-aminohexyl)-aminoadenine.

Gjentagelse av fremgangsmåten, men erstatning av 8-(6-aminohexyl)-aminoadenin med andre modifiserte baser som inneholder et fritt, primært amin, gir likeledes de tilsvarende dinitrofenylerte oligonucleotidaddukter. Repeating the procedure, but replacing 8-(6-aminohexyl)-aminoadenine with other modified bases containing a free, primary amine, also gives the corresponding dinitrophenylated oligonucleotide adducts.

Claims (10)

1. Enkjedet oligonucleotid bestående hovedsakelig av en nøyaktig lik sekvens av ikke mer enn 200 nucleotider, karakterisert ved at nucleotidene har formelen: hvor B er en pyrimidin- eller purinbase, R er en linkerarm som er bundet til en forbindelse valgt fra gruppen bestående av en blokkerende gruppe, en påvisbar markør og en fast overflate, og R4 = blokkerende gruppe, og R5 = reaktiv fosforholdig gruppe eller = H dersom 5'-OH-gruppen i 5'-endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en reaktiv fosforholdig gruppe eller R5 = blokkerende gruppe, og R4 = reaktiv fosforholdig gruppe eller = H dersom 3'-OH-gruppen i 3'-endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en reaktiv fosforholdig gruppe, og R8 = H eller blokkert hydroxylgruppe, og at minst ett av nucleotidene har en linkerarm bundet til basen i nucleotidet og hvor linkerarmen videre er bundet til en forbindelse valgt fra gruppen bestående av en reaktiv funksjonell gruppe, en blokkert funksjonell gruppe, en påvisbar markør og en fast overflate.1. Single-stranded oligonucleotide consisting mainly of an exactly identical sequence of no more than 200 nucleotides, characterized in that the nucleotides have the formula: where B is a pyrimidine or purine base, R is a linker arm attached to a compound selected from the group consisting of a blocking group, a detectable label and a fixed surface, and R4 = blocking group, and R5 = reactive phosphorus-containing group or = H if the 5'-OH group in the 5'-end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a reactive phosphorus-containing group or R5 = blocking group, and R4 = reactive phosphorus-containing group or = H if the 3'-OH group in the 3'-end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a reactive phosphorus-containing group, and R8 = H or blocked hydroxyl group, and that at least one of the nucleotides has a linker arm bound to the base in the nucleotide and where the linker arm is further bound to a compound selected from the group consisting of a reactive functional group, a blocked functional group, a detectable marker and a fixed surface. 2. Enkjedede oligonucleotider ifølge krav 1, karakterisert ved at R er hvor R-l er H eller alkyl, n er 0-20 og Y inneholder en blokkert amino- eller blokkert carboxyl- eller blokkert hvdroxy- eller blokkert thiogruppe, eller en påvisbar markør eller en fast bærer.2. Single-stranded oligonucleotides according to claim 1, characterized in that R is where R-1 is H or alkyl, n is 0-20 and Y contains a blocked amino or blocked carboxyl or blocked hydroxy or blocked thio group, or a detectable label or a solid support. 3. Enkjedede oligonucleotider ifølge krav 1, karakterisert ved at basen er et pyrimidin og linkerarmen er bundet til C-5-stillingen.3. Single-chain oligonucleotides according to claim 1, characterized in that the base is a pyrimidine and the linker arm is attached to the C-5 position. 4. Enkjedede oligonucleotider ifølge krav 1, karakterisert ved at basen er et purin og linkerarmen er bundet til C-8-stillingen.4. Single-chain oligonucleotides according to claim 1, characterized in that the base is a purine and the linker arm is attached to the C-8 position. 5. Enkjedede oligonucleotider ifølge krav 1, karakterisert ved at sekvensen er mellom 10 og 40 nucleotider lang.5. Single-stranded oligonucleotides according to claim 1, characterized in that the sequence is between 10 and 40 nucleotides long. 6. Forbindelse for anvendelse som mellomprodukt i den kjemiske syntese av et enkjedet oligonucleotid, karakterisert ved at den har formelen: hvor B er en pyrimidin eller purinbase, R er en linkerarm som er bundet til en forbindelse valgt fra gruppen bestående av en blokkerende gruppe, en påvisbar markør og en fast overflate, og R4 = blokkerende gruppe, og R5 = reaktiv fosforholdig gruppe eller = H dersom 5'-OH-gruppen i 5'-endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en reaktiv fosforholdig gruppe, eller R5 = blokkerende gruppe og R4 = reaktiv fosforholdig gruppe eller = H dersom 3'-OH-gruppen i 3'-endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en reaktiv fosforholdig gruppe, og R8 = H eller blokkert hydroxylgruppe.6. Compound for use as an intermediate in the chemical synthesis of a single-chain oligonucleotide, characterized in that it has the formula: where B is a pyrimidine or purine base, R is a linker arm attached to a compound selected from the group consisting of a blocking group, a detectable label and a fixed surface, and R4 = blocking group, and R5 = reactive phosphorus-containing group or = H if the 5'-OH group in the 5'-end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a reactive phosphorus-containing group, or R5 = blocking group and R4 = reactive phosphorus-containing group or = H if the 3'-OH group in the 3'-end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a reactive phosphorus-containing group, and R8 = H or blocked hydroxyl group. 7. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert ved at R er hvor R1 er H eller alkyl, n er 0-20 og Y inneholder en blokkert amino- eller blokkert carboxyl- eller blokkert hydroxy- eller blokkert thiogruppe, eller en påvisbar markør eller en fast bærer.7. Connection according to claim 6, characterized in that R is wherein R 1 is H or alkyl, n is 0-20 and Y contains a blocked amino or blocked carboxyl or blocked hydroxy or blocked thio group, or a detectable label or a solid support. 8. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert ved at R er bundet i C-5-stillingen når B er et pyrimidin, eller i C-8-stillingen når B er et purin.8. Connection according to claim 6, characterized in that R is bound in the C-5 position when B is a pyrimidine, or in the C-8 position when B is a purine. 9. Fremgangsmåte for kjemisk syntese av et enkjedet oligonucleotid med en påvisbar rest, karakterisert ved at en mellomproduktforbindelse tilsettes til et reaktivt nucleotid eller reaktivt oligonucleotid under reaktive betingelser, hvor mellomproduktforbindelsen har formelen: hvor B er en pyrimidin- eller purinbase, R er en linkerarm bundet til en forbindelse valgt fra gruppen bestående av en blokkerende gruppe, en påvisbar markør og en fast overflate, og R4 = blokkerende gruppe og R5 = en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, eller = H dersom 5' -OH-gruppen i 5' -endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, eller R5 = er en blokkerende gruppe og R4 = en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, eller H dersom 3' -OH-gruppen i 3' -endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, og R8 = H eller blokkert hydroxylgruppe, og hvor de reaktive betingelser omfatter en temperatur i området fra -20 til 50°C i et tidsrom i området 1 til 60 minutter, den blokkerende gruppe fjernes og deretter tilsettes en påvisbar markør som kan reagere med den ublokkerte linkerarm under reaktive betingelser, hvor de reaktive betingelser omfatter en temperatur i området -20 opp til 50°C i et tidsrom i området 1 til 24 timer.9. Process for the chemical synthesis of a single-chain oligonucleotide with a detectable residue, characterized in that an intermediate compound is added to a reactive nucleotide or reactive oligonucleotide under reactive conditions, where the intermediate compound has the formula: where B is a pyrimidine or purine base, R is a linker arm attached to a compound selected from the group consisting of a blocking group, a detectable label and a fixed surface, and R4 = blocking group and R5 = a group containing reactive phosphorus, or = H if the 5' -OH group in the 5' -end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a group containing reactive phosphorus, or R5 = is a blocking group and R4 = a group containing reactive phosphorus, or H if the 3' -OH group in the 3' -end nucleotide in a growing oligonucleotide contains a group containing reactive phosphorus, and R8 = H or blocked hydroxyl group, and where the reactive conditions comprise a temperature in the range from -20 to 50°C for a period of time in the range of 1 to 60 minutes, the blocking group is removed and then a detectable marker is added which can react with the unblocked linker arm under reactive conditions, the reactive conditions comprising a temperature in the range of -20 up to 50°C for a period of time in the range of 1 to 24 hours. 10. Fremgangsmåte for kjemisk syntese av et enkjedet oligonucleotid med en påvisbar rest, karakterisert ved at en mellomproduktforbindelse tilsettes til et reaktivt nucleotid eller reaktivt oligonucleotid under reaktive betingelser, hvor raellomprodukt-forbindelsen har formelen: hvor B er en pyrimidin- eller purinbase, R er en linkerarm bundet til en forbindelse valgt fra gruppen bestående av en blokkerende gruppe, en påvisbar markør og en fast overflate, og i R4 = blokkerende gruppe og R5 = som inneholder reaktivt fosfor, eller = H dersom 5' -OH-gruppen i 5' -endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, eller R5 = blokkerende gruppe og R4 = en gruppe som inneholder reaktivt fosfor, eller H dersom 3' -OH-gruppen i 3' -endenucleotidet i et voksende oligonucleotid inneholder en gruppe som inneholder et reaktivt fosfor, og R8 = H eller blokkert hydroxylgruppe, hvor den påvisbare markør ikke forhindrer oligonucleotidsyntese, og hvor de reaktive betingelser omfatter en temperatur i området -20 opp til 50 °C i et tidsrom i området 3.-60 minutter.10. Process for the chemical synthesis of a single-chain oligonucleotide with a detectable residue, characterized in that an intermediate compound is added to a reactive nucleotide or reactive oligonucleotide under reactive conditions, where the raw product compound has the formula: where B is a pyrimidine or purine base, R is a linker arm attached to a compound selected from the group consisting of a blocking group, a detectable label and a fixed surface, and in R4 = blocking group and R5 = containing reactive phosphorus, or = H if the 5' -OH group in the 5' -end nucleotide of a growing oligonucleotide contains a group containing reactive phosphorus, or R5 = blocking group and R4 = a group containing reactive phosphorus, or H if the 3' -OH group in the 3' -end nucleotide in a growing oligonucleotide contains a group containing a reactive phosphorus, and R8 = H or blocked hydroxyl group, wherein the detectable marker does not prevent oligonucleotide synthesis, and where the reactive conditions comprise a temperature in the range of -20 up to 50 °C for a period of time in the range of 3-60 minutes.