NO169348B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av en polypeptid-transformerende vekstfaktor - Google Patents
Analogifremgangsmaate for fremstilling av en polypeptid-transformerende vekstfaktor Download PDFInfo
- Publication number
- NO169348B NO169348B NO841827A NO841827A NO169348B NO 169348 B NO169348 B NO 169348B NO 841827 A NO841827 A NO 841827A NO 841827 A NO841827 A NO 841827A NO 169348 B NO169348 B NO 169348B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- tgf
- egf
- growth factor
- aqueous
- transforming growth
- Prior art date
Links
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 title claims description 283
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 title claims description 282
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 64
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 152
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 121
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 100
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 73
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 72
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 47
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 46
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 30
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 26
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 19
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 19
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 15
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 14
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 13
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 13
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 12
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 12
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 134
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 98
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 95
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 95
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 95
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 53
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 52
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 51
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 29
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 27
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 27
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 25
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 22
- 229940044613 1-propanol Drugs 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 21
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 20
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 19
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 19
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 18
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 17
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 17
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 17
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 14
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 11
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 11
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 11
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 10
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 9
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 7
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 7
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 7
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 7
- 229940099261 silvadene Drugs 0.000 description 7
- UEJSSZHHYBHCEL-UHFFFAOYSA-N silver(1+) sulfadiazinate Chemical compound [Ag+].C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)[N-]C1=NC=CC=N1 UEJSSZHHYBHCEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 5
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 5
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 4
- 101000851176 Homo sapiens Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 4
- 241000714179 Snyder-Theilen feline sarcoma virus Species 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 4
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 4
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 4
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 3
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 3
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 3
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006802 Burns second degree Diseases 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000714174 Feline sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000851196 Mus musculus Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 2
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 2
- 210000002159 anterior chamber Anatomy 0.000 description 2
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010009896 bone resorption factor Proteins 0.000 description 2
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- DOIRQSBPFJWKBE-UHFFFAOYSA-N dibutyl phthalate Chemical compound CCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCC DOIRQSBPFJWKBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 230000006740 morphological transformation Effects 0.000 description 2
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N (4s)-5-[[(2s)-6-amino-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2r)-1-[[2-[[2-[[(1s)-3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]a Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CC1=CC=C(O)C=C1 KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JCVDICFLPGDHAT-DJLDLDEBSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3,5-dimethylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1N(C)C(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 JCVDICFLPGDHAT-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+](CCO)CCS([O-])(=O)=O AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710083129 50S ribosomal protein L10, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000682622 Andracantha sigma Species 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical class OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229910001369 Brass Inorganic materials 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 241000282551 Cercopithecus Species 0.000 description 1
- 241001091551 Clio Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012983 Dulbecco’s minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102000018386 EGF Family of Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010066486 EGF Family of Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100029203 F-box only protein 8 Human genes 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 101100334493 Homo sapiens FBXO8 gene Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 229910004879 Na2S2O5 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101100386053 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 101800001386 Peptide II Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101800003344 Vaccinia growth factor Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000011358 absorbing material Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- -1 amino- Chemical class 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000010951 brass Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002113 chemopreventative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010094102 enzymobeads Proteins 0.000 description 1
- PSLIMVZEAPALCD-UHFFFAOYSA-N ethanol;ethoxyethane Chemical compound CCO.CCOCC PSLIMVZEAPALCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 210000001232 limbus corneae Anatomy 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940054441 o-phthalaldehyde Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229910021426 porous silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000018398 positive regulation of bone resorption Effects 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000030716 positive regulation of phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000007388 punch biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000000623 ulna Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000003357 wound healing promoting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Denne oppfinnelse vedrører fremstilling av biologisk
aktive polypeptider fra naturlige eller syntetiske kilder. Det skal beskrives forbindelser med en generell polypeptidstruktur som definerer proteiner som har cellevekstfremmende virkning og en ny klasse av transformerende vekstfaktor (TGF)-polypeptider som har den egenskap av de overfører den transformerte fenotype på normale celler reversibelt in vitro og således viser seg å
være passende effektorer av den maligne fenotype. Det skal også beskrives antigene oligopeptider oppnådd fra TGF-polypeptidene og antistoffer dannet mot de antigene oligopeptider og de assosierte TGF-polypeptider som er anvendbare i oppdagelsen og behandlingen av maligniteter. Videre skal det beskrives oligopeptider som har evne til å binde seg til cellulære vekstfaktor-reseptorer og således potensielt vil interferere med transformering av bestemte cellelinjer til en cancerøs tilstand. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen omfatter å isolere TGF-polypeptider i homogen form- fra både transformerte humane og murine cellelinjer og kroppsvæsker og mot de homogene TGF-polypeptider som fåes på denne måte. Produkter fremstilt ved oppfinnelsen kan anvendes for oppdagelse og behandling av cancer og andre proliferative sykdommer og for cellevekst-assosiert behandling, f.eks. helbredelse av skader og sår-behandling. De kan også anvendes ved behandling og påvisning av bentapsykdommer, f.eks. osteoporose og hypercalcemi.
Et antall av polypeptid-hormon og hormon-lignende vekstfaktorer er blitt funnet i vevsvæsker, og deres relasjon i kontrollen av normal cellevekst eller mitose er blitt bestemt. Disse mitogene polypeptidvekstfaktorer inkluderer insulin, insulin-lignende vekstfaktorer, vekstfaktor fått fra blodlegemer, nervevekstfaktor, fibroblastvekstfaktor og epidermalvekstfaktor (EGF). I det minste noen av disse kjente vekstfaktorene har en virkning på veksten av transformerte celler, men på basis av in vitro-forsøk, viser det seg at transformerte celler trenger mindre av disse kjente vekstfaktorer for optimal vekst og formering enn normale celler gjør. Spesielt er det blitt vist i eksperimenter i cellekultur at tilsetning av eksogene vekstfaktorer såsom insulin og EGF kan få normale celler til å etterligne noen forandringer i cellulære egenskaper som er analoge til transformering; imidlertid er de ikke i stand til å produsere alle forandringer forbundet med den transformerte fenotype, f.eks., se Sporn et al., (1981) The New Eng. J. of Med., nr. 15, s. 878-880.
Nylig er nye typer av polypeptidvekstfaktorer betegnet som transformerende vekstfaktorer eller TGF blitt funnet i visse humane og animale carcinomer og sarkomceller som har en større utfyllelse av egenskapene som viser seg nødvendig for fenotypisk transformering (Roberts et al., (1980) Proe. Nati. Acad. Sei.
USA 77, s. 3494-3498 og Todaro et al., (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, s. 5258-5262). TGF-polypeptidene som en klasse er karakterisert ved forandringene som de forårsaker når de anvendes på utransformerte, ikke-neoplastiske indikatorceller som vokser i kultur. Disse forandringer inkluderer a) tap av tetthets-avhengig inhibering av cellevekst i monolag-kultur, b) overvekst av celler i monolag-kultur, c) forandring i celleform, med det resultat at indikatorcellene antar den neoplastiske fenotype,
og d) ervervelse av festepunkt-uavhengighet med resulterende evne til å vokse i bløt agar. Evnen til festepunkt-uavhengig vekst av celler i kultur har en spesielt høy korrelasjon med neoplastisk vekst in vivo. I det minste noen av TGF-polypeptidene viser noe slektskap med EGF ved det at de er både varmestabile og syre^. stabile peptider, følsomme for reduserende stoffer og proteaser og de viser seg spesifikt å reagere med, og produsere biologiske virkninger gjennom cellulær membran EGF-reseptorer, idet TGF konkurrerer med EGF om binding til den cellulære EGF-reseptor. Imidlertid kan TGF skilles fra EGF i flere viktige henseender. Spesielt induserer EGF ikke festepunkt-uavhengig vekst av celler i kultur og antistoffer mot EGF påviser heller ikke TGF i hverken radioimmunoassay eller immunopresipitasjonstester. Videre har EGF bare en svak virkning på fenotypen av celler i kultur, mens TGF produserer en mer uttalt fenotypisk forandring i celler i kultur og overfører til dem evnen til å oppføre seg som transformerte celler. Interessant nok er transformeringen produsert
av TGF ikke permanent men reversibel i fravær av TGF, og det er intet bevis for at TGF virker som et fullstendig carcinogen selv.
(Todaro et al., (1981) J. of Supramolecular Structure and Cell Biochem. 15, s. 287-301).
Således er TGF-polypeptider en enestående klasse proteiner som kan skilles fra andre vekstfaktorer såsom EGF,både når det gjelder biologiske egenskaper og kjemisk struktur. Disse TGF har videre en rekke egenskaper av verdi eller potensiell verdi på det helsevitenskapelige område som inkluderer sterk men reversibel cellevekst eller mitogene egenskaper som finner anvendelse i cellereparering, inkluderende f.eks. helbredelse av skader og sårterapi. I tillegg er produksjonen av TGF-polypeptider eller forhøyede nivåer av produksjon karakteristiske for, hvis ikke nødvendige for, den morfologiske transformering av bestemte cellelinjer i både humant og murint vev og/eller væsker; derfor er TGF-polypeptidene eller antigene fragmenter av disse av verdi i differensiering av normale celler fra tumorceller og antistoffer dannet mot dem har anvendelse både i diagnose og behandling av maligniteter. Videre når man blir klar over at bestemte TGF-polypeptider spesifikt reagerer med og produserer sine biologiske virkninger gjennom cellulærmembran-EGF-reseptorer, reiser det muligheten med engang basis-TGF-polypeptidstrukturen er bestemt, til å korrelere strukturen med strukturen av EGF for å utvikle oligopeptider som har kjemiske karakteristika som tillater binding til EGF-reseptorene uten medfølgende fenotypisk transformering av cellen. Oligopeptider som har denne karakteristiske EGF-reseptorbindende evne, finner anvendelse i behandling av maligniteter siden oligopeptidet vil interferere eller konkurrere med TGF for oppnåelige reseptorsteder og derved forstyrre fremstillingen av de transformerte egenskaper av cellen.
Med den foreliggende oppfinnelse er det blitt utviklet en metode for å få TGF-polypeptider i tilstrekkelig mengde og renhet for å tillate fullstendig strukturbestemmelse og som et resultat av denne bestemmelse og andre observasjoner, hvilket inkluderer funn av stofflig homologi mellom human og murin TGF, er det blitt oppdaget en grunnpeptidstruktur som har bred anvendelse i celle-mitose og det beslektede bruksområde for cellevekst. Videre har man fått homogene TGF-polypeptider som har anvendelse i både cellevekstområdet og i oppdagelse og behandling av cancer og andre proliferative sykdommer. TGF-polypeptider, oligopeptider og antistoffer dannet mot disse polypeptider har også anvendelse ved påvisning og behandling av bentapsykdommer, f.eks. osteoporose, hypercalcemi og ben-resorpsjon. I tillegg fås antigene oligopeptider og oligopeptider som har evne til å binde cellulære vekstfaktor-reseptorer, fra basispeptidstrukturen og de bestemte TGF-polypeptidstrukturer. Til slutt er sammensetninger og metoder, inkluderende antistoffer dannet mot TGF-polypeptider og antigene oligopeptider fått fra disse gitt for anvendelse i helsevitenskapelige områder.
Marquardt og Todaro, J. of Bio. Chem. (1982) vol. 257,
nr. 9, s. 5220-5225, (publisert 10. mai 1982) beskriver isoleringen av et lavmolekylært humant TGF fra serumfritt medium kondisjonert ved en humanmetastatisk melanomtumorlinje ved en sekvens av reaksjonsskritt som inkluderer ekstrahering i IM eddiksyre og sekvensiell rensning på reversert fase-høytrykks-væskekromatografi idet man først eluerer med acetonitril-løsningsmiddel fulgt av eluering med 1-propanol for å frembringe et renset TGF som har karakteristisk TGF biologisk virkning, f.eks. induksjon av festepunkt-uavhengig cellevekst. Twardzik et al., Science (1982) vol. 216, s. 894-897 (publisert 21. mai 1982) rapporterer anvendelsen av samme metode for rensning for å rense et TGF fra en virustransformert rottecelle. Den biologiske virkning av det rensede materiale i cellekultur er også demonstrert. Pike et al., J. of Bio. Chem. (1982) vol. 257, nr. 24, s. 14628-14631 (publisert 25. desember 1982) bringer for dagen at både delvis renset rotte- og human TGF har evnen til å aktivere en protein kinase i human tumorcellemembraner og derfor stimulere fosforylering av syntetisk tyrosin-inneholdende peptid. De eneste andre molekyler så langt beskrevet som har denne virkning, er EGF, insulin og vekstfaktor fått fra blodlegemer, hvorav man tror at alle har viktige fysiologiske virkninger i menneske og dyr. Andre referanser av interesse er gjengitt i de forannevnte artikler.
En basisk proteinstruktur er nå blitt funnet, som definerer en ny klasse av biologisk aktive molekyler. Funnet av dette strukturpolypeptid som frembringer biologisk aktivitet,særlig i det cellevekstbefordrende område, er basert på oppdagelsen at en bestemt korrelasjon eksisterer mellom den tredimensjonale struktur av bestemte polypeptider, inkludert TGF, som inneholder multiple disulfidbindinger, og den biologiske virkning som kan tilskrives polypeptidet. Biologisk aktive polypeptider inneholder minst én peptidfrekvens av formel I:
hvor AA er en aminosyrerest valgt fra Val, Ser, His, Phe, Asn, Lys, Asp, Thr, Gin, Arg, Leu, Glu, Pro, Ala, Gly, Trp og Tyr, og a er 7, b er 4 eller 5, c er 10 og d er 8. Også tatt i betraktning er forbindelser i henhold til formel I hvor når b er 4, AA også kan være Ile eller Met, i tillegg til de nevnte aminosyrerester.
En,spesifikk klasse av polypeptider som har transformerende vekstfaktoregenskaper inkluderer forbindelser av formel II og IIA eller oligomerer av disse:
hvor R er Asp eller lys,"R<*> er Phe eller Tyr, R"' er Ser eller Phe og R'•<*> er Phe eller Tyr. Også innen rammen av oppfinnelsen er antigene oligopeptider oppnådd fra polypeptidene av formel II og IIA.
Polypeptidvekstfaktorer inneholder ett eller flere av følgende peptidfragmenter:
En klasse av oligopeptider har evne til å binde cellulære vekstfaktor-reseptorer og har derfor mulig anvendelse i behandling av maligniteter og andre forstyrrelser angående celleproliferasjon. Denne klasse av oligopeptider er basert på oppdagelsen av nøkkelsekvenser i større polypeptid-molekyler som viser både signifikant aminosyresekvens-homologi i den passende tredimensjonale struktur og har evne til å binde seg til cellulære vekstreseptorsteder. Slike oligopeptider har formel III:
hvor R er Phe eller Tyr og AA er en aminosyrerest valgt fra Val, Asn, His, Ser, Val, Ile, Gly, Leu, Asp, Asn, Cys, Thr, Ala, Tyr, Pro, Glu, Gin og Arg, og x er 0 eller et helt tall fra 1 til 5, y er 2, z er 3 og z' er 0 eller et helt tall fra 1 til 6.
Noe som også skal beskrives er biologisk aktive forbindelser og metoder som bruker polypeptid- og oligopeptid-strukturer gitt ovenfor, inkludert antistoffer mot polypeptidene av formel II og IIA og de antigene oligopeptider oppnådd fra disse, idet nevnte antistoffer er valgfritt merket med en markør som er i stand til å gi et påvisbart signal for anvendelse i diagnostiske metoder eller merket med et cytotoksisk stoff for anvendelse i cancer eller proliferativ sykdomsterapi. Andre forbindelser og metoder som anvender cellevekstfremmende egenskaper hos polypeptidene fremstilt ved foreliggende oppfinnelse, skal også beskrives.
I henhold til foreliggende oppfinnelse inkluderer fremgangsmåten å isolere homogene transformerende vekstfaktor-polypeptider fra mindre rene vandige løsninger som inneholder nevnte polypeptider, inkludert kroppsvæske og vandige medier kondisjonert med transformerende vekstfaktor-produserende celle-linjer like mye som de homogene transformerende vekstfaktor-polypeptider produsert ved dette og antistoffer dannet mot nevnte homogene polypeptider. Ved fremgangsmåten isoleres et homogent transformerende vekstfaktorpolypeptid fra et vandig medium som inneholder nevnte transformerende vekstfaktorpolypeptid i uren form ved hjelp av de følgende fremgangsmåtetrinn: (a) isolering fra et vandig medium som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid i uren form, ved
(1) dialyse av det vandige medium som inneholder den transformerende vekstfaktor i uren form, mot en vandig, svak organisk syre for å gi en løsningsmiddelfase som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid hvis fase er konsentrert og eventuelt klaret, idet det vandige medium som inneholder nevnte transformerende vekstfaktor-polypeptid i uren form, f.eks. er en kroppsvæske som inneholder transformerende vekstfaktor eller et vandig medium kondisjonert med en
transformerende vekstfaktor-produserende cellelinje,
(2) gjendannelse av den konsentrerte løsningsmiddelfase fra trinn (1) med en vandig, svak organisk syre og underkastelse av den gjendannede løsning for gelpermeasjonskromatografi ved å tilsette gjendannet løsning til en gelpermeasjons-kromatograf i-kolonne kondisjonert med en vandig, svak organisk syre og eluering med den vandige, svake organiske syre for å få valgte fraksjoner av eluat som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid i en forøket renhetstilstand, idet nevnte valgte fraksjoner blir kombinert og konsentrert for å gi et delvis renset, transformerende
vekstfaktor-polypeptid-holdig produkt,
(3) å underkaste det delvis rensede, transformerende vekstfaktor-polypeptid-holdige produkt fra trinn (2) sekvensiell revers fase-høytrykks-kromatografi ved å la nevnte produkt, etter gjendannelse i en vandig, sterk syre, passere gjennom en eller flere hydrokarbonbundne silisiumdioksyd-matrikskolonner som er blitt likevektsinnstilt med vandig, sterk syre under høytrykks-væskekromatografibetingelser, idet den første eluering av kolonnen blir utført ved å bruke en lineær acetonitrilgradient i vandig, sterk syre, og den på-følgende kolonne-eluering, som blir utført på de kombinerte, transformerende vekstfaktor-polypeptid-holdige fraksjoner fra det innledende høytrykks-kronratografitrinn, blir utført ved å bruke en lineær 1-propanol-gradient i vandig, sterk syre, idet nevnte 1-propanol-gradient blir økt i tilstrekkelig små 1-propanol-konsentrasjonsforøkninger for å gi det transformerende vekstfaktor-polypeptid som en enkelt
distinkt topp i en tilstand av homogent polypeptid, eller (b) sekvensiell kobling av aminosyrer, i rekkefølgen gitt ved polypeptid- eller oligopeptid-formelen, på en passende bærer, idet bæreren fortrinnsvis er polystyrenharpiks.
Som vandig, svak organisk syre i trinn (a) (1) og (2) anvendes fortrinnsvis vandig eddiksyre, og som vandig, sterk syre i trinn (a) (3) anvendes fortrinnsvis vandig trifluoreddiksyre.
Peptid-sekvensen som karakteriserer basisproteinstrukturen inneholder seks cysteinrester plassert i kritiske posisjoner i polypeptidskjelettet. Det er tenkt at plasseringen av cystein-restene tillater polypeptidet å folde på en spesiell måte som et resultat av disulfidbroer mellom cysteinpar, og derfor å fremvise en tredimensjonal struktur som bidrar til den biologiske virkning av det resulterende protein. Det er noen tegn som tyder på en spesiell disulfid-bro-sekvens (nummereringen av Cys-restene i formel I ovenfor 1 til 6 og fra venstre til høyre) Cys-1 er bundet til Cys-3, Cys-2 er bundet til Cys-4 og Cys-5
er bundet til Cys-6 ved disulfidbindinger i biologisk aktive former av basisproteinstrukturen. Den nøyaktige kjemiske natur av aminosyrerestene nevnt for aminosyresekvensene plassert mellom Cys-restene i formel I, viser seg ikke å være spesielt avgjørende, forutsatt at minst 10 forskjellige aminosyrer fra gruppen nevnte for formel I anvendes, og ingen aminosyrer ble gjentatt mer enn fire, fortrinnsvis tre ganger som påfølgende rester i noen gitt sekvens. Av aminosyrerestene satt opp for formel I, er preferanse gitt til Val, Ser, His, Phe, Lys, Asp, Thr, Gin, Leu, Glu, Pro, Ala og Gly. En foretrukken gruppe av
biologisk aktive polypeptider som har minst én peptidsekvens av formel I, er polypeptider og oligomerer av disse av formel IV:
hvor AA er en aminosyrerest valgt fra Val, Ser, His, Phe, Asn, Lys, Asp, Thr, Gin, Arg, Leu, Glu, Pro, Ala, Gly, Trp og Tyr, og n er et helt tall på fra 4 til 10, m er 7, o er 4 eller 5,
p er 10, q er 8 og r er et helt tall på fra 6 til 12. I denne foretrukne gruppe er enda videre preferanse gitt til polypeptider eller oligomerer av disse hvor o er 4 og n og r er 7. Med denne foretrukne gruppe kan aminosyrerestene betegnet med AA også være Ile og/eller Met, i tillegg til aminosyrerestene nevnt tidligere for formel IV. Mest foretrukne er polypeptider hvor aminosyrerestene i sekvensene plassert mellom Cys-restene, er valgt fra Val, Ser, His, Phe, Lys, Asp, Thr, Gin, Leu, Glu, Pro, Ala og Gly. Typisk vil polypeptidene i henhold til formel I og IV ha molekylvekter som varierer fra ca. 5.000 til
ca. 35.000. Foretrukne polypeptider i dette henseende har molekylvekter i området fra 5.000 til 8.000.
Som anmerket ovenfor betraktes også en ny klasse av TGF-polypeptider og oligomerer av disse av formelen (formel II og IIA ovenfor):
hvor R er Asp eller Lys, R' er Phe eller Tyr, R'* er Ser eller Phe og R'<*>' er Phe eller Tyr. Denne nye klasse av polypeptider har man fått ut fra det funn at noe TGF fått fra en rekke patte-dyrarter (både murine og humane) har stofflig homologi i amino-
syreoppbyggingen av peptidsekvensen (mer enn 90% av sekvensene er identiske) og også de samme biologiske egenskaper. Spesielt forårsaker TGF-polypeptider i henhold til formelen gitt ovenfor, tap av tetthets-avhengig inhibering av cellevekst i monolag-kultur, overvekst i monolag-kultur, karakteristisk forandring i cellulær morfologi og ervervelse av festepunkt-uavhengig vekst når anvendt på utransformerte, ikke-neoplastiske indikatorceller dyrket i kultur. I tillegg til å være ekstremt potente cellevekst-fremmere og utførere av celletransformering konkurrerer TGF-polypeptidene i henhold til formelen ovenfor med EGF for binding til cellulær EGF-reseptor og har også evnen til å aktivere et enzym, en protein kinase, i humane tumorcellemembraner. Foretrukne TGF-polypeptider av formel II ovenfor inkluderer dem hvor R er Asp, R<1> er Phe, R'<1> er Ser og R''' er Phe eller hvor R er Lys, R' er Tyr, R" er Phe og R11' er Tyr. Foretrukne TGF-polypeptider av formel IIA ovenfor inkluderer slike hvor R er Asp, R' er Phe, R" er Phe og R<1>" er Tyr. Som vil bli diskutert mer detaljert nedenfor, kan disse TGF-polypeptider fås på en passende måte fra en rekke transformerte humane og murine cellelinjer, noen embryoniske cellelinjer og kroppsvæsker av tumor-bærende pattedyr som bruker isolasjonsfremgangsmåten av oppfinnelsen eller ved konvensjonelle syntetiske eller rekombi-nante måter for å syntetisere polypeptider. Typisk vil molekylvekten av TGF-polypeptidene og oligomerene av disse av formel II og IIA være i området fra ca. 5.000 til ca. 35.000. Med hensyn på dette er fortrinn gitt til TGF-polypeptider som har en molekylvekt på fra ca. 5.000 til 8.000.
Gjenkjennelse av den reelle peptidsekvenshomologi i den
nye klasse av TGF-polypeptider av formel II og IIA ovenfor og likheten i biologiske egenskaper assosisert med den, tillater videre definering av en klasse polypeptidvekstfaktorer som er innen rammen av foreliggende oppfinnelse. Disse polypeptidvekstfaktorer er definert som å minneholde ett eller flere av de følgende peptidfragmenter:
Foretrukne polypeptider i dette henseende inkluderer polypeptider som inneholder en kombinasjon av peptidfragmenter A og C eller B og E og polypeptider som inneholder en kombinasjon av peptidfragmenter B og C. Mest foretruknne er polypeptider som inneholder fragmenter B, C og D eller B og E. Igjen vil polypeptidfaktorene som inneholder ett eller flere av peptidfrag-mentene A, B, C, D, E og F generelt ha en molekylvekt i området fra ca. 1.000 til 35.000, fortrinnsvis fra 1.000 til 8.000. Den nedre ende av molekylvektområdet vil inkludere de ovenfor spesifiserte peptidfragmenter selv som fullstendige polypeptider som har den karakteristiske vektfaktor-biologiske aktivitet.
Tidligere er det blitt anmerket at TGF-polypeptidene av foreliggende oppfinnelse er av verdi i oppdagelsen av maligniteter i pattedyr siden produksjonen og/eller forhøyde nivåer av produksjon av TGF-polypeptider er karakteristisk for morfologisk transformasjon av bestemte humane og murine cellelinjer. I dette henseende har antistoffer til TGF-polypeptidene anvendelse i diagnostikk av maligniteter siden de kan anvendes til å påvise ekstremt lave nivåer av TGF-polypeptid som er til stede i tumorceller eller kroppsvæsker. Mens hele TGF-polypeptidmolekylet kan anvendes for å danne antistoffer (både polyklonale og monoklonale) er det også mulig og fordelaktig med henblikk på omkost-ninger og teknisk utførelse å bestemme forskjellige områder i TGF-polypeptidsekvensen som er sannsynlig å være determinant-steder og å bruke disse oligopeptidene på minst ca. 8 aminosyrer, typisk minst ca. 10 og ikke mer enn ca. 20 aminosyrer, til å definere et hapten som kan brukes til å indusere antistoff-dannelse. Som videre diskutert nedenfor er oligopeptidet bundet til et passende immunogen og ført inn i et virveldyr for å produsere de ønskede antistoffer. Følgelig gir den foreliggende oppfinnelse også en rekke oligopeptider som svarer til de antigene områdene i TGF-polypeptidene. Eksempler på typer av de antigene oligopeptider som er anvendbare i dannelse av antistoffet i henhold til foreliggende oppfinnelse, er satt opp nedenfor.
Et annet sammensetningsaspekt er en klasse av oligopeptider som har terapeutisk verdi i behandling av maligniteter. Disse oligopeptider har evne til å binde cellulære vekstfaktor-reseptorer uten å forårsake feno-typisk transformering av cellen, og derfor kan de effektivt konkurrere med TGF-polypeptider om tilgjengelige reseptorsteder på cellen og avbryte eller minske celletransformering som er karakteristisk for TGF-binding til cellereseptorer. 01igopeptidene som fremstilles ved oppfinnelsen som har evne til å binde cellulære reseptorer, er av formelen (formel III ovenfor):
hvor R er Phe eller Tyr og AA er en aminosyrerest valgt fra Val, Asn, His, Ser, Lys, Ile, Gly, Leu, Asp, Asn, Cys, Thr, Ala, Tyr, Pro, Glu, Gin og Arg, og x er 0 eller et helt tall på fra 1 til
6, y er 2, z er 3 og z' er 0 eller et helt tall på fra 1 til 6. Foretrukne oligopolypeptider i henhold formelen ovenfor inkluderer disse hvor x og z<*> er 0 og AA er en aminosyrerest valgt fra Val, His, Ser, Ile, Gly og Asp. En ønsket gruppe av biologisk aktive oligopeptider beslektet med dem av formel II er de som inneholder to glycinrester i tillegg til å ha en sekvens av den følgende
formel:
hvor aminosyrerestene betegnet med AA, er de samme som dem som er nevnt i formel III ovenfor men inkluderer Phe, og betegnelsene x og z' er som gitt for formel III ovenfor. Disse oligopeptider antar en felles tredimensjonal struktur som kan tilskrives disul-fidbroene mellom de to cysteiner. Denne disulfidbroen karakteriserer de biologisk aktive former av oligopeptidene. Spesielt foretrukne oligopeptider i dette henseende er valgt fra klassen som består av
Polypeptidene og oligopeptidene fremstilt ved oppfinnelsen som definert ved de strukturelle formler (formler I til IV) og peptidsekvenser gitt ovenfor kan bli fremstilt ved syntetiske teknikker, teknikker hvorved peptidet blir islolert fra en naturlig forekommende kilde, f.eks. cellelinjer og kroppsvæsker, og ved teknikker som anvender hybrid DNA teknologi. For disse polypeptider og oligopeptider av oppfinnelsen som inneholder opp til ca. 50 aminosyrerester, har det passet å anvende konvensjonell fast fase peptidsyntese. I denne generelle syntetiske fremgangsmåte for å lage peptider som er beskrevet f.eks. i US-patent
4.341.761 til Ganfield et al., anvendes kjente sidekjede-
beskyttende grupper og konvensjonelle polystyrenharpiksbærere - f.eks. klormetylerte harpikser, hydroksymetylharpikser eller benzhydrylaminharpikser - for å utføre aminosyrekoblingen. For polypeptider som inneholder overskudd på ca. 50 aminosyrerester kan fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for å isolere homogen TGF fra naturlige kilder, som er beskrevet i detalj nedenfor, passende anvendes for å få rene former av det ønskede peptid. I dette henseende inkluderer spesielt passende kilder for TGF-polypeptider i henhold til oppfinnelsen, serum-fritt medium kondisjonert med retrovirus-transformerte Fischer rotte-embryofibroblaster, spesielt fibroblaster transformert med Snyder-Theilen felin - sarkomvirus, Moloney murin-sarkomvirus-transformerte mus 3T3-celler og humane metastatiske mélanom-cellelinjer A2058 og A375. Kilder og metoder for passende murine cellelinjer er beskrevet i DeLarco et al., (1980) J. Biol. Chem. 255, s. 3685-3690 og Ozanne et al., (1980) J. Cell. Physiol. 105, s. 163-180. Kilder og metoder for humane cellelinjer er på samme måte beskrevet i Todaro et al., (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, s. 5258-5262 og Giard et al. (1973) J.Natl. Cancer Inst., 51, s. 1417-1423. Isoleringsfremgangsmåten av oppfinnelsen beskrevet nedenfor, kan også anvendes til å få TGF-polypeptider fra forskjellige kroppsvæsker slik som urin, serum, plasma, fullblod eller cerebrospinalvæske fra mennesker eller mus som bærer maligniteter, eller transformerte celler som produserer de nye TGF-polypeptider. I dette henseende er en passende kilde for TGF-polypeptidene urin eller andre kroppsvæsker av mus som er blitt inokulert med tumorceller (humant melanom eller transformert rotte) kjent for å produsere TGF-poypeptider. I alle tilfelle kan identifiseringen og renheten av TGF-polypeptidene kontrolleres ved en radio-reseptorprøve basert på reseptor kryss-reaktivitet med EGF (se eksperimentelle eksempler nedenfor). I teknikker som anvender rekombinant eller hybrid DNA-teknologi kan oligopeptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen eller segmenter av slike polypeptider, som inneholder opptil f.eks. 20 aminosyrer , anvendes til å dedusere kodesekvensen for enkelt-trådet nukleotid-(DNA)-prøver. Disse nukleotidprøver kan bli syntetisert ved å bruke kjente syntetiske teknikker og brukt som prøve til å få messenger RNA til å kode for vekstfaktor-type polypeptider i både normale og transformerte celler eller kroppsvæsker som inneholder nevnte peptider. Så snart messenger RNA er fått,
kan konvensjonelle teknikker brukes til revers transskribering av mRNA til cDNA og etterfølgende kloning av cDNA i en passende vektor for å få fremstilling av det ønskede polypeptid.
Prosessen i henhold til oppfinnelsen gir en enestående effektiv metode for å oppnå TGF-polypeptider i homogen form fra forskjellige vandig baserte væsker som inneholder mindre rene former av TGF-polypeptidene slik som serum-frie medier kondisjonert med transformerte cellelinjer som produserer TGF-polypeptider eller kroppsvæsker, f.eks. urin fra pattedyr som bærer maligniteter eller transformerte celler som produserer TGF-polypeptidene. Viktige aspekter av denne unike isolering eller rensningsprosess inkluderer et initielt ekstraksjons eller dialyseskritt som anvender vandig eddiksyre, påfølgende gelpermeasjons-kromato-grafering av den syre-løselige TGF-inneholdende aktivitet, og til slutt, revers fase-høytrykks-væskekromatografi som anvender sekvensielt acetonitril og 1-propanol i nærvær av vandig trifluoreddiksyre. Vidt definert involverer denne fremgangsmåte isolering av et homogent transformerende vekstfaktor-polypeptid fra et vandig medium som inneholder nevnte transformerende vakstfaktor-polypeptid i uren form ved fremgangsmåteskritt som innbefatter: (1) dialyse av det vandige medium som inneholder den transformerende vekstfaktor i uren form mot vandig eddiksyre for å gi en løsningsmiddelfase som inneholder transformerende vekstfaktorpolypeptid hvis fase er konsentrert og mest mulig oppklarnet, (2) å gjenoppløse den konsentrerte løsningsmiddelfase av skritt 1) med vandig eddiksyre og underkaste den gjendannede løsning gelpermeasjons-kromatografi ved å tilsette gjendannet løsning til en gelpermeas jons-kromatograf ikolonne kondisjonert med eddiksyre og eluere med vandig eddiksyre for å få selekterte fraksjoner av eluat som inneholder transformerende vekstfaktorpolypeptid i en forøket renhetstilstand, idet nevnte selekterte fraksjoner blir ført sammen og konsentrert for å gi et delvis renset, transformerende vekstfaktorpolypeptid-inneholdende produkt, (3) å underkaste det delvis rensede, transformerende vekstfaktorpolypeptid-inneholdende produkt av skritt
2) sekvensiell revers fase-høytrykkskromatografi ved
å la nevnte produkt passere etter gjenoppløsning i vandig trifluoreddiksyre, gjennom en eller flere hydrokarbonbundne silisiumdioksyd-matrikskolonner som er blitt ekvilibrert med vandig trifluoreddiksyre under høytrykks-væskekromatografibetingelser, idet den initielle kolonne-eluering blir utført ved å anvende en lineær acetonitrilgradient i vandig trifluoreddiksyre og den påfølgende kolonne-eluering som blir utført på de kombinerte, transformerende vekstfaktorpolypeptid-inneholdende fraksjoner av det initielle høytrykks-kromatografiskrittet, idet den blir utført ved å anvende en lineær 1-propanolgradient i vandig trifluoreddiksyre, idet nevnte 1-propanolgradient økes i tilstrekkelig små 1-propanol-konsentrasjonstilvekster for å gi det transformerende vekstfaktorpolypeptid som en enkelt distinkt topp i tilstand av et homogent polypeptid.
Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan anvendes for å isolere homogen TGF fra serumfritt medium kondisjonert ved transformerte, TGF-produserende cellelinjer.
I denne foretrukne anvendelse er det kondisjonerte medium passende oppklaret, f.eks. ved sentrifugering og konsentrert forut for dialyse og den TGF-inneholdende løsningsmiddel-
fase fra dialyse er passende oppklaret, f.eks. ved sentrifugering og også konsentrert forut for gelpermeasjonskromatografi. I alle tilfeller blir dialysen passende utført ved å anvende et vandig eddiksyreløsningsmiddel som har en eddiksyrekonsentrasjon på fra 0,01 til 1 molar, med 0,1 molar eddiksyre som det foretrukne. Gelpermeasjonskromatografien kan utføres ved å bruke en rekke geler konvensjonelt anvendt til å separere proteiner eller polypeptider basert på molekylær størrelse. Passende geler inkluderer dekstrangeler, agarosegeler og polyakrylamidgeler. I dette henseende er fortrinn gitt til polyakrylamidgel-filtreringsharpikser (Bio-Gel®) slik som Bio-Gel- P-10, Bio-Gel P-30 og Bio-Gel P-60, Bio-Gel P-10 som spesielt er foretrukne.
Den vandige eddiksyre anvendt for å kondisjonere kolonnen og til å eluere de TGF-inneholdende fraksjoner, har passende en eddiksyrekonsentrasjon på fra 0,2 til 2,0 molar, med 1,0 molar eddiksyre som det foretrukne. De TGF-inneholdende fraksjoner som eluerer fra kolonnen, kan bli identifisert ved å bestemme deres EGF-konkurrerende virkning og vekstfremmende virkning i bløt agar (se eksperimentelle eksempler nedenfor). Etter gelpermeas jonskromatograf i blir fraksjonene som inneholder TGF-polypeptider i en forøket tilstand av renhet, samlet sammen og konsentrert, f.eks. ved lyofilisering som et forberedende skritt for videre rensning ved revers fase-høytrykks-væskekromatografi
(HPLC).
Sluttstadiet av rensningsprosessen av oppiinnelsen involverer sekvensiell HPLC med acetonitril og 1-propanol i nærvær av vandig trifluoreddiksyre. Denne sekvensielle HPLC kan utføres ved å bruke en eller flere HPLC-kolonner, men det er foretrukket å utføre de sekvensielle HPLC-skritt ved å anvende en enkelt HPLC-kolonne. Kolonnepakningen som anvendes, er mest passende en porøs silisium-matriks til hvilken et langkjedet hydrokarbon, f.eks. hydrokarbon som inneholder 16-22 karbonatomer, er bundet. Foretrukne pakninger er yBondapak hydrokarbonkolonner, spesielt yBondapak-C^g-kolonne (10-ym partikkelstørrelse,
0,39 x 30 cm, Waters Associates). Typisk blir fremgangsmåten utført under trykk, fortrinnsvis i området på fra ca. 3,5 til ca. 350 kg/cm 2. Forut for tilsetning til kolonnen, blir de konsentrerte TGF-inneholdende fraksjoner gjenoppløst i en vandig 1 til 10% trifluoreddiksyre og justert til en pH i området 2-5, fortrinnsvis 3,5, ved tilsetning av trifluoreddiksyre. Kolonnen blir passende ekvilibrert med 0,01 til 0,1% vandig trifluoreddiksyre, fortrinnsvis 0,05% trifluoreddiksyre før injeksjon av prøve. Den første elueringen blir utført med acetonitril i en 0,ol til 0,1%, fortrinnsvis 0,05% trifluoreddiksyre som bruker en lineær acetonitrilgradient (acetonitrilkonsentrasjon økt lineært ved en gradient i området på ca. 0,1%/min. til ca. 1%/min.). Elueringen blir utført over en tidsperiode på fra 0,2 til 3 timer ved en strømningshastighet på ca. 0,2-2 ml/min. og ved en temperatur på fra 10 til 50°C, fortrinnsvis ca. 40°C. De samlede fraksjoner som inneholder TGF-aktivitet som bestemt
ved EGF-konkurrering og bløt agarprøve, ble konsentrert, f.eks. ved lyofilisering, forut for det andre skritt av HPLC idet man anvender 1-propanol-løsningsmiddel. For det andre skritt av den sekvensielle HPLC blir de samlede og konsentrerte fraksjoner fra den første HPLC-eluering gjenoppløst i 0,01-0,1% trifluoreddiksyre og rekromatografert på samme kolonne eller en annen kolonne som er ekvilibrert med trifluoreddiksyre på en måte som er identisk til den som ble anvendt for den første kolonne. Denne andre eluering blir utført med 1-propanol i en 0,01-0,1%, fortrinnsvis 0,035% trifluoreddiksyre som anvender en lineær 1-propanolgradient. Det er viktig for optimale resultater å anvende en grunn lineær 1-propanolgradient i dette skritt. Spesielt bør 1-propanolkonsentrasjonen økes lineært ved en gradient som ikke overstiger 0,1%/min. og fortrinnsvis bør den lineære 1-propanolgradient holdes mellom 0,01%/min. og 0,05%/min. under elueringen. Denne andre eluering bør passende utføres over en tidsperiode på fra 1 til 5 timer ved en strøm-ningshastighet på ca. 0,5-5 ml/min. og ved en temperatur på fra 10 til 60°C, fortrinnsvis ca. 40°C. Ved å kontrollere den lineære 1-propanolkonsentrasjonsgradient ved de lave nivåene gitt ovenfor er det mulig å eluere TGF-polypeptider som vel-definerte topper av TGF-aktivitet i form av homogene polypeptider.
Med isolasjonsfremgangsmåten av oppfinnelsen er det mulig
å gjenvinne opptil ca. 70% av utgangs-TGF-aktiviteten i det urene startmateriale mens man oppnår grader av renselse på mer enn 200.000 fold. De homogene TGF-polypeptider fått ved isolasjons-prosessen av oppfinnelsen har typisk molekylvekter i området på ca. 5.000 til ca. 35.000 og er av tilstrekkelig renhet til å tillate dannelse av peptidsekvenser. Foretrukne homogene TGF-polypeptider som fås med fremgangsmåten av oppfinnelsen inkluderer TGF som har tydelige molekylvekter på 7.400, 20.000 og 30.000 til 35.000. Disse homogene TGF-polypeptider viser karakteristiske biologiske egenskaper av TGF-polypeptider når de anvendes på utransformerte, ikke-neoplastiske indikatorceller som vokser i kultur som inkluderer ervervelse av festepunkt-uavhengighet med resulterende evne til å vokse i bløt agar. Videre kan de homogene TGF-polypeptider brukes til å danne antistoffer (se nedenfor) som har verdi i oppdagelse og behandling av cancer og andre
proliferative sykdommer. I dette henseende er det ikke nødvendig at hver av formene av TGF blir renset til homogenitet for å kunne produsere antistoffer mot de forskjellige TGF-peptider. Disse forskjellige former av antistoffer mot TGF-polypeptidene
er også betraktet i denne oppfinnelse.
Antistoffer kan inkludere både monoklonale og polyklonale antistoffer dannet mot TGF-polypeptider av formel II gitt ovenfor, antigene oligopeptider fått fra TGF-polypeptidene av formel II og de homogene TGF-polypeptider fått ved å bruke isolasjonsfremgangsmåten av oppfinnelsen fra forskjellig transformerte cellelinjer og kroppsvæsker av pattedyr som bærer maligniteter eller transformerte celler. Antistoffene kan fremstilles på en rekke måter av kjent
metode, avhengig av om monoklonale eller polyklonale antistoffer er ønsket. For polyklonale antistoffer blir et virveldyr, typisk et husdyr, hyperimmunisert med antigen og blodet samlet kort etter gjentatte immuniseringer og gamma-globulinet isolert. Passende metoder for å fremstille polyklonale antistoffer er beskrevet i Handbook of Experimental Immunology, 3. utgave, Weir, Editor, Blackwell Scientific publi-cations, Oxford og London, 1978. For monoklonale antistoffer blir et lite dyr, typisk en mus eller rotte, hyperimmunisert med antigen, milten fjernet og lymfocyttene sammensmeltet med myelomceller i nærvær av en passende fusjonsfremmer. De resulterende hybridceller eller hybridomer blir filtrert for å isolere individuelle kloner, hvorav hver utskiller en enkel type antistoff mot antigenet. Den enkelte antistofftype som fås på denne måte er hver produktet av en enkelt B-celle fra det immune dyr dannet som svar på et spesifikt antigensted gjenkjent på det immunogene stoff. Den generelle fremgangsmåte for å få monoklonale antistoffer, inkludert de som følger oppfinnelsen, er beskrevet av Kohler og Milstein (1975) Nature 256,s.495-497. Polypeptidene og de antigene oligopeptider fremstilt ved oppfinnelsen kan anvendes direkte i immuniseringsfremgangsmåten eller de kan bindes til et passende bærerprotein idet man bruker metoder som er kjent i teknikken, f.eks. se US-patent 4.341.761 til Ganfield et al. Anvendelse av et bæreprotein er spesielt foretrukket når immuniseringen blir utført ved å bruke de antigene oligopeptider av oppfinnelsen.
Antistoffene kan brukes på en rekke måter.
I en foretrukket anvendelse kan de brukes for diagnose av maligniteter og andre proliferative sykdommer. I tilfeller hvor antigenet kan finnes i en fysiologisk væske eller ved en konsentrasjon som kan differensieres bare når malignitet eller andre proliferative sykdommer eksisterer, kan fysiologisk væske såsom serumplasma, fullblod eller cerebrospinalvæske prøves. Antistoffer anvendt i prøver kan være merket eller umerket. Umerkede antistoffer kan anvendes i agglutinasjon; merkede antistoffer kan anvendes i en lang rekke prøver, idet man anvender en lang rekke markører, såsom radionuklider, enzymer, fluorescerende stoffer, enzymsubstrater eller kofaktorer eller lignende. Disse teknikker er rikelig beskrevet i litteraturen og eksempelvise prøver kan finnes i US-patenter nr. 3.817.834; 3.935.074; 4.233.402 og 4.318.980, for å illustrere.
I noen teknikker vil det være nyttig å merke antigenet
eller fragmentet av dette, heller enn antistoffet, og ha en konkurranse mellom merket antigen og antigen i prøven om antistoff. I denne situasjon er det vanlig å frembringe kar som har kombinasjonen av det merkede antigen eller merkede fragment og antistoffet i mengder som gir optimum sensivitet og nøyaktighet.
I andre situasjoner er det ønskelig å ha en fast bærer hvor
enten antigen eller antistoff er bundet. Et polyepitopisk antigen kan tjene som en bro mellom antistoff bundet til en bærer og merket antistoff i prøvemediet. Alternativt kan man ha en konkurranse mellom merket antigen og et hvilket som helst antigen i prøven om en begrenset mengde av antistoff.
Hvor antigenet ikke kan finnes i en fysiologisk væske eller hvis funnet der, ikke.er diagnostisk for malignitet eller den mål-proliferative sykdom, da vil cellene måtte isoleres og cellene prøves for nærvær av antigen. For oppdagelse av antigen kan vevsprøven bli lysert ved konvensjonelle metoder, f.eks. base, rensemidler eller lignende, cellulære rester separeres ved filtrering eller sentrifugering og filtratet eller supernatanten isoleres og gjennomgår prøve.
For terapiformål kan enten xenogeneiske eller allogeneiske antistoffer anvendes, avhengig av behandlingens natur, og om de fremmede antistoffer vil indusere en immunrespons. Litteraturen har beskrevet et stort antall måter for å lage humane antistoffer, hvor man har funnet at mus eller andre pattedyr-antistoffer ikke er tilfredsstillende. Antistoffene kan anvendes på en lang rekke måter. Ved å anvende det passende IgG (andre enn IgG^) kan man indusere lysis gjennom den naturlige komplementprosess. Alternativt kan den lyserende del av toksin bli forenet med antistoffene, spesielt et Fab-fragment. Antistoffene kan bli bundet til liposomer for å rette liposomene mot de maligne cellene slik at de blir fordøyet av cellene ved sammensmeltning av membranene. Andre merker kan også bindes til antistoffene, slik som radionuklider, fluorescerende stoffer, enzymer og lignende. Ved å introdusere antistoffene in vivo vil antistoffene rette merkingen mot den maligne celle hvorpå nærvær av malignitet kan diagnosti-seres eller behandles.
Dannelsen av antistoffer vil variere sterkt, avhengig av naturen av merkingen, virkningen av antistoffene, stedet som antistoffene er rettet mot og lignende. Vanligvis vil antistoffene bli dannet i en fysiologisk akseptabel bærer, f.eks. saltløsning eller fosfatbuffer-saltløsning, og injisert inn i verten, når mulig på det ønskede sted, og når dette ikke er mulig inn i et sirkulerende system slik som blod.
Antistoffene kan også brukes for å isolere celler
som fremstiller TGF-polypeptider og til å fjerne celler in vitro fra en heterogen cellepopulasjon som inneholder celler som fremstiller et TGF-polypeptid. Separering kan oppnås med en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS).
Denne samme teknikk kan anvendes for å identifisere og
isolere celler som fremstiller et TGF-polypeptid. For å fjerne celler som fremstiller et TGF-polypeptid fra en blanding av celler kan de ansvarlige antistoffer kombineres med kompliment, bundet til det lyserende fragment (A-fragment) av et toksin
(se E.P.O.-søknad nr. 17.507 og britisk patentsøknad nr. 2.034.324)
eller cellene kan agglutineres og separeres på fysikalske måter.
Metodene og sammensetningene som anvender de
biologisk aktive, nye polypeptider og oligopeptider blir også frembragt for behandling av cancer og andre proliferative sykdommer og for terapiformer hvor cellevekstfremmelse er fordelaktig. Spesielt blir det fremskaffet sammensetninger som anvender oligo-
peptider av formel III ovenfor for behandling av maligniteter. Videre sammensetninger som inneholder biologisk aktive polypeptider av formler I, II og IIA for behandling av cancer og andre proliferative sykdommer og for anvendelse av cellevekstfremmelse, f.eks. helbredelse av skader og sårterapi gis også. Disse terapeutiske sammensetninger innbefatter effektive mengder av de angitte oligopeptider og polypeptider i blanding med farmasøytisk akseptable bærere. Spesielt vil farmasøytiske sammensetninger som inneholder oligopeptidene og/eller polypeptidene av oppfinnelsen som en aktiv ingrediens, normalt bli dannet med en passende faststoff- eller væskebærer avhengig av den spesielle administrasjonsmåte som brukes. For eksempel er parenterale utforminger vanligvis injiserbare væsker som anvender farmasøytisk og fysiologisk akseptable væsker slik som fysiologisk saltvann, balanserte saltløsninger eller lignende som en bærer. Orale utforminger på den annen side kan være faste stoffer, f.eks. tabletter eller kapsler eller væskeløsninger eller suspensjoner.
I de terapeutiske metoder kan oligopeptidene
og/eller polypeptidene administreres til mennesker på forskjellige måter såsom oralt, intravenøst, intramuskulært, intraperitonealt, intranasalt, intradermalt og subkutant. Den spesielle administrasjonsmåte og doseringskur vil bli valgt av den nærværende lege som tar i betraktning særegenhetene av pasienten, naturen av behandlingen som trengs, og/eller sykdommen og den involvertes sykdomstilstand. For eksempel blir ødelagt vev fra sår vanligvis behandlet ved daglige eller to ganger daglige doser over noen få dager til noen få uker; mens tumor eller cancerbehandling involverer daglig eller flere ganger daglige doser over måneder eller år. Oligopeptid og/eller poly-peptidterapien av oppfinnelsen kan kombineres med andre behand-linger og kan kombineres med eller anvendes sammen med andre kjemoterapeutiske eller kjemopreventive stoffer for å gi terapi mot proliferative sykdommer, neoplasmer eller andre tilstander som de er effektive mot.
TGF-oligopeptider, polypeptider og antistoffer dannet mot disse peptider er også effektive ved påvisning og behandling av bentapsykdommer. F.eks. er TGF-aktivitet til stede i det materiale som er ansvarlig for ben-resorberende aktivitet i tumorer som assosieres med hypercalcemi (Ibbotson et al. (1983) Science 221, 1292). Øket ben-resorpsjon kan være en endokrin effekt av TGF utsondret av tumorceller.
I tillegg stimulerer forhøyede nivåer av TGF ben-resorpsjon via kalsiumlekkasje, hvilket assosieres med slike sykdommer som osteoporose. Osteoporose er en sykdom som vanligvis ses hos eldre individer, som forårsaker bentap. Anvendelse av antistoffer mot TGF kan være indikative på eksistens av osteoporose. Derfor er TGF-antistoffer nyttige i analyse og terapi av denne betydelige sykdom.
En fremgangsmåte for påvisning av bentap i en menneskevert omfatter å bringe celler eller kroppsfluider i kontakt med et antistoff av TGF og bestemme nivået av binding av nevnte antistoff til nevnte celler eller celleprodukter i kroppen som diagnostisk for en vert med bentap. Det kan lages preparater for behandling av bentapsykdom, hvor det anvendes effektive mengder av oligopeptidene, polypeptidene eller antistoffer av TGF sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer for disse.
De følgende eksempler er gitt for å illustrere.
Eksempel 1
Produksjon/ rensing og karakterisering av
en lavmolekylvekt human- transformerende
vekstfaktor ( hTGF)
A. Eksperimentell fremgangsmåte
Kilde for hTGF
hTGF ble renset fra serumfritt medium kondisjonert ved en human metastatisk melanomlinje A2058 (Todaro et al., (1980) Proe.Nati. Acad. Sei. USA 77, s.5258-5262) fått fra en hjerne-metastase i en 43 år gammel mann. Celler ble dyrket til 90% sammenflytning i rundkolber som inneholdt Dulbecco's modified Eagle's medium (Grand Island Biological Co., 430-2100),tilsatt
10% kalveserum (Colorado Serum Co.,) ved 37°C. Cellene ble vasket i 1 time med 50 ml serum-fritt Waymouth's medium (Grand Island Biological Co., MD 705/1. Dette og en annen oppsamling
av supernatantvæske ble kassert 24 timer senere. Videre oppsamlinger ble gjort annen hver dag eller hver tredje dag over en 2 ukers periode.
Mediet ble oppsamlet ved dekantering, lagret i opp til
24 timer ved 4°C i nærvær av proteaseinhibitoren fenylmetan-sulfonylfluorid (1 ug/ml) og renset ved kontinuerlig strøm-sentrifugering ved 32.000 opm ved 4°C. Strømningshastigheter på 5 liter/time i CF-32 kontinuerlig strømningsrotor (Beckman) i modell L5-50 ultrasentrifuge (Beckman) ble anvendt. Supernatanten etter sentrifugering ved høy hastighet, vil bli referert til som A2058-kondisjonert medium.
Det A2058-kondisjonerte medium ble øyeblikkelig konsentrert i den hule fiber Dialyzer/Konsentrator (Model DC10, type H1095-20 cartridge, Amicron Corp.) ved 10°C. Konsentratet ble vasket etter en 150 gangers reduksjon i volum. Patronen ble vasket med 1000 ml Waymouth's medium. Ultrafiltratet ble kassert.
Rensing av hTGF
Dialyse og sentrifugering
Den kombinerte gjenværende del og patronvask etter ultrafiltrering av A2058-kondisjonert medium ble dialysert i 60 timer mot 0,1M eddiksyre i Spectrapor 3 dialysetube (Spectrum Medical
Industries). Den gjenværende del ble sentrifugert ved
100.000 x g i 1 time ved 4°C. Pelleten ble kassert. Supernatanten ble konsentrert ved lyofilisering og gjenoppløst i 0,5 ml IM eddiksyre/liter av opprinnelig A2058-kondisjonert medium.
Kromatografi på Bio- Gel P- 10
Etterfølgende konsentrasjon, dialyse og sentrifugering
ble supernatanten som inneholdt hTFG-aktivitet videre renset ved gel-permeasjons-kromatografi på en kolonne (2,5 x 85 cm)
(420 bed volum) av Bio-Gel P-10 (200-400 mesh, Bio-Rad Laboratories) . Kolonnen ble ekvilibrert med IM eddiksyre ved 22°C. Prøver på protein (65-115 mg) i IM eddiksyre (5 ml) ble tilsatt til kolonnen. For å sikre en konstant strømningshastighet ble kolonneutløpet regulert til 12 ml/time med en peristaltisk pumpe. 4,8 ml fraksjoner ble samlet. Alikvoter ble lyofilisert for etterfølgende bestemmelser av EGF-konkurrerende virkning og vekst-fremmende virkning i bløt agar. Fraksjoner som representerte hoveddelene av en gitt topp ble samlet og konsentrert ved lyofilisering.
Revers fase- høytrykks- væskekromatografi
Sluttrensningen av hTGF ble oppnådd ved revers fase HPLC ved å anvende den generelle fremgangsmåte beskrevet i Marquardt et al., (1981) J. of Biol. Chem. 256, s. 6859-6865. Alle separeringer ble utført på en yBondapak-C^g-kolonne (10 <y>m partikkelstørrelse, 0,39 x 30 cm, Waters Associates) ved en strømningshastighet på 1 ml/min ved 40°C. Lyofiliserte prøver ble gjenoppløst i 0,05% (v/v) trifluoreddiksyre i vann, justert til pH 2 med 10% (v/v) trifluoreddiksyre og tilsatt gjennom prøveinjektoren til kolonnen som var ekvilibrert med 0,05% trifluoreddiksyre. Kolonnen ble så eluert med en lineær acetonitril-gradient i 0,045% trifluoreddiksyre. Kolonneutløpet ble samlet i 1,5 ml fraksjoner. Alikvoter ble lyofilisert for etterfølgende EGF-konkurrering og vekststimuleringsprøver. Opp-samlingen av fraksjoner som innbefattet hoved-hTGF-aktiviteten ble konsentrert ved lyofilisering.
hTGF-inneholdende oppsamlinger ble gjenoppløst i 0,05% trifluoreddiksyre og rekromatografert på den samme kolonne,
på forhånd ekvilibrert med 0,05% trifluoreddiksyre i vann.
Kolonnen ble så eluert med en lineær 1-propanol-gradient i
0,035% trifluoreddiksyre. Kolonne-effluenten ble samlet i 1,5 ml fraksjoner. Alikvoter ble lyofilisert for EGF-konkurranse og vekststimuleringsprøver.
SDS- polyakrylamid- gelelektroforese
SDS-polyakrylamid-gelelektroforese ble utført som beskrevet
i Laemmli (1980) Nature (Lond) 227, s. 680-685. En 15-30% akrylamidgradientplate (140 x 120 x 0,75 mm) ble tillaget med en 4% gel lagt oppå. Gelene ble kjørt ved 30 volt med en elektrode-buffer som inneholdt tris (0,05M), glycin (0,38M) og SDS
(0,1 vekt/vol%) inntil sporfarven (bromfenolblått) hadde løpt ut av enden av gelen. Etter elektroforese ble gelene fiksert i 50% metanol, 10% eddiksyre i 2 timer, vasket i 5% metanol, 7% eddiksyre over natten, og farvet med sølv (Oakley et al., (1980)
Anal. Biochem. 105, s. 361-363.
Proteinbestemmelse
Totalt protein ble bestemt ved å bruke bovint serum-
albumin som standard. Forut for proteinbestemmelse ble utgangs-materialet dialysert mot fosfatbuffer-saltvann for å fjerne komponentene av kulturmediet som interfererte med farve-reaksjonen eller lyofiliserte hvis prøvene var blitt løst i flyktige syrer. Proteinet ble også bestemt ved aminosyreanalyse. Lyofiliserte prøver ble hydrolysert ved 110°C i 24
timer i uttømte Pyrex-tuber med 0,1 ml 6N HC1 som inneholdt 0,1% fenol i væskeform, og analysert med en Durrum D-500-analysator utstyrt med en PDP 8/A computing integrator som brukte o-ftalaldehyd til den fluorogene oppdagelse av primære aminer (Bensen et al., (1975) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72,
s. 619-622).
Radioreseptorprøve
loe
Renset EGF ble merket med Na I ved en modifisering av kloramin-T-metoden som beskrevet i DeLarco et al., (1978)
Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, s. 4001-4005. <125>I-EGF-bindings-prøven ble utført på subkonfluente monolag av formalin-fiksert A431 humane carcinom-celler som tidligere beskrevet (i DeLarco et al., (1980) J. of Biol. Chem. 255, s. 3685-3690). De fikserte cellene ble vasket to ganger med 0,5 ml av bindende buffer (Dulbecco's modifiserte Eagle's medium som inneholdt 1 mg/ml
av bovint serum-albumin og 50 mM 2-[bis(2-hydroksyetyl)amino]-etansulfonsyre, pH 6,8). Konkurranse ble initiert ved tilsetning av 0,2 ml av bindende buffer som inneholdt 0,4 ng av 125
I-EGF med eller uten potensial inhibitor. Etter inkubering
i 1 time ved 22°C ble den spesifikt bundne 12<5>I-EGF bestemt. TGF-innholdet ble uttrykt ved dens grad av inhibering av binding
125
av I-EGF til EGF-reseptoren. En EGF-konkurrerende aktivitets-enhet er definert som mengden av protein som inhiberer bindingen
125
av I-EGF til dens reseptor med 50%.
Bløt- agarveks tprøve
Prøven for kolonivekst i bløt agar som bruker normal rotte-nyre-fibroblaster, klone 49F, ble utført som gjengitt i Todaro et al., (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, s. 5258-5262. Lyofiliserte prøver som skulle testes ble gjenoppløst i 0,5 ml av Dulbecco's modifiserte Eagle's medium anriket med 10% kalveserum. 1,5 ml av 0,5% (w/v) agar (Difco) i det anrikede mediet og 0,5 ml av anriket medium som inneholdt 2,3 x 10 4 celler, ble tilsatt. 2,3 ml av den resulterende blanding ble pipettert på et 2 ml basislag (0,5% agar i anriket medium) i 60 mm Petri-skåler (Falcon). Cellene ble inkubert ved 37°C i en fuktig 5% C02/9 5% luftatmosfære. Prøven ble avlest ufiksert og ufarvet ved 5 dager og ved 10-14 dager.
B. Resultater
Kilde, konsentrasjon og utgangs-
fraksjonering av hTGF
hTGF ble isolert fra serum-fritt kondisjonert medium av den sterkt transformerte humane metastatiske melanom-cellelinje, A2058. Mengden av hTGF ble basert på to av dens egenskaper: evnen til å indusere festepunkt-uavhengig vekst av normale rotte-nyre-fibroblaster i bløt agar, og evnen til å konkurrere med <125>I-EGF om EGF-reseptorstedene på A431 humane carcinom-celler. Et sammendrag av skrittene som fører til isoleringen av hTGF og dets gjenvinnelse er presentert i tabell I.
For å fjerne serumproteiner ble A2058-celler sterkt vasket med Waymouth's medium før de ble kultivert i serum-fritt medium. Supernatantvæskene ble samlet annen hver dag over en 2 ukers periode. Kulturbetingelsene var slik at ved enden av kultur-perioden var mere enn 90% av cellene fortsatt levende og festet seg som monolag.Det initielle oppklarede A2058-kondisjonerte medium på 136 liter, som inneholdt 1,02 g av totalt protein og 4525 enheter av EGF-konkurrerende aktivitet, ble konsentrert til omtrent 900 ml ved å bruke en hul fiberkonsentrator med patroner på 5000 molekylvekt cutoff. Den totale EGF-konkurrerende aktivitet ble bevart og en gjenvinning over 9 5% ble oppnådd.
Dialyse av det konsentrerte A2058-kondisjonerte medium mot eddiksyre og påfølgende sentrifugering resulterte i 95% gjenvinning av den initielle totale EGF-konkurrerende aktivitet.
18% av proteinet var syre-uløselig og ble kastet. Det syre-løselige, delvis rensede hTGF ble underkastet gelpermeasjons-kromatograf i på Bio-Gel P-10. Kolonnen ble eluert med IM eddiksyre. Hovedmengden av det forurensende protein ble eluert i ekslusjonsvolumet av kolonnen og også separert fra den EGF-konkurrerende virkning og vekst-stimulerende virkning. To aktivitetstopper ble funnet å være godt løst fra hverandre. Fraksjoner med både EGF-konkurrerende og vekst-stimulerende virkning (P-10-A og P-10-B) hadde tydelige molekylvekter på
10.500 og 6.800, resp. Fraksjoner som bare hadde én av de to virkninger, ble ikke observert. hTGF-inneholdende fraksjoner ble samlet som angitt, lyofilisert, og videre renset. Den større molekylvekt TGF som ble eluert fra kolonnen i en bred topp (P-10-A) — viste seg å være assosiert med polypeptider av forskjellige størrelser. P-10-A inneholdt 46% av den initielle EGF-konkurrerende aktivitet. Den mindre molekylvekt TGF som ble eluert fra kolonnen i en skarp topp (P-10-B) — representerte 4 5% av den initielle totale EGF-konkurrerende aktivitet. Det oppsamlede utbytte av total input EGF-konkurrerende aktivitet fra skritt 1 gjennom gelpermeasjonkromatografiskrittct var 91% (tabell I).
hTGF ble eluert som to distingte hovedtopper som varierte kvantitativt fra én fremstilling til en annen. I noen fremstillinger av A2058-kondisjonert medium var i hovedsak all vekstfremmende aktivitet i hTGF-området.
Rensing av hTGF
hTGF ble videre renset med revers fase PHLC. Den samlede P-10-B ble etter gelpermeasjonskromatografi av den syreløselige EGF-konkurrerende aktivitet av konsentrert A2058-kondisjonert medium på Bio-Gel P-10 gjenoppløst i 0,05% trifluoreddiksyre i vann og så kromatografert på en yBondapak C^g-kolonne. EGF-konkurrerende og vekst-stimulerende aktiviteter i bløt agar av individuelle fraksjoner ble bestemt. hTGF ble godt separert fra hovedmengden av det forurensende protein som eluerte ved høyere konsentrasjoner av organisk løsningsmiddel. Fraksjoner som inneholdt hTGF, ble samlet, lyofilisert, og rekromatografert. En 57 gangers rensing av hTGF etter gelpermeasjonskromatografi ble oppnådd. 80% av den initiale EGF-konkurrerende aktivitet i samlet P-10-B ble gjenvunnet (tabell I).
Rekromatografi av de hTGF-inneholdende fraksjoner på yBondapak C-^g-bærer ble valgt for sluttrehsingsskrittet siden bare relativt små tap av EGF-konkurrerende aktivitet ble observert på disse kolonner. For å få en klar adskillelse av hTGF fra uren-heter var det nødvendig å bruke en grunn lineær 1-propanol-gradient i 0,035% trifluoreddiksyre. Hovedmengden av forurensende peptidmateriale ble separert fra en veldefinert aktivitets-topp. EGF-konkurrerende og vekst-stimulerende aktiviteter ble renset sammen med en klar absorberingstopp ved 13% 1-propanol. Fraksjoner som inneholdt hTGF ble samlet og videre analysert. Rensingen av hTGF var tilnærmet 7000 ganger etter gelpermeasjons-kromatografi med et utbytte på 33% av den initielle totale EGF-konkurrerende aktivitet. Den fullstendige gjenvinnelse av hTGF fra skritt 3 gjennom det siste revers fase HPLC-skrittet var 73% og gjenvinningsområdet pr. skritt var 80-100% (tabell I).
Karakterisering av hTGF
Renheten av den siste hTGF-fremstillingen ble bestemt ved analytisk SDS-polyakrylamid gel-elekroforese. Gelen ble farvet med sølv. Én hovedpolypeptidbinding med en tydelig M^. = 74 00
ble observert. Det samme mønster ble oppnådd når prøver ble tatt etter elektroforese under ikke-reduserende betingelser som indikerte at TGF er et enkeltkjedet molekyl.
Reseptor-reaktiviteten av hTGF ble sammenlignet med EGF i radioreseptorprøven. Kvantiseringen av hTGF var basert på aminosyreanalyse av en medfølgende alikvot. Både hTGF og EGF og <125>I-EGF konkurrerte for EGF-reseptorstedene på A431 humane carcinomceller som vist i fig. 3A. Den spesifikke EGF-konkurrerende aktivitet av hTGF ble funnet å være 1-1,5 x 10 g enheter pr. mg; 1,1 ng av hTGF eller EGF var nødvendig for å inhibere EGF-binding med 50%.
hTGF gjorde normale festepunkt-avhengige rottenyreceller, klone 49F, i stand til å vokse i bløt agar. Det halv-maksimale svar av hTGF i bløt agar ble nådd med 1 EGF-konkurrerende enhet, eller 1,1 ng av hTGF, mens EGF ikke stimulerer vekst av disse celler i bløt agar selv når de blir testet med onp til 10 yg.
Eksempel 2
Større skalaproduksjon, rensing og aminosyre-
sekvensering av human ( hTGF), rotte ( rTGF), og mus ( mTGF)- transformerende vekstfaktorer
A. Eksperimentelle fremgangsmåter
Kilde for TGF
rTGF, mTGF og hTGF ble renset fra serum-fritt medium kondisjonert med Fisher-rotte-embryofibroblaster, FRE C110, en subklone av FRE 3A (Sacks et al., (1979) Virology 97, s. 231-240), ikke-produktivt transformert ved Snyder-Theilen felin sarkom-virus (Snyder et al., (1969) Nature (Lond) 221, s. 1074-1075),
en Moloney murin sarkomvirus-transformert 3T3 cellelinje,
3B11-1C (Bassin et al., (1970) Int. J. Cancer 6, s. 95-107), og to humane metastatiske melanomlinjer, A2058 (se eks. I), og A375 (Girad et al., (1973) J. Nati. Cancer Inst. 51, s. 1417-1423), resp. Celler ble dyrket i 2-liters plastikkrundkolber som inneholdt Dulbecco's modifiserte Eagle's medium anriket med 10% kalveserum og deretter holdt i serum-fritt Waymouth's medium som beskrevet i DeLarco et al., (1978) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, s. 4001-4005. Serum-fritt kondisjonert medium ble samlet hver 24 time i en 3-dagers periode, oppklaret ved kontinuerlig strømningssentrifugering og supernatanten konsentrert (Marquardt et al., (1980) J. of Biol. Chem. 255, s. 9177-9181). Konsentratet av kondisjonert medium var startmaterialet for rensingen av TGF.
Rensing av TGF
TGF ble fremstilt hovedsakelig ved metodene tidligere beskrevet i Eksempel I for rensing av hTGF fra melanom. Den tilbakeholdte del etter ultrafiltrering av kondisjonert medium ble dialysert mot 0,1M eddiksyre, og supernatanten etter sentrifugering konsentrert ved lyofilisering og gjenoppløst i IM eddiksyre for påfølgende gelpermeasjonskromatografi på en kolonne (2,5 x 85 cm) av Bio-Gel P-10 (200-400 mesh, Bio-Rad Laboratories). Kolonnen ble ekvilibrert med IM eddiksyre. Fraksjoner som innbefattet hoved-EGF-konkurrerende aktivitet med en tydelig molekylvekt på ca. 7.000, ble samlet og lyofilisert.
Sluttrensingen av rTGF, mTGF og hTGF ble oppnådd ved revers fase HPLC ved å bruke kromatografisystemet som beskrevet i eks. I. Separasjonene ble utført på en yBondapak-kolonne (10 ym partikkel-størrelse, 0,39 x 30 cm, Waters Associates). Den mobile fase var 0,05% trifluoreddiksyre, og den mobile fase-modifiserer var acetonitril som inneholdt 0,045% trifluoreddiksyre. Konsentrasjonen av acetonitril ble økt lineært (0,083%/min) i løpet av 2 timer ved en strømningshastighet på 1 ml/min ved 4°C for eluering av peptider. TGF-inneholdende oppsamlinger ble lyofilisert og gjenløst i 0,05% trifluoreddiksyre og rekromatografert på den samme kolonne, idet man som den mobile fase-modifiserer brukte 1-propanol som inneholdt 0,035% trifluoreddiksyre. 1-propanol-konsentrasjonen ble økt lineært (0,05%/min) i løpet av 2 timer ved en strømningshastighet på 1 ml/min ved 40°C. Oppsamlinger av fraksjoner som innbefattet hoveddelen av EGF-konkurrerende aktivitet, ble lyofilisert.
Prøve for TGF
TGF ble kvantifisert i en radioreseptorprøve basert på reseptor-kryssreaktivitet med submaxillar kjertel-epidermal-
125 vekstfaktor fra mus (mEGF). Renset mEGF ble merket med Na I ved modifisering av kloramin-T-metoden som beskrevet i eksempel I. 125
I-EGF-bindingsprøven ble utført på formalin-fikserte A431 humane carcinomceller, 8 x 10"^ i Micro Test II-plater (Falcon) . Konsentrasjonen av TGF ble uttrykt i mEGF ng ekvivalenter/ml og var basert på mengden av TGF som var nødvendig for å produsere
125
lik inhibering av I-EGF-binding til A4 31-celler som en k^ent
mengde av umerket mEGF.
Aminosyresekvensbestemmelse av TGF
For aminosyresekvensanalyse ble rTGF (3 ug) redusert med ditiotreitol (20 mM) i 100 1 av tris-HCl-buffer (0,4M) som inneholdt guanidin-HCl (6M) og Na2~EDTA (0,1%), pH 8,5, i 2 timer ved 50°C og påfølgende S-karboksamidometylert med jodacetamid (45 mM) i 30 min. ved 22°C. Den S-karboksamidometylerte rTGF ble avsaltet på en uBondapak C^g-kolonne. Peptid ble eluert med en gradient av vandig acetonitril som inneholdt 0,04 5% trifluoreddiksyre. Konsentrasjonen av acetonitril ble økt lineært (1%/min) i løpet av 1 time ved en strømningshastighet på 1 ml/min ved 40°C.
Automatisert sekvensanalyse (Edman et al., (1967) Eur. J. Biochem. 1, s. 80-91) av S-karboksamidometylert rTGF og umodi-fisert mTGF og hTGF ble utført med en gassvæske-fastfase-mikro-sekvenator (Hewick et al., (1981) J. of Biol. Chem. 256, s. 7990-7997) . Sekvenatorfraksjoner ble analysert ved revers fase HPLC (Hunkapiller et al., (1983) Science 219, s. 650-659).
B. Resultater
Rensning av TGF
Rensede fremstillinger av lavmolekylvekt rTGF, mTGF og hTGF ble oppnådd fra det kondisjonerte medium av retrovirus-transformerte rotte- og mus-fibroblaster og to humane melanom-cellelinjer, resp. Rensingen ble oppnådd ved gelpermeasjons-kromatografi av den syreløselige EGF-konkurrerende aktivitet på Bio-Gel P-10 i IM eddiksyre, fulgt av revers fase HPLC på uBondapak C-^g-bærer som brukte sekvensielt en lineær gradient av vandig acetonitril og deretter 1-propanol som inneholdt 0,035% trifluoreddiksyre. Elueringsmønstrene av det siste rensnings-skrittet for rTGF, mTGF og hTGF viser at EGF-konkurrerende aktivitet renset sammen med en distinkt absorberingstopp, ble effektivt adskilt fra forurensende UV-absorberende materiale. Hovedproteintoppen i rTGF, mTGF og hTGF-fremstiIlinger eluerte fra en uBondapak C-^g-kolonne under standardbetingelser mellom 4 8 og 55 min.
Gelpermeasjonskromatografi på Bio-Gel P-10 besørget en separering av lavmolekylvekt-TGF fra større molekylvekt-TGF og reduserte mengden av protein tilsatt til en uBondapak C^g-;olonne i det følgende rensingsskritt. Små molekylvekt-TGF representerte 45-80% av den initielle totale EGF-konkurrerende iktivitet. Revers fase HPLC av TGF på uBondapak C-^g-bærer i de følgende to rensningsskritt var meget effektiv, idet hver i en typisk fremstilling ga et gjenvinningsområde på 80-100% pr. skritt. Den siste gjenvinningen av lavmolekylvekt-TGF var tilnærmet 70%, basert på den maksimale totale EGF-konkurrerende aktivitet oppdaget i løpet av rensingen. Gjennomsnittsutbytte av renset rTGF var 90 ng/liter, av mTGF 50 ng/liter og av hTGF
LO ng/liter av kondisjonert medium. Denne utregning er basert
?å den spesifikke aktivitet bestemt for isolert TGF og på antagelsen at EGF-konkurrerende aktivitet målt i radioreseptor-orøven, gir bare et bilde av nivået av total stor og liten nolekylvekt-TGF. Ingen immunoreaktiv mEGF ble oppdaget i kondisjonert medium.
Renhet av TGF
Renheten av rTGF, mTGF og hTGF angitt ved de kromatografiske elueringsprofiler, ble prøvet i EGF-radioreseptorprøven og ved aminosyresekvensanalyse. rTGF, mTGF og hTGF konkurrerte med <125>I-EGF for EGF-reseptorstedene på A4 31 humane carcinomceller og kunne kvalitativt og kvantitativt nesten ikke skilles fra mEGF. Derfor har man trodd at de siste TGF-fremstillinger var høyt renset og hovedsakelig homogene. En enkelt amino-terminal-sekvens ble bestemt ved automatisert Edman-degradering for rTGF, mTGF og hTGF. En hvilken som helst ublokkert minor peptidsekvens til stede ved >5% kunne ha blitt oppdaget ved metodene som ble anvendt. Homogeniteten av hTGF ble i tillegg stadfestet ved analytisk natriumdodecylsulfatpolyakrylamid-gelelektroforese.
Det rensede preparat gav én hovedpolypeptidbinding.
Aminosyresekvensering av TGF
Den fullstendige sekvensering av rTGF, mTGF og hTGF ble fullført, og aminosyresekvensene for de tre polypeptider er gitt nedenfor. Det vil bli lagt merke til fra sekvensene som er gjengitt, at rTGF og mTGF er identiske i kjemisk oppbygning og videre at reell homologi eksisterer mellom murin-TGF og hTGF
med forskjellige aminosyrerester som forekommer bare i posisjoner
7, 15, 28 og 41 i sekvensene.
(1) rTGF
(2) mTGF (3) hTGF
Eksempel 3
Produksjon av TGF in vivo og dets isolering Tumorcellelinjer (1 x 10 ) kjent for å produsere TGF (humant melanom og transformert rotte) ble inokulert i atymisk "nakne" mus og tumorer fikk anledning til å utvikles. Urin fra de tumor-bærende mus ble samlet og analysert for nærvær av TGF idet man brukte isolasjonsprosedyren og analytiske teknikker gitt i eksempel 1 ovenfor. TGF ble oppdaget i urinen av de tumor-bærende mus, som har den samme størrelse og elueringsegenskaper på HPLC som cellekulturen fått fra TGF som er beskrevet i eksempel 1 og 2 ovenfor. Videre, idet man anvendte fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 ovenfor, ble TGF til stede i museurin funnet å ha de karakteristiske TGF-biologiske egenskaper, ved at den stimulerer festepunkt-uavhengig vekst av celler og binder seg til EGF-reseptoren. Videre ble tumorene fjernet fra de tumor-bærende mus, og urinen fra musene etter at tumoren var fjernet ble testet for nærvær av TGF, idet man anvendte de ovenfor nevnte fremgangsmåter. I dette tilfelle ble det ikke funnet noe TGF
som hadde de karakteristiske elueringsegenskaper på HPLC eller TGF-lignende biologisk aktivitet. Disse resultater demonstrerer at tumorceller produserer TGF i levende dyr like meget som i cellekulturer, og at TGF kan oppdages i og isoleres fra kroppsvæsker ved å bruke fremgangsmåten av oppfinnelsen. Lignende eksperimenter ble også utført med rotter som hadde kjemisk carcinogen-induserte tumorer, og de ble funnet å ha TGF i urinen, basert på de biologiske og biokjemiske egenskaper satt opp nedenfor, mens ubehandlede rotter ikke hadde det.
Eksempel 4
Inhibering av retroviral transformert
cellevekst in vitro med antistoffer
mot antigen TGF oligopeptid
Et oligopeptid som har den følgende aminosyresekvens
(som tilsvarer aminosyresekvenser 34 til 50 av rotte-TGF): Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala
ble syntetisert ved å bruke fast-fase-teknikken av Ohgak et al.,
(1983) Journal of Immunol. Meth. 57, s. 171-184. Dette oligopeptid ble så koblet til nøkkel-limpet-hemocyanin i henhold til fremgangsmåten til Baron et al., (1982) Cell 28, s. 395-404, og anvendt til å immunisere kaniner (Baron et al., (1982), cell 28, s. 395-404) og sauer (Lemer (1982) Nature 299, s.592-596). Antisera ble prøvd mot peptid ved hjelp av en peroksydase-bundet immunoassay (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersberg, MD) og mot homogen rotte-TGF (renset i henhold til eksempel 2 ovenfor) ved immunopresipitasjon (Bister et al., (1980) J. Virol. 36,
s. 617-621) og Western blotting techniques (Burnett (1981) Analyt.
12 R
Biochem. 112, s. 195-203). Binding av -I-merket rotte-TGF og muse-EGF (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) til A431-celler dyrket i 96-brønn-mikrotiter-plater, var som beskrevet i Pruss et al., (1977) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, s. 3918-3921. Antisera fremstilt i én rotte og to sauer reagerte med det tilsvarende peptid i peroksydase-bundne immunoassays i titere på minst IO<4>. Reaksjoner av kanin-antiserum med rotte-TGF ble dokumentert ved immunopresipitasjon og stadfestet ved Western blotting. Antipeptid antisera sammen med jodinert muse-EGF gav ikke immunopresipitat i dette studium.
Humane epidermoid A431-celler har i overskudd av 10 g EGF-reseptorer pr. celle (Fabricant et al., (1977) Proe.Nati. Acad. Sei. USA 74, s. 565-569). TGF konkurrerer med EGF for binding
til disse reseptorer. Binding av <1>25I-merket rotte-TGF til disse celler ble blokkert ved et overskudd av umerket EGF og ved antiserum til peptid. En blokkerende effekt av antiserum på TGF-binding ble observert selv om antistoff-TGF-komplekset ikke ble fjernet fra mediet som omgav A431-cellene ved S. aureus protein A-fasilitert immunopresipitasjon. Blokkering ved hjelp av antistoffet var et resultat av interaksjon med TGF-molekylet heller enn med reseptoren, siden antisera ikke reagerte i immuno-presipitas jonsprøver med renset jodinert EGF-reseptor. Som man regnet med fra immunopresipitasjonsdata interfererte antiserum mot peptid ikke med binding av murin EGF til A431-celler.
Med anvendeligheten av antisera som blokkerte cellulær binding av TGF men ikke EGF, var det mulig å teste om TGF-funksjoner ved en autokrin mekanisme stimulerer veksten av maligne celler og om antistoff således kan inhibere slik vekst in vitro. Følgelig ble utransformerte normale rottenyreceller (NRK) og en rekke retrovirale cellelinjer platet ut ved lave tettheter (500 til 2.000 celler pr. skål) i serum-inneholdende medium, og etter en kort periode med vedhengning ble de flyttet til serumfritt medium. Sau- eller kanin-antistoff mot TGF-peptid eller mot forskjellige uvedkommende ikke-kryss-reagerende peptider ble tilsatt til mediet, og virkningen på cellevekst, på mikro-skopisk og makroskopisk kolonidannelse og på kolonimorfologi ble observert. Alt antistoff ble affinitetsrenset på peptidkolonner, ekstensivt dialysert, konsentrert og gjenoppløst til en antipeptid-titer på 10 til 10 . Resultatene er gitt i tabell II nedenfor. Som det sees i tabell II ovenfor inhiberte hverken kanin eller sau - anti-TGF oligopeptid kolonidannélse ved NRK-celler, men innen 4 8 timer inhiberte de vekst av Kirsten-transformerte NRK-celler, felin-sarkom-virus-transformerte rotte-embryofibroblaster (CLIO-celler) og Rous-sarkom-virus-transformerte 3T3-celler. CLlO-celler var kjent å være produktive produserere av TGF (Marquardt et al., (1983) Proe. Nati. Acad. Sei.USA 80, s.4684-4688) . De få overlevende koloniene i anti-TGF antistoff-behandlede celler tenderte til å være mindre og manglet det robuste utseende av normale kolonier. Ikke-adherente ulyserte celler fløt fritt i mediet. Denne inhibering ble delvis reversert når TGF-peptidet, men ikke når ikke-kryss-reagerende uvesentlig peptid, ble tilsatt samtidig med antistoff til TGF. Kanin- og sau-antistoff mot fire forskjellige ikke-kryss-reagerende peptider hadde ingen virkning på vekst av kolonier av NRK eller retrovirale transformerte cellelinjer. Utskiftning av antistoff-inneholdende medium med ferskt antisoff-fritt medium etter 72 timer utelot å reversere inhiberingen av kolonidannélse, men de overlevende kolonier vokste kraftig.
Eksempel 5
Syntese og karakterisering av rotte- TGF
Den kjemiske syntese av rotte-TGF (rTGF), som har den kjemiske formel gitt i eksempel 2, ble utført manuelt ved skritt-vis faststoff-fasetilnærming i henhold til de generelle prin-sipper beskrevet av Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85,
s. 2149-2156. Den differensielle syre-labile beskyttergruppe-strategi ble tilpasset for denne syntese med den konvensjonelle kombinasjon av tert.-butyloksykarbonyl for N-amino terminus og benzylalkoholderivater for sidekjedene. En mer syre-stabil benzylesterbinding som festet beskyttet aminosyrer til den polymere bærer, ble anvendt for å minimalisere tap ev peptider i løpet av de gjentatte syrebehandlinger (Mitchell et al., (1976) J. Amer. Soc. 92, s. 7357-7362). Fullstendig deproteksjon og fjernelse av peptid fra harpiksen var ved lav-høy HP-metoden av Tam et al., (1982) Tetrahedron Lett. 23, s. 4435-4438, som var forskjellig fra den konvensjonelle HF-deproteksjonsmetode og fjernet benzyl-beskyttende grupper ved SN2-mekanismen i fortynnet HF-løsning for å minimalisere alvorlige sidereaksjoner forårsaket av karbokationer som oppsto i den konvensjonelle SNl-deproteksjonsmetode. Videre har.den også til hensikt å redusere mange cysteinyl-reaksjoner som ofte hindrer syntesen av proteiner som inneholder multiple disulfidbindinger.
Etter HF-behandling og forut for noen rensning ble den uferdige og reduserte syntetiske rTGF oksydert og gjenoppløst ved den blandede disulfidmetode i nærvær av en kombinasjon av redusert og oksydert glutation (Ahmed et al., (1975) J. Biol. Chem. 250,
s. 8477-8482). Dette hindret dannelse av polymere materialer i løpet av renselsen. Det gjenoppløste, uferdige rTGF-I inneholdt 40-50% av EGF-radioreseptor og tyrosin-spesifikt protein-kinase-aktiviteter sammenlignet med det naturlige rTGF-I.
Uferdig syntetisk rTGF-I ble renset til homogenitet i tre skritt: (1) gelfiltrering på en Bio-Gel P-10-kolonne; (2) ioneutvekslings-kromatografi på en CM-Sephadex-kolonne og (3) forberedende høy-trykksvæskekromatografi (HPLC) på en C-18 revers fasekolonne.
Et totalt utbytte, basert på start-tilsetning av Ala til harpiks, var 31%.
Under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ble det rensede, syntetiske rTGF-I funnet å gi en enkelt binding med en tilsynelatende M.W. på 7.000 på SDS-PAGE-elektroforese. Aminosyreanalyse ved 6N HC1 og enzymatisk hydrolyse gav det forventede teoretiske molare forhold av den antatte sekvens.
Ikke noe fritt tiol ble oppdaget ved Ellman's metode av sulf-hydrylbestemmelse på syntetisk rTGF, men ved tiolytisk reduksjon fikk man den forventede teoretiske verdi på seks cysteiner.
Disse funn understøtter konklusjonen at syntetisk rTGF er et enkeltkjedet polypeptid som inneholder seks cysteiner i disulfidbroer, som er i overensstemmelse med de forventede kjemiske egenskaper av det naturlige rTGF. I tillegg eluerte syntetisk rTGF sammen med det naturlige rTGF som en enkelt symmetrisk topp i C-18 revers fase HPLC.
Syntetisk rTGF fremstilt i henhold til dette eksempel ble sammenlignet med naturlig rTGF i tre prøver for biologiske egenskaper av den antatte transformerende vakstfaktor. I mitogen-prøven ble stimulering av vekst av serumfattige normale rottenyreceller ved rTGF målt ved inkorporering av <125>I-jod-deoksyuridin.
I bløt agar-prøven i nærvær av fetalt bovin-serum og et annet TGF, TGF-3, kunne de morfologiske og fenotypiske forstyrrelsene ved rTGF måles kvantitativt ved kolonidannélse i bløt agar.
Den siste transformerende prøve er blitt vist å korrelere godt med tumorigenisitet (Stoker et al., (1968) Int. J. Cancer 3,
s. 683-693). Fetalt bovin-serum eller TGF-3 alene induserer ikke transformering av NRK-celler i kultur. På samme måte produserer ikke TGF, naturlig eller syntetisk, noen slik virkning i fravær av TGF-3- Både syntetisk og naturlig rTGF fremviste like dose-responskurver og halv-maksimalaktiviteter i disse to prøver.
Siden rTGF konkurrerer med mEGF for binding av EGF-reseptorer på cellulære membraner, ble syntetisk rTGF sammenlignet med det naturlige rTGF for binding på A431 humane carcinomceller. Igjen ble responsen og aktivitetene av det naturlige syntetiske rTGF funnet å være uadskillelig fra hverandre. Konsentrasjonen
125
som var nødvendig for 50% inhibering av I-EGF-binding, ble funnet å være 3,5 og 4,1 nM for det naturlige og syntetiske rTGF, resp. En konsekvens av TGF eller EGF-binding til EGF-membran-reseptorene er stimulering av fosforylering av tyrosinrester av
syntetiske peptider eller endogene substrater (Pike et al.,
(1982) J. Biol. Chem. 257, s.. 14628-14631). Syntetisk rTGF
ble funnet å stimulere fosforyleringen av syntetisk angiotensinyl-peptidsubstrat med en halv-maksimal aktivitet på 0,3 nM, en aktivitet sammenlignbar med verdien for naturlig rTGF, rapportert ved Reynold et al., (1981) Nature 292, s. 259-261).
Eksempel 6
Sårhelinq under anvendelse av TGF
Human-EGF (hEGF), rotte-TGF, analog human TGF, naturlig vaccinia virus, vekstfaktor (VGF) og rekombinant VGF ble anvendt i en sårhelingstest, i henhold til nedenstående fremgangsmåte, Sor å bestemme helingseffektene til hver faktor på annengrads forbrenninger. Rotte-TGF ble syntetisert som beskrevet ovenfor i eksempel 5, og hadde den kjemiske formel som er gitt i eksempel 2. Analogen til human-TGF, som ble fremstilt under anvendelse av standard-rekombinant-teknikker, hadde følgende aminosyresekvens:
Naturlig VGF ble renset som beskrevet nedenunder i
eksempel 15. Rekombinant VGF ble også produsert under anvendelse av standard rekombinant-teknikker. Det naturlige VGF er et 25 kd protein som inneholder følgende aminosyresekvens som faller innen omfanget av formel I ovenfor:
Den fulle aminosyresekvens for VGF-molekylet som er renset som beskrevet nedenunder i eksempel 15 (og det som er uttrykt via rekombinant-teknikk) er som følger:
Tre hun-smågriser som veide tilnærmet 4,5 kg hver ble anestetisert med Ketamine og Rompum, og deres rygger ble barbert og det gjenværende hår totalt fjernet med en kommersiell hår-fjerningskrem. En messingskabelon (3x3 cm, 147 gram) ble likevektsinnstilt i et 70°C vannbad og så anbragt i fast kontakt med den bare hud i nøyaktig 10 sekunder. 5 sår ble laget på hver side av ryggsøylen og i en avstand av tilnærmet 2,5 cm fra hverandre. Toppen av hver resulterende blemme ble fullstendig fjernet, og sårene ble behandlet to ganger pr. dag med Silvadene alene, Silvadene inneholdende én av vekstfaktorene, eller ble ikke behandlet. Smågrisene fikk spise og drikke etter ønske.
Etter 9 eller 10 dager ble smågrisene anestetisert og skorpen fra hvert brannsår fjernet. Alle brannsår ble foto-grafert, og det ble tatt en punch-biopsi innenfor hvert brannsår.
Følgende tabell indikerer den tilnærmede prosent av hvert brannsår som ble epitelialisert ved hjelp av visuell bedømmelse.
Som vist i tabell III, var TGF svært effektivt med hensyn
til å hele sår, sammenlignet med de ubehandlede kontrollprøver eller endog sammenlignet med Silvadene alene.
Eksempel 7
Sårhelina
Et annet eksperiment ble utført for å måle effekten av den analog til human-TGF som er beskrevet ovenfor, på heling av annengradsforbrenninger. De eksperimentelle betingelser var lik dem som er beskrevet ovenfor. Imidlertid ble følgende endringer gjort i metodene: Én Yorkshire-smågris ble anestetisert med Ketamine, og hvert av 12 brannsår ble laget ved hjelp av skabelonen i 11 sekunder pr. brenning. Etter at hver blemme ble fjernet,
ble sårene behandlet én gang pr. dag med et av følgende:
a. l ug/ml av TGF i Silvadene; b. 0,1 ug/ml av TGF i Silvadene; c. ubehandlet; d. Silvadene alene;
e. l ug/ml av hEGF i Silvadene; og
f. 0,1 ug/ml av hEGF i Silvadene.
Etter 7 dager ble brannskorpen fjernet. Prosent sårheling, beregnet ut fra planimetriresultater, er vist nedenunder. TGF var svært effektivt som sårhelende middel.
Eksempel 8
Hornhinnesårheling av rTGF
A. Fremstillin<g> av rTGF- polypeptid
TGF-polypeptidet ble syntetisert basert på den aminosyre-sekvens som er rapportert i eksempel 2 ovenfor, for TGF renset fra det kondisjonerte medium av Fisher-rotte-embryo-fibroblaster transformert med felin sarcoma virus. Den kjemiske syntese av rTGF ble utført som beskrevet i eksempel 5 ovenfor.
B. Fremstilling av behandlingsblanding
rTGF~cx-polypeptidet ble kombinert med isotonisk (285 m osmol) steril fosfatpufret saltløsning (pH 7,4) ved en konsentrasjon på 50 ng/ml.
C. Hornhinne- stromal- innsnitt
Totalt gjennomtrengende innsnitt med lengde 5 mm, som strakk seg inn i forkammeret langs hele sin lengde, ble laget i senter-hornhinnen til voksne Macaca fasicularis hun-primater. De høyre øyne tjente som kontroll og ble behandlet tre ganger hver dag med to dråper isotonisk (285 m osmol) steril fosfatpufret saltløsning (pH 7,4) uten rTGF. De venstre øyne ble behandlet etter samme plan med den behandlingsblanding som er beskrevet ovenfor. Etter tre dagers behandling, ble styrken på sårene målt kvantitativt ved å innføre en nål med liten boring (25 gauge) inn i forkammeret gjennom hornhinnens limbus. Nålen ble forbundet med et aneroid-manometer, og trykket ble langsomt og vedvarende øket inntil sårene først begynte å renne og deretter briste. Denne fremgangsmåte er beskrevet i detalj av Weene (1983) Anal. Ophthalmol. 15, 438.
D. Resultater
De resultater som er vist i tabell V viser at bristestyrken for TGF-behandlede hornhinner er signifikant sterkere enn de saltløsningbehandlede kontrollhornhinner.
Eksempel 9
In vivo studier med anti- TGF- antistoff
Et anti-TGF-serum ble fremstilt ved å immunisere en kanin med et glutaradehyd-konjugat av den 17-aminosyrers sekvens av rTGF som er beskrevet i eksempel 4 ovenfor, og KLH (keyhole limpet hemocyanin), og så ble Ig-fraksjonen fremstilt ved å utfelle serum to ganger med en 45%ig mettet løsning av ammonium-sulfat, gjenoppløse den til det opprinnelige volum og dialysere mot PBS.
Anti-TGF-serum og et kontrollserum ble fortynnet fra sitt opprinnelige volum på 0,5 ml til 3 ml. De resulterende volumer ble anvendt for å injisere mus intraperitonealt i en dosering av 0,1 ml pr. mus. Ti mus, ca. 3 måneder gamle, ble hver på forhånd transplantert subkutant med to småbiter av en rotte-tumor som stammet fra Snyder-Theilen feline sarcoma virus. (Hvert trans-plantat ble tellet som ett punkt, hvilket resulterer i 20 totale punkter med 10 punkter for kontrollgruppen og 10 punkter for den behandlede gruppe). Musene ble injisert med start dagen etter transplanteringen og ble også injisert på dagene 4, 7 og 11.
Med start på dag 7 ble tumordiametrene målt i to retninger med passer. Tumorene ble målt ved regelmessige intervaller på dagene 9, 11, 14, 16, 18 og 24.
Ved tidspunktet for første måling hadde 7 av de 10 punkter for kontrollgruppen tegn på tumorvekst, mens bare 4 av de 10 punkter for den behandlede gruppe hadde tumorvekst. I tillegg hadde 6 av de 10 punkter i kontrollgruppen tumorer som var minst 3 mm i diameter, mens bare 3 punkter i den behandlede gruppe hadde tumorer av nevnte størrelse. 4 punkter i kontrollgruppen var minst 5 mm i diameter på dag 9, mens bare 2 punkter i den behandlede gruppe hadde denne størrelse. Ved dag 11 hadde kontrollgruppen og den eksperimentelle gruppe lignende tumorer.
Eksempel 9a
Påvisning av TGF- aktivitet i urin fra kreftpasienter
Diverse urinprøver ble forhåndsbehandlet ved 90°C i ett minutt etter tilsetning av 1/9 volum av 20% SDS, 0,4 M DTT, 0,4 M Hepes, 0,08 M natriumklorid, 1 mM EDTA, til pH 7,4. En 20 ul prøve ble satt til en inkubasjonsblanding (50 ul i alt) modifisert for å inneholde 1% NP-40. Inkubering av prøve, antistoff dannet mot 17-aminosyre-sekvensen i rotte-TGF i eksempel 4 og <125>i-merket syntetisk 17-aminosyre-sekvens ble foretatt i 96 brønners plater i 60 minutter, fulgt av 30 minutter med Pansorbin. Antistoff-bundet peptid ble pelletert på en pute av de dibutyl-ftalat, og disse pellets ble tellet i en gammateller ved anvendelse av 3,2 mm tykke blystrømper for beskyttelse av den upelleterte isotop.
TGF-nivåer ble standardisert ved anvendelse av den syntetiske sekvens og human-melanom (A375 cellelinje) TGF fra konsentrert serumfritt kondisjonert dyrkningsmedium. TGF-nivåer ble beregnet som ng av TGF pr. mg av kreatinin. I hvert forsøk ble en eller flere normale prøver analysert, og den gjennomsnittlige normalverdi ble gitt en verdi av en relativ TGF-ekvivalent.
A. Prøvepreparering
Friske, ikke-klarnede urinprøver ble lagret i 25 ml alikvoter ved -70"C i opptil 6 måneder. I de fleste tilfeller ble prøvene hurtig tinet og umiddelbart behandlet med protease-inhibitorer (0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,05 mM pepstatin A. Sigma Chemical Co.) i 30 minutter ved 4°C. 10 ml prøver ble så dialysert ved 4°C mot enten 0,1 M eddiksyre eller 0,1 M ammoniumbikarbonat. Dialyserør med tre forskjellige porestør-reiser ble brukt: 3.500; 6.000-8.000; eller 12.000-14.000. (I noen tilfeller ble urinen innledningsvis lyofilisert og ekstra-hert, men nøytralisasjons- og etanol-eter-utfellingstrinnet ble utelatt.)
Etter 2 til 4 dager med dialyse ble urinprøvene klarnet (10.000 xG i 10 minutter), lyofilisert, gjenoppløst ved 50 ganger den opprinnelige konsentrasjon i 5 mM maursyre, samt 50 mM natriumklorid, deretter klarnet kort (12.000 xG, ett minutt) før forhåndsbehandling.
B. Kreatinin- assavs
En ubehandlet alikvot av hver prøve ble testet dobbelt med hensyn på kreatinin, under anvendelse av en manuelle kolori-metrisk test.
C. Resultater
Prøvene ble standardisert for kreatinin-nivåer. For hvert av 6 eksperimenter indikerte statistisk analyse (T-test) signifi-kante forskjeller mellom kreftpasienter og normale (P<0,001, 0,001, 0,001, 0,001, 0,01, 0,05). I de 6 eksperimenter var TGF-konsentrasjonen i urinen fra normale individer på et gjennomsnitt av 0,18 ng av TGF pr. mg kreatin, mens urinen fra alle kreftpasienter hadde et gjennomsnitt av 0,64 ng av TGF. Forhøyede TGF-nivåer ble observert hos de fleste kreftpasienter. Resultater i hvert eksperiment ble også normalisert i forhold til den gjennomsnittlige normale verdi i eksperimentet. Dataene er vist numerisk i tabell VI. Anvendelse av en vilkårlig avkutting av det dobbelte av det gjennomsnittlige normale nivå av TGF, gjør at i 81% av de forskjellige krefttilfeller som ble testet, ble det påvist høyere TGF-nivåer enn normalt.
Eksempel 10
Påvisning av TGF- aktivitet i urin fra kreftpasienter
Human-urin fra 50 personer (25 normale og 25 individer med fremskreden kreft) ble utsatt for immuno-assay ved anvendelse av antistoff mot TGF under anvendelse av den metode som er beskrevet ovenfor i eksempel 9. Ved denne undersøkelse ble 100 ml urin fra individene som skulle testes, oppsamlet, dialysert mot 1,0 molar eddiksyre og konsentrert ca. 100 ganger. Denne konsentrerte urin ble så underkastet immuno-assay under anvendelse av kanin-polyklonalt antistoff dannet mot det 17-aminosyrers oligopeptid som i eksempel 4 ovenfor, og resultatene er vist i nedenstående tabell.
I denne test var nivået av TGF i urin hos majoriteten av kreftpasienter minst 5 ganger høyere enn det hos normale individer som ble testet.
Eksempel 11
Påvisning av TGF med et monospesifikt antiserum rettet mot et syntetisk peptid
Pept idsyntese
Peptider, tilsvarende aminosyrer fra deler av rTGF-aminosyre-sekvens, beskrevet ovenfor i eksempel 2, ble syntetisert kommer-sielt (Peninsula Labs) ved standard-fastfaseteknikken til Ohgak et al. (1983) Journal of Immunol. Meth. 57, s. 171-184. Om nødvendig, ble peptider renset ved revers fase-høyytelse-væskekromatografi (HPLC) før bruk.
De anvendte sekvenser var:
Peptidkoniugering og immunisering
En 10 mg prøve av peptid ble blandet med keyhole limpet hemocyanin (10 mg; Calbiochem) i 3,5 ml av 0,1 M natriumfosfat ved pH 7,4. 4 ml av 25 mM glutaraldehyd ble tilsatt, og blandingen ble inkubert under rysting i 1 time ved 23°C. Glycin ble så tilsatt til en endelig konsentrasjon av 0,1 M, og blandingen ble rystet natten over ved 23°C. Det resulterende konjugat ble blandet med samme volum av Freund's komplette adjuvant før injeksjon.
Kaniner ble immunisert ved subkutan injeksjon av 1 mg av konjugat injisert subkutant på fire separate punkter. To forsterker-injeksjoner ble administrert ved 2 x ukentlige intervaller etter den første injeksjon. Det serum som ble anvendt ved denne undersøkelse ble oppsamlet 80 dager etter den første injeksjon. En immunoglobulinfraksjon av dette serum ble fremstilt ved ammoniumsulfatutfelling. Produktet av antistoffer som er spesifikt for immunisering av peptid ble overvåket med en fastfase-enzym-forbundet immunoabsorbent-assay.
Radionoderin<g> av peptider
Peptider ble merket med Na<125>I under anvendelse av kloramin-T-metoden, i det vesentlige som beskrevet i Das et al. (1977)
Proe. Nati. Acad. Sei. 74, s. 2790-2794. Løsninger som inneholdt muse-submaksilær kjertel-EGF (mEGF) (170 p-mol), syntetisk rTGF
(4 p-mol) eller peptid (III (400 p-mol) ble blandet med 1-2 mCi Na<125>j (Amersham, 2 mCi/n mol) i 2 M kaliumfosfat ved pH 7,5. Kloramin T (50-100 ug) ble tilsatt og inkubering ved 4° ble fortsatt i 1 minutt (mEGF og rTGF) eller 7 minutter (peptid III). Reaksjonene ble avsluttet ved tilsetning av Na2S205 (10-20 ug),
og merkede proteiner ble separert fra uomsatt Na-<1-2>^ ved kromatografi på Sephadex G-10 (Pharmacia). Spesifikke aktiviteter av peptider merket på denne måte var: 1 x 10<10> cpm/n mol (EGF); 6 x IO<8> cpm/n mol (rTGF); og 1 x IO<9> cpm/n mol (peptid III).
Radioreseptor- assay
Bindingen av <125>i-EGF til dets reseptor på monosjikt av formalin-fikserte A431-celler ble målt som beskrevet ovenfor i eksempel 1. <125>I-EGF ble tilsatt ved en sluttkonsentrasjon av 0,33 nM i nærvær eller fravær av konkurrerende substanser. Tilsetning av umerket EGF ved 0,3-0,5 nM resulterte i halv-maksimal inhibering av <125>I-EGF-binding. TGF-konsentrasjoner ble uttrykt som den mengde som var nødvendig for å produsere en inhibering av <125>I-EGF-binding, ekvivalent med en kjent mengde av
TGF.
Radioimmuno- assay
Reaktanter ble blandet i et sluttvolum av 50 ul av en løsning som inneholdt: 20 mM natriumfosfat, ved pH 7,4; 200 mM NaCl; 40 mM ditiotreitol; 0,1% (vekt:volum) BSA; 0,1% (vekt:volum) NaN3; <125>I-peptid III; (IO<4> cpm); antiserum ved en sluttfortynning av 1/15.000; og andre tilsetninger, som spesifisert. Reaksjonen ble initiert ved tilsetning av antiserum og fortsatt ved 23°C i 90 minutter. Samme volum av 10% formalin-fiksert Staphalococcus A (Pansorbin, Calbiochem) ble så tilsatt, og inkuberingen ble fortsatt i ytterligere 30 minutter ved 23"C. Immunoadsorbanten ble fjernet ved sedimentering gjennom en pute av 10% (vekt:volum) sukrose, og mengden av bundet <125>I-peptid III ble bestemt ved hjelp av en gammateller. Under disse betingelser ble tilnærmet 25% av <125>I-peptid bundet av antistof i fravær av konkurrent. Mengden av bundet peptid III ble korrigert for ikke-spesifikk binding målt i fravær av antistoff (mindre enn 5% av det totale) og uttrykt som prosent av maksimal binding. Konsentrasjoner av konkurrenter ble uttrykt som mengden av peptid III som kreves for å gi en ekvivalent inhibering av utfelling.
Krornatogra f i
Gelfiltreringskromatografi ble utført i henhold til produ-sentens instruksjoner på kolonner av Bio Gel P-10 (BioRad) ekvilibrert i 1 N eddiksyre. HPLC ble utført på en Novapak C18 kolonne (0,39 x 10 cm; Waters Associates) ved anvendelse av en strømningshastighet av 1 ml/min ved 23'C.
Fremstilling av kondisjonert medium
Serumfritt kondisjonert medium fra Snyder Theilen-transformerte Fischer rotte-embryoceller (ST-FrSV-FRE klon-10) ble oppsamlet som beskrevet tidligere av Twardzik et al. (1983) Virology 124, s. 201-207. Mediet ble klarnet ved lavhastighets-sentrifugering og lyofilisert. Resten ble så resuspendert i 1 N eddiksyre og dialysert uttømmende mot 0,1 N eddiksyre. Uløselig protein ble fjernet ved sentrifugering, og supernatanten ble lyofilisert. Til slutt ble resten resuspendert i 1/100 av det opprinnelige volum av 1 N eddiksyre og lagret ved 4°C.
Immunoblottinq- analvse
Prøver som skulle analyseres ble først underkastet natrium-dodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) på en 15-20% akrylamidgradient, og så kjørt under reduserende betingelser, under anvendelse av det system som er beskrevet av Laemmii (1970) Nature 227, s. 680-682. Etter separasjon ble proteiner overført elektroforetisk til nitrocellulose (Schleicher and Schuell, BA85, 0,45 u) som beskrevet av Burnette (1981) Anal. Biochem. 112,
s. 195-203. Overføringen ble foretatt ved tilnærmet 5V/cm i et tidsrom av 3-4 timer ved 23"C. Den resulterende protein-blot ble inkubert natten over i en melkebasert cocktail, BLOTTO
(Johnson et al. Gene Anal. Techn. 1, s. 3-8). Antiserum ble fortynnet i BLOTTO og satt til blot'en i nærvær eller fravær av overskudd av peptid III. Inkubering med antistoff ble fortsatt med hyppig agitering i 2-3 timer ved 23°C. Blot'en ble så vasket og inkubert med 12<5>I-protein A (4 x IO<6>cpm/ml; 4 x IO<7> cpm/ug i 1 time ved 23°C og vasket med BLOTTO. Antistoffbindingspunkter ble visualisert etter autoradiografi på Kodak XAR-5 film ved
-70°C under anvendelse av intensifiseringsskjermer.
Resultater
Ved anvendelse av den radioimmuno-assay som er beskrevet ovenfor, ble inngående <125>I-peptid III nær kvantitativt utfelt ved lav fortynning av antisera; antiserumet viste en titer på
>10.000. Antistoff-affinitet ble målt ved inkubering av antiserumet ved en sluttfortynning på 1/5.000 med varierende konsentrasjoner av <125>I-peptid III. Analyse av disse data ved metoden til Scatchard avslørte en enkelt klasse av bindings-komponent(er) med affinitetskonstant (Ka) på 8,3 x IO<8> M-<1> for <125>I-peptid III.
Spesifisitet av radioimmuno- assay
For å bestemme spesifisiteten til radioimmuno-assay ble forskjellige peptider testet med hensyn på sin evne til å
inhibere utfelling av <125>I-peptid III. Umerket peptid III inhiberte utfelling av <125>I-peptid III på tilnærmet lineær måte i området 0,13-11 nM; konsentrasjonene av umerket peptid III, som produserte halv-maksimal inhibering av utfelling, var 0,7 nM. Peptid IV var bare litt mindre effektivt som inhibitor for utfelling enn peptid III var, mens peptid II var totalt ineffektivt ved konsentrasjoner opp til 1,1 uM. Peptid I, tilsvarende amino-terminal-ll-restene, var også ineffektivt som konkurrent. Disse resultater indikerer at den epitop som er påvist under standard-assay-forhold var lokalisert til karboksy-terminal-ll-aminosyrene i peptid III. En oppsummering av de relative inhiberende konsentrasjoner av forskjellige peptider er presentert i tabell VIII.
De indikerte tilsetninger ble testet med hensyn på evne til å inhibere standard-RIA som beskrevet ovenfor. Konsentrasjonen av hver tilsetning som er nødvendig for oppnåelse av halv-maksimal inhibering av utfelling ble bestemt og er uttrykt i forhold til konsentrasjonen av peptid III som kreves for å gi samme inhibe-ringsnivå. Symbolet ">" indikerer den høyeste konsentrasjon som ble testet. (De inhiberende aktiviteter for peptidene I-IV var uaffisert av innlemmelse av ditiotreitol i denne assay).
rTGF ble også testet med hensyn på sin evne til å inhibere utfelling av <125>I-merket peptid III. Syntetisk rTGF, som kunne skjelnes fra det native molekyl i biologisk aktivitet, var like effektivt (på molbasis) som inhibitor som peptid III var det. Den relative inhiberende kapasitet for rTGF var betydelig nedsatt da et reduksjonsmiddel var utelatt fra reaksjonsblandingen (tabell). mEGF var totalt ineffektiv som konkurrent, ved konsentrasjoner som varierte opp til mer enn 1 uM. Dette
indikerer at RIA som her er beskerevet avviker fra andre tilgjengelige assays for TGF ved det at det er spesifikt for TGF men ikke for EGF.
For å vise direkte at antiserumet binder rTGF, ble <125>i-merket rTGF benyttet istedenfor <125>I-peptid i standard RIA. En doseavhengig utfelling av <125>I-TGF ble observert, som ble inhibert vesentlig ved tilsetning av overskudd av umerket peptid III. Scatchard-analyse av bindingsdataene som er oppnådd på denne måte, indikerte at antiserumet viste en Ka-verdi på
2,3 x IO<8> M<-1> for <125>I-TGF. Denne verdi var i rimelig overensstemmelse med den Ka-verdi som ble bestemt for <125>I-peptid III (8,3 x IO<8> M-<1>) og indikerte at antiserumet binder seg til rTGF.
Påvisning av rTGF i kondisjonert medium av transformerte celler
Én kilde for TGF er det dyrkningsmedium av celler som er transformert av RNA-tumor-virus. For å påvise rTGF i kondisjonert medium fra dyrkede transformerte celler ble følgende fremgangsmåte benyttet: En Fischer-rotte-embryocellelinje transformert ved hjelp av Snyder-Theilen-stammen fra felin-sarcoma-virus (ST-FeSV FRE klon-10), er tidligere vist å produsere forhøyede nivåer av rTGF (Gray et al. (1983) Nature 303, s. 722-725). Serumfritt kondisjonert medium ble oppsamlet, forarbeidet og konsentrert som beskrevet ovenfor. En alikvot av medium ble så underkastet gelfiltreringskromatografi på Bio-Gel P-10 under sure betingelser. Fraksjoner ble analysert for rTGF ved hjelp av EGF-reseptor-konkurranse-assay eller ved RIA.
To størrelseklasser av EGF-konkurrerende aktivitet ble
påvist under disse betingelser, én av tilnærmet Mr = 10.000 og én med Mr = 20.000; begge arter eluerte godt bak hovedmengden av protein i prøven. Begge størrelseklasser av EGF-konkurrerende aktivitet viste også immunologisk aktivitet. Ytterligere immunologisk aktivitet ble funnet i det ekskluderte volum i kolonnen hvor ingen EGF-konkurrerende aktivitet ble påvist. Disse funn indikerer at tidligere beskrevne størrelseklasser av rTGF er aktive i RIA. Forholdet mellom EGF-konkurrerende og immunologisk aktivitet var i stor grad redusert i TGF-fraksjonene med høy
molekylvekt, hvilket indikerer at de biologiske aktiviteter for disse TGF(s)-arter er mindre enn for de fraksjoner med lavere mo1eky1vekt.
For å bekrefte at den immunologiske aktivitet ble utført ved de samme molekylære substanser som EGF-konkurranseaktivitet, ble oppsamlede fraksjoner som inneholdt størrelseklassene av rTGF med Mr = 10.000 og Mr = 20.000 fra en versjon av dette eksperiment i preparativ skala, underkastet reversfasekromatografi på HPLC; betingelsene som ble anvendt, var lik dem som ble anvendt ved rensing av rTGF som beskrevet av Marquardt et al. (1983) Proe. Nati. Acad. Sei., 80, s. 4684-4688. For de oppsamlede fraksjoner med Mr = 10.000 TGF ble både EGF-konkurrerende og immunologisk aktivitet vist å ko-rense med i det vesentlige kvantitative utbytter. Ko-rensningen av begge aktiviteter under både gelfiltreringskromatografi og HPLC antydet sterkt at begge aktiviter utføres av de samme molekylære substanser. Når Mr = 20.000 EGF-konkurranseaktiviteten ble utsatt for HPLC, ble en lignende ko-rensning av EGF-konkurrerende og immunologiske aktiviteter observert. Disse eksperimenter indikerer at hovedmengden av immunologisk aktivitet som finnes i kondisjonert medium av ST-FeSV-FRE-klon 10 skyldtes rTGF.
Immunoblottings- analyse av klasser av rTGF av forskjellig størrelse.
Klassene av større størrelse av TGF som ble funnet i kondisjonert medium fra retrovirale transformerte rotteceller kunne representere enten aggregerte tilstander eller distinkte molekylære former av TGF-molekylet. For å skjelne mellom disse alternativer ble syntetisk rTGF og størrelseklassene av nativt TGF med både Mr = 10.000 og Mr = 20.000 underkastet immunoblottingsanalyse, etter separering av komponent-polypeptider ved SDS-PAGE under reduserende betingelser. Immunoreaktivt syntetisk rTGF og lavmolekylært nativt rTGF ko-migrerte som enkelte polypeptidkjeder med Mr = 6.000, immuunologisk reaktivitet for disse molekyler ble blokkert ved inkubering av antiserum med overskudd av peptid III.
I motsetning til dette inneholdt størrelseklasse med stor molekylvekt tre immunoreagerte peptider med Mr = 24.000, Mr = 40.000
og Mr = 42.000; immunologisk reaktivitet for disse peptider ble også blokkert ved tilsetning av overskudd av peptid III. Et
annet radioaktivt bånd med en migrering på mer enn Mr = 43.500
ble notert i alle rader. Dette materiale ble ufullstendig fjernet ved innlemmelse av overskudd av peptid III og ble sett overensstemmende i alle eksperimenter, uten hensyntagen til den prøve som var analysert. Derfor synes det å representere en eksperimentell artifakt. Det er bemerkelsesverdig at intet Mr = 6.000 TGF ble påvist i størrelseklassen med stor molekylvekt. Disse resultater viser at størrelseklassene av rTGF med høyere molekylvekt representerer distinkte former av TGF.
Eksempel 12
Syntetisk fragment av rTGF med reseptorbinding og antigene egenskaper
Peptider
EGF ble renset fra muse-submaksilære kjertler ekstraksjon
med 1 M HCl som inneholdt 1% trifluoreddiksyre (TFA), 5% maursyre og 1% NaCl, konsentrasjon på Sep-Pak kolonner (Waters), og reversert fase-høyytelse-væskekromatografi på uBondapak C-18 kolonner (Waters) som i Elson et al. (1984) Biochemistry Int. 8,
s. 427-435. Den komplette syntese av nativ rotte-TGF er beskrevet ovenfor i eksempel 5.
De syntetiske peptidfragmenter ble fremstilt på klormetyl-polystyren-1% divinylbenzenharpiks (Bio-Rad) med Na<->t-butoksy-karbonyl-beskyttelse. Peptider ble avbeskyttet og splittet fra harpiksen ved anvendelse av HF eller, for analogene med blokkerte C-termini, ble peptidet først fjernet ved ammonolyse (NH3/MeOH).
De rå, avbeskyttede peptider ble fortynnet og cyklisert til disulfidformen ved oksydasjon med 0,01 M K3FeCN)6. Peptid-løsningen ble fylt i en Bio-Rex 70 kationebyttekolonne, vasket med 300 ml H20 og eluert med en gradient til 50% AcOH. Peptidet ble renset ved prep-HPLC på en 2,5 x 100 cm kolonne (Altex) av Vydac 218TP C-18 pakking under anvendelse av tilnærmet 2 0% CH3CN eluent, 0,03 M i NH4OAc ved pH 4,5 (10). Peptidene 1 og 2 representerer aminosyresekvensene 34 til 43 av rTGF med henholdsvis frie eller blokkerte (N-Ac; C-amid) ender. Peptid 3. er metyl-esteren av den tilsvarende sløyfe av hTGF (Ac-Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Ala-Arg-Cys-OMe) fremstilt ved transforestring fra harpiksen (base/MeOH).
Immunogenfremstilling og immuno- assay
TGF-peptid 1 ble koblet til keyhole limpet hemocyanin (KLH) eller bovin-serumalbumin (BSA) ved tiol/maleimid-binding (King et al. (1979) J. Immunol. Methods 28, s. 201-206). Bærer-peptidkomplekser ble renset ved gelfiltrering. Et gjennomsnitt av 60 mol peptid/mol KLH og 20 mol peptid/mol BSA ble oppnådd. Kaniner ble immunisert med KLH-peptid 1-konjugatet ved multiple subkutane (s.c.) og intramuskulære (i.m.) injeksjoner av 2 mg protein i komplett Freund's adj uvant. Kaniner ble forsterket s.c. hver 2 uker med immunogenet i inkomplett Freund's adjuvant. IgG-fraksjonen i antiserumet etter 5 forsterkninger ble anvendt for immuno-assay og radiomerket ved anvendelse av Na<125>I (NEN) og Enzymobeads (Bio-Rad) til 4 x IO<5> cpm/ug protein. Polyvinyl-klorid 96 brønners plater (Costar) ble belagt med 200 ug/ml BSA-peptid 1-konjugat og tellebelagt med 10% normalt kaninserum i fosfatpufret saltløsning. Plater ble inkubert i 4 timer ved 37"C med [12<5>I]-anti-KLH-peptid 1 IgG (50.000 cpm/brønn) i nærvær eller fravær av inhibitorer, vasket, og individuelle brønner ble tellet.
Radioreseptor- assay
A-431 human-epidermoide carcinomaceller eller human-forhud-fibroblaster (HFF), etablert fra primære kulturer, ble dyrket til konfluens i 24 brønners samleskåler (Costar) i Dulbecco's minimal-essensielle medium (DMEM, Gibco) inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS, Hyclone). EGF ble radio-jodert som angitt ovenfor, til mellom 4 x IO<4> og 8 x IO<4> cpm/ng protein. Celler ble inkubert ved 4°C i 60 minutter med 1 nM [<125>I]EGF i nærvær av inhibitorpeptider i DMEM (pH 7,4; 20 mM Hepes) inneholdende 0,1% BSA. Celler ble vasket 3x med kald puffer, lysert med 0,1 N NaOH, og celle-assosiert radioaktivitet ble målt (gamma-teller). Ikke-spesifikk binding fastslått i nærvær av 100x overskudd av kald EGF var mindre enn henholdsvis 5% og 10% av den spesifikke binding
for A-431 og HFF-celler.
Celle- formerinqs- assay
HFF-celler ble dyrket til konfluens i 48 brønners samleskåler i DMEM-10% FCS og bragt til ro ved utsulting i 2 dager i DMEM-0,5% FCS. Mitogener og peptider ble inkubert med celler ved 37°C i 18 timer før en 4 timers pulsering med 1 uCi [<3>H]metyl-tymidin (NEN) og trikloreddiksyre-utfellbar radioaktivitet ble målt.
Resultater
Kanin-antistoffer mot KLH-peptid 1-konjugatet reagerte med BSA-TGF peptid ved fastfase-RIA. Denne reaksjon ble inhibert på konsentrasjonsavhengig måte av peptid 1 og litt mindre av nativ TGF. Derimot forårsaket ikke EGF signifikant inhibering.
Rotte-TGF forskyver og konkurrerer med måte bindingen av EGF til dens reseptorer. Evnen hos TGF-peptider til å konkurrere med [<125>I]EGF-binding enten til A-431-celler eller HFF ble vurdert. Peptid 1 inhiberte delvis [<125>I]EGF-binding til A-431-celler ved
>10-<6> M. Peptidene 2 og 3, oppviste imidlertid en forbedret bindings-inhibering, med henholsvis IC50-verdier på 4 x 10~<6> M og 4 x 10~<7> M (dvs. tilnærmet 0,02 og 0,2% av bindingskraften til EGF eller TGF-cx) . Lignende observasjoner ble gjort for inhibering av EGF på HFF (tabell IX). Reseptorspesifisiteten til disse vekselvirkninger er illustrert ved disse peptiders uegnethet til å inhibere enten bindingen eller den mitogene effekt av endotelisk cellevekstfaktor på HFF (ikke vist).
Ingen av TGF-peptidene var i besittelse av iboende mitogene egenskaper opp til 10~<5> M når de ble inkubert med uvirksomt HFF (data ikke vist). Imidlertid inhiberte TGF-peptidene, på konsen-tras j onsavhengig måte, induksjon av DNA-syntese i uvirksomt HFF ved EGF. Disse antagonister var like kraftige når TGF ble anvendt som mitogen (tabell IX). Som det kan sees for bindingskraften, ble den antagonistiske kraft av TGF-peptidene forbedret ved tildekning av amino- og karboksy-terminalene.
Eksempel 13
TGFa stimulerer benresorpsion in vitro
Transformerende vekstfaktorpreparater ble renset fra human-melanomacelle-kondisjonert medium og human-småplater som beskrevet i eksempel 1 og syntetisk rotte-TGF ble fremstilt som tidligere beskrevet i eksempel 2. Biologisk aktivitet av TGF-preparatene og syntetisk TGF ble overvåket under anvendelse av en EGF-radioreseptor-assay eller under anvendelse av myk-agar-kolonidannelse, også som beskrevet i eksempel 1.
Syntetisk rotte-TGF (Mr = 5.600) resorberte ben på konsentrasjonsavhengig måte. Konsentrasjoner større enn 2 ng EGF ekvivalenter/ml stimulerte benresorpsjon i tre separate eksperimenter. Det syntetiske TGF krevet minst 72 timer for å stimulere benresorpsjon. I denne henseende viser den syntetiske form seg lik EGF som resorberer ben i et lignende tidsforløp i denne bio-assay. (Tashjian et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 85, 966).
Delvis rensede preparater av høy- og lav-molekylære TGF fremstilt fra en human-melanom-cellelinje ble også testet i benresorpsjons-assay. Både høye (27.000 dalton) og lave (6.000 dalton) molekylvektformer stimulerte benresorpsjon. Den høyemolekylære form stimulerte resorpsjon i løpet av 48 timer, mens den lavmolekylære form krevet 72-96 timer for å stimulere resorpsjon, et lignende tidsforløp som for syntetisk rotte-TGF-I og EGF (se Tashjian, ovenfor).
Resultatene viser at TGF kan stimulere benresorpsjon in vitro. Syntetisk rotte-TGF og lavmolekylære human-TGF-preparater oppførte seg på lignende måte som EGF, siden de krevet forlengede inkubasjonsperioder for å stimulere benresorpsjon. De var effektive ved konsentrasjoner av ca. en størrelsesorden mindre enn EGF. Det høymolekylære human-melanom-TGF stimulerte benresorpsjon i løpet av 48 timer.
Eksempel 14
Stimulering av benresorpsjon in vitro ved syntetisk transformerende vekstfaktor
Syntetisk rotte-TGF ble fremstilt som beskrevet ovenfor i eksempel 5. Renheten til proteinet ble bekreftet ved natrium-dodecylsulfat/polyakrylamidgel-elektroforese, aminosyreanalyse og revers fase-høyytelse-væskekromatografi. Den biologiske aktivitet hos TGF-preparater og syntetisk TGF ble overvåket ved hjelp av en EGF-radioreseptor-assay (Todaro et al. (1976) Nature 264, 26.) Benresorpsjon ble fastslått ved måling av frigjøring av <45>Ca fra tidligere merkede lange knokler hos føtal rotte. Drektige rotter på dag 18 av drektigheten ble injisert med 200 yCi <45>Ca. (Raisz
(1975) J. Clin. Invest. 44, 103.) Mødrene ble avlivet på dag 19 av drektigheten, og fostrene ble fjernet. De mineraliserte knokkelskaft av spoleben og albuben ble dissekert fri for omgivende vev og brusk og anbragt i organkultur. Knoklene ble inkubert i BGJb-medium (Irvine Scientific) i 24 timer ved 37'C i fuktig atmosfære av 5% C02 og 95% luft for å tillate utbytting av løst kompleksdannet <45>Ca. Knoklene ble så dyrket i 48-12 0 timer i BGJb-medium supplert med 5% føtalt kalveserum (KC Biologicals) som inneholdt kontroll- eller testsubstanser. Benresorberende aktivitet ble målt som prosent av totalt <45>Ca frigjort inn i medium og ble uttrykt som et behandlet-til-kontroll-forhold. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av Student's t-test for upardannede data.
Syntetisk rotte-TGF (molekylvekt 5.600) i konsentrasjoner over 2 ng av EGF-ekvivalenter pr. milliliter stimulert benresorpsjon på konsentrasjonsavhengig måte i tre separate eksperimenter. Syntetisk TGF forårsaket ingen signifikant benresorpsjon i løpet av de første 48 timer av bendyrkningen, men tydelig stimulert resorpsjon i de følgende 3 dager. I denne henseende synes den syntetiske form av TGF å være lik EGF, som resorberer ben over et lignende tidsforløp i denne bio-assay. (Raisz et al. (1980) Endocrinology 107, 270.) Effekten av TGF på benresorpsjon syntes å være uavhengig av prostaglandin-syntese.
Siden rotte-TGF resorberte ben in vitro, ble humanpreparater som inneholdt TGF-aktivitet også testet med hensyn på deres effekter på ben. Delvis rensede preparater av høy- og lavmole-kylvekts TGF ble fremstilt fra en human-melanom-cellelinje (Marquardt et al. (1982) J. Biol. Chem. 275, 5220). Disse preparater ble delvis renset ved syreekstraksjon og gelfiltreringskromatografi. Både høy (13.000)- og lav (6.000)-molekylvekt-formene stimulerte benresorpsjon. Den høymolekylære form stimulerte resorpsjon i løpet av 48 timer, mens den lavmolekylære form krevet 72 til 96 timer for å stimulere resorpsjon - et tidsforløp lik det hos det syntetiske rotte-TGF og EGF.
Eksempel 15
Vaccinia virus- infiserte celler frigjør et nytt polypeptid som er funksjonelt beslektet med transformerende og epidermale vekstfaktorer, cellekultur og virus
Cercopithecus-ape-nyre (BSC-1)-celle-monosjikt ble holdt i Eagles basal-medium supplert med 10% føtalt kalveserum. Vaccinia virus (W) (stamme WR) ble dyrket i Hela-celler og renset ved sukrose-densitets-gradientsedimentering. (Moss (1981) In Gene Amplification and Analysis, vol. 2, eds., Chirickjian og Papis (Elsevier/North Holland, New York s. 253-266).
Fremstilling av kondisjonert medium
BSC-l-celle-monosjikt ble inkubert ved 37'C med renset virus i Eagles basal-medium supplert med 2% føtalt kalveserum. Cellekultur-supernatanter ble klarnet ved lavhastighets-sentrifugering og lyofilisert. Resten ble så resuspendert i en 1 M eddiksyre og dialysert uttømmende mot 0,2 M eddiksyre. Uløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering, og supernatanten ble lyofilisert og resuspendert i 1/100 av det opprinnelige volum av 1 M eddiksyre og lagret ved 4°C.
Krornatoqraf i
Gelfiltrering ble utført på kolonner av Bio-Gel P-10 (BioRad, Richmond, CA) likevektsinnstilt i l M eddiksyre. Størrelsesortering på høytrykks-væskekromatografisystem benyttet to Bio-Sil TSK-250 kolonner (BioRad) i serie.
Det isolerte materiale, betegnet Vaccinia virus-vekstfaktor (VGF), hadde den aminosyresekvens som er gitt i eksempel 6 ovenfor.
Radioreseptor- assay
Den anvendte radioreseptor-assay var lik den som er beskrevet ovenfor i eksempel 1. TGF- og VGF-konsentrasjonene ble uttrykt som den mengde som kreves for å produsere en inhibering av <125>I-EGF-binding som er ekvivalent med en kjent mengde av EGF.
Radioimmuno- assav
Den anvendte radioimmuno-assay var lik den som er beskrevet ovenfor i eksempel 11.
Resultater
Nærvær av EGF- konkurrerende aktivitet i kulturmediet til W-infiserte celler
Supernatanten, som stammet fra BSC-l-celle 24 timer etter infeksjon med W, ble testet med hensyn på nærvær av materiale som kunne konkurrere med <125>I-merket EGF for binding til EGF-reseptor-rike human-epidermoide carcinomaceller (A431). W-infiserte celler frigjorde en kraftig EGF-konkurrerende aktivitet som vesentlig metter (>10 ng) assay'en med ekvivalenten av 10 ng materiale resuspendert fra 0,5 ml dyrkningsfluid. Aktiviteten ble betegnet W-vekstfaktor (VGF). (I motsetning til dette inneholdt narre-infiserte BSC-l-kontrollkulturer minimal EGF-konkurrerende aktivitet selv ved den laveste fortynning som ble testet.)
De neste eksperimenter ble lagt opp slik at de skulle undersøke kinetikken til VGF-produksjon. Ved det tidligste tidspunkt hvor det ble undersøkt, 2 timer etter infeksjon, var forsterkede nivåer av EGF-konkurrerende aktivitet allerede tilstede i dyrkningsmediet, hvilket antyder hurtig syntese og frigjøring av VGF. Ved 12 timer ble maksimale mengder av denne aktivitet funnet i kultur-supernatanter; bare en svak økning ble notert ved 24 timer. Siden det W-kodede polypeptid med struk-turell homologi til EGF og TGF er et tidlig genprodukt, ble VGF-ekspresjon overvåket i BSC-l-cellekulturer behandlet med cytosin-arabinosid (AraC) som startet umiddelbart etter den 1 time lange virus-adsorpsjonsperiode. Inhibering av DNA-syntese av AraC blokkerer ekspresjonen av sene vaccinia-gener, mens tidlige genprodukter ikke påvirkes på lignende måte. VGF-produksjon var ikke inhibert i AraC-behandlede kulturer, men var, i forhold til infiserte kontrollkulturer, forsterket mer enn 2 ganger ved 13 og 24 timer etter infeksjonen. Nivået av VGF-produksjon var også en funksjon av virus-inokulatet (tabell XI). Med et plaque-dannende enhet (PFU) - til - celle-forhold på 20:1 ble tilnærmet 3 ng EGF-ekvivalenter av VGF pr. ml påvist i kultur-supernatanter ved
24 timer etter infjeksjonen. VGF-produksjon var proporsjonal med multiplisitet av infeksjon, med ca. 6 og 10 ng ekvivalenter av EGF påvist i BSC-l-kulturer infisert ved forhold på henholdsvis 40 og 80 PFU/celle.
Delvis rensning av VGF
Den EGF-konkurrerende aktivitet som finnes i W-infiserte BAS-l-celler ble delvis renset fra syre-ekstraherte kultur-supernatanter ved 24 timer etter infeksjonen. Syresolubiliserte polypeptider (10,5 mg) fra W-infiserte cellekultur-supernatanter ble påført i en Bio-Gel P-10 kolonne likevektsinnstilt i l M eddiksyre, og prøver fra hver fraksjon ble testet med hensyn på VGF-konkurrerende aktivitet. Hovedtoppen for EGF-konkurranse (fraksjon 42) eluerte, litt etter karbonsyre-anhydrase-markøren ved Mr = 29.000, med en tilsynelatende molekylvekt på 25.000. Ingen signifikant aktivitet ble påvist i fraksjoner tilsvarende den kjente elueringsposisjon av EGF (fraksjon 100) eller rotte-TGF (fraksjon 78) på denne kolonne. Topp-VGF-aktivitet (fraksjon 42-44) ble anvendt for påfølgende biologiske studier. Molekylvekten ble bekreftet ved benyttelse av tandem-forbundet Bio-Sil TSK 250 HPLC størrelsesorterende kolonner. All den EGF-konkurrerende aktivitet eluerte som en hovedtopp i regionen til proteinmarkøren ved Mr = 25.000.
Immunologisk sammenligning mellom EGF og TGF
For ytterligere å sammenligne TGF med VGF ble sistnevnte testet i konkurrerende radioimmuno-assay med hensyn på TGF som beskrevet ovenfor. Denne assay kan skjelne EGF fra TGF og gjenkjenner både lav- og høy-molekylvektformer av TGF fra rotte og fra menneske-opprinnelse. (Linsley et al. (1985) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82, s. 365-369). Rotte-TGF konkurrerte effektivt med <125>I-merket TGF-peptid med hensyn på binding til antistoff med en skråkultur lik den for umerket TGF-peptid. En 50% forskyvning av antigen fra antistoff ble observert ved en antigenkonsentrasjon på tilnærmet 0,2-0,3 ng-ekvivalenter av EGF. Da VGF ble testet ved ekvivalente konsentrasjoner, ble det ikke observert noen konkurranse, hvilket antyder at VGF ikke er et medlem av TGF-familien av peptider, hva immunologiske egenskaper angår. I en konkurrerende radioimmuno-assay med hensyn på nativt EGF, oppviser VGF-preparater minimal forskyvning (<10%) av <125>i-merket EGF fra et polyklonalt antistoff til nativt EGF.
Biologisk aktivitet hos VGF
Minst én størrelsesorden mer VGF (>2000 ng/1) ble funnet i forhold til den høyeste TGF-produsent, Fisher-rottefosterceller (FRE) som var ikke-produktivt transformert av Snyder-Theilen Feline sarcoma virus.
I en TGF-avhengig myk-agar-assay for forankringsuavhengig cellevekst danner VGF-stimulerte nyreceller fra normal rotte progressivt voksende kolonier i myk agar. På ng-ekvivalent-basis produserte delvis rensede VGF-preparater 102 kolonier mens EGF og rotte-TGF produserte henholdsvis 120 og 154 kolonier. (Det er mulig at kontaminerende aktiviteter i delvis rensede VGF-preparater kan influere på kvantifisering i denne type av biologisk assay.)
VGF oppviste også kraftig mitogenisitet da det ble testet på et utvalg av dyrkede fibroblaster. Da det ble testet ved ekvivalente EGF-reseptorbindingsnivåer med serum-utsultede (48 timer) mink-fibroblaster (som har relativt høye antall EGF-membran-reseptorpunkter), utløste VGF en 78% økning i DNA-syntese i forhold til ustimulerte serum-berøvede celler, mens en 59% stimulering i deoksyuridin-inkorporering ble sett hos muse-submaksilær kjertel-EGF. Således er den mitogene effekt av VGF minst så sterk som verdien hos EGF.
Claims (2)
1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en polypeptid-transformerende vekstfaktor, fortrinnsvis en human sådan, eller oligomerer derav med følgende formel:
hvor R er Asp eller Lys, R' er Phe eller Tyr, R" er Ser eller Phe og R<11>' er Asp eller Glu, R<4> er Phe eller Tyr, og R<5> er Val eller Ala, karakterisert ved: (a) isolering fra et vandig medium som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid i uren form, ved
(1) dialyse av det vandige medium som inneholder den transformerende vekstfaktor i uren form, mot en vandig, svak organisk syre for å gi en løsningsmiddelfase som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid hvis fase er konsentrert og eventuelt klaret, idet det vandige medium som inneholder nevnte transformerende vekstfaktor-polypeptid i uren form, f.eks. er en kroppsvæske som inneholder transformerende vekstfaktor eller et vandig medium kondisjonert med en transformerende vekstfaktor-produserende cellelinje,
(2) gjendannelse av den konsentrerte løsningsmiddelfase fra trinn (1) med en vandig, svak organisk syre og underkastelse av den gjendannede løsning for gelpermeasjons-kromatograf i ved å tilsette gjendannet løsning til en gelpermeasjonskromatografi-kolonne kondisjonert med en vandig, svak organisk syre og eluering med den vandige, svake organiske syre for å få valgte fraksjoner av eluat som inneholder transformerende vekstfaktor-polypeptid i en forøket renhetstilstand, idet nevnte valgte fraksjoner blir kombinert og konsentrert for å gi et delvis renset, transformerende vekstfaktor-polypeptid-holdig produkt,
(3) å underkaste det delvis rensede, transformerende vekstfaktor-polypeptid-holdige produkt fra trinn (2) sekvensiell revers fase-høytrykks-kromatografi ved å la nevnte produkt, etter gjendannelse i en vandig, sterk syre, passere gjennom en eller flere hydrokarbonbundne silisiumdioksyd-matrikskolonner som er blitt likevektsinnstilt med vandig, sterk, syre under høytrykks-væskekromatografibetingelser, idet den første eluering av kolonnen blir utført ved å bruke en lineær acetonitrilgradient i vandig, sterk syre, og den påfølgende kolonne-eluering, som blir utført på de kombinerte, transformerende vekstfaktor-polypeptid-holdige fraksjoner fra det innledende høytrykks-kromatografitrinn, blir utført ved å bruke en lineær 1-propanol-gradient i vandig, sterk syre, idet nevnte 1-propanol-gradient blir økt i tilstrekkelig små 1-propanol-konsentrasjonsforøkninger for å gi det transformerende vekstfaktor-polypeptid som en enkelt distinkt topp i en tilstand av homogent polypeptid, eller (b) sekvensiell kobling av aminosyrer, i rekkefølgen gitt ved polypeptid- eller oligopeptid-formelen, på en passende bærer, idet bæreren fortrinnsvis er polystyrenharpiks.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som den vandige, svake organiske syre i trinn (a) (1) og (2) anvendes vandig eddiksyre og i trinn (a) (3) som den vandige, sterke syre anvendes vandig trifluoreddiksyre.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US49275183A | 1983-05-09 | 1983-05-09 | |
US59813684A | 1984-04-12 | 1984-04-12 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO841827L NO841827L (no) | 1984-11-12 |
NO169348B true NO169348B (no) | 1992-03-02 |
NO169348C NO169348C (no) | 1992-06-10 |
Family
ID=27050855
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO841827A NO169348C (no) | 1983-05-09 | 1984-05-08 | Analogifremgangsmaate for fremstilling av en polypeptid-transformerende vekstfaktor |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0132021B1 (no) |
JP (1) | JPH07173193A (no) |
AU (1) | AU575049B2 (no) |
CA (2) | CA1341535C (no) |
DE (1) | DE3485219D1 (no) |
DK (1) | DK227384A (no) |
ES (1) | ES532286A0 (no) |
FI (1) | FI81365C (no) |
GR (1) | GR82078B (no) |
IE (1) | IE57724B1 (no) |
IL (1) | IL71702A (no) |
NO (1) | NO169348C (no) |
NZ (1) | NZ207983A (no) |
PT (1) | PT78571B (no) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3587022T2 (de) * | 1984-02-17 | 1993-06-17 | Genentech Inc | Menschlicher transformationswachstumsfaktor und vorlaeufer oder fragment hiervon, zellen, dna, vektoren und verfahren zu ihrer herstellung, zusammensetzungen und produkte, die diese enthalten, sowie davon abgeleitete antikoerper und diagnostizierverfahren. |
AU5249786A (en) * | 1985-01-29 | 1986-08-07 | Oncogen | Wound healing compositions |
US4686283A (en) * | 1985-04-16 | 1987-08-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Analogs of transforming and epidermal growth factor fragments for therapy and diagnosis |
NZ222168A (en) * | 1986-10-20 | 1991-05-28 | Oncogene Science Inc | Tumour growth inhibiting protein related to tgf-#b#1 and tgf-#b#2, preparation by genetic engineering methods, antibodies and pharmaceutical compositions |
US4931548A (en) * | 1987-01-30 | 1990-06-05 | Techne Corporation | Heterodimer form of transforming growth factor-beta |
AU1539188A (en) * | 1987-05-04 | 1988-11-10 | Bristol-Myers Squibb Company | TGF-B2 and novel compositions having anti-neoplastic activity |
AU6870791A (en) * | 1989-10-18 | 1991-05-16 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic constructs of tgf-beta |
US6040431A (en) * | 1995-06-07 | 2000-03-21 | Stryker Corporation | Single chain analogs of the TGF-β superfamily (morphons) |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6058960B2 (ja) * | 1978-10-09 | 1985-12-23 | サントリー株式会社 | ウィルスの検出,定量剤 |
EP0105014B1 (en) * | 1982-09-24 | 1992-05-20 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce | Repair of tissue in animals |
-
1984
- 1984-04-25 IE IE999/84A patent/IE57724B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-04-26 FI FI841649A patent/FI81365C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-04-26 EP EP84302819A patent/EP0132021B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-26 CA CA000452799A patent/CA1341535C/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-04-26 DE DE8484302819T patent/DE3485219D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-26 CA CA000590515A patent/CA1341508C/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-04-27 NZ NZ207983A patent/NZ207983A/xx unknown
- 1984-04-30 IL IL71702A patent/IL71702A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-04-30 AU AU27513/84A patent/AU575049B2/en not_active Ceased
- 1984-05-04 GR GR74608A patent/GR82078B/el unknown
- 1984-05-08 NO NO841827A patent/NO169348C/no unknown
- 1984-05-08 ES ES532286A patent/ES532286A0/es active Granted
- 1984-05-08 DK DK227384A patent/DK227384A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-05-09 PT PT78571A patent/PT78571B/pt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-22 JP JP6254765A patent/JPH07173193A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL71702A0 (en) | 1984-07-31 |
ES8600518A1 (es) | 1985-09-16 |
DK227384D0 (da) | 1984-05-08 |
AU575049B2 (en) | 1988-07-21 |
FI81365B (fi) | 1990-06-29 |
IE840999L (en) | 1984-11-09 |
ES532286A0 (es) | 1985-09-16 |
FI81365C (fi) | 1990-10-10 |
GR82078B (no) | 1984-12-13 |
JPH07173193A (ja) | 1995-07-11 |
AU2751384A (en) | 1984-11-15 |
PT78571A (en) | 1984-06-01 |
IE57724B1 (en) | 1993-03-24 |
CA1341508C (en) | 2006-06-13 |
PT78571B (en) | 1986-06-26 |
EP0132021A1 (en) | 1985-01-23 |
NZ207983A (en) | 1991-09-25 |
EP0132021B1 (en) | 1991-10-30 |
CA1341535C (en) | 2007-07-24 |
NO841827L (no) | 1984-11-12 |
DK227384A (da) | 1984-11-10 |
FI841649A (fi) | 1984-11-10 |
NO169348C (no) | 1992-06-10 |
FI841649A0 (fi) | 1984-04-26 |
DE3485219D1 (de) | 1991-12-05 |
IL71702A (en) | 1988-01-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4816561A (en) | Biologically active polypeptides | |
US5240912A (en) | Transforming growth factor (TGF) peptides | |
US4863899A (en) | Biologically active polypeptides | |
JP3155002B2 (ja) | エリスロポイエチンペプチドおよびこれらに対する抗体 | |
AU744585B2 (en) | Heparin-binding growth factor (HBGF) polypeptides | |
EP2385061A2 (en) | Neuritogenic peptides | |
AU4224493A (en) | Binding peptides which interact with ligand growth factors of the epidermal growth factor receptor and erbb-2-receptor | |
NO169348B (no) | Analogifremgangsmaate for fremstilling av en polypeptid-transformerende vekstfaktor | |
JPH02479A (ja) | snRNP−A抗原及びそのフラグメント | |
Lin et al. | Growth inhibition by vaccinia virus growth factor. | |
FI91484C (fi) | Menetelmä uuden solun kasvua säätelevän tekijän, onkostatiini M:n valmistamiseksi | |
JPH02288899A (ja) | 成熟肝実質細胞増殖因子(i) | |
CA1341536C (en) | Transforming growth factor peptides | |
NZ231140A (en) | Transforming growth factor (tgf) and its isolation | |
TAM et al. | Mapping the receptor‐recognition site of human transforming growth factor‐α | |
FI81497B (fi) | Antikroppar mot biologiskt aktiva polypeptider och deras anvaendning vid diagnostiska foerfaranden. | |
FI89061B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt aktiva antikroppar av biologiskt aktiva polypeptider samt i foerfarandet anvaenda polypeptider och oligopeptider | |
JP3232415B2 (ja) | モノクローナル抗体,その製造法および用途 | |
DK176220B1 (da) | Monoklonalt antistof, som binder human vævsfaktor-protein, samt dets anvendelse | |
CN112480247A (zh) | 抗人血清白蛋白单克隆抗体 | |
WO1989008118A1 (en) | Synthetic scm-active cancer recognition peptides | |
JP3025002B2 (ja) | Dna、ポリペプチド、抗体、およびそれらの用途 | |
US5231002A (en) | Synthetic SCM-active cancer recognition peptides | |
WO1996019501A1 (en) | Modulators of bone cell function and uses thereof | |
JPH03128329A (ja) | 虚血性心疾患の予防・治療剤 |