NO168306B - ANALOGY PROCEDURE FOR PREPARING AN INHIBITOR FORANGIOTENSIN-CONVERSING ENZYM - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av en inhibitor for angiotensin-omdannende enzym for bruk ved behandling av høyt blodtrykk. The present invention relates to the production of an inhibitor for angiotensin-converting enzyme for use in the treatment of high blood pressure.

Angiotensin-omdannende enzym (peptidyldipeptidhydrolase, i det følgende betegnet ACE) opptar en sentral rolle innen fysiologien for hypertensjon. Enzymet kan omdanne dekapeptidet angiotensin I, som har sekvensen Angiotensin-converting enzyme (peptidyl dipeptide hydrolase, hereinafter referred to as ACE) occupies a central role in the physiology of hypertension. The enzyme can convert the decapeptide angiotensin I, which has the sequence

AspArgValTyrIleHi sProPheHi sLeu AspArgValTyrIleHi sProPheHi sLeu

til et oktapeptid, angiotensin II, ved fjerning av karboksy-termlnalgruppen HisLeu. Symbolene for de forskjellige kjemiske del-grupperinger forklares i nedenstående tabell. to an octapeptide, angiotensin II, by removal of the carboxy-terminal group HisLeu. The symbols for the different chemical sub-groupings are explained in the table below.

Ala - L-alanin Ala - L-alanine

Arg = L-arginin Arg = L-arginine

Asp - L-aspartinsyre Asp - L-aspartic acid

< Glu - pyro-L-glutaminsyre < Glu - pyro-L-glutamic acid

Gly ■= ,glycin Gly ■= ,glycine

Hip - Hippursyre (benzoyl-glycin) Hip - Hippuric acid (benzoyl-glycine)

His - L-histidin His - L-histidine

Ile - L-isoleucin Ile - L-isoleucine

Leu - L-leucin Leu - L-leucine

Phe - L-fenylalanin Phe - L-phenylalanine

Pro « L-prolin Pro « L-proline

A Pro - L-3,4-dehydroprolin A Pro - L-3,4-dehydroproline

Ser - L-serin Ser - L-serine

Trp - L-tryptofan Trp - L-tryptophan

Tyr - L-tyrosin Tyr - L-tyrosine

Val - L-valin Valine - L-valine

ACE - Angiotensin-omdannende enzym ACE - Angiotensin converting enzyme

Hepes - N-2-hydroksyetylpiperazin-N<*->2-etansulfonsyre Angiotensin I dannes ved innvirkning av enzymet renin, en endopeptidase som finnes i nyren, andre vev og plasma, og som virker på et serum ot-2-globulin. Hepes - N-2-hydroxyethylpiperazine-N<*->2-ethanesulfonic acid Angiotensin I is formed by the action of the enzyme renin, an endopeptidase found in the kidney, other tissues and plasma, which acts on a serum ot-2-globulin.

Blodtrykket påvirkes av visse peptider som finnes i blodet. Et av disse, angiotensin II, er et kraftig pressorstoff (blodtrykksforhøyende middel). Et annet, bradykinin, et nonapeptid med sekvensen ArgProProGlyPheSerProPheArg er et kraftig depressorstoff (blodtrykkssenkende middel). I tillegg til en direkte pressorvirkning stimulerer angiotensin II frigjøring av aldosteron som har tendens til å forhøye blodtrykket ved å forårsake retensjon av ekstracellulære salter og fluider. Angiotensin II finnes i målbar mengde i blodet hos normale mennesker. Det finnes imidlertid i forhøyede konsentrasjoner i blodet hos pasienter med renal hypertensjon. Blood pressure is affected by certain peptides found in the blood. One of these, angiotensin II, is a powerful pressor substance (blood pressure-increasing agent). Another, bradykinin, a nonapeptide with the sequence ArgProProGlyPheSerProPheArg is a powerful depressant (blood pressure lowering agent). In addition to a direct pressor effect, angiotensin II stimulates the release of aldosterone which tends to raise blood pressure by causing retention of extracellular salts and fluids. Angiotensin II is found in measurable amounts in the blood of normal people. However, it is found in elevated concentrations in the blood of patients with renal hypertension.

Nivået for ACE-aktivitet er vanligvis i overskudd, hos både normale og hypertensive mennesker, i forhold til en mengde som er nødvendig for å opprettholde observerte nivåer av angiotensin II. Det er imidlertid funnet at betydelig blodtrykkssenkning oppnås hos hypertensive pasienter ved behandling med ACE-inhibitor. [Gavras, I., et al., New Engl. J. Med., 291, 817 (1974 )]. The level of ACE activity is usually in excess, in both normal and hypertensive people, relative to an amount necessary to maintain observed levels of angiotensin II. However, it has been found that significant blood pressure lowering is achieved in hypertensive patients by treatment with an ACE inhibitor. [Gavras, I., et al., New Engl. J. Med., 291, 817 (1974 )].

ACE er en peptidyldipeptidhydrolase. Den katalyserer hydrolysen av den nest siste peptidbinding ved C-terminalenden i en rekke acylerte tripeptider og større polypeptider med en ublokkert a-karboksylgruppe. Virkningen av ACE resulterer i hydrolytisk spalting av den nest siste peptid-bindingen fra karboksyl-terminalenden og gir som reaksjons-produkter et dipeptid og en rest. ACE is a peptidyl dipeptide hydrolase. It catalyzes the hydrolysis of the penultimate peptide bond at the C-terminal end in a variety of acylated tripeptides and larger polypeptides with an unblocked α-carboxyl group. The action of ACE results in hydrolytic cleavage of the penultimate peptide bond from the carboxyl terminal end and gives as reaction products a dipeptide and a residue.

Eeaktiviteten til enzymet varierer betydelig avhengig av substratet. Minst en type peptidbinding, som har nitrogen-atomet supplert med prolin, blir ikke hydrolysert i det hele tatt. Den tilsynelatende Michaelis-konstant (Km) varierer fra substrat til substrat over flere størrelsesordner. Med hensyn til en generell omtale av de kinetiske parametre for enzymkatalyserte reaksjoner skal det vises til Lehninger, A., Biochemistry, 2. utgave, Worth Publishers, Inc., New York, 1975, sidene 189-195. Mange peptider som er betegnet inhibitorer for den enzymatiske omdannelse av angiotensin I til angiotensin II er i virkeligheten substrater som har en lavere Km-verdi enn angiotensin I. Slike peptider er mer korrekt betegnet konkurrerende substrater. Eksempler på konkurrerende substrater er bradykinin, og peptidet BPP5a (også betegnet SQ20475) fra slangegift, hvis sekvens er The activity of the enzyme varies considerably depending on the substrate. At least one type of peptide bond, which has the nitrogen atom supplemented by proline, is not hydrolyzed at all. The apparent Michaelis constant (Km) varies from substrate to substrate over several orders of magnitude. For a general discussion of the kinetic parameters of enzyme-catalyzed reactions, reference should be made to Lehninger, A., Biochemistry, 2nd edition, Worth Publishers, Inc., New York, 1975, pages 189-195. Many peptides that are termed inhibitors of the enzymatic conversion of angiotensin I to angiotensin II are in reality substrates that have a lower Km value than angiotensin I. Such peptides are more correctly termed competitive substrates. Examples of competitive substrates are bradykinin, and the peptide BPP5a (also designated SQ20475) from snake venom, whose sequence is

<GluLysTrpAlaPro. <GluLysTrpAlaPro.

Flere syntetiske peptidderivater har vist seg å være ACE-inhibitorer av Ondetti et al. i US patent 3.832.337. Several synthetic peptide derivatives have been shown to be ACE inhibitors by Ondetti et al. in US patent 3,832,337.

Den rolle ACE spiller i patogenesen av hypertensjon har tilskyndet en forskning etter inhibitorer av enzymet som kan virke som antlhypertensive legemidler. Se f.eks. US patenter 3.891.616, 3.947.575, 4.052.511 og 4.053.651. En meget effektiv inhibitor, med høy biologisk aktivitet ved oral administrasjon, er D-3-merkapto-2-metylpropanoyl-L-prolin, betegnet S014225, beskrevet i US patent 4.046.889, og i vitenskapelige artikler av Cushman, D.W., et al., Biochemistry, 16, 5484 (1977 ), og av Ondetti, M. , et al., Science, 196, 441 (1977). Inhibitoren SQ14225 er rapportert å ha en l5ø-verdi på 2,3 x 10~<®>M. 150-verdien rapportert av Cushman et al., er konsentrasjonen av inhibitor som skal til for å gi 505É inhibering av enzymet ved et standard prøvesystem inneholdende substratet ved et nivå vesentlig over Km. Det vil forstås at 150-verdier er direkte sammenlignbare når alle potensielle faktorer som påvirker reaksjonen holdes konstant. Disse faktorer inkluderer kilden for enzym, dets renhet, substratet som anvendes og dets konsentrasjon, og sammen-setningen av prøvebufferen. Alle Isø-data som er rapportert heri er oppnådd med det samme prøvesystem og samme enzym (menneskeurin ACE) og med et omtrentlig V4 Km-nivå av substratet og er derfor i seg selv ensartet. Uoverensstemmelser med data oppnådd av andre forskere kan observeres. Og slike uoverensstemmelser eksisterer virkelig 1 littera-turen av ukjente grunner. Se f.eks. I50-verdiene for BPP()a rapportert av Cushman, D.W., et al., Experientia, 29, 1032 The role ACE plays in the pathogenesis of hypertension has prompted a search for inhibitors of the enzyme that can act as antihypertensive drugs. See e.g. US patents 3,891,616, 3,947,575, 4,052,511 and 4,053,651. A highly effective inhibitor, with high biological activity when administered orally, is D-3-mercapto-2-methylpropanoyl-L-proline, designated S014225, described in US patent 4,046,889, and in scientific articles by Cushman, D.W., et al. ., Biochemistry, 16, 5484 (1977), and by Ondetti, M., et al., Science, 196, 441 (1977). The inhibitor SQ14225 is reported to have an l5ø value of 2.3 x 10~<®>M. The 150 value reported by Cushman et al. is the concentration of inhibitor required to give 505% inhibition of the enzyme in a standard test system containing the substrate at a level substantially above the Km. It will be understood that 150 values are directly comparable when all potential factors influencing the reaction are held constant. These factors include the source of enzyme, its purity, the substrate used and its concentration, and the composition of the sample buffer. All Isø data reported herein were obtained with the same sample system and enzyme (human urine ACE) and with an approximate V4 Km level of the substrate and are therefore intrinsically uniform. Discrepancies with data obtained by other researchers can be observed. And such inconsistencies really exist in the literature for unknown reasons. See e.g. The I50 values for BPP()a reported by Cushman, D.W., et al., Experientia, 29, 1032

(1973) og av Dorer, F.E., et al., Biochlm. Blophys. Acta, 429, 220 (1976). (1973) and by Dorer, F.E., et al., Biochlm. Blophys. Acta, 429, 220 (1976).

Virknlngsmåten til S014225 har blitt basert på en modell av det aktive sted 1 ACE utviklet gjennom analogi med det bedre kjente beslektede enzym, karboksypeptidase A. Det aktive sted ble postulert å ha et kationisk punkt for binding av karboksyl-endegruppen i substratet og en lomme eller spalte som kunne binde sidekjeden i C-terminal aminosyren og gi en særlig fast binding for den heterocykliske ring i en terminal prolinrest. En lignende lomme for den nest siste aminosyre-rest ble postulert, og de publiserte data foreslo en temmelig streng sterisk betingelse, siden D-formen for inhibitoren var mer vesentlig virkningsfull enn dens stereoisomer eller 3-metyl- og usubstituerte analoger. Sulfhydrylgruppen i inhibitoren, som er postulert å være bundet ved det aktive sted nær det katalytiske senter, ble antatt å spille en sentral rolle ved inaktivering av enzymet ved å kombinere med sinkdelen som er kjent for å være vesentlig for katalytisk aktivitet. Substituenter på sulfhydrylgruppen, slik som en metylgruppe, og et S-acetylderivat, reduserte i vesentlig grad inhibitorens virkningsgrad. Se Cushman, D.W. , et al., Biochemistry, som nevnt ovenfor. The mode of action of S014225 has been based on a model of the active site 1 ACE developed by analogy with the better known related enzyme, carboxypeptidase A. The active site was postulated to have a cationic site for binding the carboxyl end group of the substrate and a pocket or gap that could bind the side chain in the C-terminal amino acid and provide a particularly strong bond for the heterocyclic ring in a terminal proline residue. A similar pocket for the penultimate amino acid residue was postulated, and the published data suggested a rather stringent steric condition, since the D-form of the inhibitor was substantially more potent than its stereoisomer or 3-methyl and unsubstituted analogues. The sulfhydryl group in the inhibitor, which is postulated to be bound at the active site near the catalytic center, was thought to play a central role in inactivating the enzyme by combining with the zinc moiety known to be essential for catalytic activity. Substituents on the sulfhydryl group, such as a methyl group and an S-acetyl derivative, significantly reduced the effectiveness of the inhibitor. See Cushman, D.W. , et al., Biochemistry, as mentioned above.

In vitro-studier av mekanismen ved hjelp av hvilken SQ14225 og dens analoger virker for å inhibere ACE har vært noe vanskeliggjort av ustabiliteten til disse molekyler under omgivende betingelser. Det er f.eks. observert at en frisk vandig oppløsning med konsentrasjon, f.eks. 1 mg pr. ml SQ14225 ved en pH-verdi på ca. 8, blir vesentlig mindre aktiv ved henstand i så kort tid som 30 minutter, og at aktiviteten fortsetter å avta etter henstand av oppløsningen i lengre tidsrom. Det antas at dette aktivitetstap hovedsakelig er resultatet av dimerisering av SQ14225 som forekommer ved sulfhydrylendegruppene hvorved det dannes et disulfld som overveiende er Inaktivt som en Inhibitor. Siden den frie sulfhydrylgruppen er meget reaktiv og lett kan oksyderes til polare sure grupper slik som sulfon- og sulfoksydgrupper, kan det også være at det observerte in vitro-tap av aktivitet i vandige oppløsninger av SQ14225 ved henstand i en viss grad er en følge av en eller flere slike oksydasjonsreaksjoner, med dannelse av en sulfon eller sulfoksyd som ikke virker effektivt 6om en inhibitor for ACE. In vitro studies of the mechanism by which SQ14225 and its analogs act to inhibit ACE have been somewhat hampered by the instability of these molecules under ambient conditions. It is e.g. observed that a fresh aqueous solution with concentration, e.g. 1 mg per ml SQ14225 at a pH value of approx. 8, becomes significantly less active when allowed to stand for as short as 30 minutes, and that the activity continues to decrease after the dissolution has been allowed to stand for a longer period of time. It is believed that this loss of activity is mainly the result of dimerization of SQ14225 that occurs at the sulfhydryl end groups, thereby forming a disulfide that is predominantly Inactive as an Inhibitor. Since the free sulfhydryl group is very reactive and can easily be oxidized to polar acidic groups such as sulfone and sulfoxide groups, it may also be that the observed in vitro loss of activity in aqueous solutions of SQ14225 upon standing is to some extent a consequence of one or more such oxidation reactions, with the formation of a sulfone or sulfoxide that does not act effectively as an inhibitor of ACE.

Slike rapporter om S014225-klinisk testing som er tilgjengelige, og hvorav noen viser til forbindelsen under betegnelsen "Captopril", foreslår at produktet er tilstrekkelig stabilt i de normale mage- og tarmmiljøer hos de fleste pasienter for å være en effektiv inhibitor for ACE ved oral administrasjon. Det er imidlertid ikke klart om det kan være en gruppe pasienter for hvilke S014225 er vesentlig ineffektiv. På grunn av den høye reaktivitet til den frie sulfhydrylgruppen, kunne S014225 lett danne blandede disulfider med serum, cellulære proteiner, peptider eller andre fri sulfhydryl-gruppeholdige stoffer 1 mage- eller tarmkanalen, i tillegg til muligheten for reaksjoner med dimerdannelse eller oksydativ nedbrytning. Et blandet disulfld med protein kan være antigenisk og det er slik at man av og til klinisk har observert allergiske reaksjoner, se Gavras, et al., New England J. Med., 298, 991 (1978). Disulfider og oksydative nedbrytningsprodukter av S014225 kan, hvis de dannes, i beste fall forventes å være overveiende ineffektive som inhibitorer. Det kan følgelig postuleres at doseresponsen til S014225 kan variere med adminlstrasjonsbetingelser og blant enkeltpasienter. Dessuten, kan det i det minste hos noen pasienter oppstå uønskede bivirkninger og opprettholdelse av en effektiv konsentrasjon av inhibitoren i kroppen kan være vanskelig å regulere. Such reports of S014225 clinical testing as are available, some of which refer to the compound under the designation "Captopril", suggest that the product is sufficiently stable in the normal gastrointestinal environments of most patients to be an effective inhibitor of ACE when given orally administration. However, it is not clear whether there may be a group of patients for whom S014225 is substantially ineffective. Due to the high reactivity of the free sulfhydryl group, S014225 could easily form mixed disulfides with serum, cellular proteins, peptides, or other free sulfhydryl group-containing substances in the gastrointestinal tract, in addition to the possibility of reactions with dimer formation or oxidative degradation. A mixed disulfide with protein can be antigenic and it is the case that allergic reactions have occasionally been observed clinically, see Gavras, et al., New England J. Med., 298, 991 (1978). Disulfides and oxidative degradation products of S014225, if formed, can be expected to be largely ineffective as inhibitors at best. It can therefore be postulated that the dose response to S014225 may vary with administration conditions and among individual patients. Moreover, at least in some patients, unwanted side effects may occur and maintaining an effective concentration of the inhibitor in the body may be difficult to regulate.

Tioesterforbindelser antas generelt å være meget reaktive fordi tioester-blndingen er lett hydrolyserbar til en sulfhydryldel og en karboksyllsk del. Tloestere anvendes følgelig ofte som aktive ester-mellomprodukter for acylerlng under milde betingelser. Slike grupper som f.eks. acetyltlo har blitt benyttet som blokkerende grupper 1 de ovennevnte patenter. Det er også postulert at tioester-mellomprodukter forekommer 1 biosyntesen av cykliske peptider slik som tyrocldln eller gramlcldln S, kfr. Llpamnn, F. 1 Accounts Chem. Res., 6, 361 (1973). Thioester compounds are generally believed to be highly reactive because the thioester mixture is readily hydrolyzable into a sulfhydryl moiety and a carboxylic moiety. Tw esters are therefore often used as active ester intermediates for acylation under mild conditions. Such groups as e.g. acetyltlo has been used as blocking groups in the above-mentioned patents. It has also been postulated that thioester intermediates occur in the biosynthesis of cyclic peptides such as tyrocldln or gramlcldln S, cf. Llpamnn, F. 1 Accounts Chem. Res., 6, 361 (1973).

Tioesterforbindelser med virkningsfull ACE-lnhlberende aktivitet og oral effektivitet som anti-hypertensive midler, er beskrevet i US patentene 4.695.585; 4.698.355, 4.707.490 og 4.777.298. Thioester compounds with potent ACE-inducing activity and oral efficacy as anti-hypertensive agents are described in US patents 4,695,585; 4,698,355, 4,707,490 and 4,777,298.

Forbindelser som er beslektet med S014225 er beskrevet av Ondetti, et al., i US patentene 4.046.889, 4.052.511, 4.053.651,5.113.715 og 5.154.840. Av interesse beskrives analoger av SQ14225 som har den 5-leddede heterocykliske ring i prolin erstattet med en 4- eller 6-leddet ring. De inhiberende virkninger til slike analoger 1 forhold til S014225 er ikke beskrevet. Bruk av D-prolin i stedet for L-prolin er rapportert drastisk å redusere den inhiberende virkningsgrad til 3-merkaptopropanoylaminosyrer (Cushman, D.W., et al., supra). Compounds related to S014225 are described by Ondetti, et al., in US Patents 4,046,889, 4,052,511, 4,053,651, 5,113,715 and 5,154,840. Of interest, analogues of SQ14225 are described which have the 5-membered heterocyclic ring in proline replaced by a 4- or 6-membered ring. The inhibitory effects of such analogues 1 in relation to S014225 have not been described. The use of D-proline in place of L-proline has been reported to drastically reduce the inhibitory potency of 3-mercaptopropanoyl amino acids (Cushman, D.W., et al., supra).

Bruk av L-3,4-dehydroprolin i stedet for prolin har blitt studert i flere systemer. Substitusjon av L-3,4-APro i 7—stillingen i bradykinin gir et bradykininderivat som har betydelig redusert fysiologisk aktivitet, kfr. Fisher, G.H., et al., Arch. Biochem. Biophys., 189, 81 (1978). På den annen side vil substitusjon av L-3,4-APro ved 3-, 5-, 8- eller 9-stillingen i ACE-inhibitor BPPga fremme dens inhiberende aktivitet, kfr. Fisher, G.H. et al., FEBS Letters, 107, 273 The use of L-3,4-dehydroproline instead of proline has been studied in several systems. Substitution of L-3,4-APro in the 7-position in bradykinin gives a bradykinin derivative that has significantly reduced physiological activity, cf. Fisher, G.H., et al., Arch. Biochem. Biophys., 189, 81 (1978). On the other hand, substitution of L-3,4-APro at the 3-, 5-, 8- or 9-position in the ACE inhibitor BPPga will promote its inhibitory activity, cf. Fisher, G.H. et al., FEBS Letters, 107, 273

(1979). I US patent 4.707.490 har man funnet at forbindelsene som har APro, som er beskrevet i nevnte søknad, har høy inhiberende virkningsgrad og anti-hypertensiv effektivitet. I øyeblikket kan det imidlertid ikke gis noen logisk begrun-nelse på forskjel1igartetheten i observerte resultater etter innsettelse av APro i stedet for prolin. Man har likeledes intet klart bilde av virkningene til andre prolinderivater eller analoger substituert ved forskjellige steder på ACE-inhibltorer. (1979). In US patent 4,707,490 it has been found that the compounds having APro, which are described in said application, have a high degree of inhibitory effectiveness and anti-hypertensive effectiveness. At the moment, however, no logical justification can be given for the difference in observed results after the introduction of APro instead of proline. There is also no clear picture of the effects of other proline derivatives or analogues substituted at different sites on ACE inhibitors.

Hittil har virkningen av aminosyren til venstre for svovel-atomet i tioesterforbindelsene beskrevet i inngitte søknader, ikke blitt bestemt. Det antas at denne aminosyren virker som et ekstra gjenkjennelsessted for enzymet. Dersom dette er tilfelle, ville det forventes at en forbindelse med en aminosyre her ville være en bedre inhibitor. Man har funnet at mange aminosyrer, substituerte aminosyrer eller analoge forbindelser kan anvendes for A i nedenstående formel I for tilveiebringelse av effektive anti-hypertensive midler og effektive inhibitorer for ACE. Det skal her vises til US patent 4.734.420. Man har funnet at hydroksyprolinene, prolin, L- og D,D-3,4-dehydroprolin, tiazolidin-4-karboksyl-syre og L-5-oksoprolinderivater alle er effektive antlhypertensive midler og har høy inhiberende virkning for ACE. So far, the effect of the amino acid to the left of the sulfur atom in the thioester compounds described in submitted applications has not been determined. It is believed that this amino acid acts as an additional recognition site for the enzyme. If this is the case, it would be expected that a compound with an amino acid here would be a better inhibitor. It has been found that many amino acids, substituted amino acids or analogous compounds can be used for A in formula I below to provide effective anti-hypertensive agents and effective inhibitors of ACE. Reference should be made here to US patent 4,734,420. It has been found that the hydroxyprolines, proline, L- and D,D-3,4-dehydroproline, thiazolidine-4-carboxylic acid and L-5-oxoproline derivatives are all effective antihypertensive agents and have a high inhibitory effect on ACE.

I US patenter 4.698.355, 4.692.459, 4.707.490 og 4.777.298 har man funnet at forbindelser med formel I var effektive anti-hypertensive midler og har høy inhiberende virkning for ACE. Ved tidspunktet for inngivelse av disse søknader hadde man ikke undersøkt noen salter av disse forbindelser og visste således ikke om saltene ville være.effektive. Man har nå fremstilt salter av disse forbindelser og har bestemt at de er effektive anti-hypertensive midler og kraftigvirkende inhibitorer for ACE. In US patents 4,698,355, 4,692,459, 4,707,490 and 4,777,298 it has been found that compounds of formula I were effective anti-hypertensive agents and have high inhibitory activity for ACE. At the time these applications were submitted, no salts of these compounds had been investigated and thus it was not known whether the salts would be effective. Salts of these compounds have now been prepared and determined to be effective anti-hypertensive agents and potent inhibitors of ACE.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles nye inhibitorer for angiotensin-omdannende enzym for bruk ved behandling av høyt blodtrykk, og disse har den generelle formel: According to the present invention, new inhibitors of angiotensin-converting enzyme are produced for use in the treatment of high blood pressure, and these have the general formula:

hvor R er hydrogen, formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, benzoyl, cyklopentylkarbonyl, tert.-butyloksykarbonyl, cyklopentylkarbonyl-L-lysyl eller pyro-L-glutamyl, where R is hydrogen, formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, benzoyl, cyclopentylcarbonyl, tert-butyloxycarbonyl, cyclopentylcarbonyl-L-lysyl or pyro-L-glutamyl,

Å er L-fenylalanyl, glycyl, L-alanyl, L-tryptofyl, L-isoleucyl, L-leucyl eller L-valyl, hvor a-amlnogruppen er 1 amidbinding med R, forutsatt at fenylalanyl er racemlsk når R er benzoyl, Å is L-phenylalanyl, glycyl, L-alanyl, L-tryptophyll, L-isoleucyl, L-leucyl or L-valyl, where the α-amino group is 1 amide bond with R, provided that phenylalanyl is racemic when R is benzoyl,

Ri er hydrogen eller metyl, R 1 is hydrogen or methyl,

R2 er L-prolln, L-3,4-dehydroprolln eller D,L-3,4-dehydro-prolin, hvor imlnogruppen er i lmldblndlng med tilstøtende R2 is L-proline, L-3,4-dehydroproline or D,L-3,4-dehydro-proline, where the imln group is in lmldblndlng with adjacent

>O0-gruppe, og >O0 group, and

n er 0 eller 1, idet når n ■= 0, så er Ri metyl, n is 0 or 1, since when n ■= 0, Ri is methyl,

og farmasøytisk akseptable salter derav. and pharmaceutically acceptable salts thereof.

Disse forbindelsene med formel I fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved at These compounds of formula I are prepared according to the present invention by

1) en forbindelse med formelen: 1) a compound with the formula:

omsettes med R2 for oppnåelse av en forbindelse med formelen: i hvilke formler R3 er acetyl, og R^, R2 og n har de ovenfor angitte betydninger, 2) fra den i trinn 1) oppnådde forbindelse fjernes R3, hvorved det oppnås en forbindelse med formelen: 3) den i trinn 2) oppnådde forbindelse omsettes med en forbindelse med formelen R-A-OH, hvorved det oppnås en forbindelse med formelen: is reacted with R2 to obtain a compound with the formula: in which formulas R3 is acetyl, and R^, R2 and n have the meanings given above, 2) from the compound obtained in step 1) R3 is removed, thereby obtaining a compound with the formula: 3) the compound obtained in step 2) is reacted with a compound with the formula R-A-OH, whereby a compound with the formula is obtained:

hvor R, A, Ri, R2 og n har de ovenfor angitte betydninger, where R, A, Ri, R2 and n have the meanings given above,

og, om ønsket, omdanner en oppnådd forbindelse til et farmasøytisk akseptabelt salt derav. and, if desired, converting an obtained compound into a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Det er foretrukket at reaksjonen i trinn 1) utføres enten i nærvær av 1,1'-karbonyldiimidazol eller dicykloheksylkarbodiimid, og reaksjonen i trinn 3) utføres i nærvær av 1,1'-karbonyldiimidazol. It is preferred that the reaction in step 1) is carried out either in the presence of 1,1'-carbonyldiimidazole or dicyclohexylcarbodiimide, and the reaction in step 3) is carried out in the presence of 1,1'-carbonyldiimidazole.

Videre er det foretrukket at R2 i trinn 1) også har en beskyttelsesgruppe for karboksyl, som fjernes i trinn 2). Videre er det foretrukket at R er benzoyl, A er fenylalanyl, Ri er metyl, R2 er prolin og n er 1. Furthermore, it is preferred that R2 in step 1) also has a protecting group for carboxyl, which is removed in step 2). Furthermore, it is preferred that R is benzoyl, A is phenylalanyl, R 1 is methyl, R 2 is proline and n is 1.

Alle de ovenfor angitte forbindelser er inhibitorer for ACE og er nyttige som oralt effektive anti-hypertensive midler. All of the above compounds are inhibitors of ACE and are useful as orally effective anti-hypertensive agents.

Salter av forbindelser med formel I Salts of compounds of formula I

Forbindelser med formel I danner basiske salter med forskjellige uorganiske og organiske baser. Slike salter inkluderer ammoniumsalter, alkalimetallsalter, jordalkali-metallsalter, salter med organiske baser, salter med aminosyrer og lignende. Eksempler på alkalimetallsalter er natrium- eller kaliumsaltene. Eksempler på jordalkalimetall-salter er kalsium- eller magnesiumsaltene. Eksempler på organiske basesalter er benzatin-, N-metyl-D-glukamin- eller hydrabaminsaltene. Eksempler på aminosyresalter er arginin og lysin. Natrium-, kalium- og lysinsaltene er foretrukne. Likeledes er ikke-toksiske, fysiologisk akseptable salter foretrukket. Compounds of formula I form basic salts with various inorganic and organic bases. Such salts include ammonium salts, alkali metal salts, alkaline earth metal salts, salts with organic bases, salts with amino acids and the like. Examples of alkali metal salts are the sodium or potassium salts. Examples of alkaline earth metal salts are the calcium or magnesium salts. Examples of organic base salts are the benzathine, N-methyl-D-glucamine or hydrabamine salts. Examples of amino acid salts are arginine and lysine. The sodium, potassium and lysine salts are preferred. Likewise, non-toxic, physiologically acceptable salts are preferred.

Saltene dannes ved omsetning av den frie syren av forbindelsene med formel I med en ekvivalent av den egnede basen som gir det ønskede kation i et oppløsningsmiddel eller medium i hvilket saltet er uoppløselig, eller i vann og fjerning av vannet ved frysetørking. The salts are formed by reacting the free acid of the compounds of formula I with an equivalent of the suitable base which gives the desired cation in a solvent or medium in which the salt is insoluble, or in water and removing the water by freeze-drying.

Saltene som fremstilles ifølge oppfinnelsen inhiberer omdannelsen av dekapeptidet angiotensin I til angiotensin II og er derfor nyttig ved reduksjon eller lindring av angiotensin-relatert hypertensjon. Virkningen av enzymet renin på angiotensinogen, et pseudoglobulin i blodplasma, produserer angiotensin I. Angiotensin I omdannes av angiotensin-omdannende enzym (AE) til angiotensin II. Det sistnevnte er et aktivt pressorstoff som har blitt implisert som det kausative middel i forskjellige former for hypertensjon i forskjellige pattedyrarter, f.eks. rotter og hunder. Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse griper inn i angiotensinogen (<renln.>) angiotensin I ^ACEJ angiotensin II-sekvensen ved å inhibere angiotensin-omdannende enzym og redusere eller eliminere dannelsen av pressorstoffet angiotensin II. Ved administrasjon av et preparat inneholdende ett eller en kombinasjon av salter av forbindelsene med formel I, vil angiotensinavhengig hypertensjon i pattedyrartene som lider under en slik tilstand bli dempet. En enkelt dose, eller fortrinnsvis to eller fire oppdelte daglige doser, tilveiebragt på en basis av fra 0,1 til 100 mg pr. kg pr. dag, fortrinnsvis 1-50 mg pr. kg pr. dag, er passende når det gjelder å redusere blodtrykk som angitt i dyremodellforsøkene beskrevet av S.L. Engel, T.R. Schaeffer, M.E. Waugh og B. Rubin, Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 143 The salts produced according to the invention inhibit the conversion of the decapeptide angiotensin I to angiotensin II and are therefore useful in reducing or alleviating angiotensin-related hypertension. The action of the enzyme renin on angiotensinogen, a pseudoglobulin in blood plasma, produces angiotensin I. Angiotensin I is converted by angiotensin-converting enzyme (AE) to angiotensin II. The latter is an active pressor substance that has been implicated as the causative agent in various forms of hypertension in various mammalian species, e.g. rats and dogs. The compounds of the present invention intervene in the angiotensinogen (<renln.>) angiotensin I ^ACEJ angiotensin II sequence by inhibiting angiotensin-converting enzyme and reducing or eliminating the formation of the pressor substance angiotensin II. By administration of a preparation containing one or a combination of salts of the compounds of formula I, angiotensin-dependent hypertension in the mammalian species suffering from such a condition will be attenuated. A single dose, or preferably two or four divided daily doses, provided on a basis of from 0.1 to 100 mg per kg per day, preferably 1-50 mg per kg per day, is appropriate in reducing blood pressure as indicated in the animal model experiments described by S.L. Engel, T.R. Schaeffer, M.E. Waugh and B. Rubin, Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 143

(1973). Stoffet blir fortrinnsvis administrert oralt, men parenterale veier slik som subkutant, intramuskulært, intravenøst eller intraperitonealt kan også anvendes. (1973). The substance is preferably administered orally, but parenteral routes such as subcutaneous, intramuscular, intravenous or intraperitoneal can also be used.

Saltene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for oppnåelse av en blodtrykksreduksjon ved inkorporering i preparater slik som tabletter, kapsler eller eliksirer for oral administrasjon eller i sterile oppløs-ninger eller suspensjoner for parenteral administrasjon. Omkring 10-500 mg av et salt eller en blanding av salter av forbindelsene med formel I sammenblandes med en fysiologisk akseptabel bærer, eksipient, bindemiddel, preserverings-middel, stabiliseringsmiddel, smaksstoff, osv., i en enhetsdoseform ifølge akseptert farmasøytisk praksis. Mengden av aktivt stoff i disse preparater er slik at en passende dose I det angitte området oppnås. The salts produced according to the present invention can be used to achieve a blood pressure reduction by incorporation into preparations such as tablets, capsules or elixirs for oral administration or in sterile solutions or suspensions for parenteral administration. About 10-500 mg of a salt or mixture of salts of the compounds of formula I is combined with a physiologically acceptable carrier, excipient, binder, preservative, stabilizer, flavoring agent, etc., in a unit dosage form according to accepted pharmaceutical practice. The amount of active substance in these preparations is such that a suitable dose in the specified range is achieved.

Som illustrasjon på hjelpestoffer som kan inkorporeres i As an illustration of excipients that can be incorporated into

tabletter, kapsler og lignende, kan følgende angis: et bindemiddel slik som tragantgummi, akacia, maisstivelse eller gelatin; et hjelpestoff slik som dikalsiumfosfat; et disintegreringsmiddel slik som maisstivelse, potetstivelse, alginsyre og lignende; et smøremiddel slik som magnesium-stearat; et søtningsmiddel slik som sukrose, laktose eller sakkarin; et smaksstoff slik som peppermynte, olje av vintergrønn eller kirsebær. Når doseringsenhetsformen er en kapsel, kan den i tillegg til de ovenfor angitte materialer Inneholde en væskeformig bærer slikk som fettolje. Forskjellige andre materialer kan være til stede som belegg eller for på annen måte å modifisere doserlngsenhetens fysiske form. tablets, capsules and the like, the following can be specified: a binding agent such as gum tragacanth, acacia, corn starch or gelatin; an excipient such as dicalcium phosphate; a disintegrant such as corn starch, potato starch, alginic acid and the like; a lubricant such as magnesium stearate; a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin; a flavoring such as peppermint, oil of wintergreen or cherry. When the dosage unit form is a capsule, it may, in addition to the above-mentioned materials, contain a liquid carrier such as fatty oil. Various other materials may be present as coatings or to otherwise modify the physical form of the dosage unit.

Tabletter kan f.eks. belegges med skjellakk, sukker eller begge deler. En sirup eller eliksir kan inneholde den aktive forbindelse, sukrose som søtningsstoff, metyl- og propyl-parabener som preservativer, et fargestoff og et smaksstoff slik som kirsebær- eller appelsinsmak. Tablets can e.g. coated with shellac, sugar or both. A syrup or elixir may contain the active compound, sucrose as a sweetener, methyl and propyl parabens as preservatives, a coloring agent and a flavoring agent such as cherry or orange flavor.

Sterile preparater for injeksjon kan formuleres ifølge konvensjonell farmasøytisk praksis ved oppløsning eller suspensjon av det aktive stoff i en bærer slik som vann for injeksjon, en naturlig forekommende vegetabilsk olje slik som sesamolje, kokosolje, peanøttolje, bomullsfrøolje, osv., eller en syntetisk fettbærer slik som etyloleat eller lignende. Buffere, preservativer og lignende kan inkorporeres etter behov. Sterile preparations for injection may be formulated according to conventional pharmaceutical practice by dissolving or suspending the active substance in a carrier such as water for injection, a naturally occurring vegetable oil such as sesame oil, coconut oil, peanut oil, cottonseed oil, etc., or a synthetic fatty carrier such as such as ethyl oleate or the like. Buffers, preservatives and the like can be incorporated as required.

Oppfinnelsen vil bli bedre forstått under henvisning til de følgende spesifikke eksempler som beskriver detaljer ved syntesen og brukseffektiviteten til de ovennevnte forbindelser. I disse eksemplene ble det benyttet tynnsjiktskromatografi (TLC) under anvendelse av si 1isiumdioksydgelplater. De numeriske oppløsningsmiddelsystemer benyttet i TLC-metodene er som følger: (1) er metanol :kloroform, 1:1 (volumdeler ). (2) er benzen: vann: eddiksyre , 9:1:9 (volumdeler). (3) er eddiksyre: vann: n-butanol 26:24:150 (volumdeler). (4) er n-buta-nol :pyridin:eddiksyre: vann , 15:10:3:12 (volumdeler). (5) er kloroform:metanol:ammoniumhydroksyd, 60:45:20 (volumdeler). Bufrene fra papirelektroforese var: pH 1,9 - maursyre:eddiksyre:vann, 3:2:25 (volumdeler); pH 5,0 - dietylen- glykol:eddiksyre:pyridin:vann, 100:6:8,5:885 (volumdeler). Tert-butyloksykarbonyl-, benzoyl-, acetyl-, formyl-, propanoyl-, butanoyl-, fenylacetyl- og fenylpropanoyl-derivatene av aminosyrene er kommersielt tilgjengelige. The invention will be better understood by reference to the following specific examples which describe details of the synthesis and efficiency of use of the above compounds. In these examples, thin layer chromatography (TLC) using silica gel plates was used. The numerical solvent systems used in the TLC methods are as follows: (1) is methanol:chloroform, 1:1 (parts by volume). (2) is benzene:water:acetic acid, 9:1:9 (parts by volume). (3) is acetic acid: water: n-butanol 26:24:150 (parts by volume). (4) is n-butanol:pyridine:acetic acid:water, 15:10:3:12 (parts by volume). (5) is chloroform:methanol:ammonium hydroxide, 60:45:20 (v/v). The buffers from paper electrophoresis were: pH 1.9 - formic acid:acetic acid:water, 3:2:25 (parts by volume); pH 5.0 - diethylene- glycol:acetic acid:pyridine:water, 100:6:8.5:885 (parts by volume). The tert-butyloxycarbonyl, benzoyl, acetyl, formyl, propanoyl, butanoyl, phenylacetyl and phenylpropanoyl derivatives of the amino acids are commercially available.

Eksempel 1 Example 1

ACE- aktlvitetsbestemmelse ACE activity determination

For de fleste av de beskrevne forsøk ble enzymet bestemt i 0.05M Hepes-buffer, pH 8,0 inneholdende 0,1M NaCl og 0,75M Na2S04. Det benyttede substrat var benzoyl-GlyHis-Leu ved en sluttkonsentrasjon på 1 x 10"<4>M, (Km x 2 x 10~<4>M), sammen med ca. 130.000 cpm av [3H]benzoylGlyHisLeu (25 Ci/mmol). Enzymet ble fortynnet i den ovenfor angitte buffer slik at 40 pl bufret enzym kunne hydrolysere 1356 substrat ved en 15 minutters inkubasjon ved 37<*>C. For å initiere prøvebestem-melsen ble 40 pl enzym og 10 pl vann eller inhibitor oppløst i vann preinkubert i 5 minutter ved 37°C. Substrat, 50 pl, ble deretter tilsatt for å initiere reaksjon og oppløsningen ble inkubert i 15 minutter ved 37° C. For å avslutte reaksjonen ble 1 ml 0,1M HC1 tilsatt, hvoretter 1 ml etylacetat ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i en rotasjonsblander og kort sentrifugert for å separere fasene. For most of the experiments described, the enzyme was determined in 0.05 M Hepes buffer, pH 8.0 containing 0.1 M NaCl and 0.75 M Na 2 SO 4 . The substrate used was benzoyl-GlyHis-Leu at a final concentration of 1 x 10"<4>M, (Km x 2 x 10~<4>M), together with about 130,000 cpm of [3H]benzoylGlyHisLeu (25 Ci/ The enzyme was diluted in the buffer specified above so that 40 µl of buffered enzyme could hydrolyze 1356 substrate during a 15 minute incubation at 37<*>C. To initiate the sample determination, 40 µl of enzyme and 10 µl of water or inhibitor were dissolved in water preincubated for 5 minutes at 37° C. Substrate, 50 µl, was then added to initiate reaction and the solution was incubated for 15 minutes at 37° C. To terminate the reaction, 1 ml of 0.1 M HCl was added, after which 1 ml of ethyl acetate was added.The mixture was stirred in a rotary mixer and briefly centrifuged to separate the phases.

En aliquot, 500 pl, av etylacetatlaget ble overført til en væskescinti1lasjonsprøveflaske inneholdende 10 ml "Riafluor". For bestemmelse av 150-verdier ble enzymaktivitet i nærvær av inhibitor ved en rekke forskjellige konsentrasjoner sammen-lignet med aktiviteten i fravær av inhibitor. En grafisk fremstilling av inhibitorkonsentrasjon mot % inhibering ga <1>50-verdier. An aliquot, 500 µl, of the ethyl acetate layer was transferred to a liquid scintillation sample bottle containing 10 ml of "Riafluor". To determine 150 values, enzyme activity in the presence of inhibitor at a number of different concentrations was compared with the activity in the absence of inhibitor. A graph of inhibitor concentration versus % inhibition gave <1>50 values.

Eksempel 2 Example 2

Syntese av 3- acetvltiopropanovl- L- prolin- t- butvlester Synthesis of 3- acetvlthiopropanovl-L-proline-t-butyl ester

3-acetyltiopropansyre, 0,865 g, ble oppløst i 2 ml redestillert tetrahydrofuran (THF) og avkjølt til 0°C. En avkjølt oppløsning av dicykloheksylkarbodiimid, 1,2031 g i 2 ml THF ble tilsatt, hvoretter en avkjølt oppløsning av L-prolin-t- 3-Acetylthiopropanoic acid, 0.865 g, was dissolved in 2 ml of redistilled tetrahydrofuran (THF) and cooled to 0°C. A cooled solution of dicyclohexylcarbodiimide, 1.2031 g in 2 mL of THF was added, followed by a cooled solution of L-proline-t-

butylester, 1 g, ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0<*>C 1 1 time og deretter ved 4<*>C natten over. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert, og bunnfallet vasket med etylacetat. Oppløsningsmidler i filtratene ble fjernet under redusert trykk i en rotasjonsfordamper. Resten le oppløst i etylacetat som deretter ble vasket tre ganger med kald IN sitronsyre, to ganger med mettet NaCl, to ganger med kald IN NaHCC<3 og tre ganger med mettet NaCl. Oppløsningen ble tørket over vannfritt MgS04 og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk i en rotasjonsfordamper ved 30<*>C, hvilket ga et klart, fargeløst oljeaktig produkt i et utbytte på omtrent 87#. Produktet migrerte som en enkelt flekk ved tynnsjiktskromatografi i fem oppløsningsmiddel-systemer. butyl ester, 1 g, was added. The reaction mixture was stirred at 0<*>C for 1 hour and then at 4<*>C overnight. The reaction mixture was then filtered, and the precipitate washed with ethyl acetate. Solvents in the filtrates were removed under reduced pressure in a rotary evaporator. The residue was dissolved in ethyl acetate which was then washed three times with cold IN citric acid, twice with saturated NaCl, twice with cold IN NaHCC<3 and three times with saturated NaCl. The solution was dried over anhydrous MgSO 4 and filtered. The solvent was removed under reduced pressure in a rotary evaporator at 30<*>C to give a clear, colorless oily product in about 87% yield. The product migrated as a single spot by thin layer chromatography in five solvent systems.

Eksempel 3 Example 3

Syntese av 3- merkaptopropanovl- L- prol in Synthesis of 3-mercaptopropanoyl-L-proline

Produktet fra eksempel 2, 3-acetyltiopropanoyl-L-prolin-t-butylester, 0,5 g, ble blandet med 4,5 ml 5, 5N metanolisk ammoniakk ved romtemperatur under nitrogen i 1 time for å fjerne acetylgruppen. Oppløsningsmidlet ble deretter fjernet ved 25°C i en rotasjonsfordamper. Etter at produktet var opptatt i metanol og inndampet to ganger til i rotasjonsfordamperen, ble den klare oljeaktige rest oppløst i etyleter, vasket to ganger med 5% kaliurobisulfat og en gang med mettet NaCl, tørket over MgS04 og filtrert. Det rester-ende oppløsnlngsmiddel ble fjernet i vakuum, hvilket ga et klart oljeaktig produkt, som migrerte som en enkelt flekk ved tynnsjiktskromatografi i tre separate oppløsnlngsmiddel-systemer. Den t-butylester-beskyttende gruppe ble fjernet ved omsetning med trifluoreddiksyre i anisol. The product of Example 2,3-acetylthiopropanoyl-L-proline-t-butyl ester, 0.5 g, was mixed with 4.5 ml of 5,5N methanolic ammonia at room temperature under nitrogen for 1 hour to remove the acetyl group. The solvent was then removed at 25°C in a rotary evaporator. After the product was taken up in methanol and evaporated twice more in the rotary evaporator, the clear oily residue was dissolved in ethyl ether, washed twice with 5% potassium bisulfate and once with saturated NaCl, dried over MgSO 4 and filtered. The residual solvent was removed in vacuo to give a clear oily product, which migrated as a single spot by thin layer chromatography in three separate solvent systems. The t-butyl ester protecting group was removed by reaction with trifluoroacetic acid in anisole.

Eksempel 4 Example 4

Ved å benytte 2-acetyltlopropansyre, i stedet for 3-acetyltiopropansyre i eksempel 2 og ved vesentlig å følge metodene i eksemplene 2 og 3, oppnås 2-merkaptopropanoyl-L-prolin. Ved å fjerne den t-butylester-beskyttende gruppen med trifluoreddiksyre i anisol som et første trinn, kan dicykloheksyl-aminsaltet dannes for å hjelpe spaltingen av isomerer. Den acetyl-beskyttende gruppe kan fjernes i et annet trinn under anvendelse av metanolisk ammoniakk, som beskrevet i eksempel 3. By using 2-acetylthiopropanoic acid, instead of 3-acetylthiopropanoic acid in example 2 and by substantially following the methods in examples 2 and 3, 2-mercaptopropanoyl-L-proline is obtained. By removing the t-butyl ester protecting group with trifluoroacetic acid in anisole as a first step, the dicyclohexylamine salt can be formed to aid the resolution of isomers. The acetyl protecting group can be removed in a second step using methanolic ammonia, as described in Example 3.

Eksempel 5 Example 5

Syntese av 3- merkapto- 2- metvl- propanovl- L- 3- hvdroksvprolin L-3-hydroksyprolin, 1 mmol, oppløses i DMF, og oppløsningen avkjøles til -15*C. Oppløsningen nøytraliseres ved tilsetning av 1 ekvivalent N-etylmorfolin. I en separat reaksjons-beholder ved -10"C blandes en ekvivalent 3-acetyltio-2-metyl-propansyre i et like stort volum DMF med 1,1 ekvivalent av 1,1'-karbonyldiimidazol, og oppløsningen omrøres i 1 time.Den første oppløsning inneholdende L-3-hydroksyprolin blandes med den andre inneholdende 3-acetyltio-2-mertylpropansyre under opprettholdelse av temperaturen ved —10°C. Den kombinerte oppløsning omrøres i 1 time ved -10"C. Oppløsningen får deretter oppvarmes langsomt til romtemperatur. Oppløsnings-midlet fjernes i en rotasjonsfordamper under redusert trykk ved 40<*>C. Etylacetat (25 ml) tilsettes, og oppløsningen avkjøles til 0°C. 2 ml IN sitronsyre tilsettes, de to fasene blandes og får deretter skille seg. Fasene separeres med en skilletrakt, og den organiske fasen vaskes to ganger til med 2 ml IN sitronsyre, to ganger med mettet NaCl og tørkes til slutt over vannfritt MgS04. MgS04 fjernes ved filtrering, og oppløsningsmidlet fjernes med en rotasjonsfordamper. Resten oppløses i og omkrystalliseres fra et ikke-polart oppløs-nlngsmiddel slik som benzen for dannelse av 3-acetyltio-2-D,L-metylpropanoyl-L-3,4-hydroksyprolin. Når 2-D-metyl-isomeren ønskes, blir resten oppløst i acetonitril (omtrent 3 ml), og oppløsningen oppvarmes til 40<*>C. En ekvivalent dicykloheksylamin tilsettes, og oppløsningen hensettes ved romtemperatur natten over. Krystallene oppsamlet ved filtrering og vaskes tre ganger med acetonitril. Når ytterligere rensing er nødvendig, kan materialet omkrystalliseres fra isopropanol. Den acetyl-beskyttende gruppe kan fjernes som 1 eksempel 3. Synthesis of 3-mercapto-2-methylpropanovl-L-3-hydroxyproline L-3-hydroxyproline, 1 mmol, is dissolved in DMF, and the solution is cooled to -15°C. The solution is neutralized by adding 1 equivalent of N-ethylmorpholine. In a separate reaction vessel at -10°C, an equivalent of 3-acetylthio-2-methyl-propanoic acid is mixed in an equal volume of DMF with 1.1 equivalents of 1,1'-carbonyldiimidazole, and the solution is stirred for 1 hour. first solution containing L-3-hydroxyproline is mixed with the second containing 3-acetylthio-2-mertylpropanoic acid while maintaining the temperature at -10°C. The combined solution is stirred for 1 hour at -10°C. The solution is then allowed to warm slowly to room temperature. The solvent is removed in a rotary evaporator under reduced pressure at 40<*>C. Ethyl acetate (25 ml) is added and the solution is cooled to 0°C. 2 ml IN citric acid is added, the two phases are mixed and then allowed to separate. The phases are separated with a separatory funnel, and the organic phase is washed twice more with 2 ml 1N citric acid, twice with saturated NaCl and finally dried over anhydrous MgSO 4 . The MgSO 4 is removed by filtration, and the solvent is removed with a rotary evaporator. The residue is dissolved in and recrystallized from a non-polar solvent such as benzene to form 3-acetylthio-2-D,L-methylpropanoyl-L-3,4-hydroxyproline. When the 2-D-methyl isomer is desired, the residue is dissolved in acetonitrile (about 3 ml), and the solution is heated to 40<*>C. An equivalent of dicyclohexylamine is added, and the solution is left at room temperature overnight. The crystals are collected by filtration and washed three times with acetonitrile. When further purification is required, the material can be recrystallized from isopropanol. The acetyl protecting group can be removed as 1 example 3.

Eksempler 6- 8 Examples 6-8

Ved å benytte D.L-3,4-dehydroprolin, L-4-hydroksyprolin eller L-tiazolidin i stedet for L-3-hydroksyprolin i eksempel 5 og ved vesentlig å følge metodene som angitt i eksempel 5, oppnås følgende forbindelser. By using D.L-3,4-dehydroproline, L-4-hydroxyproline or L-thiazolidine instead of L-3-hydroxyproline in Example 5 and by essentially following the methods as stated in Example 5, the following compounds are obtained.

Eksempel 9 Example 9

Ved å benytte 3-acetyltiopropansyre eller 2-acetyltiopropansyre I stedet for 3-acetyltio-2-metylpropansyre i eksemplene 5-8, oppnås likeledes D,L-3,4-dehydroprolin-, L-3-hydroksyprolin-, L-4-hydroksyprolin- og L-tiazolidinderivatene ved i det vesentlige å følge de beskrevne metoder. By using 3-acetylthiopropanoic acid or 2-acetylthiopropanoic acid instead of 3-acetylthio-2-methylpropanoic acid in examples 5-8, D,L-3,4-dehydroproline-, L-3-hydroxyproline-, L-4- the hydroxyproline and L-thiazolidine derivatives by essentially following the described methods.

Eksempel 10 Example 10

Syntese av N0t- r3-( Na- acetvl- L- fenvIalanvItio )- 2- D- metvl-propanovl"! - L- 3- hydroksyprol in Synthesis of N0t-r3-(Na-acetvl-L-phenylalanylthio)-2-D-methyl-propanovl"!-L-3- hydroxyproline

En oppløsning av Na<->acetyl-L-fenylalanin i redestillert dimetylformamid (DMF) avkjøles i et is-tørris-acetonbad ved —20'C. Til denne oppløsning tilsettes det en kald oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol i DMF. Oppløsningen omrøres ved —10<*>C i 2 timer og tilsettes deretter til en kald oppløsning av 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i 1 ml DMF som ble nøytralisert med N-etylmorfol in. Reaksjonsblandingen omrøres ved -10*C i ytterligere 1 time og oppvarmes deretter langsomt til romtemperatur. Oppløsnings-midlet fjernes under redusert trykk ved 40<*>C, og etylacetat tilsettes deretter til resten. Blandingen avkjøles i et isbad og vaskes med 0,1N NaCl, og deretter tre ganger med mettet NaCl-oppløsning. Det organiske oppløsnlngsmiddel fjernes med en rotasjonsfordamper etter tørking over vannfritt MgS04. Produktet renses ved hjelp av "Sephadex LH-20<tm>"-kolonne-kromatografi under anvendelse av 1,2 cm x 95 cm kolonne og elueres med isopropanol. Toppfraksjonene oppsamles, og oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk, hvilket gir det ønskede produkt. A solution of Na<->acetyl-L-phenylalanine in redistilled dimethylformamide (DMF) is cooled in an ice-dry ice-acetone bath at -20'C. A cold solution of 1,1'-carbonyldiimidazole in DMF is added to this solution. The solution is stirred at -10<*>C for 2 hours and then added to a cold solution of 3-mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-3-hydroxyproline in 1 ml of DMF which was neutralized with N-ethylmorphol in. The reaction mixture is stirred at -10*C for a further 1 hour and is then slowly warmed to room temperature. The solvent is removed under reduced pressure at 40<*>C, and ethyl acetate is then added to the residue. The mixture is cooled in an ice bath and washed with 0.1N NaCl, and then three times with saturated NaCl solution. The organic solvent is removed with a rotary evaporator after drying over anhydrous MgSO 4 . The product is purified by "Sephadex LH-20<tm>" column chromatography using a 1.2 cm x 95 cm column and eluted with isopropanol. The top fractions are collected and the solvent is removed under reduced pressure to give the desired product.

Eksempler 11 - 18 Examples 11 - 18

Ved å benytte Na<->acetylglycin, Na<->acetylalanin, I^-acetyl-tryptofan, ^-acetyltyrosin, Na<->acetylisoleucin, Na<->acetyl-leucin, ^-acetylhistidin eller Na<->acetylvalin i stedet for Na<->acetylfenylalanin i eksempel 10 og ved i det vesentlige å følge metoden i eksempel 10, oppnås følgende forbindelser: By using Na<->acetylglycine, Na<->acetylalanine, I^-acetyl-tryptophan, ^-acetyltyrosine, Na<->acetylisoleucine, Na<->acetyl-leucine, ^-acetylhistidine or Na<->acetylvaline in instead of Na<->acetylphenylalanine in Example 10 and by essentially following the method in Example 10, the following compounds are obtained:

Eksempel 19 Example 19

D,L-3,4-dehydroprolin-, L-4-hydroksyprolin- og L-tiazolidinderivatene oppnås på samme måte ved å benytte produktene i eksemplene 3-9 i stedet for 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i eksemplene 10-18 og ved 1 det vesentlige å følge metoden 1 eksempel 10. The D,L-3,4-dehydroproline, L-4-hydroxyproline and L-thiazolidine derivatives are obtained in the same way by using the products of Examples 3-9 instead of 3-mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-3 -hydroxyproline in examples 10-18 and by 1 it is essential to follow method 1 example 10.

Eksempel 20 Example 20

Ved å benytte Na<->formyl-, Na<->propanoyl-, Na<->butanoyl-, Na-fenylacetyl- eller Na<->fenylpropanoylderivatene av L-Phe, Gly, L-Ala, L-Trp, L-Tyr, L-Ile, L-Leu, L-His og L-Val 1 stedet for N°-acetylderlvatene 1 eksemplene 1019 og ved vesentlig å følge metoden i eksempel 10, oppnås formyl-, propanoyl-, butanoyl-, fenylacetyl- og fenylpropanoylderlvatene. By using the Na<->formyl-, Na<->propanoyl-, Na<->butanoyl-, Na-phenylacetyl- or Na<->phenylpropanoyl derivatives of L-Phe, Gly, L-Ala, L-Trp, L -Tyr, L-Ile, L-Leu, L-His and L-Val 1 instead of the N°-acetylderlvaten 1 examples 1019 and by essentially following the method in example 10, formyl-, propanoyl-, butanoyl-, phenylacetyl- and the phenylpropanoyl derivatives.

Eksempel 21 Example 21

Syntese av y^- rs- Cy^- tert- butvloksvkarbonvl- L- fenvlalanvl-tlo)- 2- D- metylpropanovl1- L- 3- hvdroksvprolln Synthesis of y^- rs-Cy^- tert-butyloxvcarbonvl- L- phenvlalanvl-tlo)- 2- D- methylpropanovl1- L- 3- hydroxyvprolln

En oppløsning av Na<->tert-butyloksykarbonyl-L-fenylalanln (Na<->Boc-L-Phe) 1 redestillert DMF, avkjøles 1 et is-tørris-acetonbad ved -20°C. Til denne oppløsning tilsettes en kald oppløsning av 1,1'-karbonyldlimidazol i DMF. Oppløsningen omrøres ved -10'C i 2 timer og tilsettes deretter til en kald oppløsning av 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i DMF som nøytraliseres med N-etylmorfolin. Reaksjonsblandingen omrøres ved —10<*>C i ytterligere 1 time og deretter langsomt oppvarmes til romtemperatur. Oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk ved 40"C, og etylacetat tilsettes til resten. Blandingen avkjøles i et isbad og vaskes med 0,1N HC1 og deretter tre ganger med mettet NaCl-oppløsning. Oppløsningsmidlet fjernes med en rotasjonsfordamper etter tørking over vannfritt MgS04« Produktet renses ved væskekromatograf i på "Sephadex G10<tm>" under anvendelse av en 1,2 cm x 95 cm kolonne og elueres med THF:isopropanol. Toppfraksjonene oppsamles, og oppløsnings-midlet fjernes under redusert trykk, hvilket-ga det ønskede produkt. A solution of Na<->tert-butyloxycarbonyl-L-phenylalanln (Na<->Boc-L-Phe) in redistilled DMF is cooled in an ice-dry ice-acetone bath at -20°C. A cold solution of 1,1'-carbonyldiimidazole in DMF is added to this solution. The solution is stirred at -10°C for 2 hours and is then added to a cold solution of 3-mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-3-hydroxyproline in DMF which is neutralized with N-ethylmorpholine. The reaction mixture is stirred at -10<*>C for a further 1 hour and then slowly warmed to room temperature. The solvent is removed under reduced pressure at 40°C, and ethyl acetate is added to the residue. The mixture is cooled in an ice bath and washed with 0.1N HCl and then three times with saturated NaCl solution. The solvent is removed with a rotary evaporator after drying over anhydrous MgSO4« The product purified by liquid chromatography on "Sephadex G10<tm>" using a 1.2 cm x 95 cm column and eluted with THF:isopropanol. The top fractions were collected and the solvent removed under reduced pressure to give the desired product.

Eksempler 22 - 29 Examples 22 - 29

Ved å benytte Na<->Boc-glycin, Na<->Boc-alanin, N0(-Boc-tryptofan , Na<->Boc-tyrosin, Na<->Boc-isoleucin, Na<->Boc-leucin, Na<->Boc-histidin eller Na<->Boc-valin 1 stedet for Na<->Boc-Phe 1 eksempel 21 og ved vesentlig å følge metodene 1 eksempel 21, oppnås følgende forbindelser: By using Na<->Boc-glycine, Na<->Boc-alanine, N0(-Boc-tryptophan, Na<->Boc-tyrosine, Na<->Boc-isoleucine, Na<->Boc-leucine, Na<->Boc-histidine or Na<->Boc-valine 1 instead of Na<->Boc-Phe 1 example 21 and by essentially following the methods 1 example 21, the following compounds are obtained:

Eksempel 30 Example 30

D.L-3,4-dehydroprolln-, L-4-hydroksyprolln- og L-tiazolidin-derlvatene oppnås på samme måte ved å benytte produktene i eksemplene 3-9 1 stedet for 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolln 1 eksemplene 21-29 og ved vesentlig å følge metoden 1 eksempel 21. The D.L-3,4-dehydroprollin-, L-4-hydroxyprollin- and L-thiazolidine derivatives are obtained in the same way by using the products of Examples 3-9 1 instead of 3-mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-3 -hydroxyprollin 1 examples 21-29 and by substantially following method 1 example 21.

Eksempel 31 Example 31

Syntese av Na- cvklopentylkarbonvl- L- fenvlalanin Synthesis of Na-cvclopentylcarbonvl-L-phenvalanine

En kald oppløsning av 2,06 g dicykloheksylkarbodilmid 1 10 ml diklormetan ble tilsatt til en oppløsning av 1,4114 g cyklopentankarboksylsyre i 5 ml diklormetan ved -5*C. Dette ble fulgt av tilsetning av 4,28 g L-fenylalaninbenzoylester-toluensulfonatsalt 1 10 ml DMF som ble nøytralisert med 1,36 ml N-etylmorfolin. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 1 time og deretter ved romtemperatur i 3 timer. Dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering og 50 ml etylacetat ble tilsatt til filtratet. Den organiske fase ble vasket inntil nøytral tilstand, tørket over vannfritt MgS04 og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet med en rotasjonsfordamper. Resten ble krystallisert fra isopropanol og heksan, hvilket ga 2,35 g hvite krystaller med et smeltepunkt på 88-89'C. Elementanalyse av disse krystaller ga følgende: Beregnet: C 75,19; H 7,17; N 3,9855 A cold solution of 2.06 g of dicyclohexylcarbodylimide in 10 ml of dichloromethane was added to a solution of 1.4114 g of cyclopentanecarboxylic acid in 5 ml of dichloromethane at -5*C. This was followed by the addition of 4.28 g of L-phenylalanine benzoyl ester toluenesulfonate salt in 10 ml of DMF which was neutralized with 1.36 ml of N-ethylmorpholine. The reaction mixture was stirred at 0°C for 1 hour and then at room temperature for 3 hours. Dicyclohexylurea was removed by filtration and 50 ml of ethyl acetate was added to the filtrate. The organic phase was washed until neutral, dried over anhydrous MgSO 4 and filtered. The solvent was removed with a rotary evaporator. The residue was crystallized from isopropanol and hexane to give 2.35 g of white crystals with a melting point of 88-89°C. Elemental analysis of these crystals gave the following: Calculated: C 75.19; H 7.17; N 3.9855

Funnet: C 74,96; H 7,17; N 4,09 Found: C 74.96; H 7.17; N 4.09

Benzylesteren ble fjernet ved hydrogenolyse med 2 g 10$ palladlum-på-karbon i absolutt alkohol. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og etanolen ble fjernet med en rotasjonsfordamper. Resten ble krystallisert fra eter og heksan, og dette ga 1,15 g hvite krystaller av det ønskede produkt med et smeltepunkt på 107-108°C. Elementanalyse av disse krystaller ga følgende: The benzyl ester was removed by hydrogenolysis with 2 g of 10$ palladium-on-carbon in absolute alcohol. The catalyst was removed by filtration and the ethanol was removed with a rotary evaporator. The residue was crystallized from ether and hexane, and this gave 1.15 g of white crystals of the desired product with a melting point of 107-108°C. Elemental analysis of these crystals gave the following:

Beregnet: C 68,94; H 7,33; N 5,36 Calculated: C 68.94; H 7.33; N 5.36

Funnet: C 68,90; H 7,32; N 5,34 Found: C 68.90; H 7.32; N 5.34

Produktet ble funnet å være homogent under anvendelse av papir-elektroforese ved pH 1,9 og ved pH 5,0 og under anvendelse av TLC med oppløsningsmiddelsystemer 1, 2 og 3. Det fremstilte produkt ble forkortet til Na<->cpc-L-Phe. The product was found to be homogeneous using paper electrophoresis at pH 1.9 and at pH 5.0 and using TLC with solvent systems 1, 2 and 3. The product prepared was abbreviated to Na<->cpc-L- Phew.

Eksempel 32 Example 32

Syntese av N^- rs- f^- cvklopentvlkarbonvl- L- fenvlalanvltio)- 2-D- metylpropanoyl1- L- 3- hvdroksvprolln Synthesis of N^- rs- f^- cyclopentylcarbonyl- L- phenvlalanvlthio)- 2-D- methylpropanoyl1- L- 3- hydroxyprollin

En oppløsning av forbindelsen fra eksempel 31 i 0,5 ml redestillert DMF avkjøles i et is-tørris-acetonbad ved -20*C. Til denne oppløsning tilsettes en kald oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol i DMF. Oppløsningen omrøres ved -10'C i 2 timer og blandes deretter med en kald oppløsning av 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i DMF som nøytraliseres med N-etylmorfolin. Reaksjonsblandingen omrøres ved -10*C i ytterligere 1 time og oppvarmes deretter langsomt til romtemperatur. Oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk ved -40*C og etylacetat tilsettes til resten. Blandingen avkjøles og vaskes med 0,1N HC1, og deretter tre ganger med mettet NaCl-oppløsning. Oppløsningsmidlet fjernes med en rotasjonsfordamper etter tørking over vannfritt MgS04. Produktet renses ved "Sephadex LH-20<tm>"-kolonnekromatografi under anvendelse av en 1,2 cm x 95 cm kolonne og eluert med isopropanol. Toppfraksjonene oppsamles, og oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk, hvilket gir det ønskede produkt. A solution of the compound from Example 31 in 0.5 ml of redistilled DMF is cooled in an ice-dry ice-acetone bath at -20*C. A cold solution of 1,1'-carbonyldiimidazole in DMF is added to this solution. The solution is stirred at -10°C for 2 hours and is then mixed with a cold solution of 3-mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-3-hydroxyproline in DMF which is neutralized with N-ethylmorpholine. The reaction mixture is stirred at -10*C for a further 1 hour and is then slowly warmed to room temperature. The solvent is removed under reduced pressure at -40°C and ethyl acetate is added to the residue. The mixture is cooled and washed with 0.1N HCl, and then three times with saturated NaCl solution. The solvent is removed with a rotary evaporator after drying over anhydrous MgSO 4 . The product is purified by "Sephadex LH-20<tm>" column chromatography using a 1.2 cm x 95 cm column and eluting with isopropanol. The top fractions are collected and the solvent is removed under reduced pressure to give the desired product.

Eksempler 33 - 40 Examples 33 - 40

Ved å benytte benzoylestertoluensulfonatsaltene av glycin, L-alanin, L-tryptofan, L-tyrosin, L-Isoleucin, L-leucin, By using the benzoyl ester toluenesulfonate salts of glycine, L-alanine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-Isoleucine, L-leucine,

L-histidin eller L-valin i stedet for L-Phe-saltet i eksempel 31 og ved vesentlig å følge metodene i eksempel 31 og 32, oppnås følgende forbindelser. L-histidine or L-valine instead of the L-Phe salt in Example 31 and by essentially following the methods in Examples 31 and 32, the following compounds are obtained.

Eksempel 41 Example 41

D.L-3,4-dehydroprolln-, L-4-hydroksyprolln- og L-tiazolin-derlvatene oppnås på samme måte ved å benytte produktene 1 eksemplene 3-12 1 stedet for 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-hydroksyprolln 1 eksemplene 32-40 og ved vesentlig å følge metoden 1 eksempel 32. The D.L-3,4-dehydroprollin-, L-4-hydroxyprollin- and L-thiazolin-derlvates are obtained in the same way by using the products 1 Examples 3-12 1 instead of 3-mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-hydroxyprollin 1 examples 32-40 and by essentially following the method 1 example 32.

Eksempel 42 Example 42

Syntese av Na-( 3- L- fenvlaIanvltlo- 2- D- metvlpropanovll- L- 3-hydroksyprolln Synthesis of Na-(3-L-phenylalanine)-2-D-methylpropanyl-L-3-hydroxyproline

Produktet fra eksempel 21 behandles for å fjerne beskyttelsen ved omrøring av en blanding av produktet, anlsol og vannfri trlfluoreddiksyre (TFA) ved romtemperatur i 1 time. Anlsol og TFA fjernes under redusert trykk ved 35°C, og resten tritureres med vannfri eter. Den hvite resten renses ved vaeskekromatografi på "Sephadex G-10<tm>" under anvendelse av en 1,2 cm x 95 cm kolonne og elueres med 5# eddiksyre. Toppfraksjonene oppsamles og frysetørkes, hvilket gir 17,5 mg av det ønskede produkt. The product from Example 21 is treated to remove the protection by stirring a mixture of the product, anlsol and anhydrous trifluoroacetic acid (TFA) at room temperature for 1 hour. Anlsol and TFA are removed under reduced pressure at 35°C, and the residue is triturated with anhydrous ether. The white residue is purified by liquid chromatography on "Sephadex G-10<tm>" using a 1.2 cm x 95 cm column and eluted with 5# acetic acid. The top fractions are collected and freeze-dried, yielding 17.5 mg of the desired product.

Eksempler 43 - 50 Examples 43 - 50

Ved i det vesentlige å følge fremgangsmåten i eksempel 42 fjernes på samme måte beskyttelsen fra produktene i eksemplene 22-29, og følgende forbindelser oppnås: By essentially following the procedure in Example 42, the protection is similarly removed from the products in Examples 22-29, and the following compounds are obtained:

Eksempel 51 Example 51

D,L-3,4-dehydroprolin-, L-4-hydroksyprolin- og L-tlazolidln-derivatene oppnås på samme måte ved å fjerne beskyttelsen fra forbindelsene beskrevet 1 eksempel 30. Denne fjerning foretas ved vesentlig å følge metoden 1 eksempel 42. The D,L-3,4-dehydroproline, L-4-hydroxyproline and L-tlazolidln derivatives are obtained in the same way by removing the protection from the compounds described in Example 30. This removal is carried out by essentially following the method in Example 42.

Eksempel 52 Example 52

Syntese av N- hvdroksvsuccinlmldesteren av cvklopentan-karboksvlsvre Synthesis of the N-hydroxysuccinyl ester of cyclopentane-carboxylic acid

En kald oppløsning av 11,4 g dicykloheksylkarbodllmld 1 DMF ble tilsatt dråpevis til en blanding av 5,71 g cyklopentankarboksylsyre og 5,76 g N-hydroksysuccinimid i DMF ved 0'C. Reaksjonsblandingen be omrørt ved 0<*>C i 30 minutter og deretter ved 4°C natten over. Krystallinsk dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering og bunnfallet ble vasket med etylacetat. Oppløsningsmidler fra det kombinerte filtrat ble fjernet under redusert trykk og resten ble krystallisert fra benzen og heksan, hvilket ga 5,77 g hvite krystaller med et smeltepunkt på 72,5-73°C. Det infrarøde absorpsjonsspektrum i kloroform ga et typisk spektrum for N-hydroksysuccinimidestere. Elementanalyse av krystallene ga følgende resultater: A cold solution of 11.4 g of dicyclohexylcarbodell mld 1 DMF was added dropwise to a mixture of 5.71 g of cyclopentanecarboxylic acid and 5.76 g of N-hydroxysuccinimide in DMF at 0°C. The reaction mixture was stirred at 0<*>C for 30 minutes and then at 4°C overnight. Crystalline dicyclohexylurea was removed by filtration and the precipitate was washed with ethyl acetate. Solvents from the combined filtrate were removed under reduced pressure and the residue was crystallized from benzene and hexane to give 5.77 g of white crystals, mp 72.5-73°C. The infrared absorption spectrum in chloroform gave a typical spectrum for N-hydroxysuccinimide esters. Elemental analysis of the crystals gave the following results:

Beregnet: C 59,63; H 8,83; N 8,18 Calculated: C 59.63; H 8.83; N 8,18

Funnet: C 59,74; H 8,85; N 8,24 Found: C 59.74; H 8.85; N 8.24

Produktet ble vist å være homogent under anvendelse av papir-elektroforese ved pH 1,9 og 5,0 og ved benyttelse av TLC med oppløsningsmiddelsystemer 1, 2 og 3. The product was shown to be homogeneous using paper electrophoresis at pH 1.9 and 5.0 and using TLC with solvent systems 1, 2 and 3.

Eksempel 54 Example 54

Syntese av Na- cvklopentvlkarbonvl- Nc- tert- butvloksvkarbonvl-L- lysin- N- hvdroksysuccinimidester Synthesis of Na- cvclopentylcarbonyl- N- tert- butyloxycarbonyl-L- lysine- N- hydroxysuccinimide ester

En oppløsning av 1,027 g av produktet fra eksempel 56 og 346 mg N-hydroksysucclnlmld 1 10 ml CH2C12 ble avkjølt til -5*C. Til denne oppløsning ble det under omrøring tilsatt en kald oppløsning av 680 mg dlcykloheksylkarbodllmld 1 5 ml CB^C^. Reaksjonsblandlngen ble omrørt ved CC 1 30 minutter og deretter ved 4<*>C natten over. Krystallinsk dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering og ble vasket med etylacetat. Det kombinerte filtrat ble vasket to ganger med IN NaHC03, to ganger med vann og til slutt med en oppløsning av mettet NaCl. Den organiske fasen ble tørket over vannfritt MgS04, filtrert og oppløsningsmidlet ble fjernet med en rotasjonsfordamper. Resten ble krystallisert fra isopropanol, hvilket ga 0,844 g hvite krystaller med et smeltepunkt på 140,5<*>C. Det infrarøde absorpsjonsspektrum i kloroform ga et typisk spektrum for N-hydroksysuccinimidestere. Elementanalyse av krystallene ga følgende: A solution of 1.027 g of the product from Example 56 and 346 mg of N-hydroxysuccinlmld 1 in 10 ml of CH 2 Cl 2 was cooled to -5°C. A cold solution of 680 mg of dlcyclohexylcarbodill mld 1 5 ml of CB₂C₂ was added to this solution with stirring. The reaction mixture was stirred at CC 1 for 30 minutes and then at 4<*>C overnight. Crystalline dicyclohexylurea was removed by filtration and washed with ethyl acetate. The combined filtrate was washed twice with 1N NaHCO 3 , twice with water and finally with a solution of saturated NaCl. The organic phase was dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and the solvent was removed on a rotary evaporator. The residue was crystallized from isopropanol, yielding 0.844 g of white crystals with a melting point of 140.5<*>C. The infrared absorption spectrum in chloroform gave a typical spectrum for N-hydroxysuccinimide esters. Elemental analysis of the crystals gave the following:

Beregnet: C 57,39; H 7,57; N 9,56 Calculated: C 57.39; H 7.57; N 9.56

Funnet: C 57,10; H 7,57; N 9,61 Found: C 57.10; H 7.57; N 9.61

Eksempel 55 Example 55

Syntese av Na- cvklopentvlkarbonvl- Nc- tert- butvloksvkarbonvl-L- lvsyl- L- fenvlalanin Synthesis of Na- cvclopentylcarbonyl- N- tert- butyloxycarbonyl-L- lvsyl- L- phenvalanine

En oppløsning av 220 mg av produktet fra eksempel 57 i 2 ml dioksan ble tilsatt dråpevis til en blanding av 99,1 mg L-fenylalanin og 51 mg NaH03 i en blanding av 2 ml vann og 1 ml DMF. Reaksjonsblandlngen ble omrørt ved romtemperatur natten over og dioksan ble fjernet med en rotasjonsfordamper ved 35<*>C. Etylacetat (10 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandlngen, avkjølt, surgjort til pH 2 med 0,1N HC1, og den vandige oppløsning ble kassert. Den organiske fasen ble vasket med isvann, en oppløsning av mettet NaCl og tørket over vannfritt MgSC^; og oppløsningsmidlet ble fjernet med en rotasjonsfordamper. Resten ble krystallisert fra eter og petroleumeter A solution of 220 mg of the product from Example 57 in 2 ml of dioxane was added dropwise to a mixture of 99.1 mg of L-phenylalanine and 51 mg of NaH0 3 in a mixture of 2 ml of water and 1 ml of DMF. The reaction mixture was stirred at room temperature overnight and dioxane was removed with a rotary evaporator at 35<*>C. Ethyl acetate (10 mL) was added to the reaction mixture, cooled, acidified to pH 2 with 0.1N HCl, and the aqueous solution was discarded. The organic phase was washed with ice water, a solution of saturated NaCl and dried over anhydrous MgSO4; and the solvent was removed with a rotary evaporator. The residue was crystallized from ether and petroleum ether

(kp. 30-60'C), hvilket ga 95 mg av et hvitt fast stoff med et smeltepunkt på 90-92<*>C. Produktet ble vist å være homogent under anvendelse av papirelektroforese ved pH 1,9 og ved å benytte TLC med oppløsningsmiddelsystemer 1, 2, 3 og 4. Elementanalyse ga: (bp. 30-60'C), which gave 95 mg of a white solid with a melting point of 90-92<*>C. The product was shown to be homogeneous using paper electrophoresis at pH 1.9 and using TLC with solvent systems 1, 2, 3 and 4. Elemental analysis gave:

Beregnet: C 63,78; H 8,03; N 8,58 Calculated: C 63.78; H 8.03; N 8.58

Funnet: C 63,40; H 8,07; N 8,34 Found: C 63.40; H 8.07; N 8.34

Eksempel 56 Example 56

Syntese av Na- r3-( Na- cvklopentylkarbonyl- Nc- tert- butyloksy-karbonvl - L- ly syl - L- f en vi alanvltio )- 2- D- metylpropanoyll- L- 3-hydroksvprolin Synthesis of Na- r3-( Na- cvclopentylcarbonyl- Nc- tert- butyloxy- carbonvl - L- lysyl - L- f en vi alanvlthio )- 2- D- methylpropanoyl- L- 3- hydroxyproline

En oppløsning av produktet fra eksempel 55 i redestillert DMF avkjøles i et is-tørris-acetonbad ved 20°C. Til denne oppløsning tilsettes en kald oppløsning av 1,1'-karbonyl-dilmidazol i DMF. Oppløsningen omrøres ved -10°C i 2 timer og blandes deretter med en kald oppløsning av 36 mg 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i 1 ml DMF som ble nøytralisert med N-etylmorfolin. Reaksjonsblandlngen omrøres ved —10°C i ytterligere 1 time og oppvarmes deretter langsomt til romtemperatur. Oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk ved 40°C og etylacetat tilsettes til resten. Blandingen avkjøles i et isvannbad og vaskes med IN sitronsyre og deretter tre ganger med mettet NaCl-oppløsning. Oppløsnings-midlet fjernes med en rotasjonsfordamper etter tørking over vannfritt MgS04. Produktet renses ved "Sephadex LH-20<tm>"-kolonnekromatografi under anvendelse av en 1,2 cm x 95 cm kolonne og elueres med THF:isopropanol, 3:7 (volumdeler). Toppfraksjonene oppsamles og oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk, hvilket ga det ønskede produkt som kan forkortes som NCx-[3-(Nc-cpc-N-Boc-L-Lys-L-Phe-tio )-2-D-metylpropanoyl]-L-3-hydroksyprolin. A solution of the product from Example 55 in redistilled DMF is cooled in an ice-dry ice-acetone bath at 20°C. A cold solution of 1,1'-carbonyl-dilmidazole in DMF is added to this solution. The solution is stirred at -10°C for 2 hours and then mixed with a cold solution of 36 mg of 3-mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-3-hydroxyproline in 1 ml of DMF which was neutralized with N-ethylmorpholine. The reaction mixture is stirred at -10°C for a further 1 hour and is then slowly warmed to room temperature. The solvent is removed under reduced pressure at 40°C and ethyl acetate is added to the residue. The mixture is cooled in an ice water bath and washed with 1N citric acid and then three times with saturated NaCl solution. The solvent is removed with a rotary evaporator after drying over anhydrous MgSO 4 . The product is purified by "Sephadex LH-20<tm>" column chromatography using a 1.2 cm x 95 cm column and eluting with THF:isopropanol, 3:7 (v/v). The top fractions are collected and the solvent removed under reduced pressure to give the desired product which can be abbreviated as NCx-[3-(Nc-cpc-N-Boc-L-Lys-L-Phe-thio )-2-D-methylpropanoyl]- L-3-Hydroxyproline.

Eksempel 57 Example 57

Syntese av ^- rs- CN^- cvklopentvlkarbonvl- L- lvsvl- L- fenvl-alanvltlo )- 2- D- metvlpropanovll- L- 3- hvdroksvprolln N<c->Boc-gruppen fjernes fra lysln ved omrøring av en blanding av produktet fra eksempel 56 med anlsol og vannfritt trifluoreddiksyre (TFA) ved romtemperatur i 1 time. Anlsol og TFA fjernes under redusert trykk ved 35<*>C, og resten tritureres med vannfri eter. Resten renses ved væskekromato-grafl på "Sephadex G-10<tm>" under anvendelse av en 1,2 cm kolonne og elueres med 5% eddiksyre. ToppfraksJonene oppsamles og frysetørkes, hvilket gir det ønskede produkt som kan forkortes som Na<->[3-(Na<->cpc-L-Lys-L-Phe-tio)-2-D-metyl-propanoyl]-L-3-hydroksyprolin. Synthesis of ^- rs- CN^- cvklopentvlkarbonvl- L- lvsvl- L- phenvl-alanvltlo )- 2- D- metvlpropanvll- L- 3- hvdroxvprolln The N<c->Boc group is removed from lysln by stirring a mixture of the product from Example 56 with anlsol and anhydrous trifluoroacetic acid (TFA) at room temperature for 1 hour. Anlsol and TFA are removed under reduced pressure at 35<*>C, and the residue is triturated with anhydrous ether. The residue is purified by liquid chromatography on "Sephadex G-10<tm>" using a 1.2 cm column and eluted with 5% acetic acid. The top fractions are collected and freeze-dried, yielding the desired product which can be abbreviated as Na<->[3-(Na<->cpc-L-Lys-L-Phe-thio)-2-D-methyl-propanoyl]-L- 3-Hydroxyproline.

Eksempler 58 - 65 Examples 58 - 65

Ved å benytte glycin, L-alanin, L-tryptofan, L-tyrosin, L—isoleucin, L-leucin, L-histidin eller L-valin 1 stedet for L-fenylalanin i eksempel 55 og ved i det vesentlige å følge fremgangsmåtene i eksemplene 55, 56 og 57, oppnås følgende forbindelser: By using glycine, L-alanine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-isoleucine, L-leucine, L-histidine or L-valine 1 instead of L-phenylalanine in example 55 and by essentially following the procedures in examples 55, 56 and 57, the following compounds are obtained:

65 N<0->[3-(Na<->cyklopentylkarbonyl-L-lysyl-L-alanyl-tio )-2-D-metylpropanoyl]-L-3-hydroksyprolin 65 N<0->[3-(Na<->cyclopentylcarbonyl-L-lysyl-L-alanyl-thio)-2-D-methylpropanoyl]-L-3-hydroxyproline

Eksempel 66 Example 66

D,L-3,4-dehydroprolin-, L-4-hydroksyprolin- og L-tiazolidinderivatene oppnås på samme måte ved å benytte produktene fra eksemplene 3-9 i stedet for 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i eksemplene 56 og 58-65, og ved vesentlig å følge fremgangsmåtene i eksemplene 56 og 57. The D,L-3,4-dehydroproline, L-4-hydroxyproline and L-thiazolidine derivatives are obtained in the same way by using the products of Examples 3-9 instead of 3-mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-3 -hydroxyproline in examples 56 and 58-65, and by substantially following the procedures in examples 56 and 57.

Eksempel 67 Example 67

Fremstilling av NQ. Nc- bls- t- butvloksvkarbonvl- L- lvsvl- L-fenvlalaninbenzvlester Production of NQ. Nc- bls- t- butvloxvcarbonvl- L- lvsvl- L-phenvlalaninbenzvlester

En oppløsning av N<a>,N<c->t-butyloksykarbonyl-L-lysin (i det følgende bis-Boc-L-Lys), L-fenylalaninbenzylestertoluen-sulfonsyre og N-etylmorfolin i DMF og diklormetan, avkjøles i et isbad under omrøring. En oppløsning av 0,826 g dicykloheksylkarbodiimid i 2 ml diklormetan tilsettes til den ovenfor angitte reaksjonsblanding. Reaksjonsblandlngen omrøres i et Isvannbad i 1 time og deretter ved romtemperatur natten over. Dicykloheksylurea fjernes ved filtrering, og produktet vaskes i etylacetat. Oppløsningsmidlene i de kombinerte filtrater fjernes under redusert trykk med en rotasjonsfordamper ved 40'C. Etylacetat (25 ml) tilsettes til resten, og den organiske oppløsning vaskes inntil nøytral tilstand. Den organiske fasen tørkes over vannfritt MgS04, filtreres og deretter fjernes oppløsningsmidlet med en rotasjonsfordamper. Materialet krystalliseres fra isopropanol og eter, utbytte 1,01 g av hvite nåler, smp. 103-104,5<0>C. Materialet er homogent på alle TLC- og elektroforesesystemer. Elementanalyse ga: A solution of N<a>,N<c->t-butyloxycarbonyl-L-lysine (hereafter bis-Boc-L-Lys), L-phenylalanine benzyl ester toluenesulfonic acid and N-ethylmorpholine in DMF and dichloromethane, is cooled in a ice bath while stirring. A solution of 0.826 g of dicyclohexylcarbodiimide in 2 ml of dichloromethane is added to the above reaction mixture. The reaction mixture is stirred in an ice-water bath for 1 hour and then at room temperature overnight. Dicyclohexylurea is removed by filtration, and the product is washed in ethyl acetate. The solvents in the combined filtrates are removed under reduced pressure with a rotary evaporator at 40°C. Ethyl acetate (25 ml) is added to the residue, and the organic solution is washed until neutral. The organic phase is dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and then the solvent is removed with a rotary evaporator. The material is crystallized from isopropanol and ether, yield 1.01 g of white needles, m.p. 103-104.5<0>C. The material is homogeneous on all TLC and electrophoresis systems. Elemental analysis gave:

Beregnet: C 68,84; H 6,05; N 7,64 Calculated: C 68.84; H 6.05; N 7.64

Funnet: C 68,58; H 6,05; N 7,56 Found: C 68.58; H 6.05; N 7.56

Eksempel 68 Example 68

Fremstilling av Na. Nc- bls- t- butvloksvkarbonvl- L- lvsvl- L-fenvlalanln Preparation of Na. Nc-bls- t- butvloxvcarbonvl- L- lvsvl- L-phenvlalanln

De benzoylester-beskyttende gruppe på forbindelsen 1 eksempel 67 fjernes ved katalytisk hydrogenolyse med lOSt (ved vekt) Pd-på-karbon 1 Iseddlk og 15 ml etanol ved 1,4 kg/cm<2> H2 ved romtemperatur natten over. Katalysatoren fjernes ved filtrering. Oppløsnlngsmiddel fjernes med en rotasjonsfordamper. Materialet krystalliseres fra isopropanol og benzen. The benzoyl ester-protecting group on compound 1 Example 67 is removed by catalytic hydrogenolysis with lOSt (by weight) Pd-on-carbon 1 Iceddlk and 15 ml of ethanol at 1.4 kg/cm<2> H2 at room temperature overnight. The catalyst is removed by filtration. Solvent is removed with a rotary evaporator. The material is crystallized from isopropanol and benzene.

Eksempel 69 Example 69

Frems11Iling av Na- f 3- Na. Nc- b i- butvloksvkarbonvl- L- lvsvl- L-fenvlalanvltio)- 2- D- metvlpropanovl" l - L- prolln Production of Na- f 3- Na. Nc- b i- butvloxvcarbonvl- L- lvsvl- L- phenvlalanvlthio)- 2- D- methylpropanovl" l - L- prolln

En oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol i 1,0 ml DMF tilsettes til en oppløsning av produktet i eksempel 68 i DMF ved -15°C. Reaksjonsblandlngen omrøres ved -10°C i 1 time og deretter tilsettes en blanding av 3-merkapto-2-D-metyl-propanoyl-L-prolin og N-etylmorfolin i DMF. Reaksjonsblandlngen omrøres ved -10°C i ytterligere 1 time og oppvarmes deretter langsomt til romtemperatur. DMF ble fjernet under redusert trykk med en rotasjonsfordamper ved 40'C og 7 ml etylacetat og 2 ml IN sitronsyre tilsettes deretter, Den organiske fase vaskes to ganger med IN sitronsyre og to ganger med mettet NaCl. Den organiske fasen tørkes over vannfritt MgS04 og filtreres deretter. Oppløs-nlngsmiddel fjernes under anvendelse av en rotasjonsfordamper. Resten renses ved "Sephadex G-24<tm>" (1,2 x 99 cm)-kolonnekromatografi med n-butanol:eddiksyre:H20 (4:1:5 ved volum). A solution of 1,1'-carbonyldiimidazole in 1.0 ml of DMF is added to a solution of the product of Example 68 in DMF at -15°C. The reaction mixture is stirred at -10°C for 1 hour and then a mixture of 3-mercapto-2-D-methyl-propanoyl-L-proline and N-ethylmorpholine in DMF is added. The reaction mixture is stirred at -10°C for a further 1 hour and is then slowly warmed to room temperature. DMF was removed under reduced pressure with a rotary evaporator at 40°C and 7 ml of ethyl acetate and 2 ml of 1N citric acid are then added. The organic phase is washed twice with 1N citric acid and twice with saturated NaCl. The organic phase is dried over anhydrous MgSO 4 and then filtered. Solvent is removed using a rotary evaporator. The residue is purified by "Sephadex G-24<tm>" (1.2 x 99 cm) column chromatography with n-butanol:acetic acid:H 2 O (4:1:5 by volume).

Eksempel 70 Example 70

Ved å benytte N°,N^.N^-triadamtyloksykarbonyl-L-arginin (i det følgende betegnet tri-Adoc-L-arginin) i stedet for bis-Boc-L-Lys og ved å følge vesentlig samme fremgangsmåte som i eksempel 67 oppnås tilsvarende tri-Adoc-L-Arg-derivater av L—Phe-benzylester. Tri-Adoc-L-Arg fremstilles ifølge Jager, G. og Geiger, R., Chem. Ber. 103, 1727 (1970). By using N°,N^.N^-triadamtyloxycarbonyl-L-arginine (hereinafter referred to as tri-Adoc-L-arginine) instead of bis-Boc-L-Lys and by following essentially the same procedure as in example 67 corresponding tri-Adoc-L-Arg derivatives of L—Phe benzyl ester are obtained. Tri-Adoc-L-Arg is prepared according to Jager, G. and Geiger, R., Chem. Pray. 103, 1727 (1970).

Eksempel 71 Example 71

Ved å benytte benzylestrene av Gly, Ala, Trp, Tyr, Ile, Leu, His eller Val i fremgangsmåten i eksemplene 67 og 70 oppnås de tilsvarende bis-Boc-L-Lys- og tri-Adoc-L-Arg-derivatene. Nevnte benzylestere er kommersielt tilgjengelige. Benzyl-ester-beskyttende grupper fjernes vesentlig som beskrevet i eksempel 68. By using the benzyl esters of Gly, Ala, Trp, Tyr, Ile, Leu, His or Val in the method in examples 67 and 70, the corresponding bis-Boc-L-Lys and tri-Adoc-L-Arg derivatives are obtained. Said benzyl esters are commercially available. Benzyl ester protecting groups are substantially removed as described in Example 68.

Eksempel 72 Example 72

Forbindelsene som resulterer fra eksemplene 68, 70 og 71, omsettes med en hvilken som helst av forbindelsene som resulterer fra fremgangsmåtene fra eksemplene 3-9, ved i det vesentlige å følge metodene i eksempel 68, og man oppnår derved de tilsvarende bis-Boc-L-Lys og tri-Adoc-L-Arg-derivatene. Bis-Boc og trl-Adoc-beskyttende grupper fjernes ved behandling med trifluoreddiksyre i anlsol. The compounds resulting from Examples 68, 70 and 71 are reacted with any of the compounds resulting from the methods of Examples 3-9, following essentially the methods of Example 68, thereby obtaining the corresponding bis-Boc- L-Lys and the tri-Adoc-L-Arg derivs. Bis-Boc and trl-Adoc protecting groups are removed by treatment with trifluoroacetic acid in anlsol.

Ved i det vesentlige å følge fremgangsmåtene i eksemplene 2-9 og 67-72, oppnås en familie av tiolesterforbindelser som har den generelle formel: By essentially following the procedures of Examples 2-9 and 67-72, a family of thiol ester compounds having the general formula is obtained:

hvor where

R er pyro-L-glutamyl; R is pyro-L-glutamyl;

A er L-fenylalanyl, glycyl, L-alanyl, L-tryptofyl, L-isoleucyl, L-leucyl eller L-valyl, hvis a-aminogruppe er i amidblnding med R; A is L-phenylalanyl, glycyl, L-alanyl, L-tryptophyll, L-isoleucyl, L-leucyl or L-valyl, whose α-amino group is in amide combination with R;

Ri er hydrogen eller metyl; R 1 is hydrogen or methyl;

R2 er L-prolin, L-3,4-dehydroprolin eller D,L-3,4-dehydro-prolin, hvis iminogruppe er i imidbinding med >O0; og n er 0 eller 1 slik at når n - 0, er Rj metyl, R 2 is L-proline, L-3,4-dehydroproline or D,L-3,4-dehydro-proline, whose imino group is in imide bond with >O 0 ; and n is 0 or 1 such that when n - 0, Rj is methyl,

Eksempel 73 Example 73

Svntese av Na- r3-( Na- benzovl- L- trvptofvltio)- 2- D- metvlpropanovll- L- 3- hvdroksvprolln Synthesis of Na- r3-( Na- benzoyl- L- tropophylthio)- 2- D- methylpropanyl- L- 3- hydroxypropylproline

En oppløsning av Na<->benzoyl-L-tryptofan i redestillert dimetylformamid (DMF) avkjøles i et is-tørris-acetonbad ved A solution of Na<->benzoyl-L-tryptophan in redistilled dimethylformamide (DMF) is cooled in an ice-dry ice-acetone bath at

-20'C. Til denne oppløsning tilsettes en kald oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol i DMF. Oppløsningen omrøres ved - 10°C i 2 timer og tilsettes deretter til en kald oppløsning av 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i DMF som nøytraliseres med N-etylmorfolin. Reaksjonsblandlngen omrøres ved -10<*>C i ytterligere 1 time og oppvarmes langsomt til romtemperatur. Oppløsningsmidler fjernes under redusert trykk ved 40°C, og etylacetat tilsettes til resten. Blandingen avkjøles i et isbad og vaskes med 0,1N HC1 og deretter tre ganger med mettet NaCl-oppløsning. Oppløsningsmidlet fjernes med en rotasjonsfordamper etter tørking over vannfritt MgS04. Produktet renses ved vaeskekromatografi på "Sephadex LH-20<tm>" under anvendelse av en 1,2 cm x 95 cm kolonne og elueres med isopropanol. ToppfraksJonene oppsamles, og oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk, hvilket gir det ønskede -20'C. A cold solution of 1,1'-carbonyldiimidazole in DMF is added to this solution. The solution is stirred at -10°C for 2 hours and then added to a cold solution of 3-mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-3-hydroxyproline in DMF which is neutralized with N-ethylmorpholine. The reaction mixture is stirred at -10<*>C for a further 1 hour and slowly warmed to room temperature. Solvents are removed under reduced pressure at 40°C, and ethyl acetate is added to the residue. The mixture is cooled in an ice bath and washed with 0.1N HCl and then three times with saturated NaCl solution. The solvent is removed with a rotary evaporator after drying over anhydrous MgSO 4 . The product is purified by liquid chromatography on "Sephadex LH-20<tm>" using a 1.2 cm x 95 cm column and eluted with isopropanol. The top fractions are collected and the solvent is removed under reduced pressure to give the desired

produkt. product.

Eksempler 74 - 81 Examples 74 - 81

Ved å benytte Na<->benzoyl-L-tyrosin, Na<->benzoyl-L-histidin, Na<->benzoyl-L-fenylalanin, Na<->benzoyl-glycin, Na<->benzoyl-L-alanin, Na<->benzoyl-L-isoleucin, Na<->benzoyl-L-leucin eller N^benzoyl-L-valin i stedet for Na<->benzoyl-L-tryptofan i eksempel 73 og ved vesentlig å følge fremgangsmåtene i eksempel 73 oppnås følgende forbindelser: By using Na<->benzoyl-L-tyrosine, Na<->benzoyl-L-histidine, Na<->benzoyl-L-phenylalanine, Na<->benzoyl-glycine, Na<->benzoyl-L-alanine , Na<->benzoyl-L-isoleucine, Na<->benzoyl-L-leucine or N^benzoyl-L-valine instead of Na<->benzoyl-L-tryptophan in Example 73 and by essentially following the procedures in example 73 the following compounds are obtained:

Eksempel 82 Example 82

D,L-3,4-dehydroprolin-, L-4-hydroksyprolln- og L-tiazolidin-derlvatene oppnås på samme måte ved å benytte produktene 1 eksemplene 3-9 1 stedet for 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-hydroksyprolin i eksemplene 73-81 og ved vesentlig å følge metodene 1 eksempel 73. The D,L-3,4-dehydroproline, L-4-hydroxyproline and L-thiazolidine derivatives are obtained in the same way by using the products 1 Examples 3-9 1 instead of 3-mercapto-2-D-methylpropanoyl-L -hydroxyproline in examples 73-81 and by essentially following the methods 1 example 73.

Eksempel 83 Example 83

Syntese av 2- benzoyIfenvlalanvItlopropansvre Synthesis of 2- benzoylphenvlalanylpropanoic acid

En oppløsning av benzoylfenylalanln 1 30 ml redestillert dlmetylformamld (DMF) avkjøles til -20°C. En oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol i 10 ml redestillert DMF tilsettes dråpevis under kraftig omrøring. Temperaturen får ikke overskride -14*C. Etter tilsetningen omrøres oppløsningen ved -10*C i 2 timer. D,L-tiomelkesyre i redestillert DMF på forhånd nøytralisert med redestillert N-etylmorfolin, tilsettes deretter under kontinuerlig omrøring ved -10°C i 1 time. Oppløsningen oppvarmes deretter langsomt til romtemperatur. Et omtrentlig likt volum etylacetat tilsettes. Blandingen avkjøles og nøytraliseres deretter med konsentrert HC1 i mettet NaCl. Den organiske fasen vaskes deretter tre ganger med undermettet NaCl, dvs. 5 volumdeler mettet NaCl fortynnet med 1 volumdel vann. I noen tilfeller observeres et trelagssystem. I slike tilfeller oppbevares det midtre laget og kombineres med den lavere vandige fasen. Den organiske fasen tørkes over vannfritt MgS04, filtreres og anbringes i rotasjonsfordamperen for å fjern oppløsnlngsmiddel. Den kombinerte vandige fase og midtre fase surgjøres ved 0<*>C med konsentrert HC1 til pH 2 og ekstraheres tre ganger med etylacetat. Den organiske fasen vaskes med mettet NaCl og tørkes over vannfri magnesiumsulfat, filtreres og rotasjons-fordampes. En klar olje innvinnes. A solution of benzoylphenylalanine in 30 ml of redistilled dimethylformamide (DMF) is cooled to -20°C. A solution of 1,1'-carbonyldiimidazole in 10 ml of redistilled DMF is added dropwise with vigorous stirring. The temperature must not exceed -14*C. After the addition, the solution is stirred at -10*C for 2 hours. D,L-thiolactic acid in redistilled DMF, previously neutralized with redistilled N-ethylmorpholine, is then added with continuous stirring at -10°C for 1 hour. The solution is then slowly warmed to room temperature. An approximately equal volume of ethyl acetate is added. The mixture is cooled and then neutralized with concentrated HCl in saturated NaCl. The organic phase is then washed three times with undersaturated NaCl, i.e. 5 parts by volume of saturated NaCl diluted with 1 part by volume of water. In some cases, a three-layer system is observed. In such cases, the middle layer is retained and combined with the lower aqueous phase. The organic phase is dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and placed in the rotary evaporator to remove solvent. The combined aqueous phase and middle phase are acidified at 0<*>C with concentrated HCl to pH 2 and extracted three times with ethyl acetate. The organic phase is washed with saturated NaCl and dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and rotary evaporated. A clear oil is recovered.

Eksempel 84 Example 84

Syntese av Na- r2-( Na- benzovl- L- fenvlalanvltio- propanovll- L-3. 4- dehydroprolin Synthesis of Na- r2-( Na- benzovl- L- phenvlalanvlthio- propanovl- L-3. 4- dehydroproline

Boc-L-3,4--dehydroprolin (213 mg, 1 mmol ) ble behandlet for å fjerne beskyttende gruppe med 1 ml vannfri trifluoreddiksyre i 1 time. Vannfri etyleter, 3 ml, ble tilsatt. Oppløsnings-midler ble fjernet under anvendelse av en rotasjonsfordamper ved 30°C. Resten ble vasket tre ganger med eter og deretter tørket i en vakuumeksikator over NaOH. Boc-L-3,4-dehydroproline (213 mg, 1 mmol) was treated to remove the protecting group with 1 mL of anhydrous trifluoroacetic acid for 1 hour. Anhydrous ethyl ether, 3 ml, was added. Solvents were removed using a rotary evaporator at 30°C. The residue was washed three times with ether and then dried in a vacuum desiccator over NaOH.

En oppløsning av 358 mg (1 mmol) av produktet fra eksempel 89 I 3 ml redestillert DMF, ble avkjølt til -20°C i et tørris-acetonbad. En oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol, 171 mg (1,05 mmol) i 1 ml redestillert DMF ble tilsatt dråpevis og temperaturen i reaksjonsblandlngen ble holdt ved fra —10* C til —15<*>C. Reaksjonsblandlngen ble omrørt i 2 timer. En kald oppløsning av L-3,4-dehydroprolintrifluoracetat i 2 ml DMF (nøytralisert med trietylamin) ble tilsatt. Reaksjonsblandlngen ble oppvarmet langsomt til romtemperatur. Oppløsnlngsmiddel ble fjernet med rotasjonsfordamper under anvendelse av høyvakuum ved 35°C. Resten ble oppløst i 10 ml etylacetat og 2 ml H2O. Blandingen ble surgjort med IN HC1 til pH 2 ved 0"C og ble blandet. Den organiske fasen ble separert og oppsamlet. Den vandige fasen ble ekstrahert tre ganger til med 5 ml etylacetat. A solution of 358 mg (1 mmol) of the product from Example 89 in 3 ml of redistilled DMF was cooled to -20°C in a dry ice-acetone bath. A solution of 1,1'-carbonyldiimidazole, 171 mg (1.05 mmol) in 1 ml of redistilled DMF was added dropwise and the temperature of the reaction mixture was maintained at from -10°C to -15<*>C. The reaction mixture was stirred for 2 hours. A cold solution of L-3,4-dehydroproline trifluoroacetate in 2 ml of DMF (neutralized with triethylamine) was added. The reaction mixture was slowly warmed to room temperature. Solvent was removed by rotary evaporator using high vacuum at 35°C. The residue was dissolved in 10 ml of ethyl acetate and 2 ml of H2O. The mixture was acidified with 1N HCl to pH 2 at 0°C and mixed. The organic phase was separated and collected. The aqueous phase was extracted three more times with 5 mL of ethyl acetate.

Den kombinerte organiske fase ble vasket to ganger med B^O, tre ganger med mettet NaCl og ble deretter avfarget med trekull. Den organiske fase ble tørket med vannfritt MgSC>4 og deretter filtrert. Filtratet ble inndampet til tørrhet på en rotasjonsfordamper og et oljeaktig produkt, 366 mg, ble oppnådd. Produktet ble renset ved kromatografi på "Sephadex LH-20<tm>" (1,2 x 98 cm) ekvilibrert og eluert med metanol. Fraksjoner på 150 dråper (2,9 ml) ble oppsamlet. Den ønskede forbindelse ble eluert i fraksjoner 24-29. Oppløsnlngsmiddel ble fjernet med en rotasjonsfordamper. The combined organic phase was washed twice with B2O, three times with saturated NaCl and then decolorized with charcoal. The organic phase was dried with anhydrous MgSO4 and then filtered. The filtrate was evaporated to dryness on a rotary evaporator and an oily product, 366 mg, was obtained. The product was purified by chromatography on "Sephadex LH-20<tm>" (1.2 x 98 cm) equilibrated and eluted with methanol. Fractions of 150 drops (2.9 ml) were collected. The desired compound was eluted in fractions 24-29. Solvent was removed with a rotary evaporator.

Ytterligere rensing ble oppnådd ved et annet kromatograf1-trinn på "Sephadex LH-20<tm>". Den andre kolonnen ble ekvilibrert og eluert med isopropanol, toppfraksjoner ble oppsamlet, og oppløsnlngsmiddel ble fjernet ved rotasjons-fordamping. Produktet var omtrent 9556 rent bedømt ved tynnsjiktskromatografi i oppløsningsmiddelsystemer 2 og 3. Further purification was achieved by another chromatograph1 step on "Sephadex LH-20<tm>". The second column was equilibrated and eluted with isopropanol, top fractions were collected, and solvent was removed by rotary evaporation. The product was approximately 9556 pure as judged by thin layer chromatography in solvent systems 2 and 3.

Eksempel 85 Example 85

Fremstilling av N- r3-( benzovI- D- fenvlalanvltio)- 2- D- metvl-propanovl- L- prolin Preparation of N-r3-(benzoyl-D-phenylalaninethio)-2-D-methyl-propanoyl-L-proline

a. Fremstilling av N- T3-( HC1• H- D- fenvlalanvltlo)- 2- D- metvl-propanovl- L- prolln a. Preparation of N-T3-(HC1•H-D-phenylalanine)-2-D-methyl-propanyl-L-proline

En oppløsning av 531 mg (2 mmol) Boc-D-fenylalanin i 3 ml redestillert dimetylformamid (DMF) ble avkjølt til -20'C g omrørt kraftig. 1,1'-karbonyldiimidazol (341 mg, 2,1 mmol) I 3 ml DMF (ved -10" C) ble tilsatt, og den resulterende oppløsning ble omrørt ved -10"C i 2 timer. En oppløsning av 2-D-metyl-3-merkaptopropanoyl-L-prolin (456 mg, 2,1 mmol) i 2 ml DMF og 0,285 ml N-etylmorfol in (2,1 mmol) ble tilsatt, og reaksjonsblandlngen ble omrørt ved -10'C i 1 time. Blandingen ble langsomt oppvarmet til romtemperatur. Oppløsnlngsmiddel ble fjernet ved en rotasjonsevaporator ved 35<*>C. Resten ble oppløst 1 etylacetat (25 ml) og 3 ml vann ble tilsatt. Blandingen ble avkjølt til 0"C og deretter surgjort med 0,3 ml konsentrert HC1. Den organiske fasen ble vasket en gang med kald fortynnet EC1, tre ganger med vann og tre ganger med mettet NaCl. Den organiske fasen ble tørket over vannfritt MgSC-4 og deretter filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet med rotasjonsevaporator og dette ga en oljeaktig rest. Produktet ble renset på en kolonne (2,2 x 98 cm) av ••Sephadex LH-20" ekvilibrert og utviklet med isopropanol/tetrahydrofuran (7:3 volumdeler). Fraksjoner (5,6 ml hver) ble oppsamlet. Fraksjoner 34-38 ble kombinert. Fraksjoner 33, 39, 40 og 41 ble kombinert, oppløsnings-midler fjernet og påført på nytt på kolonnen av "Sephadex LH-20". Fraksjoner 37-40 av det rekromatograferte materiale og fraksjoner 34-38 av det første kromatogra-ferte materiale ble ytterligere renset på en kolonne (1,2 x 98 cm) av silisiumdioksydgel ekvilibrert og utviklet med etylacetat. Fraksjoner (5,0 ml hver) ble oppsamlet. Fraksjoner 22-29 ble kombinert og oppløsnlngs-middel fjernet med en rotasjonsevaporator. Resten ble oppløst i en 1 ml vannfri trifluoreddiksyre inneholdende 0,5 ml anlsol. Deproteksjon forløp ved romtemperatur i en % time. Oppløsnlngsmiddel ble fjernet ved rotasjonsfordampning ved 35"C. Resten ble oppløst i 1 ml etylacetat mettet med hydrogenklorid. Vannfri eter, 5 ml, ble tilsatt ved 0"C og dette ga et hvitt bunnfall. Etter 1 time ved 0<*>C ble det hvite faste stoff oppsamlet ved filtrering og vasket fem ganger med eter. Produktet ble tørket natten over i en vakuumeksikator over NaOH og P2O5. Utbytte 381 mg. A solution of 531 mg (2 mmol) of Boc-D-phenylalanine in 3 ml of redistilled dimethylformamide (DMF) was cooled to -20°C and stirred vigorously. 1,1'-Carbonyldiimidazole (341 mg, 2.1 mmol) in 3 mL DMF (at -10°C) was added and the resulting solution was stirred at -10°C for 2 h. A solution of 2-D-methyl-3-mercaptopropanoyl-L-proline (456 mg, 2.1 mmol) in 2 mL DMF and 0.285 mL N-ethylmorpholine (2.1 mmol) was added, and the reaction mixture was stirred at -10'C for 1 hour. The mixture was slowly warmed to room temperature. Solvent was removed by a rotary evaporator at 35<*>C. The residue was dissolved in 1 ethyl acetate (25 ml) and 3 ml of water was added. The mixture was cooled to 0°C and then acidified with 0.3 mL of concentrated HCl. The organic phase was washed once with cold dilute EC1, three times with water and three times with saturated NaCl. The organic phase was dried over anhydrous MgSC- 4 and then filtered. The solvent was removed by rotary evaporation and this gave an oily residue. The product was purified on a column (2.2 x 98 cm) of ••Sephadex LH-20" equilibrated and developed with isopropanol/tetrahydrofuran (7:3 volume fractions). Fractions (5.6 ml each) were collected. Fractions 34-38 were combined. Fractions 33, 39, 40 and 41 were combined, solvents removed and reapplied to the Sephadex LH-20 column. Fractions 37-40 of the rechromatographed material and fractions 34-38 of the first chromatographed material were further purified on a column (1.2 x 98 cm) of silica gel equilibrated and developed with ethyl acetate. Fractions (5.0 ml each) were collected. Fractions 22-29 were combined and solvent removed with a rotary evaporator. The residue was dissolved in 1 ml of anhydrous trifluoroacetic acid containing 0.5 ml of anlsol. Deprotection proceeded at room temperature for one % hour. Solvent was removed by rotary evaporation at 35°C. The residue was dissolved in 1 ml of ethyl acetate saturated with hydrogen chloride. Anhydrous ether, 5 ml, was added at 0°C and this gave a white precipitate. After 1 hour at 0<*>C, the white solid was collected by filtration and washed five times with ether. The product was dried overnight in a vacuum desiccator over NaOH and P2O5. Yield 381 mg.

b. Fremstilling av N- r3-( benzovl- D- fenvlalanvltio)- 2- D- metvI-propanovl1- L- prolln b. Preparation of N-r3-(benzoyl-D-phenylalaninethio)-2-D-methyl-propanyl-L-proline

Produktet fra trinn a. ovenfor, N-[3-(HCl-H-D-fenylalanyl-tio)-2-D-metyl-propanoyl]-L-prolin (93 mg, 0,23 mmol), ble omsatt med benzoylklorid (0,029 ml, 0,25 mmol) i 0,5 ml redestillert vannfritt dioksan (0°C) og 0,099 ml (0,71 mmol) N-etylmorfolln. Reaksjonsblandlngen ble omrørt kraftig ved romtemperatur 1 3 timer. Benzoylklorid, 0,015 ml og N-etylmorfolin, 0,018 ml, ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 1 time. Oppløsnlngsmiddel ble fjernet ved rotasjonsfordampning ved 30<*>C. Resten ble oppløst 1 en liten mengde av øvre og nedre fase av n-butanol/eddiksyre/H20 (4:1:5) og ble påført på en kolonne (1,2 x 98 cm) av "Sephadex G-25" ekvilibrert for fordelingskromato-graf1. Kolonnen ble utviklet med øre fase som bevegelig fase (2,6 ml fraksjoner). Fraksjoner 15-24 ble kombinert g oppløsnlngsmiddel fjernet ved rotasjonsfordampning. Resten ble oppsamlet i en liten mengde etylacetat og ytterligere renset på silisiumdioksydgel (1,2 x 95 cm kolonne) ekvilibrert og utviklet med etylacetat (5 ml fraksjoner). Fraksjonene som inneholdt hovedtoppen ble kombinert og oppløsnlngsmiddel fjernet. Materialet ble ytterligere renset ved kromatografi på "Sephadex LH-20" (1,8 x 89 cm kolonne) ekvilibrert og utviklet med isopropanol/tetrahydrofuran (7:3 volumdeler). Fraksjoner (5,7 ml hver) ble oppsamlet og det ønskede materiale ble eluert i fraksjoner 15-18 (utbytte 98 mg). Sluttproduktet oppførte seg som et rent stoff ved papirelektroforese ved pH 5,0 og 2,0 og ved tynnsjiktskromatografi. The product from step a. above, N-[3-(HCl-H-D-phenylalanyl-thio)-2-D-methyl-propanoyl]-L-proline (93 mg, 0.23 mmol), was reacted with benzoyl chloride (0.029 ml, 0.25 mmol) in 0.5 ml redistilled anhydrous dioxane (0°C) and 0.099 ml (0.71 mmol) N-ethylmorpholn. The reaction mixture was stirred vigorously at room temperature for 13 hours. Benzoyl chloride, 0.015 mL and N-ethylmorpholine, 0.018 mL, were added and the mixture was stirred for 1 hour. Solvent was removed by rotary evaporation at 30<*>C. The residue was dissolved in a small amount of upper and lower phases of n-butanol/acetic acid/H 2 O (4:1:5) and applied to a column (1.2 x 98 cm) of "Sephadex G-25" equilibrated for distribution chromatograph1. The column was developed with ear phase as mobile phase (2.6 ml fractions). Fractions 15-24 were combined and solvent removed by rotary evaporation. The residue was taken up in a small amount of ethyl acetate and further purified on silica gel (1.2 x 95 cm column) equilibrated and developed with ethyl acetate (5 ml fractions). The fractions containing the main peak were combined and solvent removed. The material was further purified by chromatography on "Sephadex LH-20" (1.8 x 89 cm column) equilibrated and developed with isopropanol/tetrahydrofuran (7:3 v/v). Fractions (5.7 ml each) were collected and the desired material was eluted in fractions 15-18 (yield 98 mg). The final product behaved as a pure substance by paper electrophoresis at pH 5.0 and 2.0 and by thin layer chromatography.

Eksempel 86 Example 86

Fremstilling av N- r3-( benzovl- D. L- fenvlalanvltlo)- 2- D- metvlpropanovll- L- prolln Preparation of N-r3-(benzoyl-D.L-phenylalanine)-2-D-methylpropanyl-L-proline

Ved anvendelse av en 50:50-blanding av Boc-D-fenylalanin og Boc-L-fenylalanin i fremgangsmåtene i eksempel 85 ovenfor, ble N[3-(benzoyl-D,L-fenylalany1tio)-2-D-metyl-propanoyl]-L-prolin fremstilt. Using a 50:50 mixture of Boc-D-phenylalanine and Boc-L-phenylalanine in the procedures of Example 85 above, N[3-(benzoyl-D,L-phenylalaninethio)-2-D-methyl-propanoyl ]-L-proline prepared.

Eksempel 87 Example 87

Fremstilling av N-( 2- benzovlfenvlalanvltlopropanovl)- L-<p>rolln- og N- O- benzovlfenvlalanvltlopropanovl)- L- prolln-derlvater Preparation of N-(2- benzoulfenvlalanvltlopropanovl)- L-<p>roln- and N- O- benzovulfenvlalanvltlopropanovl)- L- prolln- derlvate

Den ønskede forbindelsen fremstilles ved at man benytter enten 2-merkaptopropanoyl-L-prolin eller 3-merkaptopropanoyl-L-prolin i stedet for 2-D-metyl-3-merkaptopropanoyl-L-prolin i fremgangsmåtene i eksemplene 85-86 ovenfor, og omsetter merkaptoforbindelsen med enten Boc-D-Fenylalanin, Boc-L-fenylalanin, eller en 50:50-blanding derav. The desired compound is prepared by using either 2-mercaptopropanoyl-L-proline or 3-mercaptopropanoyl-L-proline instead of 2-D-methyl-3-mercaptopropanoyl-L-proline in the methods in examples 85-86 above, and reacts the mercapto compound with either Boc-D-Phenylalanine, Boc-L-phenylalanine, or a 50:50 mixture thereof.

Merkaptoforbindelsene kan fremstilles under anvendelse av de metoder som er beskrevet i en hvilket som helst av ovennevnte US patenter. The mercapto compounds can be prepared using the methods described in any of the above US patents.

Eksempel 88 Example 88

Fremstilling av L- 3. 4- dehvdroprolin-. D. L- 3. 4- dehvdroprolin-. Preparation of L- 3. 4- dehvdroproline-. D. L- 3. 4- dehvdroproline-.

L- 3- hvdroksvprolin-. L- 4- hvdroksyprolin- og L- tiazolidln- 4-karboksvlsvrederivater L- 3- hvdroksvproline-. L- 4-hydroxyproline and L- thiazolidine-4-carboxylic acid derivatives

Den ønskede forbindelse fremstilles under anvendelse av den passende merkaptoforbindelse hvorved man i stedet for L—prolin i fremgangsmåten i eksemplene 85-87 ovenfor anvender L-3,4-dehydroprolin, D,L-3,4-dehydroprolin, L-3-hydroksyprolin, L-4-hydroksyprolin eller L-tiazolidin-4-karboksyl-syre. The desired compound is prepared using the appropriate mercapto compound whereby instead of L-proline in the process in examples 85-87 above, L-3,4-dehydroproline, D,L-3,4-dehydroproline, L-3-hydroxyproline are used , L-4-hydroxyproline or L-thiazolidine-4-carboxylic acid.

De passende merkaptoforbindelsene kan fremstilles under anvendelse av metodene beskrevet I US patenter 4.698.355 og 4.777.298. The appropriate mercapto compounds can be prepared using the methods described in US Patents 4,698,355 and 4,777,298.

Eksempel 89 Example 89

Fremstilling av D- alanvl-. D- trvptofvl-. D- tvrosvl-, D- lsoleucvI-. D- leucvl-. D- hlstidvl- og D- valvlderlvater Preparation of D-alanvl-. D-trvptofvl-. D- tvrosvl-, D- lsoleucvI-. D-leucvl-. D- hlstidvl- and D- valvlderlvater

Den ønskede forbindelse fremstilles ved at man i stedet for Boc-D-fenylalanin i fremgangsmåtene i eksemplene 887 og 88 ovenfor benytter Boc-D-alanin, Boc-D-tryptofan, Boc-D-tyrosin, Boc-D-isoleucin, Boc-D-leucin, Boc-D-histidin eller Boc-D-valin. The desired compound is prepared by using Boc-D-alanine, Boc-D-tryptophan, Boc-D-tyrosine, Boc-D-isoleucine, Boc- D-leucine, Boc-D-histidine or Boc-D-valine.

Eksempel 90 Example 90

Fremstilling av D. L- alanvl-. D. L- trvptofvl-. D. L- tvrosvl-. Preparation of D. L- alanvl-. D. L- trvptofvl-. D. L- tvrosvl-.

D. L- lsoleucvl-. D. L- leucvl-. D. L- hlstldvl- og D. L- valvlderlvater D. L- lsoleucvl-. D. L-leucvl-. D. L- hlstldvl- and D. L- vallvlderlvater

En 50:50-blandlng av Boc-D-A og Boc-L-A, hor A er alanin, tryptofan, tyrosin, isoleucin, leucin, histidin eller valin, benyttes I stedet for blandingen av Boc-D-fenylalanin og Boc-L-fenylalanin i fremgangsmåten i eksemplene 86-88 ovenfor, for oppnåelse av de ønskede forbindelsene. A 50:50 mixture of Boc-D-A and Boc-L-A, where A is alanine, tryptophan, tyrosine, isoleucine, leucine, histidine or valine, is used instead of the mixture of Boc-D-phenylalanine and Boc-L-phenylalanine in the procedure in Examples 86-88 above, to obtain the desired compounds.

Eksempel 91 Example 91

Ved å benytte den passende forbindelse i stedet for benzoylklorid i eksemplene 85 og 87-90 ovenfor og benytte velkjente fremgangsmåter, oppnås formyl-, acetyl-, propanoyl-, butanoyl-, fenylacetat-, fenylpropanoyl-, cyklopentankarbonyl-, cyklopentankarbonyl-L-lysyl-, pyro-L-glutamyl-L-lysyl-, L-lysyl-, L-arginyl- og pyro-L-glutamylderivater. By using the appropriate compound in place of benzoyl chloride in Examples 85 and 87-90 above and using well-known procedures, formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, phenylacetate, phenylpropanoyl, cyclopentanecarbonyl, cyclopentanecarbonyl-L-lysyl are obtained -, pyro-L-glutamyl-L-lysyl, L-lysyl, L-arginyl and pyro-L-glutamyl derivs.

Eksempel 92 Example 92

Fremstilling av N- r3-( benzovl- L- fenvlalanvltlo)- 2- metvl-propanovl"! - L- 5- okso- proI ln L-glutaminsyre, 10 mmol ble omsatt med 11 mmol av syre-kloridet av metakrylsyre i 35 ml IN natriumhydroksyd. Etter 60 minutter ved romtemperatur ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 2N BX1 til en pH-verdi på omkring 2. Reaksjons-produktet ble ekstrahert to ganger med et like stort volum etylacetat. Den organiske fasen ble redusert til et lite volum ved rotasjonsfordampning og produktet ble krystallisert ved tilsetning av etyleter. Det faste produkt ble oppsamlet ved filtrering. 6 mmol av produktet ble omsatt med 6 mol cykloheksylkarbodiimid i 25 ml vannfri tetrahydrofuran ved 0<*>C i 1 time og deretter ved 4'C natten over. Dicykloheksyl-ureaforbindelsen ble fjernet ved filtrering. Oppløsnings-midlet i filtratet ble fjernet ved rotasjonsfordampning. Det resulterende anhydrld (5 mmol) ble opplost 1 3 ml vannfritt THF og 6 ml vannfri etyleter. Til sistnevnte oppløsning ble det tilsatt dicykloheksylamin, 5 mmol i 2 ml etyleter, og dette ga metakryloyl-L-5-okso-prolin. Saltet ble omdannet til den frie syren ved tilsetning av 2N HC1 til pH 2,0. Produktet ble ekstrahert 1 etylacetat. Den organiske fasen ble inndampet til tørrhet og produktet krystallisert fra en blanding av heksan og etylacetat. Metakryloyl-L-5-okso-prolin, 3 mmol 1 5 ml toluen, ble omsatt med tiomelkesyre, 3 mmol, ved tilbakeløpskoking 1 1 time og dette ga 3-acetyltio-2-metyl-propanoyl-L-5-okso-prolin. Produktet ble krystallisert i en blanding av etylacetat og heksan. 3-acetyltio-2-metylpropanoyl-L-5-okso-prolin ble deproteksjonsbehandlet i flytende NH3 i metanol i nærvær av anlsol. Oppløsningsmidlet ble fjernet med en rotasjonsevaporator. Produktet ble oppløst i etylacetat og den organiske fasen vasket med kald fortynnet HC1. Oppløsningsmidlet i den organiske fasen ble fjernet ved rotasjonsfordampning. Resten ble oppløst i dimetylformamid, 4 ml, og 1-hydroksybenzotiazol, 2 mmol, og N-hydroksysuccin-imidesteren av benzoyl-L-fenylalanin, 2 mmol, ble tilsatt. Reaksjonen fikk forløpe ved romtemperatur i 48 timer. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved rotasjonsfordampning. Resten ble oppløst i et lite volum etylacetat. Den organiske fasen ble vasket med kald fortynnet HC1 og deretter mettet NaCl. Den organiske fasen ble tørket over MgS04. MgS04 ble fjernet ved filtrering og oppløsningsmidlet i filtratet ble fjernet ved rotasjonsfordampning. Resten ble oppløst i 0,5 ml THF. Den resulterende oppløsning ble påført på en kolonne (2,5 x 100 cm) av "Sephadex LH-20" ekvilibrert og utviklet med THF. Fraksjonene inneholdende det ønskede produkt (detekterbart ved dets absorpsjon ved 280 nm) ble kombinert og oppløsningsmidlet ble fjernet ved rotasjonsfordampning under høyt vakuum. Preparation of N-r3-(benzoyl-L-phenylalanine)-2-methyl-propanyl"!-L-5-oxo-propyl ln L-glutamic acid, 10 mmol was reacted with 11 mmol of the acid chloride of methacrylic acid in 35 ml 1N sodium hydroxide. After 60 minutes at room temperature, the reaction was quenched by the addition of 2N BX1 to a pH of about 2. The reaction product was extracted twice with an equal volume of ethyl acetate. The organic phase was reduced to a small volume by rotary evaporation. and the product was crystallized by addition of ethyl ether. The solid product was collected by filtration. 6 mmol of the product was reacted with 6 moles of cyclohexylcarbodiimide in 25 ml of anhydrous tetrahydrofuran at 0°C for 1 hour and then at 4°C overnight. The dicyclohexyl urea compound was removed by filtration. The solvent in the filtrate was removed by rotary evaporation. The resulting anhydride (5 mmol) was dissolved in 1 3 ml of anhydrous THF and 6 ml of anhydrous ethyl ether. To the latter solution was added dicyclo lohexylamine, 5 mmol in 2 ml of ethyl ether, and this gave methacryloyl-L-5-oxo-proline. The salt was converted to the free acid by addition of 2N HCl to pH 2.0. The product was extracted 1 ethyl acetate. The organic phase was evaporated to dryness and the product crystallized from a mixture of hexane and ethyl acetate. Methacryloyl-L-5-oxo-proline, 3 mmol 1 5 ml toluene, was reacted with thiolactic acid, 3 mmol, at reflux for 1 1 h and this gave 3-acetylthio-2-methyl-propanoyl-L-5-oxo-proline . The product was crystallized in a mixture of ethyl acetate and hexane. 3-Acetylthio-2-methylpropanoyl-L-5-oxo-proline was deprotected in liquid NH3 in methanol in the presence of anlsol. The solvent was removed with a rotary evaporator. The product was dissolved in ethyl acetate and the organic phase washed with cold dilute HCl. The solvent in the organic phase was removed by rotary evaporation. The residue was dissolved in dimethylformamide, 4 ml, and 1-hydroxybenzothiazole, 2 mmol, and the N-hydroxysuccinimide ester of benzoyl-L-phenylalanine, 2 mmol, was added. The reaction was allowed to proceed at room temperature for 48 hours. The solvent was removed by rotary evaporation. The residue was dissolved in a small volume of ethyl acetate. The organic phase was washed with cold dilute HCl and then saturated NaCl. The organic phase was dried over MgSO 4 . The MgSO 4 was removed by filtration and the solvent in the filtrate was removed by rotary evaporation. The residue was dissolved in 0.5 ml of THF. The resulting solution was applied to a column (2.5 x 100 cm) of "Sephadex LH-20" equilibrated and developed with THF. The fractions containing the desired product (detectable by its absorption at 280 nm) were combined and the solvent was removed by rotary evaporation under high vacuum.

Eksempel 93 Example 93

Fremstilling av natrlumsaltet av N^ rS- fNft- benzoyl- D. L-fenvlalanvltlo )- 2- D- metvlpropanovll- L- prolln Preparation of the sodium salt of N^ rS- fNft- benzoyl- D. L-phenvlalanvltlo )- 2- D- metvlpropanvll- L- prolln

NaHC03 (0,5 mmol) av en IM oppløsning) ble tilsatt til 234,3 mg (0,5 mmol) av Na<->[3-(Bz-D,L-fenylalanyltlo)-2-D-metyl-propanoyl]-L-prolln i 1 ml absolutt etanol under omrøring. Oppløsnlngsmldler ble fjernet ved rotasjonsfordampning ved omtrent 35<*>C. Frisk etanol ble tilsatt til den oljeaktige rest og igjen ble oppløsnlngsmiddel fjernet ved hjelp av rotasjonsfordampning. Fremgangsmåten ble gjentatt en gang til med absolutt alkohol og deretter to ganger med benzen. Den hvite resten ble tørket i en vakuumeksikator over P2O5. Omkrystallisering fra 95% etanol og benzen ga 135 mg (55,156 utbytte) av hvit krystaller med et dekomponeringspunkt på 185-186<*>C (mykner ved 153<*>C). Infrarød analyse under anvendelse av en KBr-pellet viste zwitterionbånd ved 1398 og 1600 cm"* og et tioesterbånd ved 1682 cm"<*>. Papirelektroforese ved pH 2 og 5 og tynnsj iktskromatograf i (sillslum-dioksydgelplater) under anvendelse av tre separate oppløs-ningsmiddelsystemer viste bare en flekk som kunne detekteres under UV-lys ved kort bølgelengde etter reaksjon med fenazin-metosulfat-reagenser. NaHCO 3 (0.5 mmol) of a 1 M solution) was added to 234.3 mg (0.5 mmol) of Na<->[3-(Bz-D,L-phenylalanyltlo)-2-D-methyl-propanoyl ]-L-prolln in 1 ml of absolute ethanol with stirring. Solvents were removed by rotary evaporation at about 35<*>C. Fresh ethanol was added to the oily residue and again solvent was removed by rotary evaporation. The procedure was repeated once more with absolute alcohol and then twice with benzene. The white residue was dried in a vacuum desiccator over P2O5. Recrystallization from 95% ethanol and benzene gave 135 mg (55.156 yield) of white crystals with a decomposition point of 185-186<*>C (softens at 153<*>C). Infrared analysis using a KBr pellet showed zwitterion bands at 1398 and 1600 cm"* and a thioester band at 1682 cm"<*>. Paper electrophoresis at pH 2 and 5 and thin layer chromatography (sils sludge dioxide gel plates) using three separate solvent systems showed only one spot detectable under short wavelength UV light after reaction with phenazine methosulfate reagents.

Elementæranalyse for C25<H>27<N>2s^a05'2^2°: Elemental analysis for C25<H>27<N>2s^a05'2^2°:

Beregnet: C 57,02; H 5,93; N 5,32; S 6,09 Calculated: C 57.02; H 5.93; N 5.32; S 6.09

Funnet: C 56,37; H 5,59; N 5,30; S 5,99 Found: C 56.37; H 5.59; N 5.30; S 5.99

Eksempel 94 Example 94

Fremstilling av kalslumsaltet av N°- r3-(^- benzoyl- D. L-fenylalanvltlo)- 2- D- metylpropanovll- L- prolin Preparation of the calcium salt of N°-r3-(^-benzoyl-D.L-phenylalanyl)-2-D-methylpropanoyl-L-proline

Kaliumsaltet av nevnte forbindelse ble fremstilt ved å følge fremgangsmåten i eksempel 93 under anvendelse av IM KHCO3 i stedet for IM NaHCC^. Omkrystallisering ga 70 mg av et hvitt fast stoff med et dekomponeringspunkt på 132-134<*>C. Infrarød analyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi ga verdier identiske med de for det tilsvarende natriumsalt i eksempel 93. The potassium salt of said compound was prepared by following the procedure of Example 93 using 1M KHCO 3 instead of 1M NaHCC 3 . Recrystallization gave 70 mg of a white solid with a decomposition point of 132-134<*>C. Infrared analysis, paper electrophoresis and thin layer chromatography gave values identical to those for the corresponding sodium salt in Example 93.

Eksempel 95 Example 95

Fremstilling av L- lvslnsaltet av N0;- r3-( N0t- benzovl- D. L-fenvlalanvltlo)- 2- D- metvlpropanovn- L- prolln Preparation of the L-amino salt of N0;-r3-(N0t-benzoyl-D.L-phenylalanine)-2-D-methylpropane-L-proline

En oppløsning av 73,1 mg (0,5 mmol) L-lysln fri base 1 0,3 ml avlonlsert vann, ble tilsatt dråpevls under omrøring til en oppløsning av 234,3 mg (0,5 mmol) Na<->[3-(Na<->benzoyl-D,L-fenylalanyltlo)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolln 1 1 ml absolutt alkohol. Oppløsningsmidler ble fjernet ved rotasjonsfordampning hvilket ga en hvit rest. Frisk absolutt alkohol ble tilsatt og på nytt ble oppløsningsmidlet fjernet ved hjelp av en rotasjonsevaporator. Fremgangsmåten ble gjentatt to ganger til med absolutt alkohol og deretter to ganger med benzen. Sluttutbyttet var 0,292 g (dekomponeringspunkt 152-154,4'C) etter tørking il en vakuumeksikator over P205« Omkrystallisering fra absolutt alkohol, noen dråper vann og benzen ga et utbytte på 141 mg av et hvitt bunnfall som hadde et dekomponeringspunkt på 162 ,5-163,5'C (myknet ved 160'C). Infrarød analyse under anvendelse av KBr-pellet vist zwitterionbånd ved 1389 og 1620 cm-<*>, karbonyl- og amidbånd ved 1641 cm"<1> og et tioesterbånd ved 1678 cm-<1>. Papirelektroforese ved pH 6 og tynnsjiktskromatografi (silisiumdioksyd-gelplater) under anvendelse av tre separate oppløsnings-middelsystemer viste tilstedeværelsen av både den nevnte forbindelse og lysin. A solution of 73.1 mg (0.5 mmol) L-lysln free base in 0.3 ml deionized water was added dropwise with stirring to a solution of 234.3 mg (0.5 mmol) Na<->[ 3-(Na<->benzoyl-D,L-phenylalanyltolo)-2-D-methylpropanoyl]-L-prolln 1 1 ml absolute alcohol. Solvents were removed by rotary evaporation to give a white residue. Fresh absolute alcohol was added and again the solvent was removed using a rotary evaporator. The procedure was repeated twice more with absolute alcohol and then twice with benzene. The final yield was 0.292 g (decomposition point 152-154.4°C) after drying in a vacuum desiccator over P2O5« Recrystallization from absolute alcohol, a few drops of water and benzene gave a yield of 141 mg of a white precipitate having a decomposition point of 162.5 -163.5'C (softened at 160'C). Infrared analysis using the KBr pellet showed zwitterion bands at 1389 and 1620 cm-<*>, carbonyl and amide bands at 1641 cm"<1> and a thioester band at 1678 cm-<1>. Paper electrophoresis at pH 6 and thin layer chromatography (silica -gel plates) using three separate solvent systems showed the presence of both the said compound and lysine.

Ytterligere fysiologisk akseptable salter kan fremstilles ved å benytte en passende base i stedet for NaHC03, KHCO3 eller lysin i eksemplene 93-95 og ved i det vesentlige å følge de nedenstående beskrevne metoder. Selv om eksemplene 95-97 beskriver fremstillingen av saltene av forbindelsen Na<->[3-(Na<->benzoyl-D,L-fenylalanyltlo)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin, vil det forstås at fysiologisk akseptable salter av enhver forbindelse med formel I kan fremstilles på samme måte. Additional physiologically acceptable salts can be prepared by using an appropriate base in place of NaHCO 3 , KHCO 3 or lysine in Examples 93-95 and by essentially following the methods described below. Although Examples 95-97 describe the preparation of the salts of the compound Na<->[3-(Na<->benzoyl-D,L-phenylalanyltolo)-2-D-methylpropanoyl]-L-proline, it will be understood that physiologically acceptable salts of any compound of formula I may be prepared in the same manner.

Farmakologiske forsøk Pharmacological trials

A. Den inhiberende aktivitet til produktet fra eksempel 84 In vitro ble målt ved hjelp av systemet som beskrevet i A. The inhibitory activity of the product of Example 84 In vitro was measured using the system described in

eksempel 1. Enzympreparatet ble renset fra menneskeurin som beskrevet av Ryan, J.W., et al., Tlssue and Cell 10, 555 (1978). Tabell 1 viser 150-verdien for produktet fra eksempel 84. Isg-verdien er konsentrasjonen av inhibitor som skal til for å gi 50* inhibering av enzymet under et standard-prøvesystem inneholdende substrat ved et nivå vesentlig under Km. Example 1. The enzyme preparation was purified from human urine as described by Ryan, J.W., et al., Issue and Cell 10, 555 (1978). Table 1 shows the 150 value for the product from Example 84. The Isg value is the concentration of inhibitor required to give 50* inhibition of the enzyme under a standard test system containing substrate at a level substantially below Km.

B. Oral effektivitet B. Oral effectiveness

Rotter (210-290 g legemsvekt) ble fastet natten over og deretter bedøvet med intraperitoneal pentobarbital, 50-60 mg/kg. Trachesostomi ble foretatt og dyrene ble mekanisk ventilert. En kanyle ble innført i en lårvene for injeksjon av angiotensin I, og en annen kanyle ble innført i en felles karotid-arterie for direkte måling av arterie-blodtrykk. Heparin, 1.000 enheter, ble injisert via lårvenen for å hindre koagulering. Blodtrykket ble målt ved hjelp av en trykk-transducer forbundet med en polygraf. Rottene ble injisert med 160-400 ng/kg angiotensin I i 20 pl av 0,9 g % NaCl; en mengde angiotensin I som er tilstrekkelig til å heve det midlere arterie-blodtrykk med 27-50 mm Hg. Etter at responsen hos en gitt ovenfor angiotensin I var opprettet, ble den respektive forbindelse ved 5,5-23 pmol/kg (legemiddel oppløst i 0,15 ml H2O pluss 10 pl IN NaHC03) gitt via et magerør. Ved bestemte tidsintervaller ble effektene av 160-400 ng/kg angiotensin I på det midlere arterie-blodtrykk testet. Resultatene er vist i tabell 2. Dosen av den spesielle forbindelse er vist i parentes etter nummeret på den aktuelle forbindelse. For eksempel 84 indikerer (23) at 23 pmol/kg av forbindelsen fra eksempel 84 ble administrert oralt. Tiden, i minutter, etter oral administrasjon av den spesielle forbindelse, når effektene av angiotensin I ble testet, er angitt i parentes etter "% av kontroll"-angivelsen. Rats (210-290 g body weight) were fasted overnight and then anesthetized with intraperitoneal pentobarbital, 50-60 mg/kg. Tracheostomy was performed and the animals were mechanically ventilated. One cannula was inserted into a femoral vein for injection of angiotensin I, and another cannula was inserted into a common carotid artery for direct measurement of arterial blood pressure. Heparin, 1,000 units, was injected via the femoral vein to prevent clotting. Blood pressure was measured using a pressure transducer connected to a polygraph. The rats were injected with 160-400 ng/kg angiotensin I in 20 µl of 0.9 g% NaCl; an amount of angiotensin I sufficient to raise mean arterial blood pressure by 27-50 mm Hg. After the response of an angiotensin I given above was established, the respective compound at 5.5-23 pmol/kg (drug dissolved in 0.15 ml H 2 O plus 10 µl IN NaHCO 3 ) was given via a gastric tube. At specific time intervals, the effects of 160-400 ng/kg angiotensin I on mean arterial blood pressure were tested. The results are shown in Table 2. The dose of the particular compound is shown in parentheses after the number of the compound in question. For Example 84, (23) indicates that 23 pmol/kg of the compound from Example 84 was administered orally. The time, in minutes, after oral administration of the particular compound, when the effects of angiotensin I were tested, is indicated in parentheses after the "% of control" indication.

C. Den inhiberende virkning til produktet fra eksempel 85 in vitro, ble målt i prøvesystemet beskrevet i eksempel 1.Enzympreparatet ble renset fra menneskeurin som C. The inhibitory effect of the product from example 85 in vitro was measured in the test system described in example 1. The enzyme preparation was purified from human urine which

beskrevet av Ryan, J.W., et al., Tissue and Cell 10, 555 described by Ryan, J.W., et al., Tissue and Cell 10, 555

(1978). Tabell 4 nedenfor viser 150-verdien for forbindelsen i eksempel 85. 150-verdien er konsentrasjonen av inhibitor som skal til for å gi 5056 inhiber ing av enzymet under anvendelse av et standard prøvesystem inneholdende substrat ved et nivå vesentlig under Kro. (1978). Table 4 below shows the 150 value for the compound in example 85. The 150 value is the concentration of inhibitor required to give 5056 inhibition of the enzyme using a standard test system containing substrate at a level substantially below Kro.

D. Oral effektivitet for natriumsaltet av N^- rS- d^- benzc- vl-D. L- fenvlalanvltio )- 2- D- metvlpropanovn- L- prolin Rotter (150-190 g legemsvekt) ble sultet natten over og deretter bedøvet med intraperitoneal pentobarbital, 50-60 mg/kg. Trachesostomi ble foretatt og dyrene ble ventilert mekanisk. En kanyle ble innført i en lårvene for injeksjon av angiotensin I, og en annen kanyle ble innført i en halspulsåre for direkte måling av arterieblodtrykk. Heparin, 1000 enheter, ble injisert via lårvenen for å hindre koagulering. Blodtrykket ble målt med en trykk-transducer forbundet med en polygraf. Rottene ble injisert med 400 ng/kg angiotensin I i 20 pl av 0,9 g ¥> NaCl; hvilket representerer en mengde av angiotensin I som er tilstrekkelig til å heve det midlere arterieblodtrykk med 45 mm Hg. Etter at mottageligheten hos en gitt rotte for angiotensin I var etablert, ble den ovenfor angitte forbindelse ved 10 pmol/kg (legemiddel oppløst 1 0,15 ml H2O pluss 10 pl IN NaHC03) gitt via et magerør. Ved tidsintervaller ble effektene av 400 ng/kg angiotensin I på midlere arterieblodtrykk testet. Resultatene var som følger: E. Intravenøs effektivitet til kal Iumsal tet av benzovl- D. L- fenvlalanvltlo)- 2- D- metvlpropanovl1- L- prolln Den Intravenøse effektivitet til nevnte forbindelser ble undersøkt ved hjelp av metoden som beskrevet i eksempel 98 med unntagelse av at 1 pmol/kg av legemidlet ble gitt intravenøst. De oppnådde resultater var følgende: D. Oral efficacy of the sodium salt of N^- rS- d^- benzc- vl-D. L-phenvlalanvltio)-2-D-methylpropanovn-L-proline Rats (150-190 g body weight) were starved overnight and then anesthetized with intraperitoneal pentobarbital, 50-60 mg/kg. Tracheostomy was performed and the animals were mechanically ventilated. One cannula was inserted into a femoral vein for injection of angiotensin I, and another cannula was inserted into a carotid artery for direct measurement of arterial blood pressure. Heparin, 1000 units, was injected via the femoral vein to prevent clotting. Blood pressure was measured with a pressure transducer connected to a polygraph. The rats were injected with 400 ng/kg angiotensin I in 20 µl of 0.9 g ¥> NaCl; which represents an amount of angiotensin I sufficient to raise mean arterial blood pressure by 45 mm Hg. After the receptivity of a given rat to angiotensin I was established, the above compound at 10 pmol/kg (drug dissolved in 1 0.15 mL H 2 O plus 10 µl IN NaHCO 3 ) was administered via a stomach tube. At time intervals, the effects of 400 ng/kg angiotensin I on mean arterial blood pressure were tested. The results were as follows: E. Intravenous effectiveness of the cal Ium salt of benzoyl- D. L- phenvlalanvltlo)- 2- D- metvlpropanovl1- L- prolln The Intravenous effectiveness of said compounds was examined by means of the method as described in Example 98 with exception that 1 pmol/kg of the drug was given intravenously. The results obtained were the following:

Claims (4)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en inhibitor for angiotensin-omdannende enzym for bruk ved behandling av høyt blodtrykk, og som har formelen: hvor R er hydrogen, formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, benzoyl, cyklopentylkarbonyl, tert.-butyloksykarbonyl, cyklopentylkarbonyl-L-lysyl eller pyro-L-glutamyl, A er L-fenylalanyl, glycyl, L-alanyl, L-tryptofyl, L-isoleucyl, L-leucyl eller L-valyl, hvor a-aminogruppen er i amidbinding med R, forutsatt at fenylalanyl er racemisk når R er benzoyl, Ri er hydrogen eller metyl, R2 er L-prolin, L-3,4-dehydroprolln eller D,L-3,4-dehydro-prolin, hvor iminogruppen er i imidbinding med tilstøtende >C-0-gruppe, og n er 0 eller 1, idet når n ■= 0, så er R^ metyl, og farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert ved at1. Analogous process for the preparation of an angiotensin-converting enzyme inhibitor for use in the treatment of high blood pressure, having the formula: where R is hydrogen, formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, benzoyl, cyclopentylcarbonyl, tert-butyloxycarbonyl, cyclopentylcarbonyl-L-lysyl or pyro-L-glutamyl, A is L-phenylalanyl, glycyl, L-alanyl, L-tryptophyll, L-isoleucyl, L-leucyl or L-valyl, where the α-amino group is in amide bond with R, provided that phenylalanyl is racemic when R is benzoyl, R 1 is hydrogen or methyl, R2 is L-proline, L-3,4-dehydroproline or D,L-3,4-dehydro-proline, where the imino group is in imide bond with adjacent >C-0 group, and n is 0 or 1, since when n ■= 0, then R^ is methyl, and pharmaceutically acceptable salts thereof, characterized by that 1) en forbindelse med formelen: omsettes med R2 for oppnåelse av en forbindelse med formelen:1) a compound with the formula: is reacted with R2 to obtain a compound with the formula: 1 hvilke formler R3 er acetyl, og Rj_, R2 og n har de ovenfor angitte betydninger, 2) fra den i trinn 1) oppnådde forbindelse fjernes R3, hvorved det oppnås en forbindelse med formelen: 3) den i trinn 2) oppnådde forbindelse omsettes med en forbindelse med formelen R-A-OH, hvorved det oppnås en forbindelse med formelen: hvor R, A, Rj, R2 og n har de ovenfor angitte betydninger, og, om ønsket, omdanner en oppnådd forbindelse til et farmasøytisk akseptabelt salt derav. 1 in which formulas R3 is acetyl, and Rj_, R2 and n have the meanings given above, 2) from the compound obtained in step 1) R3 is removed, whereby a compound with the formula is obtained: 3) the compound obtained in step 2) is reacted with a compound of the formula R-A-OH, whereby a compound of the formula is obtained: where R, A, Rj, R2 and n have the meanings given above, and, if desired, converting an obtained compound into a pharmaceutically acceptable salt thereof. 2. Analogi fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonen i trinn 1) utføres enten i nærvær av 1,1'-karbonyldiimidazol eller dicykloheksylkarbodiimid, og reaksjonen i trinn 3) utføres i nærvær av 1,1'-karbonyldiimidazol. 2. Analogous method according to claim 1, characterized in that the reaction in step 1) is carried out either in the presence of 1,1'-carbonyldiimidazole or dicyclohexylcarbodiimide, and the reaction in step 3) is carried out in the presence of 1,1'-carbonyldiimidazole. 3. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at R2 i trinn 1) også har en beskyttelsesgruppe for karboksyl, som fjernes i trinn 2). 3. Analogous method according to claim 2, characterized in that R2 in step 1) also has a protecting group for carboxyl, which is removed in step 2). 4. Analogi fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at R er benzoyl, A er fenylalanyl, R^ er metyl, R2 er prolin og n er 1.4. Analogous method according to claim 2, characterized in that R is benzoyl, A is phenylalanyl, R^ is methyl, R2 is proline and n is 1.