NO167921B - Fremgangsmaate til fremstilling av 7-oksomitosan-derivater - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av 7-oksomitosanforbindelser. Disse forbindelser er mitomycin A og analoger derav. Mitomycin A er antibiotikum hvis anvendelse er kjent, og de 7-0-substituerte mitosananaloger derav kan anvendes på liknende måte.

Nomenklatur; Det systematiske navn for mitomycin A ifølge Chemical Abstracts basert på en nylig revisjon (Shirhata et al,, J. Am. Chem. Soc ., Vol 105, 1983, p. 7199) er: p.aS-( la8 , 86 ,'8act, 8b 8 ) 1 -8-R (aminokarbonyl) ok sy) metyl^] - 6,8-dimetoksy-l-la,"3 ,8,8a, 8b-heksahydro-5-metyl-arizono [2 ' , 3 ' , 3,43-pyrrolop-, 2- £} indol-4, 7-dion.

Ifølge dette navn er azirinopyrroloindolringsystemet nummerert som følger:

Et nomenklatur-tr ivialsystem som har funnet utbrett anvendelse i mitomycin-litteraturen benevner ringsystemet ovenfor, sem inneholder flere av de karakteristiske substituenter av mitomycinene, som mitosan.

Ifølge dette system er mitomycin A 7,9a-dimetoksyro.itosan, og mitomycin C er 7-amino-9a-metoksymitosan. Når det gjelder den stereokjemiske konfigurasjon hos forbindelsene ifølge oppfinnelsen, er det meningen at de når de angis med stamnavnet "mitosan" eller med en struktrurformel, skal identifiseres med samme stereokjemiske konfigurasjon som den for mitomycin A eller C.

Mitomycin C er et antibiotikum som fremstilles ved fermentering og selges for tiden med godkjennelse av "Food and Drug Administ rat ion" til behandling av disseminert adenocarcinom i mage eller bukspyttkjertel i utprøvede kombinasjoner med andre godkjente kjemoterapeutiske midler og til palliativ behandling når andre mortaliteter har sviktet ("Mutamycin", Physicians Desk Reference, 37. utgave, 1983, p. 747 og 748). Mitomycin C og dens fremstilling ved fermentering er kjent fra US-patentskrift 3.660.578.

Strukturen av mitomycinene A, B og C og porfiromycin ble først offentliggjort av J.S. Webb et al., J. Am. Chem. Soc, Vol. 84, 1962, p. 3185-3187. En av de kjemiske omdanninger som ble ai vendt ved denne strukturundersøkeIse for sammenligning av mLtcmycin A med mitomycin C var omdanningen av førstnevnte, 7,9a-dimetoksymitosan, ved omsetning med ammoniakk, til sistnevnte, 7-amino-9a-metoksymitosan. Erstatning av 7-metoksy-gruppen i mitomycin A har vist seg å være en reaksjon av betyde-lig interesse ved fremstilling av aktive anti-tumorderivater av mitomycin A. Det har nylig vist seg at de stereokjemiske kon-figurasjoner i 1-, la-, 8a- og 8b-stillingene er som vist ovenfor i forbindelse med nomenklaturen ifølge Chemical Abstracts (Shirhata et al., J. Am. Chem. Soc, Vol. 105, 1983, p. 719 9-7200). Tidligere litteratur henviser til enantiomeren.

Følgende artikler og patentskrifter vedrører bl.a. omdanning av mitomycin A til et 7-substituert aminomitomycin C derivat med anti tumorakt ivitet. Formålet med denne forskning var fremstilling av derivater som var mere aktive og særlig mindre toksiske enn mitomycin C: Matsui et al., J. Antibiotics, Vol. XXI, 1969, p. 189-198, Konishita ét al., J. Med. Chem, Vol. 14, 1971, p. 103-109, Iyengar et al., J. Med. Chem., Vol 24, 1981, p. 975-981.

Iyengar, Sami, Remers og Bradner, Abstracts of Papers, 1983. Årsmøte i The American Chemical Society, Las Vegas, Nevada, mars 1982, Abstract nr. MEDI 72,

US-patentskrifter 3.332.944, 3.420.846, 3.450.705, 3.514.452, 4.231.916 samt 4.268.676.

Europeisk patentsøknad 116.208 og GB-patentsøknad 2.140.799 vedrører fremstilling av 7-substituerte aminomitomycin C derivater hvor substituenten inneholder en disulfidbinding.

7-alkoksy-substituerte mitosaner, som er strukturelt be-slektede med mitomycin A, er i en artikkel av Urakawa et al.,

J. Antibiotics, Vol 23, 1980, p. 804-809 beskrevet som verdifulle antibiotika med aktivitet overfor eksperimentelle tumorer i dyr.

Mitomycin A er det viktigste mitomycin som er fremstilt ved fermentering, og er den kommersielt tilgjengelige form. Kjent teknologi til omdanning av mitomycin C til mitomycin A har et aitall mangler. Hydrolyse av mitomycin C til den tilsvarende 7-hydrok sy-9a-metoksymitosan og etterfølgende metylering av denne forbindelse nødvendiggjør anvendelse av diazometan, en forbindelse hvis håndtering i produksjonsskala er meget risi-kabel, og 7-hydroksymellomproduktet er dessuten meget ustabilt (Matsui et al., J. Antibiotics, Vol. XXI, 1968, p. 189-198). Et forsøk på å unngå disse vanskeligheter omfatter anvendelse av 7-acyloksymitosaner (japansk patentskrift J. 556073-085,

Farmdoc nr. 56227 D/31). Alkoholyse av mitomycin A som beskrevet av Urakawa et al., J. Antibiotics, Vol 23, 1980, p. 804-809 er begrenset til utelukkende fremstilling av spesifikke 7-alkoksy-strukturtyper p.g.a. de alkoholiske utgangsmaterialers tilgjenge-lighet og reaktivitet.

Det har dessuten vært forsøkt å alkylere 7-rhydroksymitosan ned dimetyl-formamid-dimetylacetal, som er kjent som et frem-ragende metyleringsmiddel, som f.eks. anvendes til fremstilling av metylestere. Derved ble det oppnådd selektiv metylering av C-10-karbamoyldelen, mens det overraskende ikke forekom metylering av 7-OH-funksjonen (US patent 4.487.769). Denne iakttagelse underbygger det faktum, at alkyleringsmidler ikke reagerer med 7-hydrosymitosan på en forutsigbar måte.

Fra US patentskrift 4.069.024 er det kjent å alkylere 3-enolhydrok sylgruppen i et cef alospor ing-produkt under anvendelse av en 1-lavere alkyltriazenforbindelse. Imidlertid er det fra Ukrain. Khim. Zhur., Vol 21, fra 1985, p. 469-498 (Chemical Abstracts, Vol 50, 1956, 5549) kjent at succinimid alkyleres av 1-metyl-3-p-tolyltriazen til dannelse av N-metylsuccinimid. 7-oksomitosan inneholder som kjent en C-10-karbamoylrest som tr iazinr eagenset på helt parallel måte vil kunne reagere med. Dessuten er det fra M. Matsui et. al., J. Antibiotics, Vol 21, 1968, p. 196 S.M. Sami et al., J. Med. Chem., Vol 27, 1984, p. 701-708, og US patentskrift 4.746.746 kjent at aniliner, som er et reaksjonsprodukt ved triazenalkyleringsprosessen, f.eks. reagerer med 7-metoksymitosaner. Med kjennskap til disse publi-kasjoner og ovennevnte Farmdoc-publikasjon er det derfor overraskende at 7-metoksymitosan ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse ikke reagerer videre til nevnte 7-fenyl-anin omit osaner.

Diazometan er som nevnt inntil nå det eneste kjente reagens, som reagerer selektivt med 7-hydroksyfunksjonen, mens andre for-søkte alkylreagens er reagerer med resten i la-N-stillingen og med C-10-karbamoylresten eller en kombinasjon av disse. Dessuten er cet som nevnt kjent at triazenreagenser reagerer med imider, hvorved fagfolk vil forvente at triazen-reagenset vil reagere med C-10-karbamoylresten på tilsvarende måte som alkyleringsmidlet dimetylformamid-dimetylacetal, som selektivt alkylerer nevnte C-10-karbamoylrest. Således vil det på bakgrunn av den kjente teknikk ikke være nærliggende for fagfolk å underkaste 7-hydr oksymit osan alkyler ing under anvendelse av tr iazenreagenser dersom formålet er selektiv alkylering av 7-hydroksyfunksjonen.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av forbindelser med formelen (IX)

hvor

R<5> er hydrogen eller C1_galkyl, og

R^ er C^_galkyl eller substituert C^_galkyl, hvor substituentene er valgt blant C^_^ alkoksy, pyridyl, morfolino, benzyl og 1,3-dioksolan.

Mange av forbindelsene med formelen (IX) er kjente forbindelser som oppviser in vivo inhibitorisk aktivitet overfor eksperimentelle tumorer i dyr. Ifølge denne fremgangsmåte er det også blitt fremstilt et antall hittil ukjente forbindelser med formelen (IX). Spesielt er forbindelsene som her er identifisert som forbindelser ifølge eksemplene 14, 15, 16 og 19, hittil ukjente forbindelser, som også oppviser antitumoraktivitet overfor eksperimentelle tumorer i dyr. De anvendes på liknende måte sem mitomycin C. Avhengig av deres toksisitet er de anvendte doseringer innstilt i forhold til toksisiteten av mitomycin C. I ds tilfeller hvor den nye forbindelse er mindre toksisk anvendes en høyere dose.

Fremgangmåten ifølge oppfinnelsen til fremstilling av forbindelser med formelen (IX) kjennetegnes ved at en mitosan med formelen (X)

ansettes med en triazen med formelen (XI)

5 6

hvor R og R har de ovenfor anførte betydninger og Ar er den organiske rest av et diazoterbart aromatisk amin.

Uttrykket "C1_6 alkyl" og "C1_4 alkoksy" slik som anvendt i beskrivelsen og i kravene (med mindre sammenhengen viser noe annet) betyr uforgrenete eller forgrenete alkyl- eller alkoksy grupper. Fortrinnsvis inneholder disse grupper 1-4 karbonatomer, og mest foretrykket inneholder de 1 eller 2 karbonatomer.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse er det frembrakt en fremgangsmåte til fremstilling av forbindelser med formelen (IX), som kjennetegnes ved at en mitosan med formelen (X) omsettes med en triazen med formelen (XI) som vist i skjema 1.

hvor R og R^ har de overfor anførte betydninger, og Ar er dan organiske rest av et diazoterbart aromatisk amin.

De 1-substituerte 3-aryltriazener med formelen (XI), og mer spesielt l-alkyl-3-aryltriazenene, utgjør en klasse reaktanter som er kjent for at de kan anvendes til omsetning med karboksyl-syre til dannelse av de tilsvarende lavere alkylestre. 1-metyl-3-(4-metylfenyl)triazen kan fremstilles ifølge de generelle fremgangsmåter som er beskrevet av E.H. White et al. i Org. Syn., Vol. 48, 1968, p. 102-105 og som beskrevet her i fremgangsmåte 1. Denne fremgangsmåte fungerer imidlertid bare godt med vannløse-lige aminer, og en annen fremgangsmåte, som er beskrevet av E.H. White et al., Tetrahedron Letters, nr. 21, 1961, p. 761 og også beskrevet her i fremgangsmåte 2, er mer velegnet til fremstilling av triazenér av vannuløselige aminer.

Reaktanten l-metyl-3-(4-metylfenyl)triazen, som er fremstilt på den ovenfor beskrevne måte, er tidligere blitt anvendt til fremstilling av metylestre av karboksyl syrer som 2,4-dinitro-benzosyre (E.H. White et al., Org. Syn., Vol. 48, 1968, p. 102-105) og cefalosporansyrer som gir den ønskede A 3-forbindelse uten isomerisering av a 2-isomeren (Mangia, Tetrahedron Letters, nr. 52, 1978, p. 5219-20. Reaktanten er også blitt anvendt til fremstilling av et 3-metoksycefalosporinderivat ved omsetning med dat tilsvarende 3-hydroksy-3-cef em-4-kar bok sy lat i benzenløsning ved tilbakeløpstemperatur (US-patentskrift 4.069.324).

Andre l-(lavere alkyl)-3-aryltriazener med formelen (XI) kan fremstilles på liknende måte ved omsetning av andre lavere alkyl-aniner med aryldiazoniumsalter. Ethvert arylamin med 6-12 karbonatomer, som lettvint dannet et diazoniumsalt, kan anvendes som

utgangsmateriale for aryldelen i den 1,3-disubstituerte triazen.

Til fremstilling av mitomycin A foretrekkes det å anvende 3-metyl-l-(4-metylfenyl)triazen som metylseringsreaktant. Fortrinnsvis anvendes minst to moldeler av sistnevnte pr. moldel 7-hydr ok sy-9a-met oksymit osan, og omsetningen utføres fortrinnsvis i et væskeformet organisk løsningsmiddel for 7-hydroksy-9a-metok-symitosanutgangsmaterialet. Foretrukne løsningsmidler er lavere alkanoler, lavere alkansyrer-lavere alkylestre, di-lavere alkyl-etre, cykliske alifatiske etre samt lavere polyhalogenerte alifatiske hydrokarboner. Disse løsningsmidler inneholder opp til 6 karbonatomer, men de løsningsmidler som koker ved temperaturer under 100°C foretrekkes. Særlig foretrukne løsningsmidler er netylenklorid, metanol, dietyleter, etylacetat og blandinger derav. Omsetningen kan utføres ved reaksjonsblandingens tilbake-løpstemperatur eller opp til 60°C. Ved høyere temperaturer har mitosanreaktanten en tilbøyelighet til å dekomponere, noe som resulterer i et lavere utbytte. Det foretrekkes å utføre omsetningen ved romtemperatur eller derunder f.eks. i området fra 0 til 25°C.

En egnet måte til bestemmelse av når omsetningen av avsluttet er ved tynnsjiktskromatografi. Mitomycin A er mørkt purpurfarget og kan lettvint skjelnes fra utgangsmaterialet og fra biprodukter. I løsningsmiddelsystemet metylenklorid/metanol = 90:10 oppviser mitomycin A Rf = 0,36. Kromatografi på nøytralt aluminiumoksyd kan anvendes til rensing av produkter.

De ovennevnte reaksjonsbetingelser- og -forholdsregler kan i alminnelighet anvendes til fremstilling av 7-R^O-mitosaner med formelen (IX) ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Verdien av forbindelser med formlene (IX) ved antineoplast-iske, terapeutiske fremgangsmåter påvises ved resultatene av in vivo screeningprosesser, hvor forbindelsene administreres i forskjellige dosemengder til mus, hvori en P-388 leukemisk tilstand er blitt innført.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen ansees for å ha antibakte-riell aktivitet overfor gram-positive og gram-negative mikroorga-nismer på liknende måte som iaktatt for de naturlige forekommende mitomyciner, og er således potensielt verdifulle som terapeutiske midler til behandling av bakterieinfeksjoner hos mennesker og

dyr.

Aktivitet overfor P- 388 museleukemi

Tabell I inneholder resultatene av laboratorieforsøk med CDF1 .-mus, som intrapergitonealt har fått implantert et tumor-podestoff i form av 10 ascites-celler av P-388 museleukemi og er behandlet med forskjellige doser av enten en testforbindelse med formelen (I) eller (II), eller med mitomycin C. For-bindelsene ble administrert ved intraperitoneal injeksjon. Grupper på 6 mus ble benyttet til hver dosemengde, og de ble behandlet med en enkelt dose av forbindelsen dager etter podingen. En gruppe av 10 saltvannsbehandlede kontrollmus ble medtatt i hver forsøksserie. Gruppene som var behandlet med mitomycin C ble medtatt som en positiv kontroll. Det ble ført en 30 dagers protokoll over den gjennomsnittlige overlevelsestid uttrykt i dager for hver gruppe mus, og antallet over-levende ved avslutningen av 30 dagers perioden ble notert. Musene ble veiet før behandlingen og igjen den sjette dag. Vektforandringen ble tatt som et mål på legemidlets toksisitet. Det ble anvendt mus som veide 20 g, og et vekttap på opptil 2 g ble ikke betraktet som usedvanlig stort. Resultatene ble bestemt uttrykt i % T/C, som er forholdet mellom den gjennomsnittlige overlevelsestid for den behandlete gruppe og den gjennomsnittlige overlevelsestid for den saltvannsbehandlete kontrollgruppe, ganget med 100. De saltvannsbehandlete kontroll-dyr døde vanligvis i løpet av 9 dager. Den "maksimale virkning" i den følgende tabell er uttrykt i % T/C, og den dose som gir denne virkning er anført. Verdiene i parentes er de med mitomycin C som den postive kontrolloppnådde verdier i samme for-søk. Derved kan forholdet mellom den relative aktivitet av de anførte substanser og mitomycin C vurderes. Den minimale virkning uttrykt i % T/C ble ansett for å være 125. Den minimale virksomme dose, som er angitt i den følgende tabell, er den dose som gir % T/C på ca. 125. De i hvert tilfelle angitte to verdier i spalten "gjennomsnittlig vektforandring" er den gjennomsnittlige vektforandring pr. mus ved henholdsvis den maksimale virksomme dose og ved den minimale virksomme dose.

I betraktning av den iaktatte antitumoraktivitet i eksperimentelle dyretumorer kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes til inhibering av tumorer i pattedyr. Til dette formål administreres disse systematisk til et pattedyr,

som lider av en tumor, i en stort sett ikke-toksisk dose med antitumor-virkning.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er primært beregnet til anvendelse i injeksjonsform på liknende måte og med samme formål som mitomycin C. Litt større eller mindre doser kan ai vendes avhengig av den spesielle tumor-følsomhet. De kan lettvint distribueres som tørre farmasøytiske preparater som inneholder tynningsmidler, puffere, stabilisatorer, løselighetsmidler og ingredienser som bidrar til farmasøytisk anvendelighet. Disse preparater tilberedes deretter med et injiserbart flytende medi-um, som er fremstilt på bestilling, umiddelbart før bruk. Egnete injiserbare væsker omfatter vann, isotonisk saltvann o.l.

I de etterfølgende fremgangsmåter og eksempler er alle smeltepunkter ukorrigerte. De protonkjernemagnetiske resonans-spektra (<1>H NMR) ble opptatt i et "Varian XL100", "Joel FX-90Q" eller "Bruker WM 360" spektrometer, enten i pyridin-dj. eller D^O som angitt. Når pyridin-d^ anvendes som løsningsmiddel benyttes pyridinresonansen ved 5=8,57 som en intern referanse,

mens derimot TSP benyttes som intern referanse med D^O som løsningsmiddel. Kjemiske forskyvninger er angitt i £-enheter,

og koplingskonstanter i Hertz. Oppdelingsmønstre er angitt som følger: s = singlett, d = dublett, t = triplett, q = kvartett,

m = multiplett, bs = bredt signal, dd = dublett av dublett, dt = dublett av triplett. IR-spektre ble bestemt enten i et "Beckman Model 4240" spektrometer eller et "Nicolet 5DX FT" IR-spektrometer og er angitt i resiproke centimetre. UV-spektre ble bestemt enten i et "Cary Model 290" spektrometer eller et "Hewlitt Packard 8450A" spektrometer utstyrt med en multi-diodedetektor. Tynnsjiktskromatografi ble utført på 0,25 mm plater "Analtech silicagel GF". Flash-kromatografi ble utført enten med "Woelm" nøytralt aluminiumoksyd (DCC-kvalitet) eller "Woelm" silikagel (32-63^) og de anførte løsningsmidler. Alle avdampninger av løsningsmidler ble utført ved senket trykk og ved under 40°C.

l-alkyl-3-aryltriazenene utgjør en klasse reaktanter, som er kjent for å kunne anvendes til omsetning med karboksylsyrer til dannelse av de tilsvarende lavere alkylestre. l-metyl-3-(4-metylfenyl)triazen kan fremstilles på følgende måte:

Fremgangsmåte 1

E.H. White et al., Org. Cyn., Vol. 48, 1968, p. 102-195.

l- metyl- 3- p- tolyltriazen. 50,2 g (0,47 mol) p-toluidin anbringes i en 2 liter kolbe utstyrt med en 200 ml skilletrakt og en effektiv omrører, og koblen nedsenkes i et is-saltbad ved ca. -10°C. En løsning av 46,8 g (0,55 mol) kaliumnitritt i 150 ml vann anbringes i skilletrakten, og en blanding av 250 g

knust is og 140 ml konsentrert saltsyre tilsettes under om-røring til p-toluidinen. Kaliumnitrittløsningen tilsettes langsomt under fortsatt omrøring i 1-2 timer, inntil det oppnås en positiv stivelse-kaliumjodidtest (note 1), og blandingen om-røres i ytterligere 1 time for å sikre at all toluidin er om-satt .

Lesningen av p-toluendiazoniumklorid innstilles deretter ved 0°C til pH 6,8-7,2 med kaldt, konsentrert, vandig natriumkarbonat, hvoretter løsningen blir rød til orangefarget og litt rødt materiale helles ut. Den kalde, nøytrale løsning overføres til en skilletrakt og tilsettes langsomt til en kraftig omrørt blanding av 150 g natriumkarbonat, 300 ml 30-35 prosentig vandig metylamin (note 2) samt 100 g knust is i en 3 liter kolbe. Reaksjonsblandingen holdes ved ca. -10°C under til-setningen, som tar ca. 45 minutter (note 3). Løsningen ekstra-heres med tre 1 liter porsjoner eter. Eterekstraktene tørkes med vannfritt natriumsulfat og inndampes i en rotasjonsinn-damper ved romtemperatur, hvorved det oppnås 6 5 g uren l-metyl-3-p-tolyltriazen (note 4). Denne anbringes i et vann-avkjølt sublimeringsapparat, og triazenen sublimeres ved 50°C og 1 mm Hg, hvorved det oppnås 43,3 g (0,29 mol, 62%) gult, krystallinsk sublimat, smp. 77-80°C (note 5). Sublimatet kan omkrystalliseres fra heksan, hvorved triazenen oppnås som hvite nåler, smp. 80,5-81,5°C. Mer bekvemt løses det i en minimal mengde eter, og løsningen tynnes med 2 volumer heksan og av-kjøles til 0°C, hvorved det oppnås flate plater med et' litt gulaktig skjær, smp. 79-81°C. Utbyttet av ren triazen er 33-37 g (47-53%) (note 6).

Noter

1. De enkelte tester med stivelse-kaliumjodidpapir bør utføres 1-2 minutter etter at tilsetning av kaliumnitrit er fullført.

2. Det anvendes 40 prosentig vandig metylamin.

3. Omsetningen er fullført når en dråpe løsning ikke lenger gir en rød farge sammen med en løsning av S-naftol i vandig natriumkarbonat.

4. Hovedforurensningen er 1,5-di-p-tolyl-3-metyl-l,4-pentazdien (smp. 148°C). Den kan fjernes ved fraksjonert krystallisasjon, men det er enklere å sublimere triazenen fra reaksjonsblandingen.

5. Sublimatet inneholder spor av 1,3-di-p-tolyltriazen som vist ved tynnsjiktskromatografi. Omkrystallisasjon gir den rene l-metyl-3-p-tolyltriazen.

6. Denne fremgangsmåte funksjonerer bare godt ved vann-løselige aminer. Den nedenfor beskrevne fremgangsmåte 2 er bedre egnet til fremstilling av diazener med vannuløselige aminer.

Fremgangsmåte 2

(E.H. White et al., Tetrahedron Letters nr. 21, 1961, p. 761

1- n- buty1- 3- p- klorfenyltriazen. En løsning av 2,87 g (10,1 mmol) p-klor-benzendiazoniumheksafluorfosfat (om-kry.stallisert fra aceton-metanol) i dimetylf ormamid (dimetyl-aminfritt) ble langsomt tilsatt til en omrørt blanding av 0,73 g (10,0 mmol) n-butylamin, 15 g pulverisert natriumkarbonat

samt 3 0 ml dimetylformamid omrørt og holdt på -5°C. Diazonium-saltløsningen kan anvendes ved romtemperatur, et renere produkt oppnås imidlertid vanligvis dersom diazoniumsaltløsningen fremstilles i og tilsettes fra en avkjølt skilletrakt som holdes på ca. -50°C. Blandingen ble oppvarmet til 0° og omrørt inntil det ble oppnådd en negativ test med 2-naftol (noe som vanligvis

bare krever få minutter). Eter ble tilsatt, blandingen filtrert og filtratet vasket grundig med vann og deretter tørket. (Triazenen kan på dette tidspunkt isoleres og omkrystalliseres fra pentan ved lavere temperaturer).

Fremgangsmåte 3

7- hydroksy- 9a- metoksymitosan. 2,2 g (6,6 mmol) mitomycin C ble løst i 140 ml 0,1N metanolisk NaOH (50%), og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 timer. Løsningen ble deretter innstilt på ca. pH 4,0 med IN HCl og ekstrahert med 4 x 500 ml etylacetat. De kombinerte etylacetatekstrakter ble tørket med Na2S04 og inndampet ved senket trykk ved 30-35°C, hvorved det ble oppnådd en fast rest, som etter løsning i eter og behandling med overskudd av heksan ga et purpurfarget bunnfall. Bunnfallet ble oppsamlet og tørket, hvorved tittelforbindelsen ble oppnådd som et fint purpurfarget pulver (1,4 g, 63%).

<1>H NMR (pridin-d5, 6): 2,05 (s, 3H), 2,14 (bs, 1H), 2,74 (bs, 1H), 3,13 (d, 1H), 3,24 (s, 3H), 3,56 (d, 1H), 4,00 (dd, 1H), 4,37 (d, 1H), 5,05 (t, 1H), 5,40 (dd, 1H), 5,90 (bs, 2H).

Fremgangsmåte 4

Mitomycin A. 100 mg (0,30 mmol) 7-hydroksy-9a-metoksymitosan og 100 mg (0,67 mmol) 3-metyl-l-p-tolyltriazen ble løst i 2 ml metylenklorid og 10 ml dietyleter. Etter forsiktig koking med tilbakeløp i 6 timer ble løsningen omrørt i 18 timer ved romtemperatur. Tynnsjiktskromatografi (metylenklorid:metanol = 90:10) avslørte at det opptrådte en en dypt purpurfarget plett ved R_ = 0,36 med et spor av forurensning ved R^ = 0,41. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til tørr tilstand og kromatografert på "Woelm" nøytralt aluminiumoksyd under anvendelse av metylenklorid og metylenklorid:metanol = 30:1 som elueringsmidler. Fraksjoner som inneholdt komponenten R^ = 0,36 ble samlet og konsentrert til tørr tilstand. Ut-felling av den tørre rest fra metylenklorid og heksan ga 25 mg (24%) av tittelforbindelsen som et fint, amorft, purpurfarget pulver, smp. 161°C.

Analyse: beregnet for C16HlgN3Og: C: 54,96; H: 5,44; N: 12,02

funnet: C: 53,96; H: 5,37; N: 11,99

IR(KBr), v , cm"<1>: 3400, 3300, 2950, 1700, 1630, 1575,

IT13.X

1200, 1060.

NMR (pyridin-d5, 6): 1,82 (s, 3H), 2,74 (dd, 1H), 3,12 (d, 1H), 3,24 (s, 3H), 3,54 (dd, 1H), 3,96 (dd, 1H), 4,02 (s, 3H), 4,22 (d, 1H), 4,84 (bs, 2H), 5,02 (t, 1H), 5,38 (dd, 1H).

Utbyttet ved fremgangsmåte 4 økes til 63% ved å anvende metylenklorid som reaksjonsløsningsmiddel og romtemperatur i et tidsrom på 24 timer.

Fremgangsmåte 5

I en 250 ml enhalset, rundkolbe ble det anbrakt fast Na2C03, en 35% vandig aminløsning (mengde som i fremgangsmåte 1) samt is, og suspensjonen ble omrørt ved -5°C (is-saltbad). Til denne suspensjon ble det dråpevis tilsatt en kald suspensjon av p-klorbenzendiazoniumheksafluorfosfat (Aldrich Chemical Co.) i is, vann og Na2C03 (løsning ca. pH 7). Etter endt tilsetning ble reaksjonsblandingen ekstrahert med dietyleter. Dietyleterekstrakten ble vasket med vann, tørket med Na2CO^ og konsentrert. Den gulaktige, faste rest ble renset ved søylekromatografi over "Woelm" aluminiumoksyd under anvendelse av heksan:metylenklorid = 1:1 som elueringsmiddel (^"H NMR opptatt).

Eksempel 1- 8

Triazenene 1-6 i den etterfølgende tabell 3 ble fremstilt ifølge den ovenfor beskrevne generelle fremgangsmåte 1, hvor fremstillingen av triazenen i eksempel 1 er eksemplifisert. Triazenene ble renset ved søylekromatografi på "Woelm" aluminiumoksyd.

Triazenene 7-8 i tabell 3 ble fremstilt ifølge den ovenfor beskrevne generelle fremgangsmåte 5.

Eksempler 12- 19

Generell fremgangsmåte til fremstilling av 7- alkoksy- 9a-metoksymitosaner ( 12- 19

En løsning av 2,4 ekvivalenter triazen i CH2C12 :metanol = 4:1 ble tilsatt til en løsning av 7-hydroksy-9a-metoksymitosan (fremstilt i fremgangsmåte 3) i CH2Cl2 :metanol = 4:1. Reak-sjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur, og reaksjons-forløpet ble overvåket ved tynnsjiktskromatografi (10% MeOH i CH2C12). 7-alkoksy-9a-metoksymitosanforbindelsen opptrer som en mørk purpurfarget flekk i tynnsjiktskromatogrammet. Reaksjonsblandingen ble kromatografert på "Woelm" aluminiumoksyd etter at omsetningen på basis av tynnsjiktskromatografi var ansett som avsluttet, og 7-alkoksy-9a-metoksymitosanen ble oppnådd som et amorft fast stoff. De fremstilte forbindelser er angitt som eksempler 12-19 i tabell 4.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av 7-oksomitosanforbindelser med formelen (IX) hvor R er hydrogen eller C^_6alkyl, og R^ er C^_galkyl eller substituert C^_galkyl, hvor substituentene er valgt blant C^_4alkoksy, pyridyl, morfolino, benzyltio og 1,3-dioksolan, karakterisert ved at en mitosan med formelen (X) omsettes meden triazen med formelen (XI) hvor R^ og R^ har de ovenfor anførte betydninger og Ar er cen organiske rest av et diazoterbart aromatisk amin.
2. 2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det anvendes minst to moldeler av triazenen i forhold til mitosanen med formelen (X).
3. 3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at reaksjonstemperaturen er fra 0°C til 60°C.
4. 4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterk-sert.ved at reaksjonstemperaturen er fra 0°C til 25°C.