NO164479B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive peptidforbindelser. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for

fremstilling av nye peptider med en stimulerende effekt på bloddannelsen (hemopoiesen).

Benmargcellene skriver seg fra pluripotente stamceller som modner for å danne en kompleks populasjon av morfologisk distinkte celler, nemlig megakariocytter, erytrocytter,

granulocytter og lymfocytter. Bare ca. 10% av stamcellene er under celledeling til enhver tid. I en initial fase av modningen blir hver av de prolifererende stamceller "committed" til bestemt morfologisk distinkt form som tilslutt fører til en av de ovennevnte fire modne celletyper. Mens cellene prolifererer,

taper de gradvis evnen til ytterligere proliferasjon, og de modne cellene, for eksempel erytrocytter eller granulocytter,

kan ikke lenger inngå deling. Siden modne celler kontinuerlig dør, er det følgelig vesentlig at proliferasjonsevnen av de mindre modne celler, særlig stamcellene "committed" for margdannelse, opprettholdes.

Vi har nå funnet en gruppe av nye peptider som er i stand

til å stimulere proliferasjonen av margdannende stamceller.

I henhold til oppfinnelsen, fremstilles således forbindelser

med formel (I):

hvor samtlige aminosyre-enheter har L-konfigurasjon,

A utgjør

eller et hydrogenatom; B utgjør

eller en hydroksygruppe;

n og m utgjør uavhengig av hverandre heltallene 1 eller 2; a og b utgjør uavhengig av hverandre heltallene 0 eller 1; R, R' og R" utgjør uavhengig av hverandre en hydroksygruppe eller en aminogruppe; og de fysiologisk akseptable salter derav under den forutsetning at når A og B utgjør henholdsvis et hydrogenatom og en hydroksygruppe, b ikke kan være 0.

Forbindelsene med formel (I) er således symmetriske dimerer.

Når A utgjør en glutaminrest eller en prolinrest, er det å foretrekke at a=b=l, n=2 m=l, R og R' utgjør hydroksygrupper og B utgjør en lysinrest.

Når B utgjør en argininrest, er det å foretrekke at A utgjør en pyroglutamatrest, a=b=l, n=2, m=l og R og R' utgjør hydroksygrupper.

En foretrukket gruppe av forbindelser er slike hvor b=l, m=l og R, R' og R" utgjør hydroksygrupper.

Spesielt foretrukne forbindelser fremstilt i henhold til oppfinnelsen er som følger (under bruk av konvensjonell biokjemisk notasjon for aminosyrene og ved å lese fra N-enden):

En annen spesielt foretrukket forbindelse er (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)2 dvs. den forbindelse hvori a=b=l, m=l, n=2, R og R' utgjør hydroksygrupper, A utgjør en pyroglutamatrest og B utgjør en lysinrest.

Fysiologisk akseptable salter av peptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen innbefatter syreaddisjonssalter, så som hydrokloridet, hydrobromidet, sulfatet, etc, samt salter med baser så som alkalimetallsalter, f.eks. natrium- eller kaliumsalter, jordalkalimetallsalter, f.eks. kalsiumsaltet, eller aminsalter.

Noen av forbindelsene med formel (I) er dimerer av forbindelsene beskrevet og krevet beskyttet i vår Europeiske patentsøknad nr. 83.307210.1. Denne siste søknad angår en liten gruppe hemoregulerende peptider som har en hemmende effekt på granulopoiesen.

Som følge av de ytterst små mengder som er tilgjengelig av den naturlige granulopoiese-faktor, har strukturen av den naturlige substans aldri blitt bestemt. Den er aldri oppnådd i krystallinsk eller helt ren form, og det er ikke kjent hvorvidt dette kunne oppnås ved kun å benytte materiale fra naturlige kilder. Det er postulert at faktoren har strukturen pyroGlu-Asp-Asp-Cys-LysOH, men, som meddelt i vår ovennevnte Europeiske patentsøknad, har den syntetiske forbindelse med denne struktur vist seg å være inaktiv. Man har registrert at når den naturlige granulopoiese-hemmende faktor utsettes for oksyderende betingelser, dannes en forbindelse med stimulerende virkning. Dette produkt er imidlertid heller aldri blitt isolert eller bestemt. Peptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan derimot oppnås i ren form egnet for farmasøytisk bruk og i relativt store mengder.

Det er også rapportert (Exp. Hematol. 12 7 (1981)) at når én av peptidene i vår ovennevnte Europeiske patentsøknad, nemlig pyroGlu-Glu-Asp-Cys-LysOH, utsettes for frysing og opptining, oppviser det en stimulerende virkning som kan reverseres ved behandling med merkaptoetanol. Det stimulerende produkt er imidlertid aldri oppnådd i ren form og strukturen aldri bestemt.

De nye forbindelsene er testet i kjemisk ren form med henblikk på in vitro og in vivo hemoregulerende virkninger. In vitro undersøkelser av margdannende stamceller fra både menneske og mus, har vist økning på opptil 1500% av koloni-dannelse på agar. Den stimulerende effekt inntrer i konsentrasjonsområdet 10~<13> til 10<-5>M. I in vivo undersøkelsene hos mus, har vi registrert at en enkelt injeksjon kan øke antallet margdannende stamceller med 50% i løpet av 48 timer, og ved kontinuerlig infusjon, ble antallet stamceller fordoblet på 13 dager.

Forbindelsene er spesielt anvendelig for å stimulere margdannelse i pasienter som lider av nedsatt myelopoietisk aktivitet, innbefattet benmargsskade, agranulocytose og aplastisk anemi. Dette innbefatter behandling av pasienter med nedsatt benmargsfunksjon som følge av immunosuppresiv behandling for å undertrykke vevsreaksjoner, f.eks. ved benmargstrans-plantasjon.

Forbindelsene kan også benyttes for å fremme hurtigere regenerering av benmarg etter cytostatisk kjemoterapi og bestrålingsterapi ved neoplastiske og virale sykdommer.

De nye forbindelsene kan dessuten være av spesiell betydning for pasienter som har alvorlige infeksjoner som følge av manglende immunrespons etter benmargslidelse.

En annen klinisk anvendelse vil være i kombinasjon med de korresponderende monomerer eller beslektede myelopoiese-hemmere som beskrevet i vår ovennevnte Europeiske patentsøknad, for å indusere alternerende topper av høy og lav aktivitet i benmargcellene slik at den naturlige cirkadiske rytme av bloddannelsen forsterkes. På denne måte kan cytostatisk terapi gis i perioder med lav benmargsaktivitet og derved redusere risikoen for benmargsskade, mens regenereringen vil bli påskyndet av den påfølgende aktivitetstopp.

Det skal bemerkes at der ikke er noen stimulerende effekt på celler av annet vev, spesielt tumorceller relatert til ikke-myelopoietisk vev. De nye forbindelsene stimulerer således selektivt det myelopoietiske system.

Peptidene har ingen toksisitet av betydning. Dessuten er alle observerte hemotologiske virkninger reversible, og makroskopiske forandringer ble ikke registrert i de øvrige organer hos dyr som fikk peptidene injisert.

For å utøve en stimulerende virkning kan peptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen generelt gis til mennesker ved injeksjon i doseområdet 0,1-10 mg, for eksempel 1-5 mg, per 70 kg legemsvekt per dag. Ved administrasjon ved infusjon eller lignende teknikk, kan dosen ligge i området 30-300 mg per 70 kg legemsvekt, for eksempel ca. 100 mg, over en 6 dagers periode. Prinsipielt er det ønskelig å oppnå en konsentrasjon av

peptidet på ca. 10_<13>M til 10-<5>M i pasientens ekstracellulære væske.

Farmasøytiske preparater kan inneholde én eller flere av

de nye forbindelser med formel (I), eller fysiologisk forlikelige salter derav, som virkestoff sammen med et farmasøytisk bære-eller hjelpestoff. Preparatene kan fremstilles i en form egnet for oral, nasal, parenteral eller rektal administrasjon.

Uttrykket "farmasøytisk" innbefatter i denne sammenheng veterinære anvendelser av oppfinnelsen.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan fremstilles i konvensjonelle farmakologiske administrasjonsformer, så som

tabletter, drasjerte tabletter, nasalspray, oppløsninger, emulsjoner, pulvere, kapsler eller retardformer. Konvensjonelle farmasøytiske hjelpestoffer og vanlige produksjonsmetoder kan benyttes for fremstilling av disse formene. Tabletter kan for eksempel fremstilles ved å blande virkestoffet eller virkestoffene med kjente hjelpestoffer, f.eks. med fortynningsmidler, så som kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat eller laktose, sprengmidler så som maisstivelse eller alginsyre, bindemidler som stivelse eller gelatin, glattemidler som magnesiumstearat eller talkum, og/eller midler for å oppnå forsinket frigjøring, så som karboksypolymetylen, karboksymetylcellulose, celluloseacetat-ftalat eller polyvinylacetat. Tablettene kan eventuelt bestå av flere lag. Drasjerte tabletter kan fremstilles ved å overtrekke kjerner oppnådd på lignende måte som tablettene, med midler som vanligvis benyttes for tablettovertrekk, for eksempel polyvinylpyrrolidon eller skjell-lakk, gummi arabicum, talkum, titandioksyd eller sukker. For å oppnå forlenget frigjøring eller unngå uforlikelighet,

kan også kjernen bestå av flere lag. Tablett-overtrekket kan også bestå av flere lag for å oppnå forsinket frigjøring, hvorunder de ovennevnte tablett-hjelpestoffer, kan benyttes.

Organspesifikke bærersystemer kan også anvendes.

Injeksjonsoppløsninger kan for eksempel fremstilles på konvensjonell måte, så som ved tilsetning av konserveringsmidler, f.eks. p-hydroksybenzoater, eller stabilisatorer så som EDTA. Oppløsningene fylles deretter over i hetteglass eller ampuller.

Spray for nasal anvendelse kan på lignende måte tilberedes

i vandig oppløsning og anbringes i spray-beholdere enten med et aerosol-drivmiddel eller utstyres med anordninger for manuell komprimering. Kapsler som inneholder én eller flere virkestoffer kan for eksempel fremstilles ved å blande virkestoffene med inerte bæremidler, så som laktose eller sorbitol, og fylle blandingen over i gelatinkapsler. Egnede suppositorier kan for eksempel fremstilles ved å blande virkestoffet eller virkestoff-kombinasjonene med konvensjonelle bærere for dette formål, så som naturlige fett eller polyetylenglykol eller derivater derav.

Doseringsenheter som inneholder de nye forbindelsene kan fortrinnsvis inneholde 0,1-10 mg, for eksempel .1-5 mg av peptidet (I) eller salter derav.

Man kan stimulere benmargsdannelse ved å gi pasienten en effektiv mengde av et farmasøytisk preparat inneholdende de nye forbindelser.

De nye peptider kan også anvendes for fremstilling av materiale for immunologisk bestemmelsesteknikk. Peptidene kan da kovalent knyttes til en passende høymolekylær bærer, så som albumin, polylysin eller polyprolin for å injiseres i antistoff-produserende dyr (f.eks. kaniner, marsvin eller geiter). In vitro immuniseringsteknikk kan også benyttes. Antisera av høy spesifisitet oppnås ved å benytte velkjent absorbsjonsteknikk under bruk av høymolekylære bærere. Ved å introdusere radio-aktivitet (3H, 14C, <35>S) i peptidmolekylet, kan radioimmuno-assay lett utvikles og benyttes for å bestemme peptidet i forskjellige biologiske væsker som serum (plasma), urin og cerebrospinalvæske.

Peptidene kan i henhold til oppfinnelsen syntetiseres som følger: Generelt, vil forekommende reaktive sidekjede-grupper (amino, tiol og/eller karboksyl) måtte beskyttes under total-syntesens koblingsreaksjoner, og slutt-trinnet vil dermed bestå i å avspalte disse fra et beskyttet derivat med formel (I). Vanligvis vil samtlige -COOH-grupper, samtlige -NH2-grupper og

-NH-grupper av pyroglutamyl- eller prolinresten bli beskyttet. Slike beskyttede former av peptidene har den generelle formel

(II)

hvor A utgjør et hydrogenatom eller en amin-beskyttende gruppe;

en hydroksygruppe eller en karboksyl-blokkerende gruppe;

n og m utgjør uavhengig av hverandre heltallene 1 eller 2;

a og b utgjør uavhengig av hverandre heltallene 0 eller 1;

R1, R<2>, R8 og R<10> er amino, hydroksy, beskyttet amino eller karboksyl-beskyttende grupper;

R3, R4, R5, R6, R<7> og R<9> er hydrogenatomer eller amin-beskyttende grupper;

under den forutsetning at når A utgjør et hydrogenatom eller en amin-beskyttende gruppe og B utgjør en hydroksygruppe eller en karboksyl-blokkerende gruppe, da kan b ikke være 0.

Generelt, kan de beskyttede derivatene med formel (II) fremstilles ved hjelp av teknikk egnet for peptidsyntese.

En mulig syntesevei benytter cystin og kobler dette til de øvrige aminosyrerester slik at de to identiske kjedene av dimeret bygges opp og sammenkobles via den disulfid-binding som allerede forefinnes i cystin. En alternativ strategi består i å syntetisere den korresponderende monomere forbindelse i S-beskyttet form, ved å benytte S-beskyttet cystein, fjerne den S-beskyttende gruppe og foreta dimerisering. Det er mulig å benytte S-beskyttende grupper som kan fjernes ved hjelp av oksydasjonsmidler som danner en disulfid-binding direkte i det trinn hvor beskyttelsesgruppen avspaltes. Således kan for eksempel tritylgrupper fjernes selektivt med jod, fortrinnsvis i et egnet oppløsningsmiddel så som dimetylformamid. Slik dimerisering kan foretas på den C- og N-beskyttede monomer, etterfulgt av fjerning av de C- og N-beskyttende grupper, eller kan utføres som det avsluttende syntesetrinn ved å benytte en monomer med formel (III)

hvor A, B, n, m, a, b, R og R' er som ovenfor definert og R" er et hydrogenatom eller en tiol-beskyttende gruppe som kan fjernes under oksyderende betingelser.

Ved oppbygging av peptidkjedene, kan man prinsipielt

starte i C-enden eller N-enden selv om kun metoder hvor det startes i C-enden er i vanlig bruk.

Man kan således starte i C-enden ved å omsette et passende beskyttet derivat av for eksempel lysin med et passende beskyttet derivat av cystein eller cystin. Lysinderivatet vil ha en fri a-aminogruppe mens den andre reaktanten vil ha enten en fri eller aktivert karboksylgruppe og en beskyttet aminogruppe. Etter kobling kan mellomproduktet renses, for eksempel ved kromatografi, og deretter selektivt befris for N-beskyttelsen for å muliggjøre addisjon av ytterligere en aminosyrerest.

Denne fremgangsmåte fortsettes inntil den nødvendige aminosyre-sekvens er fullført.

Karboksylsyre-aktiverende substituenter som kan benyttes innbefatter for eksempel symmetriske eller blandede anhydrider eller aktiverte estere så som p-nitrofenylester, 2,4,5-triklor-fenylester, N-hydroksybenzotriazolester (OBt) eller N-hydroksy-succinimidylester (OSu).

Koblingen av frie amino- og karboksylgrupper kan for eksempel utføres ved å benytte dicykloheksylkarbodiimid (DCC). Et annet koblingsmiddel som for eksempel kan benyttes er N-etoksykarbonyl-2-etoksy-l,2-dihydrokinolin.

I alminnelighet er det hensiktsmessig å foreta koblings-reaksjonene ved lave temperaturer, for eksempel ved -20°C

opptil romtemperatur, hensiktsmessig i et egnet oppløsnings-middelsystem, for eksempel i tetrahydrofuran, dioksan, dimetylformamid, metylenklorid eller en blanding av disse oppløsnings-midlene.

Det kan være mer hensiktsmessig å foreta syntesen i fast fase på en resin-bærer. Klormetylert polystyren (kryssbundet med 1% divinylbenzen) er en anvendelig bærertype. I dette tilfelle vil syntesen starte i C-enden, for eksempel ved å

koble N-beskyttet lysin til bæreren.

En rekke egnede fastfase-teknikker er beskrevet av Eric Atherton, Christopher J. Logan og Robert C. Sheppard, J. Chem. Soc., Perkin I, 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng og

R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 102. 6117-27 (1980); James P. Tam, Richard D. Dimarchi & R. B. Merrifield, Int. J. Peptide

Protein Res 16, 412-2 5 (1980); Manfred Mutter & Dieter Bellof, Helvetica Chimica Acta, 67, 2009-16 (1984).

Et bredt utvalg av beskyttende grupper for aminosyrer er kjent og eksempler finnes i Schroder E. & Liibke, K. , The Peptides, Vol. 1 og 2, Academic Press, New York og London, 1965 og 1966; Pettit, G.R., Synthetic Peptides, Vol. 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 og 1976; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, Bd. 15, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974; Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 4-8, The Chemical Society, London 1972, 1974, 1975 og 1976; Peptides, Synthesis-physical data 1-6, Wolfgang Voelter, Eric Schmidt-Siegman, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, NY. 1983; The Peptides, Analysis, synthesis, biology 1-7, Ed: Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY. San Fransisco, London; Solid phase peptide synthesis 2.utg. John M. Stewart, Janis D. Young, Pierce Chemical Company.

Amin-beskyttende grupper som kan anvendes innbefatter således for eksempel slike beskyttelsesgrupper som karbobenzoksy (heretter også betegnet Z), t-butoksykarbonyl (heretter også betegnet Boe), 4-metoksy-2,3,6-trimetylbenzensulfonyl (heretter også betegnet (Mtr) og 9-fluorenylmetoksykarbonyl (heretter også betegnet Fmoc). Det er klart at når peptidet bygges opp fra C-enden, vil det være en amin-beskyttende gruppe på a-aminogruppen i hver ny rest som tilkobles og som må fjernes selektivt før det neste koblingstrinn. En spesielt egnet gruppe for denne midlertidige amin-beskyttelse er Fmoc-gruppen som kan fjernes selektivt ved behandling med piperidin i et organisk oppløsningsmiddel.

Karboksyl-beskyttende grupper som for eksempel kan anvendes innbefatter lett avspaltbare estergrupper, så som benzyl (Bzl), p-nitrobenzyl (ONb), pentaklorfenyl (OPC1P), pentafluorfenyl (OPFP) eller t-butyl (OtBu) grupper, samt koblingsgruppene på faste bærere, for eksempel metylgrupper bundet til polystyren.

Tiol-beskyttende grupper innbefatter p-metoksybenzyl (Mob), trityl (Trt) og acetamidometyl (Acm).

Dessuten forekommer et bredt område av andre slike grupper, som for eksempel mer utførlig beskrevet i de ovenfor nevnte litteraturreferanser, og bruken av samtlige slike grupper i de beskrevne fremgangsmåter faller innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Et bredt utvalg av fremgangsmåter for å fjerne amin- og karboksyl-beskyttende grupper foreligger. Disse må imidlertid være i overensstemmelse med den valgte syntetiske strategi. Sidekjede-beskyttende grupper må være stabile overfor de betingelser som benyttes for å fjerne de midlertidge cx-amino-beskyttende grupper før neste koblingstrinn.

Amin-beskyttende grupper så som Boe og karboksyl-beskyttende grupper så som tBu, kan fjernes samtidig ved syrebehandling, for eksempel med trifluoreddiksyre. Tiol-beskyttende grupper så som Trt, kan fjernes selektivt ved bruk av et oksydasjonsmiddel som jod.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere.

Oppløsningsmidler ble redestillert fra handelsprodukter og oppbevart på følgende måte: dimetylformamid (DMF) over molekylar-sikt 4Å, diklormetan (DCM) over CaCl2» trietylamin (TEA) over Na/Pb-legering (Baker) og trifluoreddiksyre (TFA) over molekylar-sikt 4Å.

TLC-systemene var som følger:

Sx: silika/CHCl3:MeOH (98:2)

S2: " " " (95:5)

S3: silika RP 8/0,1% TFA i 5% EtOH (aq.).

De rensede sluttproduktene ble analysert ved omvendt-fase høytrykks væskekromatografi (HPLC). HPLC-systemet besto av en HP 1090M kromatograf med innbygget automatisk prøvetaker og en HP 1040 diode-array (Hewlett-Packard, Waldbronn, FRG), og en supelcosil LC-18 kolonne (250 x 4,6 mm, 5 p partikler). Prøver ble oppløst i 0,1% (vol./vol.) TFA (aq.) og eluert med en lineær gradient fra 0 til 30% acetonitril i 0,1% TFA (aq.). Strømningshastigheten var 2 ml/min. Eluenten ble målt ved

214 nm med en båndbredde på 4 nm. Kromatogrammet for oppløsnings-midlet ble subtrahert elektronisk, og resultatene ble presentert i form av arealprosent.

Aminosyre-analyse:

De cystin-holdige peptidene ble oksydert med permaursyre for å omdanne det syrelabile cystin-residuet til den syrestabile cysteinsyre, før sur hydrolyse i 6M HC1 ved 110°C i 16 timer.

De tørre hydrolysatene ble deretter derivatisert ved bruk av fenylisotiocyanat og analysert som beskrevet av Heinrikson (Anal. Bioch. 136. 65-74, 1984).

Eksempel 1

fpGlu- Glu- Asp- Cys- Lys)o

( Fmoc- Cys- Lvs( Nc- Boc)- OtBu)2 ^ :

2 g (2,275 mM) (Fmoc-Cys-OSu)2, 2,18 g (5,0 mM) Lys(Nc-Boc)-OtBu.HCl og 0,58 g (5 mM) N-etyl-morfolin ble oppløst i

7,5 ml DMF og omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Reaksjons-blandingen ble inndampet til tørrhet under redusert trykk. Residuet ble oppløst i 50 ml CHCI3 og vasket med 3 x 12 ml 0,1N HC1 og 3 x 12 ml IM NaCl. Det organiske lag ble filtrert

gjennom et faseseparasjons-papir (Whatman) og inndampet til tørrhet under redusert trykk.

Råproduktet (3,32 g) ble omkrystallisert fra 5 ml varm

MeOH (15 timer), filtrert, vasket med MeOH og eter og lufttørket. Utbytte: 1,75 g (61%). Det hvite faststoff oppviste en hovedflekk (UV254+, Cl2/dikarboksidin+, ninhydrin-) på TLC (S^ Rf=0,667, S2: Rf=0,829).

Cvs- Lys( Nc- Boc)- OtBu)o ( 2):

1,5 g (1,19 mM) av forbindelse (1) ble oppløst i 10 ml 20% piperidin i DMF og omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. TLC (S2) viste at alt utgangsmateriale var oppbrukt og bare ett nytt produkt (U<V>254~, Cl2/dikarbosidin+, ninhydrin+) var dannet. Oppløsningsmidlet ble inndampet under redusert trykk. Residuet ble oppløst i 20 ml eter og vasket med 2 x 3 ml 0,1N HC1 og 3 ml IM NaHCC^. Det organiske lag ble filtrert gjennom et faseseparasjons-papir og inndampet til tørrhet.

Utbytte: 1,2 g. TLC oppviste bare én ninhydrin-positiv komponent (S2: Rf=0,216).

( Fmoc- Asp( P- OtBu)- Cvs- Lvs( Nc- Boc)- OtBu)2 f3^ ;

Ca. 1,19 mM av forbindelsen (2) og 1,32 g (2,6 mM) Fmoc-Asp(P-OtBu)-OSu ble oppløst i 6 ml CH2C12 og omrørt ved romtemperatur i 2 timer. TLC (S^ viste at alt ninhydrin-positivt materiale var oppbrukt og at ett nytt hoved-UV254-positivt produkt var dannet. Etter inndampning ble residuet oppløst i 30 ml EtOAc, vasket med 4 x 10 ml IM NaCl, filtrert og inndampet som beskrevet for (1). Råproduktet ble oppløst i eter (2,5 ml) og utfelt som et halvkrystallinsk faststoff ved tilsetning av 4 ml n-heksan (kjøleskap 16 timer). Oppløsnings-midlet ble fradekantert, produktet vasket med 5 ml n-heksan og tørket under redusert trykk.

Utbytte: 1,272 g (67%). TLC oppviste en hovedflekk (UV254+, Cl2/dikarboksidin+, ninhydrin-, S^ Rf=0,333, S2 :Rf=0 ,658) .

( Asp( P- OtBu)- Cvs- Lys( Nc- Boc)- OtBu)2 ( 4>;

1,0 g (0,62 mM) av forbindelse (3) ble oppløst i 5 ml 20% piperidin i CH2C12 og behandlet som beskrevet for (2). Utbytte: 0,469 g (65%). TLC oppviste bare en ninhydrin-positiv flekk (S2: Rf<=>0,22).

( Fmoc- Glu( - OtBu)- Asp( P- OtBu)- Cys- Lvs( Nc- Boc)- OtBu)2 ( 5): 0,469 g (0,407 mM) av forbindelse (4) og 0,47 g (0,90 mM) Fmoc-Glu( -OtBu)-OSu ble oppløst i 5 ml CH2C12 og omrørt ved romtemperatur i 15 timer. Opparbeidningen var som for (3). Utbytte: 0,62 g (77%). TLC oppviste en hovedflekk (UV254+, Cl2/dikarboksidin+, ninhydrin-, (S^ Rf=0,312, S2: Rf=0,536).

( Glu( - OtBu)- Asp( P- OtBu)- Cys- Lvs( Ne- Boe)- OtBu)3 ( 6):

0,50 g (0,25 mM) av forbindelse (5) ble oppløst i 2,5 ml 2 0% piperidin i CH2C12 og behandlet som beskrevet for (2).

TLC oppviste bare en ninhydrin-positiv flekk (S2: Rf=0,154).

( pGlu- Glu( - OtBu)- Asp( P- OtBu)- Cys- Lvs( Nc- Boc)- OtBu)2 ( 7):

Ca. 0,25 mM av forbindelse (6) og 0,206 g (0,546 mM) pGlu-0PC1P ble oppløst i 2,5 ml DMF og omrørt ved romtemperatur i 15 timer. Opparbeidningen var som for (3).

Utbytte: 0,259 g (59%). TLC oppviste bare en flekk UV254_, ninhydrin- og Cl2/dikarboksidin+ (S2: Rf=0,117) og kun spor av urenheter.

( pGlu- Glu- Asp- Cys- Lys)2 ( 8):

0,110 g (0,063 mM) av forbindelse (7) ble oppløst i 5 ml 80% TFA (CH2C12) og omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. Oppløsningsmidlet ble fordampet og residuet oppløst i 4 ml H20

+ 2 ml CHCI3. Vannfasen ble vasket med 2 x 3 ml CHCI3 og inndampet til tørrhet under redusert trykk. Råproduktet (0,050 g) ble renset på en Lobar (A) RP 8 kolonne (Merck) under eluering med 0,1% TFA i 7,5 EtOH (aq.). Etter lyofilisering av produktet, ble det rekromatografert på den samme kolonnen under eluering med 0,1% TFA i 5% EtOH (aq.). Produktet ble lyofilisert. Utbytte: 0,016 g. Det ninhydrin*, Cl2/dikarboksidin+ og UV254-produkt var homogent ifølge TLC, (S3: Rf=0,436), og kun spor av urenheter ble påvist ved HPLC.

Aminosyre-analyse: Asp (1,02), Glu (1,91), Cys (1,08), Lys (0,93).

Eksempel 2

(Cys-Lys)2, (9):

Forbindelse (2) fra Eksempel 1 ble oppløst i TFA og omrørt ved romtemperatur i 40 minutter. Oppløsningsmidlet ble fordampet under redusert trykk (30°C), og den vann-oppløselig del av residuet ble kromatografert på en Lobar (B) RP 8 kolonne (Merck) ved bruk av 0,1% TFA (aq.) i 5% EtOH (aq.) som mobil fase med UV220 deteksjon. Fraksjoner inneholdende det rene produkt (TLC) ble samlet og lyofilisert. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,57) og ga positiv reaksjon med ninhydrin-og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 93,5% rent (areal). Aminosyre-analyse: Cys (1,01), Lys (0,99).

Eksempel 3

(Asp-Cys-Lys)2, (10):

Forbindelse (4) behandlet som beskrevet i Eksempel 2 (2% EtOH i mobil fase) ga forbindelse (10). Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,64) og ga positiv reaksjon med ninhydrin-og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 97,9% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (0,99), Cys (1,03), Lys (0,98).

Eksempel 4

(Glu-Asp-Cys-Lys)2, (11) :

Forbindelse (6), behandlet som beskrevet i Eksempel 2, ga forbindelse (11). Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,83) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 100% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,08), Cys (0,97), Glu (0,98), Lys (0,98).

Eksempel 5

(pGlu-Glu-Asp-Cys)2, (12):

Forbindelse (12) ble syntetisert som monomer etter den kontinuerlig fastfase-peptidsyntese ved å benytte en Biolynx 4170 automatisk peptidsyntetisator (LKB) og DMF som oppløsnings-middel.

Reagenser: FMOC-Cys(Trt)-SASRIN-RESIN (Bachem); Fmoc-Asp(P-OtBu)-OPFP; FM0C-Glu( -OtBu)-OPFP; pGlu-OPCLP; HOBT som katalysator. FMOC ble fjernet etter hvert koblingstrinn med 20% piperidin i DMF. Disulfidbroen og dermed dimeren ble dannet ved å behandle det fullstendig beskyttede peptid på den faste bærer med 0,1M jod (2-3 ekv.) i DMF i 15 minutter. Etter vasking med DMF ble peptidet løst fra den faste bærer og gjenværende beskyttelses-grupper fjernet i ett trinn ved behandling med 50% TFA i CH3C1 i 40 minutter. Resinet ble frafiltrert og filtratet inndampet til tørrhet under redusert trykk (30°C). Residuet ble oppløst i 0,1% TFA (aq.) og kromatografert på en Lobar (B) RP 8 kolonne ved bruk av 0,1%

TFA (aq.) i 4% propan-2-ol (aq.) som mobil fase med UV22q deteksjon. Fraksjoner inneholdende rent produkt (HPLC) ble samlet og lyofilisert. Produktet ga ingen reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 96,9% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,15), Cys (0,99), Glu (1,85).

Eksempel 6

(pGlu-Glu-Cys-Lys)2 , (13):

Forbindelse (13) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Reagenser ikke beskrevet tidligere: FMOC-Lys(Nc-BOC)-SASRIN-RESIN; FMOC-Cys(S-Trt)-OPFP. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,49) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon.

HPLC-analyse: 100% rent (areal). Aminosyre-analyse: Cys (1,01), Glu (1,98), Lys (1,01).

Eksempel 7

(pGlu-Asp-Cys-Lys)2, (14) :

Forbindelse (14) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,55) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon.

HPLC-analyse: 97,5% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,04), Cys (0,96), Glu (0,97), Lys (1,02).

Eksempel 8

(pGlu-Asp-Glu-Cys-Lys)2, (15):

Forbindelse (15) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,42) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254~absorbsjon.

HPLC-analyse: Asp (1,03), Cys (0,96), Glu (2,09), Lys (0,94).

Eksempel 9

(pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)2» (16):

Forbindelse (16) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,38) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254~absorbsjon.

HPLC-analyse: 100% rent (areal).

Aminosyre-analyse: Asp (2,06), Cys (0,98), Glu (0,98), Lys (0,98) .

Eksempel 10

(pGlu-Glu-Glu-Cys-Lys)2 , (17):

Forbindelse (17) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,39) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon.

HPLC-analyse: 99,9% rent (areal). Aminosyre-analyse: Cys (0,95), Glu (2 ,90) , Lys (1,15).

Eksempel 11

(pGlu-Glu-Asn-Cys-Lys)2 » (18).

Forbindelse (18) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Reagenser ikke beskrevet tidligere: FMOC-Asn-OPFP. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,42) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 98,2% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asx (1,1), Cys (1,03), Glu (1,9), Lys (0,96).

Eksempel 12

(pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys)2, (19:

Forbindelse (19) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Reagenser ikke beskrevet tidligere: FMOC-Gln-OPFP. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,45) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 98,3% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,09), Cys (1,06), Glx (1,89), Lys (0,96).

Eksempel 13

(pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)2. (20):

Forbindelse (20) ble syntetiset og renset (5% propan-2-ol

i mobil fase) som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de relevante aminosyrederivater. Den endelige fjerning av beskyttelsesgruppene ble utført i 10% tioanisol i TFA.

Reagenser ikke beskrevet tidligere: FMOC-Arg(Mtr)-SASRIN-RESIN. Produktet ga ingen reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon.

HPLC-analyse: 99,4% rent (areal). Aminosyre-analyse: Arg (0,92), Asp (1,12), Cys (1,00), Glu (1,96).

Eksempel 14

(Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)2 , (21):

Forbindelse (21) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de relevante aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,57) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon.

HPLC-analyse: 94,7% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,00), Cys (1,01), Glx (2,02), Lys (0,96).

Eksempel 15

(Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)2, (22):

Forbindelse (22) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de relevante aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,57) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon.

HPLC-analyse: 98,2% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,06), Cys (1,01), Glu (0,99), Lys (0,99), Pro (0,96).

Claims (3)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser med formel (I): hvor samtlige aminosyre-enheter har L-konfigurasjon, A utgjør eller et hydrogenatom; B utgjør eller en hydroksygruppe; n og m utgjør uavhengig av hverandre heltallene 1 eller 2; a og b utgjør uavhengig av hverandre heltallene 0 eller 1; R, R' og R" utgjer uavhengig av hverandre en hydroksygruppe eller en aminogruppe; og de fysiologisk akseptable salter derav, under den forutsetning at når A og B utgjør henholdsvis et hydrogenatom og en hydroksygruppe, kan B ikke være 0, karakterisert ved at a) beskyttelsesgruppene fjernes fra en forbindelse med formel (II) hvor A utgjør et hydrogenatom eller en amin-beskyttende gruppe; B utgjør en hydroksygruppe eller en karboksyl-blokkerende gruppe; n og m utgjør uavhengig av hverandre heltallene 1 eller 2; a og b utgjør uavhengig av hverandre heltallene 0 eller 1; R1, R<2>, R<8> og R<10> er amino, hydroksy, beskyttet amino eller karboksyl-beskyttende grupper; R3, R4, R5, R<6>, R<7> og R<9> er hydrogenatomer eller amin-beskyttende grupper; under den forutsetning at når A utgjør et hydrogenatom eller en amin-beskyttende gruppe og B utgjør en hydroksygruppe eller en karboksyl-blokkerende gruppe, da kan b ikke være 0, idet fjerningen av beskyttelsesgruppene fortrinnsvis skjer ved sur hydrolyse, ved hydrogenolyse, ammonolyse eller enzymatisk hydrolyse, eller b) en forbindelse med formel (III) hvor A, B, n, m, a, b, R og R' er som ovenfor definert og R" er et hydrogenatom eller en tiol-beskyttende gruppe som kan fjernes under oksyderende betingelser, dimeriseres, og eventuelt omdannes den fremstilte forbindelse til et fysiologisk akseptabelt salt.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av forbindelser som er karakterisert ved at dot anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av forbindelsen (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)2, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende utgangsmaterialer.