NO162347B - Fremgangsmaate for enzymatisk hydrolyse av raffinose. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for enzymatisk hydrolyse av raffinose i forbindelse med fremstil-e

ling av sukker, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at reaksjonen gjennomføres ved hjelp av:

a) celler,

b) urenset eller renset enzymholdig ekstrakt fra de nedbrutte cellene, c) immobiliserte enzymer oppnådd ved en kombinering av enzymet med makromolekylære forbindelser ved dannelse av

kjemiske bindinger med grunnmassen eller ved hjelp av

ionebinding eller ved fysikalsk immobilisering, eller

d) en fysikalsk immobilisering av cellene, erholdt fra Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus NRRL Y 12056

eller Saccharomyces cerevisiae var. oleaginosus NRRL Y 12057.

Alfa-galaktosidase-enzym, (E.C 3.2.1.22) som anvendes ved fremgangmåten i henhold til oppfinnelsen fremstilles ved dyrking av mikroorganismer av slekten Saccharomyces.

Raffinose, et trisakkarid som forekommer i betydelige mengder i sukkerroer, hindrer krystallisering av sukrose og ekstrak-sjonsutbyttene nedsettes således. Dette forhold er et alvorlig økonomisk problem for sukkerfabrikker, slik at hydrolyse av raffinose blir en nødvendighet både for å forbedre kvaliteten og virkningsgraden for prosessen med krystallisering av det ekstraherte sukker.

Mange publikasjoner beskriver enzymatiske prosesser for hydrolyse av raffinose, under anvendelse av enzymer ekstra-hert fra et antall arter av mikroorganismer av slektene Absidia, Aspergillus, Bacillus, Circinella, Escherichia, Micrococcus, Mortierella, Penicillium og andre.

Når man imidlertid dyrker mange mikroorganismer inneholder celleekstrakten ikke bare alfa-galaktosidase, men også invertase slik at ved behandling av sukkerroe-melasse er hydrolysen av raffinose uønsket fulgt av hydrolyse av sukrose. Den vesentlige fordel ved fremgangsmåte i henhold til den foreliggende oppfinnelse er at den mikroorganisme som utvelges og hører til slekten Saccharomyces betyr en gunstig kombinasjon, med fordel av en dyrkningstid som er positivt forkortet i forhold til de sopparter som har den egenskap at de har en høy alfa-galaktosidase aktivitet uten noen invertase aktivitet.

Disse mikroorganismer som er blitt isolert fra avfallsvannet fra olivenoljemøller i Monterotondo (Roma, Italia)-området har blitt klassifisert som Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus og Saccharomyces cerevisiae var. oleaginosus og er deponert i Nothern Regional Center of the US Department of Agriculture, Peoria, III, hvor de er blitt tildelt de respektive nummerbetegnelser NRRL Y 12056 og NRRL Y 12057.

Deres dyrkningsmessige, morfologiske og fysiologiske karakteristiske egenskaper er gjengitt herunder.

A. Dyrkningsmessige egenskaper.

1. Fast medium (3 døgn) : Maltagar

Koloniene har smøraktig fløtefarget glans.

2. Flytende medium (3 døgn): Maltekstrakt Sediment dannes ( i S. cerevisiae var. oleaginosus observeres en svak ring)

B Morfologiske egenskaper

1. Egenskaper av de vegetative celler: Cellene er ellipsoi-dale, sylindriske og enkelte ganger langstrakt. 2. Dannelse av pseudomycelium eller virkelig mycelium. Et rudimentert pseudomycelium er til stede under anaerobe betingelser.

C Seksuelle egenskaper

De vegetative celler omdannes direkte til asci som inneholder fra en til fire kuleformede sporer.

D Fysiologiske egenskaper

1. Utnyttelse av karbonkilder:

a) Gjæring:

b) Assimilering av:

De andre karbonforbindelser assimileres ikke.

2. Assimilering av nitrogenholdige forbindelser:

Kaliumnitrat: negativ

3. Vekst ved 37°C: Positiv

For klassifiseringen, et det beskrivende skjema av J.P. Van de Walt "The Yeasts", annen utgave, utgitt av J. Lodder blitt fulgt.

Kulturene av de stammer som hører inn under oppfinnelsen kan fremstilles under aerobe betingelser ved hvilken som helst av de kjente metoder, f. eks i dyrkningsoverflater, eller foretrukket i neddykkede kulturer under anvendelse av omrørte gjæringskar.

Et dyrkningsmedium som enten kan være fast eller flytende inneholder en kilde for assimilert karbon, en kilde for nitrogen og mineralsalter.

Som karbonkilder kan glukose, melibiose, raffinose og andre sukkerarter, samt glycerol og natriumacetat anvendes.

Som nitrogenkilder kan uorganiske og organiske nitrogenfor-bindelser som kjøttekstrakt, gjærekstrakt, pepton, tripton, aminosyre, kaseinhydrolysater, soyabønnemel og andre ammoniumsalter anvendes.

En annen vesentlig fordel som skriver seg fra anvendelsen av angjeldende mikroorganismer er det forhold at enzymet synte-tiseres ved dyrking på glukose (enzymet er konstitutivt).

Et passende dyrkningsmedium har f. eks følgende sammensetning:

pH-området for dyrkningen er fra 4 - 7 og er foretrukket fra 5,0 - 5,5 og temperaturen er mellom 25°C og 28°C.

Enzymsyntesen kan påskyndes ved tilsetning av små mengder melibiose, som det vil være kjent er det disakkarid som skriver seg fra den delvise hydrolyse av raffinose. Melibiose kan direkte tilsettes til dyrkningsmediet før inokuleringen, eller i stasjonær fase. Induksjonstiden kan variere fra 16 timer til 72 timer og er foretrukket mellom 40 timer og 48 timer. De celler som samles under gjæringen eller etter avslutningen av denne kan anvendes som sådanne eller i tørr pulverform. Som et alternativ kan urensede eller rensede ekstrakter av slike celler anvendes.

For dette formål nedbrytes cellene med hvilken som helst kjent metode og det urensede eller det rensede ekstrakt anvendes.

Til sist skal det nevnes at ytterligere teknisk og økonomisk forbedring kan oppnås ved som nevnt å immobilisere enzymet ved å kombinere det med makromolekylære forbindelser, ved dannelse av kjemiske bindinger med grunnmassen, eller ved hjelp av ionebinding, eller også ved fysikalsk immobilisering av enzymet eller cellene.

Cellene oppnådd på denne måte tilsettes som sådanne eller i immobilisert form til en reaksjonsblanding som inneholder melasse med pH fra 4 - 7 og ved en temperatur fra 30°C til 60°C. Raffinosen som inneholdes i melasse hydroliseres derved til galaktose og sukrose, og utbyttet av det sistnevnte blir derved forbedret.

De følgende eksempler illustrerer de vesentlige sider ved oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Det fremstilles en dyrkningsbuljong med følgende sammensetning:

Disse forbindelser oppløses i deionisert vann og surgjøres til pH 3,5 med saltsyre.

Det således fremstilte dyrkningsmedium ble fordelt i tykkhalsede 500 ml Erlenmeyerkolber (100 ml buljong pr kolbe, sterilisering ved 116°C i 30 minutter). Kolbene ble inokulert med 1 ml av en kultur av Saccharomyces cervisiae var. oleaceus-stammen i 250 ml kolber inneholdende 50 ml av den samme dyrkingsbuljong og veksten ble fremmet ved 25°C i løpet av 16 timer under omrøring (180 omdreininger pr minutt).

Gjæringskolbene ble anbragt for inkubasjon under omrøring (180 omdreininger pr minutt) ved 25°C.

Etter 40 timer fra inokuleringen ble cellene fra dyrkingsbuljongene samlet ved sentrifugering og vasket med fosfatbuffer (0,1 M, pH 5,6). Fra 100 ml dyrkingsbuljong ble det oppnådd 0,55 g tørkede celler.

De fuktige celler samlet fra 100 ml buljong ble oppslemmet på nytt i 100 ml fosfatbuffer (0,1 M, pH 5,6) og enzymaktivi-teten ble bedømt. 1 g tørkede celler inneholdt omtrent 1-10<7 >enzymenheter. Den enzymatiske aktivitet ble målt ved hjelp av følgende metode.

Til 1 ml bufret celledispersjon ble det tilsatt 4 ml fosfatbuffer (0,1 M, pH 5,6) og noen dråper toluen for å nedbryte celleveggene. Etter 15 minutter inkubasjon med omrøring ved 40°C ble dispersjonen tilsatt 10 ml av 1 % løsning (vekt/volum) melibiose i fosfatbuffer (0,1 M, pH 5,6)

Reaksjonen ble inkubert ved 40°C i 2 timer i et omrørt vannbad og ble avbrutt ved koking av prøvene tatt fra reaksjonsblandingen i 15 minutter.

Konsentrasjonen av glukose, fremstilt ved hydrolyse av melibiose under reaksjonen, ble bestemt ved hjelp av den kolori-metriske GOD-Perid metode etter Boehringer Mannheim GmbH. Den optiske densitet av de fargede prøver ble målt ved romtempertur i et Perkin-Elmer Coleman 5 5 spektrofotometer, med optis lysvei = 0,1 dm (desimeter) ved bølgelengde 436 nm.

Hvis man som en enhet definerer den mengde enzym som frembringer et mikrogram glukose i løpet av 2 timer under prøvebetingelsene angitt ovenfor, kan enheter enzym pr gram tørkede celler beregnes fra følgende formel:

hvori:

E2h er ^en optiske densitet av prøven målt etter 2 timer. Egh er den optiske densitet av prøven målt ved 0 timer. Estandard er den °Pt;i-s}ce densitet av en standard løsning av glukose inneholdende 18,2 mikrogram glukose pr milliliter.

C er gram tørkede celler i 100 ml dyrkingsbuljong.

EKSEMPEL 2

En dyrkingsbuljong ble fremstilt med følgende sammensetning:

De ovenfor angitte forbindelser ble oppløst i deionisert vann og pH ble innstilt til 5,3 ved hjelp av saltsyre.

Kulturer i slike buljonger, av stammen Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus, fremstilt som angitt i eksempel 1, ble inkubert under omrøring (orbital, 180 omdreininger pr minutt) ved 27°C. 39 timer fra inokuleringen ble dyrkingsbuljongcellene samlet ved sentrifugering og vasket med fosfatbuffer (0,1 M, pH 5,6) .

Fra 100 ml av dyrkingsbuljongen ble det oppnådd 0,546 g tørkede celler. Cellene samlet fra 100 ml buljong ble oppslemmet på nytt i 100 ml fosfatbuffer (0,1 M, pH 5,6) og ble målt med hensyn til enzymatisk aktivitet: 1 g tørkede celler inneholdt 9,4 • 10^ enzymenheter.

EKSEMPEL 3

Et dyrkningsmedium ble fremstilt med følgende sammensetning:

De ovenfor angitte forbindelser ble oppløst i deionisert vann og pH ble innstilt med saltsyre til 5,3.

Kulturer av stammen Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus, fremstilt som i eksempel 1, ble inkubert med orbital omrøring (180 omdreininger pr minutt) ved 27°C. 43 timer etter inokuleringen ble cellene fra dyrkingsbuljongene samlet ved sentrifugering og vasket med fosfatbuffer (0,1 M, pH 5,6). Fra 100 ml dyrkingsbuljong ble det oppnådd 0,594 g tørkede celler.

Cellene samlet fra 100 ml dyrkingsbuljong ble oppslemmet på nytt i 100 ml fosfatbuffer (0,1 M, pH 5,6) og ble målt med hensyn til enzymatisk aktivitet: 1 g tørkede celler inneholdt 1,6 • 10<7> enzymenheter.

EKSEMPEL 4

Et dyrkingsmedium ble fremstilt med følgende sammensetning:

De ovenfor anførte forbindelser ble oppløst i deionisert vann og pH ble innstilt til 5,3 med saltsyre.

Kulturer av Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus i en slik buljong, fremstilt som i eksempel 1, ble inkubert med orbital omrøring (180 omdreininger pr minutt) ved 29°C. 48 timer etter inokuleringen av kulturbuljongen ble cellene samlet ved sentrifugering og vasket med fosfatbuffer (0,1 M, pH 5,6). Fra 100 ml dyrkingsbuljong ble det oppnådd 0,365 tørkede celler. 6 ml dyrkingsbuljong ble tilsatt til 50 ml 35° Brix melasse, inneholdende 1,6 vekt% raffinose i forhold til totalt faststoffinnhold og ble innstilt til pH 5,2 med H2SO4. Behandlingen ble gjennomført ved ,40°C under omrøring i 16 timer. Konsentrasjonen av galaktose, et produkt fra hydrolysen av raffinose ved reaksjonen, ble bestemt ved hjelp av metoden Laktose/Galaktose UV-test av Boehringer Mannheim GmbH. Under betingelsene angitt ovenfor ble det fremstilt 153 mikromol galaktose, ekvivalent med hydrolyse av 30 % av totalt tilstedeværende raffinose.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for enzymatisk, hydrolyse av raffinose i forbindelse med fremstilling av sukker,karakterisert ved at reaksjonen gjennomføres ved hjelp av: a) celler, b) urenset eller renset enzymholdig ekstrakt fra de nédbrutte cellene, c) immobiliserte enzymer oppnådd ved en kombinering av enzymet med makromolekylære forbindelser ved dannelse av kjemiske bindinger med grunnmassen eller ved hjelp av ionebinding eller ved fysikalsk immobilisering, eller d) en fysikalsk immobilisering av cellene, erholdt fra Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus NRRL Y 12056 eller Saccharomyces cerevisiae var. oleaginosus NRRL Y 12057.