NO153988B - PROCEDURE FOR DETERMINING CELL TYPE OR COMPATIBILITY ON A FIXED MATRIX. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for bestemmelse av celletype eller forenlighet på en fast matrise. The present invention relates to a method for determining cell type or compatibility on a solid matrix.

For mange medisinske formål er det nødvendig å bestemme forenligheten mellom blod fra en giver og en pasient. Blodcelleforenligheten bestemmes ved en ikke-opptreden For many medical purposes, it is necessary to determine the compatibility between blood from a donor and a patient. Blood cell compatibility is determined by a non-appearance

av en immunologisk reaksjon mellom antistoffer i blod- of an immunological reaction between antibodies in the blood

serum hos en pasient og antigenet som er til stede i blodceller fra en giver. Hvis f.eks. blodcellene hos en pasient er av type A (dvs. har "A"-antigener på de røde blodceller), så vil serum fra en slik pasients blod ha anti-B-antistoffer, dvs. antistoffer som vil reagere med "BM<->celler. Hvis en slik pasient får "B"-blod, så vil det skje en immunologisk reaksjon mellom nevnte anti-B-antistoffer hos pasientens serum og B-antigenene i de røde blodceller fra giveren. En slik uforenlighet kan resultere i meget alvorlige tilstander p.g.a. en.intravaskulær hemolyse. serum of a patient and the antigen present in blood cells from a donor. If e.g. the blood cells of a patient are of type A (i.e. have "A" antigens on the red blood cells), then serum from such a patient's blood will have anti-B antibodies, i.e. antibodies that will react with "BM<-> cells. If such a patient receives "B" blood, then an immunological reaction will occur between said anti-B antibodies in the patient's serum and the B antigens in the red blood cells from the donor. Such an incompatibility can result in very serious conditions due to intravascular hemolysis.

Prøver på blodcellers type og forenlighet er vanligvis Blood cell type and compatibility tests are usually done

av to typer: (i) en prøve for å bestemme hvorvidt et spesifikt antistoff tilsatt cellene vil frembringe en agglutinering av disse, og (ii) en prøve for å bestemme hvorvidt et spesifikt antistoff som tilsettes de prøvede celler sammen med serumkomplement vil forårsake cellelysering. of two types: (i) a test to determine whether a specific antibody added to the cells will cause their agglutination, and (ii) a test to determine whether a specific antibody added to the sampled cells together with serum complement will cause cell lysis.

Den første av disse to typer prøver, dvs. agglutinering, refererer seg til en sammenklumping av blodceller som f.eks. inneholder type A-antigener, og hvor anti-A-antistoffer tilsettes i et fravær av komplement. A-antigenet og anti-A- antistoffene reagerer spesifikt med hverandre ved en immunologisk reaksjon hvor antistoffet danner broer mellom tilstøtende celler. Dette fører til en sammenbundet masse av blodceller som bindes til hverandre ved hjelp av de nevnte tilsatte antistoffer. The first of these two types of tests, i.e. agglutination, refers to a clumping of blood cells such as contains type A antigens, and where anti-A antibodies are added in the absence of complement. The A antigen and the anti-A antibodies react specifically with each other in an immunological reaction where the antibody forms bridges between adjacent cells. This leads to a connected mass of blood cells which bind to each other with the help of the aforementioned added antibodies.

Den andre av de to prøver som er nevnt ovenfor, dvs. cellelysering, angår opprivning eller oppløsning av celle-membranen som fører til en celledød, og som gjør at de frigir sitt indre innhold. "Cellelysering" er et resultat av en reaksjon som skjer mellom antistoffer som er bundet til cellemembranene og en gruppe potensielt destruk-tive proteiner i normalt serum (ofte kalles disse "komplement" . The second of the two tests mentioned above, i.e. cell lysis, concerns the tearing or dissolution of the cell membrane which leads to cell death, and which causes them to release their internal contents. "Cell lysis" is the result of a reaction that occurs between antibodies that are bound to the cell membranes and a group of potentially destructive proteins in normal serum (these are often called "complement".

Begge de ovenfor beskrevne fremgangsmåter brukes for ut-prøving av type og forenlighet i cellulære blodlegemer, dvs. erytrocytter, granulocytter, lymfocytter og trombocytter eller plater. Skjønt de ofte brukes bare kvalitativt, så er begge metoder reelt kvantifiserbare og har vært brukt separat for bedømmelse av antigen, antistoff og serumkomplement. Both of the methods described above are used for testing the type and compatibility of cellular blood cells, ie erythrocytes, granulocytes, lymphocytes and thrombocytes or platelets. Although they are often used only qualitatively, both methods are actually quantifiable and have been used separately for the assessment of antigen, antibody and serum complement.

I de fremgangsmåter som brukes i vanlige medisinske klinikker i dag for prøving av celletyper og deres forenlighet, så er både agglutineringsprøvene og celleoppløsnings-prøvene utført i en flytende fase, dvs. at serum som inneholder antistoffer med eller uten det komplement som skal prøves, blir blandet med suspensjoner av blodceller hvor man ønsker å få en utprøving av deres type og forenlighet. Vanligvis blir det brukt faste volumer. In the methods used in normal medical clinics today for testing cell types and their compatibility, both the agglutination tests and the cell dissolution tests are carried out in a liquid phase, i.e. that serum containing antibodies with or without the complement to be tested is mixed with suspensions of blood cells where one wants to get a test of their type and compatibility. Generally, fixed volumes are used.

En bedømmelse av resultatene etter en agglutineringsprøve krever at en teknikker eller lignende kvalifisert perso-nale kan skille mellom en celleagglutinering som skyldes nevnte spesifikke antigen-antistoff sammenbinding fra en ikke-spesifikk cellesammenklumping, hvor usammensatte krefter også kan forårsake en viss grad av sammenklumping. Nevnte teknikker må også være i stand til å skille frie uagglutinerte celler som kan være til stede fra sammenklumpede eller agglutinerte celler. Dette er en fremgangsmåte som krever meget erfarent personell eller meget kostbart utstyr eller instrumenter for nøyaktig partikkel-telling og fordeling på størrelse. Videre vil graden av spesifikk agglutinering i hvert enkelt tilfelle enten bli dårlig eller semi-kvantitativt, eller være meget kostbart og komplisert å utføre. An assessment of the results after an agglutination test requires that a technician or similarly qualified personnel can distinguish between a cell agglutination that is due to said specific antigen-antibody binding from a non-specific cell clumping, where uncompounded forces can also cause a certain degree of clumping. Said techniques must also be capable of distinguishing free unagglutinated cells that may be present from clumped or agglutinated cells. This is a method that requires very experienced personnel or very expensive equipment or instruments for accurate particle counting and size distribution. Furthermore, the degree of specific agglutination in each individual case will either be poor or semi-quantitative, or be very expensive and complicated to perform.

Skjønt det er utviklet visse instrumenterte prøver for utprøving &v røde blodcellers type ved agglutinering, så Although certain instrumented tests have been developed for testing the type of red blood cells by agglutination, so

er utstyret for disse fremgangsmåter både kostbart og komplisert å bruke. Det er f.eks. foreslått en anordning for prøving av røde blodceller i et instrument som brukes under navnet "Autoanalyzer" fremstilt av Berkman et al. og beskrevet i Transfusion, Vol. 11, nr. 6, side 317 og følgende (19 71). I nevnte Autoanalyzer blir blodprøver og serum med antistoffer kombinert under spesielle om-stendigheter i komplekse rørformede spiraler som er utformet slik at de skal frembringe en agglutinering. Den reagerte masse føres så forbi et T-rørledd med et av rørene i ned-advendt stilling, slik at de agglutinater som er blitt dannet, har tendens til å gå ned gjennom dette rør, og deretter fjernes. Agglutineringen kan så påvises ved å måle graden eller forskyvningen i optisk tetthet i den ikke-agglutinerte fraksjon som kommer ut i horisontal retning fra nevnte T-rør (Berkman et al.), eller ved å oppsamle agglutinatene fra den nedadvendte delen av T-røret på et filterpapir (Shield et al., Transfusion, Vol. 9, side 348, 1969). Apparatet er imidlertid komplekst og kostbart, og fører i seg selv ikke til en enkel og automatisk teknikk som er egnet for rutinebruk i blodbanker og lignende. the equipment for these procedures is both expensive and complicated to use. It is e.g. proposed a device for testing red blood cells in an instrument used under the name "Autoanalyzer" manufactured by Berkman et al. and described in Transfusion, Vol. 11, No. 6, page 317 et seq. (1971). In the aforementioned Autoanalyzer, blood samples and serum with antibodies are combined under special circumstances in complex tubular spirals which are designed so as to produce an agglutination. The reacted mass is then passed past a T-tube joint with one of the tubes in a down-facing position, so that the agglutinates that have been formed tend to go down through this tube, and are then removed. The agglutination can then be detected by measuring the degree or shift in optical density in the non-agglutinated fraction that emerges in a horizontal direction from said T-tube (Berkman et al.), or by collecting the agglutinates from the downward-facing part of the T-tube on a filter paper (Shield et al., Transfusion, Vol. 9, page 348, 1969). However, the apparatus is complex and expensive, and in itself does not lead to a simple and automatic technique that is suitable for routine use in blood banks and the like.

Et alternativt apparat er beskrevet under navnet "Groupa-matic" og koster flere hundre tusen dollar (se Garretta et al., Vox Sang, Vol. 27, side 241, 1974). I dette apparatet blir serum og blodcellesuspensjoner kombinert slik at man man får frembragt en agglutinering. Nærværet av agglutinering påvises ved å føre suspensjonen tvers over to lysstråler, hvorav den ene går gjennom sentrum av reaksjonskuvetten mens den andre går gjennom periferien. An alternative apparatus is described under the name "Groupa-matic" and costs several hundred thousand dollars (see Garretta et al., Vox Sang, Vol. 27, page 241, 1974). In this apparatus, serum and blood cell suspensions are combined so that an agglutination is produced. The presence of agglutination is detected by passing the suspension across two light beams, one of which passes through the center of the reaction cuvette while the other passes through the periphery.

En forskjell i transmisjonen av strålene tas som et mål A difference in the transmission of the rays is taken as a measure

for styrken på agglutineringen. Det er imidlertid nødvendig med meget avansert elektronisk utstyr, og dette betyr at instrumentet blir så kostbart at det faller utenfor rekke-vidde for de aller fleste blodbanker. for the strength of the agglutination. However, very advanced electronic equipment is required, and this means that the instrument becomes so expensive that it falls out of range for the vast majority of blood banks.

Prøver basert på en immunlysering er intet problem når reaksjonen på celleoverflaten mellom antigen og antistoff er effektiv med komplement, f.eks. for utprøving av vev. Dette er imidlertid meget sjeldent tilfelle med røde blodceller fra mennesker, hvor enten cellemembran antigen-antistoffkomplekset reagerer ineffektivt med komplement, eller antistoffkonsentrasjonen må være begrenset for å hindre en for intens agglutinering som mekanisk vil på-virke immunlyseringen. Samples based on an immunolysis are no problem when the reaction on the cell surface between antigen and antibody is effective with complement, e.g. for tissue testing. This is, however, a very rare case with red blood cells from humans, where either the cell membrane antigen-antibody complex reacts ineffectively with complement, or the antibody concentration must be limited to prevent too intense agglutination which will mechanically affect the immunolysis.

Slike problemer påvirker i høy'grad driften av blodbanker hvor selv en vanlig rutineutprøving av typer for røde blodceller er en tidskrevende manuell operasjon som krever vanligvis mer erfarent og utdannet personell enn det som er tilgjengelig. Videre er det relativt få blobanker som kan påta seg lymfocytologiske prøver som er nødvendig for utprøving av forskjellige typer vev. Det er videre ingen direkte immunologiske prøver som er,tilgjengelige for å bestemme forenligheten mellom granulocytter, og det er bare en indirekte prøve for blodplater såsom 14C-serotonin-frigjøring. (Skjønt granulocytter og blodplater til en viss grad kan betegnes HL-A-typer for visse utvalgte og passende prøver, så vil slik typeprøving ikke garantere deres forenlighet.) Such problems greatly affect the operation of blood banks, where even a normal routine testing of types for red blood cells is a time-consuming manual operation that usually requires more experienced and trained personnel than is available. Furthermore, there are relatively few blood banks that can undertake lymphocytological samples, which are necessary for testing different types of tissue. Furthermore, there are no direct immunological tests available to determine compatibility between granulocytes, and there is only an indirect test for platelets such as 14C-serotonin release. (Although granulocytes and platelets can be HL-A typed to some extent for certain selected and appropriate samples, such typing does not guarantee their compatibility.)

Man har nå i foreliggende oppfinnelse oppdaget at både agglutinering og celleoppløsningsprøver på blodceller hos mennesker i vesentlig grad kan forbedres når et monolag av reaktive celler irreversibelt bindes til en fast matrise. Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveie-bragt en fremgangsmåte for bestemmelse av celletype eller forenlighet på en fast matrise, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man (a) danner et første monolag av celler som irreversibelt bindes til en fast matrise, idet nevnte celler har egne eller ervervede antigener; (b) bringer nevnte lag (a) i kontakt med en oppløsning inneholdende antistoffer som kan bindes ved immunoadsorpsjon til nevnte første lag av celler, i den grad antistoffene i nevnte oppløsning er reaktive med antigenene i cellene i nevnte første lag; og (c) deretter måler graden av immunoadsorpsjon av nevnte antistoffer ved å påføre en annen oppløsning inneholdende lytisk komplement som lyserer cellene i laget (a) effektivt i nærvær av immunoadsorbert antistoff, og observerer graden av immunlysis som forekommer. It has now been discovered in the present invention that both agglutination and cell dissolution tests on blood cells in humans can be significantly improved when a monolayer of reactive cells is irreversibly bound to a solid matrix. According to the present invention, there is thus provided a method for determining cell type or compatibility on a solid matrix, and this method is characterized by (a) forming a first monolayer of cells which are irreversibly bound to a solid matrix, said cells have own or acquired antigens; (b) brings said layer (a) into contact with a solution containing antibodies which can be bound by immunoadsorption to said first layer of cells, to the extent that the antibodies in said solution are reactive with the antigens in the cells of said first layer; and (c) then measuring the degree of immunoadsorption of said antibodies by applying another solution containing lytic complement that effectively lyses the cells of layer (a) in the presence of immunoadsorbed antibody, and observing the degree of immunolysis that occurs.

Ved en irreversibel binding av celler til en fast matrise mener man binding av reaktive celler ved molekylære krefter, slik som en dannelse av kovalente kjemiske bindinger mellom posisjoner på celleoverflaten og reaktive grupper på substratet, eller ved at det dannes bindinger ved svakere molekylære krefter som van der Waal-krefter, kolumbiske krefter eller hydrogenbindinger som vil motstå effekten av de videre utprøvningsbetingelser. Ikke bare øker man sensi-tiviteten eller følsomheten ved prøvingen, men resultatet av immunreaksjonen lar seg lett måle ved enkle instrumenter. By an irreversible binding of cells to a solid matrix is meant the binding of reactive cells by molecular forces, such as the formation of covalent chemical bonds between positions on the cell surface and reactive groups on the substrate, or by the formation of bonds by weaker molecular forces such as van where Waal forces, Columbian forces or hydrogen bonds that will resist the effect of the further test conditions. Not only does one increase the sensitivity of the test, but the result of the immune reaction can be easily measured with simple instruments.

Som en enkel illustrasjon kan nevnte blodtypeprøver ut-føres i tre trinn: (1) Et encellet lag av erytrocytter (som er illustrasjon, så vil disse bli betegnet type A) bindes irreversibelt til til en fast matrise; (2) ved å bruke monolaget av celler som et immuno-adsorpsjonslag, blir antistoffer som anti-A-antistoffer påført og adsorbert spesifikt, og (3) de anti-stoffbelagte celler kan nå prøves for deres følsomhet As a simple illustration, said blood type tests can be carried out in three steps: (1) A single-celled layer of erythrocytes (which is an illustration, these will be designated type A) is irreversibly bound to a solid matrix; (2) by using the monolayer of cells as an immuno-adsorption layer, antibodies such as anti-A antibodies are applied and adsorbed specifically, and (3) the antibody-coated cells can now be tested for their sensitivity

for immunlysering ved komplement (fastfase-lysering). for immunolysis by complement (solid phase lysis).

Prøveresultatet kan bedømmes på enhver hensiktsmessig The test result can be judged on any appropriate

måte, f.eks. ved undersøkelse under et mikroskop, men det er av spesiell viktighet i foreliggende oppfinnelse at prøveresultatene er spesielt godt egnet for bedømmelse ved tetthetsmålingsteknikk hvor man bruker lett tilgjengelige standardinstrumenter. way, e.g. by examination under a microscope, but it is of particular importance in the present invention that the test results are particularly well suited for assessment by density measurement techniques where readily available standard instruments are used.

J?røving av_antigener ve d konkurr erende immunoa dsorpsjon Discovery of_antigens by competitive immunoadsorption

Denne prøve innbefatter følgende trinn (a) at man påfører en fast matrise en første suspensjon av celler som man vet bærer antigener som skal prøves, under slike betingel-ser at man effektivt og irreversibelt får bundet et lag av nevnte celler til nevnte matrise; (b) bringer nevnte lag (a) i kontakt med en blanding av (i) en oppløsning av et antistoff som lar seg reagere ved immunadsorpsjon med det antigen som bæres av cellene i nevnte lag (a), og (ii) en annen oppløsning eller suspensjon- som skal bedøm-mes for antigen ved konkurrerende hemmning av antistoffet i nevnte oppløsning (i):, og (c) deretter måler hvorvidt og hvor sterkt nevnte antistoff i oppløsning (i) er bundet ved immunadsorpsjon til nevnte lag (a). This test includes the following steps (a) applying to a solid matrix a first suspension of cells known to carry antigens to be tested, under such conditions that a layer of said cells is effectively and irreversibly bound to said matrix; (b) contacting said layer (a) with a mixture of (i) a solution of an antibody which reacts by immunoadsorption with the antigen carried by the cells of said layer (a), and (ii) another solution or suspension - which is to be assessed for antigen by competitive inhibition of the antibody in said solution (i):, and (c) then measures whether and how strongly said antibody in solution (i) is bound by immunoadsorption to said layer (a) .

I ovenstående fremgangsmåte kan graden av immunoadsorpsjon bestemmes ved en eller flere av de teknikker som generelt er beskrevet ovenfor. In the above method, the degree of immunoadsorption can be determined by one or more of the techniques generally described above.

Til tross for langvarige kliniske problemer forbundet med utprøving i blodbanker samt nødvendigheten av å forbedre fremgangsmåter og gjøre disse tilgjengelige for instrumen- Despite long-standing clinical problems associated with testing in blood banks as well as the need to improve procedures and make these available for instrument-

tering og automasjon, har det vært lite fremgang på tering and automation, there has been little progress on

feltet i de senere år. I en rekke år har man brukt de såkalte "Eldon"-kort for prøver av blodtyper. Disse kort er bl.a. beskrevet i US patent 2.770.572. Dette patent beskriver et prøvekort som kan brukes for prøving av typer i menneskeblod, hvor et bærende- ark bærer på forskjellige steder på overflaten tørkede prøver av forskjellige sera som inneholder antistoff-faktorer i en blanding med konglutinin eller konglutinin-erstatnings-stoffer. Når man utfører en blodtypeprøve ved hjelp av dette kort, blir blodprøver fra den pasient hvis blod man skal typebestemme, plassert i små dråper på de forskjellige serumflekker som finnes på kortet, og deretter under-søkt etter en passende reaksjonstid for nærvær av agglutinering. Prøvene er imidlertid begrenset til anti-A, field in recent years. For a number of years, the so-called "Eldon" cards have been used for samples of blood types. These cards are i.a. described in US patent 2,770,572. This patent describes a sample card that can be used for testing types in human blood, where a carrier sheet carries at different places on the surface dried samples of different sera containing antibody factors in a mixture with conglutinin or conglutinin substitutes. When performing a blood typing test using this card, blood samples from the patient whose blood is to be typed are placed in small drops on the various serum spots found on the card, and then examined for a suitable reaction time for the presence of agglutination. However, the samples are limited to anti-A,

anti-B og anti-Rh (RhQ eller D), og selv disse prøver er forbundet med betydelige tolkningsfeil. anti-B and anti-Rh (RhQ or D), and even these tests are associated with significant interpretive errors.

Mer nylig beskrives i US patent 3.666.421 et annet diag-nostisk prøveobjektglass hvor serologiske reagenser er plassert i dråper på prøveglasset og tørket til en flekk som deretter kan rekonstitueres og reageres i en agglutineringsreaksjon for identifikasjon av blodtype (eller andre antigen-antistoff-reaksjonssystemer som lar seg identifisere ved agglutinering). Det objektglass som er beskrevet i nevnte US patent har imidlertid visse defekter som er karakteristisk for vanlig flytende fase-agglutinering, idet prøven i alt vesentlig bare viser nærvær eller fravær av agglutinering og er avhengig av en bedømmelse av erfarent personell for å bestemme hvorvidt agglutineringen er et resultat av en spesifikk antigen-antistoff-reaksjon eller kun er et resultat av en ikke-spesifikk celleaggregering. Det er vanskelig å bedømme hvorvidt frie, uagglutinerte celler er til stede sammen med sammenklumpede celler i spesifikke agglutinater. More recently, US patent 3,666,421 describes another diagnostic specimen slide where serological reagents are placed in drops on the specimen slide and dried to a spot which can then be reconstituted and reacted in an agglutination reaction for identification of blood type (or other antigen-antibody reaction systems which can be identified by agglutination). However, the slide described in the aforementioned US patent has certain defects that are characteristic of ordinary liquid phase agglutination, as the sample essentially only shows the presence or absence of agglutination and is dependent on an assessment by experienced personnel to determine whether the agglutination is a result of a specific antigen-antibody reaction or is only a result of a non-specific cell aggregation. It is difficult to judge whether free, unagglutinated cells are present together with clumped cells in specific agglutinates.

I US patent 3.770.380 beskrives en anordning som er angitt US patent 3,770,380 describes a device which is indicated

å kunne bedømme immun-adhesjonsreaksjoner. Det skal imidlertid bemerkes at nevnte immun-adhesjonsreaksjoner som beskrives i dette US patent, skiller seg fra de immun-adsorps jonsfenomener på hvilke foreliggende oppfinnelse er basert. Immun-adhesjon er en ikke-spesifikk sammenklumping av partikler eller celler som skyldes nærværet av komplement, og i denne prøve er det komplementet som forårsaker bindingen. Immun-adhesjon er karakterisert ved ikke-spesifikke reaksjoner mellom komplementet og de partikler eller celler det binder. Immun-adsorpsjon er på den annen side en spesifikk binding mellom antigeniske posisjoner på en cellemembran og de antistoffer som måtte være til stede i et serum. Således er immunadsorpsjon i mot-setning til immunadhesjon en spesifikk blanding mellom antigener og antistoffer. to be able to judge immune-adhesion reactions. However, it should be noted that said immune-adhesion reactions described in this US patent differ from the immune-adsorption ion phenomena on which the present invention is based. Immune adhesion is a non-specific clumping of particles or cells due to the presence of complement, and in this sample it is the complement that causes the binding. Immune adhesion is characterized by non-specific reactions between the complement and the particles or cells it binds. Immune adsorption, on the other hand, is a specific binding between antigenic positions on a cell membrane and the antibodies that may be present in a serum. Thus, immunoadsorption, in contrast to immunoadhesion, is a specific mixture between antigens and antibodies.

Den anordning som er beskrevet i US patent 3.770.380 er The device described in US patent 3,770,380 is

en flat, cellelignende struktur som er belagt med suksessive lag av et bakterie- eller virusholdig materiale som et topplag, som er bundet til bunnen av cellestrukturen eller anordningen ved hjelp av et transparent tørket protein-underlag. Immun-adsorpsjonsreaksjoner mellom bakterier eller virus i det således preparerte lag og røde celler som har antistoff og komplement i en prøvevæske som påføres, kan så bedømmes ved å bestemme graden hvorved de spesielt fremstilte røde celler i den påførte væske fester seg til det bakterie- eller virusholdige topplag. De fremgangsmåter som er beskrevet i ovennevnte US patent har ikke funnet praktisk klinisk anvendelse p.g.a. at immun-adhesjon i seg selv ikke er særlig anvendbart, fordi immun-adhesjon er en ikke-spesifikk reaksjon som ikke er egnet for bedømmelse av spesifikke antigen-antistoffreaksjoner. a flat, cell-like structure that is coated with successive layers of a bacterial or viral material as a top layer, which is bonded to the bottom of the cell structure or device by means of a transparent dried protein substrate. Immune-adsorption reactions between bacteria or viruses in the thus prepared layer and red cells that have antibody and complement in a sample liquid that is applied can then be assessed by determining the degree to which the specially prepared red cells in the applied liquid adhere to the bacterial or virus-containing top layers. The methods described in the above-mentioned US patent have not found practical clinical application due to that immune adhesion in itself is not particularly applicable, because immune adhesion is a non-specific reaction that is not suitable for the assessment of specific antigen-antibody reactions.

Et lag av blodceller innleiret i et fast bærende lag er blitt brukt for visse vitenskapelige formål som ikke har noe å gjøre med blodtyper og prøving av forenlighet. Slike lag er ikke bundet ved kovalente eller andre molekylære krefter. Således beskriver Goodman (Nature, 193:350, 1962) en kolonne av formalinisert røde blodceller fra mennesker innleiret i polyuretan som han brukte for å fraksjonere anti-antistoffer fra røde blodceller hos mennesker på A layer of blood cells embedded in a solid support layer has been used for certain scientific purposes unrelated to blood typing and compatibility testing. Such layers are not bound by covalent or other molecular forces. Thus, Goodman (Nature, 193:350, 1962) describes a column of formalinized human red blood cells embedded in polyurethane which he used to fractionate anti-antibodies from human red blood cells on

basis av deres bindestyrke til de innleirede røde celler. Edelman et al. (Proe. Nat. Acad. Sei. 68:2153, 1971) frak-sjonerte blodceller på basis av deres evne til spesifikt å binde seg til lektiner, antistoffer eller antigener som på forhånd var bundet til partielt hydrolyserte nylon-fibre. basis of their binding strength to the embedded red cells. Edelman et al. (Proe. Nat. Acad. Sei. 68:2153, 1971) fractionated blood cells on the basis of their ability to specifically bind to lectins, antibodies, or antigens previously bound to partially hydrolyzed nylon fibers.

Prinsippet med å binde en prostetisk gruppe (i et The principle of binding a prosthetic group (in et

antigen, antistoff, enzym, etc.) til en fast matrise, er en velkjent og etablert biokjemisk metode (se Cuatrecases og Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40:259, 1971), og er meget anvendt i fastfase radioimmunoprøver (se Brit. Med. Bull., 30:1-103, 1974) . Imidlertid har blod eller andre celler ikke vært bundet irre versibelt til en fast matrise for å lette blodtypeprøving eller forenlighetsprøving, etc. antigen, antibody, enzyme, etc.) to a solid matrix, is a well-known and established biochemical method (see Cuatrecases and Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40:259, 1971), and is widely used in solid-phase radioimmunoassays (see Brit. Med. Bull., 30:1-103, 1974). However, blood or other cells have not been irreversibly bound to a solid matrix to facilitate blood typing or compatibility testing, etc.

Det er .i det etterfølgende gitt en beskrivelse av oppfinnelsen med hensyn til de nåværende brukte prøver med erytrocytter. Polystyren-prøverør ble belagt med fibrinogen (mengde 0,5 mg/ml) som binder irreversibelt. Etter vasking ble polylysin (0,1 mg)ml) påført den bundne fibrinogen. Etter ytterligere vasking tilførte man en suspensjon av enten normale eller proteasebehandlede erytrocytter (RBC) . Disse erytrocytter ble bundet irreversielt (for det formål at de skulle prøves) som et monolag på den polylysin-fibronogen-belagte polystyren-overflate. Bindingstettheten på 2 x 10 erytrocytter pr. cm 2 er i god overensstemmelse med det som kunne forventes for slike erytrocytter som har en diameter på 7 mikrometer. A description of the invention is given in the following with regard to the currently used samples with erythrocytes. Polystyrene test tubes were coated with fibrinogen (amount 0.5 mg/ml) which binds irreversibly. After washing, polylysine (0.1 mg) ml) was applied to the bound fibrinogen. After further washing, a suspension of either normal or protease-treated erythrocytes (RBC) was added. These erythrocytes were bound irreversibly (for the purpose of testing) as a monolayer on the polylysine-fibronogen-coated polystyrene surface. The binding density of 2 x 10 erythrocytes per cm 2 is in good agreement with what could be expected for such erythrocytes which have a diameter of 7 micrometres.

Monocellelaget til de bundne erytrocytter er stabilt og vil The monocell layer of the bound erythrocytes is stable and will

i sin tid kunne tjene som et immunadsorpsjonsmiddel for å binde antistoffer fra en påført oppløsning eller et serum som er spesifikt til antigeniske posisjoner på membranene i de bundne erytrocytter. in due course could serve as an immunoadsorbent to bind antibodies from an applied solution or serum specific to antigenic positions on the membranes of the bound erythrocytes.

Metoden for å binde blodceller som et monolag på en fast matrise er ikke nødvendigvis begrenset til ovennevnte formål. Den litteratur som beskriver kobling av proteiner til polymerer (se Cuatrecases og Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40: 259, 1971), indikerer at man som et alternativ kan bruke preparater av polymerer (flak av polyuretan, polystyren, etc.) som på sine overflater inneholder reaktive grupper som glutaraldehyd, cyanogenbromid, amino eller karboksyl-grupper, og andre som vil tillate en direkte kovalent binding av blodceller til matrisen. The method of binding blood cells as a monolayer on a solid matrix is not necessarily limited to the above purpose. The literature that describes the coupling of proteins to polymers (see Cuatrecases and Anfinsen, Annu. Rev. Biochem., 40: 259, 1971), indicates that as an alternative, preparations of polymers can be used (flakes of polyurethane, polystyrene, etc.) which on their surfaces contain reactive groups such as glutaraldehyde, cyanogen bromide, amino or carboxyl groups, and others that will allow a direct covalent binding of blood cells to the matrix.

Det er selvsagt at bindestoffet må være immunologisk in-aktivt med hensyn til eventuelle antigener eller antistoffer som kan være til stede i de prøveoppløsninger som skal anvendes . It goes without saying that the binder must be immunologically inactive with regard to any antigens or antibodies that may be present in the sample solutions to be used.

Andre substrater eller matriser som kan brukes i foreliggende oppfinnelse, kan være ethvert hensiktsmessig materiale som (1) er av en slik karakter at et monocellelag irreversibelt kan bindes slik det er beskrevet ovenfor, og (2) er egnet for å brukes med hensyn til den påvirningsmetode som skal brukes. Ettersom de fleste hensiktsmessige påvisningsmetoder er basert på lystransmisjon, såsom mikroskopisk telling og scanning med hensyn til tetthetsmåling, så er det foretrukket at man bruker et lystransparent substrat. Other substrates or matrices which may be used in the present invention may be any suitable material which (1) is of such a nature that a monolayer can be irreversibly bonded as described above, and (2) is suitable for use with respect to the influence method to be used. As most appropriate detection methods are based on light transmission, such as microscopic counting and scanning with regard to density measurement, it is preferred to use a light-transparent substrate.

Hvis man imidlertid skal bruke måling av radioaktivitet, If, however, measurement of radioactivity is to be used,

så er det selvsagt unødvendig å bruke et lystransparent materiale. then it is of course unnecessary to use a light-transparent material.

For det foreliggende formål kan substratet eller matrisen ganske enkelt være innersiden av et prøverør. Hvis en densiometrisk scanningmetode skal brukes for å bedømme prøveresultatene, så er det hensiktsmessig å bruke en flat overflate. Hvis man skal bruke prøving i stor skala, kan man bruke striper av matriser med cellebindende egenskaper for å fremstille det første cellelaget. Deretter kan antistoffer merkes og prøves for sin kapasitet til å understøtte en immunlysering i nærvær av komplement. For the present purpose, the substrate or matrix may simply be the inside of a test tube. If a densiometric scanning method is to be used to judge the test results, then it is appropriate to use a flat surface. If large-scale testing is to be used, strips of matrices with cell-binding properties can be used to produce the first cell layer. Antibodies can then be labeled and tested for their capacity to support an immunolysis in the presence of complement.

Det kvantitative resultat kan så bestemmes ved scanning-densiometri ved tap av farge som indikerer lysering. The quantitative result can then be determined by scanning densitometry by loss of color indicating lysis.

Det skal bemerkes at i foreliggende oppfinnelse vil bindingen av antistoff ved en immunadsorpsjon til et lag av røde blodceller gi flere viktige fordeler. For det første kan man bruke sera med konsentrasjoner av"antistoffer som er for lave for vanlige væskefaseprøver, fordi deres spesifikke antistoffinnhold kan konsentreres som bundet antistoff på monocellelaget. For det annet, under omstendig-heter hvor ufortynnet sera ikke kan brukes i væskefase-prøver p.g.a. andre forstyrrende serumproteiner, så elimineres slik forstyrrende påvirkning med fast fase ved selektiv adsorpsjon av det antistoff som skal prøves og hvoretter vasking foretas for å fjerne de forstyrrende proteiner. For det tredje er mange sera ubrukbare for væskefaseprøver p.g.a. at de inneholder ikke-fjernbare antistoffer med uønsket spesifisitet. Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse er det ved et passende valg av celler som skal danne et første lag, umulig å adsorbere bare de antistoffer som skal prøves. It should be noted that in the present invention the binding of antibody by immunoadsorption to a layer of red blood cells will provide several important advantages. First, one can use sera with concentrations of "antibodies" that are too low for normal liquid-phase samples, because their specific antibody content can be concentrated as bound antibody on the monolayer. Second, in circumstances where undiluted sera cannot be used in liquid-phase samples due to other interfering serum proteins, such interference with solid phase is eliminated by selective adsorption of the antibody to be tested followed by washing to remove the interfering proteins.Third, many sera are unusable for liquid phase testing because they contain non-removable antibodies with undesired specificity With the help of the present invention, by an appropriate choice of cells which will form a first layer, it is impossible to adsorb only the antibodies to be tested.

Foreliggende oppfinnelse er meget godt egnet for prøving The present invention is very well suited for testing

av både celletype og celleforenlighet. For celletypifise-ring vil man f.eks. konstruere et første lag med sitt bundne antistoff av celler og antistoffer av en kjent type. For a utføre forenlighetsprøver kan blodgiverens celler brukes til å danne det første monocellelag som deretter reageres med hensyn til mulige antistoffer i en pasients serum, som så vil bli bundet ved immunadsorpsjon. Deretter kan disse of both cell type and cell compatibility. For cell typing, one will e.g. construct a first layer with its bound antibody of cells and antibodies of a known type. To perform compatibility tests, the blood donor's cells can be used to form the first monocell layer which is then reacted with respect to possible antibodies in a patient's serum, which will then be bound by immunoadsorption. Then these can

påvises ved lysering etter man har tilsatt komple- detected by lysis after adding comple-

ment . intended.

Påvisningsmetoder .som er egnet for bruk i foreliggende oppfinnelse, vil være innlysende for fagfolk. Erytrocytter inneholder sin egen etikett, nemlig pigmentert protein (hemoglobin) som har en maksimal adsorpsjon ved 415 nm. Nærvær eller fravær av erytrocytter kan derfor hensiktsmessig påvises slik det er beskrevet ovenfor. Man kan imidlertid også bruke annen påvisningsteknikk hvis dette er ønskelig. Slik teknikk innbefatter at man bruker radio-aktive atomer (f.eks. Cr, I) biokjemisk teknikk Detection methods suitable for use in the present invention will be obvious to those skilled in the art. Erythrocytes contain their own label, namely pigmented protein (hemoglobin) which has a maximum adsorption at 415 nm. The presence or absence of erythrocytes can therefore be appropriately detected as described above. However, other detection techniques can also be used if this is desired. Such techniques include using radio-active atoms (eg Cr, I) biochemical techniques

(f.eks. ved hjelp av et utvalgt intracellulært enzym) (e.g. using a selected intracellular enzyme)

eller påvisning ved hjelp av fluorescens (f.eks. ved å bruke en molekylære forbindelse for å identifisere enten en levende eller død celle) . Alle disse metoder kan lett instrumenteres og derfor gjøres automatiske. De kan enten anvendes for serologiske prøver i blodbanker, medisinsk blodprøve-typifisering, vevstypifisering og prøver for blodoverføring eller før transplantering for forenlighet. or detection by fluorescence (eg, using a molecular compound to identify either a live or dead cell). All these methods can be easily instrumented and therefore made automatic. They can either be used for serological tests in blood banks, medical blood sample typing, tissue typing and tests for blood transfusion or before transplantation for compatibility.

Det skal bemerkes at foreliggende oppfinnelse også har anvendelse på andre problemer som innbefatter immuno-spesifikke cellereaksjoner. En slik prøve er anti-globulinprøver for å bedømme celler for deres belegg av IgG, IgM, IgA, IgD og IgE immunoglobiner, og ved C3, C4 og It should be noted that the present invention also has application to other problems involving immuno-specific cell reactions. One such test is anti-globulin tests to assess cells for their coating of IgG, IgM, IgA, IgD and IgE immunoglobins, and at C3, C4 and

andre komplementkomponenter eller bundne aktiveringsproduk-ter (se Rosenfield et al., Vox-Sang, 26: 289-333, 1974). Et other complement components or bound activation products (see Rosenfield et al., Vox-Sang, 26: 289-333, 1974). One

annet anvendelsesområde vil være fastfase-prøver med kvantitativ bedømmelse, av både passive og reversert passive hemagglvtineringsprøver. Passive hemagglutinerings-prøver kan brukes for direkte analyse av antistoff-konsentra-sjon og også for indirekte analyse av oppløselige antigen-konsentrasjoner ved konkurrerende binding på basis av felles antigener (Nusbacher et al., J. Immunol., 108:893, another area of application will be solid-phase tests with quantitative assessment, of both passive and reverse passive hemagglutination tests. Passive hemagglutination tests can be used for direct analysis of antibody concentration and also for indirect analysis of soluble antigen concentrations by competitive binding on the basis of common antigens (Nusbacher et al., J. Immunol., 108:893,

1972). Reverserte passive prøver måler oppløselig antigen direkte (Cook, Immunol. 8:74, 1965 og Juji og Yokochi, Japan, J. Exptl. Med., 39: 615, 1969). På lignende måte som blodceller kan prøves for deres følsomhet overfor antistoff-styrt lysering ved prøver i faste faser, så kan bakterier, protozoer, sopp og dyrkede cellelinjer enten fra vev eller svulster', analyseres for antigeniske bestanddeler på sin overflate ved de fastfase-prøver som heri er beskrevet. 1972). Reversed passive assays measure soluble antigen directly (Cook, Immunol. 8:74, 1965 and Juji and Yokochi, Japan, J. Exptl. Med., 39: 615, 1969). In a similar way as blood cells can be tested for their sensitivity to antibody-directed lysis in solid phase samples, bacteria, protozoa, fungi and cultured cell lines either from tissues or tumors can be analyzed for antigenic components on their surface in solid phase samples as described herein.

Man kan endog forutse at man kan bruke fastfase-prøver One can even anticipate that solid-phase samples can be used

for å løse problemer som angår molekylær antistoff-konsentrasjon, K-verdien for antistoffbindingen og graden av K-verdiens heterogenitet. to solve problems concerning molecular antibody concentration, the K value for antibody binding and the degree of K value heterogeneity.

Det er underforstått at mange av de underliggende kjemiske prinsipper som er brukt i foreliggende oppfinnelse, er vel-kjente. Oppfinnelsen er enestående fordi man ikke tidligere har forstått at disse prinsipper kunne brukes for å konstruere et fastfase-monocellelag som effektivt kan utføre blodcelletypifisering og prøver for å undersøke forenligheten mellom blodceller og andre celler. It is understood that many of the underlying chemical principles used in the present invention are well known. The invention is unique because it has not previously been understood that these principles could be used to construct a solid phase monocell layer that can effectively perform blood cell typing and tests to investigate the compatibility between blood cells and other cells.

Det følgende eksempel illustrerer oppfinnelsen. The following example illustrates the invention.

Eksemp el Example

Imm unlys ering ved anti- A fra mennesker Immunization by anti-A from humans

Ved å bruke "Falcon" polystyren-prøverør (10 mm indre diameter x 75 mm) påførte man 0,2 ml av en fibronogenoppløs-ning (0,5 mg/ml) i 2 min., hvoretter man etter vasking på-førte 0,2 ml 140.000 molekylvekt poly-D-lysin HBr-oppløsning (0,1 mg/ml) i 2 min. Etter ytterligere vasking påførte man 0,2 ml av en 2-5% (volum/colum) suspensjon av type A^-celler i 0,9% NaCl i 2 min. Dette resulterte i at man fikk festet et flatt monolag av røde celler med en tethet på 2 x 10 6 celler/cm 2. Disse røde celler forble til-festet til tross for tallrike vaskinger, og til tross for påføring av sterk anti-A fra mennesker. Hvis man etter å Using "Falcon" polystyrene test tubes (10 mm inner diameter x 75 mm), 0.2 ml of a fibronogen solution (0.5 mg/ml) was applied for 2 min., after which, after washing, 0 .2 ml 140,000 molecular weight poly-D-lysine HBr solution (0.1 mg/ml) for 2 min. After further washing, 0.2 ml of a 2-5% (volume/column) suspension of type A^ cells in 0.9% NaCl was applied for 2 min. This resulted in the attachment of a flat monolayer of red cells with a density of 2 x 10 6 cells/cm 2 . These red cells remained attached despite numerous washings, and despite the application of strong anti-A from human beings. If one after to

ha påført anti-A tilførte 0,2 ml komplement, så ble hemoglobin i de adherende røde celler frigjort, og graden av immunoppløsning kunne observeres ved måling, enten ved tilbakeholdt hemoglobin eller som tilbakeholdt eller fri-51 having applied anti-A added 0.2 ml of complement, then hemoglobin in the adherent red cells was released, and the degree of immunodissolution could be observed by measurement, either by retained hemoglobin or as retained or free-51

gjort radioaktivitet i form av Cr som ble forbrukt for å merke de celler som ble anvendt i monolaget. Med en standarddose av komplement kunne den oppløsende evne for anti-A måles kvantitativt. Alternativt kunne man ved hjelp av en standarddose av anti-A definere det oppløsende komplement og måle dette ved titrering in toto, via en klassisk vei ved komplementvirkningen (ved at man brukte marsvin RP (Pillemer, L. et al., Science 120: 279, 1954)), eller via den alternative properdin-vei (ved å bruke EGTA for å chelatere Ca<++>, men ikke Mg<++> i menneskeserum (upubli-serte observasjoner)). made radioactivity in the form of Cr which was consumed to label the cells used in the monolayer. With a standard dose of complement, the resolving power for anti-A could be measured quantitatively. Alternatively, one could use a standard dose of anti-A to define the dissolving complement and measure this by titration in toto, via a classical way of the complement effect (by using guinea pig RP (Pillemer, L. et al., Science 120: 279 , 1954)), or via the alternative properdin pathway (using EGTA to chelate Ca<++> but not Mg<++> in human serum (unpublished observations)).

Ingen av disse metoder for å studere immun A-antilysering kan utføres sensitivt og reproduserbart ved å bruke væske-faseprøver. IgM, IgG og IgA anti-A er alle meget effektive agglutininer for A-^celletyper, og agglutineringen for-styrrer immunlyseringen. Ved en prøve i fastfase kan den lytiske evne for anti-A bare måles, men også påvises ved en fortynning på 50X, noe som ikke er mulig i de andre typer prøver. De diagnostiske muligheter man har med foreliggende fremgangsmåter, er følgelig enorme. None of these methods for studying immune A antilysis can be performed sensitively and reproducibly using liquid-phase samples. IgM, IgG and IgA anti-A are all very effective agglutinins for A cell types, and the agglutination interferes with immunolysis. With a sample in solid phase, the lytic ability for anti-A can only be measured, but also demonstrated at a dilution of 50X, which is not possible in the other types of samples. The diagnostic possibilities available with the present methods are consequently enormous.

Claims (1)

Fremgangsmåte for bestemmelse av celletype eller forenlighet på en fast matrise, karakterisert ved at man (a) danner et første monolag av celler som irreversibelt bindes til en fast matrise, idet nevnte celler har egne eller ervervede antigener; (b) bringer nevnte lag (a) i kontakt med en oppløsning inneholdende antistoffer som kan bindes ved immunoadsorpsjon til nevnte første lag av celler, i den grad antistoffene i nevnte oppløsning er reaktive med antigenene i cellene i nevnte første lag; og (c) deretter måler graden av immunoadsorpsjon av nevnte antistoffer ved å påføre en annen oppløsnning inneholdende lytisk komplement som lyserer cellene i laget (a) effektivt i nærvær av immunoadsorbert antistoff, og observerer graden av immunlysis som forekommer .Method for determining cell type or compatibility on a solid matrix, characterized by (a) forming a first monolayer of cells which are irreversibly bound to a solid matrix, said cells having their own or acquired antigens; (b) brings said layer (a) into contact with a solution containing antibodies which can be bound by immunoadsorption to said first layer of cells, to the extent that the antibodies in said solution are reactive with the antigens in the cells of said first layer; and (c) then measuring the degree of immunoadsorption of said antibodies by applying another solution containing lytic complement that effectively lyses the cells of layer (a) in the presence of immunoadsorbed antibody, and observing the degree of immunolysis that occurs.