NO146331B - Fremgangsmaate til fremstilling av et enecellet proteinmateriale ved dyrking av termofile bakterier - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til fremstilling av

et encellet proteinmateriale ved dyrking av termofile bakterier i et vandig medium under anvendelse av mineralske nærings-

stoffer, et oksygenert hydrokarbon, fortrinnsvis en lavere alkohol med 1-4 karbonatomer pr. molekyl, som karbon- og energikilde og en kilde for assimilerbart nitrogen under aerobe fermenteringsbetingelser og gjenvinning av de resulterende bakterier som et encellet proteinmateriale.

Forsøk på å avhjelpe den verdensomfattende knapphet på protein har omfattet forskjellige biosynteseprosesser hvor biologisk fremstilte encellede proteiner (SCP) fremstilles ved dyrking av en rekke mikroorganismer på en rekke karbonholdige substrater. De karbon- og energikilder som anvendes som substrater, bør være tilgjengelige i stort omfang, være relativt billige og av jevn kvalitet samt være sikre, dvs. at de ikke levner skadelige residuer i det proteinprodukt som til slutt fås ved mikrobiell omdannelse. Hydrokarboner fra jord-olje har vært anvendt som en karbon- og energikilde, men har medført praktiske problemer med hensyn til manglende vannoppløselighet, høyt forbruk av oksygen for å bistå den mikrobielle omdannelse og an-givelige spor av potensielt kreftfremkallende midler som stammer fra oljeråmaterialet og inneholdes i eller hefter til proteinproduktet.

Andre fremgangsmåter har konsentrert seg om bruken av oksygenerte hydrokarbonderivater som råmaterialer som følge av disses vann-oppløselighet og dermed lette håndtering, idet mikrobielle omdan-nelsesprosesser hovedsakelig utføres under vandige forhold. Slike råmaterialer er lett tilgjengelige enten fra jordoljekilder, natur-gasskilder, forskjellige avfalls/søppel-prosesser og omdannelse av metan og lignende, videre fra fermentering av forskjellige kornsorter og lignende, destruktiv destillering av tre osv. Slike oksygenerte hydrokarboner, uansett kilde, er lett tilgjengelige og relativt billige råmaterialer for fermenteringsprosesser. Det er en fordel at disse råmaterialer er delvis oksygenert, slik at den mikrobielle omdannelses/vekst-prosess krever vesentlig mindre molekylært oksygen.

En annen vanskelig og begrensende faktor ved industriell utnyttelse av encelleproteinprosesser har imidlertid vært at prosessene må kunne utføres ved relativt moderate temperaturer på ca. 20-50°C

og helst ikke over ca. 35°C. Den mikrobielle omdannelse er en sterkt eksoterm oksydasjonsreaksjon hvor der fremstilles store varmemengder som må fjernes kontinuerlig etterhvert som de oppstår, idet man

ellers vil risikere at systemet overoppvarmes og mikroorganismene dør, eller i det minste at veksten betydelig begrenses og virknings-graden derfor reduseres etterhvert som temperaturen stiger.

Mange fremgangsmåter har konsentrert seg om anvendelse av

en eller flere av de mange tilgjengelige gjærsorter som mikroorganisme. Mange gjærsopper er tilgjengelige, og gjærcellene er vanligvis noe større enn en bakteriecelle og medfører undertiden lettere separering fra fermenteringsprosessen.

Bakterier byr imidlertid på fordeler, idet et høyere råprotein-innhold i cellene oppnås fra bakterier i forhold til hva som i almin-nelighet kan oppnås fra gjærsopper, idet gjærsoppene har en høyere andel av ikke-proteinmateriale i sine celler. Bakterier har vanligvis et vesentlig høyere ekte proteininnhold og er ofte næringsmessig mere verdifullt, idet de inneholder mere av de viktige svovelaminosyrer og lysin.

Det vil være klart fordelaktig å finne frem til bakterier med evne til rask vekst og høy produksjonshastighet ved relativt høye fermenteringsprosesstemperaturer. Vekst ved høy temperatur betyr at mindre varme må fjernes, at der kreves mindre avkjølingsapparatur,

og at der endelig kreves relativt små varmemengder for steriliserings-, koagulerings- og separeringsprosesser. Faren for forurensning med andre mikrober blir også sterkt redusert. Termofile eller varme-tålende bakterier er nødvendige for industriell anvendelse av encelle-proteinprosessen.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse er der nå oppdaget to spesielle termofile bakteriearter, avdeling Protophyta, klasse Schizomycetes, orden Eubacteriales, familie Bacillaceae, slekt Bacillus, med meget ønskelige og nyttige egenskaper. Disse spesielle termofile arter vokser bedre ved høye temperaturer enn ved vanlige temperaturer.

Ifølge oppfinnelsen anvendes der således som bakterier

en av to Bacillus-arter som har fått betegnelsen NRRL B-8065

resp. NRRL B-8066, som begge vil bli nærmere beskrevet nedenfor.

Fra DE ålment tilgjengelig tysk patentsøknad 24 18 385 '

er det kjent en fremgangsmåte til fremstilling av et proteinrikt produkt ved dyrking av en bestemt Pseudomonas-art under aerobe betingelser. Ved denne fremgangsmåte skal temperaturen av kulturen vanligvis ligge på 30-50°C, fortrinnsvis 38-45°C. I mot-setning til dette tillater anvendelsen av Bacillus NRRL B-8065 eller Bacillus NRRL B-8066 ifølge oppfinnelsen temperaturer på opptil 65°C ved fremstilling av encelleprotein. Derved oppnås en rekke fordeler, som f.eks. en lettelse av varmeovergangen, en mindre krevende temperaturkontroll og en mindre forurensningsfare fra andre mikroorganismer.

Fra en artikkel av B. Snedecor og Charles L. Cooney i "Applied Microbiology" (juni 1974) pp 1112-1117, er det kjent å anvende termofile bakterier til fremstilling av encelle-protein under anvendelse av metanol som karbonkilde. De her anvendte bakterier var bare i stand til å vokse ved en metanolkonsentrasjon på opptil 1,2 g/l (0,12%), mens det ifølge oppfinnelsen er mulig med metanolkonsentrasjoner på opptil 1,5%. Dessuten oppnår man ved oppfinnelsen et encelle-protein med et høyere innhold av de essensielle aminosyrer isoleucin, leucin og valin.

De to spesielle arter av Bacillus-slekten som benyttes ifølge oppfinnelsen, er termofile, vokser effektivt med høy produktivitet på oksygenerte hydrokarbonråmaterialer, spesielt lavere alkoholer og helst metanol eller etanol, ved temperaturer som andre kjente Bacillus-arter enten er relativt uproduktive ved eller rett og slett ikke kan tåle, så sant de overhodet er produktive i og tåler et oksygenert hydrokarbonråmateriale. Disse spesielle arter er dyrket av oppfinneren som kultur 47 resp. 72, som er blitt deponert i United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Region Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, USA, idet tretti lyofiliserte <p>reparater av hver kultur er deponert og har fått deponeringsbetegnelsene NRRL B-8065 resp. NRRL B-8066. Disse spesielle kulturer er blitt deponert i overensstemmelse med det amerikanske landbruksdepartements for-skrifter, slik at avkom av disse kulturer så lenge den tilsvarende amerikanske patentsøknad er under behandling, vil være tilgjengelig for alle som US Commissioner of Patents finner berettiget til dette i henhold til Rules of Practice in Patent Cases og 35 U.S.C. 122. Deponeringen er utført i overensstemmelse med praksis i US Patent Office, slik at alle restriksjoner på til-gjengeligheten av avkom fra kulturene for publikum ugjenkallelig vil bli fjernet ved meddelelse av et US patent som er rettet mot

disse viktige kulturer. Disse kulturer vil derfor kunne gi prøver for utnyttelse i overensstemmelse med oppfinnelsen. Kulturprøver.

fra de deponerte organismer eller fra de kulturer som de deponerte organismer ble tatt fra, gir således stammer som er avledet fra

de termofile bakterieartef ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Bacillus-stammene er meget produktive ved relativt høye fermenteringstemperaturer og gir ønskelige og verdifulle encellede proteinprodukter med et høyt proteininnhold av Ønskelig aminosyre-type og -balanse. Disse spesielle Bacillus-arter som foretrekker høye temperaturer, forbedrer produksjonshastigheten av encellet protein med reduserte avkjølingskrav når de dyrkes på et karbon-og energisubstrat av et oksygenert hydrokarbon, fortrinnsvis en lavere alkohol, helst metanol eller etanol, og aller helst metanol eller et hovedsakelig metanolholdig substrat. Disse nye Bacillus-arter som foretrekker høye temperaturer, er av særlig interesse for anvendelse i skumfylte fermenteringsapparater.

Kultur nr. 72 NRRL B-8066 er en grampositiv sporedannende mikrobe som utgjør en art av slekten Bacillus og har slankt stav-formet utseende. Ingen fargede pigmenter er blitt observert i cellene.

Kultur nr. 47 NRRL B-8065 er en grampositiv sporedannende mikrobe som utgjør en art av slekten Bacillus og har tykt stav-formet utseende. Ingen fargede pigmenter er blitt observert i cellene.

Den foreliggende oppfinnelse skaffer en fremgangsmåte til dyrking av mikrobielle celler som assimilerer oksygenert hydrokarbon og hører til to nye arter av mikroorganismer, og er således rettet mot aerob dyrking i et medium som inneholder oksygenert hydrokarbon som karbon- og energikilde, ved relativt høye fermenteringstemperaturer, hvorved der fås en rask formering av cellene.

De nyisolerte, nye og spesielle mikroorganismer kan karakteriseres ved egenskaper som er vist i tabell 1 sammen med egenskapene til en rekke kjente Bacillus-kulturer. I denne tabell betyr: + = synlig tegn på vekst, fastlagt ved øking av

uklarheten av utgangsblandingen.

- = vokste ikke; ingen synlige tegn på vekst.

= kulturen ble vedlikeholdt, men der var ingen

synlige tegn på ytterligere vekst.

NG = vokste ikke på dette medium.

Alle disse sammenligninger ble gjort slik at der skulle fås en så direkte sammenligning mellom artene som mulig. Slik det er tilfellet med alle mikroorganismer/ kart naturligvis noen av egenskapene variere noe avhengig av mediet og de spesielle forhold.

Karbon- og energikilden eller substratet for fermenteringsprosessen ifølge oppfinnelsen, hvor de nye og spesielle arter av bakterier anvendes, er en eller flere karbon/ oksygen/hydrogen-holdige vannoppløselige forbindelser. Uttrykket oksygenert hydrokarbon er ment å skulle være en generell be-tegnelse som beskriver de forbindelser som kan anvendes, og er ikke nødvendigvis et begrensende uttrykk i forbindelse med kilden for substratet. De oksygenerte hydrokarboner kan inn-befatte alkoholer, ketoner, estere, etere, syrer og aldehyder som er hovedsakelig vannoppløselige, og bør av denne grunn begrenses til opptil ca. 10 karbonatomer pr. molekyl.

Belysende eksempler omfatter metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, heksanol, 1,7-heptandiol, 2-heptanol, 2-metyl-4-pentanol, pentansyre, 2-metylbutansyre, 2-pentanol, 2-metyl-4-butanol, 2-metyl-3-butanol, 2-butanol, 2-metyl-l-propanol, 2-metyl-2-propanol, 2-propanol, maursyre, eddiksyre, propansyre, formaldehyd, acetaldehyd, propanal, butanal, 2-metylpropanal, butansyre, 2-metylpropansyre, pentansyre, glutarsyre, heksansyre, 2-metylpentansyre, heptandisyre, heptansyre, 4-heptanon, 2-heptanon, oktansyre, 2-etylheksansyre, glycerin, etylenglykol, propylenglykol, 2-propanon, 2-butanon, dietyleter, metyletyleter, dimetyleter, di-n-propyletér og n-propyl-isopropyleter, samt blandinger av to eller flere av disse stoffer.

En foretrukket gruppe for slike karbon- og energikilde-materialer er vannoppløselige, alifatiske, enverdige (monohydric) hydrokarbylalkoholer som følge av disses vannoppløselighet. Enda mere foretrukket er de lavere alkoholer med 1-4 karbonatomer pr. molekyl, idet disse er lett industrielt tilgjengelige, og enda mer foretrukket er etanol og metanol. For tiden er metanol det materiale som helst foretrekkes som følge av den relativt lave pris på dette råmateriale.

Det er mulig å anvende blandinger av hvilke som helst av

disse oksygenerte hydrokarboner hvis det ønskes eller er bekvemt. F.eks. er et i handelen tilgjengelig materiale som undertiden be-tegnes som "methyl fuel" (C. & E. N., 17. september 1973, side 23),

en blanding av metanol og regulerte prosentandeler av høyere alkoholer med opp til 4 karbonatomer pr. molekyl, og dette materiale er et egnet substrat.

Jordoljegasser, f.eks. metan, etan og lignende, kan oksyderes og skaffer blandinger av overveiende de tilsvarende alkoholer. Likeledes kan man benytte varianter av ketoner, aldehyder, etere, syrer og lignende og hydrokarbonfraksjoner fra forskjellige jordoljekilder.

Dyrking av den nye og spesielle art av bakterier med oksygenerte hydrokarbonråstoffer kan med fordel utføres i et temperaturområde på 45-65°C. Mere foretrukket er området 50-60°C, og for tiden foretrekkes ca. 55°C for oppnåelse av optimale veksthastigheter.

Dyrkingen tilveiebringes i et vekstmedium som omfatter et vandig mineralsaltmedium, karbon- og energikildematerialet, molekylært oksygen og naturligvis et startpodestoff av den spesielle bakterieart som skal anvendes.

Høye konsentrasjoner av noen av de beskrevne karbon- og energisubstrater, f.eks. metanol eller formaldehyd eller lignende,

kan hindre tilfredsstillende mikrobiell vekst eller endog være dødelig for mikroorganismer ved fermenteringen under anvendelse av de nye Bacillus-arter. Relativt høye konsentrasjoner av substratene bør derfor unngås, så det er ønskelig å vedlikeholde substratkonsentra-sjonen i fermenteringsapparatet på et nivå på ca. 0,01-5 volumprosent (volume/volume percent), fortrinnsvis på ca. 0,01-0,5 volumprosent, for på denne måte hverken å sulte kulturen eller hindre veksten.

Oksygen kan tilføres fermenteringsmediet eller -kraften i en hvilken som helst form som lett kan assimileres av den innpodede mikroorganisme. Skjønt der kan anvendes forbindelser som skaffer molekylært oksygen, er disse vanligvis ikke praktiske å anvende. Molekylært oksygen skaffes således vanligvis som en oksygenholdig gass, f.eks. luft ved atmosfærisk eller forhøyet trykk eller oksygen-anriket luft når det er bekvemt og slik luft er tilgjengelig i be-traktning av det sted SCP-prosessen (fremstilling av encellet protein) utføres på. Ved anvendelse av det oksygenerte hydrokarbonsubstrat blir i virkeligheten en del av det oksygen som er nødvendig for vekst av mikroorganismen, tilført gjennom oksygeninnholdet i substratet. Ikke desto mindre må ytterligere mengder av molekylært oksygen tilføres for veksten, idet assimilasjonen av substratet og den tilsvarende vekst av mikroorganismen i virkeligheten er en forbrenningsprosess. Vanligvis blir der tilført mellom 0,1 og 10 og fortrinnsvis mellom

0,7 og 2,5 volumenheter pr. minutt av luft med normalt oksygeninnhold pr. volumenheter av væske i fermenteringsapparatet. Beregnet som oksygen er de angitte områder ca. 0,02-2,1, resp. 0,14-0,55.

Det trykk som anvendes for mikrobiologiske omdannelsespro-sesser, kan variere innen vide grenser, og trykk på 0,1-100 atmosfærer, fortrinnsvis 1-30 atmosfærer og helst såvidt over atmosfærisk trykk, anvendes som et kompromiss mellom hensynene til apparatkostnader og O2~oppløselighet. Høyere trykk enn atmosfærisk trykk er fordelaktig, idet slike trykk er tilbøyelige til å øke konsentrasjonen av oppløst oksygen i den vandige fermenteringsblanding, noe som i sin tur kan øke celleveksthastigheten. Høyere trykk enn atmosfærisk trykk foretrekkes ved høyere fermenteringstemperaturer, hvor oksygenoppløselig-heten er tilbøyelig til å avta. Skumfylte fermenteringsapparater fremmer den oksygenoverføring som er nødvendig ved høye celletett-heter og veksthastigheter.

De to spesielle Bacillus-arter Som anvendes ved fremgangsmåten, krever mineralnæringsstoffer og en kilde for assimilerbart nitrogen i tillegg til oksygenet og de beskrevne karbon- og energikilder. Kilden for nitrogen kan være en hvilken som helst nitrogenholdig forbindelse som er istand til å frigjøre nitrogen i en form som er egnet for metabolsk utnyttelse av organismen. Skjønt en rekke organiske nitrogenforbindelser kan anvendes, f.eks. andre proteiner, urea eller lignende, vil vanligvis uorganiske nitrogenmaterialer være mere økonomiske og praktiske. Egnede uorganiske nitrogenholdige forbindelser omfatter ammoniakk, ammoniumhydroksyd, forskjellige ammoniumsalter som ammoniumcitrat, ammoniumfosfat, ammoniumsulfat og ammoniumpyrofosfat og forskjellige andre forbindelser. Ammoniakkgass er bekvemt og kan anvendes ved bobling gjennom det vandige fermenter-ingsmedium i egnede mengder.

pH-verdien i den vandige mikrobielle fermenteringsblanding bør f.eks. ligge i området 5-9 og mere foretrukket 6-8. De spesielle mikroorganismer som ifølge oppfinnelsen skal anvendes, synes å fore-trekke en pH-verdi i området 6-7,5. Nærmere bestemt foretrekker organismen NRRL B-8065 en pH-verdi på ca. 6,2-6,8 og organismen NRRL B-8066 en pH-verdi på 6,2-6,5 i hva som er betegnet som et IM2-medium. Det foretrukne område for pH-verdien for mikroorganismene avhenger av det anvendte medium og varierer således noe med en endring i mediet.

Når karbon- og energikilden er eller inneholder et aldehyd i mengder som kan tenkes å være skadelig for mikroorganismen, kan de skadelige aldehydvirkninger unngås ved at substratet først behandles med en egnet mengde av en nitrogenholdig forbindelse, fortrinnsvis ammoniakk, ammoniumhydroksyd eller en annen ammoniumforbindelse, i et forhold på ca. 0,01-10 molekvivalenter av den nitrogenholdige forbindelse for hvert mol aldehyd. Et slikt behandlet substrat er da ikke bare karbon- og energikilde, men inneholder også helt eller delvis det nødvendige nitrogen.

I tillegg til oksygen, nitrogen og karbon- og energikilder er det nødvendig i passende forhold å tilføre nødvendige mengder av utvalgte mineralnæringsstoffer til råmaterialmediet for å sikre riktig vekst av mikroorganismene og øke til et maksimum assimiler-ingen av det oksyderte hydrokarbon av cellene ved den mikrobielle omdannelsesprosess.

En kilde for fosfat eller annet fosfor, magnesium, kalsium, natrium, mangan, molybden og kobber i form av ioner synes å skaffe de viktigste mineraler. Den nedenfor angitte sammensetning kan benyttes til å dyrke de nye Bacillus-arter, som imidlertid også vil vokse på andre enn metanolholdige substrater. De følgende sammen-setninger er derfor gitt bare som en veiledning for fagfolk.

For oppnåelse av et væskeformet medium, sløyfer man bare agaren.

Andre materialer som f.eks. gjærekstrakter, vitaminer, biotin og lignende eller andre vekstfaktorer kan tilsettes, f.eks. i de spormengder som er kjent i faget.

Dyrkingen av den nye Bacillus-art i henhold til oppfinnelsen kan utføres satsvis, men fortrinnsvis som en kontinuerlig fremgangsmåte på måter som er kjent i faget, og aller helst i en skumfylt fermenteringsreaktor. Den kontinuerlige fremgangsmåte har en rekke fordeler når det gjelder industriell drift for fremstilling av store mengder mikrobeceller og er således en foretrukket fremgangsmåte til utførelse av oppfinnelsen.

Både ved satsvis fremstilling eller ved den foretrukne kontinuerlige drift blir alt utstyr, dvs. reaktoren eller fermenteringsapparatet, -karet eller -beholderen, rørledninger, tilhørende sirku-lasjons- eller kjøleinnretninger og lignende, sterilisert, vanligvis ved anvendelse av damp, f.eks. ved 121°C i flere minutter, f.eks. 15 minutter. Den steriliserte reaktor podes med en kultur av den angitte mikroorganisme i nærvær av alle de riødvendige næringsstoffer, herunder oksygen og det oksygenerte hydrokarbonmateriale.

Ved kontinuerlige fremgangsmåter vedlikeholdes den kontinuerlige innføring av luft, næringsmedium, eventuelt separat tilsatt nitrogen og oksygenert råmateriale som f.eks. alkohol etterhvert som kulturen vokser. Tilsetningshastigheten av de forskjellige stoffer kan varieres for oppnåelse av en cellevekst som er så rask som det er forenlig med en effektiv utnyttelse av det oksygenerte hydrokarbonråmateriale, slik at der oppnås et maksimalt vektutbytte av celler pr. vektenhet av tilført karbon- og energimateriale. Matningshastigheten av karbon- og energikildematerialet bør reguleres slik at de mengder som tilføres fermenteringsapparatet, hovedsakelig tilsvarer den hastighet som organismene forbruker materialet med, for på denne måte å unngå overmatning, spesielt hvis det dreier seg om giftige materialer som f.eks. en alkohol eller et aldehyd som kan hindre veksten eller endog drepe mikroorganismene. En tilfredsstillende tilstand viser seg vanligvis ved at der er lite eller intet av karbon- og energikildematerialet i det utløpsmateriale som tappes ut fra fermenteringsapparatet, og en tilfredsstillende overvåkning av prosessen kan fås ved måling av innholdet av karbon- og energikildematerialet i utløpet fra fermenteringsapparatet og regulering for å holde dette innhold på et ønskelig lavt nivå, f.eks. ca. 0,1-0,5 volumprosent. Naturligvis kan en hvilken som helst av matningsstrømmene tilsettes enten porsjonsvis eller kontinuerlig i overensstemmelse med hva som er ønskelig eller bekvemt.

Der bør foreligge måleinstrumenter som kan måle celletettheten, pH-verdien, innholdet av oppløst oksygen, konsentrasjonen av alkohol eller annet råmateriale i gjæringsbeholderen, temperaturen, matningshastigheten av de inngående og utgående strømmer og lignende. Det foretrekkes at materialer som mates inn i gjæringsbeholderen, sterili-seres før innføringen. Når det oksygenerte hydrokarbonråmateriale er et materiale som kan sterilisere andre materialer, f.eks. når det dreier seg om metanol, etanol eller formaldehyd, kan det i visse tilfeller være bekvemt å tilsette denne bestanddel til andre strømmer som f.eks. mineralmediet i steriliserende mengder og således oppnå en rekke formål uten at det er nødvendig med noen separat sterilisering av mineralmediet, f.eks. ved hjelp av varme eller lignende.

Den type gjæringsapparat som anvendes, er ikke avgjørende for utførelse av fermenteringsprosessen ifølge oppfinnelsen under anvendelse av de angitte bakteriearter, men det foretrekkes for tiden å arbeide i et skumfylt fermenteringsapparat. Høyt utbytte av rene kulturer av de spesielle termofile bakteriearter med oksygenerte hydrokarbonråmaterialer oppnås best i en kontinuerlig prosess når denne foregår i et skumfylt system. Ved de anbefalte fermenteringstemperaturer oppnår de rene kulturer høye veksthastigheter og forår-saker dannelse av et meget stabilt skum. Der må naturligvis finne sted en overvåkning for regulering av veksthastighetene for å unngå at der fra gjæringsapparatet strømmer ut skum som vil kunne redusere væskevolumet og medføre et visst tap av innholdet i fermenteringsapparatet. Tilsettelse av skumhindrende midler bør unngås, hvis det overhodet er mulig, idet skumhindrende midler som f.eks. silikoner kan være skadelige for det oppløste oksygeninnhold ved de anbefalte høye temperaturer og kan få organismene til å vokse med en lavere hastighet eller lavere produktivitet eller endog å dø. Det skum som produseres med bakteriearten ifølge oppfinnelsen, er ikke skadelig for veksten og er avgjort gunstig når det gjelder å holde organismene i et system med et høyt innhold av oppløst oksygen. Oppmuntringen av en slik skumprosess i et fermenteringsapparat som er konstruert for å oppmuntre og vedlikeholde det fremstilte skum, er gunstig for opp-nåelsen av den økte O2~overgang som er nødvendig for å vedlikeholde den høye celletetthet og raske veksthastighet som disse termofile organismer krever. Bruken av et skumfylt fermenteringsapparat med de spesielle termofile bakteriearter som forbruker oksygenert hydrokarbon og produserer betydelig skum, resulterer i en meget effektiv produk-

sjon av SCP (encelleprotein).

Skumfylt drift av fermenteringsapparatet er spesielt egnet for utførelse av fermenteringsprosesser hvor store mengder gasser skal holdes i intim berøring med væskefasen for således å oppnå en reak-sjon over relativt store skilleflater mellom gassene og væsken. Fermenteringen blir således forbedret. Likeledes blir varmeovergangen forbedret for å beherske jevnheten og unngåelse av varme steder.

Et fermenteringsapparat som for tiden foretrekkes, fremgår av Process Biochemistry, juni 1972, side 37, fig. 1. Til dette apparat kan der føyes en ledning for innføring av en gass som inneholder molekylært oksygen i beholderen på et hvilket som helst egnet sted, fortrinnsvis inne i tapperøret og like over blandeinnretningen, idet sugevirkningen fra blandeinnretningen da på fordelaktig måte kan anvendes for å bistå innføringen av luft til innholdet i beholderen. Denne type gjæringsapparat arbeider effektivt når dets innhold er hovedsakelig fullstendig omdannet til et skum eller en emulsjon med lav massetetthet, og der fås da meget høye oksygenovergangshastig-heter.

En annen type gjæringsapparat som kan anvendes, er det som er beskrevet i en artikkel av Wang o.a. i Proceedings Eighth World Petroleum Congress, vol. 5, pp. 149-156 (1971), utgitt av Applied Science Publishers Ltd., London, England.

Enda en annen type fermenteringsapparat som kan anvendes, er det trykksyklusfermenteringsapparat som er beskrevet på side 63 i Chemical Engineering for 7. januar 1974.

Enda en type fermenteringsapparat som er egnet, er den vel-kjente beholder som er forsynt med en bladrører og en neddykket lufteinnretning. Et fermenteringsapparat av denne type er vist i US-PS 2 983 652.

Når der ikke fermenteres under skumfylling, kan det være nød-vendig å anvende et skumhindrende middel ved utførelse av fermenteringsprosessen ifølge oppfinnelsen. Egnede skumhindrende midler og fremgangsmåter for anvendelse av disse er kjent i fermenterings-teknikken, men en slik driftsmåte er altså vesentlig mindre foretrukket i forbindelse med de nye spesielle bakteriearter.

Både celleproduktene og de utenfor cellene dannede produkter av en dyrking av de nye Bacillus-arter på substrater i henhold til den foreliggende prosess kan gjenvinnes på konvensjonell måte. Cellene kan separeres fra utløpet fra fermenteringsapparatet ved sentri-fugering, filtrering eller lignende. Det cellefrie utløp kan deretter behandles med aceton eller en lavere alkohol, f.eks. metanol eller etanol, for å utfelle eventuelt polymert materiale som produseres utenfor cellene. Det cellefrie utløp kan også behandles ved ekstrahering med et oppløsningsmiddel og/eller en base for om ønskelig å gjenvinne andre utenfor cellene dannede produkter som pigmenter, vitaminer eller organiske syrer som fremstilles under dyrkningsprosessen. De mikrobielle celler drepes vanligvis ved varme eller på kjemisk måte, og dette kan gjøres før eller etter at cellene separeres fra utløpet fra fermenteringsapparatet. Bakterie-cellene er en verdifull proteinkilde for såvel mennesker som dyr. For menneskelig forbruk kan cellene behandles for å redusere innholdet av nukleinsyre, men for bruk som dyrefor synes en slik behandling ikke å være nødvendig.

Eksempel I

En rekke kulturer av kjente termofile mikroorganismer ble hentet fra to kulturdeponeringssteder, nærmere bestemt The United States Department of Agriculture, Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, og The American Type Culture Collection ATCC, Washington D.C. Disse kulturer ble mottatt i lyofilisert tilstand. Kulturene ble testet for vekst ved 55°C i en rekke forskjellige medier. Resultatet av disse forsøk er vist i tabell 2. De anvendte kulturer var de følgende:

Den næringskraft som ble anvendt som vekstmedium ifølge

tabell 2, er et vanlig dyrkningsmedium med 3 g/l oksekjøtt-ekstrakt og 5 g/l pepton. IM2-medium er det samme som beskrevet foran, bortsett fra at der ikke forelå noe agar i disse forsøk, hvor mediet var væskeformet. NRRL B110 2 ville ikke vokse selv på næringskraft.

ATCC 10744 ville ikke vokse i nærvær av metanol (medium 2). Skjønt

de andre kulturer vokste i nærvær av metanol, var de åpenbart ute av stand til å anvende metanol som sin eneste karbon- og energikilde for

veksten. Disse resultater står i drastisk kontrast til de ønskelige resultater som oppnås med de spesielle Bacillus-arter som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse, idet disse arter var istand til effektivt å anvende metanol som eneste karbon- og energikilde..

En kontinuerlig fermentering ble deretter utført i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Podestoffet for dette forsøk var 500 ml av en vandig dispersjon av cellene fra kultur nr. 72, NRRL B-8066, som var blitt dyrket i 24 timer på mediet BH-M med

1,5 volumprosent metanol.

Det ovenfor beskrevne podestoff ble tilsatt et fermenteringsapparat forsynt med røre- og lufteorganer og inneholdende 2 liter av et medium fremstilt med vann fra springen og i henhold til følgende oppskrift:

Metanolinnholdet var til å begynne med 1,5 volumprosent,

pH-verdien var ca. 6,7 og temperaturen var ca. 55°C. Rørehastigheten av innholdet lå på ca. 1000 omdreininger pr. minutt og luft ble inn-ført i en mengde på ca. 2 l/min. Ammoniumhydroksyd ble tilsatt kontinuerlig for å holde pH-verdien i et område på ca. 6,7-6,9 og også skaffe en nitrogenkilde.

Etterat god vekst av podestoffet var blitt iakttatt, ble der startet en kontinuerlig tilsetning av næringsmediet med 5 volumprosent metanol, samtidig som en tilsvarende mengde ble trukket ut av fermenteringsapparatet. Matningshastigheten for næringsmediet varierte fra ca. 150-800 ml pr. time i løpet av forsøket på

ca. 500 timer. Den gjennomsnittlige tilbakeholdelsestid for cellene i fermenteringsapparatet varierte fra ca. 2,4 til 5 timer. Fra tid til annen ble der tatt stikkprøver fra utløpet fra fermenteringsapparatet for å gjenvinne noen av cellene,som ble tørket, veiet og underkastet proteinanalyse. Stikkprøvene fra utløpet ble bearbeidet for å gjenvinne bare celler, dvs. at oppløselige stoffer ikke ble analysert. Cellekonsentrasjonsverdiene lå i området fra ca. 12 g/l (tørre celler) tidlig i forsøket (etter 25 timer) til 18 g/l etter 190 timer og ca. 24 g/l ved slutten av forsøket. Omdannelsen av metanol til gjenvinnbare celler var 44% av den tilførte mengde. Proteininnholdet i en cellestikkprøve tatt under dette forsøk er angitt ovenfor under omtalen av produktgjenvinningen.

Resultatene viser at den nye Bacillus-art NRRL B-8066

lett kunne dyrkes kontinuerlig ved 55°C méd metanol som energi- og karbonkilde. Videre er det vist at cellene av denne bakterieart har et høyt proteininnhold.

Eksempel II

Et annet kontinuerlig fermenteringsforsøk ble utført under anvendelse av kulturen NRRL B-8066 ifølge eksempel I. Ved dette forsøk ble fermenteringsapparatet podet med 500 ml av en vandig dispersjon av kulturen som var blitt dyrket i 26 timer på IM2-medium pluss 1,5 volumprosent metanol.

Det ovenfor beskrevne podestoff ble tilsatt et fermenteringsapparat av den samme art som beskrevet i eksempel I Fermenteringsapparatet inneholdt 2 liter av det samme FM-12-medium som er beskrevet i forbindelse med fermenteringsforsøket i eksempel I, bortsett fra at den ovennevnte spormineraloppløsning ble tilsatt mediet i en mengde av bare 5 ml/l.

Metanolinnholdet ble til å begynne med begrenset til ca.

1,5 volumprosent, pH-verdien var ca. 7,1, og temperaturen var ca. 53°c. I løpet av de første 2 timer ble omrøringen og luftmengden økt lang-somt opp til 800 omdreininger pr. minutt, resp. 2 liter pr. minutt. Ammoniumhydroksyd ble tilsatt som beskrevet i eksempel I for å holde pH-verdien i området 7,0-7,2 og skaffe en nitrogenkilde.

Etterat god vekst av podestoffet var blitt oppnådd i løpet av de første 24 timer,ble en kontinuerlig tilsetning av næringsmediet med 7,5 volumprosent metanol og 0,05 g/l MnSO^I^O begynt, samtidig som en tilsvarende mengde ble tappet ut av fermenteringsapparatet. Matningshastigheten for næringsmediumblandingen var ca. 200-400 ml

pr. time i løpet av forsøket på ca. 94 timer. Den gjennomsnittlige tilbakeholdelsestid i fermenteringsapparatet varierte fra ca. 3 til 5 timer. Der ble tatt stikkprøver av utløpet fra fermenteringsapparatet fra tid til annen for å gjenvinne og tørke cellene, som ble veiet. Stikk-prøvene fra utløpet ble behandlet for å gjenvinne bare cellene, dvs. at oppløselige stoffer ikke ble analysert. Celle-konsentrasjonen etter 24 timer varierte fra 17 til 26 g/l (tørre celler). Omdannelsen av metanol til gjenvinnbare celler var ca. 43%

av den tilførte mengde.

De ovenfor angitte resultater viser igjen at et godt utbytte

av mikrobielle celler av de nye Bacillus-arter kan oppnås ved an-

vendelse av metanol som eneste energi- og karbonkilde ved høy fermen-terings temperatur .

Eksempel III

Et kontinuerlig fermenteringsforsøk ble utført med kultur 47, NRRL B-8065.

Et fermenteringsapparat av samme type som tidligere beskrevet ble anvendt. Fermenteringsapparatet inneholdt, 2 liter av det FM-12-medium som er beskrevet i eksempel II, men i dette tilfelle fremstilt med avionisert vann. Apparatet ble fylt med 500 ml av en vandig dispersjon av kultur 47 NRRL B-8065, dyrket i 11 timer på det samme IM2-podestoffmedium som beskrevet i eksempel II med 1,5 volumprosent metanol.

Metanolinnholdet var til å begynne med 1,5 volumprosent, pH-verdien var til å begynne med ca. 6,45, og temperaturen ble holdt på ca. 54°C. Som i eksemplene I og II ble ammoniumhydroksyd tilsatt for å holde pH-verdien på ca. 6,3-6,6 samt skaffe en nitrogenkilde. Omrøringen og luftmengden ble gradvis økt til 400 omdreininger pr. minutt, resp. 0,5 l/min, i løpet av ca. 7 timer. Etter ca. 11 timer begynte den kontinuerlige tilsetning av FM-12-medium fremstilt med vann fra springen og med et innhold på 2,5 volumprosent metanol og dessuten 1 g/l KH2P04, 1 g/l K2HP04 og en liten mengde skumhindrende middel. Etter 28 timer ble det tilførte materiale modifisert ved tilsetning av ytterligere MnS04*H20 for å fordoble konsentrasjonen av dette stoff i materialet. De spesielle bakteriearter ifølge oppfinnelsen synes å ha et relativt stort forbruk av Mn<++> for optimal vekst.

I løpet av forsøket på 101,5 timer ble. ytterligere mengder av de andre spormineraler tilsatt, men ingen av dem syntes å ha noen stimulerende virkning på celleveksthastigheten. Etter 28 timer fikk fermenteringsapparatet i tillegg til luft også tilført oksygen i en voksende mengde på 0,12-0,4 l/min. Omrøringshastigheten ble tilsvarende økt fra 400 til 800 omdreininger pr. minutt i løpet av dette tidsrom. Stikkprøver av utløpet ble tatt fra tid til annen for å gjenvinne cellene og tørke og veie dem.

Tilførselshastigheten av mediet varierte fra ca. 300 ml pr. time etter 28 timer til ca. 850 ml pr. time etter 71 timer og 1070 ml pr. time etter 95 timer. Oppholdstiden for cellene lå på mellom 1,8 og 2,5 timer under de siste 30 timer. Cellekonsentrasjonene varierte fra ca. 7 til 10 g/l (tørre celler), og omdannelsen av metanol

til gjenvinnbare celler utgjør ca. 50% av tilført mengde.

De ovenstående resultater viser at kultur nr. 47 NRRL B-8065 også skaffer et godt utbytte av mikrobielle celler ved dyrking på metanol som eneste karbon- og energikilde ved relativt høye fermen-terings temperaturer .

Råproteininnholdet i cellene av de nye Bacillus-

arter ligger i området 70-85 vektprosent. Råproteinverdien oppnås ved multiplikasjon av vektprosenten av N (Kjeldahl-analyse)

i de tørkede celler med faktoren 6,25. Hydrolysering av disse tørkede celler fulgt av aminosyreanalyse ved gasskromatografi viste et proteininnhold i området 55-70 vektprosent. En aminosyrefordeling for en stikkprøve av bakterieceller fremstilt i henhold til oppfinnelsen under anvendelse av kultur nr. 72 NRRL B-8066 er gjengitt nedenfor:

Det vil bemerkes at innholdet av svovelholdige aminosyrer, dvs. cystin og metionin, er relativt lavt. Enkelte stikkprøver av celler fra de ovennevnte Bacillus-arter har faktisk vist 0,00 g cystin pr. 100 g tørkede celler. Denne situasjon er ikke uvanlig for encelleproteinprosesser og kan avhjelpes rett og slett ved tilsetning av egnede mengder syntetisk cystin eller metionin ved foring med slikt encelleprotein.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et encellet proteinmateriale ved dyrking av termofile bakterier i et vandig medium under anvendelse av mineralske næringsstoffer, et oksygenert hydrokarbon, fortrinnsvis en lavere alkohol med 1-4 karbonatomer pr. molekyl, som karbon- og energikilde og en kilde for assimilerbart nitrogen under aerobe fermenteringsbetingelser og gjenvinning av de resulterende bakterier som et encellet proteinmateriale, karakterisert ved at der som bakterier anvendes Bacillus-arten NRRL B-8065 eller NRRL B-8066.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 , karakterisert ved at dyrkingen utføres ved en fermenterings-temperatur på 45-6 5°C.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakte-. risert ved at der anvendes en temperatur på 50-6 0°C.

4. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at kulturmediet behandles med en forbindelse av toverdig mangan under dyrkingen.