NO143478B - Fremgangsmaate ved fremstilling av gamma-globuliner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av y-globuliner fra menneskeblod fra placenta. De fremstilte Y-globuliner kan anvendes direkte ved intravenøs administrasjon, eventuelt sammen med standard y-globuliner til hvilke de gir klinisk toleranse. Man kan således fremstille et intravenøst administrerbart Y-globulin fra placenta, ved anvendelse av en fraksjon av et placentaekstrakt som tidligere ble kastet.

Man vet at y-globulinene har en antistoff-virkning som gjør dem brukbare i terapi, f.eks. ved behandling eller forebyg-gelse av mikrobe-^ eller virus-inf eks joner, spesielt hos pasienter som lider av immunitetsmangel.

Y-globulinene fremstilles normalt av serum eller blod eks-trahert av placenta. Den hyppigst anvendte prosess av fraksjonering med alkohol.

Fremstillingen av Y-globuliner.fra.placenta er beskrevet av H.L. Taylor, J.AM.CHEM.SOC. 78, 1356 (1956).

Denne kjente prosess består i å behandle filtratet fra en saltholdig suspensjon av knust placenta slik at man får en etanolkonsentrasjon på 25 volum-%. Man samler opp det dannede bunnfall I og behandler det med 8 % etanol ved pH 4,8. Man fjerner bunnfallet og samler opp den ovenpåflytende

væske II. Ved tilsetning av alkohol til denne væske inntil man har en konsentrasjon på 25 volum-%, får man felling av en fraksjon III rik på y-globuliner. Bunnfallet III behandles med 17 % etanol ved pH 5,1. Man fjerner bunnfallet III-l og samler opp væsken III-l. Ved tilsetning av etanol til væsken til man har en konsentrasjon på 25 volum-%, får man et bunnfall III-2 av Y-globuliner tilsvarende dem man får ved fraksjonering av blodplasma.

Man vet at y-globulinpreparater oppnådd ved fraksjonering

med etanol (heretter kalt standard-y-globuliner) tåles godt når de tilføres intramuskulært. Derimot har man i blant

iaktatt meget alvorlige reaksjoner når de tilføres intrave-nøst.

Denne dårlige toleranse tilskrives en antikomplementærvirkning som skyldes tilstedeværelsen av aggregater som kan fiksere komplementet på samme måte som antigen-antistoff-kom-plekset .

Denne fiksering av komplementet tilsvarer en aktivering av flere enzymer hvis produkter er ansvarlige for de registrerte intoleransereaksjoner etter intravenøs injeksjon av standard-Y-globuliner.

Man kjenner forskjellige metoder til å fremstille Y-globuliner som kan injiseres intravenøst, nemlig ved inkubasjon av standard-Y-globulinet med plasmin, se M. Steinbuch m.fl., La Presse Medicale, 77 nr. 17 (1969).

Disse fremgangsmåter omfatter eksempelvis å underkaste standard-Y-globulin inkubasjon ved pH 4 og/eller enzymatisk omsetning eller nedbrytning med pepsin (se britisk patent nr. 1.001.013), papain eller plasmin, og de utgjør en sær-skilt behandling av standard-y-globulinet erholdt ved Taylor's fremgangsmåter, eller ved andre fremgangsmåter, eksempelvis fra blodserum.

Det har nå imidlertid vist seg, at såfremt man,underkaster bunnfallet III-l, som ifølge Taylor hovedsaklig består av a- og 3-globuliner, en passende behandling, er det mulig å utvinne en ytterligere fraksjon av Y-globuliner, som er rik på plasmin. Denne fraksjon, som kastes ved Taylors fremgangsmåte, har nemlig vist seg å kunne o<p>parbeides ved stan-dardmetoder, slik at den kan utnyttes ved intravenøs inngivelse av y-globuliner, hvori man har undertrykket eller nedsatt standard-y-globulins antikomplementære styrke, og det således behandlede preparat, kan også samtidig gjøres rikere på Y-globuliner ved iblanding av standard-y-globuliner erholdt fra f.eks. Taylormetoden, dvs. fra opparbeiding av overfasen III-l, som også lar seg inkubere med eget plasmin til nedsettelse av antikomplementæraktiviteten.

Herved tilveiebringes et i høy grad ønskelig nytt produkt ved en effektiv industriell fremgangsmåte, som lar seg utøve i direkte tilslutning til Taylors metode. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er særpreget ved at man går ut fra<*> det fra Taylors fremgangsmåte ved fremstilling av y-globuliner ved fraksjonering av placentaekstrakter med alkohol erholdte bunnfall III-l, som fortynnes med'vann-, og behandler den oppnådde oppløsning med en oppløsning av 2-etoksy-6,9-di-aminoakridinlaktat (E.D.A.L.), fjerner det derved dannede bunnfall, filtratet tilsettes en vandig oppløsning av ammoniumsulfat av tilstrekkelig konsentrasjon for å oppnå et bunnfall, som består av y-globulin og plasmin, og som isoleres, hvoretter man underkaster en vandig, oppløsning•av dette .bunnfall som eventuelt kan iblandes én vandig oppløs-ning av standard-y-globulin, en inkubasjon ved en pH-verdi mellom 4 og 7 og ved en temperatur mellom 10 og.45°C, inntil antikomplementæraktiviteten er lavere enn den terskelverdi som tillater intravenøs injeksjon, hvoretter oppløsningen om nødvendig underkastes en adsorpsjonsbehandling med bentonitt for å fjerne resterende plasmin, og det således erholdte y-globulinpræparat om ønsket lyofiliseres, fortrinnsvis i nærværelse av glycocol. ;Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utgjør således en stor forbedring av Taylors fremgangsmåte i den henseende at den tillater å utvinne eller opparbeide en del av y-globulinene, som ellers går-tapt ved Taylors fremgangsmåte, hvor bunnfallet III-l kastes. Men særlig tillater fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen å oppnå en fraksjon av y-globuliner, som er rik på plasmin, og som kan anvendes ved inkubasjon til å undertrykke y-globulin-standardens antikomplementærkraft, idet man samtidig kan foredle det således behandlede prepa-rats y-globulininnhold ved å tilsette standard-y-globuliner erholdt eller isolert ved ovenfor nevnte kjente teknikk. For øvrig er det fra tysk utlegningsskrift nr. 1.218.659 kjent at E.D.A.L. vil bunnfelle størstedelen av proteinene i humant serum med unntagelse av y-globulinene, hvilket vil si at det av tysk utlegningsskrift nr. 1.218.659 fremgår at man ved behandling av humant serum med E.D.A.L. feller albumin, nemlig a^- og o^-globulin, men når det tas hensyn til at det av den ovenfornevnte artikkel av Taylor fremgår at bunnfallet III-l formodes hovedsaklig å bestå av a- og 3-globuliner, må det dog regnes for meget overraskende når det med oppfinnelsen nå er påvist at man nettopp ved å gå ;ut fra dette bunnfall III-l og behandle en vandig op<p>løs-ning av dette med en oppløsning av nettopp E.D.A.L. får et filtrat som inneholder anvendelige bestanddeler til bruk ved intravenøs innføring av y-globuliner. ;Det må derfor konkluderes at den kjente litteratur ikke har antydet at bunnfallet fra Taylors fraksjon III-l nettopp skulle inneholde særlige y-globulinfraksjoner, akkurat som det heller ikke noen steder finnes antydning til at disse foreligger i blanding med plasmin, og at sistnevnte kompo-nent likeledes skullle være oppløselig under de samme betingelser som nettopp disse y-globuliner. ;Tvertimot må det fremheves, at de y-globulinfraksjoner som man arbeider videre med ved Taylorfraksjonen , finnes i filtratet III-l. Det er disse y-globuliner, som i foreliggende beskrivelse er betegnet som "standard-y-globuliner", og som om ønsket kan gjeninnføres i præparatet på et senere stadium av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Dette henger sammen med at det nå er påvist at de fra bunnfallet III-l isolerte y-globuliner i blanding med plasmin ved inkubasjon er i stand til å nedsette præparatets antikomplementærakti-vitet i meget vid utstrekning, og at de likeledes er i stand til å nedsette antikomplementæraktiviteten i en viss iblanding av standard-y-globulin, slik at totalresultatet like-vel blir et intravenøst injiserbart præparat. ;Oppfinnelsen bygger på den ide at man samtidig kan utvinne ovenfor nevnte y-globulinrest og plasmin ved å gå ut fra bunnfallet III-l og rense og isolere disse komponenter sammen ved oppløseliggjørelse ved hjelp av E.D.A.L. ("Rivanol")' ;og at nettoppp denne blanding med hell lar seg utnytte til opparbeiding av y-globuliner som kan injiseres via intra-venøs vei. ;Ytterligere har det lenge vært kjent å anvende ammoniiøtsulfat,, på samme måte som anført i foreliggende beskrivelse. Nettopp ammoniumsulfatfellinger blir jo benyttet til å definere globulinene (idet disse pr. definisjon er de proteiner som er uoppløselige i vandig ammoniumsulfatoppløsning tilsvarende 50 %'s metning, hvilket vil si ca. 300 g pr. liter). ;Britisk patentskrift nr. 1.011.013 vedrører anvendelsen ;av humant globulin, hvor man går ut direkte fra humant serum, som fortynnes med destillert vann og ved pH 7,0 felles/ med ammoniumsulfatoppløsning. Ved dette'fås en rå y-globulin-fraksjon, som isoleres ved sentrifugering og gjenoppløses i destillert vann. Etter innstilling til pH 4,0 med, eddik- . syre tilsettes 90 000 enheter pepsin pr. 100 g protein, og globulinene underkastes proteolyttisk innvirkning fra det. fremmede enzym pepsin. Dette er en helt annen metode -enn den nå anviste, ifølge hvilken det benyttes en ganske bestemt fraksjon fra placentaserum og hvor inkubasjonen ikke gjennomføres i nærvær, av fremmed enzym, men tvertimot bygger på en ny erkjennelse av at den spesielle ovenfor nevnte fraksjon III-l inneholder det egne enzym plasmin, ;som muligens er ansvarelig for resultatene>ived denne inkubasjon . ;Fra US-patentskrift nr. 3.449.416 er det kjent å anvende fraksjonert felling med E.D.A.L. og metanol ved fremstilling av y-globuliner, men det benyttes en annen fraksjonerings-sekvens og en annen alkohol enn den beskrevet av Taylor. Prinsippet ved fraksjonert felling er således velkjent, men det skal fremheves at sekvensen er annerledes enn den som nå er beskrevet, og dette er av avgjørende betydning for fremgangsmåtens heldige gjennomførelse. Ytterligere kan det bemerkes at den behandling med bentonitt som er avgjørende for fremgangsmåten omtalt i US-patentskriftet kun er en fak-ultativ sekundær behandling ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og f .eks. utmerket kan erstattes med en filtrering på asbest. ;Ytterligere har man nå funnet det ønskelig å benytte en terskelverdi for antikomplementæraktiviteten i de fremstilte Y-globuliner som er bestemt ved gjeldende normer som eventuelt kan endres ved senere innførte strengere bestemmelser. Det som er viktig er imidlertid at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres slik at man ved å utføre inkuba-sjonstrinnet tilstrekkelig lenge kan nå til en arbitær terskelverdi for antikomplementæraktivitét. Derfor benyttes uttrykket "terskelverdi, som tillater intravenøs injeksjon", idet dette uttrykk defineres nærmere nedenfor ved angivelse av den aktuelle aksepterte terskelverdi. ;Etter en foretrukket fremgangsmåte utføres behandlingen med 2-etoksy-6,9-diamino-akridin-laktat (E.D.A.L.) ved alkalisk pH. For dette setter man en base til proteinløsningen før tilsetning av E.D.A.L. Denne base er f.eks. et hydroksyd av et alkalimetall som Na. E.D.A.L. tilsettes i tilstrekkelig mengde til å gi en slik E.D.A.L.-konsentrasjon at vekten av E.D.A.L. utgjør omtrent 1/20 til 1/4 av vekten av tilstedeværende proteiner i løsningen. Proteininnholdet i den løsning som skal behandles, ligger som regel mellom 5 og 30 g/liter og er fortrinnsivs ca. 20.g/liter. Tar man som eksempel et proteininnhold på 20 g/liter, passer det altså å tilsette E.D.A.L. i tilstrekkelig mengde til å gi en endelig E.D.A.L.-konsentrasjon mellom 0,1 og 0,5 ;Det bunnfall som fås etter tilsetning av E.D.A.L. fjernes ved sentrifugering. Man tilsetter så til filtratet en vandig, halvmettet løsning av ammoniumsulfat, dvs. en løs-ning som inneholder omtrent 300 g ammoniumsulfat pr. liter. Man isolerer ved filtrering det dannede bunnfall av proteinprodukt. ;Dette sluttprodukt inneholder et proteolytisk enzym (plasmin) hvis mengde defineres ved hjelp av en "kaseinolytisk enhet". ;Den kaseinolytiske enhet defineres som den mengde plasmin som på et substrat på 3% kasein gir--en. økning på 4 50 ug tyro-sin løselig i trikloreddiksyre i løpet av 1 time ved 37°C. ;Se "The preparation of human fibrinolysein", Scouris et Coll, Vox Sanguinis (1960), 5, (4), side 357-376. ;Vanligvis inneholder det erholdte sluttprodukt fra 10 til ;100 kaseinolytiske enheter pr. gram protein, men dette inn-hold kan være lavere enn 10 enheter. ;Det erholdte prcteinprodukt kan om ønsket renses ved å bringe det i vandig oppløsning og dialysere denne. ;Etter en foretrukket fremgangsmåte utfører man før- trinnet med E.D.A.L.-behandling, et forberedende trinn som består i å elmininere den fraksjon som er uløselig ved pH .4 ,'8 t 0,2 , især ved pH 4,8 - 5/0. For dette tilsetter.man- en syre som saltsyre til løsningen av bunnfall III-l.- Deretter/fjerner man, f .eks. ved sentrif ugering det dannede- bunnfall-; Dette forberedende trinn, som ikke er obligatorisk, letter den påfølgende behandling med E.D.A.L. Dets funksjon er å eliminere lipoproteiner som finnes i løsningen. ;Alle trinn i den ovenfor beskrevne prosess kan utføres ved temperaturer mellom 0 og 25°C. ;De ved fremgangsmåten fremstilte Y-globuliner. som kan brukes intravenøst, erholdes ved at man underkaster en vandig løsning av det nevnte proteinprodukt, eventuelt i blanding med en vandig løsning av standard-Y~globuliner, en inkubasjon inntil den antikomplementære virkning forsvinner. Etter overens-komst regner man at antikomplementærvirkningen'er forsvunnet når en løsning på 50 mg/ml ikke nøytraliserer (ikke fikserer) 2 enheter av komplement a 50 % (2 enheter C 50 %); med andre ord man regner at antikomplementærvirkningen er forsvunnet når det kreves en konsentrasjon over 50 mg/ml for å fiksere 2 enheter komplement a 50 %. (Public Health Monograph n° 74, 1965, U.S.A.: Standard Diagnostic Comple-ment fixation method and adaptation to microtest). ;Løsningen som er underkastet inkubasjon kan inneholde f.eks. fra 50 til 160 g/liter proteiner. Titeren i kaseinolytiske enheter i løsningen etter inkubasjon ligger mellom 1,25 ;og 10 kaseinolytiske enheter pr. gram protein, fortrinnsvis mellom 4 og 6 kaseinolytiske enheter pr. gram protein. ;Inkubasjonen utføres ved pH mellom 4 og 7. Inkubasjons-temperaturen ligger mellom 10 og 4 5°C, inkubasjonstem-peraturen er fortrinnsvis 37°C . Inkubasjonstiden avhenger på en gang av pH, av temperaturen, av utgangsblandingens titer i kaseinolytiske enheter og av den valgte maksimale endelige antikomplementærvirkning. ;Inkubasjonens varighet avtar når pH avtar og når temperaturen stiger. ;Når man utfører inkubasjonen ved 37°C og pH 7 kreves det vanligvis fra 14 til 28 døgn for å nå en tilfredsstillende antikomplementærvirkning. ;Når man arbeider ved 37°C og pH 4, er det tilstrekkelig med 18 timers inkubasjon, eller for sikkerhets skyld fra 24 til ;4 8 timer. ;For å eliminere rester av proteolytisk enzym underkastes Y-globulinløsningen etter inkubasjonen den adsorberende virkning av bentonitt. Man kan for eksempel tilsette en 4 % bentonittsuspensjon, sterilisert i autoklav, så at det inn-føres ca. 5 g bentonitt pr. 100 g proteiner i løsningen. Man justerer pH mellom 4 og 8, f.eks. til ca. 5,5 og ryster noen timer ved temperatur mellom ca. 2 0 og 37°C, f.eks. 2 timer ved romtemperatur (20 til 25°C). Til.slutt fjerner man bentonitt f.eks. ved sentrifugering. ;Når innholdet av kaseinolytiske enheter er lavt (f.eks. ;under 2 kaseinolytiske enheter pr. gram protein) kan dog bentonittbehandlingen sløyfes. ;Når den løsning man får etter inkubasjon inneholder pyrogener eller fargestoffer, er det hensiktsmessig å underkaste den f.eks. den adsorberende virkning av alumina-gel (gel fremstilt etter Willstatter's metode i vandig miljø). For dette tilsetter man en mengde alumina-gel mellom 0,2 5 og 1 ;gang vekten av de proteiner som finnes i løsningen. Denne behandling utføres ved pH 5,5 - 0,5, ved temperatur mellom 2 0 og 4 5°C. Man ryster noen timer, f.eks. 3 timer ved 45°C. Aluminagelen fjernes deretter ved sentrifugering. ;Det slik oppnådde Y-globulin skiller seg fra standard-y-globulinet især ved ultrasentrifugerings- og gelfiltrerings-egenskaper, og også ved mangel på antikomplementærvirkning (idet mangelen på anti-komplementærvirkning etter overens-komst er definert ved hjelp av den ovenfor angitt maksimums-terskel). Kliniske forsøk har vist at y-globulin fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan tilføres intravenøst også ;hos personer som ikke tåler standard-y-globulinet i blodårene. ;For å konservere Y-globulinet etter inkubasjon og etter behandling med bentonitt eller med alumina, underkaster man det en lyofilisering. Slik får man et y-globulin-preparat som kan brukes intravenøst etter ny oppløsning i vann. ;Man har oppdaget at man etter lyofilisering får et pulver ;med bedre løselighet og stabilitet når lyofiliseringen skjer i nærvær av glykokoll, i forholdet 1 g glykokoll til 2,5 g proteiner omtrent. Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen . ;EKSEMPEL 1 ;Man løser bunnfall III-l, fremstilt etter den av H.L. Taylor og Coll. beskrevne metode, i en og en halv gang sin vekt av en vandig løsning av natriumklorid, 8 gram pr. liter avkjølt til 0°C. Man underkaster løsningen en dialyse under ren-nende vann ved 4°C i 3 til 4 dager, og fortynner så den dialyserte væske med vann (10 ganger vekten av det opprinne-lige bunnfall). Man justerer om nødvendig pH til 4,8 ved å tilsette en normal, saltsyreløsning. Man underkaster den-. fortynnede væske en sentrifugering og fjerner det dannede bunnfall. ;Man justerer den overliggende væskes pH til 7,7 ved tilsetning av en normal løsning av natriumhydroksyd, og tilsetter så natriumklorid i forholdet 2 g pr. 1 000. Man tilsetter E.D;A.L. (i form av en 1 % løsning). For å oppnå en god felling, dvs. et sediment på minst 50 % og en fullstendig klar overliggende væske, må man som regel tilsette E.D.A.L. slik at man får en konsentrasjon på 1 til 5 gram pr. 1 000 g av oppløsningen. Den optimale E.D.A.L.-mengde kan lett bestemmes på uttatte prøver som tilsettes progressivt stigende mengder E.D.A.L. ;Man lar sedimentere minst to timer, fjerner bunnfallet ved sentrifugering, og tilsetter natriumklorid til væsken for å krystallisere overskudd av E.D.A.L. Det dannede bunnfall fjernes ved filtrering. ;Man tilsetter ammoniumsulfat til filtratet i forholdet 300 gram pr. liter filtrat. Man ryster for å løse ammoniumsul-fatet fullstendig, og kontrollerer pH som skal være mellom 6 og 7. Man samler opp det dannede bunnfall ved filtrering. Man dialyserer. ;Man tilsetter glykokoll for å få en konsentrasjon på 1 %, ;og pH justeres til 7,0. Man filtrerer sterilt. ;Man får på denne måte en løsning som heretter betegnes med A. ;Man titrerer den anti-komplementære virkning hos løsningen ;A. Man inkuberer om nødvendig ved 37°C inntil antikomplementærvirkningen er tilfredsstillende, dvs. at over 50 mg/ml fikserer 2 enheter C<*> 50 %.

Når dette resultat er nådd, stoppes inkubasjonen. Man bestemmer proteinene og bestemmer innholdet av kaseinolytiske enheter. Hvis denne er ovér 0,2 enheter pr. milliliter for en løsning med 100 gram protein pr. liter, foretar man en bentonittbehandling. For dette tilsetter man en 4 % bento-nittløsning, behandlet i autoklav, i tilstrekkelig mengde til å gi 5 gram bentonitt pr. 100 gram proteiner. Man justerer pH til 5,5 ved tilsetning av en normal saltsyreløsning, og ryster 2 timer ved romtemperatur. Man fjerner bento-nitten ved sentrifugering. Hvis innholdet av kaseinolytiske enheter fremdeles er høyere enn den ovenfor angitte terskel, må man begynne bentonittbehandlingen om igjen.

Man foretar en behandling med aluminagel. I forhold til innholdet av pyrogener og farge tilsetter man en mengde alumina-gel mellom 1 gang og 0,25 ganger vekten av de tilstedeværende proteiner. I det siterte eksempel har man tilsatt 0,5 ganger vekten av de tilstedeværende proteiner. Man justerer pH til 5,5 og ryster 3 timer ved 4 5°C. Man fjerner aluminagelen ved sentrifugering.

Proteinenes doseringsstyrke innstilles, idet pH justeres til

7 ved tilsetning av en normal natriumhydroksydløsning, og tilsettes destillert vann for å justere proteininnholdet til 52 gram pr. liter. Man tilsetter natriumklorid for å få en konsentrasjon på 1 gram pr. liter og glykokoll for å få

en konsentrasjon på 20 gram pr. liter. Man filtrerer sterilt.

Den oppnådde løsning underkastes en lyofilisering. Man får på denne måte et y-globulin-preparat som kan brukes intrave-nøst etter ny, steril oppløsning i vann.

EKSEMPEL 2

Man tilsetter løsningen A, slik som man fikk den i eksempel 1 før inkubasjon,til en løsning av standard-y-globuliner for å justere innholdet til 5 kaseinolytiske enheter pr.gram proteiner.

Hvis man for eksempel ønsker å behandle 10 liter standard-Y-globuliner som inneholder 154 gram proteiner pr. liter må man tilsette X liter av en løsning A slik som man fikk i eksempel 1, som inneholder 12 5 gram proteiner pr. liter og 2 000 kaseinolytiske enheter pr. liter.

X bestemmes lett på følgende måte:

dvs.

eller omtrent 5,6 liter.

Etter at man har forsikret seg om blandingens sterilitet,

inkuberes den ved 37°C og pH 7. Man kontrollerer regelmessig på en uttatt prøve, f.eks. hver 8. dag, den antikomplementære virkning helt til den er forsvunnet.

Vanligvis tar det 14 til 28 dager. Man regner at antikomplementærvirkningen er forsvunnet når den er over 50 mg/ml for å fiksere 2 enheter C 50 %. Man stopper inkubasjonen og man behandler med bentonitt og aluminagel under de samme betingelser som i eksempel 1.

EKSEMPEL 3

Man arbeider på tilsvarende måte til den som er beskrevet i eksempel 2, men man tilsetter løsning A slik som man fikk den i eksempel 1, under andre betingelser for pH og enzymatisk konsentrasjon.

Den enzymatiske konsentrasjon justeres til 1,25 kaseino-lystiske enheter pr. gram proteiner. Inkubasjonen utføres ved pH 4 i 18 timer ved temperatur 37°C. Man arbeider videre som i eksempel 1, men man sløyfer bentonittbehandlingen.

Man får et y-globulinpreparat som kan brukes intravenøst

etter oppløsning i vann.

Kliniske undersøkelser

De foreliggende undersøkelser er gjennomført på forskjellige hospitaler og omfatter i alt 119 syke, derav 20. voksne og 99 barn.

y-globuliner fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnel-

sen innføres via intravenøs vei, idet degjeldendé <p>reparater hver gang injiseres langsomt i en til to timer, slik at hver dose fortynnes i 100 ml fysiologisk serum inneholdende 5 g natriumklorid pr. liter, og idet man hver gang benytter mindre volum til nyfødte. De injiserte doser av y-globuliner innføres i en enkelt dose og varieres mellom 250 mg til nyfødte eller for tidlig fødte og 9 g til voksne.

Rytmen ved injeksjonene varieres i henhold til sykdomsår-

saken: hver annen dag ved alvorlige infeksjoner, hver 15. dag til 3 uker som profylakse ved a-y-globulinæmi.

I flertallet av tilfeller er de behandlede sykdommer meget alvorlige:

malign blodsykdommer og tumorer .(50)

infeksjoner (7)

alvorlige infeksjoner (10)

a-y-globulinæmi (7)

virussykdommer (43)

infeksjoner hos nyfødte (6)

diverse (3).

Toleranse

Toleransen er perfekt hos 116 syke av 119, hvorav flere personer har mottatt adskillige injeksjoner.

En lege har hos en enkelt av sine pasienter konstatert en følelse av trykk for brystet og kvelningsfornemmelse. Men pasientens almene tilstand og spesielt lungetilstand var slik at det var vanskeLig å tilskrive disse sykdomstegn til innvirkningen som fulgte innførelsen av Y-globuliner via intravenøs vei. En ny injeksjon noen dager senere har ikke medført vanskeligheter hos denne pasient.

En annen lege har hos to pasienter (av 37} som har mottatt

i alt 55 injeksjoner konstatert visse reaksjoner som er van-skelige å fortolke. Et barn på 13 måneder viser etter å

ha mottatt en dose på 5 mg "tegn på mildt sjokk med cyanose, kuldegysninger i ekstremitetene uten spenningsfall, idet disse tegn dog er hurtig vikende, og idet det bemerkes at de følgende injeksjoner mottas fullstendig perfekt hos denne pasient".

Et barn på 4 år har ved innføring av en dose på 2 g og i to tilfelle mellom to injeksjoner, som forøvrig ble mottatt fint, utvist febertilstand med 40°, dog av kort varighet.

Det må imidlertid konstateres, at toleransen har vært fin og til og med fremragende, dog med unntagelse av de ovenfor 3 anførte tilfeller, hvis fortolkning forøvrig er vanskelig med hensyn til de alvorlige sykdomstilfeller som herved er behandlet.

Kliniske resultater

For ordens skyld bemerkes det først at det har vært umulig

å bedømme de prøvde produkter og deres virkning under total objektivitet, fordi de først og fremst har vært prøvet på pasienter som lider av meget alvorlige sykdommer. I nesten

halvparten av tilfellene var det tale om cancer eller malign hæmopatier. Til visse eldre pasienter som lider av infeksjoner har behandlingen kun vært benyttet i sykdommens slutt-stadium. Hertil kommer også at andre tefcapeutika kan ha vært benyttet parallelt med de her innførte y-globuliner, især antibiotika.

Det er letteæå bedømme den térapeutiske effektivitet ved inngivelse av de gjeldende y-globuliner i de.7 tilfeller som vedrører syke med a-y-globulinæmi, samt i forløpet av visse virusinfeksjoner, i hvilke tilfeller man ikke har benyttet antibiotika. Således har man hos 14 personer, som lider av maligne hæmopati og av infeksjoner av viral opprinnelse

(2 virale pneumopaties, 3 hepatitt, 3 zonas (helvetesild)

og 6 brennkoppertilfeller), oppnådd fremragende resultater i alle tilfeller. Forøvrig har 4 barn som var underkastet en behandling med corticosurenale hormoner under en hospital-epidemi med brennkopper mottatt y-globulinene intravenøst, da risikoen for maligne brennkopper er velkjent hos barn, som mottar corticoterapi. Skjønt de vanlige isolasjonsfor-anstaltninger ikke har forhindret om-seg-gripen og oppduk- . ning av nye tilfeller har dog ingen av barnene som har mottatt y-globulinene intravenøst fått brennkopper. Denne kjensgjerning er så mye mer bemerkelsesverdig, som standard y-globuliner kun har hatt liten virkning med hensyn til å hindre brennkoppertilfeller. Det dreier seg således her om en særlig interessant preventiv virkning.

Hos syke som lider av a-y-globulinæmi, er de mengder som skal injiseres via intramuskulær vei når man benytter standard-y-globuliner slik at de som uomgjengelig, følge innebærer smertefenomener. Intoleransereaksjonene i løpet av gjen-tatte behandlinger med standard y-globulinene er forholds-vis hyppige hos disse a-y-globulinæmitilfeller. De fore-kom således hos 2 pasienter og gjorde praktisk behandling umulig hos den ene av disse. Skjønt det kan forekomme para-doksalt, har behandlingen via intravenøs vei vært bedre fundert og har ikke medført anafylaktiske reaksjoner. I de a-Y-globulinæmitilfeller som har vært iaktatt har man ikke konstatert noe tilfelle av intoleranse hittil, dvs. inntil den foreliggende rapport over de kliniske forsøk skrives etter behandlingstider, som strekkes seg over nesten 17 måneder.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av Y-globuliner, som kan inn-føres via intravenøs vei, karakterisert ved at man går ut fra det fra Taylors fremgangsmåte ved frem- . stilling av Y-globuliner ved fraksjonering av placentaékstrak-ter med alkohol erholdte bunnfall III-l, som fortynnes med vann og behandler den oppnådde oppløsning med en oppløsning av 2-etoksy-6,9-diaminoakridinlaktat, fjerner det derved dannede bunnfall, tilsetter filtratet en vandig oppløsning av ammoniumsulfat av tilstrekkelig konsentrasjon til å oppnå et bunnfall som består av Y~globulin og plasmin,. og som isoleres, hvoretter man underkaster en vandig oppløsning av dette bunnfall som eventuelt kan iblandes en vandig oppløsning av standard-Y-globulin, en inkubasjon ved en pH-verdi méllom 4 og 7 og ved en temperatur mellom 10 og 4 5°C, inntil antikomplementæraktiviteten er lavere enn den terskelverdi som tillater intravenøs injeksjon, hvoretter oppløsningen om nødvendig underkastes en adsorpsjonsbehandling med bentonitt for å fjerne resterende plasmin, og det således erholdte Y-globulinpreparat om ønsket lyofiliseres, fortrinnsvis i nærvær av glykokoll.