NO142754B - Fremgangsmaate og apparat for aerob dyrkning av en mikroorganisme - Google Patents

Description

Oppfinnelsen er knyttet til industriell gjæring for fremstilling av proteiner i stor målestokk, og ved-rører en fremgangsmåte for aerob dyrkning av en mikroorganisme i et flytende næringsmedium omfattende i det minste en karbonkilde som er assimilerbar av mikroorganismen, hvorved en kulturvæske bestående av det flytende næringsmedium og en cellemasse av mikroorganismen sirkulerer i en lukket krets mellom et øvre og et nedre nivå ved hjelp av oksygenholdige gassbobler.

Dyrkning av aerobe mikroorganismer med høyt utbytte, og spesielt på petroleumfraksjoner eller på substrater oppnådd fra petroleum som bare inneholder meget lite oksygen, krever meget høye oksygenoverførings-forhold som ikke kan nås effektivt i industriell måle-

stokk i vanlige gjærtanker som omrøres eller i gjæringstårn med sirkulering. I denne sammenheng er en kultur med høyt utbytte,en kultur hvor det er mulig å fremstille fra 10 til 20 g bakterier eller gjær pr. 1 næringsvæske pr.

time hvor substrater som tilsvarer formelen C H„ ,„ eller

n Zn+2. <C>"n<H>2n+l0H f.eks. krever oksygenoverføringshastigheter som ligger over 500 mmol O 2 pr. 1 pr. time. Høye oksygenover-føringstall gjør det mulig med høye karbondioksydoverfør-ingstall. Graden av disse to overføringer skulle ikke for-årsake noen hemmende effekter som skyldes for høye partielle oksygen- eller karbondioksydtrykk i gassen som bringes i kontakt med eller som sirkulerer i kulturvæsken.

Selv om det er mulig å øke oksygenoverføringstallet

i en vanlig gjæringstank som omrøres, ved å anvende oksygen-anriket luft, kan en økning i hastigheten hvorved karbondioksyd som fremstilles under gjæringen fjernes, bare til-veiebringes ved en betraktelig øket utluftning. Det er imidlertid ikke mulig i det uendelige å øke gjennomstrøm-ningen av luft i en vanlig gjæringstank uten man raskt overstiger den grensen hvor skummet som dannes ikke lenger kan kontrolleres. I dette henseende, er situasjonen mer gunstig når man anvender et gjæringstårn med sirkulasjon som er utstyrt med et effektivt separasjonssystem ved toppen av tårnet mens den i hvert fall delvis avgassede

væske resirkuleres gjennom bunnen av tårnet. Hvis det i dette tilfelle imidlertid er ønsket å øke utluftingen for å få et oksygenoverføringstall som er nødvendig for en kultur med høyt utbytte, støter man igjen på en grense som oppstår når det dannes visse foretrukne strømnings-veier som følges av gassboblene i en næringsvæske som ikke er tilstrekkelig omrørt. Økningen i den relative hastighet av gass-strømningen i forhold til kulturvæsken fører følgelig ikke til den ønskede forbedring i oksygenover-føringstallet, men istedet til den hemmende effekt som skriver seg til de gradienter som derved oppstår og som til slutt må føre til et rent energitap. Selv om det er mulig å forbedre situasjonen ved å sette inn visse forhindringer, slik som skjermer i den veien den nedstigende gass følger, kan dette bare gjøres hvis forhindringene i sin tur ikke forårsaker at det dannes for høye partielle oksygen-trykkgradienter som skaper en hemmende trykksone i den nedre del av tårnet.

Fremstilling av mikroorganismer med høyt utbytte på substrater med lite oksygen omfatter også alvorlige varme-overføringsproblemer. I en fremgangsmåte hvor gjærings-varmen overstiger 8000 kcal pr. kg celler som er fremstilt med en produksjonshastighet 15 g pr. 1 pr. time, vil f.eks. økningen i temperaturen i mediet bli 2°C pr. minutt hvis mediet ikke avkjøles. Det er derfor nødvendig å frem-bringe et effektivt kjølesystem. Et kjølesystem som krever varmeoverføring i selve fermenterings- eller gjæringssonen kan ikke anbefales når det gjelder kulturer med høyt utbytte på grunn av de uønskede forhindringer som ut-gjøres av kjøleoverflåtene som er nødvendige for å holde en gjæringstemperatur på 30 til 40°C. Av denne grunn må kjølesystemet ligge utenfor gjæringssonen. Å opprettholde lave temperaturgradienter ved hjelp av et slikt system krever dessverre en høy sirkulasjonshastighet i væsken.

Det er bare mulig å få høye sirkulasjonshastigheter i et vanlig gjæringstårn på bekostning av en reduksjon i oksy-genoverf øringstallet som går mot kravet om maksimal vekst-hastighet .

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for aerob dyrkning av en mikroorganisme i et flytende næringsmedium omfattende i det minste en karbonkilde som er assimilerbar av mikroorganismen, hvorved en kulturvæske bestående av det flytende næringsmedium og en cellemasse av mikroorganismen sirkulerer i en lukket krets mellom et øvre og et nedre nivå ved hjelp av oksygenholdige gassbobler, og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at kulturvæsken i en fermenteringssone som strekker seg langs den oppstigende side av neynte krets fra det nedre nivå og til et høyeste punkt under det øvre nivå, underkastes den kombinerte virkning av friksjonskreftene av bobler av en gass som inneholder oksygen eller av oksygen som er frigjort under trykk i kulturvæsken ved det nedre nivå, og en mekanisk omrøring og blanding ved minst noen steder langs oppstigningssiden, og at det utøves et mottrykk på kulturvæsken øverst i fermenteringssonen. Næringsvæsken avkjøles fortrinnsvis utenfor fermenteringssonen.

Dyrkningen utføres fortrinnsvis kontinuerlig og

om mulig, langs den nedstigende side av kretsen som er knyttet til den oppstigende side ved det høyere og det lavere nivå delvis for å avgasse næringsvæsken, for-å av-kjøle den og for å gjenvinne minst en del av cellemassen som finnes i den, mens næringsvæsken som resirkuleres til gjæringssonen samtidig anrikes med næringssubstanser.

Fordelene ved foreliggende fremgangsmåte omfatter en ensartet fordeling av gassen i væsken ved høy utluft-ningshastighet, homogenitet i næringsvæsken langs gjæringssonen uten hemmende gradienter, maksimal utbredelse av gjæringssonen i det rom som er tilgjengelig for dette for-mål og effektiv overføring ved en høy sirkuleringshastighet i væsken. Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det også mulig å redusere den totale mengde energi som anvendes for å overføre en gitt mengde oksygen pr. volumenhet av utluftet væske i forhold til den mengde som anvendes i en konvensjonell fremgangsmåte. En annen fordel ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er at den fleksibelt kan til-passes spesifikasjonene for en lang rekke kulturer både med hensyn til veksthastigheten av mikroorganismene og med hensyn til den vannmengde som frigjøres under gjæringen eller med hensyn til oksygennivået eller det partielle karbondioksydtrykk.

På toppen av gjæringssonen, men under det øvre

nivå, er det tilrådelig å ha et trykk som er høyere enn trykket ved det øvre nivå. På denne måte er det mulig å understøtte fordelene med fremgangsmåten både med hensyn til fleksibilitet og med hensyn til graden av oksygenover-føring siden den del av kretsen som ligger mellom toppen av gjæringssonen og det øvre nivå kan anvendes for å ut-vide gassene som tilføres under trykk, mens trykkfallet fra bunnen til toppen av gjæringssonen kan begrenses til i det vesentlige det som bevirkes av høyden til søylen med næringsvæske.

Ifølge oppfinnelsen er det også tilveiebrakt et apparat for utførelse av den ovenfor angitte fremgangsmåte, og omfattende en lukket ledning som består av en oppstigende og en nedstigende side som står i forbindelse med hverandre ved et øvre og et nedre nivå, og dette apparat er kjennetegnet ved at- den oppstigende side omfatter et kammer som avgrenser en fermenteringssone som strekker seg fra det nedre nivå og til et høyeste punkt under det øvre nivå, idet nevnte kammer i sin nedre ende inneholder en innretning for innføring av gass, samt en innretning for mekanisk fremføring av en kulturvæske og en anordning for mekanisk blanding av kulturvæsken i hele dens høyde, og idet kammeret i sin øvre ende er forsynt med en mottrykksventil.

Det er en fordel å innføre innretninger for avgassing av næringsvæsken og innretninger for å avkjøle næringsvæsken på den nedstigende side. De som er kjent med den foreliggende teknikk vil forstå av det foregående, at apparatet ifølge oppfinnelsen etter sin konstruksjon spesielt er beregnet for kontinuerlig behandling av store mengder næringsvæske. Volumet av gjæringskammeret kan være

3 3

mer enn 50 m og til og med mer enn 100 m , og hvis opp-holdstiden av næringsvæsken i kammeret er i størrelsesorden 1 minutt, kan gjennomstrømningen være mellom 50 og 100 m<3>

pr. minutt. For under disse betingelser å begrense dimen- . sjonene på kjølesystemet og mengdene kjølevæske som er nød-vendig, er det tilrådelig å tilveiebringe en varmeveksler mellom en kompressor og en kondenser for kjølevæsken, nemlig en fordampningsveksler. Med varmeveksler av denne typen, som kan virke med gjennomstrømninger av kjølevæske på fra 10 til 20 tonn pr. time, og hvor kjølevæsken kan være freon, er det mulig å redusere størrelsen på over-flaten i varmeveksleren og derved redusere trykktapene mens man på den samme tid har fordelen av temperaturfor-skjellen som er gunstig for varmeoverføringen. Med hensyn til innretningene for avgassing, nemlig innretningene for å fjerne nitrogen i luften (i de tilfeller hvor luft til-føres gjæringskammeret), karbondioksyd som avgis under gjæringen og oksygen som ikke er anvendt, er det mulig å innføre en overflateeffektseparator eller hydrosyklon på toppen av den oppstigende side.

Innretninger for å gjenvinne cellematerialet som bæres av næringsvæsken kan tilkobles på den nedstigende side mens en tilførselsledning for næringsstoffer kan tilkobles den lavere del av gjæringskammeret. Gjenvinnings-innretningene kan bestå av en ledningsgren hvorigjennom en del av den avgassede næringsvæske kan overføres til innretninger for å skille cellemassen fra næringsvæsken, hvoretter næringsvæsken som er frigjort for cellemassen kan føres tilbake gjennom en resirkuleringsledning til den nedstigende side eller inn i gjæringskammeret. I dette henseende er det rimelig å anta at mengden næringsvæske som behandles pr. time for å skille cellemassen fra den,

er av samme størrelse som mengden næringsvæske som kommer inn i gjæringskammeret pr. minutt. Næringsstoffene kan innføres gjennom tilførselsledningen til gjæringskammeret for å fornye den mengde som brukes opp av mikroorganismen som dyrkes i kammeret, og disse næringssubstanser kan f.eks. være et hydrokarbon, en alkohol eller et sukker som karbonkilde og ammoniakk eller urea som nitrogenkilde.

Innretningene for mekanisk å drive næringsvæsken inn i gjæringskammeret kan bestå av minst et skovelhjul som roterer i horisontalplanet og som er istand til å drive næringsvæsken oppover og dermed forsterke den oppstigende virkning av friksjonen av boblene av luft eller oksygen som frigjøres under trykk ved bunnen av kammeret. Innretningene for mekanisk å blande næringsvæsken i kammeret kan bestå av flere roterende blader eller vinger som er plassert ovenfor hverandre i en viss avstand. Disse innretningene kan monteres på en felles vertikal roterende aksel som er drevet av en motor. Siden en annen virkning av disse bladene i tillegg til å blande næringsvæsken er å skape turbulente strømninger som gir en viss motstand til oppstigningen av næringsvæsken i kammeret, kan det være ønskelig å gi bladene eller vingene eller i det minste noen av dem, en helning i forhold til horisontalplanet eller en slik utførelse at minst ett av bladsettene foreligger i form av et skovelhjul som er istand til å drive næringsvæsken oppover. Det er åpenbart at en hvilken som helst kombinasjon av drivinnretninger og blandeinnretninger er mulig.

Gjæringskammeret behøver ikke nødvendigvis å strekke seg over hele avstanden mellom det øvre nivå og det lavere nivå, men istedet kan en passasje med en mottrykksventil være anordnet ved toppen av gjæringssonen, hvilken passasje ender i det øvre nivå hvor den åpner seg inn til toppen av den nedstigende side. Det er således mulig å opprettholde et trykk på et hvilket som helst nivå i kammeret som kan være fra åtte til ti meter høyt, som stort sett tilsvarer trykket hvorunder luften eller oksygenet til-føres bunnen av kammeret minus det hydrostatiske trykk av kolonnen med luftblandet næringsvæske som befinner seg mellom bunnen av kammeret og angjeldende nivå. Hvis man skal oppnå en ganske høy hastighet på oksygenoverføringen i gjæringskammeret, dvs. mer enn 50 mmol O2 og kanskje mer enn 900 mmol 02 pr. 1 pr. time, kan det derfor bli nød-vendig å ha et trykk på minst 3 til 3,5 atmosfærer i næringsvæsken som inneholder dispergert en luftmengde som er ca. 40 volum-% og i dette tilfelle kan overskuddsenergi fra tilførselsgassen ved utløpsenden av kammeret anvendes til å la røret som leder fra den trange passasjen til det øvre nivå hvor man har atmosfæretrykk, virke som en luftpumpe.

Fordelen av denne adskillelsen av overføringen av oksygen og ekspansjonen av tilførselsgassen er at det er mulig fullstendig å eliminere trykktap, og særlig trykktap som skriver seg fra kjølesystemet og å få en sirkulering i næringsvæsken gjennom apparatet mens man samtidig i gjæringssonen har et trykk som er tilstrekkelig høyt og jevnt til å få de nødvendige oksygenoverføringshastigheter. Det er mulig å tilveiebringe en trang passasje i form av en innsnevring, et diafragma eller en rekke skjermer som delvis overlapper hverandre langs en passasje som fører fra. toppen av kammeret til røret som fører til det øvre nivå.

En utførelse av apparatet som anvendes for å utføre fremgangsmåten er beskrevet ved hjelp av de følgende teg-ninger som er et diagramatisk vertikalt snitt gjennom ut-førelsen ifølge dette eksemplet.

Et vertikalt, avlangt metallkammer 1 utgjør en gjæringssone 2. En roterende aksel 3 går gjennom hele gjæringssonen, med andre ord fra det nedre nivå 4 i apparatet til toppen 5 i kammeret. Akselen 3 drives av en elektrisk motor 6 som finnes under kammeret. Sett av blader eller vinger 7, 8, 9 og 10 er plassert med jevne mellomrom på akselen 3. Hvert sett, f.eks. settet 8, består av fire flate vinger 11. Planet for hver vinge er skrått i forhold til vertikalplanet som defineres av dets frie ende og akselen 3 slik at hvert sett både kan anvendes for å

blande næringsvæsken under gjæringen i sonen 2 og for å drive næringsvæsken oppover. Gasstilførselsinnretningene 12 som er montert på bunnen av kammeret består av et sett horisontale rør som er forsynt med små hull. En til-førselsledning 13 for gassen hvis strømningshastighet er kontrollert av en gasstilførselsventil 14, skal tilføre rørene 12 gass som frigjøres under det nødvendige trykk i bunnen av kammeret 1. En mottrykksventil 15 på toppen av kammeret 1 forbinder den øvre del av gjæringssonen 2 til et ekspansjonsrør 16 som fører til det øvre nivå 17 i apparatet. Denne ventilen 15 utgjør en trang passasje for den luft-

fylte næringsvæsken og skal således forhindre trykktap som • ikke skyldes reduksjon i søylen av luftblandet næringsvæske i kammeret. Ekspansjonsrøret 16 utgjør således den øvre del av den oppstigende side av apparatet. Rørets høyde er slik at det samtidig gjør det mulig å kompensere trykktap i den nedstigende del, og overvinne motstander som ikke fullstendig er blitt kompensert i gjæringskammeret ved den drivende kraft av de to sett skovelhjul og å opprettholde den nødvendige sirkulasjonshastighet av næringsvæsken i den lukkede sløyfen som henholdsvis består av den oppstigende side og den nedstigende side av apparatet som står i forbindelse med hverandre ved henholdsvis den øvre og det nedre nivå 17 og 4. En gass-skilleinnretning 18, i det foreliggende tilfelle en syklon, er den første komponent i den nedstigende side. Et u£løpsrør 28 for gassen som enten ikke frigjøres eller ikke forbrukes under gjæringen er forbundet til den øvre del av syklonen 18 og åpner ut til atmosfæren gjennom ventilen 19 som skal kontrollere trykk-gradientene i apparatet. Den nedre del av syklonen 18 som skal motta næringsvæsken som i hvert fall er delvis skilt fra gassene, er forbundet med en tilbakeløpsledning 20.

I ledningen 20, har næringsvæsken en relativ høy tetthet som garanterer at ledningen 16 kan virke som en luftpumpe hvor den luftblandede og gjærende næringsvæsken sirkulerer i form av en dispersjon som leveres fra trykk gjennom mottrykksventilen 15. En ledning for å gjenvinne cellemateriale som bæres av den i hvert fall delvis avgassede næringsvæske eller grenledning 21 er forbundet til til-bakeløpsledningen 20. Gjennomstrømningen av næringsvæske

.som skal behandles for å skille cellematerialet fra den, kontrolleres av en gjenvinningsventil 22 som er seriekoblet til ledningen 21. Ledningen 21 fører til en innretning for å gjenvinne cellematerialet f.eks. en sentrifuge (ikke vist). En kjøleveksler av fordampningstypen, er forbundet i serie til tilbakeløpsledningen 20 for sirkulering av næringsvæsken og i serie mellom en kompressor og en kondenser (ikke vist) for å sirkulere kjølevæsken 24. En avsluttende del av tilbakeløpsledningen 20 fører fra varme-

veksleren 23 til bunnen av gjæringskammeret 1 gjennom en ventil 25 for å kontrollere sirkulasjonshastigheten av næringsvæsken i apparatet. Endelig viser 26 til en til-førselsledning for næringsstoffer som er forbindet til den lavere del av gjæringskammeret. Ledninger 26 går gjennom en ventil 27 for å kontrollere strømningshastighet-en av næringsvæsken som leveres av en blander (ikke vist). En ledning for resirkulering av næringsvæsken som er fjernet gjennom ledningen 21 og deretter skilt fra sitt cellemateriale, kan forbindes til denne blanderen for næringssubstanser. Hva man kan kalle den annen lukkede krets hvor den del av næringsvæsken hvorfra cellematerialet kontinuerlig kan fjernes, forbindes med den lukkede sløyfe hvor hele eller nesten hele næringsvæsken sirkulerer.

Fremgangsmåten og apparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse er spesielt anvendelig for dyrkning av mikroorganismer for fremstilling av intracellulære og ekstracellulære stoffer, slik som proteiner og aminosyrer.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for aerob dyrkning av en mikroorganisme i et flytende næringsmedium omfattende i det minste en karbonkilde som er assimilerbar av mikroorganismen, hvorved en kulturvæske bestående av det flytende næringsmedium og en cellemasse av mikroorganismen sirkulerer i en lukket krets mellom et øvre og et nedre nivå ved hjelp av oksygenholdige gassbobler, karakterisert ved at kulturvæsken i en fermenteringssone som strekker seg langs den oppstigende side av nevnte krets fra det nedre nivå og til et høyeste punkt under det øvre nivå, underkastes den kombinerte virkning av friksjonskreftene av bobler av en gass som inneholder oksygen eller av oksygen som er frigjort under trykk i kulturvæsken ved det nedre nivå, og en mekanisk omrøring og blanding ved minst noen steder langs oppstigningssiden, og at det utøves et mottrykk på kulturvæsken øverst i fermenteringssonen.

2. Apparat for aerob dyrkning av en mikroorganisme i et flytende næringsmedium omfattende i det minste en karbonkilde som er assimilerbar av mikroorgansimen, hvorved en kulturvæske bestående av det flytende næringsmedium og en cellemasse av mikroorganismen sirkulerer i en lukket krets mellom et øvre og et nedre nivå ved hjelp av oksygenholdige gassbobler, ifølge fremgangsmåten i krav 1; omfattende en lukket ledning som består av en oppstigene og en nedstigende side som står i forbindelse med hverandre ved et øvre og et nedre nivå, karakterisert ved at den oppstigende side omfatter et kammer (1) som avgrenser en fermenteringssone (2) som strekker seg fra det nedre nivå (4) og til et høyeste punkt under det øvre nivå (17), idet nevnte kammer (1) i sin nedre ende inneholder en innretning (12) for innføring av gass, samt en innretning (7-10) for mekanisk fremføring av en kulturvæske og en anordning (7-10) for mekanisk blanding av kulturvæsken i hele dens høyde og idet kammeret (1) i sin øvre ende er forsynt med en mottrykksventil (15).

3. Apparat ifølge krav 2,karakterisert ved at den mekaniske blandeanordning (7-10) og den mekaniske fremføringsanordning tilsammen utgjøres av en rekke vinger eller plater (11) som er roter-bart festet i avstand fra hverandre langs en vertikal roterbar akse (3), idet minst en del av hver vinge eller plate (11) er skråttstilt i samme retning i forhold til vertikalplanet.