NO137598B - Fremgangsm}te til fremstilling av ren, krystallinsk penicillinacylase - Google Patents
Fremgangsm}te til fremstilling av ren, krystallinsk penicillinacylase Download PDFInfo
- Publication number
- NO137598B NO137598B NO3693/72A NO369372A NO137598B NO 137598 B NO137598 B NO 137598B NO 3693/72 A NO3693/72 A NO 3693/72A NO 369372 A NO369372 A NO 369372A NO 137598 B NO137598 B NO 137598B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- enzyme
- bentonite
- solution
- penicillin acylase
- pure
- Prior art date
Links
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 title claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 51
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 43
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 claims description 28
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 claims description 28
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 12
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000002156 adsorbate Substances 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 15
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 15
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 13
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 13
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 10
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 6
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 5
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940043265 methyl isobutyl ketone Drugs 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 2
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- -1 sulfoethyl Chemical group 0.000 description 2
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-nitrobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(O)=O)=C1 KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000002238 CM-cellulose chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- AZCVBVRUYHKWHU-MBNYWOFBSA-N Penicillin X Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AZCVBVRUYHKWHU-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] Chemical compound [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N dialuminum;dioxosilane;oxygen(2-);hydrate Chemical compound O.[O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3].O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 229910052901 montmorillonite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZCVBVRUYHKWHU-UHFFFAOYSA-N penicillin X Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AZCVBVRUYHKWHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052604 silicate mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
- C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/816—Enzyme separation or purification by solubility
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Oppfinnelsen vedrører fremgangsmåte til fremstilling av ren, krystallinsk penicillinacylase.
Penicillinacylase (Penicillinamidase, Penicillin-deacylase) (EC (Enzyme Comission) 3-5.1.H) er et i lengre tid kjent enzym (K. Sakaguchi og S. Hurao, J. agr. Chem. Soc.,
Japan, -23.,-411 (1950)), som hydrolyserer amidbindingen i 6-stilling av benzylpenicillin under dannelse av 6-aminopenicillan-syre (6APS) og fenyleddiksyre. Forekomsten av dette enzym ble påvist i-et stort antall bakterier og sopp (J.M.T. Hamilton-Miller, Bact. Rev. 30, 76l (1966)). Penicillanacylase fra E..coli har en bred spesifitet, ved siden av benzylpenicillin hydrolyseres et stort antall andre penicilliner, f.eks. penicillin X og ampicillin, samt tallrike ved amidnitrogen alifat-iske eller aromatiske .substituerte amider av fenyleddiksyre og dens ved a-C eller ved benzenringen substituerte derivater (M. Cole, Biochem. J. 115, 733 (1969); W.. Kaufmann og K..Bauer, Nature 203, 520 (1964)).
Virkningen av enzymet utnyttes over hele verden i storteknisk målestokk for fremstilling av 6APS fra benzylpenicillin. Den tekniske gjennomføring av denne fremgangsmåte foregikk hittil ved anvendelse av de hele enzymholdige celler, (tysk patent nr. 1.111.778) eller et fra cellen ekstrahert, imidlertid ikke vidererenset enzym (US-patent nr. 3.297.546)., eller det urensede, til bentonit adsorbert enzym (US-patent nr. 3.446.705). I sistnevnte tilfelle omtaler eksemplene fremgangsmåten bare
for penicillinacylase fra Bacillus megaterium og fra Strepto-myces, således at det herav Ikke lar seg utlede noen henvisning for enzym fra E. coli.
Adsorbsjonen av proteiner og enzymer på bentonit er riktignok kjent (Methods in Enzymology, Vol. I, 96), imidlertid er det hittil bare lykkes i de mest sjeldne "tilfeller igjen å eluere et adsorbtivt bundet enzym i godt utbytte og høy renhet.
Anvendelse av hele cellene eller det ekstraherte, urensede enzym har imidlertid forskjellige ulemper. Spesielt er en slik ulempe spaltningen av en del av det anvendte penicillin ved virkningen av andre i råpreparater inneholdte enzymer, spesielt av penicillin-B-lactamase, og derved forårsaker et nedsatt utbytte av 6APS. En annen vesentlig ulempe er en
y forurensning av 6APS med proteiner, som kan føre til allergiske reaksjoner ved anvendelse av de av denne 6APS fremstilte synte-tiske penicilliner på mennesker. Disse forurensninger lar seg bare fjerne ved omstendelige og tapsrike rensningstrinn fra 6APS.
De nevnte ulemper ved anvendelsen av hele celler eller et rått cellefritt enzym unngås ved anvendelse av et rent penicillinacylasepreparat. Hittil sto det imidlertid ikke til disposisjon en enkel teknisk gjennomførbar fremgangsmåte til renfremstilling av enzymet.
Den.delvise rensning av penicillinacylase i mindre mengder er allerede beskrevet forskjellige steder (P.S. Eorkar et al., Hindustan Antibiotics Bull. 4, 152 (1961), A. Szen.tirmai, Acta Microbiologica Acad. Sei. Hung. 12, 395, (1966), D.A. Seif et-al., Biotechnology and Bioengeneering JL1, 337 ,.(1969)) • Dissei fremgangsmåter går over flere utfellings-, adsorbsjons- eller kromatografitrinn og gir bare små utbytter. En delvis rensning i større målestokk ved utfelling med tannin og rensning med forskjellige ioneutvekslere er videre omtalt i DOS 1.907-365-
Et som elektroforetisk homogent betegnet acylase-preparat ble dannet av Bondareva et al: (Biochemistry (Russ.) 3_4_, 76» (1969))
i laboratoriemålestokk ved ammoniumsulfatutfelling, kromatografi på CM-cellulose og kromatografi på DEAE-cellulose i 27% utbytte. Krystalliseringen av penicillinacylase er hittil ikke blitt beskrevet. Disse kjente fremgangsmåter gir enten bare et del-renset enzym eller de er kompliserte og tapsrike.
Det oppsto derfor behov for en enkel fremgangsmåte til fremstilling av det rene penicillinacylase. Dessuten var krystalliseringen ønskelig å oppnå, da den på den ene side er et renhetskriterium og på den annen side danner krystallsuspen-sjonen en stabil oppbevarings- og transportform for enzymet .
Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte som muliggjør å fremstille og å krystallisere ren penicillinacylase fra E. coli
på enkel måte.
Oppfinnelsen vedrører en .fremgangsmåte til fremstilling av ren, krystallinsk penicillinacylase, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at (1) man innstiller en råekstrakt av Escherichia coli-celler, som ved siden av penicillinacylase dessuten inneholder fragmenter av Escherichia coli-celler til en pH-verdi fra 3,5 til 5,5 og adskiller celle-fragment.ene, (2) bringer den dannede oppløsning ved hjelp av en "mixed bed"-ioneutveksler eller ved fortynning til en spesifikk ledningsevne på 0 til 5 mS og innstixler på en pH-verdi fra 3,5 til 8,0., (3) til den således dannede oppløsning settes bentonit, idet hvis bentoniten tilsettes i rekkefølge i flere porsjoner kasseres det etter første bentonittilsetning dannede adsorbat., (4) fraskiller bentonitenzym-produktet, (5) eluerer enzymet med en 0.,1 - 1,0 molar vandig oppløsning av ét uorganisk eller organisk salt fra bentonit-enzym-produktet, (6) dialyserer den enzymholdige oppløsning eventuelt mot en alkali-fosfat-elier acetatpufferoppløsning, (7) behandler med en anion- og/ eller kationutveksler, (8) eluerer enzymet fra ioneutveksleren på vanlig måte, (9) fra den vandige oppløsning krystalliseres enzymet ved tilsetning av ammoniumsulfat.
Aktiviteten av den ifølge oppfinnelsen fremstilte penicillinacylase bestemmes ved en ny kolorimetrisk prøve, som utnytter enzymets brede spesifitet (C. Kutzbach, E. Rauenbusch "Preparation and general Properties of Crystalline Penicillinacylase from Escherichia coli ATTC 11.105", Hoppe-Seylers Zeit-schrift fiir Physiologische Chemie 354, 45-53 (1974)).. Som sub-strat tjener 6-nitro-3-(N-feny.lacetyl)-amino-benzosyre (NIPAB). Målingen.foregår i 0,002 molar oppløsning pH 7,5> 25°C ved
405 nm. Den molare ekstinksjonskoeffisient av den ved reak-sjonen dannede 6-nitro-3~amino-benzosyre utgjør 9090 .1.mol 1,cm 1. En enzymatisk enhet (E) spalter l^u mol av substratet pr. minutt. Spaltning av benzylpenicillin under-de samme betingelser er omtrent 1,5 -ganger hurtigere. De spesifikke aktiviteter er refe-rert til etter Biuretmetoden bestemte protein.
Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen går man ut fra et råekstrakt av. E..coli-celler. Dette fremstilles f.eks. fra en ifølge tysk patent nr. 1.111.778 fremstillet kultur av E.coli-celler eller fortrinnsvis fra den i tysk patentsøknad
(P 21 54 213.2) omtalte mutant E.coli ATCC 21.728 ved behandling
med J>% metylisobutylketon ved pH 7-8 eller ved mekanisk opp-slutning, idet penicillinacylasen bringes til 70-90% i oppløs-ning-.
Dette råekstrakt bringes for lettere utfelling
av céllefragmenter og samtidig rensning av penicillinacylase ved utfelling av inaktiv protein og andre følgestoffer ved tilsetning av en mineralsyre f.eks. HC1, HNO^, HgSO^, H^PO^ eller en annen sterk syre, f.eks. eddiksyre til en pH-verdi på 3,5-5,5» fortrinnsvis 5»0 og det utfelte material adskilles på vanlig måte ved sentrifugering eller filtrering og kasseres.
Fra den som ovenstående fremstilte klare oppløs-ning bindes penicillinacylasen ved tilsetning av et aluminium-silikatmineral, fortrinnsvis av montmorillonit-typen, fortrinnsvis bentonit adsorbtivt. Mineralet adskilles på vanlig måte ved- filtrering eller sentrifugering og penicillinacylasen elueres fra residuet med en egnet saltoppløsning.
Adsorbsjonen av peniciliinacyxasen pa mineralet kan foregå vea en spesifikk ledningsevne av opplesningen pa 0-5 mS og en pH-verdi på 3>5-b,0. I den foretrukkeée utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen overholdes en ledningsevne på 1-4 mS og en pH-vérdi på 5»0. Innstillingen av oppløs-ningen av enzymet på den ønskede ledningsevne kan foregå ved fortynning, ved avsaltning med "mixed bed"-ioneutveksler og ved andre vanlige avsaltningsfremgangsmåter. Det beste utbytte og anrikning ved den etterfølgende eluering oppnås når det tilsettes nettopp så meget bentonit som er nødvendig for 100^-ig adsorbsjon av enzymet, hvilket prøves ved måling av aktiviteten i en prøve av det overstående. Under de foretrukkede betingelser er det ca. 2,0 - 5»0 g bentonit/g oppløst protein. En ennå bedre rensning oppnås når man foretar en frak-sjonert adsorbsjon idet man først tilsetter omtrent 1/5 av den samlede mengde av bentonit, idet det adsorberes omtrent uteluk-kende inaktivt fremmed protein. Etter adskillelse av det til-satte bentonit adsorberes deretter ved tilsetning av restmengden penicillinacylasen. For eluering av den adsorberte penicillinacylase anvendes 0,1-1,0 molar vandig oppløsning av uorganiske eller organiske salter, f.eks. fosfat, sulfat, aceta-t ved en pH-verdi på 6,0-9»0. Fortrinnsvis anvendes 0,1-1,0 molare opp-løsninger av Na- eller K-acetat ved pH 8,5» da det herved sammen-lignet med salter av toverdige og treverdige anioner fortrinnsvis elueres penicillinacylase. Tilsammen oppnås ved adsorbsjon på bentonit og eluering av enzymet en 4-6 gangers anrikning i ca. 70-90% utbytte. De spesielle fordeler ved dette rensetrinn ligger i den enkle gjennomførbarhet også i teknisk målestokk, volumreduksjonen av den enzymholdige oppløsning til 1/10 av rå-ekstraktet og utvinning av en konsentrert oppløsning av det anrikede enzym, som vesentlig letter den videre forarbeidelse.
Den videre rensning av penicillinacylasen til rent enzymprotein foregår ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ved kromatografi på egnede makroporøse ioneutvekslere og etterfølg-ende krystallisering. Derved kan man enten ved behandling med en ioneutveksler eller en kationutveksler fremstille en oppløs-ning av det delrensede enzym, hvorfra det rene enzym lar seg .krystallisere ved tilsetning av et utfellende salt. Eller man fremstiller i to trinn ved behandling med en kationutveksler og en anionutveksler i vilkårlig rekkefølge en oppløsning av det rene homogene enzym og hvorfra enzymet deretter likeledes kan krystalliseres.
Som anioneutveksler egner det seg spesielt med basiske grupper substituert, cellulose, f.eks. aminoetylcellulose, dietylaminoetylcellulose (DEAE-cellulose), trietylaminoetyl-cellulose (TEAE-cellulose) og tilsvarende tverrnettdannede dekstraner, f.eks. DEAE-"Sephadex" og QAE-"Sephadex". Rensningen på disse anioneutvekslere kan foregå ved pH 6,5-950- Fortrinnsvis gjennomføres fremgangsmåten i form av en søyle. Enzymet adsorberes fra en -fortynnet saltoppløsning og elueres ved senk-ning av pH eller økning av saltkonsentrasjonen i elusjonspuf-feren. Penicillinacylaseaktiviteten er regelmessig inneholdt i første fra søylen eluerte proteintopp. Fortrinnsvis foregår elueringen med en konsentrasjonsgrad igjen fra 0,01 til 0,1 M K-fosfat pH 7,0. Utbytte i dette rensetrinn utgjør 80-90%.
Som kationutveksler egner seg spesielt med sure grupper substituert cellulose, f.eks. sulfoetyl-cellulose, fos-forcellulose, karboksymetyl-cellulose, tverrbundede dekstraner, f.eks. Se-"Sephadex", SP-"Sephadex", CM-"Sephadex" og akryl-amidgelet, f.eks. "CM-Bio-Gel" eller ifølge Biochemistry <3, 4074 (1969) fremstilte karboksylgruppehoIdige polyakrylamid-geler og makroporøse harpiksioneutvekslere, f.eks. "Lewatit" SP-100, SP-120, CNP.
Adsorbsjonen av penicillinacylase på kationut-veksleren foregår fra 0,01-0,1 M saltoppløsning ved pH 3,5-
6,0, fortrinnsvis ved pH 5,0, enten ved tilsetning av ioneutveksleren til enzymoppløsningen eller ved overføring- av enzym-oppløsningen over en med utveksleren fylt søyle. Elueringen foregår enten ved en høyere pH-verdi på 6,0-8,5 eller fortrinnsvis ved liktblivende pH ved økning av saltkonsentrasjonen trinnvis eller i form av.en lineær gradient. Den foretrukkede utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av ren penicillinacylase er elueringen ved pH 5,0 ved en lineær gradient på 0,05-0,5 M natrium- eller kaliumacetat. Elueringen av penicillinacylasen foregår under disse betingelser som skarp sone ved ca. 0,2 M natriumacetat i 80-90% utbytte. -
Fra de ved anvendelse av anioneutvekslere alene eller i forbindelse med en kationutveksler dannede oppløsninger av den høyanrikede penicillinacylase, bringes enzymet til krystallisasjon ved utfelling med et egnet salt, fortrinnsvis ammoniumsulfat. Tilsetning av saltet kan foregå i konsentrert form eller i' fast form. Meget fortynnede oppløsninger av enzymet konsentreres på forhånd, mest hensiktsmessig etter kjente fremgangsmåter, f.eks. ved membranfiltrering eller ved utfel-ning med ammoniumsulfat til 7 0% metning og gjenoppløsning av" utfellingen i et mindre volum. Krystalliseringen foregår alt etter proteinkonsentrasjon fra 45~55%-ig mettet ammoniumsulfat - oppløsning, fortrinnsvis med en pH på 6,0-7,0 og værelsestemperatur i løpet av noen dager..Hurtig dannede krystaller har under mikroskopet form av splittede nåler. Ved langsom krystallisasjon får.man meget regelmessige plater (figur 1: Tegning av et opptak ved 200 gangers forstørrelse). Oppløs-ningen av det krystalliserte enzym gir i flate-elektroforese (7% gel, pH 8,9) bare et skarpt bånd (figur. 2).
Den rene krystallinske penicillinacylase er karakterisert ved følgende egenskaper: Spesifitet: Spaltning av•benzylpenicillin, N-fenacetyl-L-asparagin, 6-nitro-3(N-fenacetyl)aminobenzosyre og andre amider av fenyleddiksyre.
Molvekt: 71.000+ 2000 fra sedimentasjonslikevekt med et partielt spesifikt volum på v = 0,665 ml/g, 70.000 5000 fra tynnsjiktgelfiltrering.
Sedimentasjonskoeffisient: S^q w = 2,56 ± 0,035
ved pH 7,4, UV-spektrum (figur 3): i fosfatpuffer pH 7,0 (A)
og i 0,1 normal NaOH (B).
CD-spektrum: pH 4-10, (figur 4) betingelsene:
<250 nm: 0,085 mg/ml, d = 0,1 cm, >250 nm: 0,85 mg/ml, d = 1 cm.
[_ Aminosyreanalyse/:
Isoelektrisk punkt: 6,8 ± 0,2 (bestemt ved elek-trofokusering).
Eksempel 1.
a) Det for gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen nødvendige råekstrakt av E. coli-celler fremstilles idet man dyrker E. coli ifølge tysk patent nr. 1.111. 778, konsentrerer kulturen ved sentrifugering til et slam og oppslutter cellene, idet man etter tilsetning av 3% -metylisobutylketon og innstilling av pH-verdi til 7,5 omrører i flere timer. b) 90 liter av et således dannet råekstrakt innstilles ifølge oppfinnelsen til pH 5,0 og sentrifugeres. Det ble opp-nådd 8 0 liter klar oppløsning inneholdende 62.000 enheter med den spesifikke aktivitet 0,25 E/mg., Denne oppløsning avsaltes ved innrøring av "mixed bed"-ioneutveksler ("Lewatit" M
600 og S 100) til 1,5 mS. Etter frafiltrering av ioneutveksleren ble det under etterstilling av pH til 5,0 tilsatt 350 g bentonit (type SF, Firma Serva, Heidelberg), omrørt 30 minutter og bentoniten adskilt i en gjennomgangs sentrifuge. Det frasentrifugerte bentonit ble eluert med 5 liter 0,5 molar natriumfosfatpuffer pH 8,0 og frafiltrert. Det ble dannet 5,2 liter inneholdende 40.000 enheter (65%) av den spesifikke aktivitet 1,45 E/mg.
c) 9000 enheter av dette eluat ble ved gelfiltrering avsaltet, innstillet til pH 5,0 og ført over en 5 x 100 cm
søyle av Se-"Sephadex", ekvilibrert med 0,05 molar natriumacetat pH 5,0. Elueringen foregikk med en lineær gradient av hver 4 liter 0,07 og 0,25 molar natriumacetat pH 5,0. De forenede aktive fraksjoner inneholdt 8100 enheter (90%). Etter konsen-trasjon ved ammoniumsulfatutfelling til 7 0% metning utgjorde den spesifikke aktivitet 5,8 E/mg.
d) Den konsentrerte oppløsning av enzymet ble 'tilsatt: mettet ammoniumsulfatoppløsning til ca.. 50% metning. En derved
dannet lett uklarhet ble bortsentrifugert. Ved oppbevaring ved
4°C inntrådte etter noen dager krystallisering.
Eksempel 2.
60 liter av et ifølge eksempel la) fremstillet .oppsluttet råekstrakt ble innstillet til pH 5,0 og sentrifugert. Den overstående klare oppløsning inneholdt 92.000 enheter av den spesifikke aktivitet 0,45. Ved tilsetning av "mixed bed''-.
ioneutveksler ble det avsaltet til 1,0 mS. Til denne oppløsning ble det ved pH 530 først tilsatt 150 g bentonit og frasentrifugert. Deretter ble ytterligere 200 g bentonit tilsatt,, frasentrifugert • og' eluert med 5 liter 1 molar natriumacetat pH 8,0. Resultat: 51.000 (53%) av den spesifikke aktivitet 1,8 E/mg. .Eluatet ble avsaltet ved gelfiltrering og herav,
som omtalt i eksempel 1c), ved kromatografi på Se-"Sephadex" dannet en oppløsning av det rene enzym. Oppløsningen ble kon
sentrert og penicillinacylasen krystallisert ved tilsetning av mettet ammoniumsulfatoppløsning, som angitt i eksempel ld). Eksempel 3.
Et av 2900 liter enheter coli-kultur ifølge eksempel la) dannet oppsluttet råekstrakt ble innstillet til pH 5,0 og sentrifugert. Den overstående klare oppløsning (256 liter) inneholdt 150.000. E av spesifikk aktivitet 0,32. Ved fortynning med vann til 920 liter ble den spesifikke ledningsevne nedsatt til 2 mS. Det ble tilsatt 1 kg bentonit og frasentrifugert etter en times omrøring. Eluering med 0,5 molar natriumacetat pH 8,0 ga 6,9 liter, inneholdende 62.000 E av spesifikk aktivitet, 1,2 E/mg. Ved en annen eluering av bento-nitet med 0,5 molar natriumfosfat ble det fremstillet ytterligere 9.800 E. Samlet utbytte 47%.
47.000 E av første eluat ble avsaltet ved gelfiltrering, innstillet på pH 5,0 og adsorbert kvantitativt ved innrøring av ca. 400 ml fuktig Se-"Sephadex", ekvilibrert med 0,05 molar natriumacetat, pH 5,0. SE-"Sephadex"-gelen ble frafiltrert og pakket i en søyle av diameter 5 cm, som allerede inneholdt 1600 ml frisk Se-"Sephadex" i 0,05 molar natriumacetat pH 5,0. Deretter ble det eluert en lineær gradient av hver gang 4 liter 0,07 molar og 0,25 molar natriumacetat pH 5,0. De forenede aktive fraksjoner inneholdt 36.000 E av det rene enzym med den spesifikke aktivitet 5,3 E/mg.
Oppløsningen av det rene enzym ble konsentrert og forsiktig blandet til opptreden av en lett uklarhet med fast ammoniumsulfat. Krystalliseringen foregikk etter noen dager ved 4°C.
Eksempel 4.
a) Det for gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen nødvendige råekstrakt av E. coli-celler fremstilles
idet man konsentrerer en kultur av E.coli ATCC 21 728 ved sentrifugering til et slam og oppslutter cellen etter kjente me-kaniske fremgangsmåter, eventuelt under tilsetning av 3% metylisobutylketon. b) 610 liter av en således dannet råekstrakt, inneholdende 1,3.10^ E, ble ifølge oppfinnelsen fortynnet med av-ionisert vann til 2100 liter, innstillet med svovelsyre til pH 5,0 og sentrifugert. I det klare overstående fant man 1,42.10<6> E med en spesifikk aktivitet på 0,42 E/mg. Under etter-innstilling av pH til 5,0 ble det innrørt 13,8 kg bentonit (type B II, fra Fabriken Erbsloh) og etter 30 minutter adskilt i en passeringssentrifuge. Den adskilte bentonit ble eluert med 90 liter 0,5 molar natriumacetatoppløsning pH 8,0 og frafiltrert. Det ble dannet 92,5 liter, inneholdende 1,12.10<6> E ( 86%) med en spesifikk aktivitet på 1,64 E/mg. c) 1 liter av det ifølge b) dannede bentonit-eluat ble dialysert mot 0,001 molar kaliumfosfatpuffer pH 7,0: 8250 E
1,8 E/mg.
Enzymoppløsningen ble ført over en søyle 10 x 15 cm av DEAE-"Sephadex" A-,50 i samme puffer. Deretter ble det eluert med en lineær gradient fra hver gang 2 liter 0,01 og 0,1 molar puffer pH 7,0. Det ble oppfanget fraksjoner på 25 ml. Penicillinacylasen befant seg i fraksjonene 110 - 170, i-,2 liter 6760 E (82%) 6 E/mg.
d) Oppløsningen fra c) ble utfelt ved tilsetning av fast ammoniumsulfat (472 g/litér), utfellingen frasentrifugert
og oppløst i vann. En del av denne oppløsning inneholdende 4700 E, ble blandet med ammoniumsulfat til 46% metning, klar-sentrifugert og oppbevart ved værelsestemperatur. I løpet av en uke startet krystalliseringen. Krystallene,ble frasentrifugert, oppløst i 0,01 molar fosfatpuffer og dialysert mot samme puffer: 3300 E (70%) med 12,45 E/mg.
Eksempel 5-
60 liter av et ifølge eksempel 4a) fremstillet oppsluttet råekstrakt ble innstillet på pH 5,0 og sentrifugert. Den overstående klare oppløsning inneholdt 155.00,0 E av spesifikk aktivitet 0,3 E/mg. Ved tilsetning av "mixed bed"..
ioneutveksler ble det avsaltet til 1,0 mS. Til denne oppløsning ble det ved pH 5,0 først satt 200 g bentonit (type SF, Firma Serva), frasentrifugert og kassert, deretter ble det tilsatt ytterligere 800 g, frasentrifugert og eluert med 20 liter 0,5 molar natriumacetat pH 8,0. Resultat: 110.000 E, 1,5 E/mg.
Enzymoppløsningen ble dialysert mot 0,5 molar natriumacetatpuffer pH 5,0 og på en søyle'11 x 95 cm fylt med SE-"Sephadex" C-50 i 0,05 molar natriumacetat pH 5,0. Søylen ble eluert med-en lineær gradient av hver 15 liter 0,07 og 0,25 molar natriumacetat pH 5,0. Penicillinacylase befant seg i eluat på 24-27 liter.
Resultat: 88.000 E (80%), 4,2 E/mg.
29.000 E av denne oppløsning ble dialysert mot
0,01 molar kaliumfosfatpuffer pH 7,0 og. hatt på en søyle 11 x 25 cm DEAE-"Sephadex" A-50 i 0,01 molar kaliumfosfat pH 7,0. Elueringen foregikk med en gradient 0,01 til 0,1 molar kaliumfosfat pH 7,0. Penicillinacylase ble eluert ved slutten av gradienten. Resultat: 21.000 E (73%), 11,2 E/mg.
En del av denne oppløsning inneholdende 6000 E,
ble bragt til ca. 45% metning med fast ammoniumsulfat. Etter ca. 2 uker dannet det seg store krystaller på karveggen. Etter ytterligere to uker ved værelsestemperaturen ble krystallene frasentrifugert og en aliquot del oppløst i vann. Utbytte: 4260 E (71%), 13,1 E/mg.
Eksempel 6.
Et ifølge eksempel 4 fremstillet bentonit-eluat inneholdende 4100 E med 2,0 E/mg ble dialysert mot 0,05 molar natriumacetat pH 5,0 og hatt over en søyle 2,5 x 25 cm med "Lewatit" SP-100-Na<+->form. Elueringen foregikk med en gradient 0,05 - 0,5 molar natriumacetat pH 5,0. De aktive fraksjoner inneholdt 2020 E (56%), 6,6 E/mg.
Enzymoppløsningen ble med NaOH innstillet til pH 6,5 og ved tilsetning av fast ammoniumsulfat til 48% metning ble det rene enzym bragt til 'krystallisering. 1250 E (62%), 12,1 E/mg.
Claims (1)
- Fremgangsmåte til fremstilling av ren, krystallinsk penicillinacylase, karakterisert ved at (1) man innstiller en råekstrakt av Escherichia coli-celler, som ved siden av penicillinacylase dessuten inneholder fragmenter av Escherichia coli-celler til en pH-verdi .fra 3,5 til 5,5 og adskiller cellefragmentene, (2) bringer den dannede oppløsning ved hjelp av en "mixed bed"-ioneutveksler eller ved fortynning til en spesifikk ledningsevne på 0 til 5 mS og innstiller på en pH-verdi fra 3,5 til 8,0,(3) til den således dannede oppløsning setter bentonit, idet hvis bentoniten tilsettes i rekkefølge i flere porsjoner kasseres det etter første bentonittilsetning dannede adsorbat, (4) fraskiller bentonit-enzym-produktet, (5) eluerer enzymet med en 0,1 - 1,0 molar vandig oppløsning av et uorganisk eller organisk salt fra bentonit-enzym-produktet, (6) dialyserer den enzymholdige oppløs-ning eventuelt mot en alkali-fosfat- eller acetatpufferoppløs-ning, (7) behandler med en anion- og/eller kationutveksler, (8) eluerer enzymet fra ioneutveksleren på vanlig måte, (9) fra den vandige oppløsning krystalliseres enzymet ved tilsetning av ammoniumsulfat.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2151236A DE2151236C3 (de) | 1971-10-14 | 1971-10-14 | Verfahren zur Herstellung von reiner kristalliner Penicülinacylase |
| DE19722217745 DE2217745A1 (de) | 1972-04-13 | 1972-04-13 | Reine, kristalline penicillinacylase und verfahren zu ihrer herstellung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO137598B true NO137598B (no) | 1977-12-12 |
| NO137598C NO137598C (no) | 1978-03-21 |
Family
ID=25761878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO3693/72A NO137598C (no) | 1971-10-14 | 1972-10-13 | Fremgangsmaate til fremstilling av ren, krystallinsk penicillinacylase |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3871962A (no) |
| JP (1) | JPS57790B2 (no) |
| AR (1) | AR193765A1 (no) |
| AT (1) | AT318146B (no) |
| BE (1) | BE790075A (no) |
| BG (1) | BG22085A3 (no) |
| CA (1) | CA1014496A (no) |
| CH (1) | CH576485A5 (no) |
| DD (1) | DD101684A5 (no) |
| DK (1) | DK139521C (no) |
| EG (1) | EG10948A (no) |
| ES (1) | ES407600A1 (no) |
| FR (1) | FR2156353B1 (no) |
| GB (1) | GB1375743A (no) |
| HU (1) | HU165175B (no) |
| IE (1) | IE36761B1 (no) |
| IL (1) | IL40548A (no) |
| LU (1) | LU66286A1 (no) |
| NL (1) | NL175640C (no) |
| NO (1) | NO137598C (no) |
| PL (1) | PL83713B1 (no) |
| RO (1) | RO68218A (no) |
| SE (1) | SE405860B (no) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8801303D0 (en) * | 1988-01-21 | 1988-02-17 | Ici Plc | Improved method of separating soluble enzymes from cell debris |
| PT97397B (pt) * | 1990-04-18 | 1998-08-31 | Gist Brocades Nv | Processo para a preparacao de penicilina g acilase e de genes que a codificam |
| US6541606B2 (en) * | 1997-12-31 | 2003-04-01 | Altus Biologics Inc. | Stabilized protein crystals formulations containing them and methods of making them |
| CZ300467B6 (cs) | 2007-01-31 | 2009-05-27 | Mikrobiologický ústav AV CR, v.v.i. | Sekvence nukleotidu o velikosti 2646 bp, kódující penicilinacylázu, nové konstrukty rekombinantní nukleové kyseliny a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tuto sekvenci |
| WO2017048448A1 (en) | 2015-09-14 | 2017-03-23 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Process for making branched epdm and epdm therefrom |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1015554A (en) * | 1963-11-07 | 1966-01-05 | Beecham Group Ltd | Improvements in the production of penicillin-splitting enzymes |
| US3297546A (en) * | 1963-12-09 | 1967-01-10 | Bristol Myers Co | Preparation of 6-aminopenicillanic acid |
| US3446705A (en) * | 1967-03-30 | 1969-05-27 | Squibb & Sons Inc | Method for the production of 6-amino-penicillanic acid |
| US3736230A (en) * | 1969-02-17 | 1973-05-29 | P Delin | Process for producing 6-amino-penicillanic acid |
| US3664926A (en) * | 1970-02-26 | 1972-05-23 | Merck & Co Inc | Crystallization of l-asparaginase |
| US3769168A (en) * | 1971-06-11 | 1973-10-30 | Hayashibara Co | Process for the purification of amylases |
-
0
- BE BE790075D patent/BE790075A/xx not_active IP Right Cessation
-
1972
- 1972-10-10 DD DD166135A patent/DD101684A5/xx unknown
- 1972-10-10 BG BG21586A patent/BG22085A3/xx unknown
- 1972-10-11 IL IL7240548A patent/IL40548A/xx unknown
- 1972-10-12 JP JP10167972A patent/JPS57790B2/ja not_active Expired
- 1972-10-12 EG EG420/72A patent/EG10948A/xx active
- 1972-10-12 CA CA153,721A patent/CA1014496A/en not_active Expired
- 1972-10-12 CH CH1490472A patent/CH576485A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1972-10-12 AT AT875872A patent/AT318146B/de not_active IP Right Cessation
- 1972-10-12 LU LU66286A patent/LU66286A1/xx unknown
- 1972-10-13 GB GB4736272A patent/GB1375743A/en not_active Expired
- 1972-10-13 HU HUBA2813A patent/HU165175B/hu unknown
- 1972-10-13 NL NLAANVRAGE7213899,A patent/NL175640C/xx not_active IP Right Cessation
- 1972-10-13 RO RO7272506A patent/RO68218A/ro unknown
- 1972-10-13 PL PL1972158245A patent/PL83713B1/pl unknown
- 1972-10-13 ES ES407600A patent/ES407600A1/es not_active Expired
- 1972-10-13 NO NO3693/72A patent/NO137598C/no unknown
- 1972-10-13 DK DK509472A patent/DK139521C/da not_active IP Right Cessation
- 1972-10-13 SE SE7213239A patent/SE405860B/xx unknown
- 1972-10-13 IE IE1390/72A patent/IE36761B1/xx unknown
- 1972-10-13 AR AR244616A patent/AR193765A1/es active
- 1972-10-13 FR FR7236383A patent/FR2156353B1/fr not_active Expired
- 1972-10-16 US US297856A patent/US3871962A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RO68218A (ro) | 1981-11-04 |
| NL7213899A (no) | 1973-04-17 |
| GB1375743A (no) | 1974-11-27 |
| JPS4861686A (no) | 1973-08-29 |
| BE790075A (fr) | 1973-04-13 |
| CA1014496A (en) | 1977-07-26 |
| JPS57790B2 (no) | 1982-01-07 |
| FR2156353B1 (no) | 1977-01-14 |
| DK139521B (da) | 1979-03-05 |
| LU66286A1 (no) | 1973-01-23 |
| IL40548A0 (en) | 1972-12-29 |
| BG22085A3 (no) | 1976-11-25 |
| IE36761L (en) | 1973-04-14 |
| AR193765A1 (es) | 1973-05-22 |
| ES407600A1 (es) | 1976-01-16 |
| IE36761B1 (en) | 1977-02-16 |
| IL40548A (en) | 1975-07-28 |
| NO137598C (no) | 1978-03-21 |
| CH576485A5 (no) | 1976-06-15 |
| SE405860B (sv) | 1979-01-08 |
| DD101684A5 (no) | 1973-11-12 |
| US3871962A (en) | 1975-03-18 |
| AT318146B (de) | 1974-09-25 |
| DK139521C (da) | 1979-08-13 |
| NL175640C (nl) | 1984-12-03 |
| HU165175B (no) | 1974-07-27 |
| EG10948A (en) | 1976-09-30 |
| NL175640B (nl) | 1984-07-02 |
| FR2156353A1 (no) | 1973-05-25 |
| PL83713B1 (no) | 1976-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5719048A (en) | Separation of proteins | |
| DeMoss | [43] Glucose-6-phosphate and 6-phosphogluconic dehydrogenases from Leuconostoc mesenteroides | |
| US3912588A (en) | Creatine amidohydrolase in the conversion of creatinine to creatine | |
| JP2515283B2 (ja) | 安定なグルコ―ス・イソメラ―ゼ濃縮物およびその製法 | |
| EP0578825B1 (en) | Process for producing n-acetylneuraminic acid | |
| US4389488A (en) | Process for the enzymatic preparation of L-2-amino-4-methylphosphinobutyric acid | |
| Gibson et al. | The partial purification and properties of indole-3-glycerol phosphate synthetase from Escherichia coli | |
| Soda et al. | Crystalline lysine decarboxylase | |
| NO137598B (no) | Fremgangsm}te til fremstilling av ren, krystallinsk penicillinacylase | |
| US4542098A (en) | Production of glucose dehydrogenase and use of the resultant enzyme in the enzymatic synthesis of L-carnitine | |
| JPS6034181A (ja) | ノイラミニダ−ゼの製造法 | |
| Soda et al. | [222] Amino acid racemase (Pseudomonas striata) | |
| EP0107400B1 (en) | Hybrid plasmid and process for producing glutathione using said plasmid | |
| Lowe et al. | Enzymatic hydrolysis of penicillin V to 6-aminopenicillanic acid by Fusarium oxysporum | |
| Ratner | [93] Preparation and determination of argininosuccinic acid | |
| JPS6144474B2 (no) | ||
| Kohn et al. | [48] l-and mesotartaric acid dehydrogenase (crystalline) | |
| JP2931623B2 (ja) | Ｌ‐フェニルアラニンの製造方法 | |
| EP0059182B1 (en) | A process for isolating aminoacylase enzyme from a mammal kidney extract | |
| DE2151236C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von reiner kristalliner Penicülinacylase | |
| JP3392865B2 (ja) | 固定化酵素調製物およびＤ―α―アミノ酸の製造法 | |
| Nakamura et al. | Specificity of Fumarate Hydratase: II. Ratio of Fumarate-Hydrating Activity and (—)-Tartrate-Dehydrating Activity | |
| JP3118331B2 (ja) | シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の製造方法 | |
| Hackert et al. | Purification and crystallization of NADP+-specific isocitrate dehydrogenase from Escherichia coli using polyethylene glycol | |
| DE2167034B2 (de) | Creatinin-amidohydrolase |