NO123941B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av 1,2-mettede, 17-oksygenerte retroandrostanderivater.

Oppfinnelsen vedrorer en fremgangsmåte til fremstilling av retrosteroider av androstanrekken, som oppviser en hydroksy-eller oksogruppe i 17-stilling. Fremgangsmåten etter oppfinnelsen karakteriseres ved at man underkaster et 1,.2-mettet 20-ketosteroid av retropregnanrekken aerob enzymatisk oksydasjon ved hjelp av Fusarium solani.

Som retrosteroider betegnes i det folgende slike steroider ved hvilke metylgruppen som befinner seg ved C-atom 10, oppviser ct-konfigurasjon og hydrogenatomet som befinner seg ved C-atom 9 ^henholdsvis en 9-substituent) oppviser (3-konfigurasjon. Steroider av pregnanrekken med retro-konfigurasjon be tegnes tilsvarende i det folgende som retropregnaner henholdsvis som 9(3 ,10a-pregnaner. Slike retrosteroider er f.eks. kjent fra det belgiske patent 577.615.

Enzyminnvirkningen etter oppfinnelsen av Fusarium solani

(f.eks. av soppstammen som er registrert under ATCC Nr. 128 23)

på 20-ketosteroider av retropregnanrekken bevirker avbygning av 17-sidekjeden under dannelse av en 17-hydroksy-eller en 17-oksogruppe. Ved lengere enzyminnvirkning kan det fra D-ringen i utgangssteroidet danne seg en 6-laktonring. Således kan f.eks. fra A 4' 6-9p , 10a-pregnadien-3, 20-dion (1) (A<6->retroprogesteron) ved inkubasjon med Fusarium solani ifolge etterfølgende reaksjonsskjema oppnås A ^' 4-9(3 ,10a-androstadien-17p-ol-3-on (II), A<4>'<6->9p,10a-androstadien-3,17-dion (III) og A<6->9p,lOa-testolakton (IV).

Overraskende bevirker den enzymatiske oksydasjon etter oppfinnelsen av 1,2-stilling hydrerte steroider av retropregnanrekken selv ved langvarig inkubasjon ingen nevneverdig dehydrering " i 1,2-stilling, hvilket er tilfelle i den normale rekke.

De som utgangsstoffer anvendte 20-ketosteroider av retro-preg-nanrekkeri er mettet eller kan inneholde dobbeltbindinger, f.eks. i en eller flere av stillingene 4,5,6,7,8,9 (11) og 15, fortrinnsvis i 4-stilling: og eventuelt en ytterligere stilling (som f.eks. i tillegg i 6- eller i 6,9(11)-stilling). Ut-gangsstoffene kan foruten 20-oksogruppen inneholde ennå ytterligere substituenter i ring-systemet eller i sidekjeden. F.eks. er slike substituenter frie eller beskyttende oksogrupper,

frie eller :beskyttende hydroksygrupper, halogenatomer (som fluor- eller kloratomer) eller lavere alkylgrupper. En beskyttet oksogruppe er særlig en ketalisert oksogruppe, som f.eks. etylendioksygruppen. En beskyttet hydroksygruppe er f.eks. en forestret hydroksygruppe (forestret f.eks. med en lavere-ali-fatisk, aromatisk eller heterocyklisk karboksylsyre, som eddiksyre, propionsyré, benzosyre, furankarboksylsyre) eller en foretret hydroksygruppe, som tetrahydropyranyloksy-, benzylok-sy- eller trifénylmetoksygruppen. Foretrukne utgangsstoffer er slike 20-ketosteroider av retropregnanrekken, hvilke oppviser i 3-stilling en okso- eller hydroksygruppe og i det minste i 4-stilling en dobbeltbinding, som Z^-9p,10a-pregnen-3,20-dion (retroprogesteron) , og / É' 6-9j3,10a-pregnadien-3, 20-dion

-retroprogesteron).

Som næringsmedier for dyrkningen av Fusarium solani kan som for utviklingen av denne mikroorganisme anvendes i og for seg kjente næringsopplosninger, f.éks. næringsopplosninger med et innhold av en nitrogen- eller karbonkilde såvel som uorganiske salter. Som nitrogenkilder kan f.eks. nevnes: peptoner, maisstopevann, sojaprodukter, gjærekstrakter, aminosyrer, protein-hydrolysater, nitrater og ammoniumsalter. Som karbonkilder kommer i betraktning assimilerbare karbohydrater, som glykose, sakkarose, såvel som aminosyrer. Det kan også anvendes synte-tiske næringsopplosninger.

Dyrkningen av mikroorganismen (Fusarium solani)Æom ifolge oppfinnelsen innsettes for sidekjede-avbygningen finner sted under aerobe betingelser, fortrinnsvis submerst, f.ek-s. i rystekultur eller fermenteringskar -under omroring og lufting. Fortrinnsvis arbeider man på folgende måte: næringsopplos-ningen anpodes efter sterilisasjonen, f.eks. med en forutgående fremstilt rystekolbe-kultur eiler en mycel-sporesuspensjon av Fusarium solani og rystes henholdsvis omrores deretter 6 - 7 2 timer, fortrinnsvis 24 - 48 timer, ved 15 - 40°C, fortrinnsvis mellom 24 - 30°C, under luftning. Etter denne forvekst finner under sterile betingelser tilsetningen av retrosteroidet, som skal oksyderes, sted i form av en oppløsning f.eks. aceton, metanol eller etanol. Inkubasjonstiden kan utgjore 1-8 dager eller også lengere, f.eks. inntil 25 dager. Forlopet av fermentasjonen lar seg kontrollere ved uttak av prover og tynn-skiktskromatografisk undersokelse av disse. Isoleringen av fremgangsmåteproduktene finner sted etter i og for seg kjente metoder, som kromatograf i,. mostrbmsfordeling og fraksjonert krystallisasjon.

Fremgangsmåteproduktene kan anvendes som mellomprodukter til fremstilling av legemidler. Til dels er fremgangsmåteproduktene selv fysiologisk aktive (f.eks. anabolisk eller antiandro-gen) .

EKSEMPEL 1

4 liter av en næringsopplosning som inneholder 20g sakkarose, 3 g gjærekstrakt, 1 g glykoll, 1 g natriumnitrat, 1 g primært kaliumfosfat, 0,5 g magnesiumsulfat, 0,5 g kaliumklorid og 10. mg jernsulfat pr. 1O00 ml destillert vann steriliseres i et rystekar 45 minutter ved 120°G. Oppløsningen hvis pH-verdi utgjor 5,0, anpodes deretter med en mycyl-sporesuspensjon hvilken er avlet fra en vorter-skrå-agarkultur av Fusarium solani. Gjærblandingen. rystes mekanisk under luftning ved 24 - 28°C. Etter 48 timer tilsettes 2 g A 4' 6-9(3 ,10a-pregnadien-3,20-dion (A<6->retroprogesteron) i 40 ml aceton. Deretter dyrkes kulturen videre 8 dager under likeværende betingelser.

To kulturer som er oppnådd etter foran beskrevne.måte forenes og gjærsuppen (totalt 8 liter) skilles fra mycel. Gjærsuppen ekstraheres deretter med 8 liter, og så ennå tre ganger hver gang med 4 liter eddiksyre. Det avskilte mycel rores ut med 3 liter eddikester. De forente ekstrakter vaskes med en van-dig 10 %'ig.koksaltopplosning, torkes deretter over natrium sulfat og inndampes tilslutt under redusert trykk.

Den oljeaktige inndampningsrest (totalt 4,6 g) opploses i

100 ml eddikester-benzen (1:1) og behandles med 5 g aktivkull. Etter filtrering gjennom et filter diatomerjord oppnår man en lysegul klar opplosning som ifolge platekromatogrammet (system benzen-aceton 7:3 og 4:1 på kiselgel) hovedsakelig inneholder A 4' 6-9p ,10a-androstadien-3,17-dion og A4' -9(3 ,10a-androsta-dien- 17(3-ol-3-on.

Det lysegule filtrat inndampes nå under redusert trykk til torrhet og kromatograferes i systemet benzen-aceton 9:1 på

300 ml kiselgel (Merck 0,05 - 0,2 mm). Det samles 100 fraksjoner hver på 10 ml. Hver annen fraksjon undersokes platekromatografisk. De overensstemmende fraksjoner forenes og inndampes under redusert trykk til torrhet. Fraksjonene 1 - 15 inneholder forurensninger i liten mengde. Fraksjonene 16 - 25 inneholder 1,75 g nesten ren A4' ^-9(3 ,10a-androstadien-3,17-dion. Etter to gangers krystallisasjon fra metylenklorid-metanol-isopropyleter oppnår man denne substans i analyseren tilstand med smeltepunkt 193 - 196°C; Xmaks. (U.V.) = 285 mp; = 25.700.

Fraksjonene 30 - 34 inneholder 0,21 g A a 4 ' 6-9(3 ,10a-androsta-dien-17)3-ol-3-on med smeltepunkt 169 - 171°C (etter to gangers krystallisasjon fra metylenklorid-aceton-isopropyléter).

>^maks. (U.V.) = 285 mu; £ = 27.500.

Fra fraksjonene 26 - 29 oppnår man 0,27 g av en blanding av foran nevnte 17-hydroksy- og 17-ketoforbindelser. Den lysegule olje opploses i 200 ml benzen og tilsettes med en ekviva-lent kromsyre i 5 %' ig eddiksyre. Blandingen rystes IO timer, deretter skylles den organiske fase fra og denne vaskes med vann, deretter med mettet bikarbonatopplosning og igjen med vann, torkes tilslutt over natriumsulfat og inndampes under redusert trykk til torrhet. Man oppnår således ytterligere0,19 g 4'6-9(3 ^I0a-andro stadi en- 3,17-dion.

EKSEMPEL 2

Fire fermenteringskar som er forsynt med roreverk, dekkes hver med 6 liter av det i eksempel 1 beskrevne næringsmedium under tilsetning av et skumbekjempelsesmiddel (silikonolje). Etter sterilisasjon anpodes mediet med en 3 dager gammel rystekolbe-kultur av Fusarium solani og kulturen får veksle under omroring og luftning ved 28°C i 48 timer. Det danner seg derved allerede en rikelig mengde mycel. I hvert fermenteringskar tilsettes nå 1,5 g A 4' 6-9|3 ,10cc-pregnadien-3, 20-dion ( A6-retroprogesteron) i 40 ml aceton. Etter avsluttet omsetning avbrytes fermentasjonen (i nærværende forsok var for de enkelte tilset-ninger inkubasjonstiden på 2 - 6 dager nodvendig.for omsetnin-gen) . Etter fraskillelse av mycelet ekstraheres og opparbeides gjærsuppen etter den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåte (de enkelte råekstrakter viste ved platekromatografisk provning ikke noen forskjell med hensyn til sammensetning og ble derfor slått sammen). Man oppnår 10,05 g av en gul olje, hvilken kromatograferes på 600 ml kiselgel. Som elueringsmiddel tjener benzen-aceton 4:1. Det samles fraksjoner hver på 25 ml. Fraksjonene 1-26 inneholder forurensninger. Fra fraksjonene 28-52 oppnår man ved flere gangers krystallisasjon fra

a 4 6 metylenklorid-metanol-isopropyleter 495 mg rent £a ' -9(3,10 a-androstadien-3,17-dion med smeltepunkt 192 - 195°C. Fra fraksjonene 90 - 105 kan ved fraksjonert krystallisasjon fra metylenklorid-metanol og metylenklorid-metanol-isopropyleter isoleres 230 mg rent A a 4 ' 6-9(3,10a-androstadien-17(3-ol-3-on med smeltepunkt 168 - 170°C. Fra moderlutene av disse fraksjoner kan ved ytterligere krystallisasjon A^-^P,lOa-testo-lakton isoleres. Smeltepunkt 192 - 194°C-, "Xmaks. (U.V.) = 286 mu; = 25.OO0.

EKSEMPEL 3

10 Erlenmeyerkolber å 500 ml dekkes hver med 100 ml av en næringsopplosning med den i eksempel 1 angitte sammensetning, lukkes med vattpropper og steriliseres ved 120 C i 20 minutter. Deretter anpodes det med en fra en skråagar-kultur av Fusarium solani på vorter-agar avlet sporemycel-suspensjon. Kolbene som forbedrer gjennomluftning, er forsynt med skjerm-

plater, rystes på en roterende rystemaskin ved 24 - 28°C.

Etter 66 timers veksttid tilsettes pr. kolbe 20 mg A<4->9(3,10a-pregnen-3,20-dion (retroprogesteron) i 1 ml aceton under asep-tiske betingelser. Den tynnskiktskromatografiske kontroll av fermentasjonen etter 24, 48 og 96 timer viste at det tilsatte retroprogesteron allerede etter 24 timer praktisk talt full-stendig var avbygget til A4-9(3 ,lOa-androsten-3,17-dion.

Det samme resultat oppnås når man går frem som ovenfor beskrevet, men anvender en næringsopplosning som inneholder 15 g pepton, 3 g torr-rest fra maisstopevann og 50 mg glukose i lOOO ml ledningsvann og innstilles med riatriumhydroksyd på en pH lik 6,5.

EKSEMPEL 4

6 liter av en næringsopplosning (15 g pepton, 3^g torr-rest fra maisstopevann, 50 mg glukose pr. lOOO ml vann innstilt med natriumhydroksyd på pH = 6,5) anpodes under tilsetning av et skumbekjempelsesmiddel i et luftet fermenteringskar som er forsynt med omrorer under sterile betingelser med en 3 dager gammel rystekolbe-kultur av Fusarium solani. Etter 46 timers vekst ved 28°C tilsettes 1,2 g A4-9(3 ,10a-pregnen-3, 20-dion (retroprogesteron) opplost i 40 ml aceton. Etter 48 timer (slutt-pH = 4,6) filtreres gjærsuppen, og filtratet ekstraheres som beskrevet i eksempel 1. Råekstraktet opploses i 60 ml aceton og behandles i varme med 1,2 g aktivkull. Etter filtrering og inndampning oppnår man 2,28 g av en gul olje.

Denne opploses i lite benzen og kromatograferes på 400 ml kiselgel. Det oppfanges fraksjoner på hver IO ml. Fraksjonene 1 - 116 inneholder totalt 780 ml forurensninger. Fraksjonene 117 - 170 (benzen - 2 % aceton) inneholder 490 mg platekromatografisk ensartet A A 4-9(3,10a-androsten-3,17-dion. Smeltepunkt 155 - 156°C (etter flere gangers omkrystallisasjon fra metylenklorid-isopropyleter) 5 >«^maks. (U.V.) = 241 mp; £ = 16.500. Fra fraksjonene 186 - 244 (benzen-aceton 9:1) oppnår man 540 mg ensartet A4-9p ,10a-androsten-17(3-ol-3-on. Smeltepunkt 154 - 155°C (fra metylenklorid-isopropyleter) ; ^Xmaks. (U.V.) = 241 mu; £- 16.000.

EKSEMPEL 5

1,2 g /\4-9ft , lOnr-preanen-3,20-dion (retroprogesteron) under-kastes, som beskrevet i eksempel 4, imidlertid under forlenget inkubasjonstid til 7 dager (etter steroidtilsetning), enzymatisk oksydasjon. Derved oppnår man 1,12 g ensartet A<4->9(3,10a-androsten-3,17-dion (fra gjærsuppen kunne ved dette forsok intet A4-9(3 ,10a-androsten-17(3-ol-3-on isoleres).

Claims (3)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av 1,2-mettede, 17-oksygenerte retrosteroider av androstanrekken, karakterisert ved at man underkaster et 1,2-mettet 20-ketosteroid av retropregnanrekken aerob enzymatisk oksydasjon ved hjelp av Fusarium .solani.

2. Fremgangsmåte etter krav 1, karakterisert ved at man anvender et A 4-3,20-diketosteroid av retropregnanrekken som utgangsstoff.

3. Fremgangsmåte etter kravene 1 og 2, karakterisert ved at man anvender A 4- 9(3 ,10a-pregnen-3, 20-dion eller A4' 6-9(3 ,10a-pregnadien- 3, 20-dion som utgangsstoff.