NO118145B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av et antibiotikum, 9865 RP og dets komponenter 13057 RP,

13213 RP og 13330 RP.

Nærværende oppfinnelse vedrører fremstillingen av et nytt antibiotikum, i det følgende betegnet 9865 RP, og dets tre komponenter, i det følgende betegnet 13057 RP, 13213 RP og 13330

RP.

9865 RP, og dets tre komponenter, er i besiddelse av en meget utpreget anticanceraktivi-tet. De er også i besiddelse av en meget viktig antibakteriell effekt mot såvel gram-positive som gram-negative organismer. Denne egenskap er desto mer verdifull ved at de opprettholder et høyt aktivitetsnivå mot organismer (og særlig staphylokokk-stammer) som er blitt mot-standsdyktige mot hittil anvendte antibiotika eller visse anticancer-antibiotika, slik som actinomycin og rufokromomycin.

Det nye antibiotikum 9865 RP fremstilles ved dyrkning av to mikroorganismer, i det følgende mer fullstendig beskrevet, og som hører til slekten Streptomyces og betegnes «Streptomyces 8899» henholdsvis «Streptomyces 31723».

Antibiotikummet 9865 RP har følgende karakteristika: det er et amorft oransje-rødt pulver oppløselig i klorerte oppløsningsmidler, slik som kloroform og diklorethan, moderat oppløse-lig i vann surgjort til pH mellom 3 og 4, meget svakt oppløselig i alkoholer og praktisk talt uoppløselig i vann, benzen og diethylether. Det inneholder carbon, hydrogen, oxygen og nitrogen i følgende forhold: C = 61,0 %, H = 6,2 %, O == 28,15 %, N = 2,65 %. Dets ultrafiolette spektrum (bestemt på en oppløsning i 96 % ethanol) viser absorpsjonsmaksima ved 236 mu,

E<%>= 425, 255 mu, E<]><%>= 308, 290 mu,

1 cm lem

E ] % == 114, og 495 mu, E ] %=146, og ab-1 cm 1 cm sorpsjonsminima ved 245 mu, E \ 1 cm— 284, 280 mur , E \ 1 c% m = 108 og 325 mu^ , E } 1 c% m = 20, og en skulder ved 533 mu, Ej^= 80. Det infrarøde spektrum (bestemt på tabletter laget opp med daliumbromid) viser de følgende prinsipielle absorpsj onsbånd:

De vedlagte tegninger viser det ultrafiolette og infrarøde absorpsj onsspektrum for 9865 RP og dets tre komponenter. På tegningene er: fig. 1 det ultrafiolette spektrum for 9865 RP,

og

fig. 2 er det infrarøde spektrum for 9865 RP.

Fig. 3, 5, 7 og 9 er det ultrafiolette spektrum for 13057 RP, hydrokloridet for 13057 RP, 13213 RP henholdsvis aglyconet av 9865 RP, og

fig. 4, 6, 8 og 10 er det infrarøde spektrum for 13057 RP, hydrokloridet for 13057 RP, 13213 RP henholdsvis aglyconet av 9865 RP.

Komponentene for 9865 RP kan fastlegges ved papirkromatografi. Antibiotikummet kroma-graferes på Arches nr. 302 papir, impregnert med en pH 4,8 fosfatpuffer, med n-butanol mettet med vann, under anvendelse av nedstigende utvikling. Kromatogrammet utvikles ved bio-autografi på næringsagarplater podet med Ba-cillus subtilis eller Klebsiella pneumoniae. Kromatogrammet viser at 9865 RP inneholder tre aktive stoffer, her betegnet 13057 RP, 13213 RP og 13330 RP, hvis Rf-verdier i dette system er 0,3, 0,7 henholdsvis 0,9.

Disse tre komponenter, av hvilke 13057 RP

og 13213 RP er særlig viktige, kan isoleres fra 9865 RP etter forskjellige metoder, av hvilke noen vil bli beskrevet nedenfor. 13057 RP er en base som danner syreaddisjonssalter. Den frie base er et amorft, rødt pulver oppløselig i alkoholer og kloroform, meget svakt oppløselig i vann og ketoner, og praktisk talt uoppløselig i benzen og diethylether. Det inneholder carbon, hydrogen, oxygen og nitrogen i følgende forhold: C = 59,8 %, H = 5,85 %, N == 2,3 %, O = 29,45 %. Det smelter ved 155°—170°C (under spaltning). Dets ultrafiolette spektrum (bestemt på en opp-løsning i 96 % ethanol) viser absorpsjonsmaksima ved 236 mu, E ] % == 621, 255 mu, E*i% =

r lem r 1 cm 426, 290—295 mu, E }!% = 135, og 482^98 mu,

1 cm

E<1>™=230, og absorpsj onsminima ved 245 mu,

1 cm

e|%= 378, 280 mu, E*% = 122 og 325 mu,

1 cm r lem r E 1 cm = 10>og en skulder ved 533 mu>E i cm = 127. Dets infrarøde spektrum (bestemt på

tabletter i blanding med kaliumbromid) viser de følgende prinsipielle absorpsj onsbånd:

Dets hydroklorid danner oransje-røde nåler oppløselige i vann og alkoholer, svakt oppløse-lige i kloroform og praktisk talt uoppløselige i benzen og diethylether, og har følgende elemen-tærsammensetning: C = 55,4 %, H = 5,45 %, O = 28,8 %, N = 2,13 %, Cl = 6,15 %, smelter ved 225—230°C (under spaltning), viser optisk reaksjon [a]<2>D° = + 240° (c = 0,1; methanol), har et ultrafiolett spektrum (bestemt på en opp-løsning i 96 % ethanol) som viser absorpsj ons-maksima ved 236 mu, E<*%>= 594, 255 mu,

lem E } % = 410, 290—295 mu, E } % = 129, Og 482—

1 cm r 1 cm

498mu, E j ^m= 218, og absorpsj onsminima ved

245 mu, E}<%>= 360, 280 mu, E }<%>= 118, og

lem 1 cm

325 mu, E l °?° = 10, og en skulder ved 533 mu,

1 cm

E 1y°— 120, og har et Infrarødt spektrum (be-1 cm

stemt på tabletter i blanding med kaliumbromid) som viser de følgende prinsipielle absorpsj onsbånd:

13213 RP er et amorft oransje-rødt pulver oppløselig i klorerte oppløsningsmidler, slik som kloroform, og i dimethylformamid, moderat opp-løselig i vann surgjort til mellom pH 3 og 4, meget svakt oppløselig i alkoholer og praktisk talt uoppløselig i vann, benzen og diethylether. Det inneholder carbon, hydrogen og nitrogen i de følgende forhold: C = 58,6 %, H = 6,2 %, N = 2,2 % og det inneholder også oxygen. Det har et ultrafiolett spektrum (bestemt på en oppløs-ning 1 96 % ethanol) som viser absorpsj onsmak-sima ved 236 mu, E ]<%>= 425, 255 mu, E } % 1 cm lem

= 297, 290—295 mu, E*% = 108, og 480-—495

r1 cm

mu,e\^°= 155, og absorpsj onsminima ved 245

1 cm

mu, E } %=274, 280 mu, E}<%>= 103 og 325

lem lem

mu, E1 °f° = 20, og en skulder ved 533 mu,

1 cm

E 1 %=90, og dets infrarøde spektrum (be-1 cm

stemt på tabletter i blanding med kaliumbromid) viser de følgende prinsipielle absorpsj onsbånd:

Sur hydrolyse av 9865 RP og av dets to hoved-bestanddeler, 13057 RP og 13213 RP, frigir amino-sukret og et farvet stoff som er et aglycon. Dette aglycon danner oransje-røde nåler, oppløselige i alkoholer, ethylacetat og kloroform, svakt opp-løselige i benzen og diethylether, og uoppløse-lige i vann. Det har følgende sammensetning: C = 63,4 %, H = 5,7 %, O = 30,4 %, N = mindre enn 0,2 %. Det smelter ved 160°C og igjen ved 225—230°C. Dets ultrafiolette spektrum (bestemt på en oppløsning i 96 % ethanol) viser absorpsjonsmaksima ved 236 mu, e| ^m== 835, 255 mu,

El% = 570, 290—295 mu, E } % = 167 Og 470—

1 cm ^ 1 cm

495mu, E ^ ^m= 272, og absorpsj onsminima ved

245 mu, e<]><%>= 510, 280 mu, e]<%>= 149 og

r 1 cm r 1 cm

325 mu, E1 °f° = ca. 0, og en skulder ved 533

1 cm

mu, E 1 %=145. Dets infrarøde spektrum (be-r 1 cm

stemt på tabletter i blanding med kaliumbro-mld) viser de følgende prinsipielle absorpsj onsbånd:

Aglyconet av 9865 RP, 13057 RP og 13213 RP kan Identifiseres ved sirkulær papirkromatografi, som utføres på Arches nr. 302 papir impregnert med en oppløsning av aceton som inneholder 20 % formamid, med 2:1 blanding av kloroform og benzen mettet med formamid. Det er således mulig å demonstrere eksistensen av et enkelt stoff som har en Rf-verdi på 0,86.

Den bakteriostatiske aktivitet for 9865 RP og 13057 RP og 13213 RP, i forhold til et visst

antall organismer, er blitt bestemt ved fortyn-ningsmetodene som for tiden brukes for dette formål. For hver organisme er den laveste konsentrasjon av stoff blitt bestemt, som, under de definerte bestemmelser, forebygger all synlig utvikling i en egnet næringsgruppe. Resultatene av forskjellige bestemmelser er vist i tabell VI, hvor de minimale bakteriostatiske konsentra-sjoner uttrykkes som mikrogram stoff pr cm<3>av forsøksmediet.

Disse resultater viser at den bakteriostatiske aktivitet for 9865 RP, 13057 RP og 13213 RP opp-trer overfor tallrike bakterier, av hvilke visse er resistente overfor et eller flere av de følgende antibiotika: penicillin, tetracyclin, streptomy-cin, streptothricin, neomycin, congocidin, eryth-romycin, carbomycin, spiramycin, streptogramin, kloramfenicol, novobiocin og anticancerantibio-tikaene, actinomycin og rufokromomycin. Anti-canceraktivitetene for 9865 RP og dets tre komponenter er blitt vist i laboratorier, hvor de har vist seg å være særlig aktive mot transplanter-bare tumorer hos mus, slik som Ehrlich's ascitic tumor, sarcoma 180, benzopyrene sarcoma og lymfoblastisk leukemi AKR. Det mest interes-sante av de nye antibiotika i denne henseende har vist seg å være 13057 RP, som viser hos mus en akutt 50 %'s letal dose (eller LD-j0), bestemt ved subkutan administrasjon, av LD30= 47 mg/kg s.c. og en subakutt 50 %'s letal dose (eller LDP)0) (gitt en dose pr. dag i 5 dager), bestemt ved intravenøs eller subkutan administrasjon, av LD50= 8,75 mg/kg (intravenøst) eller LD50= 13,65 mg/kg (subkutant).

Mikroorganismene som produserer 9865 RP hører til slekten Streptomyces og betegnes her «Streptomyces 8899» henh. «Streptomyces 31723».

De er blitt deponert i the Northern Regional Re-search Laboratory of Peoria, Illinois, U.S.A., under betegnelsene NRRL 3046 henholdsvis NRRL 3045. De ble isolert fra jordprøver tatt i to forskjellige områder i Algerie.

Isolasjonsmetoden var som følger. Jordprø-ven suspenderes i sterilt destillert vann og sus-pensjonen fortynnes til forskjellige konsentra-sjoner. Et lite volum av hver. fortynning spres på overflaten av Petri-skåler som inneholder et næringsagarmedium. Etter inkubering i flere dager ved 260°C overføres koloniene av mikroorganismer som det er ønsket å isolere, på skråagar for å få mer rikelige kulturer.

Ifølge den moderne klassifikasjon som anvendes for identifiseringen av. Streptomyces [S. A. Waksman, «The Actinomycetes», The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, bind II — «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology», 7. utgave, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957 — L. E-ttlinger et coil., Archiv. fiir Mikrobiologie, 31, 326 (1958)] er ingen beskrivelse av artene blitt funnet, hvis kulturkarakteristika stemmer overens med de for Streptomyces 8899 eller 31723.

Ved hjelp av klassifikasjonen gitt av G. F. Gause et coil. («Zur Klassifizierung der Actino-myceten», Veb Gustav Fischer Verlag, Jena, 1958), har arten Streptomyces coeruleorubidus ikke desto mindre blitt iakttatt å ha en beskrivelse meget lik den for de nyoppdagede stammer. Skjønt ifølge S. A. Waksman (loe, eit. s. 323

—326), denne beskrivelse er noe upresis, er det ikke desto mindre mulig å oppta Streptomyces 8899 og Streptomyces 31723 1 arten Streptomyces coeruleorubidus og føre dem opp under betegnelsene Streptomyces coeruleorubidus stamme 8899 henh. Streptomyces coeruleorubidus stamme 31723. For å klargjøre likhetene og forskjel-lene angis de detaljerte karakteristika for de to stammer Streptomyces 8899 og Streptomyces

31273 nedenfor parallelt med karakteristikaene for Streptomyces coeruleorubidus slik som beskrevet av G. F. Gause et coil.

Mikroskopisk morfologi Sporedannelsen av Streptomyces 8899 og 31723 er vanskelig å iaktta på grunn av dens komplekse natur. Den kan iakttas enten på «syntetiske» media, slik som beskrevet av Grundy et coil. (Antibiotics and Chemotherapy, 1, 309

(1951)) eller på komplekse media, slik som Be-netfs medium (K. L. Jones, J. Bacteriol., 57, 142

(1949)). Kulturer på tynne plater undersøkt under mikroskopet viser dannelsen av forgrenede filamenter og sporekjeder karakteristiske for fa-milien Streptomyces. De sporebærende filamenter som viser den mest komplekse grad av utvikling er i form av spiraler med sagtakkede slynger med mange og ofte mere enn fem viklinger. Sporene er ovale, og måler ca. 0,6—0,9 til 0,8—1,2 u.

De sporebærende filamenter forbindes til en kransformet struktur, noen ganger mono-kransformet, men oftere bikransformet. Denne struktur kan bare iakttas under mikroskopet hvis de sporebærende filamenter bare er spiraler med en eller to viklinger, eller er redusert til en sløyfe. Ellers er utviklingen av spiraler for tykk og maskerer deres forbindelse, og hindrer iakttagelsen av enhver sekundær krans i strukturen.

Når de morfologiske elementer tas i betraktning som viser den mest komplekse utvikling kan det sluttes at det sporebærende apparat for Streptomyces 8899 og 31723 tilsvarer Biverticil-lusspira typen beskrevet i klassifikasjonen ifølge T. G. Pridham et coil. [Applied Microbiol., 6, 52

(1958)].

Da luft-myceliet av godt utviklede kulturer av begge disse nye typer Streptomyces er lyse-blått, innordnes Streptomyces 8899 og 31723 etter sammenlikning med Pridham's klassifikasjon etter serier, i gruppen Biverticillus-spira blå serie, i hvilken ingen arter er beskrevet, skjønt Streptomyces coeruleorubidus forekommer i gruppen Spira blå serie.

Generelle karakteristika

På «syntetiske» media er Streptomyces 8899 og 31723 vanligvis i besiddelse av et vegetativt mycelium som vanligvis er rosa eller oransje-rosa ved begynnelsen av utviklingen, og den røde farve som intensifiserer seg med inkuberingen blir til slutt nesten klar rød. På «organiske» media er det vegetative mycelium gulbrunt eller rødbrunt. Luftmyceliet er vanligvis velutviklet på begge typer media. Det er hvitt ved begynnelsen av dets utvikling og det får derpå meget hurtig en lyseblå farvetone, nedenfor kalt turkisblå. Alt etter graden av utvikling eller naturen av mediet gir den en svakt variabel Intensitet i farvetone, eller dets farve kan bli svakt dem-pet. Rent røde eller oransje-røde oppløselige pigmenter dannes i «syntetiske» media med in tensitet som varierer med alderen av kulturene. Pigmentet er svakt rødt (rødbrunt eller rosa-brunt) i «organiske» media. På Williams og McCoy's medium iakttas en livlig produksjon av ka-rakteristisk sort melanisk pigment.

Kulturkarakteristika og biokjemiske egenskaper

Kulturkarakteristikaene og de biokjemiske egenskaper for Streptomyces 8899 og 31723 er blitt studert på vanlig næringsagar eller fly-tende media som anvendes for identifiseringen av stammer av Streptomyces. Iakttagelsene er gjengitt i detalj i tabell VII. De vedrører kulturer inkubert ved 26°C i ca. en måned. Den en-delige tilstand for kulturene og de fremkomne farver er gitt. Henvisningene eller sammenset-ningen av kulturmediene er gjengitt nedenfor. Beskrivelsen av S. coeruleorubidus av G. F. Gause et coil er gjengitt 1 denne tabell, idet man så langt som mulig har sammenlignet med kulturer som oppnåes på media av liknende sammensetning.

Henvisninger eller sammensetninger

av kulturmedia

(1) S. A. Waksman; «The Actinomycetes», Chronica Botanica Company, Waltham (Mass.), U.S.A., 1950, side 193—197. (1-A) Oppnådd ved å erstatte sucrose med den samme vekt glucose i de foregående formler. (2) Calciummalat 1 %, ammoniumklorid 0,05 %, dikaliumfosfat 0,05 %, agar 2 %. . (3) Pepton 0,5 %, kjøttekstrakt 0,3 %, tyro-sin 0,5 %, agar 2 %.

(4) K. L. Jones, J. Bacteriology, 57, 142

(1949). (5) Grundy et coil., Antibiotics and Chemotherapy, 1, 309 (1951). (6) A. M. Williams and E. McCoy, Appl. Microbiol., 1, 307 (1953). (7) Manual of Methods for pure culture stu-dy of bacteria, Society of American bacteriolo-gists (II 60—18). (8) Kommersielt skummetmelkpulver, gjen-oppløst ifølge produsentenes instruksjoner.

Utnyttelse av forskjellige hydrocarbonstoffer [Ifølge metoden av T. G. Pridham og D. Gottlieb, J. Bact., 56, 467 (1946)].

Dyrkningen utføres på skråagar ved 26°C. Blant de stoffer som vanligvis gir en hurtig og fullstendig vekst er: xylose, arabinose, rham-nose, glucose, galactose, mannose, lactose, mal-tose, raffinose, dextrin, stivelse, glycerol (bare for S. 8899), adonitol, mannitol, sorbitol, inositol (bare for S. 8899). I motsetning hertil tillater sorbose, inulin (bare for S. 31723), esculin, erythritol og dulcitol ingen utvikling, eller bare meget begrenset utvikling. Til slutt, stoffer som gir en irregulær, moderat eller svak vekst i for-søkene omfatter ribose, levulose, sucrose, inulin (bare for S. 8899), glycerol (bare for S. 31723) og inositol (bare for S. 31723).

Systematisk klassifikasjon

De karakteristika som skal tas i betraktning for den systematiske klassifikasjon av S. coeruleorubidus stammer 8899 og 31723 er: luftmycelium turkisblå farve; den bikransformede struktur for spiralene av det sporebærende apparat; kulturenes positive melaminreaksjon på egnede media; den spesielle røde farve for det vegetative mycelium på egnede media; og den spesielle røde farve for oppløselige pigmenter på egnede media.

De første to karakteristika plaserer S coeruleorubidus stammer 8899 og 31723 i gruppen Biverticillus-spira blå serie etter Pridham's klassifikasjon, i hvilken ingen andre arter er beskrevet. Egenskapene slått sammen plaserer S. coeruleorubidus stammer 8899 og 31723, i den nye klassifikasjon etter S. A. Waksman «The Actinomycetes» (The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961), bind II, side 155, i me-lamingruppen, serie 5 (rød til rødlig-oransje vekst). Det er ingen arter i denne serie som har et blått luftmycelium. S. coeruleorubidus stammer 8899 og 31723 kan derfor plaseres i denne serie med kvalifikasjonen «blått luftmycelium».

Fremgangsmåten etter oppfinnelsen for fremstilling av et antibiotikum, betegnet 9865 R.P. og dets komponenter, betegnet 13057 R.P., 13213 R.P. og 13330 R.P., erkarakterisert vedat man dyrker Streptomyces coeruleorubidus stamme 8899 (NRRL 3046) eller Streptomyces coeruleorubidus stamme 31723 (NRRL 3045) aerobt i et næringsmedium som Inneholder assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og mineralsalter og utvinner antibiotikumet fra mediet og eventuelt skiller det slik oppnådde 9865 R.P. i dets tre foran anførte komponenter etter vanlige metoder, fortrinnsvis ved motstrømsforde-ling.

Dyrkningen av Streptomyces coeruleorubidus stamme 8899 og Streptomyces coeruleorubidus stamme 31723 (her forkortet til Streptomyces 8899 og henholdsvis Streptomyces 31723) kan utføres ifølge enhver metode for aerob over-flate eller neddykket kultur, men sistnevnte fo-retrekkes for letthets skyld. For dette formål anvendes de forskjellige typer apparater som vanligvis brukes i fermenteringslndustrien.

Det følgende skjema for fremstilling av en

produksjonskultur anvendes fortrinnsvis:

Fermenteringsmediet må inneholde assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og mineralsalter, og, eventuelt, vekstfaktorer, og alle disse elementer innføres i form av veldefinerte stoffer, eller som komplekse blandinger, slik som dem. man støter på i biologiske produkter av for-skjellig opprinnelse.

Carbohydrater, slik som glucose, lactose, sucrose, melasser, dextriner, stivelse og andre carbohydrater, slik som sukkeralkoholer, f. eks. mannitol, kan anvendes som carbonkilder, og også visse organiske syrer, f. eks. melke-, sitron-og vinsyre. Visse animalske eller vegetabile oljer, slik som talg eller soyaolje kan med fordel erstatte disse forskjellige carbonkilder, eller forenes med dem. Et bredt område av kilder for assimilerbart nitrogen er egnet. De kan være enkle kjemiske stoffer, slik som nitrater, uorga-niske og organiske ammoniumsalter, urea og aminosyrer. De kan også være komplekse stoffer som inneholder nitrogen hovedsakelig i form av protein, slik som casein, lactalbumin, gluten og hydrolysater av disse, soya-, jordnøtt- og fiskemelarter, kjøttekstrakter, gjær, «distillers' solubles» og maisstøp. Blant de tilsatte mineralske elementer kan visse utøve en pufrende eller neutraliserende effekt, slik som alkalimetall- eller jordalkalimetallfosfater og calcium- og mag-nesiumcarbonater. Andre mineralske salter bi-drar til den ioniske likevekt som er nødvendig for utviklingen av Streptomyces 8899 og 31723 og dannelsen av antibiotikumet, f. eks. alkalimetall- og jordalkalimetallklorider og -sulfater. Ytterligere virker visse stoffer som aktiviserings-midler for de metaboliske reaksjoner av Streptomyces 8899 og 31723. Disse er saltene av sink, kobolt, jern, kobber og mangan.

pH for næringsmediet skal ved begynnelsen av kulturen være mellom 6,0 og 7,8, og fortrinnsvis 6,5 til 7,5. Den optimale temperatur for kulturen er 25°—28°C, men tilfredsstillende produksjon oppnås ved temperaturer mellom 23° og 35°C. Luftningen av fermenteringsmediet kan variere innen et temmelig bredt verdiområde, men det er blitt funnet at luftningshastigheter på .0,3 til 2 liter luft pr. minutt pr. liter medium er særlig egnet. Det maksimale utbytte av antibiotikum oppnåes etter 2 til 5 dagers dyrkning, idet denne periode avhenger vesentlig av det anvendte medium. Fra det foranstående vil det forstås at de generelle betingelser for dyrkning av Streptomyces 8899 og 31723 for fremstillingen av antibiotikum 9865 RP kan variere i temmelig høy grad.

9865 RP kan isoleres fra fermenteringskul-turene ved forskjellige metoder. Fermenteringskulturen kan filtreres ved en pH på mellom 1,5 og 9, og under disse betingelser føres største-delen av det aktive materiale inn i filtratet. Etter vasking med vann beholder filterkaken praktisk talt intet aktivt materiale. Det er fordelaktig å utføre denne behandling under anvendelse av et surt medium, og særlig et som er gjort surt med oxalsyre til en pH mellom 1,5 og 2. Det er også mulig å utføre filtreringen ved en pH mellom 2 og 7, fortrinnsvis nær 2, i nærvær av en alifatisk alkohol, som inneholder 1 til 3 car-bonatomer.

Ved disse ekstraksjonsbehandlinger oppnåes 9865 RP i vanndig eller vanndig-alkoholisk oppløsning, og det ekstraheres derpå med et organisk oppløsningsmiddel ikke blandbart med vann, slik som butanol, methylisobutylketon, ethylacetat eller kloroform, ved en pH mellom 5,5 og 9, fortrinnsvis ca. 7,5. Denne ekstraksjon kan komme etter absorpsjon av antibiotikummet på en ioneutvekslerharpiks, 1 hvilket tilfelle den vanndige oppløsning justeres til en pH på ca. 4 og behandles derpå med en carboxylisk'kationutvekslerharpiks, fortrinnsvis «Amberlite IRC 50», i hydrogenform. Eluering utføres derpå med en salin- eller sur, vanndig-alkoholisk opp-løsning, fortrinnsvis med methanol, som inneholder 10 % vann og 1 % natriumklorid. Eluatet konsentreres for å fjerne alkoholen og ekstraheres derpå som beskrevet foran.

Fermenteringsmediet kan også straks ekstraheres med et organisk oppløsningsmiddel som ikke er blandbart med vann, slik som butanol, ethylacetat eller kloroform, ved en pH mellom 5,5 og 9, fortrinnsvis ca. 7,5. I dette tilfelle føres alt det aktive materiale inn i den organiske fase, som skilles fra den vanndige fase etter de vanlige metoder.

Hvilken ekstraksjonsmetode man enn vel-ger, oppnåes antibiotikummet 9865 RP til slutt i organisk oppløsning. Det kan være fordelaktig på dette tidspunkt å rense antibiotikumet ved suksessivt å føre det inn i vanndig oppløsning og i organisk oppløsning ved å variere pH. Det rå antibiotikum kan derpå isoleres fra den oppnådde organiske oppløsning i sistnevnte behandling ved konsentrasjon eller bunnfelling med et dårlig oppløsningsmiddel for antibiotikummet, slik som hexan. En isolasjonsmetode som er blitt funnet særlig fordelaktig består i surgj øring av den organiske oppløsning til en pH på ca. 4, fortrinnsvis med eddiksyre, og konsentrering av denne oppløsning under redusert trykk til et mindre volum. Tilsetning av et dårlig oppløs-ningsmiddel for 9865 RP, slik som hexan, til det oppnådde konsentrat bevirker bunnfelling av det rå antibiotikum.

For å oppnå 9865 RP i en renere tilstand kan alle vanlige metoder anvendes, slik som kromatografi på et absorberende stoff, motstrøms-f or deling eller deling mellom forskjellige oppløs-ningsmidler. Det er blitt funnet særlig fordelaktig å anvende en av de følgende to metoder: kromatografi på aluminiumoxyd ved pH 4 av det rå antibiotikum oppløst i butanol; og opp-løsning av det rå antibiotikum i en blanding av methylenklorid-carbontetraklorid-vann (5:1:6 etter volum), dekantering av den vanndige fase fulgt av dens ekstraksjon med methylenklorid, forening av methylenkloridekstraktene og konsentrasjon av sistnevnte under redusert trykk, fulgt av tilsetningen av hexan til det oppnådde konsentrat for å bunnfelle det rensede antibiotikum. En liknende metode kan også anvendes i hvilken methylenkloridet erstattes med ethylacetat.

Det er mulig å gjenta de forskjellige metoder som er angitt for ekstraksjonen og isoleringen av 9865 RP mange ganger alt etter fremstillings-kravene for å oppnå dette antibiotikum i en form som er ren nok for det tilsiktede formål.

9865 RP isolert ifølge enhver av de foranstående metoder kan derpå separeres i dets tre komponenter, 13057 RP, 13212 RP og 13330 RP. Denne separering kan utføres etter de vanlige

metoder anvendt for separeringen av et antibiotikum i dets komponenter, slik som kromatografi på forskjellige stoffer eller motstrøms-fordeling. Det er blitt funnet at sistnevnte gir de mest fordelaktige resultater, spesielt når den utføres etter en av de følgende fremgangsmåter, som imidlertid bare er fortrukne fremgangsmåter: for å oppnå 13057 RP alene, motstrømsfor-deling av 9865 RP med et butanol-fosfatpuffersystem med pH 7—7,5; for å oppnå 13213 RP alene, motstrømsfordeling av 9865 RP i et butanol-ethylacetatsystem pufret til pH 4; og for å oppnå separeringen av de tre komponenter fra 9865 RP, to suksessive motstrømsfordelinger, først med et begrenset antall overføringer med et system sammensatt av to klorerte alifatiske hydrocarboner pufret til pH 5,8, som gir to fraksjoner, en vanndig fase som inneholder 13057 RP forurenset med 13213 RP, og en organisk fase som inneholder en blanding av 13213 RP og 13330 RP forurenset med 13057 RP, fulgt av den separate behandling av de to fraksjoner slik oppnådd med et ethylacetat-methanolsy-stem, fosfatpufret til pH 5,5, hvilket på den ene side tillater isoleringen av 13057 RP og på den annen side tillater separeringen av 13213 RP og 13330 RP.

De forskjellige motstrømsfordelingsbehand-linger kan komme etter eller før de vanlige rensningsprosesser, særlig ekstraksjon eller omkrystallisasjon, for å oppnå de tre komponenter i en form som er ren nok for den tilsiktede anvendelse.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Aktivitet er over alt bestemt ved turbi-dimetrisk vurdering, under anvendelse av Klebsiella pneumoniae som den følsomme organisme, ved sammenlikning med en prøve av 9865 RP med kjent aktivitet anvendt som kontroll. Denne aktivitet uttrykkes i enheter pr. mg for faste produkter og i enheter pr. cm<3>for oppløsninger.

(Enheten er definert som den minste mengde produkt, som oppløst i en cm<3>av et egnet medium, hemmer veksten av Klebsiella pneumoniae under de foreliggende betingelser.) Luft-ningshastighetene er 5 m<3>/time for 170-liters kar og 15 m<3>/time for 800-liters kar.

EKSEMPEL 1.

Et 170-liters fermenteringskar satses med:

Dette kulturmedium har en pH på 6,15. Det steriliseres ved gjennomledning av damp ved 122°C i 40 minutter. Etter avkjøling er volumet for suppen 120 liter og pH er 7,20. Mediet podes derpå med 200 cm<3>av en kultur i en omrørt Erlenmeyer-flaske av stammen «Streptomyces 31723». Dyrkningen utføres i 27 timer ved 26°— 27 °C under omrøring og luftning med steril luft. Kulturen er derpå egnet for podning av produk-sjonskulturen.

Produksjonsdyrkningen utføres i et 800-liters fermenteringskar satset med følgende:

pH for det slik oppnådde medium justeres ;il 7,20 med konsentrert natriumhydroxydopp-øsning (400 cm<3>). Mediet steriliseres deretter ied gjennomledning av damp ved 122°C i 40 minutter. Etter avkjøling er volumet for suppen 500 liter og pH er 6,75. Man poder derpå med 50 iter av kulturen fra fermenteringskaret på 170 iiter. Kultur utføres ved 28 °C i 67 timer under amrøring og luftning med steril luft, pH for mediet er derpå 7,40, og volumet for fermenteringskulturen er 520 liter. Mengden antibiotikum tilstede i mediet er 29 enheter/cm<3>.

EKSEMPEL 2.

En inoculumkultur fremstilles i et 170-liters fermenteringskar under de samme betingelser som i eksempel 1, men med podning med 200 cm<3>av en kultur i en omrørt Erlenmeyer-flaske av stammen «Streptomyces 8899».

Produksjonsdyrkningen utføres derpå i et 800-liters fermenteringskar satset med mediet beskrevet i eksempel 1. pH for mediet justeres til 8,10 med konsentrert natriumhydroxydopp-løsning (750 cm<3>) og mediet steriliseres deretter ved gjennomledning av damp ved 122°C i 40 minutter. Etter avkjøling er volumet for suppen 500 liter og pH er 6,80. Mediet podes derpå med 75 liter av kulturen i 170-liters fermenteringskaret, og dyrkningen utføres ved 26°—27°C i 67 timer under omrøring og luftning med steril luft. pH for mediet er deretter 7,40, og volumet for fermenteringskulturen er 545 liter. Mengden antibiotikum tilstede i mediet er 9,1 enheter/ cm3.

EKSEMPEL 3.

Fermenteringskulturen fra eksempel 1 (520 liter: aktivitet 29 enheter/cm<3>) anbringes i et kar utstyrt med en omrører og pH justeres til 1,8 med en konsentrert oppløsning av oxalsyre. Omrøring utføres i en time og et filtrerings-hjelpemiddel (20 kg) tilsettes derpå. Blandingen filtreres på en filterpresse, og filterkaken vaskes med vann (100 liter) gjort sur til pH 2 med oxalsyre. Filtratet (612 liter) behandles med konsentrert natriumhydroxydoppløsning inntil pH er 4,5. Filtratet passeres derpå gjennom en kolonne som inneholder «Amberlite IRC 50» i hydrogenform (20 liter: kolonnens diameter er

15,2 cm, høyde 200 cm, harpikshøyde i ro i kolonnen er 110 cm). Filtratet passerer gjennom

«Amberlite»-laget fra bunn til topp med en hastighet på 40 liter/time. Kolonnen vaskes derpå med vann (100 liter) ved en hastighet på 50 liter/time sirkulerende fra bunn til topp og derpå med methanol (inneholdende 10 % vann; 75 li-

ter) sirkulerende fra topp til bunn ved en hastighet på 50 liter/time. Vaskevæskene helles fra, og kolonnen elueres derpå med en oppløs-ning som har den følgende sammensetning (pr. liter):

Eluatet (100 liter) som inneholder største-delen av antibiotikumet, konsentreres under redusert trykk ved 35°C til 10 liter. Konsentratet ekstraheres ved pH 7,5 med kloroform (2x5 liter). Kloroformekstraktet justeres til pH 4 med en oppløsning av eddiksyre i kloroform (10 : 100 etter volum) og konsentreres derpå ved 30 °C under redusert trykk til 100 cm<3>. Antibiotikumet bunnfelles ved tilsetning av hexan (1 liter), fraskilles, vaskes og tørkes hvorved fåes et amorft rødt pulver (9 g) med aktivitet 1.400 enheter/ mg.

EKSEMPEL 4.

Det rå antibiotikum (17,1 g), oppnådd som beskrevet i eksempel 3 (aktivitet 1530 enheter/ mg), oppløses under omrøring i en blanding av methylenklorid (1,5 liter) carbontetraklorid (0,3 liter) og vann (1,8 liter). pH justeres derpå til 3 ved tilsetningen av normal saltsyre (8 cm<3>). Etter dekantering behandles den vanndige fase med methylenklorid (7 liter) og 0,1 n natrium-hydroxydoppløsning (200 cm<3>) for å gi en pH på 7,5. Etter dekantering ekstraheres den vanndige fase igjen ved pH 7,5 med methylenklorid (3,5 liter). Methylenkloridekstraktene forenes og konsentreres til 100 cm<3>. Etter tilsetning av hexan (1 liter) til konsentratet bunnf elles et produkt som filtreres fra, vaskes og tørkes ved 30 °C under redusert trykk hvorved man får antibiotikummet 9865 RP (9,15 g) i form av et amorft oransje-rødt pulver med aktivitet 2180 enheter/mg.

EKSEMPEL 5.

En blanding fremstilles av methylenklorid, carbontetraklorid Macllvaine-puffer — pH 5,8 (20 cm<3>av denne puffer fremstilles ved tilsetning av 12,09 cm<3>0,2 M Na2HP04-oppløsning til 7,91 cm<3>0,1 M sitronsyreoppløsning) i forhol-dene 2:1:3 (etter volum). Når denne blanding er i likevekt separeres de to faser. 9865 RP (10 g) med aktivitet 1750 enheter/mg (oppnådd som beskrevet i eksempel 4) oppløses i en blanding av fasene (1 liter av hver). Dette' system utsettes for en motstrømsfordeling med 6 overførin-ger i 5-liters celler under anvendelse av den tunge (organisk oppløsningsmiddel) fase som den bevegelige fase og den lette (vanndige) fase som den stasjonære fase, og under anvendelse av 1 liter av hver fase hver gang. Blandingene av nedre faser (blanding A) og øvre faser (blanding B) av de første 4 celler, og blandingene av nedre faser (blanding C) og øvre faser (blanding D) av de siste 3 celler samles opp separat.

Blanding B justeres til pH 7,5 ved tilsetnin-

gen av normal natriumhydroxydoppløsning (300 cm<3>) og ekstraheres derpå med kloroform (4 liter, 2 liter og 1 liter). Kloroformekstraktene og blanding A forenes og konsentreres under redusert trykk (til 700 cm<3>). Konsentratet vaskes med vann ved pH 7,5 (2 x 350 cm<3>) og moder - lutene fra vaskingen ekstraheres med kloroform (2x100 cm<3>). Det vaskede konsentrat og kloro-formekstratene forenes og konsentreres under redusert trykk til 70 cm<3>. Hexan (700 cm<3>) tilsettes derpå og det fremstilte bunnfall filtreres fra, vaskes og tørkes under redusert trykk ved 30°C, og gir en fraksjon Ft(5,1 g) som hovedsakelig inneholder antibiotikumet 13057 RP.

Ved en separat behandling ekstraheres blanding D med methylenklorid (3 liter og 1,5 liter). Methylenkloridekstraktene og blanding C forenes og konsentreres under redusert trykk til 800 cm<3>. Konsentratet vaskes med vann (400 cm<3>) og konsentreres derpå igjen til 700 cm<3>. Hexan (1 liter) tilsettes og det fremstilte bunnfall filtreres fra, vaskes og tørkes under redusert trykk ved 30°C for å gi en fraksjon F2(3,7 g) som hovedsakelig inneholder 13213 RP og 13330 RP.

EKSEMPEL 6.

Et produkt (10 g), lik med fraksjon Ftnevnt foran, utsettes, etter å være blitt oppløst i et ethylacetat-methanol — pH 5.5-M/15 fosfatpuffersystem (8:3: 5 etter volum; 200 cm<3>), for en motstrømsfordeling av 110 overføringer i et 50 celle Craig apparat (50 overføringer i appa-ratet og 60 overføringer ved uttakning), idet det begynnes ved de første to celler. Blandingen av de øvre faser av celler 0 til 37 (3,8 liter) utvinnes og konsentreres til 300 cm<3>. Konsentratet slik oppnådd og blandingen av de nedre faser av celler 0 til 37 (3,8 liter) forenes derpå og konsentreres til 800 cm<3.>pH justeres til 8 ved tilsetning av normal natriumhydroxydoppløsning

(180 cm<3>) og den oppnådde oppløsning ekstraheres med kloroform (800 cm<3>og 400 cm<3>). Kloroformekstraktene konsentreres til 400 cm<3>og vaskes med vann (400 cm<3>) gjort alkalisk til pH 8. Moderlutene fra vaskingen ekstraheres med

kloroform (200 cm<3>). Det vaskede konsentrat

og kloroformekstraktene forenes, konsentreres

til 400 cm<3>, vaskes med vann (400 cm<3>) gjøres alkalisk til pH 8 og konsentreres til 100 cm<3>. Butanol (200 cm<3>) tilsettes, og blandingen konsentreres til 100 cm<3>. Butanoloppløsningen som oppnåes justeres til pH 3,5 ved tilsetning av butanol mettet med normal saltsyre (30 cm<3>) og holdes i 12 timer ved 4°C. Krystaller danner seg som filtreres fra, vaskes og tørkes og gir et før-ste utbytte (4,55 g) av rått 13057 RP hydroklorid. Konsentrasjon til 100 cm<3>av krystallisa-sjonsmoderlutene, tilsetning av hexan (1 liter) og filtrering, vasking og tørking av det fremstilte bunnfall gir et annet utbytte (2,5 g) av rått 13057 RP hydroklorid.

EKSEMPEL 7.

Rått 13057 RP hydroklorid (3,75 g) oppnådd som beskrevet i eksempel 6, oppløses i dioxan (40 cm<3>) som inneholder 20 % vann. Den oppnådde oppløsning filtreres og vannfri dioxan (15 cm<3>) tilsettes i løpet av 2 timer, fulgt av vannfri dioxan (235 cm<3>) i løpet av 30 minutter. Et produkt krystalliserer ut som fraskilles, vaskes og tørkes og gir 13057 RP hydroklorid (2,75 g)

i form av oransjerøde nåler, s.p. 225—230°C (under spaltning), med aktivitet 151 enheter/mg.

Denne forbindelse (0,208 g) oppløses i en blanding av vann (200 cm<3>) og butanol (150 cm<3>) 0,1 n natriumhydroxydoppløsning. (3,4 cm<3>) tilsettes, blandingen separeres, og den vandige fase ekstraheres deretter med butanol (50 cm<3>). Butanolekstraktene forenes, vaskes med vann, gjøres alkalisk til pH 8 (2 x 100 cm<3>) og konsentreres til 10 cm<3>. Det oppnådde konsentrat behandles med hexan (50 cm<3>) og det fremstilte bunnfall filtreres fra, vaskes og tørkes og gir 13057 RP (0,0945 g) i form av et amorft rødt pulver, aktivitet 160 enheter/mg.

EKSEMPEL 8.

Et produkt (5 g), lik fraksjonen F2oppnådd

i eksempel 5, utsettes, etter å være blitt oppløst i et ethylacetat-methanol — pH 5,5 M/15 fosfatpuffersystem (8:3:5 etter volum; 200 cm<3>) for en motstrømsfordeling identisk med den beskrevet i eksempel 6. Blandingen av de øvre faser av celler 36 til 89 (5,3 liter) utvinnes og konsentreres til 500 cm<3>. Det slik oppnådde konsentrat og blandingen av de nedre faser av celler 36 til 89 (5,3 liter) forenes og konsentreres til 800 cm<3>. Konsentratet ekstraheres suksessivt med methylenklorid (2 x 800 cm<3>) og kloroform (800 cm<3>). De oppnådde ekstrakter forenes, konsentreres til 400 cm<3>, vaskes med vann ved pH 7,5 (2 x 400 cm<3>) og konsentreres derpå til 10 cm<3>. Tilsetning av hexan (100 cm<3>) bevirker bunnfelling av et produkt som filtreres fra, vaskes og tørkes under redusert trykk, og gir 13213 RP (1,1 g) i form av et amorft, oransje-rødt pulver, aktivitet 2.650 enheter/mg.

EKSEMPEL 9.

Fermenteringskulturen (500 liter) oppnådd i eksempel 2 behandles slik som beskrevet i eksempel 3 og gir rått 9865 RP (8,5 g) aktivitet 395 enheter/mg. Dette rå produkt (17 g) renses slik som beskrevet i eksempel 4, men methylenkloridet erstattes av ethylacetat, og det fåes 9865 RP (3 g), aktivitet 1300 enheter/mg.

EKSEMPEL 10.

9865 RP (12,4 g) oppnådd som beskrevet i eksempel 9, utsettes, i et butanol — pH 7,35 M/3 fosfatpuffersystem, for motstrømsfordeling med 50 overføringer. Ved ekstraksjon med butanol av de nedre faser av celler 12 til 35, konsentrasjon av butanolekstraktene, vasking, tilsetning av butanol mettet med normal saltsyre og tilsetning av hexan oppnåes et første utbytte (1 g) av 13057 RP hydroklorid, fulgt, etter konsentrasjon av moderlutene, av et andre utbytte (1,1 g) av det samme produkt. Disse to utbytter tar etter omkrystallisasjon for vanndig dioxan, form av oransjerøde nåler, s.p. ca. 225—230°C (under spaltning), aktivitet 67 enheter/mg.

En liknende behandling av cellene 36 til 49 og gir rått 13213 RP (1,1 g), aktivitet 1800 enheter/mg, som etter å være blitt utsatt for mot-strømsfordeling med 50 overføringer i et bu-tanolethylacetat — pH 4 Macllvaine-puffersy-stem (3 : 7 : 10 etter volum), gir 13213 RP (0,5 g) i form av et amorft oransje-rødt pulver, aktivitet 2000 enheter/mg.

EKSEMPEL 11.

En fermenteringskultur (625 liter), frem-stilt slik som beskrevet i eksempel 2, anbringes i et omrørt kar. pH justeres til 9 med konsentrert natriumhydroxydoppløsning. Omrøring fortset-tes i 30 minutter og et filterhjelpemiddel (32 kg) tilsettes derpå. Blandingen filtreres på en filterpresse og vaskes med vann (275 liter). Filtratet (780 liter) behandles med natriumklorid (156 kg) og pH justeres til 3 med 12 n saltsyre. Filtratet ekstraheres deretter med butanol (260 liter), og butanolekstrakten konsentreres under redusert trykk ved 35°C til 4 liter. Konsentratet filtreres, og det rå antibiotikum bunnfelles fra den klargjorte oppløsning med petrolether (32 liter), frafiltreres, vaskes og tørkes i vakuum ved 30°C og gir rått 9865 RP (227 g) som et rød-brunt pulver, aktivitet 45 enheter/mg.

Det oppnådde råprodukt (50 g) oppløses i butanol mettet med vann (200 cm<3>), og den oppnådde oppløsning kromatograferes ved pH 4 gjennom en kolonne som inneholder aluminiumoxyd (500 cm<3>). Etter fiksering av antibiotikummet utvikles kromatogrammet og elueres med butanol mettet med vann (4 liter). Tre-far-vede fraksjoner utvinnes (volumer hneholdsvis 450 cm<3>, 1500 cm<3>og 1500 cm<3>). Den første fraksjon konsentreres under redusert trykk til 50 cm<3>og behandles derpå med hexan (500 cm<3>) og gir 9865 RP (8,3 g) aktivitet 68,5 enheter/mg. De andre to fraksjoner konsentreres hver under redusert trykk til 100 cm<3>og behandles med hexan (1 liter hver) og gir 9865 RP (4,4 g), aktivitet 216 enheter/mg henholdsvis 9865 RP

(1,35 g), aktivitet 800 enheter/mg.

EKSEMPEL 12.

En fermenteringskultur (425 liter), frem-stilt som beskrevet i eksempel 1 (aktivitet 40 enheter/cm<3>) gjøres sur til pH 1,8 med oxalsyre og filtreres. Filterkaken vaskes med vann (100 liter) sur gjort til pH 2 med oxalsyre, og det oppnådde forenede filtrat (500 liter) ekstraheres ved pH med kloroform (150 liter og 100 liter). Ekstraktene forenes og ekstraheres med vann ved pH 4 (80 liter og 50 liter). Den oppnådde vanndige ekstrakt gjøres alkalisk til pH 8 med normal natriumhydroxydoppløsning og ekstraheres med kloroform (40 liter og 20 liter). Kloroformekstraktene slik oppnådd surgjøres til pH 4 med en oppløsning av eddiksyre i kloroform (10 : 100 etter volum), og det surgjorte ekstrakt konsentreres ved 30°C under redusert trykk til 50 cm<3>. Det rå antibiotikum bunnfelles deretter ved tilsetning av hexan (500 m<3>), frafiltreres, vaskes og tørkes i vakuum ved 30°C og gir 9865 RP (680 mg) i form av et rødt pulver, aktivitet 1080 enheter/mg.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et antibiotikum, betegnet 9865 RP, og dets komponenter, betegnet 13057 RP, 13213 RP og 13330 RP, karakterisert ved at man dyrker Streptomyces coeruleorubidus stamme 8899 (NRRL 3046) eller Streptomyces coeruleorubidus stamme 31723 (NRRL 3045) aerobt i et næringsmedium som inneholder assimilerbare kilder for

   carbon, nitrogen og mineralsalter og utvinner antibiotikumet fra mediet, og eventuelt skiller det slik oppnådde 9865 RP i dets tre foran an-gitte komponenter etter vanlige metoder, fortrinnsvis ved motstrømsfordeling.