NL9301957A - Method for identifying microorganisms, and useful tools. - Google Patents
Method for identifying microorganisms, and useful tools. Download PDFInfo
- Publication number
- NL9301957A NL9301957A NL9301957A NL9301957A NL9301957A NL 9301957 A NL9301957 A NL 9301957A NL 9301957 A NL9301957 A NL 9301957A NL 9301957 A NL9301957 A NL 9301957A NL 9301957 A NL9301957 A NL 9301957A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- nucleic acid
- primers
- amplification
- dna
- electrophoresis
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Description
Werkwijze voor het identificeren van micro-organismen, endaarvoor bruikbare hulpmiddelenMethod for identifying micro-organisms, and useful tools for this
GEBIED VAN DE UITVINDINGFIELD OF THE INVENTION
De uitvinding ligt op het gebied van de detectie enidentificatie van micro-organismen en heeft betrekking op eenwerkwijze voor het aantonen en identificeren van micro-organismen in een monster, alsmede op hulpmiddelen voor gebruikin een dergelijke werkwijze.The invention relates to the detection and identification of microorganisms and relates to a method for detecting and identifying microorganisms in a sample, as well as to aids for use in such a method.
STAND VAN DE TECHNIEKSTATE OF THE ART
De klassieke methode voor het aantonen en identificeren vanmicro-organismen, met name in klinische monsters, zoals urine,feces, sputum en bloed, alsmede in voedingsmiddelen, gebeurtdoor kweken in verrijkings- en selectieve media, gevolgd doorbiochemische identificatie.The classic method of detecting and identifying microorganisms, particularly in clinical specimens such as urine, faeces, sputum and blood, as well as in food, is by culture in enrichment and selective media followed by biochemical identification.
Soms is de biochemische identificatie, die op de kweek-stappen volgt, vervangen door een immunologische identificatiemet behulp van antilichamen, zoals in een Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) of een Enzyme Immuno Assay (EIA), of dooreen genetische identificatie met behulp van bacteriesoort-specifieke DNA probes in een hybridisatie analyse of bacterie-soort-specifieke primers in een polymerase chain reactie (PCR).Sometimes the biochemical identification following the culture steps has been replaced by an immunological identification using antibodies, such as in an Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) or an Enzyme Immuno Assay (EIA), or by a genetic identification using bacterial species -specific DNA probes in a hybridization analysis or bacteria-type-specific primers in a polymerase chain reaction (PCR).
Een belangrijk nadeel van de kweekstappen, die nodig zijnvoordat de bacteriën kunnen worden geïdentificeerd, is huntijdrovende karakter. Sommige bacteriën, zoals Mycobacteriumtuberculosis, vereisen enkele weken kweek.A major drawback of the culture steps required before the bacteria can be identified is their time consuming nature. Some bacteria, such as Mycobacterium tuberculosis, require several weeks of culture.
In principe kan de PCR, die een in vitro amplificatiebehelst, gebruikt worden om de kweekstappen te verkorten ofzelfs overbodig te maken. Hiervoor is echter nodig, indiensoort-specifieke primers worden gebruikt, dat men op voorhand dein het monster te zoeken bacteriesoort kent, want anders zullende soort-specifieke primers een negatief resultaat geven.In principle, the PCR, which involves an in vitro amplification, can be used to shorten the culture steps or even make it superfluous. However, this requires, if species-specific primers are used, that the species of bacteria to be sought in the sample is known in advance, because otherwise species-specific primers will give a negative result.
Indien men daarentegen gebruik maakt van universeleprimers, d.w.z. primers die gekozen zijn binnen evolutionairgeconserveerde DNA sequenties, verkrijgt men wel een positiefresultaat, maar geen identificatie (zie K. Chen, H. Neimark, P. Rumore, C.R. Steinman. 1989. Broad range DNA probes fordetecting and amplifying eubacterial nucleic acids. FEMSMicrobiology Letters 57:19-24).On the other hand, if one uses universal primers, ie primers selected within evolutionary conserved DNA sequences, a positive result is obtained, but no identification (see K. Chen, H. Neimark, P. Rumore, CR Steinman. 1989. Broad range DNA probes fordetecting and amplifying eubacterial nucleic acids (FEMSMicrobiology Letters 57: 19-24).
Door Chen et al zijn DNA hybridisatie probes gebruikt diehomoloog zijn met geconserveerde delen van bacterieel 16Sribosomaal RNA (rRNA) sequenties. Het gebruik van deze 16S rRNAgen sequenties heeft een aantal voordelen. Het 16S rRNA genwordt in alle bacteriën aangetroffen. Het gen bestaat uitgeconserveerde delen, die onderbroken worden door soort¬specifieke sequenties. Over het algemeen zijn er meerderekopieën van het gen aanwezig in de bacteriële cel. Hierdoor kaneen betere/hogere gevoeligheid gehaald worden in verhouding totniet-ribosomale sequenties.Chen et al have used DNA hybridization probes that are homologous to conserved portions of bacterial 16Sribosomal RNA (rRNA) sequences. The use of these 16S rRNA gene sequences has a number of advantages. The 16S rRNA gene is found in all bacteria. The gene consists of conserved parts, which are interrupted by species-specific sequences. In general, multiple copies of the gene are present in the bacterial cell. This allows a better / higher sensitivity to be achieved relative to non-ribosomal sequences.
Als alternatief kan het rRNA zelf gebruikt worden als basisvoor amplificatie. Hiertoe dient dan wel eerst een DNA kopie vanhet rRNA gemaakt te worden. Dit kan met behulp van een reversetranscriptase, zoals avian myeloblastosis virus reverse trans¬criptase (AMV-RT), of een thermostabiel DNA polymerase dat dezeactiviteit bezit, bijvoorbeeld Tth-polymerase. Dit leidt tot eenverdere verbetering van de gevoeligheid, omdat er tot 10.000kopieën van het rRNA in de bacteriële cel aanwezig kunnen zijn.Alternatively, the rRNA itself can be used as a basis for amplification. For this purpose, a DNA copy of the rRNA must first be made. This can be done using a reverse transcriptase, such as avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (AMV-RT), or a thermostable DNA polymerase that has this activity, for example Tth polymerase. This leads to a further improvement in sensitivity, since up to 10,000 copies of the rRNA may be present in the bacterial cell.
De gebruikte hybridisatie probes of primers zijn gerichttegen sequenties, die niet bij eukaryoten (ergo ook .niet bij demens) gevonden worden. Deze primers kunnen dus gebruikt worden voor het aantonen van de aanwezigheid van onbekende bacteriën ineen monster.The hybridization probes or primers used are directed against sequences not found in eukaryotes (ergo, not even in humans). These primers can thus be used to detect the presence of unknown bacteria in a sample.
Voor een gerichte behandeling van patiënten met bijv.antibiotica is het echter noodzakelijk om de identiteit van debacteriën te kennen. Om de bacteriën te identificeren zal hetzijde nucleotidensequentie bepaald moeten worden, hetzij hetgeamplificeerde product van de PCR gehybridiseerd moeten wordenmet een groot aantal soort-specifieke DNA probes.However, for targeted treatment of patients with e.g. antibiotics, it is necessary to know the identity of the bacteria. To identify the bacteria, either the nucleotide sequence will have to be determined or the amplified product of the PCR hybridized with a large number of species-specific DNA probes.
De eerstgenoemde methode (bepaling van de nucleotiden¬sequentie) is tijdrovend en kostbaar.The former method (determination of the nucleotide sequence) is time consuming and expensive.
De methode, waarbij gebruik gemaakt wordt van specifiekeprobes, die hybridiseren met de soort-specifieke delen van degeamplificeerde rRNA sequentie, is beschreven voor een(theoretische) PCR-gebaseerde assay voor het vaststellen vanbacteremie door Roche Molecular Systems (D.ü. Leong. 1992.The method, using specific probes, which hybridize with the species-specific parts of the amplified rRNA sequence, has been described for a (theoretical) PCR-based assay for the determination of bacteremia by Roche Molecular Systems (D.ü. Leong. 1992 .
Design of a PCR assay for the rapid detection of bacteremia.Infection in Medicine 7:43-48).Design of a PCR assay for the rapid detection of bacteremia.Infection in Medicine 7: 43-48).
Een nadeel van deze methode is dat men moet beschikken overeen groot aantal (tientallen) soort-specifieke probes om deverschillende bacteriesoorten te kunnen identificeren. Het doorLeong beschreven systeem is dan ook nog niet in de praktijkgebracht.A drawback of this method is that it is necessary to have a large number (tens) of species-specific probes to identify the different bacterial species. The system described by Leong has therefore not yet been put into practice.
Snelle identificatie, bijvoorbeeld bij bacteremie ofnekkramp, is vaak gewenst en zowel de bekende kweekmethode alsde huidige DNA technologie geven geen praktische oplossing voordit probleem.Rapid identification, for example in case of bacteremia or neck cramps, is often desirable and both the known culture method and the current DNA technology do not provide a practical solution to this problem.
KORTE SAMENVATTING VAN DE UITVINDINGBRIEF SUMMARY OF THE INVENTION
De onderhavige uitvinding verschaft een werkwijze voor hetidentificeren van een in een monster aanwezig micro-organisme,omvattende het onderwerpen van in het monster aanwezig nucleïnezuurvan het micro-organisme aan nucleïnezuur amplificatie ondertoepassing van een of meer sets van universele primers, diegebaseerd zijn op een gen van het te identificeren micro- organisme dat zowel geconserveerde als variabele gebieden omvat,waarbij de primers gekozen zijn in geconserveerde gebieden dieeen variabel gebied insluiten, het in enkelstrengs vorm brengen van het produkt van denucleïnezuur amplificatie, het onderwerpen van het in enkelstrengs vorm gebrachteamplificatieprodukt aan een elektroforese welke in staat is omenkelstrengs nucleïnezuren van gelijke lengte van elkaar tescheiden op grond van verschillen in nucleotidensequentie, het detecteren van het geëlektroforeerde nucleïnezuur, enhet vergelijken van de positie van het geëlektroforeerdenucleïnezuur met die van een set referentie-nucleïnezuren vanbekende micro-organismen.The present invention provides a method for identifying a microorganism present in a sample, comprising subjecting nucleic acid of the microorganism present in the sample to nucleic acid amplification using one or more sets of universal primers based on a gene of the microorganism to be identified comprising both conserved and variable regions, the primers being selected in conserved regions enclosing a variable region, single-stranding the product of denucleic acid amplification, subjecting the single-stranded amplification product to electrophoresis which is capable of separating single-stranded nucleic acids of equal length from each other due to differences in nucleotide sequence, detecting the electrophoresed nucleic acid, and comparing the position of the electrophoresed nucleic acid with that of a set of reference -nucleic acids of known microorganisms.
De micro-organismen kunnen bacteriën, virussen, fungi,actinomyceten of eencellige parasieten zijn, maar bestaan bijvoorkeur uit bacteriën.The microorganisms can be bacteria, viruses, fungi, actinomycetes or single-celled parasites, but preferably consist of bacteria.
De sets van universele primers zijn in het geval van deidentificatie van bacteriën bij voorkeur gebaseerd op het 16SrRNA gen van bacteriën. Een zeer geschikte set van primers isgebaseerd op de gebieden 1173-1192 en 1370-1389 van het 16S rRNAgen en bestaat dan bij voorkeur uit de primers ER1: AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC [SEQ ID NO:l], enER2: GAG GAA GGT GGG GAT GAC GT [SEQ ID NO:2].The sets of universal primers are preferably based on the 16SrRNA gene of bacteria in the case of bacterial deidentification. A very suitable set of primers is based on regions 1173-1192 and 1370-1389 of the 16S rRNA gene and then preferably consists of primers ER1: AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC [SEQ ID NO: 1], and ER2: GAG GAA GGT GGG GAT GAC GT [SEQ ID NO: 2].
Het heeft overigens de voorkeur, vanwege een optimalespecificiteit en differentiatie tussen verschillende soorten vanbacteriën, dat in de nucleïnezuur amplificatie ten minste tweesets van primers worden gebruikt. De meerdere sets van primerskunnen tegelijk in een multiplex amplificatie worden toegepast.Meerdere sets van primers kunnen ook worden toegepast in een’nested' nucleïnezuur amplificatie waarbij een eersteamplificatie met een eerste set primers wordt gevolgd door eentweede amplificatie met een tweede set primers, waarbij deprimers van de tweede set gebaseerd zijn op gebieden die tussendie van de eerste set primers zijn gelegen. Een dergelijke 'nested' nucleïnezuur amplificatie leidt tot een verbeterdedetectie limiet (gevoeligheid).Incidentally, it is preferred, because of an optimal specificity and differentiation between different types of bacteria, that at least two sets of primers are used in nucleic acid amplification. The multiple sets of primers can be used simultaneously in a multiplex amplification. Multiple sets of primers can also be used in a nested nucleic acid amplification in which a first amplification with a first set of primers is followed by a second amplification with a second set of primers, in which primers of the second set are based on regions located in between the first set of primers. Such 'nested' nucleic acid amplification leads to an improved detection limit (sensitivity).
De nucleïnezuur amplificatie bestaat bij voorkeur uit eenpolymerase chain reactie (PCR) onder toepassing van een DNApolymerase, meer in het bijzonder een thermostabiel DNApolymerase, zoals Taq-polymerase, Vent-polymerase, Tth-polymerase, of SuperTag-polymerase (Superrag is een merknaam).Bij voorkeur wordt het DNA polymerase onderworpen aan eenvoorbehandeling waardoor contaminerend DNA en/of RNA wordtverwijderd.The nucleic acid amplification preferably consists of a polymerase chain reaction (PCR) using a DNA polymerase, more particularly a thermostable DNA polymerase, such as Taq polymerase, Vent polymerase, Tth polymerase, or SuperTag polymerase (Superrag is a brand name) Preferably, the DNA polymerase is subjected to a pretreatment to remove contaminating DNA and / or RNA.
Het target nucleïnezuur bestaat in de PCR uit DNA, te wetengenomisch DNA van het micro-organisme (zoals het 16S rRNA gen)of cDNA, gesynthetiseerd door reverse transcriptie van RNA vanhet micro-organisme (zoals uit het 16S rRNA zelf gesynthetiseerdCDNA).The target nucleic acid in the PCR consists of DNA, namely genomic DNA of the microorganism (such as the 16S rRNA gene) or cDNA, synthesized by reverse transcription of RNA from the microorganism (such as from the 16S rRNA itself synthesized CDNA).
De nucleïnezuur amplificatie kan echter ook wordenuitgevoerd volgens een transcription-based amplification system(TAS), zoals volgens een self-sustained sequence replication(3SR) reactie, een nucleic acid system based amplification(NASBA) of een template mediated amplification (TMA). Het targetnucleïnezuur kan in dat geval uit RNA of DNA van het micro-organisme bestaan.However, nucleic acid amplification can also be performed by a transcription-based amplification system (TAS), such as by a self-sustained sequence replication (3SR) reaction, a nucleic acid system based amplification (NASBA) or a template mediated amplification (TMA). The target nucleic acid can in that case consist of RNA or DNA of the micro-organism.
Werkwijzen volgens het transcription-based amplificationsystem (TAS) omvatten een DNA synthese stap en een RNAtranscriptie stap. In de werkwijze wordt een oligonucleotideprimer, die een polymerase binding site (een promotor) bevat,gehybridiseerd met een target RNA molekuul of een gedenatureerdtarget DNA molekuul. Na de hybridisatie van de primer aan hettarget molekuul wordt door reverse transcriptie met behulp vanreverse transcriptase een cDNA streng gesynthetiseerd. Nadenaturatie (door verwarming) wordt een tweede oligonucleotidemet het nieuw gesynthetiseerde cDNA gehybridiseerd. Door opnieuwreverse transcriptase (of DNA polymerase) toe te voegen wordteen dubbelstrengs DNA molekuul gesynthetiseerd. Door een RNApolymerase toe te voegen worden vervolgens RNA kopieën gegenereerd. Vier cycli van dit proces zijn voldoende om eenmiljoen-voudige amplificatie te realiseren.Methods of the transcription-based amplification system (TAS) include a DNA synthesis step and an RNA transcription step. In the method, an oligonucleotide primer containing a polymerase binding site (a promoter) is hybridized with a target RNA molecule or a denatured target DNA molecule. After the hybridization of the primer to the target molecule, a cDNA strand is synthesized by reverse transcription using reverse transcriptase. After denaturation (by heating), a second oligonucleotide is hybridized with the newly synthesized cDNA. By adding reverse reverse transcriptase (or DNA polymerase), a double-stranded DNA molecule is synthesized. RNA copies are then generated by adding an RNA polymerase. Four cycles of this process are sufficient to achieve one million fold amplification.
De self-sustained sequence replication (3SR) methode is eenmodificatie van TAS. Het belangrijkste verschil is dat de 3SRwerkwijze isotherm (37-42°C) wordt uitgevoerd en dat het RNAtarget wordt afgebroken. RNase H wordt gebruikt om het RNA inhet (door het reverse transcriptase gevormde) RNA-cDNA hybridemolekuul af te breken en daardoor een omzetting van het cDNA ineen dubbelstrengs DNA molekuul mogelijk te maken. Alsbijzonderheid wordt hier ook in de tweede primer een promotorsequentie aangebracht zodat transcriptie vanaf twee uiteindenvan het dubbelstrengs DNA molekuul kan verlopen. Het RNA, dat indeze reactie ontstaat, wordt weer omgezet in een RNA-cDNAhybride molekuul, zodat de reactie zichzelf in stand houdt. In15 minuten wordt ongeveer een honderdduizend-voudige RNAamplificatie bereikt.The self-sustained sequence replication (3SR) method is a modification of TAS. The main difference is that the 3SR method is performed isothermally (37-42 ° C) and the RNA target is degraded. RNase H is used to degrade the RNA in the RNA-cDNA hybrid molecule (formed by the reverse transcriptase) and thereby allow conversion of the cDNA into a double-stranded DNA molecule. In particular, a promoter sequence is also applied here in the second primer so that transcription can proceed from two ends of the double-stranded DNA molecule. The RNA generated in this reaction is converted back into an RNA-cDNA hybrid molecule, so that the reaction maintains itself. Approximately one hundred thousand fold RNA amplification is achieved in 15 minutes.
Ten behoeve van de detectie van het geamplificeerde engeëlektroforeerde nucleïnezuur kunnen tijdens de nucleïnezuuramplificatie gelabelde primers of gelabelde nucleotiden wordentoegepast. Bijvoorbeeld kunnen radioactief gelabelde primers ofnucleotiden worden toegepast, of primers, die met een fluoro-chroom, een chemiluminescente stof, biotine of digoxigeninegelabeld zijn.For the detection of the amplified and electrophoresed nucleic acid, labeled primers or labeled nucleotides may be used during nucleic acid amplification. For example, radiolabeled primers or nucleotides can be used, or primers labeled with a fluoro-chromium, a chemiluminescent substance, biotin or digoxigenin.
Het geamplificeerde en geëlektroforeerde nucleïnezuur kan,indien het niet gelabeld is, worden gedetecteerd door kleuring,bijvoorbeeld door zilverkleuring, ethidiumbromidekleuring ofStains-all kleuring.The amplified and electrophoresed nucleic acid, if not labeled, can be detected by staining, for example, by silver staining, ethidium bromide staining or Stains-all staining.
Voor de elektroforese van enkelstrengs nucleïnezuur wordtbij voorkeur gebruik gemaakt van een polyacrylamide gel elektro¬forese onder niet-denaturerende condities.For the electrophoresis of single-stranded nucleic acid, use is preferably made of a polyacrylamide gel electrophoresis under non-denaturing conditions.
Indien het produkt van de amplificatie uit dubbelstrengsDNA bestaat, wordt dit bijv. door verhitting in enkelstrengsvorm gebracht voordat het aan de genoemde elektroforese wordtonderworpen. Indien het produkt van de amplificatie uit enkelstrengs RNA bestaat, kan dit rechtstreeks aan de genoemdeelektroforese worden onderworpen.If the product of the amplification consists of double-stranded DNA, it is, for example, brought into single-stranded form by heating before it is subjected to said electrophoresis. If the product of the amplification consists of single-stranded RNA, it can be directly subjected to the said electrophoresis.
Het in het monster aanwezige nucleïnezuur van het micro-organisme wordt bij voorkeur uit het monster geïsoleerd voordathet aan nucleïnezuur amplificatie wordt onderworpen. Het monsterkan bijv. bestaan uit een klinisch monster, zoals urine, feces,sputum of bloed, of een voedingsmiddel.The microorganism nucleic acid present in the sample is preferably isolated from the sample before being subjected to nucleic acid amplification. For example, the sample jar may consist of a clinical sample, such as urine, faeces, sputum or blood, or a food.
De uitvinding verschaft ook een hulpmiddel, geschikt voorgebruik in de nieuwe werkwijze volgens de uitvinding, omvattendeeen verzameling elektroforese patronen van nucleïnezuren van alsreferentie dienende micro-organismen.The invention also provides an aid suitable for use in the new method of the invention, comprising a collection of electrophoresis patterns of nucleic acids from reference microorganisms.
Voorts verschaft de uitvinding een verzameling van hulp¬middelen, geschikt voor gebruik in de nieuwe werkwijze volgensde uitvinding, omvattende een nucleïnezuur amplificatie kit met een of meer sets vanuniversele primers, die gebaseerd zijn op een gen van het teidentificeren micro-organisme dat zowel geconserveerde alsvariabele gebieden omvat, waarbij de primers gekozen zijn ingeconserveerde gebieden die een variabel gebied insluiten, een elektroforese kit voor een elektroforese welke in staatis om enkelstrengs nucleïnezuren van gelijke lengte van elkaarte scheiden op grond van verschillen in nucleotidensequentie,middelen voor het detecteren van gelabeld of ongelabeldgeëlektroforeerd nucleïnezuur, en een verzameling elektroforese patronen van nucleïnezurenvan als referentie dienende micro-organismen.Furthermore, the invention provides a collection of tools suitable for use in the new method of the invention comprising a nucleic acid amplification kit containing one or more sets of universal primers based on a gene of the microorganism to be identified which is both conserved and variable regions, wherein the primers are selected in conserved regions enclosing a variable region, an electrophoresis kit for an electrophoresis capable of separating single-stranded nucleic acids of equal length from each other due to differences in nucleotide sequence, means for detecting labeled or unlabeled electrophoresed nucleic acid , and a collection of nucleic acid electrophoresis patterns of reference microorganisms.
GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDINGDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
De onderhavige uitvinding maakt gebruik van PCR (of eenandere nucleïnezuur amplificatie methode) onder toepassing vangeschikt gekozen universele primers, gecombineerd met eenelektroforese van het amplificatie produkt, waarin sequentie-afhankelijke verschillen in mobiliteit ("Sequence DependentDifferences in Mobility" [SDDM]) van enkelstrengs DNA (ssDNA)optreden.The present invention uses PCR (or any other nucleic acid amplification method) using suitably selected universal primers, combined with an electrophoresis of the amplification product, in which sequence-dependent differences in mobility ("Sequence DependentDifferences in Mobility" [SDDM]) of single-stranded DNA (ssDNA) occur.
Overigens is recent een soortgelijke werkwijze, de PCR-enkelstrengs DNA conformatie polymorfisme methode (PCR-single-stranded conformation polymorphism [PCR-SSCP]), als eenmogelijke werkwijze voor het aantonen van punt-mutatiesbeschreven (M. Orita, H. Iwahana, H. Kanazawa, K. Hayashi, T. Sekiya. 1989. Detection of polymorphisms of human DNA by gelelectrophoresis as single-strand conformation polymorphisms.Proceedings National Academy of Sciences USA 86:2766-2770).Incidentally, a similar method, the PCR single-stranded DNA conformation polymorphism method (PCR-single-stranded conformation polymorphism [PCR-SSCP]), has recently been described as a possible method for detecting point mutations (M. Orita, H. Iwahana, H Kanazawa, K. Hayashi, T. Sekiya, 1989. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proceedings National Academy of Sciences USA 86: 2766-2770).
PCR-SSCP is ontworpen voor het aantonen van éen enkelepuntmutatie. De PCR-SSCP kijkt naar een kleine verandering in demobiliteit van het ssDNA met de punt-mutatie ten opzichte van'wild-type' ssDNA. Deze techniek wordt gebruikt voor hetaantonen van éen enkele punt-mutatie in oncogenen en bijerfelijke ziekten.PCR-SSCP is designed to detect a single point mutation. The PCR-SSCP looks for a small change in demobility of the ssDNA with the point mutation compared to wild-type ssDNA. This technique is used to demonstrate a single point mutation in oncogenes and hereditary diseases.
De DNA sequentie, die een mogelijke puntmutatie bevat,wordt eerst geamplificeerd met behulp van de PCR. Hetgeamplificeerde produkt wordt vervolgens gedenatureerd tot tweeenkelstrengs DNAs en geanalyseerd met behulp van niet-denaturerende polyacrylamide gel electroforese.The DNA sequence, which contains a possible point mutation, is first amplified using the PCR. The amplified product is then denatured into two-stranded DNAs and analyzed by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.
Onder niet-denaturerende condities heeft het DNA eensecondaire structuur die het gevolg is van de nucleotiden-sequentie en de samenstelling van de oplossing waarin het DNAzich bevindt. Een verandering in de nucleotidensamenstellinghoeft echter niet altijd een verandering in de secondairestructuur tot gevolg te hebben. De mobiliteit van het ssDNAtijdens gel electroforese hangt af van de gevormde secondairestructuur. Het valt niet te voorspellen hoe de secondairestructuur de mobiliteit beïnvloedt. De verwachte verandering inmobiliteit is echter gering omdat de lengte van het ssDNAfragment een overheersende rol in de bepaling van de mobiliteitspeelt.Under non-denaturing conditions, the DNA has a secondary structure resulting from the nucleotide sequence and the composition of the solution containing the DNA. However, a change in the nucleotide composition may not always result in a change in the secondary structure. The mobility of the ssDNA during gel electrophoresis depends on the secondary structure formed. It is impossible to predict how the secondary structure affects mobility. However, the expected change in mobility is small because the length of the ssDNA fragment plays a predominant role in the determination of mobility.
In een aantal gevallen is het dan ook niet mogelijk omondanks de aanwezigheid van een punt-mutatie een verschil inmobiliteit te vinden (K. Hayashi. 1992. PCR-SSCP: A method for detection of mutations. Genetic Analysis Techniques andApplications 9:73-79).In some cases it is therefore not possible to find a difference in mobility despite the presence of a point mutation (K. Hayashi. 1992. PCR-SSCP: A method for detection of mutations. Genetic Analysis Techniques andApplications 9: 73-79 ).
Volgens de uitvinding wordt een dergelijke elektroforesestap gebruikt voor het identificeren (i.e. het benoemen) vanbacteriesoorten, niet voor het aantonen van éen enkele punt-mutatie zoals in PCR-SSCP gebeurt.According to the invention, such an electrophoresis step is used to identify (i.e. name) bacterial species, not to detect a single point mutation as is done in PCR-SSCP.
Het principe van de onderhavige methode (PCR-SDDM) voor hetidentificeren van bacteriën is als volgt. Met behulp vanuniversele primers, die in geconserveerde gebieden van het 16SrRNA gen gekozen zijn, wordt een DNA sequentie geamplificeerd,die een soort-specifieke sequentie insluit. Het geamplificeerdeDNA wordt gedenatureerd (in enkelstrengs vorm gebracht) enonderworpen aan niet-denaturerende gel electroforese.The principle of the present method (PCR-SDDM) for bacterial identification is as follows. Using universal primers selected in conserved regions of the 16SrRNA gene, a DNA sequence is amplified which includes a species-specific sequence. The amplified DNA is denatured (single stranded) and subjected to non-denaturing gel electrophoresis.
Verondersteld wordt dat de soort-specifieke sequentieaanleiding geeft tot verschillende secondaire structuren enmobiliteiten in de gel. Door de mobiliteit van een bepaald ssSNAten opzichte van éen of meerdere referentie DNA moleculen ofmerkers (markers) vast te stellen en deze te relateren aan eendata bestand met de mobiliteit van ssDNAs afkomstig van bekendebacteriesoorten, kan de identiteit van de onbekende bacterievastgesteld worden.The species-specific sequence is believed to give rise to various secondary structures and mobilities in the gel. By identifying the mobility of a given ssSNA to one or more reference DNA molecules or markers (markers) and relating them to a data file with the mobility of ssDNAs from known bacterial species, the identity of the unknown bacteria can be established.
In tegenstelling tot de (klassieke) PCR-SSCP wordt nietgekeken naar de aan- of afwezigheid van éen enkele punt-mutatiedoor een geringe mobiliteitsverandering van een ssDNA molecuulten gevolge van deze mutatie vast te stellen, maar naar demobiliteit van een (in principe willekeurig) ssDNA molecuul tenopzichte van een set merkers om vervolgens aan de hand van dezemobiliteit de identiteit van een bacterie vast te stellen.In contrast to the (classic) PCR-SSCP, the presence or absence of a single point mutation is not examined by detecting a slight mobility change of an ssDNA molecule as a result of this mutation, but the demobility of an (in principle random) ssDNA molecule compared to a set of markers to subsequently determine the identity of a bacterium based on this mobility.
Detectie methodenDetection methods
Voor het detecteren van het geëlektroforeerde DNA or RNAkan een kleuringstechniek worden gebruikt, bijvoorbeeld eenzilverkleuring of een ethidiumbromidekleuring. Naast dezekleuringsmethoden zijn er in de literatuur nog een groot aantalandere kleuringen voor het aantonen van DNA of RNA in gels beschreven. Een aantal van deze methoden is ook geschikt voorhet aantonen van ssDNA in PCR-SDDM.A staining technique may be used to detect the electrophoresed DNA or RNA, for example, a silver stain or an ethidium bromide stain. In addition to these staining methods, many other stains have been described in the literature for detecting DNA or RNA in gels. Some of these methods are also suitable for detecting ssDNA in PCR-SDDM.
Een alternatieve kleuring is met Stains-all [l-ethyl-2-(1-ethylnaphthol[1,2-d]thiazolin-2-ylidene)-2-methylpropenyl]naphthol[l,2-d]thiazoliumbromide; Sigma, St. Louis, MO).An alternative staining is with Stains-all [1-ethyl-2- (1-ethylnaphthol [1,2-d] thiazolin-2-ylidene) -2-methylpropenyl] naphthol [1,2-d] thiazolium bromide; Sigma, St. Louis, MO).
Directe labelling van het PCR product is mogelijk doorgebruik te maken van radio-activiteit, fluorochromen, chemi-luminescentie labels, biotine en digoxigenine systemen.Direct labeling of the PCR product is possible using radioactivity, fluorochromes, chemiluminescence labels, biotin and digoxigenin systems.
Indien de PCR reactie wordt uitgevoerd bij aanwezigheid vaneen geschikt radio-actief label zoals 35S, 32P, 33P-deoxynucleotide trifosfaten (dNTP) of 32P, 33P-gelabelde primerskan het ssDNA band patroon worden vastgelegd met autoradiografieof een β-scanner. Het autoradiogram kan vervolgens met eenscanner ingelezen worden in de computer en met geschikte soft¬ware geanalyseerd. Hierdoor is een directe toekenning van eensoortnaam aan een ssDNA banden patroon mogelijk. De gegevens vaneen β-scanner kunnen over het algemeen direct voor analyse in decomputer ingevoerd worden.If the PCR reaction is performed in the presence of an appropriate radioactive label such as 35S, 32P, 33P-deoxynucleotide triphosphates (dNTP) or 32P, 33P-labeled primers, the ssDNA band pattern can be captured by autoradiography or a β-scanner. The autoradiogram can then be read into the computer with a scanner and analyzed with suitable software. This allows direct assignment of a species name to an ssDNA band pattern. The data from a β-scanner can generally be entered directly into the computer for analysis.
Het gebruik van chemiluminescente labels, bijvoorbeeldacridinium esters, is alleen mogelijk in combinatie met primers(de primers worden dus gelabeld, want de aanwezigheid van hetlabel heeft invloed op de mobiliteit). De chemiluminescentiewordt of met een film vastgelegd of door middel van een camerasysteem. In beide gevallen kunnen de data met behulp vancomputer apparatuur geanalyseerd worden.The use of chemiluminescent labels, for example acridinium esters, is only possible in combination with primers (so the primers are labeled, because the presence of the label has an influence on mobility). The chemiluminescence is either recorded with a film or by a camera system. In both cases, the data can be analyzed using computer equipment.
Labelling van de primers met een fluorochroom, bijv.fluoresceine isothiocyanaat (FITC) (het fluorochroom heeftinvloed op de mobiliteit van het ssDNA), heeft belangrijkevoordelen. Electroforese en analyse van de resultaten kunnen dangekoppeld worden door gebruik te maken van een automatische DNAsequencer. Het principe van een automatische DNA sequencer isdat met een geschikt fluorochroom gelabelde DNA moleculen dooreen polyacrylamide gel geëlectroforeerd worden. Onder aan de gelwordt het fluorochroom aangestraald met laserlicht van eengeschikte golflengte. De fluorescentie intensiteit wordt bepaald en doorgegeven aan een computer. De tijd die een DNA molecuulnodig heeft om de laser te passeren is hier een maat voor demobiliteit.Labeling the primers with a fluorochrome, e.g. fluorescein isothiocyanate (FITC) (the fluorochrome affects the mobility of the ssDNA) has important advantages. Electrophoresis and analysis of the results can then be coupled using an automatic DNA sequencer. The principle of an automatic DNA sequencer is that electrophoresed with a suitable fluorochrome labeled DNA molecules are electrophoresed by a polyacrylamide gel. At the bottom of the gel, the fluorochrome is irradiated with laser light of a suitable wavelength. The fluorescence intensity is determined and passed on to a computer. The time it takes for a DNA molecule to pass the laser is a measure of demobility.
Het gebruik van biotine en digoxigenine systemen is welmogelijk maar minder praktisch, omdat na de gel electroforesehet DNA overgeblot moet worden naar een nitrocellulose of nylonmembraan. Na het blotten wordt de positie van de DNA fragmentenzichtbaar gemaakt door de blot te incuberen met een conjugaatvan een enzym en hetzij avidine hetzij een anti-digoxigenineantilichaam, gevolgd door de omzetting van een substraat van hetin het conjugaat gebruikte enzym.The use of biotin and digoxigenin systems is possible but less practical, because after the gel electrophoresis the DNA has to be blotted to a nitrocellulose or nylon membrane. After blotting, the position of the DNA fragments is visualized by incubating the blot with an enzyme conjugate and either avidin or an anti-digoxigenin antibody, followed by conversion of a substrate of the enzyme used in the conjugate.
Alternatieven tijdens en voor de PCRAlternatives during and before the PCR
PCR amplificatie kan, behalve met Tag-polymerase, ook metandere thermostabiele DNA polymerases uitgevoerd worden, bijv.Vent-polymerase, Ttii-polymerase, Super Tag-polymerase. Doorgebruik te maken van andere preparaten met thermostabiele DNApolymerases is het vaak mogelijk om contaminatie van hetpolymerase preparaat met DNA of RNA, afkomstig van de voorisolatie van het polymerase gebruikte bacteriële cel, tevoorkomen. In voorkomende gevallen zal het noodzakelijk zijn omhet preparaat met de thermostabiele DNA polymerase te behandelenmet DNase of RNase om contaminerend DNA of RNA te verwijderen.DNase wordt vervolgens door een hitte-behandeling geïnactiveerd.Het RNase kan geïnactiveerd worden door het toevoegen van eenremmer zoals RNasine.PCR amplification, in addition to Tag polymerase, can also be performed with other thermostable DNA polymerases, e.g. Vent polymerase, Ttii polymerase, Super Tag polymerase. By using other preparations with thermostable DNA polymerases it is often possible to avoid contamination of the polymerase preparation with DNA or RNA from the bacterial cell used for the pre-isolation of the polymerase. Where appropriate, it will be necessary to treat the preparation with the thermostable DNA polymerase with DNase or RNase to remove contaminating DNA or RNA, which is then inactivated by heat treatment, and the RNase can be inactivated by adding an inhibitor such as RNasine.
De differentiatie tussen verschillende bacteriesoorten(specificiteit) kan verbeterd worden door een tweede set primerste gebruiken. In principe is het mogelijk om beide sets primerstegelijk te gebruiken (multiplex PCR), waardoor er meer dan éenDNA fragment tegelijk wordt geamplificeerd.The differentiation between different bacterial species (specificity) can be improved by using a second set of primer ones. In principle, it is possible to use both sets of primer-like (multiplex PCR), so that more than one DNA fragment is amplified at the same time.
De detectie limiet van het systeem (gevoeligheid) kanverbeterd worden door een zogeheten "nested PCR” uit te voeren.Bij deze opzet worden eveneens twee sets primers gebruikt. Detweede set primers ligt dan tussen de posities van de primers in de eerste set. De eerste set wordt bijv. gedurende 30 cycligebruikt en een deel van het PCR monster wordt vervolgens vooreen tweede amplificatie van 30 of 35 cycli met de tweede setprimers gebruikt.The detection limit of the system (sensitivity) can be improved by performing a so-called "nested PCR". In this setup, two sets of primers are also used. The second set of primers is then between the positions of the primers in the first set. The first for example, set is used for 30 cycles and part of the PCR sample is then used for a second amplification of 30 or 35 cycles with the second set primers.
In plaats van DNA is het ook mogelijk om RNA als "target"sequentie te gebruiken. Het gebruik van het rRNA heeft alsvoordeel dat er tot 10.000 kopieën per cel aanwezig kunnen zijn.Het rRNA wordt dan met behulp van reverse transcriptase omgezetin een cDNA, dat vervolgens dient als uitgangsmateriaal voor debovenbeschreven PCR methoden.Instead of DNA it is also possible to use RNA as a "target" sequence. The advantage of using the rRNA is that it can contain up to 10,000 copies per cell. The rRNA is then converted into a cDNA using reverse transcriptase, which then serves as the starting material for the PCR methods described above.
Een alternatieve methode is echter de 3SR methode (T.R.Gingeras, K.M. Whitfield, D.Y. Kwoh. 1990. Unique features ofthe self-sustained sequence replication (3SR) reaction in the invitro amplification of nucleic acids. Ann. Biol. Clin. 48: 498501; J.C. Guatelli, K.M. Whitfield, D.Y. Kwoh, K.J.However, an alternative method is the 3SR method (TRGingeras, KM Whitfield, DY Kwoh. 1990. Unique features of the self-sustained sequence replication (3SR) reaction in the invitro amplification of nucleic acids. Ann. Biol. Clin. 48: 498501; JC Guatelli, KM Whitfield, DY Kwoh, KJ
Barringer, D.D. Richman, T.R. Gingeras. 1990. Isothermal, invitro amplification of nucleic acids by a multi-enzyme reactionmodeled after retroviral replication. Proceedings NationalAcademy of Sciences USA 87:1874-1878) en de "nucleic acid systembased amplification" (NASBA) (T. Kievits, B. van Gemen, D. vanStrijp, R. Schukking, M. Dircks, H. Adriaanse, L. Malek, R.Sooknanan, P. Lens. NASBA™ isothermal enzymatic in vitro nucleicacid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1infection. 1991. Journal of Virological Methods 35:273-286).Barringer, D.D. Richman, T.R. Gingeras. 1990. Isothermal, invitro amplification of nucleic acids by a multi-enzyme reaction modeled after retroviral replication. Proceedings NationalAcademy of Sciences USA 87: 1874-1878) and the "nucleic acid system-based amplification" (NASBA) (T. Kievits, B. van Gemen, D. vanStrijp, R. Schukking, M. Dircks, H. Adriaanse, L. Malek, R. Sooknanan, P. Lens, NASBA ™ isothermal enzymatic in vitro nucleicacid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection. 1991. Journal of Virological Methods 35: 273-286).
Het principe van 3SR en de NASBA is vergelijkbaar en beidezijn afgeleid van het transcription-based amplification system(TAS) (D.Y. Kwoh, G.R. Davis, K.M. Whitfield, H.L. Chapelle, L.J. Di Michele, T.R. Gingeras. 1989. Transcription-basedamplification system and detection of amplified humanimmunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwichhybridization format. Proceedings National Academy of SciencesUSA 86:1173-1177).The principle of 3SR and NASBA is similar and both are derived from the transcription-based amplification system (TAS) (DY Kwoh, GR Davis, KM Whitfield, HL Chapelle, LJ Di Michele, TR Gingeras. 1989. Transcription-based amplification system and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization format. Proceedings National Academy of Sciences USA 86: 1173-1177).
Kort weergegeven is het principe van de NASBA als volgt.Briefly, the NASBA principle is as follows.
Met behulp van een specifieke primer Pl, die aan de 5'-kant eenT7 promotorsequentie bezit, wordt onder toepassing van AMV- reverse transcriptase (AMV-RT) een dubbelstrengs DNA-RNA hybridegemaakt van het target RNA molecuul. RNase H breekt vervolgensde RNA streng van dit hybride af. De tweede specifieke primer P2kan met het ontstane ss-cDNA hybridiseren (annealen) en de DNA-afhankelijke DNA polymerase activiteit van AMV-RT maakt het ss-cDNA dubbelstrengs. Het product is een dubbelstrengs DNAmolecuul met een T7 promotor. Door het gebruik van T7 RNApolymerase ontstaat een 100 tot 1000-voudige toename van hetspecifieke RNA. Dit RNA kan weer gebruikt worden door AMV-RTvoor het genereren van nieuwe cDNA moleculen. Hierdoor onstaateen cyclische fase en een enorme toename van de hoeveelheid RNA.Het hele proces speelt zich af bij bijv. 41°C. Het RNA productwordt uiteindelijk gedetecteerd c.q. geanalyseerd. Met enkelekleine modificaties kan ook dubbelstrengs DNA in plaats van RNAals uitgangsmateriaal dienen.Using a specific primer P1, which has a T7 promoter sequence on the 5 'side, a double-stranded DNA RNA hybrid is made from the target RNA molecule using AMV reverse transcriptase (AMV-RT). RNase H then breaks down the RNA strand of this hybrid. The second specific primer P2 can hybridize (anneal) to the resulting ss cDNA and the DNA dependent DNA polymerase activity of AMV-RT makes the ss cDNA double stranded. The product is a double stranded DNA molecule with a T7 promoter. The use of T7 RNA polymerase results in a 100 to 1000 fold increase in the specific RNA. This RNA can be used again by AMV-RT to generate new cDNA molecules. This creates a cyclic phase and an enormous increase in the amount of RNA. The whole process takes place at eg 41 ° C. The RNA product is ultimately detected or analyzed. Single-stranded modifications can also serve double-stranded DNA instead of RNA as starting material.
Het NASBA systeem heeft als mogelijk bijkomend voordeel dathet RNA gebruikt wordt voor SDDM identificatie. Voor SSCP isbeschreven dat het gebruik van RNA tot grotere verschillen inmobiliteit leidt (G. Sarkar, H.-S. Yoon, S.S. Somer. 1992.Screening for mutations by RNA single-strand conformationpolymorphism (rSSCP): comparison with DNA-SSCP. Nucleic Acidsresearch 20:871-878).The NASBA system has the added benefit of using the RNA for SDDM identification. For SSCP, the use of RNA has been reported to lead to greater differences in mobility (G. Sarkar, H.-S. Yoon, SS Somer. 1992. Screening for mutations by RNA single-strand conformation polymorphism (rSSCP): comparison with DNA-SSCP. Nucleic Acids Research 20: 871-878).
Detectie van andere micro-orqanismenDetection of other micro-organisms
Hoewel de belangrijkste toepassing van de uitvinding zalbestaan uit het identificeren en van elkaar onderscheiden vanbacteriesoorten (species), is de uitvinding ook bruikbaar voorhet onderscheiden van genera of van stammen.Although the main application of the invention will be to identify and distinguish bacterial species (species), the invention is also useful for distinguishing genera or strains.
Behalve voor de identificatie van bacteriën is de methodein principe ook geschikt voor de identificatie van schimmels(fungi, actinomyceten) en eencellige parasieten. De universeleprimers die hierin beschreven zijn, kunnen echter niet gebruiktworden, omdat eukaryoten het voor de bacteriën gekozen soort¬specifieke deel van het rRNA missen. Schimmels hebben geeninserties in de rRNA sequentie ten opzichte van humaan (zoogdier) rRNA. Wel kunnen soort-specifieke sequenties wordenaangewezen, die geflankeerd worden door geconserveerdesequenties, waar universele eukaryote primers gekozen kunnenworden. Contaminatie van de monsters door humaan rRNA of rRNADNA leidt echter tot extra producten in de PCR-SDDM, die deinterpretatie van de gegevens kunnen beïnvloeden. Voor sommigeparasieten, zoals Plasmodium (de veroorzaker van malaria), zijnwel unieke inserties in het rRNA beschreven, maar in zulkeomstandigheden ligt het meer voor de hand om met Plasmodiumspecifieke primers kijken. Ook hier zal men dus voornoemdeuniversele eukaryote primers moeten gebruiken.In addition to the identification of bacteria, the method is in principle also suitable for the identification of fungi (fungi, actinomycetes) and single-celled parasites. However, the universal primers described herein cannot be used because eukaryotes lack the species-specific part of the rRNA selected for the bacteria. Fungi have no insertions in the rRNA sequence relative to human (mammalian) rRNA. Species-specific sequences can be designated, flanked by conserved sequences, where universal eukaryotic primers can be selected. Contamination of the samples by human rRNA or rRNADNA, however, leads to additional products in the PCR-SDDM, which may influence data interpretation. For some parasites, such as Plasmodium (the causative agent of malaria), unique insertions have been described in the rRNA, but in such circumstances it is more obvious to look with Plasmodium-specific primers. Here, too, one will therefore have to use the aforementioned universal eukaryotic primers.
Toepassing van de onderhavige methode bij virussen wordtbemoeilijkt door de sterke heterogeniteit van virussen. Dezehebben over het algemeen geen gemeenschappelijke sequenties. Eenuitzondering vormen enterovirussen, waarvoor universele primersbeschreven zijn.Application of the present method to viruses is complicated by the strong heterogeneity of viruses. These generally do not have common sequences. Enteroviruses, for which universal primers have been described, are an exception.
De onderhavige werkwijze zal echter bij virussen welgebruikt kunnen worden voor (epidemiologische) typering vanisolaten, bijv. voor het onderscheiden van verschillendeserotypen van adenovirus, human papilloma virus (HPV) en humanimmunodeficiency virus type 1 en 2 (HIV). In dergelijke gevallenzullen species-specifieke primers gebruikt moeten worden diestam-specifieke sequenties insluiten.However, the present method can be used in viruses for (epidemiological) typing of isolates, e.g. for distinguishing different serotypes of adenovirus, human papilloma virus (HPV) and human immunodeficiency virus types 1 and 2 (HIV). In such cases, species-specific primers will have to be used to include strain-specific sequences.
Kwantitatieve PCR-SDDMQuantitative PCR-SDDM
De PCR-SDDM kan aangepast worden om kwantitatief dehoeveelheid DNA c.q. RNA in een monster te bepalen en daarmeehet aantal micro-organismen dat aanwezig is. Dit kan bijv.belangrijk zijn bij de kwaliteitsbewaking van water of hetvolgen van anti-microbiële therapie. Hiertoe dient voor de PCRstap een bekende hoeveelheid DNA respectievelijk RNA toegevoegdte worden. Het PCR product moet echter wel een andere mobiliteitin de gel hebben dan het te kwantificeren DNA. Door hetverkregen signaal te meten (radio-activiteit: meten van α, β ofγ-straling of densitometrie op het autoradiogram; fluorochroom: fluorescentie intensiteit; zilverkleuring en ethidiumbromide:densitometrie) en te relateren aan het signaal dat verkregenwordt met bekende hoeveelheden DNA c.q. RNA, die voor de PCRgebruikt worden, is de in het monster aanwezige hoeveelheid DNAc.q. RNA te bepalen en daarmee het aantal micro-organismen.The PCR-SDDM can be adjusted to quantitatively determine the amount of DNA or RNA in a sample and thus the number of microorganisms that are present. This can be important, for example, when monitoring water quality or following anti-microbial therapy. For this purpose, a known amount of DNA or RNA must be added for the PCR step. However, the PCR product must have a different mobility in the gel than the DNA to be quantified. By measuring the signal obtained (radioactivity: measuring α, β or γ radiation or densitometry on the autoradiogram; fluorochrome: fluorescence intensity; silver staining and ethidium bromide: densitometry) and relating it to the signal obtained with known amounts of DNA or RNA, used for the PCR is the amount of DNAc.q. in the sample. Determine RNA and thus the number of micro-organisms.
VOORBEELDENEXAMPLES
Monster voorbereiding bii gebruik van.lossekolonies of rein- cul£ur.e.s.Sample preparation using colony colonies or reinult £ ur.e.s.
Gram-negatieve bacteriën werden overnacht op bloed agarplaten gekweekt bij 37°C, vervolgens van de platen geschraapt engelyseerd in gedeïoniseerd water met 5-10% chelex 100 (Biorad,Richmond, CA) door 5 minuten bij 95°C te verhitten.Gram-negative bacteria were grown overnight on blood agar plates at 37 ° C, then scraped from the plates and lyonized in deionized water with 5-10% chelex 100 (Biorad, Richmond, CA) by heating at 95 ° C for 5 minutes.
Gram-positieve bacteriën werden in 0,01% natriumdodecyl-sulfaat (SDS) en 5-10% chelex 100 gelyseerd door 5 minuten op95°C te verhitten. Na de lysis werd 0,5% Nonidet P-40 (Sigma,Gram positive bacteria were lysed in 0.01% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 5-10% chelex 100 by heating at 95 ° C for 5 minutes. After the lysis, 0.5% Nonidet P-40 (Sigma,
St. Louis, MO) toegevoegd om remming van het Tag-polymerase doorSDS te voorkomen.St. Louis, MO) to prevent inhibition of the Tag polymerase by SDS.
Bloedmonster voorbereiding voor detectie bacteremia met behulpvan de PCRPrepare blood sample for detection of bacteremia using the PCR
De monster voorbereiding bestond uit lysis van de bloed¬cellen gevolgd door een filterconcentratie van eventueelaanwezige bacteriën. Met behulp van deze methode konden(relatief) grote volumina bloed gelyseerd worden. Tenminste 2 mlbloed kon met deze methode opgewerkt worden.The sample preparation consisted of lysis of the blood cells followed by a filter concentration of any bacteria present. With this method, (relatively) large volumes of blood could be lysed. At least 2 ml of blood could be worked up by this method.
EDTA of citraat bloed werd 1:1 verdund met 1% Nonidet P40(NP40; Sigma, St. Louis, MO) en ingevroren. Na ontdooien werdhet monster 5 minuten bij 4000 x g en een temperatuur van +4°Cgecentrifugeerd. De pellet werd één keer gewassen met 0,5% NP40,en vervolgens gedurende 5 minuten bij 4000 x g gecentrifugeerd,waarna één keer met fysiologisch zout gewassen en vervolgens 5minuten bij 4000 x g gecentrifugeerd werd. De verkregen pelletwerd geresuspendeerd in 200 μΐ 1 x PCR buffer (10 mM Tris-HCl(pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,01% (gewicht/volume) gelatine) en 15 minuten geïncubeerd met 300 μg DNase I bij 37°C.Hierna werd de suspensie door een 0,22 μιη Duraporemembraanfilter (GVHP filter) (Millipore, Bedford, MA)gefiltreerd, en het filter werd vervolgens twee keer gewassenmet fysiologisch zout. Het filter werd naar een 0,5 mleppendorfbuisje overgebracht en de eventueel aanwezige bacteriënwerden in 50 μΐ 5%-10% chelex in gedeïoniseerd water gèlyseerddoor 10 minuten bij 95°C te verhitten. Na een centrifugatie van30 seconden bij ongeveer 12.000 x g werd 20 μΐ van hetsupernatant gebruikt voor PCR amplificatie.EDTA or citrate blood was diluted 1: 1 with 1% Nonidet P40 (NP40; Sigma, St. Louis, MO) and frozen. After thawing, the sample was centrifuged at 4000 x g and a temperature of + 4 ° C for 5 minutes. The pellet was washed once with 0.5% NP40, then centrifuged at 4000 x g for 5 minutes, washed once with saline and then centrifuged at 4000 x g for 5 minutes. The resulting pellet was resuspended in 200 μl of 1x PCR buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% (weight / volume) gelatin) and incubated with 15 minutes 300 μg DNase I at 37 ° C. After this, the suspension was filtered through a 0.22 μl Durapor Membrane Filter (GVHP filter) (Millipore, Bedford, MA), and the filter was then washed twice with saline. The filter was transferred to a 0.5 mleppendorf tube and the bacteria, if present, were lysed in 50 µl 5% -10% chelex in deionized water by heating at 95 ° C for 10 minutes. After a 30 second centrifugation at approximately 12,000 x g, 20 μl of the supernatant was used for PCR amplification.
PCRPCR
De PCR werd gedurende 35 cycli uitgevoerd met primersgericht tegen geconserveerde 16S rRNA gen sequenties (Chen et al1989, FEMS Microbiology Letters 57: 19-24).The PCR was performed for 35 cycles with primers directed against conserved 16S rRNA gene sequences (Chen et al1989, FEMS Microbiology Letters 57: 19-24).
ER1: AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC (nucleotide no. 1173-1192) enER2: GAG GAA GGT GGG GAT GAC GT (complementair aan nucleotideno. 1370-1389) .ER1: AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC (nucleotide No. 1173-1192) and ER2: GAG GAA GGT GGG GAT GAC GT (complementary to nucleotides No. 1370-1389).
Elke cyclus bestond uit 1 minuut 94°C, 10 seconden 72°C, 1minuut 55°C. Het PCR reactie mengsel (50 μΐ) bestond uit: 10 mMTris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,01% (gewicht/volume) gelatine, 100 μΜ van elke primer, 1 U Taq-polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Emmeryville, CA) en 100 μΜ vanelke dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).Each cycle consisted of 94 ° C for 1 minute, 72 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 1 minute. The PCR reaction mixture (50 μΐ) consisted of: 10 mMTris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl2, 0.01% (weight / volume) gelatin, 100 μΜ of each primer, 1 U Taq polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Emmeryville, CA) and 100 μΜ of each dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Amplificatie van het target DNA resulteerde in een DNAfragment van ongeveer 218 bp (kleine verschillen afhankelijk vande bacteriesoort zijn mogelijk).Amplification of the target DNA resulted in a DNA fragment of approximately 218 bp (small differences depending on the bacterial species are possible).
Analyse met behulp van gel electroforeseAnalysis using gel electrophoresis
Na amplificatie werd 5-10 μΐ van het PCR mengsel toegevoegdaan 5 μΐ sequencing monster buffer (95% formamide, 5 mM EDTA,0,05% broomfenolblauw en 0,05% xyleen cyanol FF) en 5 minutenbij 95°C verhit. Het gedenatureerde DNA werd vervolgens directop ijs geplaatst en na 10 minuten op een gel gebracht vooranalyse.After amplification, 5-10 μΐ of the PCR mixture was added to 5 μΐ sequencing sample buffer (95% formamide, 5 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue and 0.05% xylene cyanol FF) and heated at 95 ° C for 5 minutes. The denatured DNA was then placed directly on ice and gelated for 10 minutes for pre-analysis.
Analyse werd uitgevoerd met drie verschillende typen poly¬acrylamide gelen. In alle gevallen werd 10% glycerol toegevoegdom de resolutie te verbeteren. De gebruikte geltypen zijn:Analysis was performed with three different types of polyacrylamide gels. In all cases, 10% glycerol was added to improve the resolution. The gel types used are:
- 6% bisacrylamide/acrylamide (1 : 29), 0,05% ammoniumpersulfaaten 0,005% TEMED in 54 mM Tris, 54 mM boraat, 1,2 mM EDTA- 6% bisacrylamide / acrylamide (1: 29), 0.05% ammonium persulfates 0.005% TEMED in 54mM Tris, 54mM borate, 1.2mM EDTA
(0,6xTBE pH 8,3).(0.6xTBE pH 8.3).
- 6% hydrolink longranger gel (JT Baker, Deventer, Nederland),0,05% ammoniumpersulfaat en 0,005% TEMED in 54 mM Tris, 54 mMboraat, 1,2 mM EDTA (Ο,βχΤΒΕ pH 8,3).- 6% hydrolink longranger gel (JT Baker, Deventer, The Netherlands), 0.05% ammonium persulfate and 0.005% TEMED in 54 mM Tris, 54 mM borate, 1.2 mM EDTA (Ο, βχΤΒΕ pH 8.3).
- 0,5 x MDE (Mutation Detection Enhancement) gel (JT Baker),0,05% ammoniumpersulfaat en 0,005% TEMED in 54 mM Tris, 54 mMboraat, 1,2 mM EDTA ( Ο,βχΤΒΕ pH 8,3 ).- 0.5 x MDE (Mutation Detection Enhancement) gel (JT Baker), 0.05% ammonium persulfate and 0.005% TEMED in 54 mM Tris, 54 mM borate, 1.2 mM EDTA (Ο, βχΤΒΕ pH 8.3).
Bij gebruik van polyacrylamide gelen en longranger gelenwerd met spacers van 0,4 mm een betere resolutie verkregen danmet spacers van 0,75 mm.When using polyacrylamide gels and longgranger gels, a better resolution was obtained with spacers of 0.4 mm than with spacers of 0.75 mm.
Electroforese werd uitgevoerd bij kamertemperatuur met 0,6x TBE buffer bij 1,5 W constant vermogen gedurende 1,5-2 uurvoor een 6 x 8 cm gel en bij 5 W constant vermogen gedurende 3-4uur voor een 20 x 20 cm gel.Electrophoresis was performed at room temperature with 0.6x TBE buffer at 1.5 W constant power for 1.5-2 hours for a 6 x 8 cm gel and at 5 W constant power for 3-4 hours for a 20 x 20 cm gel.
Na de electroforese werd de positie (een maat voor demobiliteit) van het ssDNA in de gel vastgesteld met ethidium-bromidekleuring of zilverkleuring.After electrophoresis, the position (a measure of demobility) of the ssDNA in the gel was determined by ethidium bromide staining or silver staining.
De ethidiumbromidekleuring werd als volgt uitgevoerd. Degel werd 5 minuten ondergedompeld in een oplossing van 1 μg/mlethidiumbromide in 0,6 x TBE buffer en vervolgens ontkleurd in0,6 x TBE gedurende 15 min. DNA banden werden zichtbaar gemaaktmet UV-licht.The ethidium bromide staining was performed as follows. The gel was immersed in a solution of 1 μg / mlethidium bromide in 0.6 x TBE buffer for 5 min and then decolorized in 0.6 x TBE for 15 min. DNA bands were visualized by UV light.
Bij de zilverkleuring werden de gelen eerst gefixeerd in50% methanol gedurende 30 minuten bij 37°C en vervolgens tweemaal gewassen met gedeïoniseerd water. De gelen werden voor 15-30 minuten behandeld bij 37°C met 0,1% zilvernitraat, 0,056%NaOH en 0,375% NH4OH. Kleurontwikkeling vond plaats doorincubatie met 0,005% citroenzuur en 0,019% formaldehyde. Degelen werden gewassen met gedeïoniseerd water en de kleur¬ontwikkeling werd gestopt met 50% methanol en 5% azijnzuur.In the silver staining, the gels were first fixed in 50% methanol for 30 minutes at 37 ° C and then washed twice with deionized water. The gels were treated for 15-30 minutes at 37 ° C with 0.1% silver nitrate, 0.056% NaOH and 0.375% NH4OH. Color development occurred by incubation with 0.005% citric acid and 0.019% formaldehyde. Degels were washed with deionized water and the color development was stopped with 50% methanol and 5% acetic acid.
Volgens een alternatieve zilverkleuringsmethode werden degelen eerst gefixeerd in 10% azijnzuur gedurende 20 minuten envervolgens drie maal gewassen met gedeioniseerd water gedurende2 minuten. De gelen werden 30 minuten behandeld metzilvernitraat (1 g/1), 1,5 ml 37% mierezuur per liter. De gelwerd gedurende 20 seconden gewassen met gedeioniseerd water.Kleurontwikkeling vond plaats door 2-5 minuten incubatie met 30g/1 natriumcarbonaat, 1,5 ml 37% mierezuur per liter en 2 mg/1Na2S2Ü3.5H2O. De kleurontwikkeling werd gestopt door de gelengedurende 5 minuten met 10% azijnzuur te behandelen. Alleincubaties werden bij kamertemperatuur uitgevoerd.According to an alternative silver staining method, sections were first fixed in 10% acetic acid for 20 minutes and then washed three times with deionized water for 2 minutes. The gels were treated with silver nitrate (1 g / l), 1.5 ml 37% formic acid per liter for 30 minutes. The gel was washed with deionized water for 20 seconds. Color development occurred by incubation for 2-5 minutes with 30g / l sodium carbonate, 1.5ml 37% formic acid per liter and 2mg / 1Na2S2O3.5H2O. Color development was stopped by treating the gels with 10% acetic acid for 5 minutes. All incubations were performed at room temperature.
Resu.1hat-.en: De methode werd toegepast op 57 bacteriestammen gekozen uit 27 soorten en 15 geslachten. Dit resulteerde in 22verschillende ssDNA band patronen zoals weergegeven in Tabel 1.Resu.1hat-.en: The method was applied to 57 bacterial strains selected from 27 species and 15 genera. This resulted in 22 different ssDNA band patterns as shown in Table 1.
Tabel 1. De verschillende ssDNA band patronen verkregen bijanalyse van verschillende bacteriesoorten.Table 1. The different ssDNA band patterns obtained by analysis of different bacterial species.
patroon soort_aantal stammen getast 1 Staphylococcus epldermidis 3 2, 3 Staphylococcus aureus 3 4 Klebsiella oxytoca 2 5 Klebsiella pneumoniae 3 6 Enterobacter cloacae 3 I Enterobacter aerogenes 2 7 Enterobacter agglomerans 1 7 Enterobacter gergovia 1 8 Proteus vulgaris 3 8 Proteus mirabilis 2 9 Citrobacter freundii 2 10 Escherichia coli 6 10 Salmonella choleraesuis 4 10 Shigella dysenteriae 1 10 Shigella flexneri 1 II Listeria monocytogenes 1 11 Listeria innocua 1 12 Enterobacter sakazaki 1 13 Bacteroides fragilis 1 14 Acinetobacter calcaoceticus 2 15 Clostridium difficile 2 16 Morganella morganii 2 17 Streptococcus groep A 2 18 Pseudomonas fluorescens 1 19,20 Pseudomonas putida 1 21 Pseudomonas malthophilia 3 22 Pseudomonas aeruginosa 3cartridge species number of strains probed 1 Staphylococcus epldermidis 3 2, 3 Staphylococcus aureus 3 4 Klebsiella oxytoca 2 5 Klebsiella pneumoniae 3 6 Enterobacter cloacae 3 I Enterobacter aerogenes 2 7 Enterobacter agglomerans 1 7 Enterobacter gergovia 1 8 Proteus vulgarilis 3 8ii Citro vulgaris 3 8ii 10 Escherichia coli 6 10 Salmonella choleraesuis 4 10 Shigella dysenteriae 1 10 Shigella flexneri 1 II Listeria monocytogenes 1 11 Listeria innocua 1 12 Enterobacter sakazaki 1 13 Bacteroides fragilis 1 14 Acinetobacter calcaoceticus 2 15 Clostridium difficile 2 16 Areptocococcus 2 17 Strept. Pseudomonas fluorescens 1 19.20 Pseudomonas putida 1 21 Pseudomonas malthophilia 3 22 Pseudomonas aeruginosa 3
De ssDNA band patronen waren soort-specifiek, behalve datde geteste Proteus spp. hetzelfde patroon te zien gaven. Dit wasook het geval voor de Listeria spp.f enkele van de Enterobacterspp. en de Escherichia coli/Salmonella choleraesuis/Shigellagroep. De identieke patronen voor Listeria monocytogenes enListeria innocua waren te verwachten gezien het feit dat deaanwezigheid van enkele virulentie genen het enige verschilvormt tussen beide soorten. Ook de identieke patronen tussenEscherichia coli en Shigella spp. waren te verwachten omdatbeide soorten op genetisch niveau ±99% identiek zijn en dus tot1 en dezelfde soort gerekend moeten worden. De overeenkomst vanEscherichia-coli met Salmonella choleraesuis was minderverwacht, hoewel beide soorten zeer nauw verwant zijn.The ssDNA band patterns were species specific, except that the Proteus spp. the same pattern. This was also the case for the Listeria spp.f some of the Enterobacterspp. and the Escherichia coli / Salmonella choleraesuis / Shigella group. The identical patterns for Listeria monocytogenes and Listeria innocua were to be expected given that the presence of some virulence genes is the only difference between the two species. Also the identical patterns between Escherichia coli and Shigella spp. were to be expected because both species are ± 99% identical at genetic level and should therefore be counted as 1 and the same species. The similarity of Escherichia coli with Salmonella choleraesuis was less expected, although both species are very closely related.
Om een goed onderscheid tussen de Proteus spp., deEnterobacter spp. van patroon 7 en de Salmonellacholeraesuis/Escherichia coli groep te maken, is mogelijk eenbetere resolutie gedurende electroforese noodzakelijk of er iseen tweede set primers noodzakelijk om voldoende verschil tekunnen vinden.To properly distinguish between the Proteus spp., The Enterobacter spp. of pattern 7 and the Salmonella choleraesuis / Escherichia coli group, a better resolution during electrophoresis may be necessary or a second set of primers may be necessary to find sufficient difference.
In tegenstelling tot de bovengenoemde resultaten werdenvoor Staphylococcus aureus en Pseudomonas putida tweeverschillende patronen gevonden. In sommige gevallen werden nogandere banden gevonden, die echter wel reproduceerbaar waren.Deze banden kunnen behulpzaam zijn bij een betere differentiatievan de verschillende bacteriesoorten.In contrast to the above results, two different patterns were found for Staphylococcus aureus and Pseudomonas putida. In some cases, even more bands were found, which were, however, reproducible and may help to better differentiate the different bacterial species.
Uit deze resultaten concluderen we dat het mogelijk is omde hier beschreven PCR-SDDM methode te gebruiken voor deidentificatie van bacteriën. Hiertoe zijn een beperkt aantalsets primers nodig welke resulteren in éen of enkele ssDNA bandpatronen voor elke soort. De aanwezigheid van grote hoeveelhedenbacteriën, die niet geïdentificeerd behoeven te worden, kanechter interfereren.From these results, we conclude that it is possible to use the PCR-SDDM method described here for bacteria identification. This requires a limited number of primer sets which result in one or a few ssDNA band patterns for each species. However, the presence of large amounts of bacteria, which need not be identified, may interfere.
SEQUENTIE LIJSTSEQ ID NO:1 LENGTH: 20 nucleotidesTYPE: nucleotidesSTRANDEDNESS: singleAGGCCCGGGA ACGTATTCAC 20 SEQ ID NO :2 LENGTH: 20 nucleotidesTYPE: nucleotidesSTRANDEDNESS: singleGAGGAAGGTG GGGATGACGT 20 Q τ n 1 q r 7SEQUENCE LIST SEQ ID NO: 1 LENGTH: 20 nucleotides TYPE: nucleotides STRANDEDNESS: singleAGGCCCGGGA ACGTATTCAC 20 SEQ ID NO: 2 LENGTH: 20 nucleotides TYPE: nucleotides STRANDEDNESS: singleGAGGAAGGTG GGGATGACGT 20 r
Claims (29)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9301957A NL9301957A (en) | 1993-11-11 | 1993-11-11 | Method for identifying microorganisms, and useful tools. |
| PCT/NL1994/000283 WO1995013396A2 (en) | 1993-11-11 | 1994-11-11 | A method for identifying microorganisms, and aids useful thereof |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9301957 | 1993-11-11 | ||
| NL9301957A NL9301957A (en) | 1993-11-11 | 1993-11-11 | Method for identifying microorganisms, and useful tools. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9301957A true NL9301957A (en) | 1995-06-01 |
Family
ID=19863128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9301957A NL9301957A (en) | 1993-11-11 | 1993-11-11 | Method for identifying microorganisms, and useful tools. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| NL (1) | NL9301957A (en) |
| WO (1) | WO1995013396A2 (en) |
Families Citing this family (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE38442E1 (en) * | 1994-06-22 | 2004-02-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM) |
| US5942391A (en) | 1994-06-22 | 1999-08-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM) |
| US6593086B2 (en) | 1996-05-20 | 2003-07-15 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Nucleic acid amplification methods |
| US5876924A (en) * | 1994-06-22 | 1999-03-02 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM) |
| GB9420774D0 (en) * | 1994-10-14 | 1994-11-30 | Univ Wales | Method of detecting and identifying spore forming bacteria |
| DE19716456C2 (en) * | 1997-04-21 | 2002-05-08 | Schmitt Heinz Josef | Use of a combination of primers for the detection of infectious agents |
| GB9719044D0 (en) * | 1997-09-08 | 1997-11-12 | Inst Of Ophthalmology | Assay |
| EP1044284A2 (en) * | 1998-01-08 | 2000-10-18 | Merck Sharp & Dohme de Espana S.A.E. | Hybridization probes which differentiate between the actinomadura madurae group of bacteria and maduromycetes |
| AU5062500A (en) * | 1999-04-26 | 2000-11-10 | Amersham Pharmacia Biotech Ab | Primers for identifying typing or classifying nucleic acids |
| DE19945916A1 (en) | 1999-09-24 | 2001-04-05 | Biotecon Diagnostics Gmbh | Nucleic acid molecules for the detection of bacteria and phylogenetic units of bacteria |
| WO2001023608A2 (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Merck Sharp & Dohme De Espana, S.A.E. | Hybridization probes which specifically detect strains of the genera microbispora, microtetraspora, nonomuria and planobispora |
| DE10027113A1 (en) | 1999-12-23 | 2001-09-27 | Andreas Hoeft | Method for determining microbial DNA / RNA, kit therefor and use of the method |
| US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
| WO2004060278A2 (en) | 2002-12-06 | 2004-07-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
| US20040121309A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in blood, bodily fluids, and bodily tissues |
| AU2013231102B2 (en) * | 2001-03-02 | 2016-04-28 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
| US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
| US20030027135A1 (en) | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
| US7217510B2 (en) * | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
| US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
| US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US7205111B2 (en) * | 2003-07-24 | 2007-04-17 | Marshfield Clinic | Rapid identification of bacteria from positive blood cultures |
| US8097416B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| US20120122099A1 (en) | 2003-09-11 | 2012-05-17 | Rangarajan Sampath | Compositions for use in identification of bacteria |
| US7666592B2 (en) | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
| EP2458619B1 (en) | 2004-05-24 | 2017-08-02 | Ibis Biosciences, Inc. | Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding |
| US20050266411A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
| US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
| US7309589B2 (en) * | 2004-08-20 | 2007-12-18 | Vironix Llc | Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing |
| WO2006135400A2 (en) | 2004-08-24 | 2006-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of recombinant organisms |
| US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
| US20060205040A1 (en) | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Rangarajan Sampath | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
| AU2006272776B2 (en) | 2005-07-21 | 2012-01-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants |
| US8088582B2 (en) | 2006-04-06 | 2012-01-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for the use in identification of fungi |
| AU2007353877B2 (en) | 2006-09-14 | 2012-07-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
| JP5680304B2 (en) | 2007-02-23 | 2015-03-04 | アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド | Rapid forensic DNA analysis |
| WO2008151023A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
| US8148163B2 (en) | 2008-09-16 | 2012-04-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
| EP2349549B1 (en) | 2008-09-16 | 2012-07-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, and system |
| EP2344893B1 (en) | 2008-09-16 | 2014-10-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and methods |
| EP2396803A4 (en) | 2009-02-12 | 2016-10-26 | Ibis Biosciences Inc | Ionization probe assemblies |
| WO2010104798A1 (en) | 2009-03-08 | 2010-09-16 | Ibis Biosciences, Inc. | Bioagent detection methods |
| US9393564B2 (en) | 2009-03-30 | 2016-07-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Bioagent detection systems, devices, and methods |
| US8950604B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
| WO2011008972A1 (en) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems for bioagent identification |
| WO2011014811A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests |
| EP3098325A1 (en) | 2009-08-06 | 2016-11-30 | Ibis Biosciences, Inc. | Non-mass determined base compositions for nucleic acid detection |
| ES2628739T3 (en) | 2009-10-15 | 2017-08-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
| US20130157265A1 (en) * | 2009-10-22 | 2013-06-20 | Jesus Mingorance Cruz | Composition, method and kit for detecting bacteria by means of sequencing |
| US9758840B2 (en) | 2010-03-14 | 2017-09-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Parasite detection via endosymbiont detection |
| JP5399312B2 (en) * | 2010-04-26 | 2014-01-29 | 日東電工株式会社 | Adhesive sheet |
| EP3280821B1 (en) | 2015-04-07 | 2023-12-06 | Polyskope Labs | Detection of one or more pathogens |
| KR20210151827A (en) * | 2019-03-15 | 2021-12-14 | 폴리스코프 랩스 | Selective enriched broth for detection of one or more pathogens |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990001560A1 (en) * | 1988-07-29 | 1990-02-22 | David John Evans | Bacterial dna probe |
| WO1990015157A1 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-13 | Gene-Trak Systems | Universal eubacteria nucleic acid probes and methods |
| EP0479117A1 (en) * | 1990-10-05 | 1992-04-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods and reagents for identifying bacteria |
| WO1993005179A1 (en) * | 1991-08-29 | 1993-03-18 | THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES:National Institutes of Health | A method for discriminating and identifying alleles in complex loci |
-
1993
- 1993-11-11 NL NL9301957A patent/NL9301957A/en not_active Application Discontinuation
-
1994
- 1994-11-11 WO PCT/NL1994/000283 patent/WO1995013396A2/en active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990001560A1 (en) * | 1988-07-29 | 1990-02-22 | David John Evans | Bacterial dna probe |
| WO1990015157A1 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-13 | Gene-Trak Systems | Universal eubacteria nucleic acid probes and methods |
| EP0479117A1 (en) * | 1990-10-05 | 1992-04-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods and reagents for identifying bacteria |
| WO1993005179A1 (en) * | 1991-08-29 | 1993-03-18 | THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES:National Institutes of Health | A method for discriminating and identifying alleles in complex loci |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| G. SARKAR ET AL.: "Screening for mutations by RNA single-strand conformation polymorphism (rSSCP): comparison with DNA-SSCP", NUCL. ACIDS RES., vol. 20, no. 4, 25 February 1992 (1992-02-25), IRL PRESS, OXFORD, ENGLAND;, pages 871 - 878 * |
| K. CHEN ET AL.: "Broad range DNA probes for detecting and amplifying eubacterial nucleic acids", FEMS MICROBIOLGY LETTERS, vol. 57, no. 1, January 1989 (1989-01-01), ELSEVIER, AMSTERDAM, NL;, pages 19 - 24 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1995013396A3 (en) | 1995-06-08 |
| WO1995013396A2 (en) | 1995-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL9301957A (en) | Method for identifying microorganisms, and useful tools. | |
| US6699670B2 (en) | Quantitative assay for the simultaneous detection and speciation of bacterial infections | |
| Wolcott | Advances in nucleic acid-based detection methods | |
| US5298392A (en) | Process for detection of water-borne microbial pathogens and indicators of human fecal contamination in water samples and kits therefor | |
| JP4481491B2 (en) | Nucleic acid detection method | |
| JP3070529B2 (en) | Species-specific detection of Mycobacterium kansasii | |
| US10550438B2 (en) | Methods and compositions for detecting bacterial nucleic acid | |
| EP0630971A2 (en) | Method, reagents and kits for detection of neisseria gonorrhoea | |
| JP2011510630A (en) | Use of a nucleic acid probe to detect a nucleotide sequence of interest present in a sample | |
| Tomioka et al. | A multiplex polymerase chain reaction microarray assay to detect bioterror pathogens in blood | |
| US20240117447A1 (en) | Polynucleotides for the amplification and detection of neisseria gonorrhoeae | |
| JPH08510386A (en) | Identification of Salmonella by polymerase chain reaction | |
| US7879581B2 (en) | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species | |
| AU8955998A (en) | Assay for Chlamydia trachomatis by amplification and detection of Chlamydia trachomatis nucleic acid | |
| Gill et al. | Enzyme-linked immunosorbent assay of nucleic acid sequence-based amplification for molecular detection of M. tuberculosis | |
| Feng et al. | A universal random DNA amplification and labeling strategy for microarray to detect multiple pathogens of aquatic animals | |
| WO2005083114A1 (en) | Method, kit and system for enhanced nested pcr | |
| AU781192B2 (en) | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species | |
| US9593384B2 (en) | Metronidazole resistance in trichomonas vaginalis and single nucleotide polymorphisms | |
| Knight | Molecular genetic methods for detection and identification of viable but nonculturable microorganisms | |
| EP1252331B1 (en) | Methods and compositions for detection of mycobacterium avium complex species | |
| JPH05184399A (en) | Method for detecting giardia containing giardin gene | |
| JP2552787B2 (en) | Specific detection method for Mycobacterium tuberculosis | |
| US20220396828A1 (en) | Method of determining the presence of a hyper-virulent clostridioides difficile strain of the b1/nap1/027 group in a sample | |
| CN116606947A (en) | Primer probe for detecting pseudomonas aeruginosa and detection kit thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |