NL9001083A

NL9001083A - Beta-cel antigeen.

Info

Publication number: NL9001083A
Application number: NL9001083A
Authority: NL
Original assignee: Rijksuniversiteit
Priority date: 1990-05-04
Filing date: 1990-05-04
Publication date: 1991-12-02
Also published as: CA2082162A1; JPH05508395A; US20090226930A1; WO1991017186A1; ATE144529T1; AU652157B2; DE69122864T2; AU7863291A; EP0528886B1; DE69122864D1; DK0528886T3; EP0528886A1

Description

Titel: Beta-cel antigeen

De uitvinding heeft betrekking op een antigeen van beta-cellen, welk antigeen een epitoop omvat die specifiek herkend wordt door T-cellen die betrokken zijn bij het ziekte-proces van type-1 diabetes mellitus.

Type-1 (insuline afhankelijke) diabetes mellitus is een ziekte met een prevalentie van ca. 0,2% in Noord-West Europa. De incidentie is de afgelopen 20 jaar verdubbeld. De ziekte openbaart zich over het algemeen vóór het negentiende levensjaar. De levensverwachting ligt ongeveer 10 jaar beneden die van de gezonde populatie. Het is een belangrijk gezondheidsprobleem in de westerse bevolking, mede ook gezien het feit dat de ziekte gepaard gaat met een groot aantal complicaties zoals blindheid, hart- en vaatziekten, nierinsufficiëntie en neuritis. Type-1 diabetes wordt veroorzaakt door het irreversibel verlies van de insuline-producerende cellen (beta-cellen) in de pancreatische eilandjes van Langerhans ten gevolge van een ontstekingsproces, waarvan de oorzaak onbekend is. Als gevolg van dit verlies van de beta-cellen is de patiënt voor de rest van het leven afhankelijk van exogene (van buiten toegediende) insuline. Pancreastransplantatie lijkt weinig zin te hebben zolang het proces, dat leidt tot de vernietiging van beta-cellen, niet is gedefiniëerd en niet gestopt kan worden.

De destructie van de beta-cellen is waarschijnlijk het gevolg van een autoimmuunproces. Hierop wijst onder andere de infiltratie van de eilandjes van Langerhans door mononucléaire cellen waaronder veel T-lymphocyten (insulitis) op het tijdstip van diagnose. Een andere aanwijzing voor een relatie tussen het immuunsysteem en type-1 diabetes is de associatie van bepaalde genetische markers van het HLA (human leucocyte-associated antigens) systeem, de benaming voor het humane MHC (major histocompatibility complex), dat een centrale rol speelt in het reguleren van de immuunrespons. Met name HLA-DR3 en/of -DR4 positieve individuen hebben een verhoogd relatief risico op het ontwikkelen van de ziekte, terwijl bepaalde HLA-DQ allelen geassociëerd lijken te zijn met resistentie.

Eenzelfde, door het MHC gecodeerde protectie wordt ook aangetroffen in het muismodel voor type-1 diabetes, de NOD muis. Deze muizestam is normaliter I-E negatief (I-E is het equivalent bij de muis van HLA-DQ bij de mens) en ontwikkelt spontaan diabetes in een deel van de populatie.

Eilandcel autoantistoffen (ICA's) werden reeds 15 jaar geleden voor het eerst aangetroffen in serum van type-1 diabetes patiënten. Later is aangetoond dat deze ICA's vaak jaren voorafgaande aan de klinische manifestatie van de ziekte in het serum kunnen worden gedetecteerd. De eilandcel-determinant, waartegen deze antistoffen zijn gericht, is echter nog steeds niet geïdentificeerd. Als enige struktuur is een niet nader gedefiniëerd 64 kD eiwit geprecipiteerd met behulp van serum van (pre)diabetes patiënten. ICA's lijken ziekte (type-1 diabetes) en targetcel (beta-cel) specifiek, waardoor deze antistoffen een voorspellende waarde hebben met betrekking tot de ontwikkeling van type-1 diabetes. Dit schept de mogelijkheid om personen te identificeren voordat de ziekte zich klinisch manifesteert, zodat immunothérapie in dat geval tot preventie van totale beta-cel destructie en dus van diabetes kan leiden.

Het is echter onwaarschijnlijk dat ICA's een rol spelen in de pathogenese van type-1 diabetes. Uit studies met proefdiermodellen van deze ziekte (NOD-muizen, BB-ratten) is gebleken dat T-lymphocyten (zowel van T-helper type CD4+ als van cytotoxische T-cel type CD8+) de ziekte kunnen overbrengen naar gezonde ontvangers. De CD4+ T-cellen die verantwoordelijk zijn voor deze transfer werden gekloneerd en bleken specifiek voor eilandcel-antigenen. De histologie van pancreata van muizen, die met de pathogène T-cel klonen waren geïnjecteerd, vertoonde de karakteristieke insulitis, voorafgaande aan het ontwikkelen van diabetes. De expressie van I-E is geassociëerd met deletie tijdens de ontogenie van T-cellen die gebruik maken van een bepaalde T-cel receptor voor de herkenning van antigeen. Uit I-E negatieve NOD muizen, die recentelijk diabetes hadden ontwikkeld, werden CD4+ en CD8+ T-cellen gekloneerd die zowel eilandcel-specifiek als pathogeen waren in zowel I-E positieve als I-E negatieve muizen. Alle klonen hadden de specifieke T-cel receptor waarvan bekend was dat hij in muizen, die I-E tot expressie brengen, gedeleteerd is. Dit zou het beschermende effect van I-E kunnen verklaren. Uit de observatie, dat alle eilandcel-specifieke diabetes-inducerende T-cel klonen gebruik maken van dezelfde T-cel receptor, volgt dat het wellicht mogelijk is om specifiek in deze autoimmuun-respons in te grijpen.

De beste aanwijzingen voor een rol voor T-cellen in de pathogenese van type-1 diabetes in de mens komen uit studies van pancreastransplantaties tussen identieke tweelingen en HLA-identieke broers of zussen, waarvan een van de twee een type-1 diabetes patiënt was. Wanneer een pancreastransplantaat van de gezonde donor getransplanteerd werd in de patiënt vond geen afstoting van het transplantaat plaats, maar waren de getransplanteerde eilandjes toch niet in staat om de patiënt van exogeen insuline onafhankelijk te maken. Histologie van het transplantaat vertoonde wederom de voor diabetes kenmerkende insulitis, waarschijnlijk het gevolg van een opvlamming van de "auto"immuun respons tegen beta-cel determinanten. Deze insulitis ging niet samen met een verhoging van de ICA-titers, hetgeen tegen ICA als effector mechanisme in type-1 diabetes pleit. Indien deze voor beta-cel destructie verantwoordelijke autoreactieve T-cellen alsmede de strukturen waartegen deze T-cellen gericht zijn zouden worden gekarakteriseerd, zouden strategieën voor immunothérapie en preventie ontwikkeld kunnen worden.

Door de uitvinders zijn nu T-cellen geïsoleerd uit het bloed van een recent gediagnostiseerde type-1 diabetes patiënt die reactief zijn tegen een beta-tumorcellijn-membraan preparaat van de rat. Deze T-cel klonen reageren ook tegen eiland-preparaten van de hond en een suspensie van humane foetale pancreas—cellen, waardoor gesuggereerd wordt dat het antigeen geconserveerd is in de evolutie en niet rat- of tumor-specifiek is. Met deze T-cel klonen is vervolgens op subcellulair niveau gezocht naar een determinant van de beta-cel die herkend wordt door de T-cel klonen. Met behulp van een discontinue dichtheidsgradiënt werden diverse fracties gegenereerd die met behulp van bepaalde marker eiwitten werden gekarakteriseerd. Op deze wijze werden een viertal fracties gedefinieerd: pellet (lysosomen, endoplasmatisch reticulum, mitochondria), plasmamembraan, insuline secreterende granula en cytosol. Deze fracties werden als antigeen aangeboden aan het panel van T-cel klonen. Twee van de klonen bleken een determinant te herkennen in de insuline secreterende granula (ISG). De reactiviteit van deze twee klonen (1C6 en 1C10) met de overige fracties kon toegeschreven worden aan contaminatie van deze fracties met ISG. De granula werden vervolgens onderworpen aan een verdere fractionering in granulummembraan en granulummatrix. De T-cel reactiviteit was gericht tegen de granulummembraan fractie en bleef intact na een reeks extracties die erop gericht waren om extrinsieke eiwitten te verwijderen. Dit duidt erop dat het antigeen een intrinsiek granulummembraan eiwit is. Vervolgens is het moleculair gewicht van het antigeen dat herkend wordt door kloon 1C6 vastgesteld met behulp van scheiding van eiwit op basis van molecuulgewicht door middel van SDS/polyacrylamide gelelektro-forese en elektroelutie van eiwitten uit de aldus gegenereerde gelfracties. Het antigeen bleek een molecuulgewicht van circa 38 kD te hebben. Als granulummembraan eiwit zal dit 38 kD eiwit tijdens insuline release door middel van exocytose tijdelijk op het plasmamembraan geëxposeerd worden en dan beschikbaar zijn voor componenten van het immuunsysteem. Het is derhalve aannemelijk dat expressie van genoemde target strukturen correleert met de functionele activiteit van beta— cellen, d.w.z. insuline produktie en secretie. Dit zou de reeds beschreven relatie tussen beta—cel activiteit en het ontstaan van type-1 diabetes kunnen verklaren.

Er is nog niet eerder een antigeen geïdentificeerd dat herkend wordt door T-cellen, geïsoleerd uit een type-1 diabetes patiënt. Het is aannemelijk dat deze T-cellen (CD4+ T-cellen) de potentie hebben om als effector mechanisme tot beta-cel destructie te leiden. Dit wordt ondersteund door de resultaten uit proefdiermodellen voor zowel diabetes mellitus als een reeks andere autoimmuun ziekten zoals rheumatoïde arthritis en multiple sclerosis. De identificatie van auto-reactieve T-cellen en autoantigenen in dergelijke modellen hebben onlangs geresulteerd in de ontwikkeling van strategieën voor therapie of preventie van de autoimmuunstoornis.

De identificatie van het 38 kD beta-cel antigeen creëert de mogelijkheid om diabetes-gerelateerde T-cel responsen te karakteriseren. Op basis van de struktuur op het antigeen die door de T-cellen herkend wordt (de antigene determinant of epitoop) en de strukturen op de T-cel receptoren van de klonen die bij deze herkenning betrokken zijn kunnen strategieën voor bijvoorbeeld diagnostiek, tolerantie inductie en specifieke immunothérapie van type-1 diabetes ontwikkeld worden. Onder de aanname dat, in analogie met de hierboven genoemde proefdiermodellen, een uniforme set van T-lymphocyten bij het ziekteproces betrokken is, kan men zelfs met behulp van antistoffen tegen de T-cel receptoren van deze T-cellen of door middel van vaccinatie met de T-cellen of met synthetische peptiden van deze T-cel receptoren in de autoimmuunrespons ingrijpen. Deze mogelijkheid tot interventie in het ziekteproces bestaat overigens alleen bij een tijdige detectie van de autoimmuun respons. De identificatie volgens de uitvinding van het 38 kD autoantigeen op de insuline producerende beta-cellen heeft daarom implicaties voor toepassingen op zowel het gebied van diagnostiek als op therapeutisch vlak. Het 38 kD antigeen zou bijvoorbeeld zelf gebruikt kunnen worden om de autoimmuun respons tegen deze beta-cel struktuur te detecteren, zelfs reeds voordat de ziekte zich openbaart. Hiervoor zou men een ELISA techniek kunnen toepassen, waarbij met behulp van het 38 kD eiwit sera van kinderen, die eventueel geselecteerd zijn op basis van gevoeligheid voor het ontwikkelen van de ziekte, gescreend worden op reactieve autoantistoffen. Dit zou een aanmerkelijke verbetering betekenen ten opzichte van de huidige techniek, waarbij gebruik wordt gemaakt van uiterst dunne cryocoupes van een optimaal geconserveerde pancreas als substraat voor autoantistoffen. De beschikbaarheid van een dergelijke geschikte pancreas vormt momenteel een van knelpunten in diabetes onderzoek en diagnostiek. De incubatie omstandigheden van de huidige diagnostische sérologie zijn bovendien dermate gevoelig en tijdrovend, dat een simpele ELISA aanzienlijke praktische voordelen heeft. Standaardisatie van het protocol geeft de mogelijkheid om onderling uitslagen uit te wisselen zonder dat de huidige verschillen in resultaat tussen de diverse laboratoria in de wereld optreden.

Aldus kan volgens de uitvinding met behulp van het 38 kD beta-cel antigeen door de identificatie van een autoreactieve T-cel respons een betere en vroegere indicatie van beta-cel destructie worden verkregen, bijvoorbeeld in kinderen die een verhoogd risico hebben of reeds een voorstadium van diabetes vóór klinisch manifest worden van de ziekte hebben bereikt.

Een geschikt alternatief voor een diagnostische techniek met het 38 kD antigeen zelf is een diagnostische techniek, welke gebruik maakt van antilichamen die specifiek de beta-cel reactieve T—cellen herkennen. Hiervoor zullen dan met name monoklonale antilichamen tegen de autoreactieve T-cel receptor geschikt zijn.

Bovendien kan, gebruikmakend van unieke specifieke sequenties van de T-cel receptoren op beta-cel reactieve T-cellen, een protocol worden opgesteld om dergelijke cellen op I te sporen en vervolgens te inactiveren of elimineren. Hiervoor zou vooral een behandeling met monoklonale antilichamen tegen de autoreactieve T—cel receptor geschikt zijn. Een geschikt alternatief bestaat uit een vaccinatie behandeling of een behandeling voor het induceren van tolerantie met behulp van > synthetische peptiden, die van de specifieke T-cel receptor zijn afgeleid.

Een andere mogelijkheid is de generatie met behulp van het 38 kD eiwit van specifieke T-cellijnen die na een in vitro behandeling teruggespoten kunnen worden in de patiënt volgens een T-cel vaccinatie protocol, zoals dat van Cohen et al. In modellen van autoimmuunziekten heeft een dergelijke benadering reeds geleid tot preventie van de ziekte of zelfs genezing van het proefdier.

De uitvinding verschaft derhalve een beta-cel antigeen, bestaande uit een intrinsiek transmembraan eiwit van insuline secreterende granula van in pancreatische eilandjes van Langerhans gelegen beta-cellen, welk eiwit een epitoop bevat die herkend wordt door de T-cel kloon 1C6.

Deze (humane) T-cel kloon 1C6 is op 3 mei 1990 gedeponeerd bij de European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) onder nummer 1C6 90050301.

Zoals hierboven reeds is opgemerkt, heeft het beta-cel antigeen volgens de uitvinding een molecuulgewicht van circa 38 kD.

De uitvinding verschaft verder een peptide, dat de door de T-cel kloon 1C6 herkende epitoop van het beta-cel antigeen volgens de uitvinding nabootst en door de T-cel kloon 1C6 kan worden herkend. Zo'n peptide kan in de plaats van het antigeen zelf worden gebruikt in werkwijzen voor het detecteren van reactieve T-cellen en in werkwijzen voor het genereren van reactieve T-cellijnen.

Ook strekt de uitvinding zich uit over een T-cel, die in staat is om het beta-cel antigeen volgens de uitvinding te herkennen, alsmede over een T-cel receptor (TCR) van een dergelijke T-cel, welke TCR in staat is om het beta-cel antigeen volgens de uitvinding te herkennen. Ook strekt de uitvinding zich uit over een peptide dat zo'n TCR, die de door de T-cel kloon 1C6 herkende epitoop van het beta-cel antigeen volgens de uitvinding kan herkennen, nabootst en de door de T-cel kloon 1C6 herkende epitoop van het beta-cel antigeen volgens de uitvinding kan herkennen. Meer in het bijzonder wordt hiermee gedoeld op een specifiek en immunogeen peptide van zo'n TCR, dat in plaats van de T-cel (T-cel vaccinatie) gebruikt kan worden voor vaccinatiedoeleinden.

Voorts wordt de uitvinding belichaamd in een antilichaam met specificiteit voor een T—cel, die in staat is om het beta— cel antigeen volgens de uitvinding te herkennen, alsmede in een antilichaam met specificiteit voor het beta-cel antigeen volgens de uitvinding.

Tenslotte omvat de uitvinding ook het gebruik van een van de bovengenoemde materialen volgens de uitvinding voor type-1 diabetes mellitus diagnostiek en/of monitoring, alsmede het gebruik van een van de bovenstaand genoemde materialen volgens de uitvinding voor type-1 diabetes mellitus therapie en/of preventie.

De uitvinding zal nu aan de hand van een voorbeeld nader worden toegelicht.

Voorbeeld

Door transplanteerbaar insulinoma weefsel van ratten te homogeniseren en aan een discontinue Nycodenz dichtheids-gradiënt centrifugering te onderwerpen werden vier fracties bereid, die volgens een analyse met behulp van marker eiwitten (zie tabel A) resp. gevormd werden door cytosolbestanddelen, plasmamembraan, insuline secreterende granules (ISG) en een uit een mengsel van lysosomen, mitochondria en endoplasmatisch reticulum bestaand pellet. Elke fractie werd getest op zijn vermogen om de proliferatie van een panel van T-cel klonen, geïsoleerd uit het periferaal bloed van een recent gediagnos-tiseerde type-1 diabetes patiënt, te stimuleren. Deze CD4 tot expressie brengende, HLA-DR1 gerestricteerde T-cel klonen werden gegenereerd met behulp van een ruw membraan preparaat van de ratte insulinoma cellijn RINm5F als antigeen. Bij twee kloons (1C6 en 1C10) werd een sterke proliferatie van de cellen als respons op de aan insuline secreterende granules verrijkte fractie waargenomen (zie tabel A). Enige reactiviteit werd gevonden met de eiwitten in het pellet, maar de omvang van de celproliferatie was in overeenstemming met de verontreiniging door insuline secreterende granules.

De fractie van de insuline secreterende granules werd onderworpen aan Percoll dichtheidsgradient centrifugering, hetgeen resulteerde in een tweevoudige verhoging van de specifieke activiteit van de granule marker en een twee- tot vijfvoudige verlaging van de specifieke activiteiten van de andere marker eiwitten. De celproliferatie van de kloons 1C6 en 1C10 in respons op deze gezuiverde granules werd niet geringer, hetgeen erop wijst dat de T—cel responsen niet te wijten waren aan een verontreiniging van de granule fractie door een ondergeschikt celbestanddeel.

Het ISG preparaat werd verder gesubfractioneerd in granule matrix en membraan componenten. De respons van de kloons 1C6 en 1C10 was beperkt tot de membraan fractie en bleef behouden na een reeks extractiestappen, uitgevoerd om extrinsieke membraaneiwitten te verwijderen (zie tabel B).

Met behulp van SDS/polyacrylamide-gelelektroforese van het granule membraan, gevolgd door T-cel proliferatietests met door middel van elektroelutie op moleculairgewicht gescheiden eiwitten werd het molecuulgewicht van het door de kloon 1C6 herkende antigeen bepaald. De respons van deze T-cel kloon was gericht tegen fracties met een gemiddeld molecuulgewicht van 38 kD onder niet-reducerende omstandigheden. Een reductie van disulfide-bruggen in het monster voorafgaande aan de elektroforese had geen invloed op de schijnbare grootte van het antigeen.

De cellulaire verdeling van het door kloon 1C6 herkende antigeen is in tabel C weergegeven. Sterk positieve reacties werden, behalve bij insuline-producerend weefsel, ook waargenomen bij hypofyse, bijnier en een neuroblastoma cellijn. Deze weefsels zijn samen met de pancreatische eilandjes leden van het diffuse neuroendocrine systeem en hebben een aantal morfologische en moleculaire kenmerken gemeenschappelijk. Een gemeenschappelijke eigenschap van de reactieve weefsels is hun opslag van bioactieve polypeptiden in intracellulaire opslag-vesicles en secretie door een exocytose mechanisme. Ze verschillen hierin van de meeste niet-reactieve weefsels in de geteste reeks. Omdat weefsel van de exocrine pancreas geen celproliferatie veroorzaakt is het echter niet waarschijnlijk dat het antigeen een functionele component van de exocytose machinerie is.

A: alkalisch fosfatase B: aryl sulfatase C: cytochroom oxidase D: NADPH cytochroom C E: carboxypeptidase H

Toelichting bi~i tabel A

Zoals uit tabel A blijkt, vertoonden de T-cel kloons 1C6 en 1C10 een sterke proliferatie als reactie op subcellulaire fracties van insulinoma die verrijkt waren voor de marker van de secretoire granules, carboxypeptidase H. De responsen op fracties verrijkt aan cytosol eiwitten en plasma membraan bestanddelen (marker: alkalisch fosfatase) waren aanmerkelijk kleiner. De T-cel reactiviteit op de pelletfractie bevattende endoplasmatisch reticulum (NADPH cytochroom C reductase), lysosomen (aryl sulfatase) en mitochondria (cytochroom oxidase) kon aan een verontreiniging van deze fractie door secretoire granule componenten worden toegeschreven.

Subcellulaire fractionering

Alle stappen werden uitgevoerd bij 4°C, tenzij anders is aangegeven. Transplanteerbaar ratte insulinoma weefsel (3-5 g) werd gehomogeniseerd in 20 ml 270 mM sucrose, 10 mM MES-KOH, 1 mM EGT A , 1 mM MgSC>4 oplossing, pH 6.5, en gedurende 6 min bij 1770 X g gecentrifugeerd om celresten en kernen te verwijderen. De supernatant (20 ml) werd geplaatst op een driestaps (5 ml/stap) dichtheidsgradiënt, samengesteld door mengen van 19.2% (w/v) Nycodenz, 170 mM sucrose, 10 mM MES-KOH oplossing met de homogenisatie media in verhoudingen van 1:3, 1:1 en 1:0. De gradiënt werd gedurende 60 min bij 100000 x g gecentrifugeerd in een Beekman SW28 rotor en het materiaal verzameld van de supernatant (cytosol), het 0/4.8% Nycodenz grensvlak (de lichte membranen), het 9.6/19.2% grensvlak (de insuline secreterende granules) en de pellet. De deeltjes-fracties werden twee keer gewassen, door resuspenderen in homogenisatie media en centrifugeren gedurende 25 min met 100000 x g, en bij -70°C bewaard als 1-2 mg eiwit/ml in 270 mM MES pH 6.5.

T-cel proliferatie

In microtiterplaten met 96 putjes met vlakke bodem werden gedurende 3 dagen in drievoud 104 T-cellen en 5 x 104 bestraalde HLA-DR1,1 mononucléaire cellen als antigeen presenterende cellen gekweekt in aanwezigheid van 5 μg/ml antigeen. Na toevoeging van 3H-thymidine en een incubatie van 16 uur werden de cellen geoogst op een filter van glasvezel. Het aantal cpm 3H-thymidine incorporatie werd gemeten door vloeistof-scintillatretelling; in de tabel is naast de gemeten cpm ook de standaard deviatie aangegeven. Eiwitbepalingen werden uitgevoerd met Pierce BCA reagens nadat de membraan monsters eerst oplosbaar waren gemaakt door 5 min verwarmen op 60°C in 20 μΐ 0.2% natrium dodecylsulfaat in 10 mM Tris Cl pH 8. De in de tabel vermelde resultaten, afkomstig van één experiment, zijn representatief voor de in drie verschillende proeven verkregen gegevens.

Toelichting bin tabel.-S

Insuline secreterende granules (1-2 mg eiwit), verkregen zoals bij tabel A beschreven, werden opvolgend geëxtraheerd door sonicatie (20 s, MSE sonificator) in 5 ml van de volgende ijskoude oplossingen: 10 mM NH4HCO3 (laag zout), 10 mM NH4HCO3 dat 2 mM EDTA en 1 M NaCl bevatte (hoog zout) of 0.5 M Na2CC>3 (alkalisch). Na elke extractie werd het materiaal gedurende 30 min met 240000 x g gecentrifugeerd, en de pellet werd gewassen door resuspenderen in 5 ml 10 mM NH4HCO3 en centrifugeren zoals eerder. Monsters werden bij elke stap geresuspendeerd in 50 μΐ 10 mM NH4HCO3 en geanalyseerd op eiwit en antigeen activiteit als in tabel A. De in de tabel vermelde resultaten, afkomstig van één experiment, zijn representatief voor de in drie verschillende proeven verkregen gegevens.

Toelichting bin tabel C

Vast weefsel werd eerst verpulverd in vloeibare stikstof, daarna gesoniceerd in ijskoud 10 mM Tris Cl pH 7.4. Celresten werden verwijderd door centrifugeren gedurende 10 min met 1700 X g en een membraanfractie werd bereid door centrifugeren gedurende 60 min met 100000 x g. Deze membranen werden gere-suspendeerd in CM (5 μg/ml) en getest voor antigeniciteit in een T-cel proliferatieproef zoals hierboven beschreven. Een negatieve respons (beoordeeld als radioactiviteit opname minder dan drie keer die, gevonden bij T-cellen en antigeen presenterende cellen in afwezigheid van antigeen) werd verkregen met fibroblasten, maagbodem, thyroid, lever, long, hartspier, skeletspier en een humane exocrine pancreas tumor.

Bepaling van de molecuulgrootte van het antigeen

Granule membranen werden, zoals bij tabel B is vermeld, uit insuline secreterende granules bereid door lysis in 10 mM NH4HCO3 dat 1 M KC1 bevatte. De gewassen membraan pellet (200 μg eiwit) werd gereconstitueerd in 50 μΐ 125 mM Tris Cl dat 0.2% natrium dodecylsulfaat (SDS) en 0.001% broomfenolblauw bevatte, 10 min op 60°C verwarmd en op een polyacrylamidegel gebracht. Na elektroforese werd de gel in plakken gesneden en werd elke plak aan elektroelutie onderworpen gedurende 60 min bij 120V in 75 μΐ 50 mM Tris, 50 mM glycine, 1 M NaCl, 0.1% SDS onder toepassing van een LKB Extraphor apparaat (Pharmacia, Zweden). De door de elektroelutie geïsoleerde eiwitten werden geprecipiteerd met 3 volumehoeveelheden aceton en overnacht bij -70°C bewaard voordat gedurende 5 min met 11000 x g gecentrifugeerd werd. Elke pellet werd twee keer in aceton gewassen, aan de lucht gedroogd en geresuspendeerd door sonicatie in 100 μΐ 10 mM NH4HCO3. De eiwit concentraties werden bepaald op de bij tabel A vermelde wijze en de monsters werden tot 1 en 5 μg/ml in kweekmedia verdund voor de T-cel proliferatietest. De totale opbrengst van de door elektroelutie geïsoleerde eiwitten was 70% en elke geëlueerde fractie bevatte 5-20 μg eiwit. De zuiveringsgraad van het antigeen was in dit stadium 5000-voudig betrokken op het oorspronkelijke insulinoma eiwit.

Claims

1. Beta-cel antigeen, bestaande uit een intrinsiek transmembraan eiwit van insuline secreterende granula van in pancreatische eilandjes van Langerhans gelegen beta-cellen, welk eiwit een epitoop bevat die herkend wordt door de T-cel kloon 1C6.

2. Peptide, dat de door de T-cel kloon 1C6 herkende epitoop van het beta-cel antigeen volgens conclusie 1 nabootst en door de T-cel kloon 1C6 kan worden herkend.

3. T-cel, die in staat is om het beta-cel antigeen volgens conclusie 1 te herkennen.

4. T-cel receptor van een T-cel, die in staat is om het beta-cel antigeen volgens conclusie 1 te herkennen.

5. Peptide dat een T-cel receptor, die de door de T-cel kloon 1C6 herkende epitoop van het beta-cel antigeen volgens conclusie 1 kan herkennen, nabootst en de door de T-cel kloon 1C6 herkende epitoop van het beta-cel antigeen volgens conclusie 1 kan herkennen.

6. Antilichaam met specificiteit voor een T-cel, die in staat is om het beta-cel antigeen volgens conclusie 1 te herkennen.

7. Antilichaam met specificiteit voor het beta-cel antigeen volgens conclusie 1.

8. Gebruik van een materiaal volgens een van de conclusies 1-7 voor type-1 diabetes mellitus diagnostiek en/of monitoring.

9. Gebruik van een materiaal volgens een van de conclusies 1-7 voor type-1 diabetes mellitus therapie en/of preventie.