NL8900670A - POLYNUCLEOTIDE PROBE, METHOD AND KIT FOR IDENTIFYING AND DETECTING GRAM-NEGATIVE BACTERIA. - Google Patents

Description

Polynucleotide-probe, werkwijze en kit voor het identificeren en opsporen van Gram-negatieve bacteriën.Polynucleotide probe, method and kit for identifying and detecting Gram negative bacteria.

De uitvinding heeft betrekking op een polynucleotide-probe die specifiek een geslacht of soort van Gram-negatieve bacteriën herkent.The invention relates to a polynucleotide probe that specifically recognizes a genus or species of Gram negative bacteria.

Een snelle opsporing van micro-organismen is in allerlei sectoren van groot belang. In de voedingsmiddelensector is een snelle detectie van grote economische betekenis omdat het daarmee mogelijk wordt een uitspraak te doen over de microbiologische kwaliteit van grondstoffen, tussen- en eindprodukten. Daarmee wordt bevorderd dat produkten sneller voor consumptie worden vrijgegeven en worden dure en kwaliteits-verlagende opslag- en wachtprocedures vermeden. Ter illustratie van de behoefte aan versnelling van microbiologische bepalingen kan dienen dat het aantonen van bijvoorbeeld een Salmonella-soort in levensmiddelen met de gangbare microbiologische methoden tenminste 5 dagen in beslag neemt.Rapid detection of micro-organisms is of great importance in many sectors. In the food sector, rapid detection is of great economic importance because it makes it possible to make a statement about the microbiological quality of raw materials, intermediate and end products. This promotes faster release of products for consumption and avoids expensive and quality-reducing storage and waiting procedures. It may serve to illustrate the need to accelerate microbiological determinations that it can take at least 5 days to detect, for example, a Salmonella species in food with the usual microbiological methods.

Vele bacterie-geslachten die in de levensmiddelenmicrobiologie een belangrijke rol spelen behoren tot de familie der Enterobacteriaceae. Zo zijn de geslachten Salmonella, Shigella en Yersinia pathogeen en in hoge mate betrokken bij geregistreerde voedselinfecties, Het specifiek aantonen van pathogene Enterobacteriaceae is in veel gevallen niet alleen een tijdrovende zaak maar bovenal moeilijk, vooral wanneer deze bacteriën tot de minderheids flora behoren en dat is meestal het geval. In de voe-dingsmiddelenmicrobiologie wordt dit probleem veelal omzeild door gebruikmaking van indicator-organismen om de microbiologische kwaliteit te bepalen dan wel preventieve controles uit te voeren. Zo wordt de aanwezigheid van Enterobacteriaceae, zonder specificatie, in een voedingsmiddel als een indicatie gebruikt voor de hygiënische toestand in voedingsmiddelenbedrijven. Dergelijke bepalingen worden zowel door overheidsinstanties. controlerende organen als door bedrijfslaboratoria regelmatig uitgevoerd. Ofschoon het gebruik van indicator-organismen, zoals hierboven genoemd, zijn waarde heeft bewezen, is het toch vaak noodzakelijk om een identificatie voor diverse species uit te voeren.Many bacterial genera that play an important role in food microbiology belong to the Enterobacteriaceae family. For example, the genera Salmonella, Shigella and Yersinia are pathogenic and highly involved in registered foodborne infections. Specific identification of pathogenic Enterobacteriaceae is in many cases not only a time consuming task but above all difficult, especially when these bacteria belong to the minority flora and that is usually the case. In food microbiology, this problem is often circumvented by using indicator organisms to determine the microbiological quality or to carry out preventive checks. For example, the presence of Enterobacteriaceae, without specification, in a food is used as an indication of the hygienic condition in food companies. Such provisions are made by both government agencies. control bodies as regularly performed by company laboratories. Although the use of indicator organisms, as mentioned above, has proven its worth, it is often necessary to carry out identification for various species.

Ook in de geneeskunde en de gezondheidszorg is een snelle bepaling van micro-organismen van groot belang bijvoorbeeld voor het lokaliseren en bestrijden van infecties. Verder is ook bij het milieubeheer behoefte aan snelle en doeltreffende bepalingsmethoden voor de aanwezigheid van bacteriën.Rapid determination of micro-organisms is also very important in medicine and health care, for example for the localization and control of infections. In addition, environmental management also requires rapid and effective methods for determining the presence of bacteria.

Voor het opsporen van bacteriën is het tot nu toe meestal nodig uit het te onderzoeken monster een reincultuur te bereiden, waarna op grond van de verschijningsvorm en andere onderzochte eigenschappen van de bacterie tot een bepaalde soort of een bepaalde groep wordt besloten. Zo wordt volgens het veel gebruikte z.g. API-systeem het micro-organisme onderworpen aan een grote reeks proeven waarin telkens het al of niet optreden van een bepaalde enzymactiviteit wordt bepaald. De gevonden combinatie van activiteiten geeft een aanwijzing voor de bacteriesoort of voor het bacteriegeslacht in kwestie. Dergelijke werkwijzen zijn be werkelijk en bovenal niet definitief: er wordt slechts met een bepaalde waarschijnlijkheid (van minder dan 100%) een bacterie of groep bacteriën aangetoond.To detect bacteria, it has hitherto usually been necessary to prepare a pure culture from the sample to be examined, after which a specific species or group is decided on the basis of the appearance and other properties of the bacteria examined. For example, according to the commonly used API system, the micro-organism is subjected to a large series of tests in which the presence or absence of a certain enzyme activity is determined. The combination of activities found gives an indication for the bacterial species or for the bacterial genus in question. Such methods are real and above all not definitive: a bacterium or group of bacteria is only detected with a certain probability (less than 100%).

Langs verschillende wegen wordt gewerkt aan snellere diagnostische methoden voor het aantonen van bacteriën. De DNA-DNA-hybridisatie wordt als een veelbelovende techniek beschouwd (zie Klausner en Wilson, Bio/-Technology _1, 471-478, 1983). In principe zoekt men daarbij met een DNA-fragment dat specifiek is voor een bacteriesoort of een groep bacteriën als "probe" naar structureel verwant DNA in bacteriën die men wil identificeren. Het grote voordeel van zo'n detectietechniek is dat wordt getoetst op genotype in plaats van zoals gebruikelijk op fenotype. Eigenschappen die niet of moeilijk tot expressie komen en vaak alleen via proefdieronderzoek getest kunnen worden (bijvoorbeeld kerato-conjuctivitis-test voor enteroinvasieve E. coli en Shigella) kunnen via DNA-DNA-hybridisatie in vitro worden getoetst. Bovendien is de gevoeligheid van de techniek zodanig dat een aantal voorbehandelingen die het materiaal in de conventionele techniek moet ondergaan niet nodig is. Een overzicht van het gebruik van DNA-probes is te vinden in J.A.Matthews en L.J. Kricka, Analytical Strategies for the use of DNA-probes: Anal. Bio-chem. 169, 1-25 (1988).Faster diagnostic methods for the detection of bacteria are being worked on in various ways. DNA-DNA hybridization is considered a promising technique (see Klausner and Wilson, Bio / Technology, 1, 471-478, 1983). In principle, a DNA fragment that is specific for a bacterial species or a group of bacteria is used as a "probe" to search for structurally related DNA in bacteria that you want to identify. The major advantage of such a detection technique is that it is tested for genotype instead of as usual for phenotype. Properties that are not or are difficult to express and often can only be tested via animal studies (for example kerato-conjuctivitis test for enteroinvasive E. coli and Shigella) can be tested in vitro via DNA-DNA hybridization. In addition, the sensitivity of the technique is such that a number of pretreatments that the material must undergo in the conventional technique are not necessary. An overview of the use of DNA probes can be found in J.A. Matthews and L.J. Kricka, Analytical Strategies for the use of DNA probes: Anal. Bio-chem. 169, 1-25 (1988).

De weg die tot nu toe wordt gevolgd voor het ontwikkelen van DNA-probes voor bacteriën is het fragmenteren van bacterieel DNA op betrekkelijk willekeurige wijze, het kloneren van fragmenten in plasmide-vec-toren en het nagaan met behulp van radioactieve merkers of fragmenten specifiek hybridiseren met bacterieel DNA. Voor toepassing van de veelbelovende PCR-procedure moet vervolgens de sequentie van dergelijke fragmenten worden bepaald, waarna oligonucleotiden worden bereid en weer getest. Nadeel van dergelijke probes is dat zij een langdurige en bewerkelijke bereiding vergen, een bereiding die bovendien voor een volgende te onderzoeken bacteriesoort geheel opnieuw moet worden afgewikkeld, waardoor het samenstellen van een kit voor het bepalen van verschillende bacteriën in monsters op basis van dergelijke probes vrijwel onmogelijk is. Bekend zijn ook probes op basis van een ribosomaal RNA: deze verto nen echter in een aantal gevallen een hinderlijke kruisreactiviteit (onvoldoende in- en exclusiviteit).The path to date for developing DNA probes for bacteria has been to fragment bacterial DNA in a relatively arbitrary manner, cloning fragments into plasmid vectors, and to specifically hybridize using fragments or fragments with bacterial DNA. To use the promising PCR procedure, the sequence of such fragments must then be sequenced, oligonucleotides are prepared and tested again. The disadvantage of such probes is that they require a long and laborious preparation, a preparation which moreover has to be completely unwound for a further bacterial species to be investigated, which means that the composition of a kit for determining different bacteria in samples based on such probes is virtually is impossible. Probes based on a ribosomal RNA are also known: in a number of cases, however, they show an annoying cross-reactivity (insufficient in- and exclusivity).

Gevonden is dat bepaalde sequenties van genen die coderen voor bui-tenmembraaneiwitten van Gram-negatieve bacteriën en de daaraan complementaire sequenties zeer geschikt zijn als polynucleotide-probe, waarmee micro-organismen van een bepaalde soort of geslacht, bijvoorbeeld in voedingsmiddelen, in klinische specimen of in het milieu, kunnen worden opgespoord.It has been found that certain sequences of genes encoding outer membrane proteins of Gram-negative bacteria and the complementary sequences are very suitable as a polynucleotide probe, with which microorganisms of a particular species or genus, for example in food, in clinical specimens or in the environment, can be detected.

De polynucleotide-probe volgens de uitvinding bevat derhalve een polynucleotide dat overeenkomt met of complementair is aan een gedeelte van een voor een buitenmembraaneiwit van een Gram-negatieve bacterie coderend gen of boodschapper-RNA.Thus, the polynucleotide probe of the invention contains a polynucleotide corresponding to or complementary to a portion of a gene or messenger RNA encoding an outer membrane protein of a Gram negative bacterium.

De polynucleotide-probe volgens de uitvinding heeft als voordeel dat deze slechts een betrekkelijk gering aantal nucleotiden bevat (in de orde van 10-40 baseparen), waardoor deze eenvoudig kan worden bereid en toegepast. Tegelijk blijkt deze; probe specifiek te zijn voor een bepaald geslacht of soort van Gram-negatieve bacteriën.The advantage of the polynucleotide probe of the invention is that it contains only a relatively small number of nucleotides (on the order of 10-40 base pairs), making it easy to prepare and use. At the same time it appears; probe to be specific to a particular genus or species of Gram negative bacteria.

De polynucleotide-probe kan zowel een polydesoxyribonucleotide (DNA-probe) als een polyribonucleotide (RNA-probe) bevatten. Met de term "polynucleotide" wordt hier geen bepaald minimum aantal nuclexnezuren per molecuul aangeduid, en deze term staat derhalve niet in absolute tegenstelling tot "oligonucleotide".The polynucleotide probe can contain both a polydesoxyribonucleotide (DNA probe) and a polyribonucleotide (RNA probe). The term "polynucleotide" does not denote a particular minimum number of nucleic acids per molecule here, and is therefore not in absolute opposition to "oligonucleotide".

Een verder voordeel van de polynucleotide-probe volgens de uitvinding is dat de hybridisatie ook met andere methoden waarneembaar kan worden gemaakt, bijvoorbeeld met de z.g. PCR-methode (polymerase chain reaction). Verder zijn de probes betrekkelijk gemakkelijk te combineren tot een kit waarmee een reeks relevante Gram-negatieve bacteriën, bijvoorbeeld in voedingsmiddelen, lichaamsvocht, watermonsters e.d., kan worden geïdentificeerd.A further advantage of the polynucleotide probe according to the invention is that the hybridization can also be made observable by other methods, for example with the so-called PCR method (polymerase chain reaction). Furthermore, the probes are relatively easy to combine into a kit that can identify a range of relevant Gram negative bacteria, for example, in foods, body fluids, water samples, and the like.

Buitenmembraaneiwitten zijn eiwitten die aanwezig zijn in het buitenmembraan van de celenveloppe van Gram-negatieve bacteriën en daar verschillende functies vervullen zoals het doorlaten van voedingsstoffen (de porievormende buitenmembraaneiwitten of porinen) en van grotere opgeloste stoffen en het bijdragen aan de structuur en de binding van het buitenmembraan. Deze eiwitten worden aangeduid als OmpA, OmpC, OmpF, PhoE, LamB, Tsx, OmpT, FhuA, BtuB, FepA, FecA, enz.Outer membrane proteins are proteins that are present in the outer membrane of the cell envelope of Gram-negative bacteria and fulfill various functions there, such as the passage of nutrients (the pore-forming outer membrane proteins or porins) and of larger solutes and contributing to the structure and binding of the outer membrane. These proteins are referred to as OmpA, OmpC, OmpF, PhoE, LamB, Tsx, OmpT, FhuA, BtuB, FepA, FecA, etc.

Buitenmembraaneiwitten van E.coli zijn beschreven door J.Tommassen in Membrane Biogenesis van J.A.F. Op den Kamp, NATO ASI Series, Vol. H16, 351-373 (1988), Springer Verlag, Berlijn-Heidelberg.Outer membrane proteins of E.coli have been described by J. Tommassen in Membrane Biogenesis of J.A.F. Op den Kamp, NATO ASI Series, Vol. H16, 351-373 (1988), Springer Verlag, Berlin-Heidelberg.

De buitenmembraaneiwitten van Gram-negatieve bacteriën bevatten ge- deelten die sterk heteroloog zijn, d.w.z. dat er belangrijke verschillen in de aminozuursequentie van die gedeelten van de eiwitten tussen de verschillende micro-organismen bestaan. Door deze sterke heterologie kan met betrekkelijk korte sequenties al onderscheid tussen bacteriesoorten of -geslachten worden gemaakt. Bijgevolg vertonen ook de voor deze eiwitten coderende genen plaatselijk een sterke heterologie. Deze genen worden op overeenkomstige wijze aangeduid? ompA, ompC, ompF, phoE, enz. De phoE-genen van enige enterobacteriën zijn onderzocht door Van der Ley et al., Eur.J.Biochem. .164, 469-475 (1987). De ompA-genen van enige Enterobacteriën zijn beschreven door Braun & Cole, 1984, Mol.Gen.Genet. 195, 321-328.The outer membrane proteins of Gram-negative bacteria contain parts that are highly heterologous, i.e. that there are important differences in the amino acid sequence of those parts of the proteins between the different microorganisms. Due to this strong heterology, a distinction can already be made between bacterial species or genera with relatively short sequences. Consequently, the genes encoding these proteins also locally show a strong heterology. These genes are similarly labeled? ompA, ompC, ompF, phoE, etc. The phoE genes of some enterobacteria have been examined by Van der Ley et al., Eur. J. Biochem. 164, 469-475 (1987). The ompA genes of some Enterobacteria have been described by Braun & Cole, 1984, Mol.Gen.Genet. 195, 321-328.

De heterologe gedeelten van de buitenmembraan-eiwitten komen veelal in de aan het celoppervlak geëxposeerde delen van de buitenmembraan-eiwitten voor, terwijl de membraan-overspannende delen sterk geconserveerd zijn. Derhalve zijn die gedeeltes van de genen die overeenkomen met de geëxposeerde gedeelten van de buitenmembraan-eiwitten bijzonder geschikt als basis voor specifieke polynucleotide-probes volgens de uitvinding.The heterologous parts of the outer membrane proteins often occur in the parts of the outer membrane proteins exhibited at the cell surface, while the membrane-spanning parts are highly conserved. Therefore, those portions of the genes corresponding to the displayed portions of the outer membrane proteins are particularly suitable as a basis for specific polynucleotide probes of the invention.

Een voorbeeld van een geschikte probe voor het aantonen van Salmo-nella-species is er een die het 23-mer oligodesoxynucleotide TTTAGTAGACGGGCCGCCAGGGA omvat, overeenkomend met een geëxposeerd deel van het OmpA—eiwit van S.typhimurium.An example of a suitable probe for detecting Salmonella species is one comprising the 23-mer oligodeoxynucleotide TTTAGTAGACGGGCCCCCCGGGA corresponding to an exhibited portion of the S.typhimurium OmpA protein.

De probes volgens de uitvinding kunnen zijn opgebouwd op basis van de buitenmembraan-eiwitten,in principe van alle Gram-negatieve bacteriën, en derhalve worden gebruikt voor het opsporen van dezelfde Gram-negatieve bacteriesoorten of -geslachten. Bijzonder van belang zijn probes voor Enterobacteriaceae, omdat deze bacteriën een grote rol spelen bij infecties, voedselvergiftigingen, biologische verontreinigingen e.d. Genoemd kunnen worden bacteriën van de geslachten Enterobacter. Klebsiella. Salmonella, Yersinia. Edwardsiella. Erwinia. Serratia. Citrobacter. Proteus en Providencia. De uitvinding is ook van toepassing op andere Gram-negatieve bacteriën dan Enterobacteriaceae. zoals Pseudomonas.The probes according to the invention can be constructed on the basis of the outer membrane proteins, in principle of all Gram-negative bacteria, and are therefore used to detect the same Gram-negative bacteria species or genera. Probes of particular interest are for Enterobacteriaceae, because these bacteria play a major role in infections, food poisoning, biological contaminants, etc. The bacteria of the genera Enterobacter can be mentioned. Klebsiella. Salmonella, Yersinia. Edwardsiella. Erwinia. Serratia. Citrobacter. Proteus and Providencia. The invention also applies to Gram negative bacteria other than Enterobacteriaceae. like Pseudomonas.

De polynucleotide-probes volgens de uitvinding herkennen specifiek bacterie-geslachten en eventueel bacterie-soorten. Zo blijkt een van een buitenmembraan-eiwit van Salmonella typhimurium afgeleide probe alle Salmonella-soorten te herkennen en geen vals-positieve reaktie met andere soorten te vertonen. Hierbij dient echter te worden opgemerkt dat de gangbare indeling van bacteriën in geslachten en soorten geenszins volmaakt is, waardoor het kan voorkomen dat een probe afgeleid van een tot een bepaald geslacht behorende soort of stam een soort met dezelfde ge- slachtsnaam niet herkent.The polynucleotide probes of the invention specifically recognize bacterial genera and optionally bacterial species. For example, a probe derived from an outer membrane protein of Salmonella typhimurium appears to recognize all Salmonella species and to show no false positive reaction with other species. It should be noted, however, that the common classification of bacteria in genera and species is by no means perfect, which means that a probe derived from a species or strain belonging to a particular genus may not recognize a species with the same genus name.

De genus-begrenzing van de probes volgens de uitvinding is echter zo sterk, dat het optreden van een dergelijke "vals-negatieve" reaktie een aanwijzing is, dat de soort die deze negatieve reaktie geeft niet tot het geslacht in kwestie behoort. Omgekeerd herkent een bijvoorbeeld van een Escherichia coli afgeleide probe ook Shigella sp., hetgeen bevestigt dat E.coli en Shigella-sp. tot hetzelfde geslacht en wellicht zelfs tot één soort behoren (zie W.J, Brenner, in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. I, blz. 410-411, Williams & Williams Co. Baltimore (1984)).However, the genus limitation of the probes according to the invention is so strong that the occurrence of such a "false negative" reaction is an indication that the species giving this negative reaction does not belong to the genus in question. Conversely, a probe derived from an Escherichia coli, for example, also recognizes Shigella sp., Confirming that E. coli and Shigella sp. are of the same genus and may even belong to one species (see W. J, Brenner, in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. I, pp. 410-411, Williams & Williams Co. Baltimore (1984)).

Dat de polynucleotide-probes volgens de uitvinding een zo hoge exclusiviteit en inclusiviteit hebben is bijzonder verrassend, gezien de resultaten met DNA-probes volgens de stand van de techniek.The fact that the polynucleotide probes of the invention have such a high exclusivity and inclusivity is particularly surprising, given the results with prior art DNA probes.

De polynucleotide-probe volgens de uitvinding kan op basis van een geschikt gedeelte van een gen of boodschapper-RNA coderend voor een bui-tenmembraan-eiwit van de gekozen bacterie worden bereid door aaneenrijgen van de desbetreffende nucleotiden volgens op zichzelf bekende wijze. De bereiding kan met voordeel geautomatiseerd geschieden met een DNA-synthese-inrichting.The polynucleotide probe of the invention may be prepared from the appropriate bacterial nucleus based on a suitable portion of a gene or messenger RNA encoding an outer membrane protein of the selected bacterium. Advantageously, the preparation can be automated with a DNA synthesizer.

Het vermogen van de aldus verkregen probe om selektief bacteriën op te sporen wordt aangetoond, bijvoorbeeld door middel van hybridisatie in een z.g. slot-blot-procedure (P.J. Carter et al., Cell J58^ 835-840 (1984)). Het DNA van de te onderzoeken bacterie(n) wordt daarbij uit de cellen vrijgemaakt en op een filter gehecht en vervolgens in contact gebracht met een probe volgens de uitvinding, voorzien van bijvoorbeeld een radioactief label. Na hybridiseren wordt bijvoorbeeld door middel van een autoradiogram nagegaan of de probe met een nucleotidesequentie heeft gereageerd, met andere woorden deze nucleotidesequentie heeft herkend .The ability of the probe thus obtained to selectively detect bacteria is demonstrated, for example, by hybridization in a so-called slot blot procedure (P.J. Carter et al., Cell J58835-4040 (1984)). The DNA of the bacterium (s) to be tested is thereby released from the cells and attached to a filter and then brought into contact with a probe according to the invention, provided with, for example, a radioactive label. After hybridization, it is checked, for example, by means of an autoradiogram whether the probe has reacted with a nucleotide sequence, in other words has recognized this nucleotide sequence.

Anderzijds kan voor de detectie van hybridisatie met voordeel gebruik worden gemaakt van de z.g. polymerase-ketenreactie ofwel "Polymerase chain reaction" (PCR)-procedure, zie R.K. Saiki et al, Science 239, 487 (1988) en EP-A-200362. Bij deze werkwijze wordt met behulp van twee korte oligodesoxynucleotiden, z.g. primers, voorkomend in een langer polydesoxynucleotide, een polydesoxynucleotide-fragment efficient enzymatisch vermeerderd in cycli van kopiëren en denatureren bij verschillende temperaturen. Op deze wijze kan met twee probes in korte tijd van een herkend DNA-fragment een zo grote hoeveelheid worden verkregen dat detectie zonder radioaktieve merking mogelijk is.On the other hand, the so-called polymerase chain reaction or "polymerase chain reaction" (PCR) procedure can advantageously be used for the detection of hybridization, see R.K. Saiki et al, Science 239, 487 (1988) and EP-A-200362. In this method, using two short oligodeoxynucleotides, so-called primers, contained in a longer polydesoxynucleotide, a polydesoxynucleotide fragment is efficiently propagated enzymatically in cycles of copying and denaturing at different temperatures. In this way, with two probes, a quantity of a recognized DNA fragment can be obtained in such a short time that detection without radioactive labeling is possible.

Een andere recent ontwikkelde wijze die kan worden toegepast om hy- bridisatie waar te nemen is de koppeling aan viraal RNA, waarna de probe wordt gehybridiseerd met het te bepalen DNA-monster. Eventuele hybridisatie kan vervolgens worden aangetoond door in vitro vermenigvuldiging van het gehybridiseerde RNA met behulp van viraal replicase. Op deze wijze kan van het gehybridiseerde RNA in korte tijd een zo grote hoeveelheid verkregen worden dat detectie zonder radioactieve merking mogelijk is. Zie ook P.M. Lizardi et al. Biotechnology 6, 1197-1102 (1988).Another recently developed way that can be used to observe hybridization is the coupling to viral RNA, after which the probe is hybridized with the DNA sample to be determined. Hybridization can then be demonstrated by in vitro multiplication of the hybridized RNA using viral replicase. In this way, the amount of the hybridized RNA can be obtained in such a short time that it is possible to detect it without radiolabeling. See also P.M. Lizardi et al. Biotechnology 6, 1197-1102 (1988).

De polynucleotide-probe kan worden gebruikt om een bacteriesoort of -geslacht selectief binnen een veelheid aan bacteriën op te sporen, bijvoorbeeld in levensmiddelen. Ook is de polynucleotide-probe volgens de uitvinding zeer geschikt voor het identificeren van geïsoleerde bacteriën, eventueel van een reincultuur,voor medische toepassing (infecties) .The polynucleotide probe can be used to selectively detect a bacterial species or genus within a variety of bacteria, for example in food. The polynucleotide probe according to the invention is also very suitable for identifying isolated bacteria, possibly of a pure culture, for medical use (infections).

De uitvinding heeft derhalve ook betrekking op een werkwijze voor het opsporen en identificeren van Gram-negatieve bacteriën, in het bijzonder van Enterobacteriaceae, waarbij men de polynucleotide-probe zoals hierboven omschreven gebruikt.The invention therefore also relates to a method for detecting and identifying Gram-negative bacteria, in particular Enterobacteriaceae, using the polynucleotide probe as described above.

De werkwijze bestaat bijvoorbeeld daaruit dat men het polynucleotide materiaal van het te onderzoeken monster op bekende wijze isoleert of hecht aan een drager en vervolgens in contact brengt met een probe volgens de uitvinding. De hybridisatie kan vervolgens volgens verschillende methoden worden gedetecteerd, bijvoorbeeld door toepassing van 32P-ATP, viraal replicase enz. Bijzonder voordeel heeft de werkwijze volgens de uitvinding bij toepassing van de PCR-methode zoals hierboven aangegeven, waarbij het vermenigvuldigde polynucleotidefragment op verschillende wijze kan worden gedetecteerd.The method consists, for example, of isolating or adhering the polynucleotide material of the sample to be tested in a known manner to a carrier and then contacting it with a probe according to the invention. The hybridization can then be detected by various methods, for example, using 32P-ATP, viral replicase, etc. The method of the invention has particular advantage in using the PCR method as indicated above, wherein the multiplied polynucleotide fragment can be differently detected.

De uitvinding heeft tevens betrekking op een samenstel ("kit'1) voor het selektief opsporen/identificeren van Gram-negatieve bacteriën, welk samenstel een of meer van de hierboven beschreven polynucleotide-probes bevat. In het bijzonder bevat deze kit een combinatie van DNA-probes voor het testen op de aanwezigheid van een reeks Enterobacteriaceae.The invention also relates to a kit ("kit" 1) for selectively detecting / identifying Gram-negative bacteria, which kit contains one or more of the above-described polynucleotide probes. In particular, this kit contains a combination of DNA probes for testing for the presence of a series of Enterobacteriaceae.

De kit volgens de uitvinding kan naast de polynucleotide-probe tevens middelen bevatten voor het isoleren van het (gehybridiseerde) polynucleotide, zoals filters, voor het detecteren van het hybridisatie-signaal, zoals merkstoffen, en voor het in vitro vermenigvuldigen van gehybridiseerde polynucleotidefragmenten zoals een DNA-polymerase of een viraal polymerase alsmede andere middelen voor het uitvoeren van een identificatie van bacteriën, en eventueel een voorschrift daarvoor.In addition to the polynucleotide probe, the kit according to the invention may also contain means for isolating the (hybridized) polynucleotide, such as filters, for detecting the hybridization signal, such as markers, and for multiplying in vitro hybridized polynucleotide fragments such as a DNA polymerase or a viral polymerase as well as other means for carrying out identification of bacteria, and possibly a prescription therefor.

De onderstaande voorbeelden illustreren dat polvnucleotide-sequen-ties die coderen voor aan het celoppervlak geëxposeerde delen van bui tenmembraan-eiwitten of de daaraan complementaire sequenties kunnen worden gebruikt als genus-specifieke probes voor het identificeren van Gram-negatieve bacteriën.The examples below illustrate that polynucleotide sequences encoding cell surface exposed portions of outer membrane proteins or their complementary sequences can be used as genus specific probes to identify Gram negative bacteria.

Voorbeeld IExample I

Synthese en merking van oligo-nucleotidenSynthesis and labeling of oligo nucleotides

De oligodesoxynucleotiden werden automatisch bereid met behulp van een Biosearch 8600 DNA-synthesizer en werden vervolgens gezuiverd door middel van hoge-drukvloeistofchromatografie. De oligomeren werden aan het 5'-uiteinde gemerkt door enzymatisch gekatalyseerde overdracht van 32p-fosfaat uit [y-^^P]ATP (3000 Ci/mmol, Amersham Int. plc Amersham, Engeland) met T4 polynucleotide-kinase (Pharmacia, Uppsala, Zweden) volgens de werkwijze van Maniatis et al., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982).The oligodeoxynucleotides were automatically prepared using a Biosearch 8600 DNA synthesizer and then purified by high pressure liquid chromatography. The oligomers were labeled at the 5 'end by enzymatically catalyzed transfer of 32 P-phosphate from [γ] P P ATP (3000 Ci / mmol, Amersham Int. Plc Amersham, England) with T4 polynucleotide kinase (Pharmacia, Uppsala , Sweden) according to the method of Maniatis et al., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY (1982).

Bacteriestammen en plasmidenBacterial strains and plasmids

De onderstaande bacteriestammen werden gedurende een nacht bij 37°C onder schudden in L-medium (J.Tommassen et al., EMBO.J.2^ 1275-1279 (1983)) gekweekt. Escherichia coli K-12 stam CE1194 met een chromosomale phoE-deletie, alsmede het phoE+ derivaat CE1195 (J.Tommassen et al., J.Bacteriol. 149, 668-672 (1982)). E.coli B (instituut voor Moleculaire Biologie en Medische Biotechnologie, Rijksuniversiteit Utrecht). Stam EIEC, een entero-invasieve E.coli uit menselijke faeces alsmede Shigella dysenteriae, Shigella boydii serovar 2 en een onbekende serovar, Shigella flexneri serovars I,II,III,IV,VI,X en een onbekende serovar. Shigella sonnei serovars I,II en een onbekende serovar uit menselijke faeces waren afkomstig van het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieuhygiëne, Bilthoven. Andere gebruikte enterobacteriële stammen waren Edwardsiella tarda, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii. Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Providencia stuartii. Salmonella braenderup, Salmonella derby, Salmonella panama, Serratia mar-cescens. Shigella flexneri, Shigella sonnei (H.Hofstra, J.Dankert. J.Gen.Microbiol. 119, 123-131 (1980), Salmonella typhimurium SJ2353 (T. Sato, T.Yura, J.Bacteriol. 139, 468-477 (1979)), Salmonella typhimurium LT2, Salmonella typhimurium B7121-2 pro“ (instituut voor Moleculaire Biologie en Medische Biotechnologie, Rijksuniversiteit Utrecht) en Salmonella typhimurium KB1711 (K.Bauer et al., J. Bacterol. 161: 813-816 (1985)). Voor de "polymerase chain reaction" procedure werden gebruikt: E. coli K-12 stam CGSC4234 (E. coli Genetic Stock Center, Department of Human Genetics, Yale University School of Medicine, New Haven,Conn.), Salmonella panama en Salmonella typhimurium SJ2353. Voor de DNA-spot-testen werden de volgende plasmiden gebruikt: pACYCl84 (A. Chang, S. Co hen, J. Bacteriol. _134 = Π41-1156 (1978)) en zijn derivaten pJP29 (bevat het phoE-gen van E. coli, D. Bosch et al., J. Mol. Biol. J89_: 449-455 (1986), pKP2 (bevat het phoE-gen van Klebsiella pneumoniae, P. van der Ley et el., Eur. J. Biochem. 164:469-475 (1987) en PEC17 (bevat het phoE-gen van Enterobacter cloacae, C. Verhoef et al., Gene 32: 107-115 (1984)). Plasmide pBR322 (F. Bolivar et al., Gene 2: 95-113 (1977)) en zijn derivaat pSTl (bevat een deel van het phoE-gen van Salmonella typhjmurium, G. Spierings, niet gepubliceerd).The bacterial strains below were grown overnight at 37 ° C with shaking in L medium (J. Tommassen et al., EMBO.J.2 ^ 1275-1279 (1983)). Escherichia coli K-12 strain CE1194 with a chromosomal phoE deletion, as well as the phoE + derivative CE1195 (J. Tommassen et al., J. Bacteriol. 149, 668-672 (1982)). E.coli B (Institute for Molecular Biology and Medical Biotechnology, University of Utrecht). Strain EIEC, an entero-invasive E. coli from human faeces as well as Shigella dysenteriae, Shigella boydii serovar 2 and an unknown serovar, Shigella flexneri serovars I, II, III, IV, VI, X and an unknown serovar. Shigella sonnei serovars I, II and an unknown serovar from human faeces came from the National Institute of Public Health and Environmental Hygiene, Bilthoven. Other enterobacterial strains used were Edwardsiella tarda, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii. Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Providencia stuartii. Salmonella braenderup, Salmonella derby, Salmonella panama, Serratia mar-cescens. Shigella flexneri, Shigella sonnei (H. Hofstra, J. Dankert. J. Gen. Microbiol. 119, 123-131 (1980), Salmonella typhimurium SJ2353 (T. Sato, T. Yura, J. Bacteriol. 139, 468-477 (1979)), Salmonella typhimurium LT2, Salmonella typhimurium B7121-2 pro "(Institute for Molecular Biology and Medical Biotechnology, University of Utrecht) and Salmonella typhimurium KB1711 (K. Bauer et al., J. Bacterol. 161: 813-816 ( 1985)). For the "polymerase chain reaction" procedure were used: E. coli K-12 strain CGSC4234 (E. coli Genetic Stock Center, Department of Human Genetics, Yale University School of Medicine, New Haven, Conn.), Salmonella Panama and Salmonella typhimurium SJ2353 For the DNA spot assays, the following plasmids were used: pACYCl84 (A. Chang, S. Co hen, J. Bacteriol. _134 = Π41-1156 (1978)) and its derivatives pJP29 (contains the phoE gene from E. coli, D. Bosch et al., J. Mol. Biol. J89_: 449-455 (1986), pKP2 (contains the phoE gene from Klebsiella pneumoniae, P. van der Ley et el., EUR J. Biochem. 164: 469-475 (1987) and PEC17 (contains the phoE gene from Enterobacter cloacae, C. Verhoef et al., Gene 32: 107-115 (1984)). Plasmid pBR322 (F. Bolivar et al., Gene 2: 95-113 (1977)) and its derivative pST1 (contains part of the phoE gene of Salmonella typhymurium, G. Spierings, not published).

Slot-blot Hybridisatieprocedure:Slot-blot Hybridization Procedure:

Nadat de optische dichtheid bij 600 nm van de verkregen celcultures op OD = 1,1 voor het testen van de Shigella-probe en op OD = 0,7 voor het testen van de Salmonella-probe was ingesteld, werden hoeveelheden van 100/ul langzaam door nitrocellulose (NC)filters (BA 85-Schleicher en Shuell, Kassei, BR Duitsland) gefiltreerd in een slot-blot-apparaat (Minifold II, Schleicher & Shuell). De filters werden bereid volgens de werkwijze van P.J.Carter et al., Cell 38, 835-840 (1984). Het DNA werd op het NC-filter gehecht door 4 minuten UV-bestraling ( λ 320 nm, L2723, Ankersmit). De filters werden 45 minuten bij 60 C voorgehybridi-seerd in 0,25 % Protifar (Nutricia NV, Zoetermeer), 6 x SSC (90 mM na-triumchloride, 90 mM natriumcitraat pH 7,0). Na toevoegen van de probe (10 pmol DNA) werd het filter 1,5 uur bij 60°C gehybridiseerd. De filters werden tweemaal met 6 x SSC bij 60°C gewassen en er werden auto-radiogrammen van de filters gemaakt door blootstelling aan een Fuji X-ray-film gedurende 3 dagen.After the optical density at 600 nm of the obtained cell cultures was adjusted to OD = 1.1 for Shigella probe testing and OD = 0.7 for Salmonella probe testing, aliquots of 100 µl were slowly filtered through nitrocellulose (NC) filters (BA 85-Schleicher and Shuell, Kassei, BR Germany) in a slot blot device (Minifold II, Schleicher & Shuell). The filters were prepared according to the method of P. J. Carter et al., Cell 38, 835-840 (1984). The DNA was attached to the NC filter by 4 minutes of UV irradiation (λ 320 nm, L2723, Ankersmit). The filters were prehybridized for 45 minutes at 60 ° C in 0.25% Protifar (Nutricia NV, Zoetermeer), 6 x SSC (90 mM sodium chloride, 90 mM sodium citrate pH 7.0). After adding the probe (10 pmol of DNA), the filter was hybridized at 60 ° C for 1.5 hours. The filters were washed twice with 6 x SSC at 60 ° C and autograms of the filters were made by exposure to a Fuji X-ray film for 3 days.

DNA-spot-procedure: Van de plasmide-oplossingen (j_ 0.5/ug//ul) werd 1/ul op NC gespot. De filters werden vervolgens behandeld en gehybridiseerd als beschreven in de slot-blot hybridisatieprocedure.DNA Spot Procedure: 1 µl of the plasmid solutions (j_ 0.5 µg // µl) were spotted on NC. The filters were then treated and hybridized as described in the slot blot hybridization procedure.

Polymerase Chain Reaction (PCR)-procedure: Het Taq_ DNA-polymerase (Perkin Elmer CETUS, Norwalk, USA) werd gebruikt volgens voorschrift van de fabrikant met uitzondering van het gebruik van 10 mM Tris HCl. pH 8,8 in plaats van pH 8,4, 1 eenheid T£g_ DNA-polymerase in plaats van 2 eenheden en het eindvolume werd van 50/ul teruggebracht naar 25/ul. Als substraat in de reactie werd gebruik gemaakt van chromosomaal DNA (£ 10 ng) geïsoleerd volgens Marmur (Marmur, J. et al., J.Mol. Biol, 3_* 208-218 (1961) uit de E. coli K-12 stam CGSC4234, S. panama en S. typhi-murium SJ 2353). Als primer-koppels werden gebruikt STl/ST3c en ST2/ST3c resulterend in de vermeerdering van fragmenten van respectievelijk 285 en 156 baseparen. Er werden 40 cycli gedraaid van 1 minuut 92°C, 2 minuten 42°C, 2 minuten 65°C met behulp van een programmeerbaar incubator-blok (PHC-1, New Brunswick Scientific B.V., Soest, Holland). Van het re- actiemengsel werd 10/ul op een 1,3% agarosegel geanalyseerd.Polymerase Chain Reaction (PCR) Procedure: The Taq_ DNA polymerase (Perkin Elmer CETUS, Norwalk, USA) was used according to the manufacturer's instructions except for the use of 10 mM Tris HCl. pH 8.8 instead of pH 8.4, 1 unit Tgg DNA polymerase instead of 2 units and the final volume was reduced from 50 µl to 25 µl. As substrate in the reaction, chromosomal DNA (10 ng) isolated according to Marmur (Marmur, J. et al., J. Mol. Biol, 3 * 208-218 (1961) from E. coli K-12 was used. strain CGSC4234, S. panama and S. typhimurium SJ 2353). ST1 / ST3c and ST2 / ST3c were used as primer pairs resulting in the propagation of fragments of 285 and 156 base pairs, respectively. 40 cycles were run from 1 minute 92 ° C, 2 minutes 42 ° C, 2 minutes 65 ° C using a programmable incubator block (PHC-1, New Brunswick Scientific B.V., Soest, Holland). 10 µl of the reaction mixture was analyzed on a 1.3% agarose gel.

Salmonella-probes: Er werden drie Salmonella-probes gesyntheti seerd, gebaseerd op het eerste, het tweede en het derde aan het cel- oppervlak geexposeerde fragment van het OmpA eiwit van S. typhimurium. De DNA-sequenties van deze fragmenten zijn als resp. STl, ST2 en ST3c weergegeven in Figuur 1. De in- en exclusiviteit van ST3c werd getest in een slot-blot hybridisatieprocedure. Figuur 4 geeft het autoradiogram van het filter na hybridisatie met de probe weer. Op het filter zijn de volgende stammen aangebracht: IA, P. mirabilis; IB, S, panama: 1C, S. typhimurium; 2A, S. marcescens; 2B, C, freundii, 2C, K. pneumoniae; 3A, E. tarda; 3B, E. aerogenes; 3C, P. stuartii; 4A, E. coli B; 4B, S. typhimurium KB1711; 4C, S. braenderup; 5A, S. derby; 5B, S. typhimurium LT2; 5C, S. typhimurium B pro; 6A, P. vulgaris; ÖB, S. flexneri: 6C, S. sonnei. Strepen in het autoradiogram geven aan dat de probe aan een complementaire nucleotide-sequentie in de gelyseerde cellen was gebonden. De figuur toont aan dat de probe reageert met S. braenderup, S. derby en S. typhimurium. De probe reageert niet met de andere Enterobacteriaceae. Onder de gebruikte testcondities reageert de probe echter niet met S. panama. Onder de omstandigheden gebruikt in de PCR-reactie (Figuur 5) bleek echter zowel het chromosomaal DNA geïsoleerd uit S. panama (Slot 5 en 6) als het chromosomaal DNA geïsoleerd uit S. typhimurium (Slot 3 en 4) als substraat gebruikt te worden. Wanneer het chromosomaal DNA geïsoleerd uit E. coli als substraat werd aangeboden vond noch amplificatie van het fragment van 285 baseparen (Slot 1) plaats bij gebruik van de probes STl en ST3c, noch van het fragment van 156 baseparen (Slot 2) bij gebruik van de probes ST2 en ST3c. De resultaten tonen aan dat de drie probes specifiek zijn voor Salmonella.Salmonella Probes: Three Salmonella probes were synthesized based on the first, second and third cell surface fragment of the OmpA protein of S. typhimurium. The DNA sequences of these fragments are as. ST1, ST2 and ST3c shown in Figure 1. The in and exclusivity of ST3c was tested in a slot blot hybridization procedure. Figure 4 shows the autoradiogram of the filter after hybridization with the probe. The following strains are applied to the filter: IA, P. mirabilis; IB, S, Panama: 1C, S. typhimurium; 2A, S. marcescens; 2B, C, freundii, 2C, K. pneumoniae; 3A, E. tarda; 3B, E. aerogenes; 3C, P. stuartii; 4A, E. coli B; 4B, S. typhimurium KB1711; 4C, S. braenderup; 5A, S. derby; 5B, S. typhimurium LT2; 5C, S. typhimurium B pro; 6A, P. vulgaris; ÖB, S. flexneri: 6C, S. sonnei. Stripes in the autoradiogram indicate that the probe was bound to a complementary nucleotide sequence in the lysed cells. The figure shows that the probe reacts with S. braenderup, S. derby and S. typhimurium. The probe does not react with the other Enterobacteriaceae. However, under the test conditions used, the probe does not react with S. panama. However, under the conditions used in the PCR reaction (Figure 5), both the chromosomal DNA isolated from S. panama (Slot 5 and 6) and the chromosomal DNA isolated from S. typhimurium (Slot 3 and 4) were found to be used as a substrate . When the chromosomal DNA isolated from E. coli was presented as a substrate, neither amplification of the 285 base pair fragment (Slot 1) occurred using the ST1 and ST3c probes, nor the 156 base pair fragment (Slot 2) using the probes ST2 and ST3c. The results show that the three probes are specific to Salmonella.

Voorbeeld IIExample II

Shigella-probe: Voor het ontwikkelen van de Shigella-probe werd gebruik gemaakt van de zeer nauwe verwantschap die bestaat tussen Shigella en E.coli (zie W.J. Brenner, Family I Enterobacteriaceae. in: Bergey'sShigella probe: The very close relationship existing between Shigella and E.coli was used to develop the Shigella probe (see W.J.Brenner, Family I Enterobacteriaceae. In: Bergey's

Manual of Systematic Bacteriology, vol. I, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, blz. 410-411 (1984). Daarom werd verondersteld dat de sequenties van de phoE genen van Shigella species vrijwel identiek zijn aan de bekende sequentie van het E, coli K-12 phoE gen. De Shigella probe waarvan de sequentie met de overeenkomstige sequenties van K.pneumoniae en E.cloacae (P.van der Ley et.al, Eur. J.Biochem.]64: 469-475 (1987)) zijn weergegeven in Figuur 2, is gebaseerd op het vijfde aan het cel-oppervlak geexposeerde deel van het PhoE-eiwit van E. coli. Met behulp van een slot-blot hybridisatieprocedure werd de specificiteit van de probe getest. Het autoradiogram is weergegeven in fxg. 6. Op het filter werden de volgende stammen aangebracht: IA, P. mirabilis: IB, S. panama; 1C, ji. typhimurium; 2A, Si. marcescens: 2B, C. freundii; 2C, K. pneumoniae; 3A, E. tarda; 3B, E. aerogenes; 3C, P. stuartii; 4A, CE1195; 4B, CE1194; 4C, EIEC; 5A, Sh. sonnei I; SB, Sh. sonnei IX: 5C, Sh. sonnei· 6A, Sh. dvsenteriae; 6B, Sh. boydii: 6C, Sh. flexneri: 7A, Sh. flexneri I; TB, Sh. flexneri II; 7C, Sh. flexneri III; 8A, Sh. flexneri IV; 8B, Sh. flexneri X; 8C, L-medium; 9A, Sh. sonnei; 9B, Sh. boydii 2; 9C, Stu flexneri VI. De probe reageerde met alle geteste Shigella-stammen en met E. coli K12 CE1195 en de entero-invasieve E. coli-stam (EIEC).Manual of Systematic Bacteriology, vol. I, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, pp. 410-411 (1984). Therefore, the sequences of the phoE genes of Shigella species were thought to be almost identical to the known sequence of the E. coli K-12 phoE gene. The Shigella probe whose sequence with the corresponding sequences of K. pneumoniae and E. cloacae (P. van der Ley et.al, Eur. J. Biochem.] 64: 469-475 (1987)) are shown in Figure 2, is based on the fifth cell surface exhibited portion of the E. coli PhoE protein. The specificity of the probe was tested using a slot-blot hybridization procedure. The autoradiogram is shown in fxg. 6. The following strains were applied to the filter: IA, P. mirabilis: IB, S. panama; 1C, ji. typhimurium; 2A, Si. marcescens: 2B, C. freundii; 2C, K. pneumoniae; 3A, E. tarda; 3B, E. aerogenes; 3C, P. stuartii; 4A, CE1195; 4B, CE1194; 4C, EIEC; 5A, Sh. sonnei I; SB, Sh. sonnei IX: 5C, Sh. sonnei · 6A, Sh. dvsenteriae; 6B, Sh. boydii: 6C, Sh. flexneri: 7A, Sh. flexneri I; TB, Sh. flexneri II; 7C, Sh. flexneri III; 8A, Sh. flexneri IV; 8B, Sh. flexneri X; 8C, L medium; 9A, Sh. sonnei; 9B, Sh. boydii 2; 9C, Stu flexneri VI. The probe reacted with all Shigella strains tested and with E. coli K12 CE1195 and the entero-invasive E. coli strain (EIEC).

De resultaten tonen aan, dat de probe specifiek is voor de soort Shigella/E. coli.The results show that the probe is specific to the Shigella / E species. coli.

Voorbeeld IIIExample III

Enterobacter- en Klebsiella-probe:Enterobacter and Klebsiella probe:

De Enterobacter-probe en de Klebsiella-probe, waarvan de sequenties met de overeenkomstige sequentie van E.coli zijn weergegeven in Figuur 3, zijn gebaseerd op het achtste aan het celoppervlak geëxposeerde fragment van het PhoE-eiwit van respectievelijk E, cloacae en K. pneumoniae. De specificiteit van de probes werd onderzocht in DNA-spot-tests. Het auto radiogram van het filter gehybridiseerd met de Enterobacter-probe en gehybridiseerd met de Klebsiella-probe is weergegeven in figuur 7, respectievelijk foto links en foto rechts. Op de filters waren de volgende plasmiden aangebracht: IA, PEC17; IB, PBR322; PJP29: 2B. PACYC184: 3A. pKP2; 3B, pSTl. Figuur 7 links laat zien dat de Enterobacter-probe alleen reageert met pECl7 en niet met de andere plasmiden. Figuur 7 rechts laat zien dat de Klebsiella-probe alleen met pKP2 reageert.The Enterobacter probe and the Klebsiella probe, whose sequences with the corresponding sequence of E. coli are shown in Figure 3, are based on the eighth fragment of the PhoE protein of E, cloacae and K exhibited at the cell surface. pneumoniae. The specificity of the probes was examined in DNA spot tests. The auto radiogram of the filter hybridized with the Enterobacter probe and hybridized with the Klebsiella probe is shown in Figure 7, left and right, respectively. The following plasmids were applied to the filters: IA, PEC17; IB, PBR322; PJP29: 2B. PACYC184: 3A. pKP2; 3B, pSTl. Figure 7 on the left shows that the Enterobacter probe reacts only with pECl7 and not with the other plasmids. Figure 7 on the right shows that the Klebsiella probe reacts only with pKP2.

Hieruit kan geconcludeerd worden dat de Enterobacter-probe en de Klebsiella-probe niet kruisreageren met de phoE-genen van de andere geteste Enterobacteriaceae.It can be concluded from this that the Enterobacter probe and the Klebsiella probe do not cross-react with the phoE genes of the other Enterobacteriaceae tested.

Claims (8)

1. Polynucleotide-probe die specifiek een geslacht of soort van Gram-negatieve bacteriën herkent, welke probe een polynucleotide bevat dat overeenkomt met of complementair is aan een gedeelte van een voor een buitenmembraaneiwit van de Gram-negatieve bacterie coderend gen of boodschapper-RNA.A polynucleotide probe that specifically recognizes a genus or species of Gram-negative bacteria, which probe contains a polynucleotide corresponding to or complementary to a portion of an outer membrane protein of the Gram-negative bacterium encoding gene or messenger RNA. 2. Probe volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gedeelte van het gen of boodschapper-RNA codeert voor een hoofdzakelijk aan het cel-oppervlak geëxposeerd deel van het buitenmembraaneiwit.The probe according to claim 1, characterized in that the portion of the gene or messenger RNA encodes a portion of the outer membrane protein mainly exhibited on the cell surface. 3. Probe volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de Gram-negatieve bacterie behoort tot de Enterobacteriaceae.Probe according to claim 1 or 2, characterized in that the Gram-negative bacterium belongs to the Enterobacteriaceae. 4. Werkwijze voor het opsporen en/of identificeren van Gram-negatieve bacteriën, met het kenmerk, dat men daarbij een of meer probes volgens een der conclusies 1-3 gebruikt.Method for detecting and / or identifying Gram-negative bacteria, characterized in that one or more probes according to any one of claims 1-3 are used. 5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men Enterobacteriaceae opspoort en/of identificeert onder gebruikmaking van probes volgens conclusie 3.Method according to claim 4, characterized in that Enterobacteriaceae is detected and / or identified using probes according to claim 3. 6. Werkwijze volgens conclusie 4 of 5, met het kenmerk, dat men een fragment van het gen of boodschapper-RNA dat door de probes wordt herkend vervolgens vermeerdert door toepassing van een polymerase-keten-reactie.A method according to claim 4 or 5, characterized in that a fragment of the gene or messenger RNA recognized by the probes is then amplified using a polymerase chain reaction. 7. Kit voor het opsporen en/of identificeren van Gram-negatieve bacteriën welke een of meer polynucleotide-probes volgens conclusies 1-3 bevat.A kit for detecting and / or identifying Gram-negative bacteria containing one or more polynucleotide probes according to claims 1-3. 8. Kit voor het opsporen en/of identificeren van Enterobacteriaceae, welke een of meer polynucleotide-probes volgens conclusie 3 bevat.A kit for detecting and / or identifying Enterobacteriaceae containing one or more polynucleotide probes according to claim 3.