NL8802710A - METHOD FOR DETERMINING AN ENZYME AND SUITABLE KIT AND SUBSTANCE. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het bepalen van een enzym en daarvoor geschikte kit en stof.Method for determining an enzyme and suitable kit and substance.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van de concentratie van een verschijningsvorm van een enzym in een biologische vloeistof door van de vloeistof een monster af te scheiden en in dit monster met behulp van een immunologische bepalingsmethode het gehalte van de verschijningsvorm van het enzym te bepalen.The invention relates to a method for determining the concentration of an appearance of an enzyme in a biological liquid by separating a sample from the liquid and in this sample by means of an immunological determination method the content of the appearance of the enzyme. to decide.

In biologische vloeistoffen, zoals weefselextracten, urine, celextracten, cultuurmedia, plantenextracten of bloed komen veel typen enzymen voor. In deze vloeistoffen zijn de enzymen vaak niet erg stabiel, bijvoorbeeld door de aanwezigheid van andere enzymen, fysiologische remmers of omdat het enzym intrinsiek niet stabiel is. Dergelijke enzymen komen veelal in lage concentraties voor en zijn daardoor niet eenvoudig accuraat te bepalen.Many types of enzymes are found in biological liquids, such as tissue extracts, urine, cell extracts, culture media, plant extracts or blood. The enzymes are often not very stable in these liquids, for example due to the presence of other enzymes, physiological inhibitors or because the enzyme is intrinsically unstable. Such enzymes often occur in low concentrations and are therefore not easy to accurately determine.

In bloed komen bijvoorbeeld proteasen voor, betrokken bij stolling, fibrinolyse, immunologische afweerreacties en weefselopbouw of afbraak-processen. Voorbeelden van dergelijke proteasen zijn thrombine, plasminogeen activatoren, plasminogeen, elastase en collagenase.Proteases, for example, are involved in blood, involved in clotting, fibrinolysis, immunological defense reactions and tissue building or breakdown processes. Examples of such proteases are thrombin, plasminogen activators, plasminogen, elastase and collagenase.

Deze proteasen zijn dikwijls in verschillende vormen aanwezig, nl. als inactief proenzym, actief enzym, enzym-inhibitor complexen en inactief enzym. Men is meestal in het actief vrij enzym geïnteresseerd, soms echter ook of vooral in het als proenzym of remmercomplex aanwezig enzym. Het bepalen van deze verschijningsvorm van het enzym is vaak moeilijk,bijv. doordat het actieve vrije enzym ook na monstername nog kan reageren met natuurlijke in het monster voorkomende remmers (fysiologische remmers) zodat de werkelijke waarde in het monster hoger zal zijn dan de in de test gemeten waarde.These proteases are often present in various forms, namely as inactive proenzyme, active enzyme, enzyme inhibitor complexes and inactive enzyme. People are usually interested in the active free enzyme, but sometimes also or especially in the enzyme present as a proenzyme or inhibitor complex. Determining this appearance of the enzyme is often difficult, e.g. because the active free enzyme can still react after sampling with natural inhibitors (physiological inhibitors) present in the sample, so that the actual value in the sample will be higher than the value measured in the test.

Dit probleem kan zeer hinderlijk zijn, bijv. bij het bepalen van de plasminogeen activatoren t-PA (weefsel-type plasminogeen activator) en u-PA (urokinase) in bloed omdat deze enzymen in zeer lage concentraties voorkomen en er een zeer snelle fysiologische remmer in bloed bestaat. Ook bij een aantal stollings-enzymen zoals bijv. thrombine treedt dit probleem op.This problem can be very troublesome, e.g. when determining the plasminogen activators t-PA (tissue-type plasminogen activator) and u-PA (urokinase) in blood because these enzymes occur in very low concentrations and a very fast physiological inhibitor in blood. This problem also occurs with a number of clotting enzymes such as, for example, thrombin.

Plasminogeen activatoren zijn zeer specifieke serine proteasen die omzetting van plasminogeen in piasmine katalyseren. Piasmine is in staat bloedsto-lsels op te lossen door het daarin aanwezige fibrine af te breken. Er zijn verschillende plasminogeen-activatoren bekend, waarvan urokinase en weefseltype plasminogeen activator de belangrijkste zijn. In het bijzonder lijkt t-PA een rol te spelen bij de fibrinolyse in vivo, waarschijnlijk als gevolg van de specifieke affiniteit voor fibrine. In verband hiermee is er behoefte aan een betrouwbare en eenvoudige methode voor het bepalen van de concentratie actief t-PA in lichaamsvloeistoffen, in het bijzonder bloed, van zowel gezonde mensen als van patiënten met bepaalde afwijkingen. Te denken valt hierbij aan op jonge leeftijd optredende thrombose of onverklaarbare bloedingen.Plasminogen activators are very specific serine proteases that catalyze the conversion of plasminogen to plasmin. Piasmine is capable of dissolving blood tissues by breaking down the fibrin contained therein. Several plasminogen activators are known, the most important of which are urokinase and tissue type plasminogen activator. In particular, t-PA appears to play a role in in vivo fibrinolysis, probably due to its specific affinity for fibrin. In this connection, there is a need for a reliable and simple method for determining the concentration of active t-PA in body fluids, especially blood, of both healthy people and patients with certain abnormalities. This could include thrombosis or unexplained bleeding at a young age.

In lichaamsvloeistoffen kan t-PA, evenals andere proteasen, in verschillende vormen voorkomen, namelijk als actief vrij enzym, als inactief vrij enzym en als inactief complex met fysiologisch voorkomende remmers. Voor in vivo fibrinolyse is waarschijnlijk slechts het actieve vrije t-PA van belang.In body fluids, t-PA, like other proteases, can exist in various forms, namely as an active free enzyme, as an inactive free enzyme, and as an inactive complex with physiologically occurring inhibitors. For in vivo fibrinolysis, probably only the active free t-PA is important.

Er kunnen twee verschillende type bepalingen voor t-PA worden onderscheiden: immunologische en functionele. Bij immunologische bepalingen wordt de hoeveelheid van plasminogeen activator antigeen bepaald. Afhankelijk van het gebruikte antilichaam wordt ofwel totaal t-PA antigeen, ofwel een of meer van de t-PA vormen, actief vrij t-PA, inactief vrij t-PA, of inactief t-PA in complex met remmers bepaald. Bij functionele bepalingen wordt alleen actief vrij t-PA bepaald.Two different types of assays for t-PA can be distinguished: immunological and functional. In immunological assays, the amount of plasminogen activator antigen is determined. Depending on the antibody used, either total t-PA antigen, or one or more of the t-PA forms, active free t-PA, inactive free t-PA, or inactive t-PA in complex with inhibitors is determined. In functional determinations, only active free t-PA is determined.

Van beide typen bepalingsmethoden zijn een aantal voorbeelden bekend. Een probleem bij deze bepalingsmethoden blijft echter het bepalen van actief vrij t-PA in lichaamsvloeistoffen zoals bijv. bloed. Het is namelijk gebleken dat in dergelijke vloeistoffen vaak remmers voorkomen die met actief vrij t-PA kunnen reageren na het moment van bloedafname en zo de hoeveelheid actief vrij t-PA verlagen waardoor een onjuiste waarde wordt gemeten. In de klinische praktijk blijkt een snelle gestandaardiseerde bloedafname procedure om deze problemen op te lossen, moeilijk te realiseren.A number of examples of both types of determination methods are known. However, a problem with these assay methods remains the determination of active free t-PA in body fluids such as eg blood. Namely, it has been found that such fluids often contain inhibitors that can react with active free t-PA after the time of blood collection and thus reduce the amount of active free t-PA, thereby measuring an incorrect value. In clinical practice, a fast standardized blood collection procedure to solve these problems has proved difficult to achieve.

Doel van de uitvinding is om de betrouwbaarheid van werkwijzen voor het bepalen van de concentratie van een actief vrij enzym, zoals in het bijzonder de proteasen t-PA en u-PA, in een biologische vloeistof, zoals bloed en weefselkweekmedia, waarin ook een of meer fysiologische remmers van het enzym voorkomen, te vergroten en met name minder afhankelijk te maken van de tijd die tussen het moment van monstername en het tijdstip van de bepaling verstrijkt.The object of the invention is to improve the reliability of methods for determining the concentration of an active free enzyme, such as in particular the proteases t-PA and u-PA, in a biological fluid, such as blood and tissue culture media, in which also one or more prevent, increase and in particular make less physiological inhibitors of the enzyme dependent on the time elapsing between the time of sampling and the time of the determination.

Dit doel wordt volgens de uitvinding gerealiseerd met een werkwijze van het in de aanhef vermelde type, welke gekenmerkt wordt doordat men, wanneer de te bepalen verschijningsvorm het actieve enzym in vrije toestand is, tijdens of nagenoeg direkt na het afscheiden van het monster, en wanneer de te bepalen verschijningsvorm een pro-enzym of een enzym-inhibitor complex is, ten laatste nagenoeg direkt na activering daarvan, voldoende van een van een detecteerbare groep voorziene remmer van het enzym in het monster brengt om in hoofdzaak alle aanwezig actief vrij enzym te binden voordat het kan reageren met in het monster aanwezige fysiologische remmers, en men op een later tijdstip middels een immunologische bepaling de hoeveelheid van het aldus gebonden actief vrij enzym vaststelt.This object is achieved according to the invention by a method of the type stated in the opening paragraph, which is characterized in that, when the phenomenon to be determined is the active enzyme in free state, during or almost immediately after the sample has been separated, and when the appearance to be determined is a proenzyme or an enzyme inhibitor complex, at least almost immediately after its activation introduces enough of a detectable group inhibitor of the enzyme into the sample to bind substantially all of the active free enzyme present before it can react with physiological inhibitors present in the sample, and the amount of the active free enzyme thus bound is subsequently determined by means of an immunological determination.

Volgens de uitvinding wordt, wanneer de te bepalen verschijningsvorm het actieve enzym in vrije toestand is, het monster direkt geincubeerd met een overmaat remmer van het desbetreffende enzym. Deze remmer bevat minimaal twee reactieve groepen waarvan er één met een zekere specificiteit reageert met het actief centrum van het enzym en één hetzij een label bevat dat specifiek kan worden aangetoond, zoals een radioisotoop, hetzij anderszins herkenbaar is, zoals door middel van een specifieke interactie met een reagens dat een detecteerbaar label bevat. Doordat alleen vrij en actief enzym met de remmer zal reageren, wordt alleen dit gelabeld en dus ook later bepaald.According to the invention, when the form to be determined is the active enzyme in the free state, the sample is immediately incubated with an excess inhibitor of the enzyme concerned. This inhibitor contains at least two reactive groups, one of which reacts with a certain specificity with the active center of the enzyme and one either contains a label that can be specifically identified, such as a radioisotope, or is otherwise recognizable, such as by a specific interaction with a reagent containing a detectable label. Because only free and active enzyme will react with the inhibitor, only this is labeled and therefore also determined later.

Door een snelle reactie met het actief vrij enzym in het monster wordt reactie met fysiologische remmers of andere inactivering na de monstername of tijdens opslag van het monster voorkomen. De remmer is bij voorkeur een voor het te bepalen enzym specifieke, niet-macromoleculaire remmer. Macromoleculaire stoffen, zoals antilichamen die met het actief centrum van het te bepalen enzym reageren, zijn voor gebruik als remmer volgens de uitvinding minder geschikt. Redenen hiervoor zijn dat 1) de reactiesnelheid van een vrij enzym met een groot molekuul zoals een antilichaam laag is, waardoor een hoge concentratie van het antilichaam nodig zou zijn; 2) antilichamen niet erg stabiel zijn bij transport en opslag, 3) de gevoeligheid van de bepaling vrij laag is, 4) een antilichaam-antigeen reactie reversibel is, zodat de reactie met fysiologische remmers mogelijk blijft, vooral als deze laatsten irreversibel werken.A rapid reaction with the active free enzyme in the sample prevents reaction with physiological inhibitors or other inactivation after sampling or during sample storage. The inhibitor is preferably a non-macromolecular inhibitor specific for the enzyme to be determined. Macromolecular substances, such as antibodies which react with the active center of the enzyme to be determined, are less suitable for use as an inhibitor according to the invention. The reasons for this are that 1) the reaction rate of a free enzyme with a large molecule such as an antibody is low, which would require a high concentration of the antibody; 2) antibodies are not very stable during transport and storage, 3) the sensitivity of the assay is quite low, 4) an antibody-antigen reaction is reversible, so that the reaction with physiological inhibitors remains possible, especially if the latter act irreversibly.

In de onderhavige uitvinding worden deze problemen ondervangen door gebruik te maken van laag moleculaire synthetische remmers, die zeer snel met actief vrij enzym, zoals de hier verder vooral als voorbeeld genomen proteasen reageren, in hoge molaire concentraties aanwezig zijn en stabiel zijn tijdens transport en opslag. Voor deze remmers is van belang dat zij een hoge affiniteit voor het doelenzym hebben, snel reageren, in elk geval veel sneller dan de concurrerende fysiologische remmers, bij voorkeur een covalente binding met het enzym aangaan, stabiel zijn bij opslag en transport, en bij voorkeur een grote mate van specificiteit vertonen voor het doelenzym. Veel van de enzymen voorkomend in biologische vloeistoffen behoren tot de proteasen. Verschillende typen proteasen worden gevonden zoals serineproteasen, thiolproteasen, asparaginezuur proteasen en metalloproteasen. De in bloed voorkomende stollings-en fibriolyse- (pro-)enzymen zoals thrombine, plasminogeen, tissue-type plasminogeen activator (t-PA) en urokinase (u-PA), zijn serine-proteasen. Een belangrijk thiolprotease is cathepsine B uit de lysosomen. Het maagenzym pepsine behoort tot de groep van asparaginezuur proteasen, terwijl collagenase, o.a. betrokken bij botmetabolisme, een metalloprotease is. Voor vele enzymen in elk van deze groepen zijn remmers bekend, vaak met hoge affiniteit en grote specificiteit. Zo worden serine proteasen onder andere geremd door organische fluorofosfaten (zoals diisopropylfluorofosfaat), sulfonylfluorides (zoals fenylmethaansulfonylfluoride) en peptidylhalo-methylketonen. Thioproteasen zijn ook te remmen door peptidylhalomethylketonen, peptidyldiazomethanen of peptidylaldehydes. Voor diverse asparaginezuurproteasen zijn inhibitors beschreven, vaak gebaseerd op gemodificeerde peptiden zoals statine en pepstatine. Ook voor metalloproteasen zijn inhibitors bekend, gebaseerd op aldehyde of keton afgeleiden van aminozuren of peptiden, of gebaseerd op fosforbevattende peptide analogen. In het algemeen zijn naast een reactieve groep die met het actieve centrum reageert ook één of meer groepen aanwezig die de specificiteit voor het doelenzym vergroten of bepalen. Hiervoor kunnen korte peptiden zeer geschikt zijn. Zo is bekend dat D-Phe-Pro-Arg-Chloromethylketon (PPACK) een uitstekende remmer van thrombine en t-PA is, terwijl urokinase (u-PA), een andere plasminogeen activator die voorkomt in bloed, hier vrij traag mee reageert. D-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon daarentegen is een zeer goede remmer van u-PA terwijl t-PA hier traag mee reageert.In the present invention, these problems are overcome by using low molecular weight synthetic inhibitors which react very quickly with active free enzyme such as the proteases especially exemplified herein, are present in high molar concentrations and are stable during transport and storage . It is important for these inhibitors that they have a high affinity for the target enzyme, react quickly, in any case much faster than the competing physiological inhibitors, preferably enter into a covalent bond with the enzyme, be stable in storage and transport, and preferably exhibit a high degree of specificity for the target enzyme. Many of the enzymes found in biological fluids are among the proteases. Different types of proteases have been found, such as serine proteases, thiol proteases, aspartic proteases and metalloproteases. The blood-clotting and fibriolysis (pro) enzymes such as thrombin, plasminogen, tissue-type plasminogen activator (t-PA) and urokinase (u-PA) are serine proteases. An important thiol protease is cathepsin B from the lysosomes. The gastric enzyme pepsin belongs to the group of aspartic acid proteases, while collagenase, inter alia involved in bone metabolism, is a metalloprotease. Inhibitors are known for many enzymes in each of these groups, often with high affinity and high specificity. For example, serine proteases are inhibited by organic fluorophosphates (such as diisopropyl fluorophosphate), sulfonyl fluorides (such as phenylmethanesulfonyl fluoride) and peptidyl halomethyl ketones, among others. Thioproteases can also be inhibited by peptidyl halomethyl ketones, peptidyl diazomethanes or peptidyl aldehydes. Inhibitors have been described for various aspartic proteases, often based on modified peptides such as statin and pepstatin. Inhibitors are also known for metalloproteases, based on aldehyde or ketone derivatives of amino acids or peptides, or based on phosphorus-containing peptide analogues. In general, in addition to a reactive group that reacts with the active center, one or more groups are also present that increase or determine the specificity for the target enzyme. Short peptides can be very suitable for this. For example, D-Phe-Pro-Arg-Chloromethylketone (PPACK) is known to be an excellent inhibitor of thrombin and t-PA, while urokinase (u-PA), another plasminogen activator found in blood, reacts with it quite slowly. D-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketone, on the other hand, is a very good inhibitor of u-PA while t-PA reacts slowly with it.

Door een geschikte combinatie van reactieve groep en peptide kan voor vele enzymen een goede specificiteit worden bereikt.A good specificity can be achieved for many enzymes by a suitable combination of reactive group and peptide.

In de onderhavige uitvinding worden derivaten van dergelijke synthetische remmers beschreven die naast de functionele groepen, nodig voor remming en specifieke herkenning van het enzym ook nog een later op eenvoudige en gevoelige wijze detecteerbaar label of anderszins herkenbare groep bevatten. Verschillende typen labels of herkenbare groepen kunnen worden gebruikt, zoals radioactieve isotopen, fluorescerende groepen (bijv. dansylgroep), met behulp van antilichamen detecteerbare haptenen (bijv. trinitrobenzeen), biotine(derivaten) die met behulp van (strept)avidine te detecteren zijn, enzymen die een detecteerbaar product leveren, of andere met behulp van fysische-, chemische-, biologische-, of immunologische methoden detecteerbare of detecteerbaar te maken groepen.The present invention describes derivatives of such synthetic inhibitors which, in addition to the functional groups necessary for inhibition and specific recognition of the enzyme, also contain a label or otherwise recognizable group which can be detected in a simple and sensitive manner. Different types of labels or recognizable groups can be used, such as radioactive isotopes, fluorescent groups (e.g. dansyl group), antibodies detectable haptens (e.g. trinitrobenzene), biotin (derivatives) detectable by (strept) avidin, enzymes providing a detectable product, or other groups detectable or detectable by physical, chemical, biological or immunological methods.

Wanneer het monster direct na of zelfs tijdens de monstername in contact wordt gebracht met een remmerderi-vaat van genoemd type reageert dus het aanwezige vrije protease, zoals t-PA onmiddellijk irreversibel met dit derivaat. Aldus wordt niet alleen de reactie met in het monster aanwezige fysiologische remmers voorkomen, maar wordt ook het aanwezige vrije t-PA voorzien van een detecteerbaar label.Thus, when the sample is contacted immediately after or even during sampling with an inhibitor derivative of said type, the free protease present, such as t-PA, immediately irreversibly reacts with this derivative. Thus, not only is the reaction with physiological inhibitors present in the sample prevented, but the free t-PA present is also provided with a detectable label.

Hierdoor is de hoeveelheid vrij t-PA die ten tijde van de monstername aanwezig was later te onderscheiden van het in andere vormen aanwezige t-PA. De procedure van monstername en opslag wordt hierdoor zeer vereenvoudigd. Indien men een proenzym of een inactief remmercomplex wenst te meten kan men, vóór dat men het remmerderivaat toevoegt een geschikte activeringsstap uitvoeren om het inactieve proenzym of remmercomplex om te zetten in actief enzym. Wanneer men de concentratie van het proenzym of het remmercomplex, exclusief de concentratie van het actief vrij enzym, wil bepalen kan men bijv. een aparte meting van het actief vrij enzym uitvoeren, waarbij het verschil tussen de twee meetresultaten informatie geeft over de gezochte concentratie, of kan men een bijdrage aan het meetresultaat door het actief vrij enzym verhinderen, bijv. door direkt bij de monstername remmer zonder herkenbare groep toe te voegen.This makes it possible to distinguish the amount of free t-PA that was present at the time of sampling from the t-PA present in other forms. This greatly simplifies the sampling and storage procedure. If one wishes to measure a proenzyme or an inactive inhibitor complex, before adding the inhibitor derivative, an appropriate activation step can be performed to convert the inactive proenzyme or inhibitor complex into active enzyme. If one wants to determine the concentration of the proenzyme or the inhibitor complex, excluding the concentration of the active free enzyme, one can, for example, perform a separate measurement of the active free enzyme, whereby the difference between the two measurement results provides information about the concentration sought, or can a contribution to the measurement result be prevented by the active free enzyme, for instance by directly adding an inhibitor to the sample without recognizing a group.

De volgens de uitvinding te gebruiken, gelabelde remmer kan gemakkelijk volgens gangbare technieken worden bereid. Hiertoe gaat men bijv. uit van commercieel verkrijgbare remmer preparaten met een specificiteit, geschikt voor het te bepalen enzym. Voor t-PA valt hierbij te denken aan bijv. D-Phe-Pro-Arg-chloromethyl-keton, terwijl voor u-PA Glu-Gly-Arg-chloromethylketon geschikter is. Aan een dergelijke remmer wordt een detecteerbare groep gekoppeld, bijv. aan een vrije NH2~groep eventueel via een spacer van gewenste lengte.The labeled inhibitor to be used according to the invention can be easily prepared according to conventional techniques. For this purpose, one starts, for example, from commercially available inhibitor preparations with a specificity, suitable for the enzyme to be determined. For example, for t-PA, for example D-Phe-Pro-Arg-chloromethyl-ketone, while for u-PA Glu-Gly-Arg-chloromethyl-ketone is more suitable. A detectable group is coupled to such an inhibitor, e.g. to a free NH 2 group, optionally via a spacer of the desired length.

Een hiervoor geschikte groep is bijv. biotine dat als N-hydroxy-succinimidylbiotine aan de vrije aminogroep van bijv. bovengenoemde remmers is te koppelen. Omdat in waterige oplossing chloromethylketonen hun grootste stabiliteit hebben bij lage pH en de koppeling met N-hydroxysuccinimidylgroep bij voorkeur bij hoge pH geschiedt, is het raadzaam de koppeling uit te voeren in een organisch oplosmiddel. Een hiervoor geschikt oplosmiddel is methanol waaraan bij voorkeur een organische base zoals triethylamine is toegevoegd om de bij de koppelingsreactie vrijkomende protonen te binden.A suitable group for this purpose is, for example, biotin which can be coupled as N-hydroxy-succinimidylbiotin to the free amino group of, for example, the above inhibitors. Since chloromethyl ketones have the greatest stability at low pH in aqueous solution and the coupling with N-hydroxysuccinimidyl group is preferably at high pH, it is advisable to carry out the coupling in an organic solvent. A suitable solvent is methanol to which an organic base such as triethylamine is preferably added to bind the protons released in the coupling reaction.

De temperatuur waarbij de koppelingsreactie kan worden uitgevoerd is niet kritisch maar ligt bij voorkeur rond kamertemperatuur. Onder dergelijke omstandigheden is de koppeling na ongeveer 3 uur compleet. Het product kan worden gezuiverd, bijv. door middel van reversed phase HPLC gebruikmakend van een gradient startend met 0.1% trifluorazijnzuur in water en eindigend met 0.1% trifluorazijnzuur in acetonitril. Het oplosmiddel kan worden verwijderd door verdamping, bij voorkeur onder vacuum. Het product kan worden opgelost in een organisch oplosmiddel of in water. Methanol is hiervoor zeer geschikt.The temperature at which the coupling reaction can be carried out is not critical, but is preferably around room temperature. Under such conditions, the pairing is complete after about 3 hours. The product can be purified, e.g., by reversed phase HPLC using a gradient starting with 0.1% trifluoroacetic acid in water and ending with 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile. The solvent can be removed by evaporation, preferably under vacuum. The product can be dissolved in an organic solvent or in water. Methanol is very suitable for this.

In een concreet geval is gebruik gemaakt van de remmer D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon en het label biotine. Uitgaande van D-Phe-Pro-Arg-chloromethyl-keton en N-hydroxy-succinimidyl biotine werd het remmer derivaat hiotinyl-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon bereid door reactie van D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon 5 mM met N-hydroxysuccinimidylbiotine 5 mM in methanol met triethylamine 10 mM gedurende 0-24 h bij kamertemperatuur. Na verschillende reactietijden werden monsters genomen en werd met behulp van HPLC gebruikmakend van een reversed phase kolom en elutie met een gradient lopend van 0.1% trifluorazijnzuur in water naar 0.1% trifluorazijnzuur in acetonitril, de omzetting gecontroleerd. De pieken van de beide uitgangsmaterialen bleken duidelijk af te nemen en er verscheen een piek van het koppelings-product. Na ca. 3 h incubatie was de omzetting maximaal.In a specific case, the inhibitor D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketone and the label biotin have been used. Starting from D-Phe-Pro-Arg-chloromethyl-ketone and N-hydroxy-succinimidyl biotin, the inhibitor derivative hiotinyl-Phe-Pro-Arg-chloromethylketone was prepared by reacting D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketone 5 mM with N -hydroxysuccinimidylbiotin 5 mM in methanol with triethylamine 10 mM for 0-24 h at room temperature. After different reaction times, samples were taken and the conversion was checked by HPLC using a reversed phase column and elution with a gradient ranging from 0.1% trifluoroacetic acid in water to 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile. The peaks of both starting materials were clearly reduced and a peak of the coupling product appeared. After about 3 h of incubation, the conversion was maximum.

Het product kon gezuiverd worden met behulp van preparatieve HPLC als boven geschetst. Het biotinyl-PPACK is een uitstekende remmer van t-PA, vergelijkbaar met PPACK zelf.The product could be purified by preparative HPLC outlined above. The Biotinyl PPACK is an excellent inhibitor of t-PA, similar to PPACK itself.

Aan een t-PA bevattend monster, waarvan men de concentratie aan vrij t-PA wil bepalen, wordt overmaat biotinyl-PPACK toegevoegd, bij voorkeur in een concentratie van Ο.Ι-Ι,ηΜ om een voldoend snelle reactie tussen t-PA en remmer te bereiken. Hierna volgt een bepaling sterk gelijkend op een traditionele enzym immunoassay.To a t-PA containing sample, the concentration of free t-PA of which is to be determined, excess biotinyl-PPACK is added, preferably in a concentration of Ο.Ι-Ι, ηΜ to ensure a sufficiently fast reaction between t-PA and inhibitor. An assay follows closely similar to a traditional enzyme immunoassay.

Er wordt gebruik gemaakt van houders van kunststof, bijv. polyvinylchloride of polystyreen houders, bij voorkeur in de vorm van buizen of microtiter platen met een aantal afzonderlijke putjes. Deze houders worden gecoat met mono- of polyclonale antilichamen tegen t-PA en nagecoat met bijv. runderserum albumine volgens daarvoor gangbare procedures. Aan de gecoate houders worden monsters toegevoegd die met biotinyl-PPACK gelabeld t-PA bevatten. Na incubatie onder schudden gedurende 1-24 h in een buffer die daarvoor geschikt is zoals een 10 mM fosfaatbuffer met pH van bijv. 7.5, bij voorkeur bevattend 5 mM Ethyleendiaminotetraacetaat en een detergens zoals Tween 20 5 g/1, worden de houders een aantal malen gewassen met dezelfde of een overeenkomstige buffer. Hierna wordt er streptavidine of avidine, gekoppeld aan een enzym zoals mierikswortelper-oxidase of alkalische fosfatase toegevoegd en gedurende 1-4 h geïncubeerd bij bijv. kamertemperatuur onder schudden. De houders worden weer gewassen met een geschikte buffer en tenslotte geïncubeerd met een geschikt substraat voor mierikswortelperoxidase of alkalische fosfatase, waaruit een gekleurd product ontstaat. Zoals in enzym immunoassays is de concentratie in een bepaald gebied bij benadering evenredig met de hoeveelheid vrij t-PA in het oorspronkelijke monster. De detectie-limiet van de onderhavige methode is zodanig dat meting van fysiologische concentraties t-PA in bloed of andere lichaamsvloeistoffen mogelijk is.Plastic containers are used, e.g. polyvinyl chloride or polystyrene containers, preferably in the form of tubes or microtiter plates with a number of separate wells. These containers are coated with mono- or polyclonal antibodies to t-PA and postcoated with, e.g., bovine serum albumin according to conventional procedures. Samples containing biotinyl-PPACK labeled t-PA are added to the coated containers. After incubation with shaking for 1-24 h in a suitable buffer such as a 10 mM phosphate buffer with a pH of e.g. 7.5, preferably containing 5 mM Ethylenediaminotetraacetate and a detergent such as Tween 20 5 g / l, the containers are washed with the same or a corresponding buffer. Streptavidin or avidin, coupled to an enzyme such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, is then added and incubated for 1-4 h at e.g. room temperature with shaking. The containers are again washed with a suitable buffer and finally incubated with a suitable substrate for horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, from which a colored product is formed. As in enzyme immunoassays, the concentration in a given region is approximately proportional to the amount of free t-PA in the original sample. The detection limit of the present method is such that measurement of physiological concentrations of t-PA in blood or other body fluids is possible.

Het grote voordeel van de onderhavige methode boven bestaande procedures is, dat de situatie die in het monster op een zeker moment bestaat, bij voorkeur direct na of tijdens opvangen, dan wel op een ander geschikt moment zoals na activatie van proenzym of remmercomplex, kan worden gefixeerd, waarna op een daarvoor geschikt tijdstip de eigenlijke bepaling kan worden uitgevoerd. Voor routine bepalingen van grote aantallen monsters wordt de bepaling bij voorkeur uitgevoerd in microtiterplaten en worden de metingen verricht met speciale meerkanaals fotometers, eventueel gekoppeld aan een computer voor data-opslag en verwerking.The major advantage of the present method over existing procedures is that the situation that exists in the sample at a certain moment, preferably immediately after or during collection, or at another suitable moment such as after activation of proenzyme or inhibitor complex, can be fixed, after which the actual determination can be made at a suitable time. For routine determination of large numbers of samples, the determination is preferably performed in microtiter plates and measurements are made with special multichannel photometers, optionally coupled to a computer for data storage and processing.

De bepaling kan echter ook in buizen of cuvetten worden verricht. De specificiteit van de onderhavige methode wordt op twee punten bepaald, namelijk door de keuze van het remmerderivaat en door de keuze van het polyclonale-of monoclonale antilichaam bij de detectie. Door aanpassing hetzij van het remmerderivaat hetzij van het antilichaam of beide, kan de bepaling geschikt gemaakt worden voor andere proteasen. Hierbij valt te denken aan (pro-) enzymen voorkomend in bijv. stolling of fibrinolyse zoals plasminogeen, u-PA, t-PA, (pro)throm-bine, maar het hier beschreven principe is algemeen toepasbaar. Andere voorbeelden van enzymen die op een dergelijke manier zouden kunnen worden bepaald, zijn naast de serineproteasen, de thiolproteasen zoals cathepsine B waarbij derivaten van Phe-Phe-Arg-chloro-methylketon als remmers kunnen worden gebruikt, aspartaat-proteasen als renine met derivaten van statine als remmer, metalloproteasen als collagenase en angiotensine converterend enzym met bijv. ketoraethyleen- en amino-ketonpeptide derivaten.However, the determination can also be made in tubes or cuvettes. The specificity of the present method is determined in two points, namely by the choice of the inhibitor derivative and by the choice of the polyclonal or monoclonal antibody in the detection. By modifying either the inhibitor derivative or the antibody or both, the assay can be made suitable for other proteases. Examples are (pr) enzymes occurring in, for example, coagulation or fibrinolysis such as plasminogen, u-PA, t-PA, (pro) thrombin, but the principle described here is generally applicable. Other examples of enzymes that could be determined in such a way are, in addition to the serine proteases, the thiol proteases such as cathepsin B where derivatives of Phe-Phe-Arg-chloromethylketone can be used as inhibitors, aspartate proteases such as renin with derivatives of statin as inhibitor, metalloproteases as collagenase and angiotensin converting enzyme with e.g. ketoraethylene and amino ketone peptide derivatives.

De uitvinding verschaft verder een kit-type combinatie van middelen voor het uitvoeren van de bepalingsmethode volgens de uitvinding, omvattende (a) een van een detecteerbare groep voorziene remmer van het te bepalen actief vrij enzym; en (b) een polyklonaal of monoklonaal antilichaam tegen het te bepalen actief vrij enzym.The invention further provides a kit-type combination of means for carrying out the assay method of the invention, comprising (a) a detectable group inhibitor of the active free enzyme to be assayed; and (b) a polyclonal or monoclonal antibody against the active free enzyme to be determined.

Dergelijke kits zullen doorgaans, naast een met (a) gevulde houder en een met (b) gevulde houder, nog andere middelen en een of meer werkvoorschriften/ge-bruiksaanwijzingen bevatten.Typically, such kits will contain, in addition to a (a) -filled container and a (b) -filled container, other means and one or more work / operating instructions.

Bij andere middelen kan bijv. gedacht worden aan een houder, gevuld met een bufferoplossing die desgewenst ook een preservatief en een oppervlakte actieve stof bevat; bij gebruik van een met biotine(derivaat) of hapteen gelabeld remmer derivaat, een houder met een afgemeten hoeveelheid van (bij voorkeur met een enzym) gelabeld streptavidine of avidine respectievelijk met een enzym gekoppeld monoklonaal- of polyklonaal antilichaam tegen het hapteen; bij gebruik van een op een enzymatische reactie gebaseerde detectie, houders met een voor een dergelijk enzym, bijv. mierikswortel-peroxidase of alkalische fosfatase, geschikt substraat, alsmede houders omvattende incubatievloeistof voor de uitvoering van de omzetting van dit substraat.Other means can for instance be considered a container filled with a buffer solution which, if desired, also contains a preservative and a surfactant; when using a biotin (derivative) or hapten-labeled inhibitor derivative, a container containing a measured amount of (preferably with an enzyme) labeled streptavidin or avidin or an enzyme-linked monoclonal or polyclonal antibody to the hapten; when using an enzymatic reaction-based detection, containers with a substrate suitable for such an enzyme, e.g., horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, as well as containers containing incubation liquid for carrying out the conversion of this substrate.

Een combinatie volgens de uitvinding kan ook een houder omvatten met een afgemeten hoeveelheid van het te bepalen enzym of proenzym, om controle metingen mogelijk te maken.A combination according to the invention may also comprise a container with a measured amount of the enzyme or proenzyme to be determined, to allow control measurements.

Tenslotte omvat de uitvinding ook van een detecteerbare groep voorziene remmers van een actief vrij enzym, welke voor gebruik in de werkwijze volgens de uitvinding geschikt zijn.Finally, the invention also includes detectable group of inhibitors of an active free enzyme, which are suitable for use in the method of the invention.

De uitvinding wordt aan de hand van een voorbeeld nader toegelicht.The invention is explained in more detail by means of an example.

VOORBEELDEXAMPLE

(a) Remming t-PA(a) Inhibition t-PA

Men incubeerde een oplossing bevattende 5 IU/ml t-PA, met 1 uM van een gezuiverd biotinyl-PPACK preparaat gedurende enkele minuten bij een temperatuur tussen 0 en 37°C, bij voorkeur bij kamertemperatuur.A solution containing 5 IU / ml t-PA, with 1 µM of a purified biotinyl-PPACK preparation, was incubated for a few minutes at a temperature between 0 and 37 ° C, preferably at room temperature.

Hierna werd de overgebleven t-PA activiteit gemeten met een daartoe bekende methode. De t-PA activiteit bleek vrijwel volledig door het remmerpreparaat te worden geremd. Dit betekent dat het remmerpreparaat in staat is om een covalent complex te vormen met het actief centrum van t-PA.The remaining t-PA activity was then measured by a known method. The t-PA activity was found to be almost completely inhibited by the inhibitor preparation. This means that the inhibitor preparation is able to form a covalent complex with the active center of t-PA.

(b) Bepaling van t-PA(b) Determination of t-PA

Aan een t-PA bevattend monster werd biotinyl-FPACK als remmerpreparaat toegevoegd en er werd geïncubeerd als onder (a). Een oplossing, bevattende 10 ug/ml van polyklonale antilichamen die tegen t-PA waren opgewekt (verkrijgbaar bij Biopool, Zweden) in 0.1 M NaHCOg, pH 9.6 werd gedurende ongeveer 20 h bij kamertemperatuur onder schudden in contact gebracht met de putjes van een PVC microtiterplaat. Een volume van 0.10 ml van een dergelijke oplossing per putje was hiervoor zeer geschikt. Een nacoating met bijv. lQmg/1 runderserum-albumine in dezelfde buffer gedurende enkele uren bleek zeer aan te bevelen.Biotinyl FPACK as an inhibitor preparation was added to a t-PA sample and incubated as under (a). A solution containing 10 µg / ml of polyclonal antibodies raised against t-PA (available from Biopool, Sweden) in 0.1 M NaHCOg, pH 9.6 was contacted with the wells of a PVC for about 20 h at room temperature with shaking microtiter plate. A volume of 0.10 ml of such a solution per well was very suitable for this. A re-coating with, for example, 1 mg / 1 bovine serum albumin in the same buffer for a few hours was highly recommended.

In putjes van een op deze wijze gecoate microtiterplaat werden verschillende hoeveelheden van een met biotinyl-PPACK remmerpreparaat geïncubeerd monster gebracht. Het volume werd gebracht op 0.10 ml per putje met een buffer bevattende 10 mM natriumfosfaat, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA en 0.5 g/1 Tween 20. De plaat werd overnacht bij kamertemperatuur licht geschud.Different amounts of a sample incubated with biotinyl-PPACK inhibitor preparation were placed in wells of a microtiter plate coated in this manner. The volume was adjusted to 0.10 ml per well with a buffer containing 10 mM sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA and 0.5 g / l Tween 20. The plate was shaken slightly overnight at room temperature.

Na legen van de putjes werden deze drie maal gewassen met 0.15 ml van dezelfde buffer. Vervolgens werd per putje 0,10 ml van een oplossing van streptavidine-mieriks-wortelperoxidase conjugaat toegevoegd in dezelfde buffer. Na incubatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur werd de plaat weer driemaal met dezelfde buffer gewassen. Hierna werd per putje 0.10 ml van een oplossing van tetramethylbenzidine in een ureumperoxide bevattende buffer toegevoegd. Na incubatie gedurende 0-2 uur bij 25°C werd 0.05 ml 2 M H2SO4 toegevoegd en de extinctie gemeten bij 450 nm met behulp van een meerkanaals fotometer. Het bleek dat de gemeten extinctie nagenoeg lineair toenam met de hoeveelheid vrij t-PA in het monster.After emptying the wells, they were washed three times with 0.15 ml of the same buffer. Then, 0.10 ml of a solution of streptavidin-horseradish peroxidase conjugate was added per well in the same buffer. After incubation for 2 hours at room temperature, the plate was again washed three times with the same buffer. After this, 0.10 ml of a solution of tetramethylbenzidine in a urea peroxide-containing buffer was added per well. After incubation for 0-2 hours at 25 ° C, 0.05 ml 2 M H 2 SO 4 was added and the absorbance measured at 450 nm using a multi-channel photometer. It was found that the measured absorbance increased almost linearly with the amount of free t-PA in the sample.

(c) Kit voor t-PA bepaling Een "kit" voor 96 bepalingen als beschreven onder (b) omvat:(c) Kit for t-PA assay A "kit" for 96 assays as described under (b) includes:

Een microtiterplaat gecoat en nagecoat volgens (b), voorzien van een stabilisator zoals mannitol. Een houder bevattende een voldoend grote hoeveelheid (O.lOyumol) biotinyl-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon in droge vorm dan wel opgelost in 1.0 ml methanol. Een houder bevattende 0.50 ml tetramethylbenzidine in vloeibare vorm. Een houder bevattende een afgepaste hoeveelheid ureumperoxide, bij voorkeur in tabletvorm. Eventueel een houder bevattende een bekende hoeveelheid gezuiverd t-PA in droge vorm waaraan water moet worden toegevoegd, voor het doen van controle metingen. Een werkvoorschrift volgens (b) en een voorschrift voor het voorbereiden van de monsters en opvangen van bloed. Inplaats van remmerpre-paraat in een voorraadhouder, kan de kit ook 96 gebruiksklare bloedopvangbuizen bevatten, bijv. van het vacuumtype, waarin zich een afgemeten hoeveelheid antistollings-middel zoals natriumcitraat en een afgemeten hoeveelheid biotinyl-phe-pro-arg-chloromethylketon bevinden.A microtiter plate coated and postcoated according to (b), provided with a stabilizer such as mannitol. A container containing a sufficiently large amount of (0.10Yumol) biotinyl-Phe-Pro-Arg-chloromethylketone in dry form or dissolved in 1.0 ml of methanol. A container containing 0.50 ml of tetramethylbenzidine in liquid form. A container containing a metered amount of urea peroxide, preferably in tablet form. Optionally a container containing a known amount of purified dry form t-PA to which water is to be added for control measurements. A working instruction according to (b) and a regulation for preparing the samples and collecting blood. In place of inhibitor formulation in a storage container, the kit may also contain 96 ready-to-use blood collection tubes, e.g. of vacuum type, containing a measured amount of anticoagulant such as sodium citrate and a measured amount of biotinyl-phe-pro-chloromethyl ketone.

Claims (12)

1. Werkwijze voor het bepalen van de concentratie van een verschijningsvorm van een enzym in een biologische vloeistof door van de vloeistof een monster af te scheiden en in dit monster met behulp van een immunologische bepalingsmethode het gehalte van de verschijningsvorm van het enzym te bepalen, met het kenmerk, dat men, wanneer de te bepalen verschijningsvorm het actieve enzym in vrije toestand is, tijdens of nagenoeg direkt na het afscheiden van het monster, en wanneer de te bepalen verschijningsvorm een pro-enzym of een enzym-inhibitor complex is, ten laatste nagenoeg direkt na activering daarvan, voldoende van een van een detecteerbare groep voorziene remmer van het enzym in het monster brengt om in hoofdzaak alle aanwezig actief vrij enzym te binden voordat het kan reageren met in het monster aanwezige fysiologische remmers, en men op een later tijdstip middels een immunologische bepaling de hoeveelheid van het aldus gebonden actief vrij enzym vaststelt.Method for determining the concentration of an enzyme's appearance in a biological liquid by separating a sample from the liquid and determining the content of the enzyme's appearance in this sample by means of an immunological determination method, with characterized in that, when the form to be determined is the active enzyme in the free state, during or almost immediately after the sample has been separated, and when the form to be determined is a proenzyme or an enzyme inhibitor complex, at the latest substantially immediately after activation thereof, introduces enough of a detectable inhibitor of the enzyme into the sample to bind substantially all of the active free enzyme present before it can react with physiological inhibitors present in the sample, and is later determines the amount of the active free enzyme thus bound by immunological determination. 2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een voor het enzym specifieke, niet-macromoleculaire remmer toepast.2. Process according to claim 1, characterized in that an enzyme-specific, non-macromolecular inhibitor is used. 3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de concentratie in de biologische vloeistof bepaalt van het actieve enzym in vrije toestand door tijdens of nagenoeg direkt na het afscheiden van het monster de van een detecteerbare groep voorziene remmer toe te voegen en later middels een immunologische bepaling de hoeveelheid van het aan deze van een detecteerbare groep voorziene remmer gebonden actief vrij enzym vast te stellen.A method according to claim 1, characterized in that the concentration in the biological liquid of the active enzyme in the free state is determined by adding the inhibitor provided with a detectable group during or almost immediately after the sample has been separated and subsequently determine, by immunological determination, the amount of the active free enzyme bound to this inhibitor provided with a detectable group. 4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het enzym een protease is.A method according to claim 1, characterized in that the enzyme is a protease. 5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het enzym een serine-protease is.The method according to claim 1, characterized in that the enzyme is a serine protease. 6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men een organisch fluorofosfaat, een organisch sulfonylfluoride of een peptidylhalomethylketon als remmer toepast.6. Process according to claim 5, characterized in that an organic fluorophosphate, an organic sulfonyl fluoride or a peptidyl halomethyl ketone is used as inhibitor. 7. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men ter bepaling van actief vrij weefsel-type plasminogeen activator (t-PA) of van geactiveerd t-PA/ inhibitor complex D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon als remmer toepast.Method according to claim 5, characterized in that D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketone is used as inhibitor to determine active free tissue-type plasminogen activator (t-PA) or activated t-PA / inhibitor complex. 8. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men ter bepaling van actief vrij urokinase (u-PA) of van geactiveerd pro-u-PA D-Glu-Gly-Arg-chloro-methylketon als remmer toepast.Method according to claim 5, characterized in that D-Glu-Gly-Arg-chloro-methyl ketone is used as inhibitor to determine active free urokinase (u-PA) or activated pro-u-PA. 9. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-8, met het kenmerk, dat men een van biotine als herkenbare groep voorziene remmer toepast.Process according to any one of claims 1 to 8, characterized in that an inhibitor provided with biotin as a recognizable group is used. 10. Werkwijze voor het bepalen van de concentratie van actief vrij weefsel-type plasminogeen activator (t-PA) in bloed, door van het bloed een monster af te scheiden en in dit monster met behulp van een immunologische bepalingsmethode het gehalte van het actief vrij t-PA te bepalen, met het kenmerk, dat men nagenoeg direkt na het afscheiden van het monster voldoende biotinyl-phe-pro-arg-chloromethylketon in het monster brengt om in hoofdzaak alle aanwezig actief vrij t-PA te binden voordat het kan reageren met in het monster aanwezige fysiologische remmers, en men op een later tijdstip middels een immunologische bepaling de hoeveelheid van het aldus gebonden actief vrij t-PA vaststelt.10. Method for determining the concentration of active free tissue-type plasminogen activator (t-PA) in blood, by separating a sample from the blood and determining the content of the active free in this sample by means of an immunological determination method Determine t-PA, characterized in that sufficient biotinyl-phe-pro-arg-chloromethylketone is introduced into the sample almost immediately after the sample has been separated off to bind substantially all active free t-PA present before it can react with physiological inhibitors present in the sample, and the amount of the active free t-PA thus bound is subsequently determined by means of an immunological determination. 11. Kit-type combinatie van middelen voor het uitvoeren van de werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, omvattende (a) een van een detecteerbare groep voorziene remmer van het te bepalen actief vrij enzym; en (b) een polyklonaal of monoklonaal antilichaam tegen het te bepalen actief vrij enzym.Kit-type combination of means for carrying out the method according to any one of the preceding claims, comprising (a) a detectable group inhibitor of the active free enzyme to be determined; and (b) a polyclonal or monoclonal antibody against the active free enzyme to be determined. 12. Van een detecteerbare groep voorziene remmer van een actief vrij enzym, geschikt voor gebruik in de werkwijze volgens een der conclusies 1-10.A detectable group-inhibitor of an active free enzyme suitable for use in the method according to any one of claims 1-10.