NL8403195A - Immunogene complexen en vaccins die deze bevatten. - Google Patents

Description

N.0.32.810 1

Immunogene complexen en vaccins die deze bevatten

De uitvinding heeft betrekking op immunogene complexen, die zijn afgeleid van gezuiverde bacteriële of virale membraaneiwitten, alsmede 5 op vaccins die deze complexen bevatten.

De toepassing van gezuiverde bacteriële en virale membraaneiwitten als antigeen voor het immuniseren van mens en dier biedt bepaalde voordelen boven het toepassen van gehele cellen of delen daarvan. Door gezuiverde eiwitten te gebruiken, kan men namelijk componenten uitslui-10 ten, die ongewenste, bijvoorbeeld pyrogene reacties oproepen. Voorts kan men de eiwitten zodanig kiezen, dat deze zoveel mogelijk uitsluitend de gewenste immunogene eigenschappen bezitten en bovendien geen isogene variatie vertonen. Een nadeel van de gezuiverde membraaneiwitten, in het bijzonder van bacteriële buitenmembraaneiwitten is echter, 15 dat ze in het algemeen slechts een geringe immunogene activiteit bezitten.

Gevonden werd nu dat complexen van gezuiverde bacteriële of virale membraaneiwitten met detergentia een aanmerkelijk grotere immunogene werking vertonen. De uitvinding heeft dan ook betrekking op deze com-20 plexen, alsmede op vaccins die deze complexen bevatten.

Als detergentia zijn vooral 0-D-octylglucoside (hierna kortweg oc-tylglucoside genoemd) en Zwittergent 3-14 geschikt gebleken.

Zwittergent 3-14 is een detergens met be taïne-s tructuur, waarvan de chemische naam luidt: 3-(N-tetradecyl-N,N-dimethylammonium)-propaan-l-25 sulfonaat.

De uitvinding wordt hoofdzakelijk toegelicht aan de hand van detergentia-complexen van buitenmembraaneiwitten, die afgeleid zijn van Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis en Haemophilus influenzae. De uitvinding is daartoe echter niet beperkt.

30 Vooral met van gonococcen of meningococcen afgeleide porie-eiwit- ten zijn goede resultaten bereikt. Deze buitenmembraaneiwitten hebben voordelen boven andere immunogene eiwitten, omdat ze in grote hoeveelheden in het membraan aanwezig zijn. Zo maakt het porie-eiwit PI van N.gonorrhoeae ongeveer 50Z uit van de totale hoeveelheid op het buiten-35 membraan aanwezige eiwitten. Voorts is het voordelig, dat PI in alle gonococcenstammen aanwezig is, een minimale isogene variatie vertoont en dat een gedeelte van het molecuul uit het membraan steekt, waardoor het in staat is met antilichamen te reageren.

Gebleken is, dat PI van gonococcen met het detergens een complex 40 vormt in een gewichtsverhouding van ongeveer 2:1. Het complex is opge- §4 ö 3 j S 5 t * 2 bouwd uit een molecuul PI, in trimere vorm, en enkele honderden deter-gensmoleculen. De detergensmoleculen zorgen ervoor, dat het eiwit in in oplossing blijft en dat het hydrofiele deel van het eiwit, dat verantwoordelijk is voor de inductie van beschermende antistoffen, vol-5 doende wordt geëxposeerd. Bij de bereiding van de complexen kan een overmaat detergens worden gebruikt. Men kan bijvoorbeeld voor de bereiding van een complex uit gonococcen PI met octylglucoside een gewichtsverhouding van ongeveer 1:4 (eiwit:detergens) aanhouden. Bij toepassing van Zwittergent 3-14 is een goede verhouding ongeveer 2:3.

10 De uitvinding heeft eveneens betrekking op vaccins, die de immuno gene complexen volgens de uitvinding bevatten. De vaccins worden op gebruikelijke wijze bereid. Ze kunnen de gebruikelijke toevoegsels bevatten. Van deze toevoegsels kan aluminiumfosfaat worden genoemd, dat een adjuvans-werking vertoont.

15 Gebleken is, dat antisera tegen PI van gonococcen van serotype 1, 5 en 9 een aanmerkelijke kruisreactiviteit vertonen. Het is daarom voordelig in een vaccin eiwit-detergens-complexen op te nemen, waarvan de eiwitcomponent een mengsel is van Pi’s van gonococcen, die afgeleid zijn van een aantal verschillende serotypen, bijvoorbeeld van serotypen 20 1, 5 en 9. Hiermee wordt bereikt, dat het vaccin de vorming van anti-

licharaen zal induceren, die met PI van alle negen serotypen reageren. Voorbeeld I

Op gebruikelijke wijze werden gonococcenstammen B2 (serotype 1), C3 (serotype 5) en F6 (serotype 9) gekweekt. De culturen werden door 25 verwarming op 56°C gedurende 30 minuten geïnactiveerd. Na centrifugeren werden de bacteriën gelyofiliseerd. De cel-vrije cultuurvloeistof werd gebruikt voor de bereiding van buitenmembraancomplexen (OMC), terwijl uit de gelyofiliseerde bacteriën gezuiverd PI werd bereid.

Bereiding van buitenmembraancomplexen (OMC) 30 De cel-vrije cultuurvloeistof werd tachtig maal geconcentreerd met behulp van een Amicon holle-vezel-patroon (H10P10). Het concentraat werd gecentrifugeerd (10.000 x g, 20 minuten) om eventueel achtergebleven bacteriën te verwijderen. Het OMC werd afgecentrifugeerd (2h bij 100.000 x g), gesuspendeerd in 300 mM NaCl-50 mM Tris, pH 7,2, weer af-35 gecentrifugeerd (2h bij 100.000 x g) en tenslotte gesuspendeerd in gedestilleerd water tot een eiwitconcentratie van 2 mg/ml.

Zuivering van PI

De isoleringsprocedure was gebaseerd op de procedure, die door Blake en Gotschlich gebruikt is voor de isolering van eiwit II (J.Exp. 40 Med. 159, 452-462 (1984)). Gelyofiliseerde gonococcen (2,5 g droog ge- 8403195 » · 3 wicht) werden geëxtraheerd met 2,5 g 3-(N-tetradecyl-N,N-dimethyl-ammo-nium)-l-propaansulfonaat (Z3-14) in 0,5 M calciumchloride bij pH 4,0 in een totaal volume van 250 al. Na 1 uur werden intacte cellen en fragmenten door centrifugeren verwijderd (20 minuten, 20.000 x g). Zonodig 5 werd de pH van bovenstaande vloeistof opnieuw op 4,0 ingesteld met verdund zoutzuur, waarna ethanol werd toegevoegd tot een concentratie van 20%. Na 30 minuten werd het neergeslagen materiaal verwijderd door centrifugeren (20 minuten, 10.000 x g). De bovenstaande vloeistof werd tot 150 ml geconcentreerd door ultrafiltratie (Amicon holle vezel HlDx50); 10 150 ml 50 mM Tris-10 mM EDTA-0,05% (gew/vol) Z3-14, pH 8,0 (buffer A) werd toegevoegd en het volume werd tot de helft gereduceerd; deze procedure werd 5 maal herhaald om het calciumchloride en de ethanol volledig te verwijderen. Daarna werd de eiwitoplossing op een met buffer A geëquilibreerde kolom (50 x 1,8 cm) van DEAE-Sepharose gebracht. De ei-15 witten werden geëlueerd met een lineaire gradiënt van 0,0 tot 0,6 H Nad in buffer A (2 maal 100 ml), bij een stroomsnelheid van 50 ml/h.

De resultaten zijn in fig. 1 weergegeven. De fracties werden geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE en de PI bevattende fracties werden samengevoegd. Dit produkt wordt gedeeltelijk gezuiverd PI genoemd.

20 Het gedeeltelijk gezuiverde PI werd op een vooraf met 50 mM

Tris-200 mM NaCl-10 mM EDTA-0,05% (gew/vol) Z3-14, pH 7,2 gebufferde Sephacryl S-300 kolom (80 x 3,6 cm) gebracht. De kolom werd geëlueerd met een stroomsnelheid van 50 ml/h. De resultaten zijn in fig. 2 weergegeven. PI bevattende fracties werden samengevoegd en bij 4°C opgesla-25 gen met 0,02% (gew/vol) natriumazide als conserveermiddel. Het in dit stadium verkregen produkt wordt aangeduid als gezuiverd PI.

Isolering van met SDS gedenatureerd PI.

Het gedeeltelijk gezuiverde PI werd onderworpen aan SDS-PAGE. Het gel werd gekleurd met Coomassie Brilliant Blue gedurende 10 minuten, en 30 kort ontkleurd, waarna de PI-banden met een mesje werden uitgesneden.

Het eiwit werd door elektrolutie uit het gel gewonnen, nagenoeg als beschreven in Anal. Biochem. 128, 7-10 (1983).

Analytische methoden.

Het eiwit werd bepaald met behulp van de methode van Lowry, als 35 beschreven in J. Biochem. 193, 265-275 (1951) en gemodificeerd door Peterson (Anal. Biochem. 83, 346-356 (1977)) met runderserumalbumine als standaard. Het organische fosfaat werd bepaald met de methode, die door Chen en medewerkers beschreven is in Anal. Chem. 28, 1756-1758 (1956) na verassen van de monsters volgens Ames en Dubin (J. Biochem.

40 235, 767-775 (1960)). De bepaling van ketodesoxyoctanoaat (EDO) werd 8403193 I ? 4 > uitgevoerd met behulp van de methode van Karkhanis en medewerkers (Anal. Biochem. 85» 595-601 (1978)) met KDO als standaard. De methode van Laemmli (Nature 227, 680-685 (1970) werd gebruikt voor de SDS-PAGE. Biologische activiteiten.

5 De Limulus-amoebocyt-lysaat-test werd uitgevoerd als beschreven in

Develop. Biol. Stand 34, 15-20 (1977). Voor de pyrogeniteitstest met konijnen werd gebruik gemaakt van het voorschrift in de Europese Pharmacopee II, blz. 53-61 (1971).

ELISA procedures.

10 De antigene werking van gedeeltelijk gezuiverd PI werd met behulp van ELISA bepaald. Het PI werd met 80% ethanol neergeslagen en vervolgens ofwel opgelost in 0,5% (gew/vol) Z3-14 ofwel in 30 mM octylgluco-side (eiwitconcentratie 1-2 mg/ml). Na verdunnen tot 10 yg/ml met 0,15 M NaCl, werden gedurende de nacht bij kamertemperatuur microtiter-15 platen met ΡΙ-preparaten bedekt. Ter bepaling van de antilichaamniveaus van serummonsters werden microtiterplaten bedekt met 0HC, verdund met 0,15 M NaCl tot een eiwitconcentratie van 10yg/ml. De daaropvolgende stappen van de ELISA werden uitgevoerd als beschreven in Infect. Immun. 40, 369-380 (1983). IgG-antilichaam-niveaus werden uitgedrukt als arbi-20 traire antilichaameenheden.

Immunisatie van muizen

Groepen van 8 muizen werden intraperitoneaal met PI geïnjecteerd. Het PI was daarbij aanwezig als complex volgens de uitvinding of werd als aggregaat, in met SDS gedenatureerde toestand of als in 0MC aanwe-25 zig PI toegepast.

a. PI als complex volgens de uitvinding of als aggregaat.

Gezuiverd PI in buffer met Z3-14 werd met 80% ethanol neergeslagen. Het neergeslagen PI werd opnieuw opgelost tot een eiwitconcentratie van 2 mg/ml ofwel in 0,3% (gew/vol) Z3-14 in 0,15 M NaCl, of in 30 0,8% (gew/vol) octylglucoside in 0,15 M NaCl, ofwel gesuspendeerd in 0,15 M NaCl. Deze oplossingen werden met 0,15 M NaCl verdund tot een concentratie van 1 yg eiwit per ml. De geïnjecteerde hoeveelheid was 0,5 yg eiwit (geadsorbeerd aan 50 yg A1P04), aanwezig in 0,5 ml.

4 Weken na de immunisatie werd bloed afgenomen.

35 b. Met SDS gedenatureerd PI.

Met SDS gedenatureerd PI werd met 80% ethanol geprecipiteerd, gesuspendeerd in 0,15 M NaCl en geëmulgeerd met een gelijk volume Freund's compleet adjuvans. De geïnjecteerde hoeveelheid was 10 yg eiwit, aanwezig in 0,2 ml. Een tweede dosis werd na 6 weken toegediend en 40 2 weken later werd bloed afgenomen.

' 840 3 1 95 • c 5 c. In OMC aanwezig PI.

(MC werd verdund met 0,15 M NaCl tot een eiwitconcentratie van 1 yg/ml. De geïnjecteerde hoeveelheid was 0,5 yg eiwit (aan 50 yg A1P04 geadsorbeerd). Een tweede dosis werd na 6 tot 10 weken gegeven, terwijl 5 2 weken later bloed werd afgenomen.

TOELICHTING EN RESULTATEN Zuivering van serotypen 1, 5 en 9 van PI.

Het PI kon effectief uit een bacteriesuspensie in oplossing gebracht worden door middel van Z3-14 bij aanwezigheid van calciumchlori-10 de. Deze stap werd bij pH 4,0 uitgevoerd. Bij lagere pH-waarden ging de opbrengst aan eiwit achteruit, terwijl bij hogere pH-waarden steeds meer andere eiwitten geëxtraheerd werden. De effectiviteit van de extractie blijkt afhankelijk te zijn van de gebruikte hoeveelheid detergens. Normaliter werd 1 g Z3-14 per g droge bacteriën gebruikt, waarbij 15 ongeveer 100 mg eiwit werd gesolubiliseerd. Bij toepassing van een geringere hoeveelheid Z3-14 werd overeenkomstig minder eiwit vrijgemaakt. Grotere hoeveelheden Z3-14 leidden niet noemenswaard tot een verbetering van de opbrengst* Na de precipitatie met 20% ethanol werd de ethanol en het calciumchloride door ultrafiltratie uit de bovenstaande 20 vloeistof verwijderd. Het eiwit werd daarna op een DEAE-Sepharose kolom gebracht en met een NaCl-gradiënt geëlueerd (Fig. 1). Het gedeeltelijk gezuiverde PI werd als een symmetrische piek geëlueerd bij een molari-teit van 0,4. Ook het elutieprofiel van lipopolysaccharide (LPS) werd bepaald aan de hand van EDO-analyse. Uit fig. 1 blijkt, dat de top van 25 de KDO-piek voorafgaat aan die van de PI-piek. Op deze kolom kon echter geen volledige scheiding van de beide componeneten worden bereikt. De daaropvolgende gel-permeatie-chromatografie op Sephacryl S-300 gaf echter een verdere scheiding van beide componenten (Fig. 2). Het PI werd geëlueerd als een symmetrische piek (fracties 34 tot 38), gevolgd door 30 een tweede piek, die enig eiwit met laag molecuulgewicht en het grootste deel van de lipopolysacchariden bevatte. Uit SDS-PAGE-analyse blijkt, dat de eerste piek uit nagenoeg zuiver PI bestond. Uitgaande van 2,5 g (droog gewicht) bacteriën, was de opbrengst aan PI doorgaans 20 tot 50 mg. In de volgende tabel A is een overzicht gegeven van de 35 resultaten van een karakteristieke zuivering, waarbij de gewonnen hoeveelheden eiwit en KD0 zijn vermeld.

840 31 9 5 « i 6

TABEL A

Zuivering van eiwit I (serotype 1), uitgaande van 2,5 g (droog gewicht) bacteriën.

eiwit_KDO_KDO/eiwit

Zuiveringstrap totaal gewonnen totaal gewonnen yg/mg __ (mg) (%) (mg) (%)_ Z3-14 extract 272 100 4>35 100 16 20% ethanol precipitatie 85 31 2,80 64 33 DEAE-Sepharose 41 15 0,69 16 17

Sephacryl S-300 24,4 8,9 0,17 3,9 7 840 3 1 9 5 * · « 7

Analyse en biologische werking van gezuiverd PI.

Het KDO-gehalte van gedeeltelijk gezuiverd PI lag tussen 15 en 50 yg KDO/mg eiwit. Na verdere zuivering op Sephacryl S-300 was deze waarde verminderd tot 6 A 7 yg kDO/mg eiwit. Wanneer men voor PI een 5 molecuulgewicht van 34.000 aanneemt, komt dit overeen met een molaire verhouding van KDO tot eiwit van 1. Uit fosfaat-analyse bleek, dat minder dan 2 mol fosfaat/mol eiwit aanwezig was. Dit fosfaat is waarschijnlijk afkomstig van lipopolysaccharide met misschien een kleine bijdrage van fosfolipiden.

10 Uit de resultaten van de Limulus-amoebocyt-lysaat-test bleek, dat de endotoxische activiteit van het PI-preparaat 2-10-voudig werd verminderd na chromatografie op Sephacryl S-300, waardoor de chemische analyse werd bevestigd. In dezelfde doses als voor meningococcen-polysaccha-ride-vaccins vereist zijn, voldeed het gezuiverde PI-preparaat aan de 1-3 eisen van de pyrogeniteitstest (konijnen) (W.H.O. Techn. Rep. Ser. 658, 174-184 (1981».

Antigene werking van gezuiverd PI.

De antigene werking van PI (serotype 1) werd onderzocht met behulp van een ELISA. Het Z3-14 bleek geen invloed te hebben op de adsorptie 20 van het eiwit op microtiterplaten. Om vast te stellen of Z3-14 invloed heeft op het binden van antilichamen door de antigene determinanten op het eiwit af te schermen, werd Z3-14 vervangen door octylglucoside, een niet-ionisch detergens. Octylglucoside heeft een kortere koolwaterstof-staart dan Z3-14 en zal daarom een zwakkere hydrofobe interactie met 25 het eiwit hebben. Er werden 2 antisera gebruikt om de verschillen tussen de beide antigeenpreparaten te onderzoeken. Antiserum 1 was een antiserum tegen met SDS gedenatureerd PI. Dit serum bevat vermoedelijk antilichamen, die gericht zijn tegen epitopen zowel op het hydrofobe als op het hydrofiele gedeelte van PI. Antiserum 2 was een antiserum 30 tegen natief 0MC van de gonococcen. Naar verwachting bevat dit antiserum voornamelijk antilichamen tegen epitopen op het hydrofiele trimeer-gedeelte van PI. In fig. 3 zijn de resultaten van de ELISA vermeld, waarbij beide antisera met de twee antigeenpreparaten werden getest.

Antiserum 1 reageerde nauwelijks met PI in Z3-14, doch vertoonde een 35 sterke reactie met PI in octylglucoside. Bij gebruik van antiserum 2 was dit verschil veel minder uitgesproken. Deze resultaten doen veronderstellen, dat het hydrofiele deel van PI in beide antigeenpreparaten beschikbaar is voor interactie met antilichamen, doch dat het hydrofobe deel van PI door Z3-14 sterker wordt afgeschermd dan door octylglucosi-40 de.

840 3 1 95 * , 8

Immunogene activiteit van gezuiverd PI.

Voor toepassing als vaccin moet PI in een vorm worden toegediend, die leidt tot de produktie van antilichamen, die met PI als aanwezig in het buitenmembraan van de bacteriën reageert. Mogelijkerwijs is de con-5 formatie van gezuiverd PI verschillend van die van PI in het buitenmembraan, daar interacties met fosfolipiden, lipopolysaccharide en andere membraaneiwitten de conformatie kan beïnvloeden. Daarom is de inductie van antilichamen irt muizen door PI in 3 verschillende toestanden onderzocht. Deze toestanden waren: a. gezuiverd PI in Z3-14; b. een prepa-10 raat waarin Z3-I4 vervangen was door octylglucoside en c. PI zonder detergens. De antisera werden in een ELISA getest, waarbij het homologe OMC als antigeen diende. In fig. 4 zijn de relatieve antilichaamr i niveaus van de verschillende antisera vermeld. Duidelijk blijkt, dat beide detergentia de immunogene activiteit van gezuiverd PI aanmerke-15 lijk vergroten. Er werden geen significante verschillen tussen de preparaten met Z3-14 en octylglucoside waargenomen. Duidelijk is echter, dat bij afwezigheid van detergentia PI een slechte immunogene werking vertoont, vermoedelijk door verregaande aggregatie tengevolge van hydrofobe interacties.

20 Daar de antilichaam-niveaus met ELISA, waarin OMC als antigeen werd gebruikt, werden bepaald, zou het mogelijk zijn dat de antisera met andere eiwitten dan PI of met LPS zouden reageren. Teneinde dit te controleren, werden de volgende experimenten uitgevoerd.

OMC (serotype 1) werd onderworpen aan SDS-PAGE. Na elektroforese werden 23 de gescheiden componenten overgebracht op nitrocellulose door middel van ’’Western Blotting". Vervolgens werd geïncubeerd met de volgende antisera: 1. Anti-OMC (serotype I) 2. Anti-PI in Z3-14 (serotype 1) 30 3. Anti-PI in octylglucoside (serotype 1) 4. Anti-PI in Z3-14 (serotype 5) 5. Anti-PI in Z3-14 (serotype 9) 6. controleserum.

De resultaten zijn in fig. 6 afgebeeld. Het OMC (spoor 1) induceerde 35 antistoffen tegen PI (bovenste band), tegen PUI (middelste band) en tegen lipopolysaccharide (onderste band). Na inspuiting met de PI-detergens-complexen volgens de uitvinding (sporen 2 en 3) werden uitsluitend antistoffen tegen PI gevormd, terwijl aan de dikte van de banden te zien is, dat het antistofniveau daarbij hoger lag dan het ni-40 veau dat door OMC werd gevormd. Sporen 4 en 5 geven een geringe kruis- 840 3 1 9 5 a ” * 9 reactiviteit van de antistoffen aan, terwijl de uiterst geringe kleuring in spoor 6 duidt op de spicificiteit van het blotting—systeem voor de bepaling van antistoffen*

De kruisreactiviteit tussen serotypen 1, 5 en 9 van PI werd onder-5 zocht in een ELISA met heteroloog OMC als antigeen. De resultaten zijn in fig* 5 vermeld. Uit deze resultaten blijkt, dat anti-serotype 1 een aanmerkelijke kruisreactie vertoont met OMC van serotype 5, terwijl anti-serotype 5 kruisreacties vertoont met OMC van beide serotypen 1 en 9.

10 Voorbeeld II

De in voorbeeld I beschreven procedure werd toegepast voor het isoleren van een klasse 1 en 2 buitenmembraaneiwit-eombinatie van groep 6, type 2 meningococcen en van een klasse 1 en 3 buitenmembraaneiwit-combinatie van groep B, type 16 meningococcen. Beide combinaties zijn 15 voor meer dan 90% zuiver en bevatten een laag lipopolysaccharide-gehal-te. De laatstgenoemde combinatie werd gecomplexeerd met Z3-14 en werd eenmaal bij groepen muizen ingespoten* Bet immunogene vermogen van het complex is in onderstaande tabel S weergegeven*

20 TABEL B

Tmraunogeen vermogen van het met Z3-14 gevormde complex van klasse 1 en 3 buitenmembraaneiwitcombinatie van groep B, type 16 meningococcen.

25 Immunogeen vermogen (0Dxl0^)a 1/50 1 2 1/150 2 1/450 2 234 100 100 1.170 558 249 30 _ 840 31 9 5

Gemeten in ELISA t.o.v. de buitenmembraaneiwitten in de natieve vorm.

2

Serumverdunning.

35

Voorbeeld III

De procedure van voorbeeld I werd eveneens toegepast voor het isoleren van een buitenmembraaneiwit b en c bevattende combinatie van H. influenzae type b. De combinatie was voor meer dan 90% zuiver. De bij 40 muizen gevormde antistoffen werden met de blotting-techniek aangetoond.

Claims (2)

1. 7. Vaccin, dat een immnunogeen complex volgens een of meer der voorafgaande conclusies bevat.
2. 8. Vaccin volgens conclusie 7, waarin de eiwitcomponent van het complex een mengsel is van Pi's van gonococcen, die afgeleid zijn van een aantal verschillende serotypen. ********** 840 3 1 9 5