NL8303082A - METHANOL DEHYDROGENASE ENZYME; METHOD FOR GROWING MICRO-ORGANISMS; CHEMICAL PRODUCTS; MICRO-ORGANISMS CATALYZED EPOXY DATES OR HYDROXYLATIONS; METHYLOTROPHIC MICROORGANISMS. - Google Patents
METHANOL DEHYDROGENASE ENZYME; METHOD FOR GROWING MICRO-ORGANISMS; CHEMICAL PRODUCTS; MICRO-ORGANISMS CATALYZED EPOXY DATES OR HYDROXYLATIONS; METHYLOTROPHIC MICROORGANISMS. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8303082A NL8303082A NL8303082A NL8303082A NL8303082A NL 8303082 A NL8303082 A NL 8303082A NL 8303082 A NL8303082 A NL 8303082A NL 8303082 A NL8303082 A NL 8303082A NL 8303082 A NL8303082 A NL 8303082A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- enzyme
- nad
- dehydrogenase
- methanol
- produce
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/32—Processes using, or culture media containing, lower alkanols, i.e. C1 to C6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
, * ! * VO 50.97, *! * VO 50.97
Methanol dehydrogenase enzym; werkwijze voor het kweken van micro-organismen; chemische produkten; door micro-organismen gekatalyseerde epoxydaties of hydroxyleringen; methylotrofe micro-organismen.Methanol dehydrogenase enzyme; method for growing micro-organisms; chemical products; microorganism-catalyzed epoxidations or hydroxylations; methylotrophic microorganisms.
De uitvinding heeft betrekking op een methanol dehydrogenase enzym, dat bestaat uit een quinoproteïne.The invention relates to a methanol dehydrogenase enzyme, which consists of a quinoprotein.
Een dergelijk enzym is bekend uit C.Anthony, "The Biochemistry of Methylotrophs", blz. 167-186 (1982), Academie Press, New York. Het beken-5 de enzym (EC 1.1.99.8) is NAD-onafhankelijk (NAO staat voor nicotinamide adenine dinucleotide, dat een positieve lading draagt en een elektronenof waterstofacceptor is; door acceptatie van 2 elektronen en 1 proton ontstaat de elektronen- of waterstofdonor NADH); heeft een brede, maar goed gedefinieerde substraatspecificiteit (geschikte substraten zijn bij-10 voorbeeld methanol, ethanol, formaldehyde); gebruikt als elektronenaccep-tor in vivo cytochroom c, bij in vitro detecties een kunstmatige kationo-gene kleustof, zoals fenazine methosulfaat of het kationradikaal van te-tramethyl-p-fenyleendiamine; en vereist onder aerobe omstandigheden in vitro ammoniumionen. Het holo-enzym omvat het apo-enzym (meestal een di-15 meer) en twee prosthetische groepen, bestaande uit pyrrolo-quinoline quinon (PQQ; volledige naam 2,7,9-tricarboxy-tH pyrrolo[2,3 f]-quinoline-4,5-dion).Such an enzyme is known from C. Anthony, "The Biochemistry of Methylotrophs," pp. 167-186 (1982), Academy Press, New York. The known-5 enzyme (EC 1.1.99.8) is NAD independent (NAO stands for nicotinamide adenine dinucleotide, which carries a positive charge and is an electron or hydrogen acceptor; acceptance of 2 electrons and 1 proton creates the electron or hydrogen donor NADH ); has a broad, but well-defined substrate specificity (suitable substrates are, for example, methanol, ethanol, formaldehyde); used as electron acceptor in vivo cytochrome c, in in vitro detections an artificial cationic clay, such as phenazine methosulfate or the cation radical of tetramethyl-p-phenylenediamine; and requires in vitro ammonium ions under aerobic conditions. The holoenzyme includes the apoenzyme (usually a di-15 mer) and two prosthetic groups consisting of pyrrolo-quinoline quinone (PQQ; full name 2,7,9-tricarboxy-tH pyrrolo [2.3 f] - quinoline-4,5-dione).
Het enzym fungeert als katalysator bij de reactie: CH30H-*-CH20+2H, en stelt de micro-organismen daardoor in staat om te groeien op een voe-20 dingsbodem, die als C-bron methanol bevat. Aangezien methanol een goedkope en explosie-veilige stof is, bestaat grote belangstelling voor micro-organismen die onder toepassing daarvan kunnen worden gekweekt om microbiëel eiwit of andere chemische produkten te produceren. Men kan bijv· denken aan de produktie van veevoeder, diverse enzymen, waaronder wasmid-25 delenzymen (proteasen en lipasen), antibiotica, vitamines, zoals vitamine 3t2 en biopolymeren, zoals polyhydroxyboterzuur.The enzyme acts as a catalyst in the reaction: CH 3 OH - * - CH 2 O + 2H, thereby enabling the microorganisms to grow on a nutrient medium containing methanol as the C source. Since methanol is an inexpensive and explosion-proof substance, there is great interest in microorganisms that can be grown using it to produce microbial protein or other chemicals. Examples include the production of animal feed, various enzymes, including detergent partial enzymes (proteases and lipases), antibiotics, vitamins, such as vitamin 3t2 and biopolymers, such as polyhydroxybutyric acid.
Bioenergetisch gezien fungeert het bekend NAD-onafhankelijke methanol dehydrogenase echter niet optimaal, doordat het pas op een verge-vordere plaats (cytochroom c) op de ademhalingsketen (ook wel elektronen-30 transportketen genoemd) aansluit; dit impliceert dat weinig ATP (adenosine trifosfaat) wordt gevormd en dat de benodigde energie door een aanzienlijke mate van verbranding moet worden geleverd, zodat minder formalde- hydeprodukt ter beschikking staat voor biosyntheses.From a bioenergetic point of view, however, the known NAD-independent methanol dehydrogenase does not function optimally, because it only connects to the respiratory chain (also referred to as electron transport chain) at an advanced location (cytochrome c); this implies that little ATP (adenosine triphosphate) is formed and that the necessary energy must be supplied by a considerable degree of combustion, so that less formaldehyde product is available for biosynthesis.
8 s* f\ ? λ λ η8 s * f \? λ λ η
O v OO v O
9 * -2-9 * -2-
Nu was reeds door Loginova en Trotsenko in FEMS Microbiology Letters 5, blz. 239-243 (1979) waargenomen, dat in cel vrije extracten van sommige grampositieve methylotrofe bactariën noch NAD-onafhankelijk, noch NAD-afhankelijk methanol dehydrogenase, noch methanol oxidase (een 5 in methylotrofe gisten voorkomend flavoproteTne) konden worden aangetoond. Zij speculeerden dat het enzym, dat voor de primaire methanoloxydatie in deze micro-organismen verantwoordelijk is, bijzonder labiel is of bijzondere detectiecondities vraagt.It has already been observed by Loginova and Trotsenko in FEMS Microbiology Letters 5, pp. 239-243 (1979), that in cell-free extracts of some gram-positive methylotrophic bactarians, neither NAD-independent, NAD-dependent methanol dehydrogenase, nor methanol oxidase (a 5 flavoproteins present in methylotrophic yeasts). They speculated that the enzyme responsible for primary methanol oxidation in these microorganisms is particularly labile or requires special detection conditions.
Thans is gevonden dat.in dergelijke micro-organismen een uit een 10 quinoproteTne bestaand methanol dehydrogenase enzym (MDH) voorkomt, dat volgens de uitvinding gekenmerkt is doordat het enzym NAD afhankelijk is en in vivo onderdeel uitmaakt van een complex met NADH dehydrogenase enzym en formaldehyde dehydrogenase enzym, welk complex via het NADH dehydrogenase enzym aan de ademhalingsketen is gekoppeld. .It has now been found that such micro-organisms contain a quinoprotein methanol dehydrogenase enzyme (MDH), which according to the invention is characterized in that the enzyme is NAD dependent and forms in vivo part of a complex with NADH dehydrogenase enzyme and formaldehyde. dehydrogenase enzyme, which complex is linked to the respiratory chain via the NADH dehydrogenase enzyme. .
15 Tevens is gevonden dat het enzym voorkomt in en geïsoleerd kan worden uit methylotrofe micro-organismen, waarvan cel vrije extracten methanol oxyd®end® werkzaamheid vertonen indien zowel NAD als een anionogene kleurstof, zoals 2,6-dichlorofenol indofenol, aanwezig zijn.It has also been found that the enzyme occurs in and can be isolated from methylotrophic microorganisms whose cell-free extracts show methanol oxyd®end® activity when both NAD and an anionic dye such as 2,6-dichlorophenol indophenol are present.
Opgemerkt wordt dat het gebruik van een anionogene kleurstof wordt 20 voorgeschreven om een selectieve detectie mogelijk te maken. Zou een kationogene kleurstof worden gebruikt, hoeft methanol oxyderende activiteit niet op de aanwezigheid van het enzym volgens de uitvinding te wijzen. De reden hiervoor is, dat het bekende NAD-onafhankelijke methanol dehydrogenase wel met behulp van een kationogene kleurstof, maar niet met 25 een anionogene kleurstof kan worden gedetecteerd. Het NAD-afhankelijke methanol dehydrogenase volgens de uitvinding kent deze beperking ten aanzien van de aard van de kleurstof niet.It is noted that the use of an anionic dye is prescribed to allow for selective detection. Should a cationic dye be used, methanol oxidizing activity need not indicate the presence of the enzyme of the invention. The reason for this is that the known NAD-independent methanol dehydrogenase can be detected with the aid of a cationic dye, but not with an anionic dye. The NAD-dependent methanol dehydrogenase of the invention does not have this limitation on the nature of the dye.
De uitvinding betreft derhalve een in de natuur voorkomend enzym, waarvan het bestaan en de karakteristieke eigenschappen onbekend waren 30 en dat niet eerder geïsoleerd en gemanipuleerd was.The invention therefore relates to a naturally occurring enzyme, the existence and characteristics of which were unknown and which had not previously been isolated and manipulated.
Met behulp van een aan celvrije extracten uitgevoerde detectie-methode, waarbij naast methanol als substraat zowel NAD als de anionogene kleurstof 2,6-dichlorofenol indofenol (DCPIF) aanwezig waren is vastgesteld dat het nieuwe enzym voorkomt in de grampositieve bacteriën 35 Nócardia spec.239; Eubactérium'limosum en Clostridium'thèrmóautotrophi-cum, alsmede in de gramnegatieve bacterie'MethylQcoccuS capsülatus, stam Bath. Daarentegen bleek het nieuwe enzym niet voor te komen in de gram- 8303082 * * -3- negatieve Hyphomicrobium X en Pseudomonas spec. Gezien de aanwezigheid van het nieuwe enzym in alle onderzochte grampositieve bacteriën en gezien het feit, dat in grampositieve bacteriën nog nooit NAD-onafhanke-lijke MDH (verder ook wel aangeduid als klassiek MDH) is gevonden, lijkt 5 aannemelijk dat het nieuwe enzym (verder ook wel aangeduid als nieuw MDH) in alle grampositieve, op methanol groeiende bacteriën voorkomt.Using a detection method performed on cell-free extracts, in which, in addition to methanol as substrate, both NAD and the anionic dye 2,6-dichlorophenol indophenol (DCPIF) were present, it was determined that the new enzyme occurs in the gram-positive bacteria. ; Eubactérium'limosum and Clostridium'thèmmautotrophi-cum, as well as in the gram-negative bacterium'MethylQcoccuS capsülatus, strain Bath. In contrast, the new enzyme was not found in the gram-8303082 * * -3- negative Hyphomicrobium X and Pseudomonas spec. In view of the presence of the new enzyme in all the gram-positive bacteria investigated and the fact that NAD-independent MDH (hereinafter also referred to as classical MDH) has never been found in gram-positive bacteria, it seems plausible that the new enzyme (further (also referred to as new MDH) in all gram-positive bacteria growing on methanol.
Het gevonden nieuw MDH heeft niet alleen PQQ, maar ook NAD als co-enzym nodig. De behoefte aan NAD is specifiek: nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADP) is geen geschikt coenzym. Het nieuw MDH blijkt 10 evenals klassiek MDH door zuurstof te worden geïnactiveerd, in geval van manipulaties in vitro. De inactivering kan worden verhinderd of opgeheven door de aanwezigheid van ammonium-ionen. De substraatspecifici-teit is nauwer dan in het geval‘van klassiek MDH: het nieuw MDH gebruikt als substraat specifiek methanol; formaldehyde en ethanol zijn geen ge-15 schikte substraten.The new MDH found needs not only PQQ, but also NAD as a coenzyme. The need for NAD is specific: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) is not a suitable coenzyme. The new MDH appears to be inactivated by oxygen as well as classical MDH, in case of manipulations in vitro. The inactivation can be prevented or canceled by the presence of ammonium ions. The substrate specificity is narrower than in the case of classical MDH: the new MDH uses as substrate specific methanol; formaldehyde and ethanol are not suitable substrates.
Het meest bijzondere en tegelijk gunstige aspect van het nieuw MDH is, dat het in vivo onderdeel uitmaakt van een complex met NADH dehydrogenase en formaldehyde dehydrogenase, welk complex stevig via het NADH dehydrogenase helemaal vooraan aan de ademhalingsketen is gekoppeld 20 en geen vrij NADH produceert. Dit wordt schematisch getoond in Fig. t van de tekening. Het voordeel van deze koppeling aan het begin van de adem-halingsketen zal de deskundige duidelijk zijn: daardoor wordt veel ATP geproduceerd en dus de in het substraat opgeslagen energie optimaal benut.The most special and at the same time beneficial aspect of the new MDH is that it is in vivo part of a complex with NADH dehydrogenase and formaldehyde dehydrogenase, which complex is tightly coupled to the respiratory chain through the NADH dehydrogenase and does not produce free NADH. This is shown schematically in Fig. t of the drawing. The advantage of this coupling at the beginning of the respiratory chain will be clear to the skilled person: it produces a lot of ATP and thus optimally uses the energy stored in the substrate.
In Fig. 2 van de tekening wordt schematisch de struktuuren hypc-25 thetische werking van het complex getoond, (het daarin getoonde FAD staat voor flavine adenine dinucleotide). Het bij de oxydatie van methanol gevormde NADH komt niet uit het complex vrij, maar wordt waarschijnlijk door het aan de ademhalingsketen gebonden NADH dehydrogenase (in vitro het van een kleurstof zoals DCPIP afhankelijke NADH dehydrogenase) geoxy-30 deerd. Het juiste mechanisme is nog niet opgehelderd. Het complex is door HPLC gel filtratie in een sorbitol bevattende buffer aangetoond: alle drie de activiteiten bleken aanwezig; het molekuulgewicht bleek ongeveer 200.000 te zijn.In FIG. 2 of the drawing schematically shows the structure and hypothetical activity of the complex, (the FAD shown therein stands for flavin adenine dinucleotide). The NADH formed in the oxidation of methanol is not released from the complex, but is likely to be oxidized by the respiratory chain NADH dehydrogenase (in vitro dye-dependent NADH dehydrogenase). The correct mechanism has not yet been clarified. The complex has been detected by HPLC gel filtration in a sorbitol-containing buffer: all three activities were found; the molecular weight was found to be about 200,000.
Het complex omvat een NAD-afhankelijk formaldehyde dehydrogenase 35 (een enzym dat de dehydrogenering van gehydrateerd formaldehyde tot for-miaat katalyseert), dat wel specifiek NAD verlangt, maar niet alleen formaldehyde als substraat heeft, Aceetaldehyde blijkt zelfs een beter sub- r* ” λ *7 z' ry C ’-· ' - - -J i- « * -4- straat te zijn, terwijl ook propionaldehyde geschikt is.The complex includes an NAD-dependent formaldehyde dehydrogenase 35 (an enzyme that catalyzes the dehydrogenation of hydrated formaldehyde to formate), which specifically requires NAD but not only has formaldehyde as a substrate, but acetaldehyde appears to be a better substrate * ” λ * 7 z 'ry C' - · '- - -J i- «* -4- street, while propionaldehyde is also suitable.
Het complex kan gemakkelijk worden geTsoleerd en tot de componenten worden gedissocieerd. Isolatie van het complex kan bijv. worden gerealiseerd door de geoogste cellen (centrifugeren), gesuspendeerd in een 5 buffer, open te breken (bijv. onder druk) en de na centrifugeren verkregen supernatant op een "kolom van ionenuitwisselingsmateriaal te brengen (bijv. DEAE-Sephacel). Het complex kan worden geëlueerd met een buffer-oplossing, die een hydroxyl groepen bevattende verbinding, zoals sorbitol,, glycerol, polyethyleenglycol, bevat.The complex can be easily isolated and dissociated into components. For example, isolation of the complex can be achieved by breaking open the harvested cells (centrifugation) suspended in a buffer (eg under pressure) and placing the supernatant obtained after centrifugation on a column of ion exchange material (eg DEAE -Sephacel) The complex can be eluted with a buffer solution containing a hydroxyl group-containing compound such as sorbitol, glycerol, polyethylene glycol.
10 De componenten van het complex kunnen worden geTsoleerd door het celvrije extract weer op een kolom van ionenuitwisselingsmateriaal (bijv. DEAE-Sephacel) te brengen en daaruit de NADH-dehydrogenase component te elueren (bijv. met 0,5M kaliumfosfaatbuffer; pH 6,8), waarna de hieuw MDH component samen met de formaldehyde dehydrogenase component wordt geëlu-15 eerd met een bufferoplossing, die weer een hydroxyl groepen bevattende verbinding bevat (bijv. 0,02 M kaliumfosfaatbuffer; pH 7,2; welke 1M KC1 en 2% sorbitol bevat). De nieuw MDH component en formaldehyde dehydrogenase component kunnen vervolgens door gelfiltratie (bijv. op een TSK-G 3000 SW kolom in 0,2 M kaliumfosfaatbuffer; pH 7,0) en/of verdere standaard 20 biochemische scheidings- en zuiveringstechnieken worden gescheiden en geïsoleerd.The components of the complex can be isolated by reapplying the cell-free extract to a column of ion exchange material (eg DEAE-Sephacel) and eluting from it the NADH dehydrogenase component (eg with 0.5M potassium phosphate buffer; pH 6.8 ), after which the heel MDH component together with the formaldehyde dehydrogenase component is eluted with a buffer solution, which again contains a hydroxyl group-containing compound (eg 0.02 M potassium phosphate buffer; pH 7.2; containing 1M KCl and 2% sorbitol). The new MDH component and formaldehyde dehydrogenase component can then be separated and isolated by gel filtration (eg on a TSK-G 3000 SW column in 0.2 M potassium phosphate buffer; pH 7.0) and / or further standard biochemical separation and purification techniques. .
Het is verder mogelijk gebleken om het complex uit de componenten terug te vormen door de componenten in bufferop!ossingen· samen te voegen. De bioenergetisch gunstige eigenschappen van het nieuw MDH komen 25 tot uiting in een werkwijze voor het kweken van micro-organismen, waarbij methanol als C-bron wordt toegepast, welke werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt wordt doordat A. methylotrofe micro-organismen, die wel NAD-onafhankelijk methanol dehydrogenase, maar niet NAD-afhankelijk methanol dehydrogenase volgens con- 30 clusie t of 2 kunnen produceren,worden toegepast nadat zodanige genetische manipulaties zijn uitgevoerd, dat in de micro-organismen het vermogen om laatstgenoemd type enzym te produceren is geïntroduceerd, en waarbij desgewenst het vermogen om eerstgenoemd type enzym te produceren is vernietigd door genetische manipulatie of de werking van eerstgenoemde 35 type enzym wordt geblokkeerd door een selectief blokkeringsmiddel voor eerstgenoemde type enzym te gebruiken; of B. methylotrofe micro-organismen, die zowel NAD-onafhankelijk methanolIt has further been found possible to reform the complex from the components by combining the components in buffer solutions. The bioenergically favorable properties of the new MDH are expressed in a method for the cultivation of microorganisms, wherein methanol is used as C source, which method according to the invention is characterized in that A. methylotrophic microorganisms, which do have NAD independent methanol dehydrogenase, but not capable of producing NAD-dependent methanol dehydrogenase according to claim t or 2, are applied after genetic manipulations have been performed such that the microorganisms have been introduced to produce the latter type of enzyme, and if desired, the ability to produce the former type of enzyme has been destroyed by genetic engineering or the action of the former type enzyme is blocked by using a selective blocking agent for the former type enzyme; or B. methylotrophic microorganisms, which are both NAD-independent methanol
Ql A " C 9 O V· 'sJ v' iJ *» * .Ql A "C 9 O V · 'sJ v' iJ *» *.
-5- dehydrogenase als NAD-afhankelijk methanol dehydrogenase, volgens conclusie 1 of 2 kunnen produceren, worden toegepast, waarbij het vermogen om eerstgenoemd type enzym te produceren is vernietigd door genetische manipulatie of de werking van eerstgenoemde type enzym wordt geblokkeerd door 5 een selectief blokkeringsmiddel voor eerstgenoemde t}peeizymtegebniken; of C. micro-organismen, die geen methanol dehydrogenase enzym kunnen produceren, worden toegepast nadat zodanige genetische manipulaties zijn uitgevoerd, dat in de micro-organismen het vermogen om NAD-afhankelijk methanol dehydrogenase volgens conclusie 1 of 2 te produceren is geTntro-10 duceerd.Dehydrogenase can be used as NAD-dependent methanol dehydrogenase, according to claim 1 or 2, wherein the ability to produce the former type of enzyme is destroyed by genetic engineering or the action of the former type of enzyme is blocked by a selective blocking agent for the former t} peeizymtegniken; or C. microorganisms, which cannot produce methanol dehydrogenase enzyme, are used after genetic manipulations have been performed such that the microorganisms have demonstrated the ability to produce NAD-dependent methanol dehydrogenase according to claim 1 or 2 .
Met de term "genetische manipulatie" worden alle ingrepen omvat, waardoor de genetische informatie van een micro-organ isme kan worden gewijzigd. Bij introductie van specifieke genetische informatie moet men daarbij denken aan toepassing van DNA recombinant technieken. Bij ver-15 nietiging van aanwezige genetische informatie kan men denken aan mutaties, bijv. door behandeling met mutagene stoffen of straling, of ook ' aan ingrijpen met DNA recombinant technieken.The term "genetic engineering" encompasses all interventions that allow the genetic information of a micro-organism to be modified. When introducing specific genetic information, one should think of the application of DNA recombinant techniques. In case of destruction of present genetic information, one can think of mutations, eg by treatment with mutagens or radiation, or also intervention with DNA recombinant techniques.
In het geval dat een selectief blokkeringsmiddel voor klassiek MDH wordt toegepast, kan daartoe een cyclopropaanderivaat worden gebruikt, 20 bijv. cyclopropanol of cyclopropanon. Cyclopropanol is zeer geschikt gebleken, doordat het wel het klassieke enzym, maar niet het nieuwe enzym blokkeerde. Deze mogelijkheid van selectieve blokkering is van groot belang, omdat daardoor een geschikte selectiemethode voor transformanten ter beschikking komt (niet getransformeerde micro-organismen, die alleen 25 klassiek MDH bevatten, gaan dood).In the case where a selective blocking agent for classical MDH is used, a cyclopropane derivative can be used for this purpose, eg cyclopropanol or cyclopropanone. Cyclopropanol has proved to be very suitable because it blocked the classic enzyme, but not the new enzyme. This possibility of selective blocking is of great importance, because it provides a suitable selection method for transformants (untransformed microorganisms containing only classical MDH die).
De werkwijze volgens de uitvinding maakt het mogelijk om de groei-opbrengst te verbeteren van op methanol groeiende bacteriën of andere micro-organismen zoals schimmels en gisten, die voor de productie van microbieel eiwit of andere interessante chemische produkten zoals enzymen 30 (bijv. wasmiddel enzymen zoals proteasen of lipasen), antibiotica, vitamines, biopolymeren, etc. worden gebruikt.The method according to the invention makes it possible to improve the growth yield of bacteria growing on methanol or other micro-organisms such as fungi and yeasts, which are used for the production of microbial protein or other interesting chemical products such as enzymes (eg detergent enzymes such as proteases or lipases), antibiotics, vitamins, biopolymers, etc. are used.
Ook wordt door de onderhavige werkwijze mogelijk gemaakt, dat door genetische manipulatie uit van nature niet op methanol groeiende micro-organismen nieuwe micro-organismen worden gecreëerd die wel op het goed-35 kope en explosieveilige methanol groeien en een hoog produktierendement hebben. Indien nodig, dient de genetische manipulatie met recombinant DNA-technieken ook de introductie in het micro-organisme van de genetische informatie voor een geschikt formaldehyde dehydrogenase en/of een geschikt ί"> V ' 7' ·"" O ) * : Ύ '\C T** ** , v -6- NADH dehydrogenase te omvatten.The present method also makes it possible for new microorganisms to be created by means of genetic manipulation from microorganisms which do not naturally grow on methanol, but which do grow on cheap and explosion-safe methanol and which have a high production yield. If necessary, genetic engineering using recombinant DNA techniques should also include the introduction into the micro-organism of the genetic information for an appropriate formaldehyde dehydrogenase and / or an appropriate ί "> V '7'" "O) *: Ύ ' \ CT ** **, v -6- NADH dehydrogenase.
Een andere toepassingsmogelijkheid is het gebruik van nieuw MDH als reductieëquival enten leverend systeem in methaan mono-oxygenase (MMO) bevattende bacteriën, die als biokatalysator kunnen 5 dienen voor epoxydatie- en hydroxyleringsreacties.Another application possibility is the use of new MDH as a reduction equivalent grafting system in methane monooxygenase (MMO) containing bacteria, which can serve as biocatalyst for epoxidation and hydroxylation reactions.
De uitvinding verschaft daartoe een werkwijze voor het epoxyderen of hydroxyl eren van al dan niet verzadigde ali fati sche alicyclische en aromatische koolwaterstoffen, organische verbindingen met meerdere ringen, gechloreerde koolwaterstoffen, en fenolen, waar-10 bij methaan mono oxygenase (MMO) bevattende micro-organismen als katalysator worden toegepast, welke werkwijze gekenmerkt wordt doordat A. methylotrofe micro-organismen,. die wel NAD-onafhankelijk methanol dehydrogenase, maar niet NAD-afhankelijk methanol dehydrogenase volgens conclusie lof 2.kunnen produceren, worden toegepast nadat zoda- 15 nige genetische manipulaties zijn uitgevoerd, dat in de micro-organismen het vermogen om laatstgenoemd type enzym te produceren is geïntroduceerd, en waarbij desgewenst het vermogen om eerstgenoemd type'enzym te produceren is vernietigd door genetische manipulatie of de working · . ‘van eerstgenoemde type enzym wordt geblokkeerd, door een selectief blok- 20 keringsmiddel voor eerstgenoemde type enzym te gebruiken; of B. methylotrofe micro-organismen, die zowel NAD-onafhankelijk methanol dehydrogenase als NAD-afhankelijk methanol dehydrogenase volgens conclusie 1 of 2 kunnen produceren, worden toegepast, waarbij het vermogen om eerstgenoemd type enzym te produceren is vernietigd door gene- 25 tische manipulatie of de werking van eerstgenoemde type enzym wordt geblokkeerd door een selectief blokkeringsmiddel voor eerstgenoemde type enzym te gebruiken; of C. . micro-organismen, die geen methanol dehydrogenase enzym kunnen produceren, worden toegepast nadat zodanige genetische manipulaties zijn 30 uitgevoerd, dat in de micro-organismen het vermogen om NAD-afhankelijk methanol dehydrogenase volgens conclusie t of 2 te produceren is geïntroduceerd.To this end, the invention provides a process for epoxidizing or hydroxylating saturated or unsaturated aliphatic alicyclic and aromatic hydrocarbons, multi-ring organic compounds, chlorinated hydrocarbons, and phenols, including methane monooxygenase (MMO) containing micro- organisms are used as a catalyst, which method is characterized in that A. methylotrophic microorganisms. which can produce NAD-independent methanol dehydrogenase, but cannot produce NAD-dependent methanol dehydrogenase according to claim 1 or 2, are applied after such genetic manipulations have been carried out that the microorganisms have the ability to produce the latter type of enzyme and, if desired, the ability to produce the former type enzyme has been destroyed by genetic engineering or the working. "Of the former type of enzyme is blocked, by using a selective blocking agent for the former type of enzyme; or B. methylotrophic microorganisms capable of producing both NAD-independent methanol dehydrogenase and NAD-dependent methanol dehydrogenase according to claim 1 or 2, wherein the ability to produce said type of enzyme has been destroyed by genetic engineering or the action of the former type of enzyme is blocked by using a selective blocking agent for the former type of enzyme; or C.. microorganisms which cannot produce methanol dehydrogenase enzyme are used after genetic manipulations have been performed such that the microorganisms have introduced the ability to produce NAD-dependent methanol dehydrogenase according to claim t or 2.
Dergelijke epoxydatie- of hydroxyleringsreacties leveren vaak maar één type produkt op. Omzettingen van propeen in epoxy-35 propaan, cyclohexaan in cyclohexanol, benzeen in fenol, m-chloortolueen in een mengsel van benzylalkohol en benzylepoxyde, zijn goede voorbeelden. De reactie die bijvoorbeeld plaats vindt wanneer een verbinding RH wordt gehydroxyleerd is als volgt: o O 'j ’ / - y ·« -7- * ψSuch epoxidation or hydroxylation reactions often yield only one type of product. Conversions of propylene to epoxy-propane, cyclohexane to cyclohexanol, benzene to phenol, m-chlorotoluene in a mixture of benzyl alcohol and benzyl epoxide are good examples. For example, the reaction that takes place when a compound RH is hydroxylated is as follows: o O 'j ’/ - y ·« -7- * ψ
RH + 02 + ΧΗ2 ΐ0 ROH + Η20 + XRH + 02 + ΧΗ2 ΐ0 ROH + Η20 + X
In sommige gevallen fungeert NADH als verbinding XH2, maar aangenomen wordt dat er nog een onbekende XHZ moet zijn.In some cases, NADH acts as compound XH2, but it is believed that there must still be an unknown XHZ.
Het lijkt nu zeer waarschijnlijk, dat dit onbekende reductieëquivalen-5 ten leverende materiaal het nieuw MDH is, dat o.a. ook in de methaan-groeier Methylococcus capsulatus, stam Bath, is aangetroffen. Een verbeterde biokatalysator kan men nu verkrijgen door de route via klassiek MDH te blokkeren (hetzij door toevoeging van een selectief blokkerings-middel zoals cyclopropanol, hetzij door genetische manipulatie, zoals 10 een gerichte mutatie). Wanneer de reactie nu wordt uitgevoerd in tegenwoordigheid van 1/3 mol methanol per mol RH, zal een optimale hoeveelheid reductieëquivalenten worden gevormd en RH volledig in ROH worden omgezet. Bovendien is de kans op afbraak van het gevormde ROH kleiner (een gevolg van het blokkeren van klassiefe MDH, waarvan de brede sub-15 straatspecificiteit veelal verdere oxydatie van het gevormde ROH toe-laat).It now seems very probable that this unknown reduction equivalence-providing material is the new MDH, which has also been found, inter alia, in the methane grower Methylococcus capsulatus, strain Bath. An improved biocatalyst can now be obtained by blocking the pathway via classical MDH (either by adding a selective blocking agent such as cyclopropanol or by genetic engineering such as a targeted mutation). When the reaction is now carried out in the presence of 1/3 mole of methanol per mole of RH, an optimum amount of reduction equivalents will be formed and RH will be completely converted to ROH. In addition, the chance of degradation of the formed ROH is smaller (a consequence of blocking class MDH, the broad substrate specificity of which often allows further oxidation of the formed ROH).
Een zeer specifiek toepassingsgeval van deze werkwijze is de bereiding van methanol uit methaan onder toepassing van biokatatysatoren.A very specific application case of this process is the preparation of methanol from methane using biocatalysts.
De uitvinding wordt ook belichaamd in methylotrofe mi-20 . cro-organismen, die gekenmerkt zijn doordat ze het vermogen hebben om NAD-afhankelijk methanol dehydrogenase volgens conclusie 1 of 2 te produceren verkregen uit A. micro-organismen, die wel NAD-onafhankelijk methanol dehydrogenase, 25 maar niet NAD-afhankelijk methanol dehydrogenase kunnen produceren, door zodanige genetische manipulaties, dat het vermogen om NAD-afhanke-1 ijk methanol dehydrogenase te produceren i’s geïntroduceerd en desgewenst het vermogen om NAD-onafhankelijk methanol dehydrogenase te produceren is vernietigd; of 30 B. micro-organismen, die zowel NAD-onafhankelijk als NAD-afhankelijk methanol dehydrogenase kunnen produceren, door zodanige genetische manipulaties, dat het vermogen om NAD-onafhankelijk methanol dehydrogenase te produceren is vernietigd; of C. micro-organismen, die geen methanol dehydrogenase enzym kunnen pro-35 ducaren, door zodanige genetische manipulaties, dat het vermogen om NAD-afhankelijk methanol dehydrogenase te produceren is geTntroduceerd.The invention is also embodied in methylotrophic mi-20. cro-organisms, characterized by having the ability to produce NAD-dependent methanol dehydrogenase according to claim 1 or 2 obtained from A. microorganisms, which may contain NAD-independent methanol dehydrogenase, but not NAD-dependent methanol dehydrogenase produce, through genetic engineering, that the ability to produce NAD-dependent methanol dehydrogenase has been introduced and, if desired, the ability to produce NAD-independent methanol dehydrogenase has been destroyed; or B. microorganisms capable of producing both NAD-independent and NAD-dependent methanol dehydrogenase, through genetic engineering such that the ability to produce NAD-independent methanol dehydrogenase is destroyed; or C. microorganisms, which cannot produce methanol dehydrogenase enzyme, by genetic engineering such that the ability to produce NAD-dependent methanol dehydrogenase has been introduced.
-7 λ rf? '· » % ·· -m -8- « *-7 λ rf? '· »% ·· -m -8-« *
Ook voor dergelijke kunstmatig gecreëerde micro-organismen worden uitsluitende rechten gevraagd.Exclusive rights are also requested for such artificially created micro-organisms.
De uitvinding zal aan de hand van onderstaand experimenteel gedeelte nader worden toegelicht.The invention will be explained in more detail with reference to the experimental part below.
55
Kweken van Nocardia.spec..239 bacteriënCultivation of Nocardia.spec..239 bacteria
Er werd gebruik gemaakt van een bacterie, die door Kato et al is beschreven in Microbial Growth on -Compounds, biz. 91-98 (1975). De bacterie wordt daarin aangeduid als Streptomyces spec. 239, 10 maar nader onderzoek, leerde dat de bacterie tot de Nocardia behoort.A bacterium, described by Kato et al in Microbial Growth on Compounds, biz., Was used. 91-98 (1975). The bacterium is referred to therein as Streptomyces spec. 239, 10 but further investigation revealed that the bacterium belongs to the Nocardia.
De bacterie werd gekweekt bij 37°C op 0,5¾ ethanol + 0,5¾ methanol met goede beluchting in een medium, dat per liter 2 g NH^Cl; 1 g K2HP04; 1 g NaHaPa4.2H*0; 0,2 g MgS04.7H20; 1 mg ZnS04.7H20; 1 mg CuS04.5H20; 1 mg Mn$04.7H20; 0,5 mg Mo03.H20; 0,5 mg CoCl2.6H20; 10 mg FeCl3.H20; 15 en 10 mg CaCl2.2H20 bevatte. Tijdens het kweken werd de pH van de cultuur met een geconcentreerde ammorïiakoplossing op 7,0 gehouden en werd de omzetting van de alkoholen gaschromatografiscir op een Porapak Q kolom gevolgd. De ethanol werd het eerst verbruikt. Toen de methanol was verbruikt, werden de cellen geoogst.The bacterium was grown at 37 ° C on 0.5¾ ethanol + 0.5¾ methanol with good aeration in a medium containing 2 g NH 2 Cl per liter; 1 g of K2HPO4; 1 g NaHaPa4.2H * 0; 0.2 g MgSO 4 .7H 2 O; 1 mg ZnSO 4 .7H 2 O; 1 mg CuSO 4 .5H 2 O; 1 mg Mn $ 04.7H20; 0.5 mg MoO3.H 2 O; 0.5 mg CoCl2.6H2 O; 10 mg FeCl3.H2 O; 15 and 10 mg CaCl2.2H20. During cultivation, the pH of the culture was kept at 7.0 with a concentrated ammonia solution and the conversion of the alcohols was monitored by gas chromatography on a Porapak Q column. The ethanol was consumed first. When the methanol was consumed, the cells were harvested.
2020
Isolatie van het complexIsolation of the complex
Een ingevroren pasta van bacteriecellen werd ontdooid en gemengd met een gelijk volume 0,02 M kaliumfosfaatbuffer; pH 7,2.A frozen bacterial cell paste was thawed and mixed with an equal volume of 0.02 M potassium phosphate buffer; pH 7.2.
De bacteriën werden onder een druk van 110 MPa in een "French pressure 25 cell" opengebroken. DNAase werd toegevoegd om de viscositeit te verlagen. De suspensie werd gedurende 20 minuten bij 4°C gecentrifugeerd op 48000 xg.The bacteria were broken open in a "French pressure 25 cell" under a pressure of 110 MPa. DNAase was added to decrease the viscosity. The suspension was centrifuged at 48000 xg for 20 minutes at 4 ° C.
De supernatant werd op een DEAE-Sephacel kolom gebracht, die met 0,02 M kaliumfosfaatbuffer; pH 7,2 was geëquilibreerd, waarna 30 de kolom met dezelfde buffer werd gewassen. Het complex van nieuw MDH/ formaldehyde dehydrogenase/NADH dehydrogenase werd met 0,02 M kaliumfosfaatbuffer; pH 7,2, welke 1 M KC1 en Z% sorbitol bevatte, geëlueerd.The supernatant was placed on a DEAE-Sephacel column, containing 0.02 M potassium phosphate buffer; pH 7.2 was equilibrated and the column was washed with the same buffer. The complex of new MDH / formaldehyde dehydrogenase / NADH dehydrogenase was treated with 0.02 M potassium phosphate buffer; pH 7.2, containing 1 M KCl and Z% sorbitol, eluted.
Isolatie van de componenten van het complex 35 Het cel vrije extract werd op de bovenstaand beschreven wijze op de DEAE-Sephacel kolom gebracht. Na wassen van de kolom, werd ^ ” - - " . 9 9 Ü V „ *y 'J O »· * · -9- de NADH dehydrogenase component geë'lueerd met 0,5 M kaliumfosfaatbuffer; pH 6,8. Daarna werden het nieuw MDH en het formaldehyde dehydrogenase gezamenlijk geëlueerd met 0,02 M kaliumfosfaatbuffer; pH 7,2, welke t M KC1 en 2% sorbitol bevatte. Het nieuw methanol dehydrogenase S werd van het formaldehyde dehydrogenase gescheiden door gelfiltratie op een TSK-G 3000 SW kolom in 0,2 M kaliumfosfaatbuffer; pH 7,0.Isolation of the components of the complex. The cell-free extract was applied to the DEAE-Sephacel column as described above. After washing the column, the NADH dehydrogenase component was eluted with 0.5 M potassium phosphate buffer; pH 6.8. the new MDH and the formaldehyde dehydrogenase eluted together with 0.02 M potassium phosphate buffer, pH 7.2, containing t M KCl and 2% sorbitol The new methanol dehydrogenase S was separated from the formaldehyde dehydrogenase by gel filtration on a TSK-G 3000 SW column in 0.2 M potassium phosphate buffer, pH 7.0.
EnzymdetectlesEnzyme Detectles
De activiteiten van het complex werden gemeten in 0,1 M 10 tetranatriumpyrofosfaat, met of zonder aanwezigheid van 0,12 M NH^Cl; pH 9,0, waarbij de reductie van 2,6-dichlorofenol-indofenol (4Q^uM) werd gevolgd bij 600 nm.The activities of the complex were measured in 0.1 M 10 tetrasodium pyrophosphate, with or without the presence of 0.12 M NH 2 Cl; pH 9.0, following the reduction of 2,6-dichlorophenol-indophenol (40 µM) at 600 nm.
Voor de methanoloxydatie activiteit werd 2,5 mM NAD en 2 mM methanol toegepast. De meting van de formaldehyde-oxydatie activiteit vond 15 plaats in tegenwoordigheid van 2,5 mM NAD en 1 mM formaldehyde (gehy-drolyseerd paraformaldehyde). De NADH dehydrogenase activiteit werd gemeten met 280 ^uM NADH in het analysemengsel.For the methanol oxidation activity, 2.5 mM NAD and 2 mM methanol were used. The formaldehyde oxidation activity was measured in the presence of 2.5 mM NAD and 1 mM formaldehyde (hydrolyzed paraformaldehyde). NADH dehydrogenase activity was measured with 280 µM NADH in the analysis mixture.
De activiteiten van de componenten nieuw MDH en formaldehyde dehydrogenase werden met dezelfde NAD en substraat concentra-20 ties als voor het complex gemeten, maar bij 340 nm gevolgd (indicatie voor NADH produktie). De activiteit van het geïsoleerde NADH dehydrogenase werd op dezelfde wijze gemeten als voor het complex.The activities of the novel MDH and formaldehyde dehydrogenase components were measured with the same NAD and substrate concentrations as for the complex, but monitored at 340 nm (indication for NADH production). The activity of the isolated NADH dehydrogenase was measured in the same manner as for the complex.
Resultaten 25 Het cel vrije extract vertoonde uitsluitend kleurstof (DCPIP) afhankelijke methanoloxydatie, indien NAD aanwezig was. Formal-dehyde-oxydatie activiteit kon zowel via NADH vorming als via kleur-stofreductie, indien NAD aanwezig was, worden gemeten.Results The cell free extract showed dye (DCPIP) dependent methanol oxidation only when NAD was present. Formal dehyde oxidation activity could be measured via NADH formation as well as dye reduction if NAD was present.
Het cel vrije extract vertoonde ook kleurstof afhankelijke NADH oxyda-30 tie activiteit.The cell-free extract also showed dye-dependent NADH oxidation activity.
De drie activiteiten werden gemakkelijk geadsorbeerd aan DEAE ionenuitwisselaars. De methanoloxydatie activiteit kon echter alleen geëlueerd worden met buffers, die hydroxyverbindingen zoals sorbitol, glycerol of polyethyleenglycol bevatten. Het dan verkregen 35 eluaat vertoonde alle drie de activiteiten als bovenvermeld voor het cel vrije extract. De gevonden activiteiten zijn in onderstaande tabel <5 TT λ Λ 9 - -------------------The three activities were readily adsorbed on DEAE ion exchangers. However, the methanol oxidation activity could only be eluted with buffers containing hydroxy compounds such as sorbitol, glycerol or polyethylene glycol. The 35 eluate then obtained showed all three activities as mentioned above for the cell-free extract. The activities found are in the table below <5 TT λ Λ 9 - -------------------
VV
-10- A vermeld.-10- A stated.
TABEL ATABLE A
Dehydrogenase activiteiten van de uit DEAE-Sepharose geëlueerde fractie.Dehydrogenase activities of the fraction eluted from DEAE-Sepharose.
(DCPIP +.NAD) analyse......... NADH produktie ® SfmMiraa^ aanwezigheid ,u mol DCPIP geredu- »u mol NADH per1 ' van. NAD 'ceerd per min. en 'min. en per mg .......per mg proteïne proteïne methanol(2) - 0 0 methanol(2) + 0 »032 0 10 formaldehyde (2) - 0 0 formaldehyde (2) + 0,110 0,080 NADH (0,3) ........0,318.......(DCPIP + .NAD) analysis ......... NADH production ® Sphmira presence, u mole DCPIP reduced mole NADH per 1 of. NAD 'ced per min. And' min. and per mg ....... per mg protein protein methanol (2) - 0 0 methanol (2) + 0 »032 0 10 formaldehyde (2) - 0 0 formaldehyde (2) + 0.110 0.080 NADH (0.3 ) ........ 0.318 .......
15 .De methanoloxydatie activiteit ging, anders dan de NADH.15. The methanol oxidation activity was different from the NADH.
en'formaldehyde oxydatie activiteiten, na verloop van tijd verloren, kennelijk als gevolg van de aanwezigheid van zuurstof. Een dergelijke situatie is eerder waargenomen bij klassie.ltMDH, waar bij toelaten van 0a bij een anaëroob preparaat een snelle transformatie in een NH3-20 afhankelijke enzymvorm optreedt (zie Duine et al, J.Gen.Microbiol.115, blz. 523-526 (1979)). Door toevoeging van ammoniumzouten werd ook hier de methanoloxydatie activiteit verhoogd, zoals onderstaande tabel B voor een gedeeltelijk verouderd preparaat laat zien.and formaldehyde oxidation activities, lost over time, apparently due to the presence of oxygen. Such a situation has previously been observed in class 1 MDM, where admission of 0a to an anaerobic preparation results in a rapid transformation into an NH 3-20 dependent enzyme form (see Duine et al, J. Gen. Microbiol. 115, 523-526 (1979)). The addition of ammonium salts also increased the methanol oxidation activity here, as shown in Table B below for a partially aged preparation.
25 TABEL B25 TABLE B
Dialyse van de uit DEAE-Sepharose geëlueerde fractie.Dialysis of the fraction eluted from DEAE-Sepharose.
enzymbereiding toevoeging van (DCPIP + NAD) analyse, na NH3 ,u mol DCPIP gereduceerd per .. .' .'minuut.en.per.mg.proteïne 30 anaerobe dialyse - 0,031 anaerobe dialyse + 0,048 aerobe dialyse - 0,002 aerobe dialyse........+ ' 0,051 1 ^ _ a 3 r. ~ ’ *-v ·-·?-------------------------- U v * v - -11- %enzyme preparation addition of (DCPIP + NAD) analysis, after NH3, u mol DCPIP reduced per ... minute and per protein protein anaerobic dialysis - 0.031 anaerobic dialysis + 0.048 aerobic dialysis - 0.002 aerobic dialysis ....... + 0.051 1 ^ a 3 r. ~ ’* -V · - ·? -------------------------- U v * v - -11-%
Door HPLC geTfiltratie in een sorbitol bevattende buf-feroplossing werd het bestaan van een complex met een molekuulgewicht van ongeveer 200-000 aangetoond, welk complex alle drie de activiteiten bevatte. HPLC gelfi1tratie in een buffer zonder sorbitol wees op 5 dissociatie van het complex, omdat NADH dehydrogenase gevonden werd bij een retentietijd van 21 minuten in plaats van 14 minuten. Elutie van het NADH dehydrogenase uit de DEAE Sephacel bleek inderdaad mogelijk met een sorbitol vrije buffer (0,5 M kaliumfosfaat; pH 6,8; NADH s 50/uM), waarbij de resterende twee activiteiten geadsorbeerd bleven.Filtration by HPLC in a sorbitol-containing buffer solution demonstrated the existence of a complex having a molecular weight of about 200-000, which complex contained all three activities. HPLC gel filtration in a buffer without sorbitol indicated dissociation of the complex, because NADH dehydrogenase was found at a retention time of 21 minutes instead of 14 minutes. Indeed, elution of the NADH dehydrogenase from the DEAE Sephacel was found to be possible with a sorbitol free buffer (0.5 M potassium phosphate; pH 6.8; NADH s 50 / µM), leaving the remaining two activities adsorbed.
10 Met een 1 MKC1, 2% sorbitol bevattende 0,02 M kaliumfosfaatbuffer; pH10 With a 1 MKC1, 2% sorbitol containing 0.02 M potassium phosphate buffer; pH
7,2, werd NAD-afhankelijk formaldehyde dehydrogenase geëlueerd, dat niet langer via kleurstofreductie kon worden aangetoond en een 30x zo hoge waarde voor formaldehyde vertoonde dan het enzym in het complex.7.2, NAD-dependent formaldehyde dehydrogenase was eluted, which could no longer be detected via dye reduction and exhibited a 30x higher formaldehyde value than the enzyme in the complex.
15 Gel filtratie op een HPLC kolom bevestigde het idee dat sprake was van twee enzymen omdat een gedeeltelijke scheiding van de twee enzymenGel filtration on an HPLC column confirmed the idea that there were two enzymes because a partial separation of the two enzymes
Nieuw MDH bevattende fracties werden op PQQ geanalyseerd door denaturering gedurende 2 minuten op een kokend waterbad, afkoel en, centrifugeren en omgekeerde fase HPLC van de supematanten volgens de 20 procedure, beschreven door Duine et al in Analytical Biochemistry 133 (1983). Er werden hoeveelheden PQQ gevonden, die evenredig waren met de oorspronkelijke methanoldehydrogenase activiteit.New MDH containing fractions were analyzed on PQQ by denaturation for 2 minutes on a boiling water bath, cooling, centrifugation and reverse phase HPLC of the supernatants according to the procedure described by Duine et al in Analytical Biochemistry 133 (1983). Amounts of PQQ were found to be proportional to the original methanol dehydrogenase activity.
Geïsoleerd nieuw methanol dehydrogenase bleek niet in staat om een methanoloxydatie te katalyseren.. Wel trad een wijziging 25 in het absorptiespectrum op bij aanwezigheid van methanol en NAD, maar deze lag bij ongeveer 325 nm (NADH produktie zou bij 34Q nm zichtbaar moeten zijn) en bleek ongevoelig voor verdere toevoegingen van methanol en NAD,Isolated new methanol dehydrogenase was unable to catalyze a methanol oxidation. However, a change in the absorption spectrum occurred in the presence of methanol and NAD, but was at approximately 325 nm (NADH production should be visible at 34Q nm) and proved insensitive to further additions of methanol and NAD,
Door recombinatie, d.w.z. bij elkaar voegen van de af-30 zonderlijke componenten in bufferoplossingen, kon het complex weer worden teruggevormd,, hetwelk bleek uit het opnieuw betreden van een kleurstofgebonden, NAD-afhankelijke methanoloxydatie.Recombination, i.e., combining the separate components in buffer solutions, allowed the complex to be reformed again, which was evidenced by re-entering a dye-bound, NAD-dependent methanol oxidation.
q ~ C. ~ .* 'q ~ C. ~. * '
Claims (10)
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8303082A NL8303082A (en) | 1983-09-05 | 1983-09-05 | METHANOL DEHYDROGENASE ENZYME; METHOD FOR GROWING MICRO-ORGANISMS; CHEMICAL PRODUCTS; MICRO-ORGANISMS CATALYZED EPOXY DATES OR HYDROXYLATIONS; METHYLOTROPHIC MICROORGANISMS. |
| PCT/NL1984/000029 WO1985001063A1 (en) | 1983-09-05 | 1984-08-28 | Methanol dehydrogenase enzyme; a process for culturing micro-organisms; chemical products; epoxidations or hydroxylations catalyzed by micro-organisms; methylotrophic micro-organisms |
| EP84903204A EP0153943A1 (en) | 1983-09-05 | 1984-08-28 | Methanol dehydrogenase enzyme; a process for culturing micro-organisms; chemical products; epoxidations or hydroxylations catalyzed by micro-organisms; methylotrophic micro-organisms |
| AU33175/84A AU3317584A (en) | 1983-09-05 | 1984-08-28 | Methanol dehydrogenase enzyme a process for culturing micro- organisms chemical products epoxidations or hydroxylations catalzed by micro-organisms methylotrophic micro-organisms |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8303082A NL8303082A (en) | 1983-09-05 | 1983-09-05 | METHANOL DEHYDROGENASE ENZYME; METHOD FOR GROWING MICRO-ORGANISMS; CHEMICAL PRODUCTS; MICRO-ORGANISMS CATALYZED EPOXY DATES OR HYDROXYLATIONS; METHYLOTROPHIC MICROORGANISMS. |
| NL8303082 | 1983-09-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8303082A true NL8303082A (en) | 1985-04-01 |
Family
ID=19842352
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8303082A NL8303082A (en) | 1983-09-05 | 1983-09-05 | METHANOL DEHYDROGENASE ENZYME; METHOD FOR GROWING MICRO-ORGANISMS; CHEMICAL PRODUCTS; MICRO-ORGANISMS CATALYZED EPOXY DATES OR HYDROXYLATIONS; METHYLOTROPHIC MICROORGANISMS. |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0153943A1 (en) |
| AU (1) | AU3317584A (en) |
| NL (1) | NL8303082A (en) |
| WO (1) | WO1985001063A1 (en) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341130C (en) * | 1984-07-27 | 2000-10-31 | Adrianus Marinus Ledeboer | Use of oxidoreductases in bleaching and/or detergent compositions and their preparation by microorganisms engineered by recombinant dna technology |
| US5741672A (en) * | 1984-07-27 | 1998-04-21 | Unilever Patent Holdings B.V. | Expression and production of polypeptides using the promoters of the hansenula polymorpha MOX and DAS genes |
| CN1301818A (en) * | 1999-12-27 | 2001-07-04 | 上海博德基因开发有限公司 | New polypeptide-quinoprotein reductase 7 and polynucleotide coding such polypeptide |
| WO2015013295A1 (en) * | 2013-07-22 | 2015-01-29 | Lygos, Inc. | Recombinant production of chemicals from methane or methanol |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK154779A (en) * | 1978-04-14 | 1979-10-15 | Exxon Research Engineering Co | PROCEDURE FOR EPOXIDATION OF LOWER ALFAOLEFINS |
| EP0066994A3 (en) * | 1981-06-04 | 1984-02-01 | Imperial Chemical Industries Plc | Production and use of genetically-modified microorganisms |
-
1983
- 1983-09-05 NL NL8303082A patent/NL8303082A/en not_active Application Discontinuation
-
1984
- 1984-08-28 EP EP84903204A patent/EP0153943A1/en not_active Withdrawn
- 1984-08-28 AU AU33175/84A patent/AU3317584A/en not_active Abandoned
- 1984-08-28 WO PCT/NL1984/000029 patent/WO1985001063A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0153943A1 (en) | 1985-09-11 |
| WO1985001063A1 (en) | 1985-03-14 |
| AU3317584A (en) | 1985-03-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Valentine | Bacterial ferredoxin | |
| Schneider et al. | Purification and properties of soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus H 16 | |
| Trower et al. | Isolation and characterization of a cyclohexane-metabolizing Xanthobacter sp | |
| Lee et al. | Enzyme-catalyzed organic synthesis: a comparison of strategies for in situ regeneration of NAD from NADH | |
| Alefounder et al. | A periplasmic location for methanol dehydrogenase from Paracoccusdenitrificans: Implications for proton pumping by cytochrome aa3 | |
| Machida et al. | Purification and properties of pyranose oxidase from Coriolus versicolor | |
| Kawai et al. | Bacterial oxidation of polyethylene glycol | |
| Guillén et al. | Oxygen activation during oxidation of methoxyhydroquinones by laccase from Pleurotus eryngii | |
| Abril et al. | Enzymatic Baeyer-Villiger type oxidations of ketones catalyzed by cyclohexanone oxygenase | |
| CN101437949B (en) | Method of producing hydroxycarboxylic acid by regenerating coenzyme | |
| Kniemeyer et al. | (S)-1-Phenylethanol dehydrogenase of Azoarcus sp. strain EbN1, an enzyme of anaerobic ethylbenzene catabolism | |
| Sahm et al. | Metabolism of methanol by Rhodopseudomonas acidophila | |
| Imlay et al. | Superoxide production by respiring membranes of Escherichia coli | |
| Kremer et al. | Ethanol dissimilation in Desulfovibrio | |
| Chiang et al. | Cholest-4-en-3-one-Δ1-dehydrogenase, a flavoprotein catalyzing the second step in anoxic cholesterol metabolism | |
| Nishiyama et al. | Hydrogen peroxide-forming NADH oxidase belonging to the peroxiredoxin oxidoreductase family: existence and physiological role in bacteria | |
| Schramm et al. | Ether-cleaving enzyme and diol dehydratase involved in anaerobic polyethylene glycol degradation by a new Acetobacterium sp. | |
| Dolin | OXIDATION OF REDUCED DIPHOSPHOPYRIDINE NUCLEOTIDE BY CLOSTRIDIUM PERFRINGENS I: Relation of Peroxide to the Over-all Reaction | |
| Hektor et al. | Nicotinoprotein methanol dehydrogenase enzymes in Gram-positive methylotrophic bacteria | |
| NL8303082A (en) | METHANOL DEHYDROGENASE ENZYME; METHOD FOR GROWING MICRO-ORGANISMS; CHEMICAL PRODUCTS; MICRO-ORGANISMS CATALYZED EPOXY DATES OR HYDROXYLATIONS; METHYLOTROPHIC MICROORGANISMS. | |
| Kawai | Existence of ether bond-cleaving enzyme in a polyethylene glycol-utilizing symbiotic mixed culture | |
| Arfman et al. | Environmental regulation of alcohol metabolism in thermotolerant methylotrophic Bacillus strains | |
| Samain et al. | Isolation of succinate dehydrogenase from Desulfobulbus elongatus, a propionate oxidizing, sulfate reducing bacterium | |
| US5085993A (en) | Coenzyme-independent l-sorbosone dehydrogenase from pseudomonas putida | |
| Boulton et al. | N-methylglutamate dehydrogenase, a flavohaemoprotein purified from a new pink trimethylamine-utilizing bacterium |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |