NL8301093A - PROCESS FOR PREPARING A LOW-MOLOCULAR PEPTIDE. - Google Patents

Description

4 JShn,..."S . * -1- 22991/Vk/mb4 JShn, ... "S. * -1- 22991 / Vk / mb

Korte aanduiding: Werkwijze voor het bereiden van een laag molekulair peptide, (afsplitsing van 7611698).Short designation: Process for preparing a low molecular weight peptide, (split from 7611698).

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het 5 bereiden van een laag mo-lekulair peptide met formule X-A-E-Q, waarin A en Q gelijk of verschillend zijn en wel een aminozuur- of peptiderest, X een beschermende groep voor een aminogroep is en Q een beschermende groep voor een carboxylgroep is, te weten een tertiaire alkoxy-, ethoxy-, benzyloxy, benzylamino- en benzhydrylaminogroep, eventueel gesubstitueerd 10 met een inerte substituent.The invention relates to a method for preparing a low molecular peptide of formula XAEQ, wherein A and Q are the same or different, namely an amino acid or peptide residue, X is a protecting group for an amino group and Q is a protecting group for a carboxyl group, namely a tertiary alkoxy, ethoxy, benzyloxy, benzylamino and benzhydrylamino group, optionally substituted with an inert substituent.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit Chem. Abstr. 57, 3560b-i (1962), waar de omzetting van carbobenzoxy-D,L-fenylalanine met het waterstofchloridezout van de ethylester van glycine in aanwezigheid van chymotrypsine is beschreven; verkregen wordt de ethylester van 15 carbobenzoxy-L-fenylalanyl-glycine. Ook wordt een dergelijke werkwijze beschreven door J.S. Fruton in Advances in Protein Chemistry, (1949) (Academie Press Inc., New York, N.Y.); hier is bijvoorbeeld sprake van de bereiding van benzyloxycarbonyl-fenylalanyl-glycyl-tyrosinearaide door reactie van benzyloxycarbonyl-fenylalanyl-glycine met tyrosineamide 20 in aanwezigheid van papaïne.Such a method is known from Chem. Abstr. 57, 3560b-i (1962), where the reaction of carbobenzoxy-D, L-phenylalanine with the hydrochloride salt of the ethyl ester of glycine in the presence of chymotrypsin has been described; the ethyl ester of carbobenzoxy-L-phenylalanyl-glycine is obtained. Such a method is also described by J.S. Fruton in Advances in Protein Chemistry, (1949) (Academy Press Inc., New York, N.Y.); this refers, for example, to the preparation of benzyloxycarbonyl-phenylalanyl-glycyl-tyrosine arid by reaction of benzyloxycarbonyl-phenylalanyl-glycine with tyrosine amide in the presence of papain.

Desalniettemin lijkt deze methode van peptidebereiding voor de vakman weinig aantrekkelijk te zijn geweest. Enzymatische peptidebereiding blijkt voornamelijk te zijn toegepast in de zogeheten plasteïne-condensatie, waarbij wordt uitgegaan van aan de eindstandige amino- en 25 carboxylgroepen niet beschermde oligopeptiden. In het Amerikaanse | octrooischrift 3.803.327 is zulk een plasteïne-condensatie beschreven, waarbij een waterbevattende oplossing van oligopeptiden met een gemiddeld molecuulgewicht van 1200-2000 wordt behandeld met een enzym, gekozen uit chymotrypsine, pepsine, subtilisine, aspergillo peptidase A 30 of een van Rhizopus sp afkomstig neutraal proteinase, bij een temperatuur van 37 °C en een pH-waarde van 3-7. Volgens L. Zervas, Peptides (1965), blz. 89-98, met name blz. 96-97, moeten de bij de plasteïne-condensatie in aanwezigheid van pepsine als uitgangsverbindingen toe te passen oligopeptiden uit ten minste 4 aminozuurresten bestaan. Naderhand 35 is gebleken dat men aan de oligopeptiden aminozuren of dipeptiden kan toevoegen welke dan in het plasteïne-condensaat worden ingebouwd.Nevertheless, this method of peptide preparation does not seem to have been attractive to those skilled in the art. Enzymatic peptide preparation appears to have been mainly used in the so-called plasteine condensation, starting from oligopeptides which are not protected at the terminal amino and carboxyl groups. In American | U.S. Pat. No. 3,803,327 discloses such a plasteine condensation wherein an aqueous solution of oligopeptides having an average molecular weight of 1200-2000 is treated with an enzyme selected from chymotrypsin, pepsin, subtilisin, aspergillo peptidase A 30 or Rhizopus sp. neutral proteinase, at a temperature of 37 ° C and a pH value of 3-7. According to L. Zervas, Peptides (1965), pp. 89-98, in particular pp. 96-97, the oligopeptides to be used as starting compounds in the plasteine condensation in the presence of pepsin must consist of at least 4 amino acid residues. It has subsequently been found that it is possible to add amino acids or dipeptides to the oligopeptides, which are then incorporated into the plasteine condensate.

In dit verband wordt gewezen op Chem. Abstr. 74, 11982a (1971) waarin sprake is van het toepassen van chymotrypsine en op 8301093 - ---- -2- 22991/Vk/mb J. Agr. Food. Chem. Ij), 1151-1154, (1971); in de laatsgenoemde publicatie worden als enzym onder meer een alkalisch proteinase, ficine, papaïne en pronase vermeld. Verder is in Biochemistry j3, 3703-3710 (1969) een gerichte peptidesynthese beschreven, waarbij een aminozuur 5 op een voorafbepaalde positie in een peptideketen van een polypeptide wordt ingebouwd in aanwezigheid van trypsine. Al deze bekende werkwijzen hebben betrekking op de bereiding van peptiden met een betrekkelijk hoog molecuulgewicht, terwijl volgens de onderhavige werkwijze laag moleculaire peptiden, namelijk dipeptiden, tripeptiden of tetrapeptiden 10 worden verkregen. Verder is uit het Amerikaanse octrooischrift 3.544.426 een in waterbevattend milieu bij een pH-waarde van 7-8 uitgevoerde enzymatische peptidebereiding bekend, waarbij het enzym is verkregen uit dierlijk weefsel, bijvoorbeeld kalfslever, en de reactie wordt uitgevoerd in aanwezigheid van een fosforzuurderivaat van een 15 nucleoside en, bij voorkeur, tevens van magnesiumionen. In voorbeeld i van dit Amerikaanse octrooischrift wordt aldus, uitgaande van een tripeptide, door opeenvolgende omzetting met methylesters van vier verschillende aminozuren en heptapeptide bereid in een opbrengst van ongeveer 90%.In this connection reference is made to Chem. Abstr. 74, 11982a (1971) which refers to the use of chymotrypsin and 8301093 - ---- -2- 22991 / Vk / mb J. Agr. Food. Chem. Ij), 1151-1154, (1971); in the latter publication, as an enzyme, reference is made, inter alia, to an alkaline proteinase, ficin, papain and pronase. Furthermore, Biochemistry J3, 3703-3710 (1969) describes a directed peptide synthesis, wherein an amino acid 5 is incorporated into a peptide chain of a polypeptide at a predetermined position in the presence of trypsin. All these known methods relate to the preparation of peptides of a relatively high molecular weight, while according to the present method low molecular peptides, namely dipeptides, tripeptides or tetrapeptides, are obtained. Furthermore, U.S. Pat. No. 3,544,426 discloses an enzymatic peptide preparation carried out in an aqueous medium at a pH value of 7-8, wherein the enzyme is obtained from animal tissue, for example calf liver, and the reaction is carried out in the presence of a phosphoric acid derivative of a nucleoside and, preferably, also of magnesium ions. Thus, in Example 1 of this U.S. Patent, starting from a tripeptide, it is prepared by successive reaction with methyl esters of four different amino acids and heptapeptide in a yield of about 90%.

20 Veel gebruikelijker dan de enzymatische bereiding van pepti den zijn evenwel chemische syntheses, zoals bijvoorbeeld beschreven in G.R. Pettit "Synthetic Peptides", Vol.I, (uitg. Van Nostrand, 1970).However, much more common than the enzymatic preparation of peptides are chemical syntheses, as described, for example, in G.R. Pettit "Synthetic Peptides", Vol. I, (Van Nostrand, 1970).

Deze chemische syntheses hebben een aantal nadelen, met name racemi-.sering. Met de onderhavige werkwijze wordt het optreden van racemisering 25 vermeden, terwijl de gewenste peptiden dikwijls kunnen worden verkregen in opbrengsten van 60% of meer.These chemical syntheses have a number of drawbacks, especially racemization. The present method avoids the occurrence of racemization, while the desired peptides can often be obtained in yields of 60% or more.

De uitvinding heeft nu betrekking op de in de aanhef omschreven werkwijze, met het kenmerk, dat een zuurcomponent van een aminozuur of peptide met een N-eindstandige beschermende groep met de 30 formule X-A-OH of een zout daarvan in reactie wordt gebracht met een aminecomponent van een aminozuur of peptide met een C-eindstandige beschermende groep met de formule H-E-Q of een zout hiervan, in aanwezigheid van een Substilisine in een waterige oplossing met een pH-waarde van 6-9.The invention now relates to the method described in the opening paragraph, characterized in that an acid component of an amino acid or peptide with an N-terminal protective group of the formula XA-OH or a salt thereof is reacted with an amine component of an amino acid or peptide having a C-terminal protecting group of the formula HEQ or a salt thereof, in the presence of a Substilisine in an aqueous solution with a pH value of 6-9.

35 Opgemerkt zij nog, dat in de op 28 oktober 1975 ter inzage gelegde Nederlandse octrooiaanvrage 7504254 sprake is van de bereiding van een peptide door aminozuurderivaten in een waterbevattend milieu bij een pH-waarde van 2-6 te laten reageren in aanwezigheid van pepsine; 8301093 * —........- -*· -3- 22991/Vk/mb in de gegeven voorbeelden wordt de bereiding beschreven van peptiden bestaande uit 3-7 aminozuurresten. Het in deze oudere octrooiaanvrage toegepaste enzym is echter geen Substilisine.It should also be noted that Dutch patent application 7504254, which was filed for inspection on October 28, 1975, refers to the preparation of a peptide by reacting amino acid derivatives in a water-containing medium at a pH value of 2-6 in the presence of pepsin; 8301093 * - - - - - - - 22991 / Vk / mb In the examples given, the preparation of peptides consisting of 3-7 amino acid residues is described. However, the enzyme used in this earlier patent application is not Substilisine.

Substilisine is een serineproteïnase en kan worden bereid 5 onder toepassing van B. Subtilis of soortgelijke microörganismen zoals Carsberg, Novo of BPN1,.Substilisin is a serine proteininase and can be prepared using B. Subtilis or similar microorganisms such as Carsberg, Novo or BPN1.

Het uitgangsmateriaal met de formule X-A-OH waarin X een beschermende groep is voor de eindetandige aminogroep en A een aminozuurrest of een peptiderest vooretelt wordt verder aangeduid als 10 zuurcomponent. Voorbeelden van in radikaal A opgenomen aminozuren zijn: alifatische monoaminomonocarbonzuren zoals glycine (Gly), alanine (Ala), valine (Val), norvaline (nor-Val), leucine (Leu), iaoleucine (He), norleucine (nor-Leu), oxyaminozuren zoals serine (Ser), threonine (Thr), 15 homo-serine (homo-Ser), zwavelbevattende aminozuren zoals methionine (Met), cystine (CysS) en cysteine (Cys), monoaminodicarbonzuren zoals asparaginezuur (Asp), glutamine-zuur (Glu), asparagine (Asn),glutamine (Gin), 20 diarainomonocarbonzuren zoals ornithine (Orn), lysine (Lys), arginine (Arg), aromatische aminozuren zoals fenylalanine (Phe), tyrosine Oiyr), heterocyclische aminozuren zoals histidine (His), tryptofaan (Trp) en proline (Pro).The starting material of the formula X-A-OH wherein X is a protecting group for the endine amino group and A pre-represents an amino acid residue or a peptide residue is further referred to as an acid component. Examples of amino acids included in radical A are: aliphatic monoaminomonocarboxylic acids such as glycine (Gly), alanine (Ala), valine (Val), norvaline (nor-Val), leucine (Leu), iaoleucine (He), norleucine (nor-Leu) oxyamino acids such as serine (Ser), threonine (Thr), homo-serine (homo-Ser), sulfur-containing amino acids such as methionine (Met), cystine (CysS) and cysteine (Cys), monoaminodicarboxylic acids such as aspartic acid (Asp), glutamine acid (Glu), asparagine (Asn), glutamine (Gin), 20 diarainomonocarboxylic acids such as ornithine (Orn), lysine (Lys), arginine (Arg), aromatic amino acids such as phenylalanine (Phe), tyrosine Oiyr), heterocyclic amino acids such as histidine ( His), tryptophan (Trp) and proline (Pro).

25 De aminozuren worden verder aangeduid met de algemeen toege paste symbolen. De peptiden worden aangeduid door combinatie van deze symbolen.The amino acids are further indicated by the commonly used symbols. The peptides are indicated by combination of these symbols.

De beschermende groepen voor de vrije eindstandige aminogroep (N-eindstandige beschermende groep) van de zuurcomponent zijn de in de peptidechemie voor dit doel gebruikelijke groepen zoals 30 tertiaire alkoxycarbonylgroepen, t-butoxycarbonyl (BOC), t-amyloxycarbonyl (t-Aoc); benzyloxycarbonyl (Z), p-methoxybenzyloxycarbonyl (PMZ), 3,5-di-methoxybenzyloxycarbonyl ZiOMe^ , 2,4,6-trimethylbenzyloxycarbonyl (TMZ), p-fenylazobenzyloxycarbonyl (PZ), p-tolueensulfonyl (Tos) en o-nitrofenyl-sulfonyl (Nps).The protecting groups for the free-terminal amino group (N-terminal protecting group) of the acid component are the groups commonly used in peptide chemistry for this purpose, such as tertiary alkoxycarbonyl groups, t-butoxycarbonyl (BOC), t-amyloxycarbonyl (t-Aoc); benzyloxycarbonyl (Z), p-methoxybenzyloxycarbonyl (PMZ), 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl ZiOMe ^, 2,4,6-trimethylbenzyloxycarbonyl (TMZ), p-phenylazobenzyloxycarbonyl (PZ), p-toluenesulfonyl (Tos) and o-nitrophenyl -sulfonyl (Nps).

35 Het uitgangsmateriaal met de formule H-E-Q wordt aangeduid als aminecomponent. In deze formule geeft E een aminozuurrest of een peptiderest weer, waarin, evenals dat hierboven het geval is bij radi— ^nal A, de gebruikelijke aminozuren kunnen zijn opgenomen· Toepasbare - 8301093 -4- 22991/Vk/mb beschermende groepen voor de carboxylgroep (C-eindstandige beschermende groepen) zijn bijvoorbeeld lagere alkoxygroepen met 1-4 koolstofatomen zoals t-butoxy (OBu1"); benzyloxy (OBzl), ρ-nitrobenzyloxy £(OBzl) (p-NOgjJ; benzhydryloxy (OBzh), benzylamino (NHBzl), 2,4-dimethoxybenzylamino 5 (NHDMB) of benzhydrylamino (NHBzh). Deze beschermende groepen voor de eindstandige carboxylgroep van de aminecomponent zijn bestand tegen esterase- en amiderasereacties die worden veroorzaakt door Substilisine.The starting material of the formula H-E-Q is referred to as an amine component. In this formula, E represents an amino acid residue or a peptide residue, which, as is the case with Radiol A above, may include the usual amino acids · Applicable - 8301093 -4-22991 / Vk / mb protecting groups for the carboxyl group (C-terminal protecting groups) are, for example, lower alkoxy groups with 1-4 carbon atoms such as t-butoxy (OBu1 "); benzyloxy (OBzl), ρ-nitrobenzyloxy (OBzl) (p-NOgjJ; benzhydryloxy (OBzh), benzylamino (NHBzl ), 2,4-dimethoxybenzylamino (NHDMB) or benzhydrylamino (NHBzH) These protecting groups for the terminal carboxyl group of the amine component are resistant to esterase and amiderase reactions caused by Substilisine.

i)e zuurcomponent en de aminecomponent bevatten aminozuur-resten en peptideresten met een functionele groep aan een zijketen. Het 10 verdient de voorkeur de functionele groep met een beschermende groep te beschermen. Geschikte beschermende groepen voor de u -aminogroep (N^)) zijn N£j-benzyloxycarbonyl (ND-Z), t-butoxycarbonyl (N °-BOC) en tosyli) The acid component and the amine component contain amino acid residues and peptide residues with a functional group on a side chain. It is preferable to protect the functional group with a protecting group. Suitable protecting groups for the--amino group (N 2)) are N 2 -benzyloxycarbonyl (ND-Z), t-butoxycarbonyl (N ° -BOC) and tosyl

QQ

(N^-Tos). Geschikte beschermende groepen voor de N-guanidinogroep (N ) van Arg zijn nitro (N^-NO ), N^-benzyloxycarbonyl (N^-Z) en N^.N^-dibenzyl-c ^ 15 oxycarbonyl (N -Z-Z). Geschikte beschermende groepen voor de imidazoöl-ringen (N^m) van His zijn N^m-benzyl (N^m-Bzl) en tosyl (N^m-Tos). Een geschikte beschermende groep voor de u-carboxylgroep is CD-benzyloxy (-OBzl). Geschikte beschermende groepen voor de hydroxylgroep van alifa-tische of aromatische oxyaminozuren zijn aralkylgroepen zoals benzyl (Bzl). 20 Een geschikte S-beschermende groep voor de raercaptogroep van Cys is de benzylgroep (Bzl). De beschermende groepen moeten de eigenschap hebben dat ze stabiel zijn bij de hoofdreactie en ze moeten geraakkelijk uit het produkt kunnen worden verwijderd zonder dat nevenreacties optreden. De zuurcomponent en de aminecomponent die als uitgangsstof worden toegepast 25 kunnen beschermende groepen bevatten of de 0C -aminogroep van de araine- component kan vrij zijn of de vorm hebben van een anorganisch of organisch zout zoals hydrochloride, hydrobromide, oxalaat, p-tolueensulfonaat of acetaat.(N ^ -Tos). Suitable protecting groups for the N-guanidino group (N) of Arg are nitro (N ^ -NO), N ^ -benzyloxycarbonyl (N ^ -Z) and N ^ .N ^ -dibenzyl-c ^ 15 oxycarbonyl (N -ZZ) . Suitable protecting groups for the imidazole rings (N 4 m) of His are N 4 m-benzyl (N 4 m-Bzl) and tosyl (N 4 m-Tos). A suitable protecting group for the--carboxyl group is CD-benzyloxy (-OBzl). Suitable protecting groups for the hydroxyl group of aliphatic or aromatic oxyamino acids are aralkyl groups such as benzyl (Bzl). A suitable S-protecting group for the Cys raercapto group is the benzyl group (Bzl). The protecting groups must have the property of being stable in the main reaction and they must be capable of being removed from the product without causing side reactions. The acid component and the amine component used as starting material may contain protecting groups or the 0C-amino group of the araine component may be free or in the form of an inorganic or organic salt such as hydrochloride, hydrobromide, oxalate, p-toluenesulfonate or acetate .

Bij de onderhavige reactie kan de pH-waarde van 6-9 30 op twee manieren worden gehandhaafd. De condensatiereactie kan worden uitgevoerd in een bufferoplossing zoals een citroenzure buffer-oplossing, een Mcllvaine-, Kolthoff-, tris-HCl- of een Veronal-buffer-oplossing waarin, de zuurcomponent en de aminecomponent worden opgelost en waaraan het enzym wordt toegevoegd. Verder kan de condensatiereactie 35 worden uitgevoerd terwijl de pH van het reactieraengsel in het juiste gebied wordt gehouden door zuur of base aan het reactiemengsel toe te voegen al naar gelang de bepaalde pH-waarde.In the present reaction, the pH value of 6-9 can be maintained in two ways. The condensation reaction can be carried out in a buffer solution such as a citric acid buffer solution, a Mcllvaine, Kolthoff, tris-HCl or Veronal buffer solution in which the acid component and the amine component are dissolved and to which the enzyme is added. Furthermore, the condensation reaction can be carried out while keeping the pH of the reaction mixture in the correct range by adding acid or base to the reaction mixture according to the determined pH value.

De uitgangsstoffen worden gewoonlijk toegepast in een ver- 8301093 •ώ — -a* -5- 22991/Vk/mb houding van 0,8 tot 2 mol, bij voorkeur 1 tot 1,5 mol zuuroomponent per mol aminecomponent. Wanneer de uitgangsstoffen niet goed oplosbaar zijn in water, is het mogelijk de oplosbaarheid van de reagentia te verbeteren door een oplosmiddel toe te voegen zoals methanol, 5 ethanol, dimethylformamide, dioxan, tetrahydrofuran en dimethylsulfoxide. Deze oplosmiddelen worden aan de waterige oplossing toegevoegd. De toegevoegde hoeveelheid oplosmiddel moet worden beperkt om de activiteit van het enzym bij de reactie volgens de uitvinding niet te verstoren. Wanneer een oplosmiddel wordt toegepast wordt dit 10 gewoonlijk gebruikt in een hoeveelheid van minder dan 1 gewichtsdeel, bij voorkeur 0,1-1,0 gewichtsdeel,per gewichtsdeel water. De reactie volgens de uitvinding wordt in waterig- medium uitgevoerd en het is noodzakelijk de relatieve oplosbaarheid van het reactieprodukt te verminderen, bij voorkeur tot een betrekkelijk slecht oplosbare of onop-15 losbare toestand in het systeem.The starting materials are usually used in a ratio of 0.8 to 2 moles, preferably 1 to 1.5 moles, of acid atomic component per mole of amine component. When the starting materials are not readily soluble in water, it is possible to improve the solubility of the reagents by adding a solvent such as methanol, ethanol, dimethylformamide, dioxane, tetrahydrofuran and dimethyl sulfoxide. These solvents are added to the aqueous solution. The amount of solvent added must be limited so as not to interfere with the activity of the enzyme in the reaction of the invention. When a solvent is used, it is usually used in an amount of less than 1 part by weight, preferably 0.1-1.0 part by weight, per part by weight of water. The reaction according to the invention is carried out in aqueous medium and it is necessary to reduce the relative solubility of the reaction product, preferably to a relatively sparingly soluble or insoluble state in the system.

De toegepaste hoeveelheid Substilisine ligt tussen 10 en 500 mg, en is bij voorkeur 10-400 mg, meer in het bijzonder 50-300 mg per mmol aminecomponent.. De reactietemperatuur ligt gewoonlijk tussen 20 en 55 °C, bij voorkeur tussen 30 en 40 °C, bij welke temperatuur 20 de enzymactiviteit kan worden gehandhaafd. De reactie vindt onder deze omstandigheden plaats in 1-24 uren. Het reactieprodukt slaat neer uit het j reactiesysteera en het kan makkelijk worden afgescheiden.The amount of Substilisin used is between 10 and 500 mg, and is preferably 10-400 mg, more in particular 50-300 mg per mmol amine component. The reaction temperature is usually between 20 and 55 ° C, preferably between 30 and 40 ° C, at which temperature the enzyme activity can be maintained. The reaction takes place under these conditions in 1-24 hours. The reaction product precipitates from the reaction system and can be easily separated.

Voorbeeld iExample i

Kolthof f buf f eroplossing met een pH -waarde van 8,5 weed in een hoe-25 veelheid van 20 ml toegevoegd aan 409 mg (1,10 mmol) B0C-Tyr(Bzl)-0H en 303 mg (1,00 mmol) H-Val-NHDMB.HC1 en daarna werd 1,0 ml 1N NaOH aan het mengsel toegevoegd. Vervolgens werd onder roeren 100 mg Substilisine ii (titer 100 x 10 PUN/g, in de handel gebracht door Nagase Sangyo K.K.) aan het mengsel toegevoegd bij 38 °C en de reactie werd gedurende 24 uren 30 uitgevoerd. Het gel-neerslag werd gefiltreerd en werd achtereenvolgens gewassen met water, 0,5 N HC1, 7% ammonia en water, waarbij 361 mg ruwe kristallen van het produkt werden verkregen. Dit produkt werd opgelost in methanol en de warme oplossing werd geschud met actieve kool om eiwit te verwijderen. De oplossing werd ingedampt en het produkt werd 35 herkristalliseerd door water toe te voegen, waarbij een zuiver produkt BOC-Tyr(Bzl)-Val-NHDMB werd verkregen. De opbrengst bedroeg 297 mg 83 0 1 0 9 3 ___ * -6- 22991/Vk/mb (48?) en het smelttraject was 165-168 °C. De waar,<ie was -0,8 (C = 0,25; chloroform) en de gegevens uit de elementair-analyse waren: C (?) H (?) N (?) berekend 67,83 7,32 6,78 5 gevonden 67,71 7,35 6,60Kolthof f buf f solution with a pH value of 8.5 weed in an amount of 20 ml added to 409 mg (1.10 mmol) B0C-Tyr (Bzl) -0H and 303 mg (1.00 mmol) H-Val-NHDMB.HCl and then 1.0 ml 1N NaOH was added to the mixture. Then, with stirring, 100 mg of Substilisin ii (titer 100 x 10 PUN / g, sold by Nagase Sangyo K.K.) was added to the mixture at 38 ° C and the reaction was carried out for 24 hours. The gel precipitate was filtered and washed successively with water, 0.5 N HCl, 7% ammonia and water, yielding 361 mg of crude crystals of the product. This product was dissolved in methanol and the warm solution was shaken with activated charcoal to remove protein. The solution was evaporated and the product was recrystallized by adding water to obtain a pure product BOC-Tyr (Bzl) -Val-NHDMB. The yield was 297 mg of 83 0 1 0 9 3% -6-22991 / Vk / mb (48?) And the melting range was 165-168 ° C. The commodity was -0.8 (C = 0.25; chloroform) and the elements from the elemental analysis were: C (?) H (?) N (?) Calculated 67.83 7.32 6, 78 5 found 67.71 7.35 6.60

Voorbeeld IiExample II

Citroenzure bufferoplossing meteen pH-waarde van 7,5 werd in / een hoeveelheid van 20 ml toegevoegd aan 518 mg (1,10 mmol) BOC-Val-Tyr-(Bzl)-QH en 517 mg (1,00 mmol) H-Val-His-(Bzl)-0Bzl.2HCl en daarna werd 10 2,0 ml 1N NaOH aan de oplossing toegevoegd. Vervolgens werd 100 mgCitric acid buffer solution with a pH value of 7.5 was added in / an amount of 20 ml to 518 mg (1.10 mmol) BOC-Val-Tyr- (Bzl) -QH and 517 mg (1.00 mmol) H- Val-His- (Bzl) -0Bzl.2HCl and then 2.0 ml 1N NaOH was added to the solution. Then 100 mg

Substilisine (zoals vermeld in voorbeeld I) onder roeren aan het mengsel toegevoegd bij 38 °C en de reactie werd gedurende 24 uren uitgevoerd. Het verkregen kleurloze neerslag werd gefiltreerd en werd met water gewassen, waarbij 620 mg ruwe kristallen werden verkregen. Het.Substilisin (as mentioned in Example I) was added to the mixture with stirring at 38 ° C and the reaction was carried out for 24 hours. The resulting colorless precipitate was filtered and washed with water, whereby 620 mg of crude crystals were obtained. It.

15 produkt werd opgelost in 300 ml warme methanol en de warme oplossing geschud met actieve kool gedurende 1 uur om eiwit te verwijderen. De oplossing werd ingedampt en water werd aan het residu toegevoegd waarbij een kristallijn produkt BOC-Val-TyriBzD-Val-His-iBzD-OH.H^O werd verkregen. De opbrengst bedroeg 450 mg (56?) en het smelttraject was 20 176-180 °C. De C°Qwaarde was -6,6 (C = 0,5; methanol) en de gegevens uit de elementair-analyse waren: C (?) H (?) N (%) berekend 64,84 7,17 10>31 gevonden 64,84 7,16 10,90The product was dissolved in 300 ml of warm methanol and the warm solution shaken with activated charcoal for 1 hour to remove protein. The solution was evaporated and water was added to the residue to obtain a crystalline product BOC-Val-TyriBzD-Val-His-iBzD-OH.H 2 O. The yield was 450 mg (56?) And the melting range was 176-180 ° C. The C ° Q value was -6.6 (C = 0.5; methanol) and the data from the elemental analysis were: C (?) H (?) N (%) calculated 64.84 7.17 10> 31 found 64.84 7.16 10.90

25 Voorbeeld IIIExample III

Mcllvaine bufferoplossing met een pH-waarde van 8,97 werd in een hoeveelheid van 7,5 ml toegevoerd aan 282 mg (0,60 mmol) BOC-Val-Tyr(Bz1)-OH en 345 mg (0,50 mmol) H-Val-His(Bzl)-Pro-Phe-0Et.2HCl, waarna 1,2 ml IN NaOH aan de oplossing werd toegevoegd. Daarna werd onder 30 roeren Substilisine toegevoegd bij 38 °C gedurende 24 uren en de reactie werd uitgevoerd. Het verkregen gel-neerslag werd gefiltreerd en werd achtereenvolgens gewassen met water, 0,5 N HC1 en water waarbij 400 mg ruwe kristallen werden verkregen. Dit produkt werd opgelost in warme ethanol en de warme oplossing werd geschud met actieve kool om eiwit te 35 verwijderen. De oplossing werd geconcentreerd en het residu werd herkristal-liseerd uit ethylacetaat waarbij BOC-Val-Tyr(Bzl)-Val-His(Bzl)-Pro-Phe-OH.-2H20 werd verkregen. De opbrengst bedroeg 334 mg (62%) en het smelttraject was 163-168 °C. De£<xJ ^ waarde was -26,9 (C = 1,0; N,N-dimethylformamide) 8301093 -* — ** -7- 22991/Vk/mb en de gegevens uit de elementair-analyse waren: C (ί) H (%) N (» berekend 64,66 7,11 10,40 gevonden 64,87 6,80 10,52Mcllvaine buffer solution with a pH value of 8.97 was added in an amount of 7.5 ml to 282 mg (0.60 mmol) BOC-Val-Tyr (Bz1) -OH and 345 mg (0.50 mmol) H Val-His (Bzl) -Pro-Phe-0Et.2HCl, after which 1.2 ml of 1N NaOH was added to the solution. Substilisine was then added with stirring at 38 ° C for 24 hours and the reaction was carried out. The resulting gel precipitate was filtered and washed successively with water, 0.5 N HCl and water to yield 400 mg of crude crystals. This product was dissolved in warm ethanol and the warm solution was shaken with activated charcoal to remove protein. The solution was concentrated and the residue was recrystallized from ethyl acetate to yield BOC-Val-Tyr (Bzl) -Val-His (Bzl) -Pro-Phe-OH.-2H 2 O. The yield was 334 mg (62%) and the melting range was 163-168 ° C. The £ <xJ ^ value was -26.9 (C = 1.0; N, N-dimethylformamide) 8301093 - * - ** -7- 22991 / Vk / mb and the elemental analysis data were: C ( ί) H (%) N (calculated 64.66 7.11 10.40 found 64.87 6.80 10.52

5 Voorbeelden IV-IX5 Examples IV-IX

De werkwijze volgens voorbeeld III werd herhaald, behalve dat een zuurcomponent van een Nc£-acylaminozuur of N cC-acyldipeptide en een arainecomponent van de dipeptide-t.butylester werden toegepast zoals weergegeven in de tabel.The procedure of Example III was repeated, except that an acid component of an Nc-acylamino acid or NcC-acyl dipeptide and an arain component of the dipeptide t-butyl ester were used as shown in the table.

j j ! -------—1 8301093 «5 ί -8- 22991/Vk/mb Ο ο\ <τ cc <* «* σ\θ Ό ·* οο»* -*η coon cs ο θ' ο β» ·*η οο ι-» <Ü £2 «» Α *% Α · Λ «Λ «* ·* ΛΛ to Is* γ-' γ^. f^»co enen r*- r**j j! -------— 1 8301093 «5 ί -8- 22991 / Vk / mb Ο ο \ <τ cc <*« * σ \ θ Ό · * οο »* - * η coon cs ο θ 'ο β »· * Η οο ι-» <Ü £ 2 «» Α *% Α · Λ «Λ« * · * ΛΛ to Is * γ- 'γ ^. f ^ »co ones r * - r **

>. r-π r-» rH rH>. r-π r- »rH rH

tl tw N^y « j·tl tw N ^ y «j ·

f3 O. ON r-f Ό O i—1 00 O OO®' 00 Of3 O. ON r-f Ό O i — 1 00 O OO® '00 O

^OC »\ on n» ό O' 00 »*m r» r» vovo I r> d) pC«« ·>·* » * “*» " " “ * Μφ·α r- r». r» r» vo ό i-» t· Όνο Ό Ό *H ^ ra m fi o r» co io on co mn co *s co es 4-« ς_, > r» oo co r~» es «* mn co sr o® C ¢) (1) η η λ » » » " » " « ** * <u n bn o r·» r» ®w oo co as co hh <m <-h g ^ Ό vo ΌΌ Ό Ό ΌΌ vQ v£> ΌΌ fU ^ ^ Λ /-» /»i ^ /S /-V r-v t| 43 bO A 60 O ba XJbff OblJ J3 bO Λ 60 Φ s^*r S_/ v«/ >«/ N*·' Se^ >-✓ V-X 'w' . / jj co <f Ό Ό Ό es I o ^ o to Ό » p-i r»^ OC »\ on n» ό O '00 »* m r» r »vovo I r> d) pC« «·> · *» * “*» "" "* Μφ · α r- r». r »r» vo ό i- »t · Όνο Ό Ό * H ^ ra m fi or» co io on co mn co * s co es 4- «ς_,> r» oo co r ~ »es« * mn co sr o® C ¢) (1) η η λ »» »» »" «** * <un bn or ·» r »®w oo co as co hh <m <-hg ^ Ό vo ΌΌ Ό Ό ΌΌ vQ v £> ΌΌ fU ^ ^ Λ / - »/» i ^ / S / -V rv t | 43 bO A 60 O ba XJbff OblJ J3 bO Λ 60 Φ s ^ * r S_ / v «/>« / N * · 'Se ^> -✓ V-X' w '. / jj co <f Ό Ό Ό es I o ^ o to Ό »p-i r»

40 <U U rH r-t rH t—I <—· ι—I40 <U U rH r-t rH t — I <- ι — I

H T>0 « I I I I IH T> 0 «I I I I I

» dv o ό ® ·τ “J <5»Dv o ό ® · τ“ J <5

Sf. O ΜΙΛ ΛΟΌSf. O ΜΙΛ ΛΟΌ

CQ 40 rH 1-4 (-4 rH I ' 1—ICQ 40 rH 1-4 (-4 rH I '1-I

+0 m+0 m

bObO

a3s»a ό es m es γη ov ,* ® n es es m O - ·- a o_ t i 4J I « t ® <>—» P rH rH rH -C ΙΛa3s »a ό es m es γη ov, * ® n es es m O - · - a o_ t i 4J I« t ® <> - »P rH rH rH -C ΙΛ

PQ cö «J © 0h PPQ cö «J © 0h P

0 > > > 1 £h 40 I I | l /-» v-o V O rH 4) <U a) CS w 3 · © & 43 Λ 4= o Pn0>>> 1 £ h 40 I I | l / - »v-o V O rH 4) <U a) CS w 3 © & 43 Λ 4 = o Pn

•C W > Ph ¢1(0¾ S iJ• C W> Ph ¢ 1 (0¾ S iJ

O ι · ι es ι w iO ι · ι es ι w i

c, <J (D 4) U 33 rH ÖOJJ (H4Jc, <J (D 4) U 33 rH ÖOJJ (H4J

e3 o. · ob λ P.-Jf1 ra μ 3 <U 3 w X Ph Ph Η·> <jgwge3 o. · ob λ P.-Jf1 ra μ 3 <U 3 w X Ph Ph Η ·> <jgwg

CO I I I 44 I I O I OCO I I I 44 I I O I O

12 S 340 0) · <U4J © I 0) I12 S 340 0) <U4J © I 0) I

Ö 4) 4)3 433 433 43rH,i34) (J |-1Ρ3ΑηΜΡη«Ρη©ΡηΛ 1 I O I O I O I > I PhÖ 4) 4) 3 433 433 43rH, i34) (J | -1Ρ3ΑηΜΡη «Ρη © ΡηΛ 1 I O I O I O I> I Ph

N es es es es NN es es es N

44 44 44 44 44 3 3 3 3 3 3 rö as « M PO ffl Ph44 44 44 44 44 3 3 3 3 3 3 rö as «M PO ffl Ph

40 o o O O O I40 o o O O O I

C I lil·'*'C I lil · '*'

(ü rH rH rH rH rH CQ(ü rH rH rH rH rH CQ

ic^cd ra ra ra © pic ^ cd ra ra ra © p

0) o · > > > > > H0) o ·>>>>> H

c ο. Μ ι ι ι ι i S4 •HS'4) ω 4) aJ <u §°!l!'C ^5 f3 f! f! ^3 ra O Ph Ph Ph Ph Ph ^55c ο. S ι ι ι ι i S4 • HS'4) ω 4) aJ <u § °! L! 'C ^ 5 f3 f! f! ^ 3 ra O Ph Ph Ph Ph Ph ^ 55

I I I ι I · I OI I I ι I · I O

m « EC P3 EC » 33 W 33 Λ., g O O O " bj o 40 ι ι ι O ι G 4) μ h-η S μ 4) pc j: „fN « ,¥ aSc 3hEh> mj co 10°· · ' * cT ns 1 μα'3 3 ej ra <oïï <u Λ Λ T ^ J3 3θΛι3 »3 Ph Ph <£ Ph N O X I ι ι « ff ·m «EC P3 EC» 33 W 33 Λ., g OOO "bj o 40 ι ι ι O ι G 4) μ h-η S μ 4) pc j:„ fN «, ¥ aSc 3hEh> mj co 10 ° · · '* CT ns 1 μα'3 3 ej ra <oïï <u Λ Λ T ^ J3 3θΛι3 »3 Ph Ph <£ Ph NOXI ι ι« ff ·

N CS CS N Pj1 CSN CS CS N Pj1 CS

_____________________ü3_______ Ό_____________________ ü3 _______ Ό

rHrH

ΦΦ

O cHO cH

U Η HU Η H

o ï> W Μ H ><3o ï> W Μ H> <3

O W > > > > HO W>>>> H

>____J_ -> ____ Y_ -

1Λ rH I-H1Λ rH I-H

8301093 »» -9- 22991/Vk/mb8301093 »» -9- 22991 / Vk / mb

Voorbeeld XExample X.

In een kolf werden 398,5 mg (1 mmol) Z-Phe-Val-OH en 320.4 mg (1 mmol) H-Phe-Val-OBu gesuspendeerd in 10 ml water. De glaselektrode van een pH-meter werd in de suspensie gebracht en 150 mg Substi-In a flask, 398.5 mg (1 mmol) of Z-Phe-Val-OH and 320.4 mg (1 mmol) of H-Phe-Val-OBu were suspended in 10 ml of water. The glass electrode of a pH meter was placed in the suspension and 150 mg of Substi-

5 lisine werd onder roèren aan de suspensie toegevoegd, terwijl de pH-waarde van het mengsel werd ingesteld op 7,5-8,0 door aan het mengsel 0,1 N NaOH toe te voegen om de vaste bestanddelen op te lossen. Het mengsel werd 20 uren bij .38 °C geroerd. Tijdens de reactie werd de pH-waarde van het reactiemengsel gehandhaafd op 7,5-8,0 door aan het mengsel 0,1 N NaOHLisin was added to the suspension under stirring, while the pH of the mixture was adjusted to 7.5-8.0 by adding 0.1 N NaOH to the mixture to dissolve the solids. The mixture was stirred at 38 ° C for 20 hours. During the reaction, the pH of the reaction mixture was maintained at 7.5-8.0 by adding 0.1 N NaOH to the mixture

10 toe te voegen. Het verkregen neerslag werd gefiltreerd en werd achtereenvolgens gewassen met water, 1N HC1, water, 7% ammonia en water en daarna gedroogd. Het produkt werd herkristalliseerd uit ethylacetaat-petroleumether waarbij 190 mg (opbrengst 27,1%) van Z-Phe-Val-Phe-Val-0Bufc werd verkregen met een smelttraject van 130-145 °C.10. The resulting precipitate was filtered and washed successively with water, 1N HCl, water, 7% ammonia and water and then dried. The product was recrystallized from ethyl acetate-petroleum ether to give 190 mg (yield 27.1%) of Z-Phe-Val-Phe-Val-0Bufc with a melting range of 130-145 ° C.

15 Voorbeeld XIExample XI

In een kolf werden 471,5 mg (1 mmol) Z-fhe-Tyr-OH en 320.4 mg H-Phe-Val-0But gesuspendeerd in 10 ral water. De glaselektrode van een pH-meter werd in de suspensie gebracht en 150 mg Substilisine werd onder roeren aan de suspensie toegevoegd, terwijl de pH-waarde van het 20 mengsel werd ingesteld op 7,5-8,0 door toevoegen van 0,1 N NaOH om de i vaste bestanddelen op te lossen. Het mengsel werd 20 uren bij 38 °C ge- iIn a flask, 471.5 mg (1 mmol) of Z-fhe-Tyr-OH and 320.4 mg of H-Phe-Val-0But were suspended in 10 ral water. The glass electrode of a pH meter was placed in the suspension and 150 mg of Substilisin was added to the suspension with stirring, while the pH of the mixture was adjusted to 7.5-8.0 by adding 0.1 N NaOH to dissolve the solids. The mixture was washed at 38 ° C for 20 hours

roerd. Tijdens de reactie werd de pH-waarde van het reactiemengsel gehandhaafd op 7,5-8,0 door 0,1 N NaOH aan het mengsel toe te voegen. Het Jstirred. During the reaction, the pH of the reaction mixture was maintained at 7.5-8.0 by adding 0.1 N NaOH to the mixture. The J

verkregen neerslag werd gefiltreerd en werd achtereenvolgens gewassen 25 met water, 1N HC1, water, 7% ammonia en water en daarna gedroogd.The precipitate obtained was filtered and washed successively with water, 1N HCl, water, 7% ammonia and water and then dried.

Het produkt werd herkristalliseerd uit ethylacetaat-petroleumether waarbij 230 mg (opbrengst 30%) Z-Phe-Tyr-Phe-Val-0But werd verkregen met een smeltpunt van 155 °C.The product was recrystallized from ethyl acetate-petroleum ether to yield 230 mg (30% yield) of Z-Phe-Tyr-Phe-Val-0But with a melting point of 155 ° C.

83010938301093

Claims (1)

-10- 22991/Vk/mb Werkwijze voor het bereiden van een laag molekulair peptide met formule X-A-E-Q,waarin A en E gelijk of verschillend zijn en wel 5 een aminozuur- of peptiderest, X een beschermende groep voor een amino-groep is en Q een beschermende groep voor een carboxylgroep is, gekozen uit een tertiaire alkoxy-, ethoxy-, benzyloxy-, benzylamino- of benz-hydrylaminogroep', eventueel gesubstitueerd met een inerte substituent, met het kenmerk, dat een zuurcomponent van een aminozuur of peptide met 10 een N-eindstandige beschermende groep met de formule X-A-OH of een zout daarvan in reactie wordt gebracht met een aminocomponent van een aminozuur of peptide met een C-eindstandige beschermende groep met de formule H-E-Q of een zout hiervan, in aanwezigheid van Substilisine in een waterige oplossing met een pH-waarde van 6-9. 15 Eindhoven, januari 1983 8301093-10-22991 / Vk / mb Process for preparing a low molecular weight peptide of formula XAEQ, wherein A and E are the same or different, 5 being an amino acid or peptide residue, X being a protecting group for an amino group and Q a carboxyl protecting group selected from a tertiary alkoxy, ethoxy, benzyloxy, benzylamino or benzhydrylamino group, optionally substituted with an inert substituent, characterized in that an acid component of an amino acid or peptide having an N-terminal protecting group of the formula XA-OH or a salt thereof is reacted with an amino component of an amino acid or peptide with a C-terminal protecting group of the formula HEQ or a salt thereof, in the presence of Substilisin in a aqueous solution with a pH value of 6-9. 15 Eindhoven, January 1983 8301093