NL8100158A - Werkwijze voor het verkrijgen van globine. - Google Patents

Description

* ¢.

-1- 21707/Vk/jg

Aanvrager: Hie Food Science Institute Foundation, Tokio, Japan.

Korte aanduiding: Werkwijze voor het verkrijgen van globine.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen 5 van globine uit bloed. Globine wordt beschouwd als een waardevol eiwit. Vleessoorten, verkregen uit verschillende dieren, zoals runderen, varkens, schapen en pluimvee worden meestal volledig effectief gebruikt als bron voor eiwit. Hoewel bloed echter ongeveer 7 tot 8$ van het lichaamsgewicht uitmaakt van een dier en het bloed waardevolle eiwitten bevat wordt het 10 nagenoeg volledig afgevoerd als afvalmateriaal. Ongeveer 20$ van het bloed bestaat uit vaste stoffen,en eiwitten maken ongeveer 80$ uit van het vaste bestanddeel in het bloed en bovendien zijn er kleine hoeveelheden lipiden, sacchariden, zouten en organische zuren aanwezig. De bloedei-witten omvatten serumeiwitten zoals albumine en globuline en globine, 15 hetgeen een eiwitcomponent is van hemoglobine in erythrocyten.

Er zijn reeds werkwijzen ontwikkeld voor het zuiveren van serum-eiwitten, te weten albumine en globuline en het afscheiden en bereiden van deze serumeiwitten is reeds op industriële schaal toegepast. De werkwijze echter voor het afscheiden van globine, hetgeen een eiwitcomponent 20 is van hemoglobine, is nog niet voldoende ontwikkeld omdat het afscheiden van globine uit hematiet moeilijk is.

In het kader van de gedane onderzoekingen is een werkwijze ontwikkeld voor het afscheiden en zuiveren van globine door het effectief gebruiken van globine als eiwit houdend materiaal en de werkwijze volgens 25 de uitvinding wordt hierdoor gekenmerkt, dat hemoglobine wordt afgescheiden uit het bloed van dieren, een waterige oplossing wordt gevormd met 0,5-5$ hemoglobine, hieraan een zuur wordt toegevoegd om de pH in te stellen op 2,0-2,2 en de ionische sterkte op 0,005-0,015, de waterige oplossing in contact wordt gebracht met carboxymethylcellulose, dat in even-30 wicht is gebracht met een zure vloeistof met een pH van 2,0-2,2 en een ionensterkte van 0,005-0,015 en daarna globine wordt opgelost uit het carboxymethylcellulose met een zure vloeistof.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende beschrijving, waarbij verwezen is naar de bijgevoegde tekening, waarbij: 35 fig. 1 een grafische voorstelling geeft van de globine-afscheiding met diverse ionenwisselaars, waarbij de curven 1, 2, 3, 5 en 6 respec tievelijk de resultaten weergeven, verkregen met SP-Sephadex C-50, carboxymethylcellulose, Amberlite GC-120 type 1, Amberlite GC-50 type 2, 8100158 -2- 21707/Vk/jg

Dowex 50X-4 en hemoglobine ter vergelijking, fig. 2 grafisch de invloed weergeeft van carboxymethylcellulose bij het afscheiden van globine uit bloed van kippen, zoals aangegeven in voorbeeld I, waarbij 10 ml ruw kippenhemoglobine-oplossing (met 180 mg 5 hemoglobine) werd gebruikt, waarbij de tekens 0 en · de absorpties weergeven bij respectievelijk 280 nm en 420 nm, fig. 3 de invloed aangeeft van carboxymethylcellulose voor het afscheiden van globine uit het bloed van runderen, zoals aangegeven in voorbeeld II, waarbij 30 ml hemoglobine-oplossing uit runderbloed (met 50 mg 10 hemoglobine) werd gebruikt, waarbij de tekens 0 en · de absorpties weergeven bij respectievelijk 280 nm en 520 nm.

Ten einde hematiet en globine af te scheiden en te winnen uit bloed is het eerst noodzakëlijk om hemoglobine af te scheiden uit het bloed. Wanneer het bloed aan lucht blijft staan, wordt fibrinogeen gecoaguleerd 15 in de vorm van fibrines door de werking van slonbine. Gecoaguleerd bloed wordt afgescheiden tot serum en bloedklonters door centrifugale afscheiding of filtratie. Het afscheiden van een hemoglobinefractie uit de bloedklonters wordt bewerkstelligd door oplossen (hemolyse) van hemoglobine uit erythrocyten door een ultrasone behandeling van de bloedklonters, 20 herhaling van vreisdrogen en ontdooien, roeren of homogeniseren van een waterige suspensie van bloedklonters of het toevoegen van saponine. Verder kan een hemoglobinefractie worden verkregen door het toevoegen van een middel dat coagulatie voorkomt, zoals natriumcitraat of heparine aan het verzamelde bloed, waarna het mengsel wordt onderworpen aan een een-25 trifugale werking om een hemocytfractie te verkrijgen en vervolgens wordt de hemocytfractie onderworpen aan hemolyse op dezelfde wijze als boven is aangegeven.

Water wordt toegevoegd aan de aldus verkregen hemoglobinefractie ter vorming van een waterige oplossing met een concentratie van 0,5 tot 30 5%. Vervolgens wordt een zuur, zoals zwavelzuur of zoutzuur toegevoegd aan de oplossing om de pH-waarde in te stellen op 2,0-2,2 en de Ionische sterkte op 0,005 tot 0,015, waarbi-j hemoglobine wordt gedissocieerd tot hemathiet en globine.

. Daarnaast wordt carboxymethylcellulose, aangebracht in een kolom 35 en een zure vloeistof met een pH-waarde van 2,0-2,2 en een ionische sterkte van 0,005 tot 0,015 door de gepakte kolom gevoerd om het carboxymethylcellulose hiermee in evenwicht te brengen. Als waterige vloeistof met een pH-waarde van 2,0-2,2 en een ionische sterkte van 0,005 tot 0,015 810 0 15 8

• ~ 'M

-3- 21707/Vk/jg verdient het de voorkeur om 0,01N zoutzuur of zwavelzuur te gebruiken.

De bovenvermelde waterige oplossing met 0,5 tot 5% hemoglobine en met een pH-waarde van 2,0 tot 2,2 en een ionisohe sterkte van 0,005 tot 0,015 wordt door de kolom gevoerd die gepakt is met het in evenwicht ge-5 brachte carboxymethylcellulose om hematiet en globine te adsorberen aan carboxymethylcellulose.

Vervolgens wordt een waterige zure oplossing, bijvoorbeeld 0,Q1N zoutzuur door de kolom gevoerd, ter verkrijging van een afvoerstroom die globine bevat. Zodoende wordt de afscheiding van globine bewerkstelligd.

10 Terwijl globine wordt opgelost door middel van de zure vloeistof blijft hematiet geadsorbeerd aan carboxymethylcellulose. Dit hematiet kan echter ook worden opgelost,,doordat men door de kolom een zure vloeistof voert, waaraan natriumchloride is toegevoegd in een hoeveelheid van 0,03 tot 0,1 mol/1 of een alkalische oplossing met een pH-waarde van 10 tot 15 12, bijvoorbeeld een 0,01N waterige oplossing van natriumhydroxyde.

Het globine houdende eluaat wordt ontzouten en de ontzoute oplossing wordt direct ingedampt en gedroogd of verwarmd nadat de pH-waar-de is ingesteld op 6,8 door het toevoeren van 0,5 N NaOH, waarbij globine wordt neergeslagen. Het neerslag wordt gewonnen door centrifugale afschel -20 ding en aan de lucht gedroogd bij een temperatuur van 60 °C, ter verkrijging van een droog globineprodükt.

Het aldus verkregen droge globineprodükt is nagenoeg vrij van hematiet en het is gebleken dat dit droge produkt geschikt is als eiwit houdend materiaal om verder te worden toegepast voor het bereiden van voe-25 dingsmiddelen.

De uitvinding zal nader worden toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden en de hierna beschreven test.

Test 1) Scheiding door een verdelingsmethode, waarbij een twee-lagen 30 systeem wordt toegepast met water.

Een 20i-ige oplossing van dextran T70, een 40?-ige oplossing Carbo-wax 6000, een 1JÉ-ige oplossing van hemoglobine in zoutzuur met een pH-waarde van 3 en water werden gemengd in een verhouding van 2/1/1/1. Het mengsel werd geschud in een glazen cilinder en vervolgens werd het meng-35 sel bewaard, waarbij het mengsel werd gescheiden in twee lagen. Enkele onoplosbare stoffen bleken aanwezig te zijn aan het oppervlak en bij het tussenvlak tussen de twee lagen. Zowel de bovenste en onderste laag waren op vergelijkbare wijze gekleurd met hemoglobine en in beide lagen werd de 8100158 » r ·*- -1»- 21707/Vk/jg absorptiecurve bepaald bij een golflengte van 240-460 nm, waarbij pieken werden waargenomen bij 280 nm en 420 nm. Zodoende werd bevestigd dat globine en hematiet niet in de twee verschillende lagen onafhankelijk van elkaar waren verdeeld.

5 2) Scheiding met behulp van ionenwisselaar.

0,05 g Van zowel 1) SR-Sephadex C-50, 2) carboxymethylcellulose, 3) Amberlite CG-120 type 1, 4) Amberlite CG-50 type 2 en 5) Dowex 50-X-4 als ionenwisselaars werden afzonderlijk tot zwellen gebracht met 10 ml van een glycinezout-bufferoplossing met een pH-waarde van 3. Vervolgens 10 werd 3 ml 1$ hemoglobine-oplossing met een pH-waarde van 3 toegevoegd aan de tot zwellen gebrachte ionenwisselaar en het mengsel werd voldoende geschud en centrifugaal gescheiden. De absorptiecurve van elke bovenstaande vloeistof werd gemeten bij een golflengte van 200-440 nm, waarbij een curve is verkregen zoals weergegeven in fig. 1. Wanneer de absorptie bij 15 420 nm wordt verlaagd in de bovenstaande vloeistof en de absorptie bij 280 nm, is gelijk aan die van hemoglobine, betekent dit dat slechts hematiet gebonden is aan de ionenwisselaar en globine kan worden afgescheiden met de ionenwisselaar.

Uit de resultaten die aangegeven zijn in fig. 1 blijkt, dat bij de 20 ionenwisselaars die afwijkend zijn van carboxymethylcellulose beide pieken aanwezig zijn bij 280 nm en 420 nm of dat de beide pieken zijn verlaagd en er geen mogelijkheid is om globine af te scheiden. Hierentegen geldt dat bij carboxymethylcellulose de absorptie bij 420 nm aanzienlijk · is verlaagd en het is duidelijk dat alleen hemochroraogeen is geadsorbeerd 25 en globine is afgescheiden.

Voorbeeld I

Vers, gecoaguleerd bloed van kippen met 9,5$ hemoglobine en 4,3$ serumeiwitten, werd in een hoeveelheid van 100 g onderworpen aan een centrifugale scheiding bij 7000 omwentelingen per minuut gedurende 15 minu-30 ten. Vervolgens werd 40 ml van een 0,9$ waterige oplossing van natrium-chloride toegevoegd aan de verkregen bloedklonters om een her-precipita-tie te bewerkstelligen en 40 ml water werd verder toegevoegd en de centrifugale scheiding werd uitgevoerd ter verkrijging van gewassen bloedklonters.

Vervolgens werd 200 ml water toegevoegd aan de bloedklonters en 35 het mengsel werd onderworpen aan een ultrasone golfbehandeling (9 kHz, 1,5 A, 10 minuten) en vervólgens werd een centrifugale afscheiding bewerkstelligd bij 7000 omwentelingen per minuut gedurende 15 minuten ter verkrijging van een hemoglobine-oplossing. Vervolgens werd 50 ml water 8100158 ? * -5- 21707/Vk/jg toegevoegd aan het afgescheiden'precipitaat en het precipitaat werd gewassen door centrifugale precipitatie. De wasvloeistof en 150 ml water werden toegevoegd aan de bovenvermelde hemoglobine-oplossing. De verkregen oplossing werd gedialyseerd ten opzichte van water om een ontzouting 5 te bewerkstelligen en zoutzuur werd toegevoegd aan de ontzoute oplossing, zodat een 0,01N oplossing werd verkregen.

Ongeveer 3 g carboxymethyloellulose (in de handel gebracht door Seikagaku Kogyo K.K.) werd in evenwicht gebracht met 0,01N zoutzuur, waarbij carboxymethyloellulose was aangebracht in een glazen kolom met een 10 inwendige diameter van 2,3 cm, zodat de kolom een hoogte had van 10 cm en 10 ml van de bovenvermelde zure hemoglobine^oplossing werd door de gepakte kolom naar beneden gevoerd bij een lineaire snelheid van 0,04 cm/ seconde en vervolgens werd 0,01 N zoutzuur door de kolom naar beneden gevoerd.

15 De afgevoerde vloeistofstroom werd verzameld, zodat 10 ml van een fractie werd verkregen en de absorptie bij 280 nm en 420 nm werden gemeten met behulp van een foto-elektrische spectrofotometer. De absorptie bij 280 nm is inherent aan globine en de absorptie bij 420 nm is inherent aan hematiet (haem).

20 De absorptiecurve van de zo verkregen Fr actie is weergegeven in fig. 2. In fig. 2 is piek I die van de globinefractie en omdat piek I een bepaalde absorptie inhoudt bij 420 nm, is het duidelijk dat een kleine hoeveelheid hematiet aanwezig is in de globinefractie. De aanwezigheid van een dergelijke kleine hoeveelheid hematiet bewerkstelligd echter geen 25 probleem wanneer deze globinefractie wordt gebruikt als voedingsmateriaal. Wanneer de fractie van piek I opnieuw wordt onderworpen aan een behandeling met carboxymethyloellulose, is het hematiet volledig verwijderd.

De fractie overeenkomend met piek I werd gevriesdroogd ter verkrijging van 184 mg van een droog produkt met globine met een globinegehalte 30 van 95?, een asgehalte van 2? en een watergehalte van 3?. Globine werd zodoende verkregen in een hoeveelheid van 74? en de opbrengst was 7? gebaseerd op het gecoaguleerde bloed.

Voorbeeld II

Bloed van runderen werd in een hoeveelheid van 2,5 g, met een hemo-35 globinegehalte van 9,5?, behandeld en gevriesdroogd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I ter vèrkrijging van 170 rag droog globine-produkt. De gegevens met betrekking tot de afgevoerde vloeistof uit de kolom,zijn weergegeven in fig. 3· 8100 15 8 ♦ *- -6- 21707/Vk/jg

Voorbeeld III

Bloed van varkens met een hemoglobinegehalte van 11,0$, werd in een hoeveelheid van 2,5 g behandeld en gevriesdroogd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I, ter verkrijging van 205 mg droog glo-5 bine.

-CONCLUSIE- 8100158

Claims (1)

1. -7- 21707/Vk/jg < * CONCLUSIE·. Werkwijze voor het verkrijgen van globine uit bloed, met het kenmerk, dat hemoglobine wordt afgescheiden uit het bloed van dieren, een waterige . 5 oplossing wordt gevormd met 0,5-5? hemoglobine, hieraan een zuur wordt toegevoegd om de pH in te stellen op 2,0 tot 2,2 en de Ionische sterkte op 0,005-0,015, de waterige oplossing in contact wordt gebracht met carboxy-methyloellulose dat in evenwicht is gebracht met een zure oplossing bij een pH van 2,0-2,2 en een ionensterkte van 0,005-0,015 en daarna globine 10 .wordt opgelost uit het carboxymethylcellulose met een zure vloeistof. Eindhoven, januari 1981. * 8100158