NL8007128A - DETECTION OF HUMAN CANCER CELLS WITH ANTIBODIES FOR ANTIGENS FROM THE NUCLEOLI OF HUMAN CANCER CELLS. - Google Patents
DETECTION OF HUMAN CANCER CELLS WITH ANTIBODIES FOR ANTIGENS FROM THE NUCLEOLI OF HUMAN CANCER CELLS. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8007128A NL8007128A NL8007128A NL8007128A NL8007128A NL 8007128 A NL8007128 A NL 8007128A NL 8007128 A NL8007128 A NL 8007128A NL 8007128 A NL8007128 A NL 8007128A NL 8007128 A NL8007128 A NL 8007128A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- antibodies
- cells
- nucleoli
- human
- antigens
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
S 5773-1 Β.·^- -* Ρ··& cS 5773-1 Β. · ^ - - * Ρ ·· & c
Detectie van menselijke kankercellen met antilichamen voor antigenen uit de nucleoli^ van menselijke kankercellen.'Detection of human cancer cells with antibodies to antigens from the nucleoli of human cancer cells.
De uitvinding heeft betrekking op nucleolaire antigenen (antigenen uit kemlichamen), die aangetroffen worden in een ruim trajekt van menselijke kankersoorten en niet voorkomen in overeenkomstige niet-tumor-weefsels, benevens op antilichamen en antisera die specifiek zijn voor dit 5 (deze) nucleolaire antigen(en) voor diagnostische doeleinden.The invention relates to nucleolar antigens (antigens from nuclear bodies), which are found in a wide range of human cancers and do not occur in corresponding non-tumor tissues, as well as antibodies and antisera specific for this (these) nucleolar antigen (s) for diagnostic purposes.
Eerdere vondsten bij proefdieren hebben gewezen op de aanwezigheid van nucleaire en nucleolaire antigenen in tumoren, die niet voorkomen in niet-tumorweefsels (R.K. Busch c.s., Cancer Res. 34, 2362, 1974; Yeoman c.s., Proc.Natl.Acad Sci. USA 73, 3258, 1976; 3258, 1976; Busch en Busch, 10 Tumori 63, 347, 1977; Davis c.s. Cancer Res. '38, 1906, 1978; Marashi c.s., Cancer Res. 39,-59, 1979). Bij deze eerdere onderzoekingen van de onderhavige uitvinders werden antilichamen bereid voor nucleoli van normale en nëoplastische cellen van ratten door immunisatie van konijnen (R.K.Previous animal findings have indicated the presence of nuclear and nucleolar antigens in tumors, which do not exist in non-tumor tissues (RK Busch et al., Cancer Res. 34, 2362, 1974; Yeoman et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 73 , 3258, 1976; 3258, 1976; Busch and Busch, Tumori 63, 347, 1977; Davis et al. Cancer Res. 38, 1906, 1978; Marashi et al., Cancer Res. 39, 59, 1979). In these previous studies of the present inventors, antibodies were prepared for nucleoli of normal and rat neoplastic cells by immunization of rabbits (R.K.
Busch c.s. ,.1-.6.; Busch en Busch, l.c.; Davis c.s., l.c.). Er werd een 15 heldere nucleolaire fluorescentie in de met aceton gefixeerde cellen aangetoond met behulp van de indirekte immunofluorescentiemethode. Ook werd gevonden, dat de immunoprecipitine-banden in Ouchterlony gelen, die gevormd waren met antisera voor nucleolaire antigenen van Novikoff hepatoom,. die geëxtraheerd waren uit nucleoli van Novikoff hepatoom bij de rat, verschil-20 de van de overeenkomstige immunoprecipitinebanden, die verkregen werden met nucleolaire antigenen uit de lever en nucleolaire anti-leverantisera (Busch en Busch, l.c.).Busch et al., 1-6; Busch and Busch, l.c .; Davis et al., L.c.). Clear nucleolar fluorescence in the acetone-fixed cells was demonstrated using the indirect immunofluorescence method. It was also found that the immunoprecipitin bands in Ouchterlony gels formed with antisera for Novikoff hepatoma nucleolar antigens. extracted from nucleikins of Novikoff hepatoma in the rat, different from the corresponding immunoprecipitin bands obtained with nucleolar antigens from the liver and nucleolar anti-liver antisera (Busch and Busch, 1.c.).
Een verdere specifiteit werd aangetoond doordat antitumor * nucleolair antiserum, dat geabsorbeerd was met extracten van leverkernen, 25 een positièvè nucleolaire fluorescentie gaf in ascites cellen van Novikoff hepatoom, maar niet in levercellen. Omgekeerd gaf antièlever nucleolair antiserum, dat geabsorbeerd was met nucleolaire tumorextracten geen detecteerbare nucleolaire fluorescentie met tumor, maar wel een positieve fluorescentie in levernucleoli (Davis c.s., l.c.).A further specificity was demonstrated by the fact that anti-tumor * nucleolar antiserum, which was absorbed with extracts of liver nuclei, gave positive nucleolar fluorescence in ascites cells of Novikoff hepatoma, but not in liver cells. Conversely, anti-liver nucleolar antiserum absorbed with nucleolar tumor extracts did not provide detectable nucleolar fluorescence with tumor, but positive fluorescence in liver nucleoli (Davis et al., L.c.).
30 Aangezien immunofluorescentie-analyse erop wees, dat er ver schillen waargenomen konden worden in met aceton gefixeerde tumoruitstrijk-sels en uitstrijksels van normale rattencellen (in het bijzonder na absorptie van de antisera met normale leverkernen en nucleoli), werd getracht deze antisera op nucleolaire antigenen bij rattentumoren toe te 35 passen voor het onderzoeken van overeenkomstige weefselmonsers verkregen - uit menselijke tumoren. Bij onderzoek met antilichamen op nucleoli van tumoren van knaagdieren bleek, dat een positieve immunofluorescentie niet 8007128 I > - 2 - t 1 gevonden werd bij menselijke tumornucleoli. ïn verband daarmee begonnen de onderhavige uitvinders met een nieuwe reeks proeven om menselijke nucleolaire antigenen te vinden. Hierbij werd positieve immunofluorescentie gevonden bij menselijke tumorweefsels met antisera en antilichamen voor deze nieuwe 5 preparaten van nucleolie van menselijke tumoren. Bij dit onderzoek werden de antilichamen geabsorbeerd met nucleaire sonicaten van placenta, benevens met foetaal kalverserum (Busch c.s., Cancer Res. 39, 3024, 1979; Davis c.s., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 892, 1979; Smetana c.s. Life Sci. 25, 227, 1979).Since immunofluorescence analysis indicated that differences could be observed in acetone-fixed tumor smears and smears from normal rat cells (especially after absorption of the antisera with normal liver nuclei and nucleoli), this antisera was attempted on nucleolar antigens to be used in rat tumors to examine corresponding tissue samples obtained from human tumors. Testing with antibodies to rodent tumor nucleoli showed that positive immunofluorescence 8007128 I - 2 - t 1 was not found in human tumor nucleoli. In connection with this, the present inventors started a new series of tests to find human nucleolar antigens. Positive immunofluorescence was found in human tumor tissues with antisera and antibodies for these novel nucleic oil preparations from human tumors. In this study, the antibodies were absorbed with nuclear placental sonicates, as well as with fetal calf serum (Busch et al., Cancer Res. 39, 3024, 1979; Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 892, 1979; Smetana et al. Life Sci. 25, 227, 1979).
10 De uitvinding is het resultaat van onderzoek bestemd om deze nieuwe menselijke nucleoaire antigenen toe te passen voor het detecteren van een ruim trajekt van menselijke nieuwvormingen (neoplasmen)..The invention is the result of research intended to use these novel human nucleoar antigens to detect a wide range of human novelizations (neoplasms).
Hieronder geeft Tabel A een samenvatting van de menselijke tumoren, waarbij een heldere nucleolaire immunoflorescentie gevonden werd 15 met de antilichamen op menselijke tumornucleoli. De resultaten van deze onderzoekingen gaven een bevestiging van de verrassende vondst, dat vele menselijke tumoren een gemeenschappelijk nucleolair antigeen bevatten, dat een positieve immunoflüorescentie vertoont met antisera of immunóglobuline- frakties van dergelijke antisera (Busch c.s., l.c.).Below, Table A summarizes the human tumors, where clear nucleolar immunoflorescence was found with the antibodies on human tumor nucleoli. The results of these studies confirmed the surprising finding that many human tumors contain a common nucleolar antigen that shows positive immunofluorescence with antisera or immunoglobulin fractions of such antisera (Busch et al., L.c.).
20 Tabel a20 Table a
Heldere nucleolaire immunoflorescentie bij menselijke tumoren (Uit; Busch c.s., 1979) X Carcinomen 25 1. Blaas, overgangscel 2. Hersens astrocytoom gliobastoom 3. Wervelkolom, adenocarcinoom (4) 3Q metastase: lever transplanteerbaar carcinoom (GW-39) 4. Exocrineklier, carcinoom 5. Slokdarm, carcinoom van plaatjesachtige cellen 6. Lever, primair carcinoom 22 7. Long; adenocarcinoom (2) "oat" cel (2) plaatjesachtige cellen (5) 8. Melanoom, kwaadaardig, cerebrale metastasen 8007128 « * * l - 3 - 9. Prostaat, adenocarcinoom (4) «Μ 10. Huid: carcinoom van basaalcellen (2) carcinoom van plaatjescellen (7) metastase: lymfknoop 11. Maag, adenocarcinoom metastase: lever metastase: lymfknoop 12. Schildklier, carcinoom (2) II Sarcomen 1. Myoblastoom, kwaadaardig, van lip metastase 'naar cervicaie lymfknoop 2. Osteogeen sarcoom (3), biopsie, weefselcultuur 3. Synoviaal sarcoom 4. Lymfoom (4), geen Hodgkins III Hematologische Neoplasmen 1. Ziekte van Hodgkins (Reed Sternberg, 5) 2. Leukemie: CLL (5), harige cellen (milt) 3. Lymfoon, lymfocytisch, milt 4. Multipel myelöom (5) 5. Mycosis fungoides 6. Acute myelocytische leukemie (5) 7. Chronische myelocytische leukemie (5) 8. Acute monocytische leukemie (2) IV Cultures 1. Borst carcinoom 2. Adenocarcinoom van wervelkolom 3. HeLa 4. HEp-2 5. Prostaat, carcinoom (3) 6. Carcinoom van plaatjescëllen (3)'Clear nucleolar immunoflorescence in human tumors (Uit; Busch et al, 1979) X Carcinomas 25 1. Bladder, transitional cell 2. Brain astrocytoma gliobastoma 3. Spine, adenocarcinoma (4) 3Q metastasis: liver transplantable carcinoma (GW-39) 4. Exocrine gland, carcinoma 5. Esophagus, carcinoma of platelet-like cells 6. Liver, primary carcinoma 22 7. Lung; adenocarcinoma (2) "oat" cell (2) platelet-like cells (5) 8. Melanoma, malignant, cerebral metastases 8007128 «* * l - 3 - 9. Prostate, adenocarcinoma (4)« Μ 10. Skin: carcinoma of basal cells ( 2) platelet cell carcinoma (7) metastasis: lymph node 11. Stomach, adenocarcinoma metastasis: liver metastasis: lymph node 12. Thyroid, carcinoma (2) II Sarcomas 1. Myoblastoma, malignant, from lip metastasis' to cervical lymph node 2. Osteogenic sarcoma ( 3), biopsy, tissue culture 3. Synovial sarcoma 4. Lymphoma (4), no Hodgkins III Hematological Neoplasms 1. Hodgkins disease (Reed Sternberg, 5) 2. Leukemia: CLL (5), hairy cells (spleen) 3. Lymph , lymphocytic, spleen 4. Multiple myeloma (5) 5. Mycosis fungoides 6. Acute myelocytic leukemia (5) 7. Chronic myelocytic leukemia (5) 8. Acute monocytic leukemia (2) IV Cultures 1. Breast carcinoma 2. Adenocarcinoma of the spine 3. HeLa 4. HEp-2 5. Prostate, carcinoma (3) 6. Carcinoma of platelet cells (3) '
Opmerking: de tussen haken geplaatste getallen geven het aantal gevallen aan.Note: The numbers in parentheses indicate the number of cases.
i Bij de niet-tumorweefsels, goedaardige tumoren en onstekings-toestanden werden in het algemeen negatieve resultaten verkregen, zoals blijkt uit de onderstaande B (Busch c.s., l.c.).Negative results were generally obtained in the non-tumor tissues, benign tumors and inflammatory states, as shown in B below (Busch et al., l.c.).
Tabel BTable B
Negatieve immunofluorescentie bij menselijke weefsels .(Uit: Busch c.s., 1979)_~ ~ I Normaal weefsel 8007128 1 1Negative immunofluorescence in human tissues. (From: Busch et al., 1979) ~ ~ I Normal tissue 8007128 1 1
* V* V
- 4 - 1. Blaas 2. Beendermerg (hemoblastische lijnen, (5)a^ 3. Borst 4. Roodachtig grijze laag in gecentrifugeerd bloed (3) 5 5. Galblaas 6. Dunne darm, holten van Liéberkuhn 7. Dikke-darm 8. Nier 9. Lever (2) 10 10. Long (aangrenzend aan tumor) 11. Lymfknoop 12. Lymfocyten, normaal (2) 13. Alvleesklier 14. Pijnappelklier 15 15. Hypofyse 16. Placenta 17. Prostaatkliër 18. Huid 19. Maag 20 20. Schildklier II Goedaardig groeiende weefsels 1. Borst, adenoom 2. Parathyroide adenomen (2) 3. Prostaatkliër, hyperlasia (3) 25 4. Schildklier, adenomen (3) nodulaire struma's (2) III Onstekingsziëkten 1. Chronische ulceratieve colitis 2. Glomerulonefitis 30 3. Granulom en fibrose van de long 4. Lever - cirrose, hepatitis 5. Lupus profundus (borstklier en huid) 6. Buleuse pemfigus 7. Maagzweer 35 8. Ontstekings hyperplasie-lymfknopen (4) 9. Infectueuze mononucleose (5) IV Cultures 1. Borst fibroblasten 2. Lymfocyten, met PHA gestimuleerd a) Aantallen tussen haken geven aantal gevallen aan.- 4 - 1. Bladder 2. Bone marrow (hemoblastic lines, (5) a ^ 3. Chest 4. Reddish gray layer in centrifuged blood (3) 5 5. Gallbladder 6. Small intestine, cavities of Liéberkuhn 7. Large intestine 8 Kidney 9. Liver (2) 10 10. Lung (adjacent to tumor) 11. Lymph node 12. Lymphocytes, normal (2) 13. Pancreas 14. Pineal gland 15 15. Pituitary 16. Placenta 17. Prostate gland 18. Skin 19. Stomach 20 20. Thyroid II Benign growing tissues 1. Breast, adenoma 2. Parathyroid adenomas (2) 3. Prostate gland, hyperlasia (3) 25 4. Thyroid, adenomas (3) nodular goiter (2) III Inflammatory diseases 1. Chronic ulcerative colitis 2 Glomerulonephitis 30 3. Granulom and fibrosis of the lung 4. Liver - cirrhosis, hepatitis 5. Lupus profundus (mammary gland and skin) 6. Buleuse pemfigus 7. Peptic ulcer 35 8. Inflammatory hyperplasia lymph nodes (4) 9. Infectious mononucleosis (5 ) IV Cultures 1. Breast fibroblasts 2. Lymphocytes, stimulated with PHA a) Numbers in brackets indicate number of cases.
8007128 1' -+ - 5 -8007128 1 '- + - 5 -
Deze resultaten, die oorspronkelijk met iamunofluorescentie verkregen werden, zijn geverifieerd en uitgebreid met immunoperoxidase-methoden.These results, originally obtained by immunofluorescence, have been verified and extended by immunoperoxidase methods.
De uitvinding berust op de verrassende vondst, dat gemeen-5 schappelijke nucleolaire antigenen aangetroffen worden in een grote verscheidenheid van menselijke kankercellen, maar niet voorkomen in normale menselijke cellen. De antigenen zijn eiwitten, die een regelende funktie op de genen of andere funkties kunnen hebben en tijdens de gehele celdeling op een perichromosomale plaats blijven bestaan. Belangrijke aspekten van 10 de uitvinding zijn de vondst van de gemeenschappelijke nucleolaire antigenen, die in.-.menselijke kankercellen worden aangetroffen, het isoleren en zuiveren van de nucleolaire antigenen, de vorming van antisera en anti-lichamen, die specifiek zijn voor deze antigenen, diagnostische onderzoekmethoden onder toepassing van antisera en antilichamen, die specifiek zijn 15 voor deze antigenen, teneinde menselijke kankercellen te detecteren, en een diagnostische uitrusting, die antilichamen of antisera óf beide bevat, welke specifiek zijn voor deze nucleolaire antigenen.The invention is based on the surprising finding that common nucleolar antigens are found in a wide variety of human cancer cells, but do not exist in normal human cells. The antigens are proteins, which may have a regulatory function on the genes or other functions and persist in a perichromosomal site throughout cell division. Important aspects of the invention are the discovery of the common nucleolar antigens found in human cancer cells, the isolation and purification of the nucleolar antigens, the formation of antisera and antibodies specific for these antigens, diagnostic test methods using antisera and antibodies specific for these antigens to detect human cancer cells, and diagnostic equipment containing antibodies or antisera or both specific for these nucleolar antigens.
De antigenen zijn aangetroffen in een grote verscheidenheid menselijke kankersoorten, waaronder kankers van het centrale zenuwstelsel, 20 het maagdarmkanaal, het genitourinale stelsel, de long, de huid, bloedvor-mende weefsels en endocrine en exocrine klieren. Als voorbeelden van kwaadaardige cellen bij mensen zijn te noemen: HeLa-cellen, prostaatcarcinom, andere carcinomen, carcomen en hematologische neoplasmen. De antigenen kunnen geëxtraheerd worden uit kernen of nucleoli van kwaadaardige cellen 25 bij mensen. De antigenen zijn niet aangetroffen in overeenkomstige niet- tumorweefsels. Bij toepassing van de diagnostische methoden van de uitvinding voor het detecteren van kwaadaardige cellen werden circa 1 % valse negatieven en 3 % valse positieven gedetecteerd. De .valse negatieven stellen necrotische tumorweefsëls of om onbèkënde oorzaken niet-reaktieve tumoren voor. De valse 30 positieven zijn 2 gevallen van "preneoplastische weefsels" en zwak positieven bij enkele haardgebieden in "hyperplastisch weefsel". Twee focale positieve gebieden werd geïdentificeerd als "preneoplastische gebieden"' of focale neoplastische transformatie bij ontstekingsweefsels in het maagdarmkanaal.The antigens have been found in a wide variety of human cancers, including cancers of the central nervous system, gastrointestinal tract, genitourinal system, lung, skin, blood-forming tissues, and endocrine and exocrine glands. As examples of malignant cells in humans can be mentioned: HeLa cells, prostate carcinom, other carcinomas, carcomas and haematological neoplasms. The antigens can be extracted from nuclei or nucleoli of malignant cells in humans. The antigens have not been found in corresponding non-tumor tissues. Using the diagnostic methods of the invention to detect malignant cells, approximately 1% false negatives and 3% false positives were detected. The false negatives represent necrotic tumor tissues or, for unknown reasons, non-reactive tumors. The false positives are 2 cases of "preneoplastic tissues" and weak positives in some of the heart regions in "hyperplastic tissue". Two focal positive areas were identified as "preneoplastic areas" or focal neoplastic transformation in inflammatory tissues in the gastrointestinal tract.
De antigenen bezitten een hoofdsoort en ten minste een en mo-35 gelijk meer kleinere antigeensoorten. De hoofd-antigeensoort uit menselijke kankercellen (a) bezit een duidelijk isoelektrisch punt van 6,0-6,7 en omstreeks 6,3, zoals bepaald door iso-elektrisch focusseren, met pH 3-10 ' en polyacrylamidegel; (b) bezit een molecuulgewicht van circa 50.000-60.000 dalton bepaald door twee dimensionele gel-elektroforese met een tweede 8007128 * ^ · - 6 - demensie van SDS (natriumdodecylsulfaat); (c) is gedeeltelijk sterk gebonden asm nucleair en nucleolair RNP en gedeeltelijk oplosbaar in 0,01 M Tris-HCl, pH 8; (d) en is zowel nucleolair als extranucleolair, maar blijft tijdens de celdeling "intranucleair" of met de chromosomen verbonden.The antigens have a major species and at least one and possibly more minor antigen species. The major antigenic species from human cancer cells (a) has a clear isoelectric point of 6.0-6.7 and about 6.3, as determined by isoelectric focusing, with pH 3-10 'and polyacrylamide gel; (b) has a molecular weight of about 50,000-60,000 daltons as determined by two-dimensional gel electrophoresis with a second 8007128 -6 -dimension of SDS (sodium dodecyl sulfate); (c) is partially strongly bound asm nuclear and nucleolar RNP and partially soluble in 0.01 M Tris-HCl, pH 8; (d) and is both nucleolar and extranucleolar, but remains "intranuclear" or linked to the chromosomes during cell division.
5 De tweede antigeensdort, die gedetecteerd werd, geeft een pl van circa 6,0 (bepaald volgens dezelfde methode als bij de hoofd-antigeen-soort) en zijn molecuulgewicht bedraagt eveneens 50.000-60.000 dalton. Het is mogelijk, dat dit een gemodificeerd produkt is van het hoofd-antigeen, maar er is niet bepaald of het structureel verwant is. Deze antigeensoort 10 is in een relatief kleinere concentratie aanwezig dan de hoofd-antigeensoort.The second antigenic residue, detected, gives a pl of about 6.0 (determined by the same method as in the main antigen species) and its molecular weight is also 50,000-60,000 daltons. It is possible that this is a modified product of the main antigen, but it has not been determined whether it is structurally related. This antigen type 10 is present in a relatively smaller concentration than the main antigen type.
Antigenen zijn eveneens aanwezig in nucleolaire ribonucleo-proteine (RNP) deeltjes, die verkregen worden door ultracentrifugeren van de hieronder te beschrijven Tris-extracten. Het in deze deeltjes aanwezige antigeen is sterker aan eiwitten en ribonucleinezuur (RNA) gebonden dan het 15 antigeen in de in Tris oplosbare fraktie. Het is nog niet duidelijk of de antigenen in het RNF-deeltje identiek zijn aan die in de bovendrijvende fraktie, maar hun isoelektrische punten zijn dezelfde en zij absorberen de antilichamen voor de antigenen. Nucleolaire antigenen die aanwezig zijn in fibrielen, waarschijnlijk van het netwerk van het nucleaire ribonucleo-20 proteine, worden eveneens in kankercellen waargenomen met behulp van immune-lichtmicroscopie. Dit zijn extra nucleolaire structuren, die elementen kunnen voorstellen, waarvan de RNP-deeltjes zijn afgeleid.Antigens are also present in nucleolar ribonucleoprotein (RNP) particles, which are obtained by ultracentrifugation of the Tris extracts described below. The antigen present in these particles is more bound to proteins and ribonucleic acid (RNA) than the antigen in the Tris soluble fraction. It is not yet clear whether the antigens in the RNF particle are identical to those in the supernatant fraction, but their isoelectric points are the same and they absorb the antibodies to the antigens. Nucleolar antigens present in fibriels, probably from the network of the nuclear ribonucleo-20 protein, are also detected in cancer cells by immune light microscopy. These are additional nucleolar structures, which can represent elements from which the RNP particles are derived.
Er dient nog te worden uitgemaakt of de antigenen een stof voorstellen, die in., hoge concentraties in kankercellen en in zeer lage 25 concentraties in niet-kankercellen aanveZig-is of dat zij foetale antigenen zijn, zoals eerder gevonden werd bij vergelijkende onderzoeken aan nucleaire antigenen van Novikoff hepatoom bij de rat en normale levercellen vein de rat (Yeoman c.s., 1976).It remains to be determined whether the antigens represent a substance which is affected in high concentrations in cancer cells and in very low concentrations in non-cancer cells or whether they are fetal antigens, as previously found in nuclear comparative studies. antigens of Novikoff hepatoma in the rat and normal liver cells in the rat (Yeoman et al., 1976).
Alle stappen voor het verkrijgen en analyseren van monsters 30 van menselijk weefsel, bloed en serum van menselijke tumoren en andere weefsels van patiënten die van kanker verdacht werden, waren goedgekeurd door het Human Research Committee in Baylor College of Medicine, Houston, Texas en daarmee samenwerkende ziekenhuizen. COupes.van: menselijke, tumoren werden verkregen uit bevroren coupes..van operatiemonsters, biopsie of ge-35 conserveerde cryostaatmonster, in hoofdzaak van het Department of Pathology van Houston Veterans Administration Medical Centre en ook van the Michigan Kanker Foundation, Detroit, Michigan en van de Afdeling voor Interne Geneeskunde van de Keizer Karei Universiteit in Praag, Tsjechoslowakije. Deze coupes werden op de aanwezigheid van necleolaire antigenen geanalyseerd 8007128All steps for obtaining and analyzing samples of human tissue, blood and serum from human tumors and other tissues from patients suspected of cancer had been approved by the Human Research Committee at Baylor College of Medicine, Houston, Texas and associated hospitals. COUPES. From: Human tumors were obtained from frozen sections of surgical specimens, biopsy or conserved cryostat specimens mainly from the Department of Pathology of Houston Veterans Administration Medical Center and also from the Michigan Cancer Foundation, Detroit, Michigan and from the Department of Internal Medicine of the Imperial Karei University in Prague, Czechoslovakia. These sections were analyzed for the presence of necleolar antigens 8007128
JJ
- 7 - V * volgens methoden van indirekte immunofluorescentie en immunoperoxidase.- 7 - V * by methods of indirect immunofluorescence and immunoperoxidase.
De zuivering van de antigenen werd Uitgevoerd door kernen of nuclëoli 6 maal te extraheren met 10 mM Tris HC1/0,1 mH PMSF/pH 8 in een hoeveelheid van 20 volumina op 1 volume kernen of nucleoli. Het extract 5 werd eerst gedurende 10 minuten met 27.000 x. g.en daarna 16 uren met 100,000 x g gecentrifugeerd. Men 'gebruikte ammoniumsulfaat van 40 % ver-zadigingsconcentratie om verontreinigingen te verwijderen. De 40 - 100 % ammoniumsulfaatfraktie werd door centrifugeren verzameld en tegen 20 mM Tris HCl/pH 7,6 gedialyseerd. De antigenen werden gechromatografeerd over 10 DE-52 cellulosekolommen (lx 10 cm). De antigenen werden geëlueerd in de fraktie van 0,15 M NaCl/0,1 mM PMSF met pH 7,6. Gelen voor het isoelektrisch focusseren werden toegepast om de antigenen te identificeren en te zuiveren. Deze gelen bevatten 4 % acrylamide/8M ureum/2 % amfolinen (pH 3,5-10). De antigenen met respectievelijk pi 6,3 en 6,0 werden uit de gelen gesneden.The purification of the antigens was performed by extracting nuclei or nucleoli 6 times with 10 mM Tris HCl / 0.1 mH PMSF / pH 8 in an amount of 20 volumes on 1 volume of nuclei or nucleoli. The extract 5 was first washed at 27,000 x for 10 minutes. and then centrifuged at 100,000 x g for 16 hours. Ammonium sulfate of 40% saturation concentration was used to remove impurities. The 40-100% ammonium sulfate fraction was collected by centrifugation and dialyzed against 20 mM Tris HCl / pH 7.6. The antigens were chromatographed on 10 DE-52 cellulose columns (1 x 10 cm). The antigens were eluted in the fraction of 0.15 M NaCl / 0.1 mM PMSF with pH 7.6. Isoelectric focusing gels were used to identify and purify the antigens. These gels contain 4% acrylamide / 8M urea / 2% ampholines (pH 3.5-10). The antigens with pi 6.3 and 6.0, respectively, were excised from the gels.
15 Op. SDS (natriumdodecylsulfaat) gelen werd één hoofdvlek gevonden voor elk van deze antigenen.15 Op. SDS (sodium dodecyl sulfate) gels, one main spot was found for each of these antigens.
Kernen of nucleoli van HeLa cellen werden bereid door HeLa cellen te verzamelen uit Spinner kweekflessen (7-8 liter). De cellen dienen 5 in de logfase te zijn (7-8 x 10 cellen/ml) en ware dit ook. De cellen wer-20 den gedurende 8 minuten bij 800 x g gecentrifugeerd onder vorming van cel-tabletten. Deze celtabletten werden gesuspendeerd in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (0,15 M NaCl, 0,01 M fosfaat, pH 7,2) door zacht homogeniseren met een losse stamper van polytetrafluoretheen en gedurende 8 minuten met 800 x g gecentrifugeérd. De cellen werden een tweede maal met 25 PBS gewassen en de celtabletten werden gewogen. De celtabletten werden door zacht homogeniseren in 20 volumina reticulocyt standaardbuffer (RSB) met pH 7,4 gehomogeniseerd, waarna men ze 30 minuten op ijs liet zwellen. Daarna werden de cellen gedurende 8 minuten bij 1000 x g gecentrifugeerd en opnieuw door zacht homogeniseren gesuspendeerd in RSB buffer plus 1/20 volume van 30 het reinigingsmiddel Nonidet P40 (10% in RSB). De uiteindelijke hoeveelheid Nonidet bedroeg 0,5 volume %. De cellen werden met een Dounce homogeniseer-inrichting met 20-60 slagen gehomogeniseerd tot de cellen gebroken waren en de kernen vrijgekomen waren en van cytoplasma bevrijd waren. De cellen werden daarna 8 minuten bij 1000 x g gecentrifugeerd, door zacht homogeni-35 seren weer gesuspendeerd in 0,88 M sucrose met 0,5 mM Mg-acetaat (20 x gewicht-volume) en 20 minuten bij 1500 x g gecentrifugeerd. Het verkregen materiaal bevatte de HeLa kernen en deze werden gebruikt om de hieronder beschreven antigeenextracten te bereiden. Kernen van andere menselijke kwaadaardige cellen kunnen op overeenkomstige wijze verkregen worden.Nuclei or nucleoli of HeLa cells were prepared by collecting HeLa cells from Spinner culture bottles (7-8 liters). The cells should be and should be 5 in the log phase (7-8 x 10 cells / ml). The cells were centrifuged at 800 x g for 8 minutes to form cell tablets. These cell tablets were suspended in phosphate buffered saline (PBS) (0.15 M NaCl, 0.01 M phosphate, pH 7.2) by gentle homogenization with a loose polytetrafluoroethylene stamper and centrifuged at 800 x g for 8 minutes. The cells were washed a second time with 25 PBS and the cell tablets were weighed. The cell tablets were homogenized by gentle homogenization in 20 volumes of reticulocyte standard buffer (RSB) with pH 7.4 and swelled on ice for 30 minutes. The cells were then centrifuged at 1000 x g for 8 minutes and resuspended in RSB buffer plus 1/20 volume of the detergent Nonidet P40 (10% in RSB) by gentle homogenization. The final amount of Nonidet was 0.5 volume%. The cells were homogenized with a Dounce homogenizer with 20-60 strokes until the cells were broken and the nuclei were released and cleared of cytoplasm. The cells were then centrifuged at 1000 x g for 8 minutes, resuspended in 0.88 M sucrose with 0.5 mM Mg acetate (20 x weight volume) by gentle homogenization and centrifuged at 1500 x g for 20 minutes. The resulting material contained the HeLa nuclei and these were used to prepare the antigen extracts described below. Nuclei from other human malignant cells can be similarly obtained.
8007128 « t - 8 -8007128 «t - 8 -
Voor het isoleren van nucleoli werd het op de bovenbeschreven wijze verkregen kerntablet vervolgens door zacht homogeniseren gesuspendeerd in 0,34 M saccharose met 0,5 mM Mg-acetaat waarbij men 2 ml saccharose per gram van de oorspronkelijke cellen gebruikte. De kernen werden met ultra-5 sonore trillingen behandeld (met een Branson inrichting) met salvo!s van 10 sekonden (en 10 sekonden rust). De totale tijd lag tussen 60 en 110 sekonden. De vrijgekomen nucleoli werden bewaakt door microscopisch onderzoek. Om de nucleoli zichtbaar te maken werden zij gekleurd met azuur C ( een oplossing van 1 % azuur C in 0,25 M saccharose). Het preparaat dient 10 aan het einde van de behandeling met ultrasonore trillingen vrij te zijn van kernen. Op de met ultrasonore trillingen behandelde fraktie bracht men drie maal het volume 0,88 M saccharose-oplossing' (zonder Mg-acetaat) aan en men centrifugeerde 20 maal bij 1500 x g. Het verkregen materiaal bevatte de HeLa nucleoli, die als immunogeen toegepast kunnen worden.To isolate nucleoli, the core tablet obtained as described above was then suspended by gentle homogenization in 0.34 M sucrose with 0.5 mM Mg acetate using 2 ml sucrose per gram of the original cells. The cores were treated with ultra-5 sonic vibrations (with a Branson device) with 10 second bursts (and 10 seconds rest). The total time was between 60 and 110 seconds. The released nucleoli were monitored by microscopic examination. To visualize the nucleoli, they were stained with azure C (a solution of 1% azure C in 0.25 M sucrose). The preparation should be free from cores at the end of the ultrasonic treatment. The fraction treated with ultrasonic vibrations was applied three times the volume of 0.88 M sucrose solution (without Mg acetate) and centrifuged 20 times at 1500 x g. The material obtained contained the HeLa nucleoli, which can be used as an immunogen.
15 Gewoonlijk werd met de bovenstaande werkwijze'een bevredigende reiniging verkregen (Busch en Smetana, 1970) en bij licht microscopie bleek, dat de kwaliteit van deze preparaten in hoofdzaak bevredigend was. Bij analyse met elektronenmicroscopie bleek echter de aanwezigheid van chromatine en verontreinigingen uit de kern. Het hoofdprobleem voor een doelmatige 20 zuivering van deze preparaten is de beperkte hoeveelheid oorspronkelijke HeLa cellen in de cultures, waardoor het aantal hernieuwde zuiveringsstap-pen beperkt wordt. Nucleoli, die bereid werden uit preparaten van 5-10 g HeLa cellen i.p.v. de hoeveelheden van 0,5-1 g, die bij eerder onderzoek gebruikt werden, gaven voldoende materiaal voor een adequate zuivering.Usually, a satisfactory cleaning was obtained by the above method (Busch and Smetana, 1970) and light microscopy showed that the quality of these preparations was essentially satisfactory. However, electron microscopy analysis revealed the presence of chromatin and impurities from the nucleus. The main problem for efficient purification of these preparations is the limited amount of original HeLa cells in the cultures, limiting the number of renewed purification steps. Nucleoli, which were prepared from preparations of 5-10 g of HeLa cells instead of the amounts of 0.5-1 g used in previous research, provided sufficient material for adequate purification.
25 De omstandigheden voor het kweken van de HeLa cellen en het isoleren van de placenta-kemen waren praktisch dezelfde als, die we'lke al eerder beschreven waren (Davis c.s., 1979).The conditions for culturing the HeLa cells and isolating the placenta nuclei were practically the same as those previously described (Davis et al., 1979).
Een Tris extract van HeLa werd bereid door de HeLa kernen in NaCl-EDTA buffer te suspenderen, 10 x gewicht/volume, dus 1 gram kernen/ 30 10 ml buffer (buffer: 0,075 M.lïaCl, 0,025 M Na-EDTA? pH 8j ImM PMSF).A Tris extract of HeLa was prepared by suspending the HeLa nuclei in NaCl-EDTA buffer, 10 x weight / volume, i.e. 1 gram of nuclei / 10 ml buffer (buffer: 0.075 M.lIaCl, 0.025 M Na-EDTA? PH 8j ImM PMSF).
Het fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) wordt in een concentratie van 100 mM in isopropanol toegepast. Het wordt aan iedere oplossing toegevoegd vóór het extraheren. De suspensie werd met een Dounce homogeniseerinrichting onder toepassing van 20 slagen gehomogeniseerd en 5 minuten gecentrifugeerd 35 met 3000 x g. De bovenstaande vloeistof werd verzameld. De bovengenoemde extracties werden nog 2 maal met het kernmateriaal herhaald. Het NaCl-EDTA extract werd niet bij het onderhavige antigeenonderzoek gebruikt en derhalve verwijderd. Het kernmateriaal werd gesuspendeerd in 10 maal gewicht/ volume 0,01 M Tris-HCl; pH 8; 1 mM PMSF en met een Dounce homogeniseerin- 8007128 - 9 - " ff ( richting met 20 slagen gehomogeniseerd, hoewel opgemerkt wordt, dat 0,01 M Tris-HCl met pH 7-9 bevredigend is. De bovenstaande vloeistof werd verzameld en op ijs bewaard. Tijdens de extracties met Tris braken de kernen en werd chromatine afgegeven. Het breken van de kernen werd bewaakt met micros-5 copisch onderzoek. Het materiaal werd opnieuw gesuspendeerd in de Tris buffer en men liet de kernen gedurende 15 minuten op ijs "zwellen" Daarna werd met een "Dounce" apparaat met 20 slagen gehomogeniseerd en werd gedurende 10 minuten met 12000 x g gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd bewaard. Het materiaal werd ophieuw gesuspendeerd en had een 10 witachtig donzig uiterlijk. Het werd opnieuw met een "Dounce” apparaat gehomogeniseerd met 20 slagen en 30 minuten met 27000 x g gecentrifugeerd.The phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) is used in a concentration of 100 mM in isopropanol. It is added to each solution before extraction. The suspension was homogenized with a Dounce homogenizer using 20 strokes and centrifuged at 3000 x g for 5 minutes. The supernatant was collected. The above extractions were repeated 2 more times with the core material. The NaCl-EDTA extract was not used in the present antigen study and was therefore removed. The core material was suspended in 10 times weight / volume 0.01 M Tris-HCl; pH 8; 1 mM PMSF and homogenized with a Dounce 8007128-9 "ff (direction 20 strokes homogenized, although it is noted that 0.01 M Tris-HCl with pH 7-9 is satisfactory. The supernatant was collected and on ice During the extractions with Tris, the nuclei broke and chromatin was released The breaking of the nuclei was monitored by micros-5 copic examination The material was resuspended in the Tris buffer and the nuclei were swelled on ice for 15 minutes "Then homogenized with a 20-stroke" Dounce "apparatus and centrifuged at 12000 xg for 10 minutes. The supernatant was saved. The material was resuspended and had a whitish-fluffy appearance. It was again washed with a" Dounce " homogenized with 20 strokes and centrifuged at 27000 xg for 30 minutes.
De bovenstaande vloeistof werd verzameld en met de eerdere' bovenstaande vloeistoffen verkregen van de Tris-extracten gekombineerd.The supernatant was collected and combined with the previous supernatants obtained from the Tris extracts.
De Tris-extracten werden daarna geconcentreerd met een 15 Amicon UM-10 of PM-10 Diaflo membraan. In het algemeen bedroeg het volume bij het begin omstreeks 50 ml en werd het geconcentreerd tot 4-5 ml. De uiteindelijke eiwitconcentratie bedraagt omstreeks 4-5 milligram/ml. Met dit Tris-extract kan het konijn geimmuniseerd worden.The Tris extracts were then concentrated with a 15 Amicon UM-10 or PM-10 Diaflo membrane. Generally, the volume at the beginning was about 50 ml and concentrated to 4-5 ml. The final protein concentration is about 4-5 milligrams / ml. The rabbit can be immunized with this Tris extract.
Onder toepassing van de bovenstaande werkwijze kan men ook 20 extracten bereiden uit HeLa nucleoli en van kernen of nucleoli van andere kwaadaardige cellen bij mensen.Using the above method, one can also prepare extracts from HeLa nucleoli and from nuclei or nucleoli of other malignant cells in humans.
Voor het Tris-immunogeen verdunt men 250 ƒ11 Tris-extract (4—5 mg/ml, dat op de bovenstaande wijze bereid is, met 250yil PBS. Men . kombineert dit met Freund's hulpvloeistof, zoals voor het nucleolaire 25 immunogeen hieronder beschreven wordt.For the Tris immunogen, dilute 250 µl Tris extract (4-5 mg / ml prepared as above) with 250 µl PBS and combine with Freund's auxiliary liquid as described below for the nucleolar immunogen.
Antilichamen werden bereid door konijnen met preparaten van HeLa celnucleoli als volgt te immuniseren: de HeLa nucleoli werden gewogen .(20-30 mg, vochtig gewicht) en gelijkmatig gesuspendeerd in 0,5 ml 0,01 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,2. Daarna werden ze als volgt 30 gemengd met 0,6 ml volledig hulpmiddel van Freund (GIBCO): de gesupendeerde nucleoli werden in een injectiespuit van 5 ml gebracht en het hulpmiddel van Freund in een tweede spuit. Aan iedere spuit bevestigde men een naald met een doorsnede van 1,2 mm, waarvan de punt verwijderd was. De naalden werden daarna verbonden met een stuk polyetheenbuis met een inwendige 35 doorsnede van 1,2 mm (Clay-Adams). De inhoud van de spuiten werd gemengd tot het preparaat dik werd en moeilijk door de buis te persen was.Antibodies were prepared by immunizing rabbits with HeLa cell nucleoli preparations as follows: the HeLa nucleoli were weighed (20-30 mg, wet weight) and suspended evenly in 0.5 ml 0.01 M phosphate buffered saline, pH 7. 2. Then, they were mixed with 0.6 ml of Freund's complete vehicle (GIBCO) as follows: the nucleucle supernatants were placed in a 5 ml syringe and the Freund's vehicle in a second syringe. A needle 1.2 mm in diameter with the tip removed was attached to each syringe. The needles were then connected to a 1.2 mm inner diameter piece of polyethylene tube (Clay-Adams). The contents of the syringes were mixed until the preparation became thick and difficult to squeeze through the tube.
Het konijn werd op de rug geschoren en op 6 plaatsen werd intradermaal een injektie toegediend van 0,1 ml per plaats. De resterende 8007128 s - 10 - 0,4-0,5 ml werd voor de helft subcutaan (onder de losse huid op het bovenste deel van de rug) en voor de helft intramusculair (in de dijspier) gelnjek-teerd. De injekties werden gedurende 3 weken 1 maal per week gegeven, waarbij elke keer dezelfde hoeveelheden nucleoli werden toegediend. De eerste 5 bloedafname werd 7-10 dagen na de derde week van de immunisatie uitgevoerd. Hen gebruikte een konijne-oorkam (Bellco) en een vacuumpomp om het bloed te verzamelen. Men liet het bloed (circa 45-50 ml) 3-4 uren bij kamertemperatuur klonteren. Het serumgedeelte werd uit de buis verwijderd en 30 minuten met 1000 g gecentrifugeerd (hierdoor worden evenutele vrije rode 10 bloedlichaampjes gesëdimenteerd). Het heldere serum werd verzameld en daarna geabsorbeerd (of in bevroren toestand gehouden tot men gereed was voor de absorptie). De bloedklonter kan gedurende:.een nacht gekoeld wordën. Hierdoor komen nog enkele ml serum vrij. Het serum van iedere bloedafname werd met de indirekte immunoflorescentiemethode onderzocht op de aanwezigheid 15 van antilichamen voor de nucleoli.The rabbit was shaved back and an injection of 0.1 ml per site was administered intradermally at 6 sites. The remaining 8007128 s - 10 - 0.4-0.5 ml was injected half subcutaneously (under the loose skin on the upper back) and half injected intramuscularly (in the thigh muscle). The injections were given once a week for 3 weeks, the same amounts of nucleoli being administered each time. The first 5 blood draws were performed 7-10 days after the third week of immunization. Hen used a rabbit ear comb (Bellco) and a vacuum pump to collect the blood. The blood (about 45-50 ml) was allowed to clot at room temperature for 3-4 hours. The serum portion was removed from the tube and centrifuged with 1000 g for 30 minutes (this causes some free red blood cells to be sedimented). The clear serum was collected and then absorbed (or kept frozen until ready for absorption). The blood clot can be cooled overnight. This will release a few more ml of serum. The serum from each blood draw was tested for the presence of antibodies to the nucleoli by the indirect immunoflorescence method.
Andere niet-menselijke gastheren (bijv. geiten, schapen, paarden, kippen enz.) kunnen met preparaten van nucleoli uit menselijke kwaadaardige cellen geïmmuniseerd worden om de antisera of antilichamen tegen de nucleolaire antigenen volgens de uitvinding op te 'wekken. Antisera 20 kunnen ook bereid worden door immunisatie van niet-menselijke gastheer dieren met extracten (bijv. Tris-extract) van kernen of nucleoli van voor mensen kwaadaardige cellen.Other non-human hosts (eg, goats, sheep, horses, chickens, etc.) can be immunized with nucleoli preparations from human malignant cells to raise the antisera or antibodies to the nucleolar antigens of the invention. Antisera 20 can also be prepared by immunizing non-human host animals with extracts (eg, Tris extract) from nuclei or nucleoli of human malignant cells.
De absorptie van antinucleolair antiserum werd uitgevoerd door het konijne-antiserum eerst te absorberèn met 20 % normaal menselijk 25 serum en 2Q % foetaal kalfsserum (GIBCO). Men voegde 20 % normaal menselijk sefum toe aan het konijne-antiserum (4 ml op 20 ml) en incubeerde 1 uur onder schudden in een op 37° C gehouden waterbad. Men verwijderde de kolf uit het bad, voegde 20 % foetaal kalfsserum (4,8 ml op 24 ml) toe en incubeerde 1 uur onder schudden in een op 37° C gehouden waterbad. De kolf 30 werd verwijderd en nog een uur bij kamertemperatuur geIncubeerd, waarbij gemengd werd door iedere 15 minuten zacht om te zwenken. Daarna werd het mengsel 30 minuten bij 15000 x g gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistof (geabsorbeerd serum) werd verwijderd en bewaard. Het geabsorbeerde serum werd in de immunoglobulinevoxm (Ig) omgezet onder toepassing van de 35 werkwijze, die hieronder beschreven is voor de (NH^)^SO^-precipitatie van serum.The absorption of antinucleolar antiserum was performed by first absorbing the rabbit antiserum with 20% normal human serum and 2Q% fetal calf serum (GIBCO). 20% normal human sefum was added to the rabbit antiserum (4 ml to 20 ml) and incubated for 1 hour with shaking in a water bath kept at 37 ° C. The flask was removed from the bath, 20% fetal calf serum (4.8 ml to 24 ml) was added and incubated for 1 hour with shaking in a water bath kept at 37 ° C. The flask 30 was removed and incubated for an additional hour at room temperature, mixing by gentle swirling every 15 minutes. The mixture was then centrifuged at 15000 x g for 30 minutes and the supernatant (absorbed serum) was removed and stored. The absorbed serum was converted to the immunoglobulin volxm (Ig) using the method described below for the (NH 2) 2 SO 2 precipitation of serum.
Het Ig-preparaat uit het nucleolaire antiserum, dat geabsorbeerd was met normaal menselijk serum en-foetaal kalfsserum, werd nu geabsorbeerd met een normaal menselijk weefsel (placenta of lever). Een ge- 8007128 » * I ** - 11 - lijk volume sonicaat (door behandeling met ultrasohore trillingen verkregen materiaal) van placentakernen in PBs 7,2 (10-15 mg eiweit/ml) werd toegevoegd aan het geabsorbeerde nucleolaire immunoglobuline (10 ml Ig plus 10 ml kemsonicaat) en het mengsel werd 1 uur onder schudden in een op 5 37° C gehouden waterbad gelncubeerd. Daarna werd nog een uur bij kamertem-‘peratuur gelncubeerd, waarbij gemengd werd door de kolf iedere 15 minuten .· - zacht om te zwenken; hierna Werd 30 minuten gecentrifugeerd bij 15000 x g.The Ig preparation from the nucleolar antiserum, which had been absorbed with normal human serum and fetal calf serum, was now absorbed with normal human tissue (placenta or liver). An 8007128 * * ** - 11 - volume volume of sonicate (material obtained by ultrasonication) of placenta nuclei in PBs 7.2 (10-15 mg egg whey / ml) was added to the absorbed nucleolar immunoglobulin (10 ml Ig plus 10 ml core sonicate) and the mixture was incubated for 1 hour with shaking in a water bath kept at 37 ° C. Then incubation was continued for an hour at room temperature, mixing through the flask every 15 minutes - gentle to swirl; then centrifuged at 15000 x g for 30 minutes.
De bovenstaande vloeistof werd verzameld en de'geabsorbeerde Ig werd op de beschreven wijze weer neergeslagen met (NH^SO^. Deze Ig kan als het 10 uiteindelijke antilichaamprodukt worden toegepast of door. chromatografie over diethylaminoethyl (DEAE) cellulose als volgt verder gezuiverd worden;The supernatant was collected and the absorbed Ig was reprecipitated in the manner described with (NH 2 SO 2. This Ig can be used as the final antibody product or further purified by chromatography on diethylaminoethyl (DEAE) cellulose as follows;
De Ig, die in de met 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing met pH 7,2 aanwezig is, wordt gedialyseerd tegen 0,0175 M fosfaatbuffer met pH 6,3 (zonder zout). Na dialyse wordt gedurende 20 minuten bij 2500 x g 15 gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof wordt op de DEAE kolom gebracht (20 mg eiwit per gram cellulose, Whatman DE 52). De IgG wordt uit de kolom geëulueerd met de 0,0175 M fosfaatbuffer. Na elutie wordt de IgG-fraktie gedialyseerd tegen de met 0,01 M fosfaat, gebufferde zoutoplossing met pH 7,2.The Ig, which is present in the 0.01 M phosphate buffered saline with pH 7.2, is dialyzed against 0.0175 M phosphate buffer with pH 6.3 (without salt). After dialysis, centrifugation is carried out at 2500 x g for 20 minutes. The supernatant is placed on the DEAE column (20 mg of protein per gram of cellulose, Whatman DE 52). The IgG is eluted from the column with the 0.0175 M phosphate buffer. After elution, the IgG fraction is dialyzed against the 0.01 M phosphate buffered saline pH 7.2.
20 Dezelfde werkwijze werd gevolgd voor het controleserum, dat uit het pre-immuneserum bestond, dat verkregen was door bloedafname van het konijn (of een ander niet-menselijk gastheerdierl voordat de immunisatie begonnen was.The same procedure was followed for the control serum, which consisted of the pre-immune serum obtained by drawing blood from the rabbit (or other non-human host animal before the immunization had started).
Konijne-immunoglobuline Ig werd als volgt bereid: er werd 25 een verzadigde (NH^SOj oplossing (760 g/liter) bereid en een gelijk volume koude verzadigde (NH^^SO^ werd druppelsgewijs onder roeren aan het antiserum tóegevoegd. Er vormde zich eén wit neerslag en men liet dit neerslag zich gedurende 1*2-2 uren in de koude aggregeren met een magnetische - ' roerder. Het neergeslagen antiserum werd gedurende 20 minuten met 3000 x g 30 gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd verwijderd en het materiaal werd opnieuw gesuspendeerd in PBS met pH 7,2 (ongeveer de helft van het volume van het oorspronkelijke serum). Het oplosbaar gemaakte materiaal werd in een dialysezak gebracht en gedurende een nacht in de koude gedialyseerd tegen 100 volumina PBS (met magnetisch, roeren). De dialysezak werd 35 de volgende morgen in vers PBS (100 maal het volume) geplaatst en de dialyse werd gedurende 6 uren voortgezet. De immunoglobuline werd zorgvuldig uit de dialysezak verwijderd en gedurende 20 minuten met 2500 x g gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd verzameld.Rabbit immunoglobulin Ig was prepared as follows: a saturated (NH 2 SO 2 solution (760 g / liter) was prepared and an equal volume of cold saturated (NH 2 SO 2) was added dropwise to the antiserum with stirring. one white precipitate and this precipitate was allowed to aggregate in the cold for 1 * 2-2 hours with a magnetic stirrer. The precipitated antiserum was centrifuged at 3000 xg for 20 minutes. The supernatant was removed and the material was redistilled. suspended in PBS at pH 7.2 (about half the volume of the original serum). The solubilized material was placed in a dialysis bag and dialyzed overnight against 100 volumes of PBS (with magnetic stirring). dialysis bag was placed in fresh PBS (100 times the volume) the next morning and dialysis was continued for 6 hours The immunoglobulin was carefully removed from the dialysis bag and left for 20 minutes and centrifuged at 2500 x g. The supernatant was collected.
De in de literatuur beschreven werkwijze voor immunofluorescentie 8007128 - 12 - (RK Busch c.s., 1974; Hilgers c.s., 1972) werd als volgt bij dit onderzoek toegepast: men bracht 150 ul antinucleolair antiserum in een verdunning van 1:50 op met acetón gefixeerde HeLa cellen of op gefixeerde weefselmon-sters (volgens Hilgers c.s. 1972; RK Busch c.s., 1974). Het kan nodig zijn 5 meer dan 150 ul te gebruiken, als het weefselmonster een groot gedeelte van het glaasje bedekt. De verdunning van het antiserum (As) hangt af van de titer van het antilichaam (Ab). Men kan ook andere verdunningen toepassen tot aan het punt, waarbij de As- of Ab-preparaten te verdund worden om het positieve responsi te geven op bekende positieve cellen (bijv. HeLa. 10 De glaasjes werden gedurende 45-50 minuten bij 37° C in een vochtige ruimte geincubeerd (de vochtigde kamer kan bestaan uit een grote petrischaal, waarin een vochtige papieren handdoek is gebracht). Na het incuberen werd het antiserum van het glaasje gewassen door voorzichtige toevoeging van PBS en de glaasjes werden in een houder geplaatst en 1 uur in BBS gewassen. 15 Het PBS werd 3 maal ververst, na 15 minuten, na 30 minuten en na 45 minuten. De glaasjes werden uit PBS verwijderd en 10 maal in gedestilleerd of ge-deoniseerd water gedompeld met snelle op en neer bewegingen. De glaasjes werden met koude lucht van een ventilator of föhn gedroogd (2-3 minuten), waarbij men voorzichtig was niet te ver te drogen. Men bracht 150 ^il met 20 fluoresceien gemerkt geite- .antikonijne-antiserum (Hyland of Cappel) in de verdunning 1:10 óp de glaasjes en incubeerde 30-35 bij kamertemperatuur in de vochtige kamer. Het tweede antilichaam werd door voorzichtig wassen met PBS van het glaasje verwijderd. Daarna werden de glaasjes 1 uur in PBS gewassen, waarbij 3 maal ververst werd, na 15 minuten, 30 minuten en 25 45 minuten; in plaats daarvan kan men ze na de eerste 15 minuten wassen ook in vers PBS plaatsen en ze gedurende de nacht in een koelkast laten staan. Na het uiteindelijke wassen met PBS werden de glaasjes 10 maal in gedeoniseerd of gedestilleerd water gedompeld met snelle op en neer bewegingen en met koude lucht van een ventilator of föhn (2-3 minuten) ge-30 droogd. Een oplossing van glycerol en PBS in de verhouding 1:1 werd aan de cellen of het weefselmonster toegevoegd en het geheel werd met een dek-glaasje bedekt. Het monster kan verscheidene maanden bewaard worden, wanneer men het dekglaasje afdichtend bevestigt met een .afdichtmiddel, bijv. ongekleurde nagellak, en koud bewaart. Het glaasje werd daarna met een fluores-35 centiemicroscoop onderzocht. Nucleolaire fluorescentie werd niet waargenomen met pre-immune immunoglobuline of pre-immune IgG-frakties. De andere toegepaste immunologische methoden waren dezelfde als die bij vroeger onderzoek (Kendall, 1938; Lowry c.s, 1951; Dale en Latner, 1969; Laurell, 1972; Wallace c.s., 1974; Marashi c.s. 1979) toegepast waren. Voor analyse 8007128 ’ # · ·· I. - --13- van de nucleolaire localisatie van de immunofluorescentie werden.monsters ** tijdens het' waarnemen van de fluorescentie in en buiten fase-contrast-be-.lichting geplaatst.The immunofluorescence method 8007128-12 - described in the literature (RK Busch et al., 1974; Hilgers et al., 1972) was used in this study as follows: 150 µl of antinucleolar antiserum was applied in a 1:50 dilution with acetone-fixed HeLa cells or on fixed tissue samples (according to Hilgers et al. 1972; RK Busch et al., 1974). It may be necessary to use more than 150 µl if the tissue sample covers a large portion of the slide. The dilution of the antiserum (As) depends on the titer of the antibody (Ab). Other dilutions can also be used up to the point where the As or Ab preparations are too diluted to give the positive response to known positive cells (eg HeLa. 10 Slides were run at 37 ° C for 45-50 minutes incubated in a humid space (the humid chamber may consist of a large Petri dish, into which a moist paper towel is placed.) After incubation, the antiserum was washed from the slide by carefully adding PBS and the slides were placed in a container and 1 washed in BBS for 15 hours The PBS was changed 3 times, after 15 minutes, after 30 minutes and after 45 minutes Slides were removed from PBS and dipped 10 times in distilled or deionized water with rapid up and down movements. Slides were dried with cold air from a fan or hair dryer (2-3 minutes), being careful not to over-dry 150 µl of 20 fluorescein-labeled goat anti-rabbit serum (Hyland or Capp) el) in the 1:10 dilution on the slides and incubated 30-35 at room temperature in the humid chamber. The second antibody was removed from the slide by gentle washing with PBS. The slides were then washed in PBS for 1 hour, with 3 changes, after 15 minutes, 30 minutes, and 45 minutes; instead, after the first 15 minutes of washing, they can also be placed in fresh PBS and left in a refrigerator overnight. After final washing with PBS, the slides were dipped 10 times in deionized or distilled water with rapid up and down movements and dried with cold air from a fan or hair dryer (2-3 minutes). A 1: 1 ratio of glycerol and PBS was added to the cells or tissue sample and covered with a coverslip. The sample can be stored for several months if the coverslip is sealed with a sealant, eg uncoloured nail polish, and stored cold. The slide was then examined with a fluorescent 35 microscope. Nucleolar fluorescence was not observed with pre-immune immunoglobulin or pre-immune IgG fractions. The other immunological methods used were the same as those used in previous research (Kendall, 1938; Lowry et al, 1951; Dale and Latner, 1969; Laurell, 1972; Wallace et al, 1974; Marashi et al. 1979). For analysis 8007128 # · ·· I. - --13- of the nucleolar localization of the immunofluorescence, samples ** were placed in and outside phase contrast illumination while observing the fluorescence.
I.p.v. met fluoresceren gemerkt geite-antikonijneserum kan 5 men ook de methode met immunoperoxidase toepassen. Zo werd bijv. 150 jil van met peroxidase gemerkte geite- antikonijneserum in de verdunning 1:10 of 1:20 toegevöëgd. Plaatselijke peroxidase-aktiviteit kan aangetoond worden met een 'aantal redoxikleurstofsystemen, geschikt voor llichtmicroscopie . - of elektrorienmicroscopie. Andere enzymen kunnen dienen als merkmaterialên 10 voor de indirekte methode en men kan peroxidase en andere enzymen direkt gebruiken door het primaire antilichaam te merken.Instead of fluorescently labeled goat anti-rabbit serum, the immunoperoxidase method can also be used. For example, 150 µl of peroxidase-labeled goat anti-rabbit serum was added in the 1:10 or 1:20 dilution. Local peroxidase activity can be demonstrated with a number of redox dye systems suitable for light microscopy. - or electrical microscopy. Other enzymes can serve as markers for the indirect method, and peroxidase and other enzymes can be used directly by labeling the primary antibody.
Incubatièmêdium volgens Kamofsky wordt als vólgt bereid: men weegt voldoende diaminóbenzidine (Sigma) af en suspendeert dit in 0,05 M Tris=HCl met pH 7,6, zodat de..concentratie 0,5 mg/ml bedraagt. Men 15 bereidt een waterstofperoxide-oplossing van 0,02 % (in de 0,05 M Tris-HCl-buffer). Men mengt de oplossingen van 0,5 mg/ml DAB en 0,02 % in een gewichtsverhouding 1:1 (deze gemengde oplossing werd iedere keer dat hij gebruikt werd vers bereid en tijdens de bereiding koud gehouden). Men brengt 200-300 ul van het mengsel van DAB en HjC^ op het glaasje en incubeert 30 20 minuten in een vochtige kamer bij kamertemperatuur.Incubation medium according to Kamofsky is prepared as follows: Sufficient diaminobenzidine (Sigma) is weighed out and suspended in 0.05 M Tris = HCl with pH 7.6, so that the concentration is 0.5 mg / ml. A hydrogen peroxide solution of 0.02% (in the 0.05 M Tris-HCl buffer) is prepared. The 0.5 mg / ml DAB and 0.02% solutions are mixed in a 1: 1 weight ratio (this mixed solution was prepared fresh each time it was used and kept cold during the preparation). 200-300 µl of the mixture of DAB and HjCl2 are placed on the slide and incubated in a humid chamber at room temperature for 30 minutes.
Na deze incubatie verwijdert men het DAB en mengsel door het glaasje te wassen met de 0,05 M Tris-HCl-buffer van pH 7,6, waaraan 0,1 M NaCl is toegevoegd. De glaasjes worden daarna 2 maal telkens 10 minuten gewassen in 0,05 M Tris-HCl met 7,6, dat 0,1 M is aan NaCl. Men beëindigt 25 de bewerking van de microscoopglaasjes als aangegeven in stappen 11-14 (behalve dat de PBS gewijzigd is iii Tris-HCl). Na voltooiing wordt het glaasje onderzocht met lichtmicroscopie.After this incubation, the DAB and mixture are removed by washing the slide with the 0.05 M Tris-HCl buffer of pH 7.6, to which 0.1 M NaCl has been added. The slides are then washed 2 times for 10 minutes each in 0.05 M Tris-HCl with 7.6, which is 0.1 M NaCl. The processing of the microscope slides as indicated in steps 11-14 is terminated (except that the PBS is modified iii Tris-HCl). After completion, the slide is examined by light microscopy.
Microscoopglaasjes met HeLa cellen voor immunofluorescentie .werden als volgt bereid: er werd een voorraad van gefixeerde HeLa cellen 30 bereid door aktief groeiende cellen uit de HeLa cultuurfles met PBS met een pH van 7,2 te verwijderen en daarmee te wassen. De cellen werden zo 6 'gesuspendeerd, dat er ten minste 1,5 x 10 cellen/ml aanwezig waren. Men bracht 1 druppel van de HeLa-cel suspensie op ieder gewassen glaasje (gereinigd met reinigingsmiddel, gespoeld met gedestilleerd of gedeoniseerd ‘ 35 water en gereinigd met alcohol en vervolgens gespoeld en warme lucht uit een föhn gedroogd) en spreidde dit enigszins uit en liet het bij kamer-- temperatuur (of een nacht in de koude)' drogen. De gedroogde cellen werden -----gefixeerd door de glaasjes 12 minuten bij 4° C in aceton te plaatsen. De glaasjes werden genummerd met een markeerpsttood voor glas met diamanten.Microscope slides with HeLa cells for immunofluorescence were prepared as follows: A stock of fixed HeLa cells was prepared by removing and growing actively growing cells from the HeLa culture flask with PBS pH 7.2. The cells were suspended 6 'so that at least 1.5 x 10 cells / ml were present. 1 drop of the HeLa cell suspension was placed on each washed slide (cleaned with detergent, rinsed with distilled or deionized water and cleaned with alcohol, then rinsed and dried with hot air from a hair dryer) and spread slightly and left dry at room temperature (or overnight in the cold). The dried cells were fixed by placing the slides in acetone at 4 ° C for 12 minutes. Slides were numbered with a diamond marker marker for glass with diamonds.
8007128 - 14 -8007128 - 14 -
De glaasjes werden als positieve controle op inmuriofluorescentie gebruikt.The slides were used as a positive control for inmurio fluorescence.
Het onderhavige onderzoek bevestigt, dat nucleolaire anti-genen aanwezig zijn in tumorcellen, maar niet wórden aangetroffen in niet-tumorweefseis. Een aanvankelijk onderzoek toonde aan, dat zowel in cellen 5 cultures van menselijke tumoren als in monsters verkregen bij autopsie of biopsie, een heldere nucleolaire fluorescentie verkregen werd met de dubbele antilichaamtechniek (indirekte immunofluorescentie) en dat geen overeenkomstig resultaat bereikt werd met een reeks non-tumorweefsels (Davis c.s., 1979). Bij later onderzoek'werden meer dan 60 kwaadaardige gezwellen 10 onderzocht en werd ook een reeks controleweefsèls onderzocht. Het is van groot belang, dat deze ruime sortering van kwaadaardige gezwellen van ectodermale, endodermale en mesodermale oorsprong de aanwezigheid van een of meer gemeenschappelijke nucleolaire'antigënen vertoond (Tabel A).The present study confirms that nucleolar anti-genes are present in tumor cells, but were not found in non-tumor tissue requirement. An initial study showed that, in both cell cultures of human tumors and in samples obtained by autopsy or biopsy, clear nucleolar fluorescence was obtained by the double antibody technique (indirect immunofluorescence) and that no similar result was achieved with a series of non- tumor tissues (Davis et al., 1979). Later studies examined more than 60 malignant growths 10 and also examined a series of control tissues. It is of great importance that this wide range of malignant growths of ectodermal, endodermal and mesodermal origin exhibits the presence of one or more common nucleolar antigens (Table A).
voorbeeld Iexample I
15 Normale weefseis: Bij 17 niet-tumorweefsels trad geen nucleolaire fluorescentie op na incubering van de antisera of antilichamen met de verschillende gefixeerde celpreparaten. Van bijzonder belang was, dat noch de Malpighiaanse laag van de huid, noch de cellen van het beendermerg, noch de holten van Lieberkuhn bij deze methode positieve .immunofluorescentie vertoonden.Normal tissue requirement: No nucleolar fluorescence occurred in 17 non-tumor tissues after incubation of the antisera or antibodies with the different fixed cell preparations. Of particular interest, neither the Malpighian layer of the skin, nor the bone marrow cells, nor the Lieberkuhn cavities showed positive immunofluorescence in this method.
20 Bovendien waren de verschillende niet-tumorweefsels grenzend aan de neoplas-men eveneens negatief; hieronder zijn vele weefsels van verschillende types. Een aantal goedaardige gezwellen, die onderzocht werdén, waaronder verschillende soorten adenomen van de schildklier, waren eveneens negatief (Tabel B).In addition, the various non-tumor tissues adjacent to the neoplasms were also negative; below are many fabrics of different types. A number of benign growths examined, including various types of thyroid adenomas, were also negative (Table B).
Voorbeeld IIExample II
25. Onstekingsbeschadiglngen: Om vast te stellen of een ontstekingsresponsie verband hield met het verschijnen van deze antigenen werd een onderzoek uitgevoerd met 8 soorten ontstekingsweefseis. Bij de meeste daarvan trad geen waarneembare fluorescentie op in de nucleoli van de onderzochte cellen. Er werden echter secties in monsters van ulceratieve colitis en maagzweer 30 gevonden’, die een positieve nucleolaire fluorescentie vertoonden. In het bijzonder waren twee of drie secties van de ulceratieve colitis negatief, terwijl een een duidelijke positieve nucleolaire fluorescentie vertoonde.25. Inflammatory Damages: To determine whether an inflammatory response was associated with the appearance of these antigens, a study was conducted with 8 types of inflammatory tissue requirement. Most of them showed no detectable fluorescence in the nucleoli of the cells examined. However, sections in ulcerative colitis and gastric ulcer samples were found, showing positive nucleolar fluorescence. In particular, two or three sections of the ulcerative colitis were negative, while one showed markedly positive nucleolar fluorescence.
Bij het riaagzweerweefsel vertoonde een van de twee geanalyseerde secties een positieve nucleolaire fluorescentie. Deze resultaten zijn bijzonder 35 interessant i.v.m. de bekende neiging van deze lesies een verandering te ondergaan tot kwaadaardige gezwellen. Van bijzonder beIcing was om zowel de focaal positieve als negatieve gebieden van deze plaatjes opnieuw te bekijken in de hematoxyline, met eosine gekleurde secties; deze toonden aan, dat errinderdaad gebieden in deze lesies bestonden, die niet 'alleen 8007128 - 15 - a § mitotische figuren vertoonden, maar ook een ophoping van de epitheellaag.In the rat ulcer tissue, one of the two sections analyzed showed positive nucleolar fluorescence. These results are particularly interesting in connection with the known tendency of these lesions to change into malignant growths. Of particular interest was to review both the focal positive and negative regions of these platelets in the hematoxylin, with eosin stained sections; these showed that there were indeed areas in these lesions not only showing mitotic figures, but also an accumulation of the epithelial layer.
Dit wees er mogelijk op, dat deze cellen in situ preneoplastische lesies of carcinoom zouden kunnen gaan vormen. Het is mogelijk, dat de vondst van deze fluorescerende gebieden behulpzaam kunnen zijn bij beslissingen om 5 chirurgisch op te treden met locale of meer algemene resecties"van de aangetaste lesies.This possibly indicated that these cells could form preneoplastic lesions or carcinoma in situ. It is possible that the discovery of these fluorescent regions may assist in decisions to perform surgery with local or more general resections of the affected lesions.
. voorbeeld lil. example lil
Artifacten: In het epithëel van de maag was er een gebied van fluorescentie in iedere cel, dat niet nucleolair was en dat een niet-specifieke locali-10 satie van het fluorescerende antilichaam leek voor te stellen. In een holte van de dunne darm bleek een niet-specifieke localisatie van het antilichaam voor te komen in de vorm van aggregaten; in de meeste gevallen werden deze aggregaten verwijderd door filtratie vooraf van de'antilichamen door een Millipore filter met poriën van 0,45 ^am..In een monster borst-15 weefsel, dat negatief was op nucïeolaire fluorescentie waren in het algemeen kleine, niet-specifieke immunofluorescentievlekken 'verdeeld zonder speciale localiserende kenmerken voor wat betreft de celmorfologie. De diametèrs van deze zeer kleine, niet-specifieke precipitaten bedroegen 0,5-0,1 jm, waar tegenover de nucïeolaire diameters in de kernen en nucleoli 4-6 urn 20 bedroegen.Artifacts: In the epithelium of the stomach, there was a region of fluorescence in each cell which was not nucleolar and which seemed to represent a nonspecific localization of the fluorescent antibody. In a cavity of the small intestine, nonspecific localization of the antibody was found to occur in the form of aggregates; in most cases, these aggregates were removed by pre-filtration of the antibodies through a 0.45 µm pore Millipore filter. In a sample of breast tissue negative on nuclear fluorescence, generally small, not -specific immunofluorescence spots' distributed without special localizing characteristics in terms of cell morphology. The diameters of these very small, nonspecific precipitates were 0.5-0.1 µm, whereas the nucleolar diameters in the nuclei and nucleoli were 4-6 µm.
v Voorbeeld IVv Example IV
Fluorescentie-tijdens fasen van de celcyclus: De nucïeolaire fluorescentie werd gemakkelijk zichtbaar gemaakt bij de nucleoli in-interfase. In de metafase werd de nucïeolaire fluorescentie niet waargenomen als duidelijke 25 eenheid, maar 'was deze zichtbaar tussen de chromosomen en in de verbindingsgebieden tussen de "kernen" en het cytoplasma. Aangezien de nucleolus tijdens de metafase grotendeels verdwijnt en de synthese van rRNA in de late profase ophoudt, was het verrassend, dat de nucïeolaire fluorescentie niet als een duidelijke eenheid in dergelijke cellen zichtbaar was (Tan en Lerner, 1972).Fluorescence-during cell cycle phases: Nuclear fluorescence was easily visualized at the nucleoli in-interphase. In the metaphase, nucleolar fluorescence was not observed as a clear unit, but was visible between the chromosomes and in the junction regions between the "nuclei" and the cytoplasm. Since the nucleolus largely disappears during the metaphase and the synthesis of rRNA in late prophase ceases, it was surprising that the nucleolar fluorescence was not visible as a distinct unit in such cells (Tan and Lerner, 1972).
30 De vondst dat resten van de immunofluorescentieprodukten tijdens de mitosis blijven bestaan wijst er echter op, dat de nucïeolaire sub-structuren (i.p.v. de nucïeolaire produkten) de antigenen bevatten, die epigenetisch blijven bestaan.However, the finding that residues of the immunofluorescence products persist during mitosis indicates that the nucleolar sub-structures (instead of the nuclearolar products) contain the antigens that persist epigenetically.
Voorbeeld VExample V
35 Kwaadaardige gezwellen, negatieven: In de reeks kwaadaardige gezwellen werden over alle glaasjes in wisselende mate negatieve gebieden gevonden.35 Malignant growths, negatives: In the series of malignant growths negative areas were found to varying degrees across all slides.
In het algemeen correleerden deze met necrotische of door abcessen aangetaste delen van de neoplasmen. In een monster van een hersentumor was de massa, die geen positieve fluorescentie vertoonde,necrotisch; vele leukocyten 8007128 « - 16 - t waren aanwezig, maar er was geen bepaalde structuur. Een adenocarcinoom, dat metastasen in de hersens gaf, vertoonde geen positieve fluorescentie; de redenen daarvoor waren niet duidelijk. Aangezien 61 van de onderzochte 63 tumoren een positieve nucleolaire fluorescentie vertoonden, was 97 % 5 van de onderzochte reeks positief. Deze onderzoeken zijn nu verder verruimd tot meer dan 300 menselijke kankermonsters, waaronder een reeks kankergezwellen van de borst, de prostaat, de long en hematologische tumoren, alles met sterk overeenkomstige resultaten.In general, these correlated with necrotic or abscess-affected parts of the neoplasms. In a brain tumor sample, the mass, which showed no positive fluorescence, was necrotic; many leukocytes 8007128 -16-t were present, but there was no particular structure. An adenocarcinoma, which gave brain metastases, showed no positive fluorescence; the reasons for this were not clear. Since 61 of the 63 tumors examined showed positive nucleolar fluorescence, 97% 5 of the series tested were positive. These studies have now expanded to more than 300 human cancer samples, including a range of cancerous growths of the breast, prostate, lung and hematological tumors, all with very similar results.
Voorbeeld VIExample VI
10 Merken; Direkte immunochemische methoden voor het aantonen van de antilichamen zijn bijv. het merken van het primaire antilichaam met een of meer van de volgende merkstoffen: een radio-isotoop voor autoradiografie, bijv.10 Brands; For example, direct immunochemical methods of detecting the antibodies include labeling the primary antibody with one or more of the following markers: a radioisotope for autoradiography, e.g.
125 131 14 3 - X, .1, C, of H; een fluorescerende kleurstof, bijv.fluoresceien of tetramethylrodamine voor fluorescentiemicroscopie; een enzym, dat een 15 fluorescerend of gekleurd produkt geeft voor detectering door fluorescentie of lichtmicroscopie of dat een produkt met grote elektronendichtheid geeft, zodat het aangetoond kan worden door elektronenmicroscopie; of een molecuul met grote elektronendichtheid, bijv. ferritine, voor direkt zichtbaar maken met elketronenmicroscopie.125 131 14 3 - X, .1, C, or H; a fluorescent dye, e.g. fluoresceins or tetramethylrodamine for fluorescence microscopy; an enzyme which gives a fluorescent or colored product for detection by fluorescence or light microscopy or which gives a product of high electron density so that it can be detected by electron microscopy; or a molecule of high electron density, e.g., ferritin, for direct visualization by electron microscopy.
20 Als indirekte immunochemische methoden zijn te noemen het merken van het tweede antilichaam of een ander bindingseiwit, dat specifiek is voor het eerste antilichaam, met een fluorescerende kleurstof, met een verbinding met grote elektronendichtheid, met een enzym, dat een produkt geeft, dat detecteerbaar is door licht, fluorescentie of elektrönenmicros-25 copisch onderzoek of een radio-isotoop, dat detecteerbaar is door autoradiografie.Indirect immunochemical methods include labeling the second antibody or other binding protein, which is specific for the first antibody, with a fluorescent dye, with a high electron density compound, with an enzyme, which gives a product detectable is by light, fluorescence or electron micros-25 microscopic examination or a radioisotope detectable by autoradiography.
Als indirekte immunochemische methoden voor het zichtbaar maken van de antilichamen zijn te noemen toepassing van hybride primaire of secundaire antilichamen of antilichaamfragmenten (F (eb') 2)/ waarin een deel van 30 het hybride antilichaampreparaat specifiek is voor de nucleolaire antigenen (hybride primair antilichaam) of voor het primaire antilichaam (hybride secundair antilichaam) en een deel specifiek is voor een merkstof, bijv. die welke in de bovenstaande alineas genoemd zijn.As indirect immunochemical methods for the visualization of the antibodies, use can be made of hybrid primary or secondary antibodies or antibody fragments (F (eb ') 2) / in which part of the hybrid antibody preparation is specific for the nucleolar antigens (hybrid primary antibody ) or for the primary antibody (hybrid secondary antibody) and a portion is specific for a label, e.g., those mentioned in the above paragraphs.
Gemerkte al dan niet geconjugeerde antilichamen kunnen af-35 zonderlijk verpakt worden in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of andere gebufferde suspendeermiddelen voor distributie als diagnostische uitrustingen. Als geschikte suspendeermiddelen zijn te noemen glycerol, heparine en saccharose. Als geschikte buffers zijn te noemen barbitalbuffers, 8007128 . - · * · = ' · - 17 - morfolinefauffers, MOPS[3-(N-morfolino)propaansulfonzuur], hepes[N-2-hydroxy-ethylpiperazine N-2-ethaansulfonzuur], Tris-carbonaat e.d.Labeled conjugated or unconjugated antibodies can be individually packaged in phosphate buffered saline (PBS) or other buffered suspending agents for distribution as diagnostic kits. Glycerol, heparin and sucrose can be mentioned as suitable suspending agents. Barbital buffers, 8007128, can be mentioned as suitable buffers. Morpholine drivers, MOPS [3- (N-morpholino) propanesulfonic acid], Hepes [N-2-hydroxyethylpiperazine N-2-ethanesulfonic acid], Tris carbonate and the like.
* Λ \ r% 8007128* Λ \ r% 8007128
Claims (29)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CA343088 | 1980-01-04 | ||
CA000343088A CA1157373A (en) | 1980-01-04 | 1980-01-04 | Detection of human cancer cells with antibodies to human cancer nucleolar antigen(s) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NL8007128A true NL8007128A (en) | 1981-08-03 |
Family
ID=4115973
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NL8007128A NL8007128A (en) | 1980-01-04 | 1980-12-31 | DETECTION OF HUMAN CANCER CELLS WITH ANTIBODIES FOR ANTIGENS FROM THE NUCLEOLI OF HUMAN CANCER CELLS. |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS56101553A (en) |
KR (1) | KR850001770B1 (en) |
AR (1) | AR232046A1 (en) |
AT (1) | AT373397B (en) |
AU (1) | AU535024B2 (en) |
BE (1) | BE886935A (en) |
CA (1) | CA1157373A (en) |
CH (1) | CH659328A5 (en) |
DE (1) | DE3047654A1 (en) |
DK (1) | DK554980A (en) |
ES (2) | ES498305A0 (en) |
FI (1) | FI810007L (en) |
FR (1) | FR2484650B1 (en) |
GB (1) | GB2067286B (en) |
GR (1) | GR72850B (en) |
IE (1) | IE50760B1 (en) |
IL (1) | IL61641A (en) |
IT (1) | IT1172216B (en) |
LU (1) | LU83015A1 (en) |
NL (1) | NL8007128A (en) |
NO (2) | NO803910L (en) |
NZ (1) | NZ195756A (en) |
OA (1) | OA06713A (en) |
PH (5) | PH18765A (en) |
PT (1) | PT72301B (en) |
SE (1) | SE450665B (en) |
ZA (1) | ZA807754B (en) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4487830A (en) * | 1982-05-14 | 1984-12-11 | American Hoechst Corporation | Enzyme/immunofluorescent assay for autoantibodies |
JPS5990052A (en) * | 1982-11-16 | 1984-05-24 | Katsu Taniguchi | Melanoma diagnosis medicine using monoclonal specific antibody |
US4871661A (en) * | 1983-11-23 | 1989-10-03 | The Ohio State University Research Foundation | Process for testing the carcinogenicity of a material or the presence of cancer-inducing factors in an environment |
US4746539A (en) * | 1983-11-23 | 1988-05-24 | The Ohio State University Research Foundation | Purification of cancer-associated protein and preparation of antibody thereto |
EP0145373B1 (en) * | 1983-11-23 | 1992-03-25 | The Ohio State University Research Foundation | Purification of cancer-associated protein and preparation of antibody thereto |
US4645737A (en) * | 1984-03-05 | 1987-02-24 | American Hoechst Corporation | Enzyme/immunofluorescent assay for anti-treponemal antibodies |
US4607008A (en) * | 1984-03-05 | 1986-08-19 | American Hoechst Corporation | Enzyme/immunofluorescent assay for anti-Epstein-Barr Virus antibodies |
ATE76509T1 (en) * | 1984-05-02 | 1992-06-15 | Univ Research Corp | IMMUNOLOGICAL TEST PROCEDURE OF A PROCOAGULATING ENZYME FOR THE DETECTION OF CANCER. |
US4616658A (en) * | 1985-02-27 | 1986-10-14 | William Shell | Non-radioactively labeled microspheres and use of same to measure blood flow |
US4798719A (en) * | 1986-09-11 | 1989-01-17 | University Of Pittsburgh | Method for selection of antigens suitable as in vivo targets for antibodies |
US5019368A (en) * | 1989-02-23 | 1991-05-28 | Cancer Biologics, Inc. | Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy |
US4861581A (en) * | 1986-12-05 | 1989-08-29 | Cancer Biologics, Inc. | Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy |
CA2023030A1 (en) * | 1990-07-13 | 1992-01-14 | Robert R. Guerrero | In vitro method and probe for detecting the presence of the ring shaped particle and malignancy in humans and animals |
-
1980
- 1980-01-04 CA CA000343088A patent/CA1157373A/en not_active Expired
- 1980-12-04 AU AU65070/80A patent/AU535024B2/en not_active Ceased
- 1980-12-04 IE IE2533/80A patent/IE50760B1/en unknown
- 1980-12-04 NZ NZ195756A patent/NZ195756A/en unknown
- 1980-12-05 IL IL61641A patent/IL61641A/en unknown
- 1980-12-10 ZA ZA00807754A patent/ZA807754B/en unknown
- 1980-12-15 PH PH24978A patent/PH18765A/en unknown
- 1980-12-17 DE DE19803047654 patent/DE3047654A1/en active Granted
- 1980-12-18 LU LU83015A patent/LU83015A1/en unknown
- 1980-12-22 NO NO803910A patent/NO803910L/en unknown
- 1980-12-22 AR AR283753A patent/AR232046A1/en active
- 1980-12-27 JP JP18948880A patent/JPS56101553A/en active Pending
- 1980-12-29 DK DK554980A patent/DK554980A/en not_active Application Discontinuation
- 1980-12-30 KR KR1019800005026A patent/KR850001770B1/en active
- 1980-12-30 CH CH9652/80A patent/CH659328A5/en not_active IP Right Cessation
- 1980-12-31 PT PT72301A patent/PT72301B/en unknown
- 1980-12-31 NL NL8007128A patent/NL8007128A/en not_active Application Discontinuation
- 1980-12-31 BE BE0/203378A patent/BE886935A/en not_active IP Right Cessation
- 1980-12-31 GB GB8041638A patent/GB2067286B/en not_active Expired
-
1981
- 1981-01-02 FR FR8100014A patent/FR2484650B1/en not_active Expired
- 1981-01-02 FI FI810007A patent/FI810007L/en not_active Application Discontinuation
- 1981-01-02 ES ES498305A patent/ES498305A0/en active Granted
- 1981-01-02 SE SE8100011A patent/SE450665B/en not_active IP Right Cessation
- 1981-01-05 AT AT0001081A patent/AT373397B/en not_active IP Right Cessation
- 1981-01-05 GR GR63789A patent/GR72850B/el unknown
- 1981-01-05 IT IT67001/81A patent/IT1172216B/en active
- 1981-01-05 OA OA57289A patent/OA06713A/en unknown
-
1982
- 1982-02-01 ES ES509239A patent/ES8307377A1/en not_active Expired
-
1983
- 1983-02-21 PH PH28548A patent/PH18624A/en unknown
- 1983-02-21 PH PH28550A patent/PH18129A/en unknown
- 1983-02-21 PH PH28549A patent/PH18636A/en unknown
- 1983-02-21 PH PH28547A patent/PH18637A/en unknown
-
1985
- 1985-01-02 NO NO850005A patent/NO850005L/en unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gitlin et al. | Localization of C‐reactive protein in synovium of patients with rheumatoid arthritis | |
Zabriskie et al. | An immunological relationship between the group A streptococcus and mammalian muscle | |
Gabbiani et al. | Human smooth muscle autoantibody: Its identification as antiactin antibody and a study of its binding to “nonmuscular” cells | |
US4628027A (en) | Vitro diagnostic methods using monoclonal antibodies against connective tissue proteins | |
Bhattacharya et al. | Immunologic studies of human serous cystadenocarcinoma of ovary. Demonstration of tumor‐associated antigens | |
Busch et al. | A nucleolar antigen found in a broad range of human malignant tumor specimens | |
NL8007128A (en) | DETECTION OF HUMAN CANCER CELLS WITH ANTIBODIES FOR ANTIGENS FROM THE NUCLEOLI OF HUMAN CANCER CELLS. | |
EP0067642A1 (en) | Detection of malignant tumor cells | |
US4448890A (en) | Detection of human cancer cells with antibodies to human cancer nucleolar antigens | |
Hollinshead et al. | Reactivity between herpesvirus type 2-related soluble cervical tumor cell membrane antigens and matched cancer and control sera | |
Habel et al. | Immunological evidence on the role of the lymphocyte in antibody formation | |
US4624932A (en) | Recognins and their chemoreciprocals | |
Cooper et al. | Loss of strain specificity of the TA3-St subline: evidence for the role of epiglycanin in mouse allogeneic tumor growth | |
EP0007214A1 (en) | Product for detecting the presence of cancerous or malignant tumor cells | |
Charney et al. | Demonstration, purification, and partial characterization of abnormal (HSL) antigens in stable human cell lines | |
US4794077A (en) | Detection of human cancer cells with anitbodies to human cancer nucleolar antigen p145 | |
Sulitzeanu | Antigenic components of rat connective tissue. | |
US4840915A (en) | Method for diagnosing malignant tumors | |
Misra | Glomerular basement membrane antigens of Masugi nephritis | |
Korngold et al. | The antigens of human leukocytes. II. The specificity of leukocyte antigens | |
Duhl et al. | Tumor-associated chromatin antigens of human colon adenocarcinoma cell lines HT-29 and LoVo | |
US4976957A (en) | Process for the production of recognins and their chemoreciprocals | |
CA1172165A (en) | Detection of human cancer cells with antibodies to human cancer nucleolar antegen(s) | |
Howell et al. | Characterization of a novel human corneal endothelial antigen. | |
BARNHART | Immunologic techniques |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
BV | The patent application has lapsed |