NL8005703A - GLUCAGON FRAGMENT AND ITS APPLICATION. - Google Patents

Description

t - VO 1101t - VO 1101

Titel: Glucagonfragment en zijn toepassing.Title: Glucagon fragment and its application.

De uitvinding "betreft een glucagonfragment met de formule H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Fhe-V al-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Oïï (1) een geconjugeerde vorm van dit glucagonfragment en eiwit, alsmede een werkwijze voor het "bereiden van een specifiek antilichaam onder toes''* passing van deze geconjugeerde vorm.The invention "relates to a glucagon fragment of the formula H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Fhe-V al-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Oïï (1) a conjugated form of this glucagon fragment and protein, as well as a method of "preparing a specific antibody using this conjugated form.

Glucagon is een hormoon, dat invloed heeft op de koolhydraat-stafwisseling, en "bestaat als "bekend uit een 1-29 peptide van de pancreas met de formule 1; 2 3 h 5 6 10 H - His - Ser - C-ln - Gly - Thr - Phe - T 8 9 10 11 12 13Glucagon is a hormone that influences carbohydrate metabolism and is "known as" a pancreatic 1-29 peptide of the formula 1; 2 3 h 5 6 10 H - His - Ser - C-ln - Gly - Thr - Phe - T 8 9 10 11 12 13

Thr - Ser - Asp - Tyr - Ser - Lys - Tyr -Ik 15 16 17 18 19 20Thr - Ser - Asp - Tyr - Ser - Lys - Tyr -I 15 16 17 18 19 20

Leu - Asp - Ser - Arg - Arg - Ala - Gin 21 22 23 2k 25 26 27Leu - Asp - Ser - Arg - Arg - Ala - Gin 21 22 23 2k 25 26 27

Asp - Phe - Val - Gin - Tip - Leu - Met -28 29Asp - Phe - Val - Gin - Tip - Leu - Met -28 29

Asn - Thr - OH (2) (hieronder aangeduid als glucagon (1-29)); de "bloedspiegelbepaling hiervan is zeer "belangrijk voor clinische proeven.Asn - Thr - OH (2) (referred to below as glucagon (1-29)); the "blood level determination of this is very" important for clinical trials.

Radioimmunoproef-, fluorescerende immunoproef-, enzymimmunoproef-20 en dergelijke analysemethoden, gebaseerd op immunogene reacties zijn belangrijke analysemethoden gebleken voor het bepalen van sporehoeveel-heden glucagon, maar hiervoor is een specifiek antilichaam een essentiële voorwaarde.Radioimmunoassay, fluorescent immunoassay, enzyme immunoassay, and the like analytical methods based on immunogenic reactions have been found to be important analytical methods for determining trace amounts of glucagon, but a specific antibody is an essential prerequisite for this.

Specifieke antilichamen voor glucagon kunnen evenwel alleen 25 incidenteel worden verkregen door toepassing van een combinatie van glucagon (1-29) als hapteen en runderserumalbumine (BSA), terwijl een goede reproduceerbaarheid daarvan niet mag worden verwacht.However, specific antibodies to glucagon can only be occasionally obtained by using a combination of glucagon (1-29) as hapten and bovine serum albumin (BSA), while good reproducibility thereof should not be expected.

Voorts bestaan er enkele voorbeelden van een produktie van dit soort antilichamen onder toepassing van een combinatie van een hapteen, 30 zoals een fragment van glucagon (l-29), b.v. het glucagonfragment bestaande uit peptide (18-29) in glucagon, het glucagonfragment bestaande uit peptide (19-29) in glucagon (hieronder aangeduid als glucagon (19-29)s zie de Japanse octrooipublicatie 53-99320) of glucagonfragment bestaande uit peptide(15-29) in glucagon (zie de Japanse octrooipu-35 blicatie 5^-2^868), met BSA.Furthermore, there are some examples of production of this type of antibodies using a combination of a hapten, such as a fragment of glucagon (1-29), e.g. the glucagon fragment consisting of peptide (18-29) in glucagon, the glucagon fragment consisting of peptide (19-29) in glucagon (hereinafter referred to as glucagon (19-29) s see Japanese patent publication 53-99320) or glucagon fragment consisting of peptide ( 15-29) in glucagon (see Japanese patent publication 5 ^ -2 ^ 868), with BSA.

8005703 Η ' -2-8005703 Η '-2-

De mogelijkheid, een effectief antilichaam te verkrijgen voor een proef gebaseerd op een imrmnoreactie van glucagon (1-29) is nu nader bestudeerd en daarbij verd gevonden, dat een combinatie van proteïne en een nieuw glucagcnfragment, bestaande uit peptide (16-29) in glucagon 5 effectief deze antilichamen produceerde, welke antilichamen gunstig reageren met gemerkt glucagon (1-29) en diverse gemerkte glucagonfrag-menten bij immunoreacties. . .The possibility of obtaining an effective antibody for a test based on an immunoreaction of glucagon (1-29) has now been further investigated and it has been found that a combination of protein and a novel glucose fragment consisting of peptide (16-29) glucagon 5 effectively produced these antibodies, which antibodies react favorably with labeled glucagon (1-29) and various labeled glucagon fragments in immunoreactions. . .

De uitvinding betreft derhalve een glucagonfragment bestaande uit een peptide met de formule on 16 10 H-Ser-Arg-Arg-Ma-Gln-Asp-Fhe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH (l) (hieronder aangeduid als glucagonfragment (16-29))·The invention therefore relates to a glucagon fragment consisting of a peptide of the formula on 16 10 H-Ser-Arg-Arg-Ma-Gln-Asp-Fhe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH (1) (referred to below as glucagon fragment (16-29))

Voorts betreft de uitvinding een combinatie van glucagon (16-29) met proteïne. Daarnaast betreft de uitvinding een werkwijze voor het bereiden van een specifiek antilichaam onder toepassing van de canbi-15 natie (l6-29) met eiwit.The invention further relates to a combination of glucagon (16-29) with protein. In addition, the invention relates to a method of preparing a specific antibody using the cannbination (16-29) protein.

De synthese van glucagon (16-29) volgens de uitvinding kan als volgt worden uitgevoerd: Een aminozuur en/of peptide wordt door condensatie in de volgorde van de aminozuurvolgorde van formule 1 omgezet en de schermgroep voor de reactieve greep als laatste trap van de reac-20 tie vrijgesteld. Deze condensatiereactie kan worden uitgevoerd volgens een gebruikelijke peptidesynthese onder herhaling van de aanhechting en verwijdering van de schermgroepen en condensatie. De schermgroepen voor de synthese van de uitgangsmaterialen of tussenprodukten zijn de gebruikelijke schermgroepen voor peptidesynthesen en deze kunnen ge-25 makkelijk door hydrolyse, een zure ontleding, reductie, aminolyse of hydrazinolyse worden verwijderd.The synthesis of glucagon (16-29) according to the invention can be performed as follows: An amino acid and / or peptide is converted by condensation in the amino acid sequence of formula 1 and the reactive grip screen group as the last step of the reaction. -20 tie exempt. This condensation reaction can be carried out according to a conventional peptide synthesis with repetition of the attachment and removal of the protecting groups and condensation. The screen groups for the synthesis of the starting materials or intermediates are the usual screen groups for peptide syntheses and can easily be removed by hydrolysis, an acid decomposition, reduction, aminolysis or hydrazinolysis.

B.v. kan de ot -aminogroep gebruikelijk worden beschermd door een benzyloxycarbonylgroep, zoals benzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyl-oxycarbonyl of p-methaxybenzyloocycarbonyl, danwel een alifatische oxy-30 carbonylgroep, zoals t-amyloxycarbonyl of t-butoxycarbonyl.E.g. the α-amino group can usually be protected by a benzyloxycarbonyl group, such as benzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyl-oxycarbonyl or p-methaxybenzyloocycarbonyl, or an aliphatic oxy-carbonyl group, such as t-amyloxycarbonyl or t-butoxycarbonyl.

De carboxylgroep kan door verestering worden beschermd. De es-tergroep wordt gesubstitueerd met een alkanol, zoals methanol of ethanol, danwel een ar alkanol, zoals benzylalcohol, p-nitrobenzylalcohol, p-methcxybenzylalcohol of dichloorbenzylalcohol.The carboxyl group can be protected by esterification. The ester group is substituted with an alkanol, such as methanol or ethanol, or an ar alkanol, such as benzyl alcohol, p-nitrobenzyl alcohol, p-methylbenzyl alcohol or dichlorobenzyl alcohol.

35 De hydroxylgroep van serine en threonine kan desgewenst door 8005703 *·«. r-* -3- veresteren of veretheren worden bescheimd. Een esterschermgroep is ben-zyloxycarbonyl; een ethers chermgroep is de benzylgroep.The hydroxyl group of serine and threonine may optionally be 8005703 *. r- * -3- esterification or etherification are protected by foaming. An ester screen group is benzyl oxycarbonyl; an ethers group is the benzyl group.

De aminogroep in de guanidinogroep van arginine wordt beschermd door tosyl of een benzyloxyearbonylgroep. Het is echter niet altijd nood-5 zakelijk de guanidinegroep te beschermen.The amino group in the guanidino group of arginine is protected by tosyl or a benzyloxyearbonyl group. However, it is not always necessary to protect the guanidine group.

Ha de laatste trap van de condensaties worden de schermgroepen bij voorkeur door een zure ontleding, met name door waterstoffluoride in een trap verwijderd. Daarcm worden de reactieve zijketengroepen van serine, arginine, asparaginezuur of threonine bij voorkeur be-10 schermd door een schermgroep die gemakkelijk kan worden verwijderd met waterstoffluoride.After the last stage of the condensations, the protecting groups are preferably removed by an acidic decomposition, in particular by hydrogen fluoride in one stage. Therefore, the reactive side chain groups of serine, arginine, aspartic acid or threonine are preferably protected by a protecting group which can be easily removed with hydrogen fluoride.

B.v. wordt de hydroxylgroep van serine en threonine beschermd door een benzylgroep; de aminogroep van de guard dinogroep in arginine door een tosylgroep en de zijketencarbcxylgrcep van asparaginezuur 15 door een benzylester.E.g. the hydroxyl group of serine and threonine is protected by a benzyl group; the amino group of the guard dino group in arginine by a tosyl group and the side chain carbyl group of aspartic acid 15 by a benzyl ester.

Andere d -aminogroepen en carboxylgroepen worden beschermd door een schermgroep, die kan worden verwijderd onder voorwaarden, waarbij de schermgroep van de zijketen niet verdwijnt. B.v. wordt de <J. -aminogroep bij voorkeur beschermd door t .butoxycarbonyl of t.amyloxycarbonyl, 20 welke groepen gemakkelijk met trifluorazijnzuur kunnen worden verwijderd, danwel door benzyloxycarbonyl, welke groep gemakkelijk door een katalytische reductie kan verdwijnen. Carboxylgroepen worden beschermd in de vorm van methyl- of ethylesters, die kunnen worden gesplitst door verdunde natronloog, terwijl de carboxylgroep bij het C-uiteinde wordt 25 beschermd als benzylester, welke met watervrij waterst of fluoride kan worden gesplitst.Other d-amino groups and carboxyl groups are protected by a protecting group, which can be removed under conditions, whereby the protecting group from the side chain does not disappear. E.g. becomes the <J. -amino group preferably protected by t-butoxycarbonyl or t-amyloxycarbonyl, which groups can be easily removed with trifluoroacetic acid, or by benzyloxycarbonyl, which group can easily disappear by catalytic reduction. Carboxyl groups are protected in the form of methyl or ethyl esters, which can be cleaved by dilute caustic soda, while the carboxyl group at the C-terminus is protected as benzyl ester, which can be cleaved with anhydrous water or fluoride.

De condensatie van de aminozuren en/of peptiden wordt als volgt uitgevoerd. B.v. wordt een aminozuur of peptide met een beschermde O"-aminogroep en een geactiveerde eindstandige carboxylgroep angezet 30 met een aminozuur of peptide met een vrije <K-aminogroep en een beschermde eindstandige carboxylgroep. Anderzijds wordt een aminozuur of peptide met de geactiveerde -aminogroep en een beschermde eindstandige carboxylgroep omgezet met een aminozuur of peptide met een vrije eindstandige carboxylgroep en een beschermde é -aminogroep.The condensation of the amino acids and / or peptides is carried out as follows. E.g. an amino acid or peptide having a protected O "amino group and an activated terminal carboxyl group is reacted with an amino acid or peptide having a free <K-amino group and a protected terminal carboxyl group. On the other hand, an amino acid or peptide having the activated amino group and a protected terminal carboxyl group reacted with an amino acid or peptide having a free terminal carboxyl group and a protected ε-amino group.

35 De carboxylgroep kan b.v. worden geactiveerd door omzetting in het 8005703 * -ll·- zuur-azide, 'een zuur-anhydride, een zuur-imidazolide, -isoxazolide of een actieve ester, danwel door een reactie met carbodiïmideof N,N’-carbonyldiïmidazool.The carboxyl group can e.g. are activated by conversion into the 8005703 * -11 · acid azide, an acid anhydride, an acid imidazolide, isoxazolid or an active ester, or by reaction with carbodiimide or N, N "carbonyldiimidazole.

Bij voorkeur wordt de condensatiereactie uitgevoerd met carbo-5 diïmide, met een azide of volgens de actieve estermethode. Bij de condensatiereactie moet racemisatie zorgvuldig worden vermeden en voorkeursmethoden daarvoor zijn de azide-, de actieve estermethode onder.toepassing van een succinimideëster of p-nitrofenylester, de Wunschmethode (Z. Haturforsch., 21$, ^26 (1966)) of de Geigermethode (Chem. Ber., 103, 10 788 (1970)), in het bijzonder de gemodificeerde Geigermethode onder toepassing van N-ethyl, N*-3-dimethylaminopropyl-carbodiImide als conden-satiemiddel.Preferably, the condensation reaction is carried out with carbo-5 diimide, with an azide or according to the active ester method. In the condensation reaction, racemization should be carefully avoided, and preferred methods thereof are the azide, the active ester method using a succinimide ester or p-nitrophenyl ester, the Wunsch method (Z. Haturforsch., $ 21, (266)) or the Geiger method (Chem. Ber., 103, 10 788 (1970)), in particular the modified Geiger method using N-ethyl, N * -3-dimethylaminopropyl-carbodiimide as a condensing agent.

Aldus wordt het beschermde peptide 1 verkregen. De schermgroepen worden bij voorkeur door een zure ontleding afgesplitst, liefst in een 15 trap met waterstoffluoride, waarna uiteindelijk het produkt 1 wordt verkregen.Thus, the protected peptide 1 is obtained. The protecting groups are preferably split off by an acidic decomposition, preferably in a stage with hydrogen fluoride, after which the product 1 is finally obtained.

Het peptide 1 kan worden gezuiverd door kolamchramatografie onder toepassing van een carrier.The peptide 1 can be purified by column chromatography using a carrier.

Het glucagon (16-29) volgens de uitvinding wordt gebonden aan een 20 proteïne, waardoor een conjugaat ontstaat, dat een antilichaam kan doen produceren. Voorbeelden van gebruikelijke proteïnen zijn BSA of een modificatie daarvan, waarbij de inwendige moleculaire disulfidegroep met alkali of natriumlaurylsulfaat en een mercaptoëthanolbehandeling is gesplitst.The glucagon (16-29) of the invention is bound to a protein to form a conjugate capable of producing an antibody. Examples of common proteins are BSA or a modification thereof, where the internal molecular disulfide group is split with alkali or sodium lauryl sulfate and a mercaptoethanol treatment.

25 Voorbeelden van een conjugateereagens voor glucagon en proteïne zijn polyfunctionele conjugateere agentia, zoals glutaraldehyde of 3-(2'-benzothiazolyl-dithio)-propionaat-succinimideëster (zie de Japanse octrooiaanvrage 53-85900). Deze polyfunctionele conjugatiereagentia worden geselecteerd op de functionele groep, die deelneemt bij het bin-30 den van het proteïne.Examples of a conjugating agent for glucagon and protein are polyfunctional conjugating agents, such as glutaraldehyde or 3- (2'-benzothiazolyl dithio) propionate succinimide ester (see Japanese patent application 53-85900). These polyfunctional conjugation reagents are selected for the functional group that participates in binding the protein.

De verhouding van glucagon (16-29) en proteïne, zoals BSA is er een, waarbij het glucagon (16-29) in een molovermaat wordt toegepast, liefst van ca. 10 mol glucagon (l6-29) per mol BSA. Bij de bindingsreac-tie wordt eerst de benodigde hoeveelheid glucagon (l6-29) in een waterig 35 medium met pH 7-8 gebracht waarna het polyfunctionele conjugatiereagens daaraan wordt toegevoegd. De reactie verloopt onder koelen of bij 8003703 -5- kamertemperatuur gedurende 1-¼ uren. Na zuivering door gelfiltratie wordt BSA toegevoegd en wederom bij kamertemperatuur gedurende 1-¼ uren omgezet. Het geconjugeerde produkt van glucagon (l6-29) en BSA wordt na zuivering, b.v. door gelfiltrerén en dialyse, verkregen en 5 indien nodig na lyofiliseren opgeslagen.The ratio of glucagon (16-29) and protein, such as BSA, is one in which the glucagon (16-29) is used in a molar excess, most preferably about 10 moles glucagon (16-29) per mole BSA. In the binding reaction, the required amount of glucagon (16-29) is first placed in an aqueous medium of pH 7-8, after which the polyfunctional conjugation reagent is added thereto. The reaction proceeds under cooling or at 8003703-5 room temperature for 1 ¼ hours. After purification by gel filtration, BSA is added and again reacted at room temperature for 1 ¼ hours. The conjugated product of glucagon (16-29) and BSA after purification, e.g. by gel filtration and dialysis, and stored if necessary after lyophilization.

De aldus verkregen geconjugeerde vorm van glucagon (16-29) en eiwit wordt aan zoogdieren, zoals konijnen, ratten, cavia's of muizen toegediend om ze te sensitiseren. B.v. wordt het geconjugeerde materiaal gesuspendeerd in Freund's compleet adjuvans en subcutaan geïnjecteerd 10 bij cavia's in een hoeveelheid van 30-70^ig glucagon (16-29) en wel h - 7 malen met tussenpozen van 2 weken. Een antiserum wordt hierna verkregen uit het bloed van de behandelde dieren volgens een gebruikelijke procedure, zoals bloedopvangen en centrifugeren. Het genoemde antiserum bevat een hoge concentratie aan het specifieke antilichaam 15 en kan worden opgeslagen in een vriesinrichting en daarna worden toegepast door het verdunnen van zekere porties. Het genoemde specifieke antilichaam wordt immunologisch niet alleen aan gemerkt glucagon(1-29) gebonden, maar ook aan diverse gemerkte glucagonfragmenten, zoals gluca-gonfragment (17-29); glucagonfragment (19-29)» en fragment (16-29) 20 Als hierboven uiteengezet is het glucagonfragment (16-29) vol gens de uitvinding bijzonder bruikbaar voor een antilichaamproduktie in de vorm van conjugatie van glucagon (16-29) on proteïne. Het aldus verkregen antilichaam heeft bijzonder goede specifieke bindingseigenschappen bij immun ore acties en deze immun ore actie wordt bij voorkeur 25 toegepast voor radioimmunoproeven, fluorescerende inmunoproeven en enzymimmunoproeven op glucagon (1-29) in vivo.The conjugated form of glucagon (16-29) and protein thus obtained is administered to mammals such as rabbits, rats, guinea pigs or mice to sensitize them. E.g. the conjugate material is suspended in Freund's complete adjuvant and injected subcutaneously into guinea pigs in an amount of 30-70 µg glucagon (16-29) at h - 7 times at 2 week intervals. An antiserum is then obtained from the blood of the treated animals by a conventional procedure such as blood collection and centrifugation. The said antiserum contains a high concentration of the specific antibody 15 and can be stored in a freezer and then used by diluting certain portions. Said specific antibody is immunologically bound not only to labeled glucagon (1-29), but also to various labeled glucagon fragments, such as glucagon fragment (17-29); glucagon fragment (19-29) and fragment (16-29) As set forth above, the glucagon fragment (16-29) of the invention is particularly useful for an antibody production in the form of conjugation of glucagon (16-29) on protein. The antibody thus obtained has particularly good specific binding properties in immunoreactions and this immunoreaction is preferably used for radioimmunoassays, fluorescent immunoassays and enzyme immunoassays on glucagon (1-29) in vivo.

Er is reeds vermeld in de Japanse octrooipublicatie 55-39702, dat het glucagonfragment (15-29) een activiteit heeft jegens eiwit. Maar in deze beschrijving zijn geen voorbeelden gegeven van 3C glucagon (16-29). Bovendien is glucagon (-6-29) volgens de uitvinding reactiever gebleken en meer specifiek vergeleken met het fragment (15-29) hetgeen waarschijnlijk wordt veroorzaakt door het N-eindstandige aminozuur serine van glucagon (16-29).It has already been reported in Japanese Patent Publication 55-39702 that the glucagon fragment (15-29) has an activity against protein. However, no examples of 3C glucagon (16-29) are given in this description. In addition, glucagon (-6-29) of the invention has been found to be more reactive and more specifically compared to the fragment (15-29) which is likely due to the N-terminal amino acid serine of glucagon (16-29).

De afkortingen in deze beschrijving betekenen het volgende: 35 Ser; L-serine Val; L-valine S 0 0 5 7 0 3 -6-The abbreviations in this description mean the following: 35 Ser; L-serine Val; L-valine S 0 0 5 7 0 3 -6-

Arg; L-arginine !Erp; L-tryptofanArg; L-arginine! Erp; L-tryptophan

Ala; L-alanine Leu; L-leucineAla; L-alanine Leu; L-leucine

Gin; L-glutamine Met; L-methionineGin; L-glutamine Met; L-methionine

Asp; L-asparaginezuur Asn; L-asparagine 5 Phe; L-fenylalanine Thr; L-threonine BOC; t-butoxycarbonyl OBzl; benzylester AOC; t-amyloxyc arbonyl OSU; H-hydroxysue cinimi deester Z; benzyloxycarbonyl OHP; p-nitrofenylesterAsp; L-aspartic acid Asn; L-asparagine 5 Phe; L-phenylalanine Thr; L-threonine BOC; t-butoxycarbonyl OBzl; benzyl ester AOC; t-amyloxyc arbonyl OSU; H-hydroxysue cinema ester Z; benzyloxycarbonyl OHP; p-nitrophenyl ester

Bzl; "benzyl TFA; trifluorazijnzuur 10 Tos; tosyl UMM; flf-methylmorfoline CMe; methylester Et^O; diëthylether THF; tetrahydrofuran IMF; dimethylformamide HOBT; 1-hydroxyhenzotriazool WSC; N-ethyl, N'-3-dimethylaminopropylcarbodiïmide 15 De volgende voorheelden lichten de uitvinding nader toe. In deze voorheelden werden de volgende drager en ontwikkelvloeistoffen hij de dunnelaagchrcmatografie (DLC) gebruikt.Bzl; "benzyl TFA; trifluoroacetic acid 10 Tos; tosyl UMM; flf-methylmorpholine CMe; methyl ester Et 2 O; diethyl ether THF; tetrahydrofuran IMF; dimethylformamide HOBT; 1-hydroxyhenzotriazole WSC; N-ethyl, N'-3-dimethylaminopropylcarbodiheides further illustrate the invention In these examples, the following carrier and developing fluids were used in thin layer chromatography (TLC).

(DLC) drager: Merck cellulose Art 5716.(DLC) support: Merck cellulose Art 5716.

2 0 ontwikkelaar: 1: hutanol - pyridine - azijnzuur - water (15 : 10 : 3 : 11) 2: de havenlaag van hutanol - pyridine - azijnzuur - water ( 10 : 3 : 0,1 : 11) 3: de hovenlaag van 25 hutanol - pyridine - azijnzuur - water (5 : 3 : o,l : 11) drager: Merck silicagel Art 5721. ontwikkelaar: 1;: chloroform - methanol - azijnzuur (95 · 5 : 3) 5. chloroform - methanol - azijnzuur (80 : 25 : 2) 30 6: chloroform - ethanol - ethylacetaat (5:2:5) 7: chloroform - methanol - azijnzuur (85 : 15 : 5)·2 0 developer: 1: hutanol - pyridine - acetic acid - water (15: 10: 3: 11) 2: the harbor layer of hutanol - pyridine - acetic acid - water (10: 3: 0.1: 11) 3: the top layer of 25 hutanol - pyridine - acetic acid - water (5: 3: o, 1:11) carrier: Merck silica gel Art 5721. developer: 1 :: chloroform - methanol - acetic acid (95 · 5: 3) 5. chloroform - methanol - acetic acid (80: 25: 2) 30 6: chloroform - ethanol - ethyl acetate (5: 2: 5) 7: chloroform - methanol - acetic acid (85: 15: 5)

Voorbeeld I:Example I:

Productie van H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH 35 (glucagon (16-29)): 8005703 ' ^ « -7-Production of H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH 35 (glucagon (16-29)): 8005703 '^ «-7-

O OO O

6 anr anisool, 0,9^ cm (10 mM ethaandithiol en 131 mg (l mm) ska-tol werd! toegevoegd aan 2,5 g (l mM) BOC-Ser (Bzl)-Arg (Tos )-Arg(Tos )-Ala-Gln-Asp(0Bzl )-Ehe-Val-6 anr anisole, 0.9 µcm (10 mM ethanedithiol and 131 mg (1 mm) ska-tol was added to 2.5 g (1 mM) BOC-Ser (Bzl) -Arg (Tos) -Arg (Tos ) -Ala-Gln-Asp (0Bzl) -Ehe-Val-

Gln-Trp-Leu-Met-Asn-llir (Bzi-1-0BZ1.Gln-Trp-Leu-Met-Asn-llir (Bzi-1-0BZ1.

•5 5 Dit mengsel werd toegevoegd aan 20 cm watervrij waterstoffluon- de en 1 uur hij 0°C geroerd; vervolgens werd het HF snel in vacuo afge-destilleerd. 100 cm diëthylether werd aan het residu toegevoegd cm het precipitant^te scheiden. Dit precipitant werd opgelost in 50-80$'s azijn-This mixture was added to 20 cm anhydrous hydrogen fluoride and stirred at 0 ° C for 1 hour; then the HF was quickly distilled off in vacuo. 100cm diethyl ether was added to the residue to separate the precipitant. This precipitant was dissolved in 50-80 $ vinegar-

OO

zuur (100 cm"5) en gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd ge- . · 3 10 vriesdroogd tot 1,22 g poeder. Dxt poeder werd opgelost m 150 cm 8 M waterig ureum en met ammonia op pH 9 gebracht. Deze oplossing werd aangebracht op een kolom ^ x 20 cm carboxymethylcellulose en geëquili-breerd met 8 M waterige ureum. Na 30 minuten werd de kolom met water uitgewassen om de ureum te verwijderen en geëlueerd met een continue concen-15 tratiegradiëntprocedure onder toepassing van 1 liter water, met azijnzuur op pH U,5 gebracht, tot een waterige 0,2 M ammoniumacetaatoplossing met pH h,5 (l liter). Vervolgens werd de kolom nog geëlueerd met 500 cm van een waterige 0,5 M ammoniumacetaatoplossing met pH ^,5 en uiteindelijk geëlueerd met een waterige 0,5 M ammoniumacetaatoplossing met pH 20 U,5 en daarin 8 M ureum ter fractionering van de actieve fracties II (buizen 80-110), III (buizen 120-170), Γ7 (buizen 171-230) en V (buizenacid (100 cm @ 5) and centrifuged. The supernatant was lyophilized to 1.22 g of powder. Dxt powder was dissolved with 150 cm @ 8 M aqueous urea and brought to pH 9 with ammonia. This solution was applied to a column of x 20 cm of carboxymethyl cellulose and equilibrated with 8 M aqueous urea After 30 minutes, the column was washed with water to remove the urea and eluted with a continuous concentration gradient procedure using 1 liter of water, with acetic acid is brought to pH U.5 to an aqueous 0.2 M ammonium acetate solution with pH h.5 (1 liter), the column is then eluted with 500 cm of an aqueous 0.5 M ammonium acetate solution with pH1.5 and finally eluted with an aqueous 0.5 M ammonium acetate solution of pH 20 U, 5 and containing 8 M urea to fractionate the active fractions II (tubes 80-110), III (tubes 120-170), Γ7 (tubes 171-230) and V (tubes

OO

231-290) in elk fracties van 7 cm , waarna' deze actieve fracties werden gev vriesdroogd.231-290) in 7 cm fractions each, after which these active fractions were lyophilized.

Het gedroogde poeder verkregen uit de actieve fractie V werd op-The dried powder obtained from the active fraction V was dissolved

O OO O

25 gelost in 50 cm 50$’s azijnzuur. Hieraan werd 2,5 cm thioglycolzuur toegevoegd en het geheel 21 uren bij U5°C bewaard. In deze oplossing werd 2k g ureum opgelost en het onoplosbare materiaal afgefiltreerd. Het filtraat werd aangebracht op een kolom van U,2 x 10k cm van Sephadex LH-20 en met 50$'s azijnzuur geëlueerd. De fracties uit de buizen25 dissolved in 50 cm of 50 $ acetic acid. To this was added 2.5 cm of thioglycolic acid and the whole was stored at U5 ° C for 21 hours. 2k g of urea was dissolved in this solution and the insoluble material was filtered off. The filtrate was applied to a column of U, 2 x 10k cm of Sephadex LH-20 and eluted with 50% acetic acid. The fractions from the tubes

QQ

30 62-79 elk van 7 cm , werden verzameld en gevriesdroogd tot 150 mg poeder.62-79 each of 7 cm, were collected and lyophilized to 150 mg powder.

PIC: BS 0,50; Sf2 0,3^.PIC: BS 0.50; Sf2 0.3 ^.

Het gelyofiliseerde poeder verkregen uit de actieve fractie IV werd opgelost in 20 car5 50$’s azijnzuur, hieraan 1 cm thioglycolzuur toegevoegd en dit geheel 21 uren bij ^5°C bewaard. In deze oplossing 35 werd 9»6 g ureum opgelost en het onoplosbare materiaal afgefiltreerd.The lyophilized powder obtained from the active fraction IV was dissolved in 20 ml of 50% acetic acid, 1 cm of thioglycolic acid was added thereto and the whole was stored for 21 hours at 5 ° C. In this solution 35 9 g of urea was dissolved and the insoluble material was filtered off.

8005703 % -8-8005703% -8-

Dit filtraat werd aangebracht op een kolom van 3,3 x 120 cm Sephadex LH- 20 en geëlueerd met 50#’s azijnzuur. De actieve fracties van de "buizen -5 32-37, elk van 7 cm , werden verzameld en gevriesdroogd tot 110 g poeder.This filtrate was applied to a 3.3 x 120 cm Sephadex LH-20 column and eluted with 50 # acetic acid. The active fractions from the tubes -5 32-37, each of 7 cm, were collected and lyophilized to 110 g of powder.

5 DLC: Rf1 * 0,50DLC: Rf1 * 0.50

Aminozuur analyse: Asp 2,03 (2), Thr 0,96 (l), Ser 0,87 (l),Amino acid analysis: Asp 2.03 (2), Thr 0.96 (l), Ser 0.87 (l),

Glu 2,07 (2), Ala 1,02 (l), Val 0,91 (l),*Glu 2.07 (2), Ala 1.02 (l), Val 0.91 (l), *

Met 0,95 (l), Leu 1, Ehe 0,95 (1),With 0.95 (l), Leu 1, Ehe 0.95 (1),

Arg 2,19 (2), Trp 1,0U (l).Arg 2.19 (2), Trp 1.0U (1).

10 De lyofilisaten verkregen uit de actieve fracties III en II werden behandeld en over een kolcm gechrcmatografeerd op dezelfde wijze als de actieve fractiesIV en wel tot 130 mg poeder (DLC: Rf1 * 0,50) uit de fracties van de buizen 31-36 voor de actieve fractie III en 50 mg poeder (DLC: Rf1 = 0,50) uit de buisfracties 39-*A voor de actieve 15 fractie II.The lyophilisates obtained from the active fractions III and II were treated and chromatographed on a column in the same manner as the active fractions IV, up to 130 mg powder (TLC: Rf1 * 0.50) from the fractions of tubes 31-36 for the active fraction III and 50 mg powder (TLC: Rf1 = 0.50) from the tube fractions 39- * A for the active fraction II.

Voorbeeld II:Example II:

Geconjugeerde vorm van glucagon (16-29) en BSA of gemodificeerd BSA: (1) De geconjugeerde vorm van glucagon (l6-29) en BSA: 20 15 mg glucagon 16-29 werd opgelost in 0,0001 N natronloog en op 3 3 pH 8,0 gebracht waardoor 20 cm oplossing werd verkregen. 1,5 cm waterig 25#’s glutaraldehyde werd aan deze oplossing toegevoegd en 2 uur bij kamertemperatuur daarmee omgezet. Het reactiemengsel werd vervolgens geleid door een kolom van 5 x 50 cm Sephadex G-15 en de gepasseerde frac-25 tie opgevangen; dit was een oplossing met daarin 11 mg derivaat van glutaraldehyde met omgezet de N-eindgroep van glucagon (16-29).Conjugated form of glucagon (16-29) and BSA or modified BSA: (1) The conjugated form of glucagon (16-29) and BSA: 20 15 mg glucagon 16-29 was dissolved in 0.0001 N sodium hydroxide solution and 3 adjusted to pH 8.0 to give 20 cm of solution. 1.5 cm of aqueous 25 # 's glutaraldehyde was added to this solution and reacted with it for 2 hours at room temperature. The reaction mixture was then passed through a 5 x 50 cm column of Sephadex G-15 and the passed fraction collected; this was a solution containing 11 mg of glutaraldehyde derivative with converted N-end group of glucagon (16-29).

k2 mg BSA (van Sigma Co.) werd aan deze vloeistof toegevoegd en 2 uren daarmee bij kamertemperatuur omgezet. Het verkregen reactiemengsel werd tegen gedestilleerd water gedialyseerd en het dialysaat ge-30 lyofiliseerd tot de geconjugeerde vorm van glucagon (16-29) met BSA (gebonden in een molverhouding BSA:glucagon in ca. 1:10). Opbrengst W3 mg.k2 mg BSA (from Sigma Co.) was added to this liquid and reacted with it at room temperature for 2 hours. The resulting reaction mixture was dialyzed against distilled water and the dialysate lyophilized to the conjugated form of glucagon (16-29) with BSA (bound in a BSA: glucagon molar ratio in about 1:10). Yield W3 mg.

(2) De geconjugeerde vorm van glucagon (16-29) met gemodificeerd BSA: 15 mg glucagon (16-29) werd cpgelost in 0,0001 N natriumhydroxyde 35 en als een 20 cm^ oplossing op pH 8 gebracht. Vervolgens werd 0,1# 3005703 -9- van een dimethylforaamideoplossing van 3-(2'-benzothiazolyl-dithio) propimaatsuccinimi deëster (1,575 cm^) toegevoegd en 1 uur tij 5°C daarmee angezet. Het verkregen reactiemengsel werd door een kolom van 5 x 50 cm Sephadex G-15 geleid, bevochtigd met een acetaatbuffer met pH 5 met 5 daarin dimethylf ormamide, en de gepasseerde fractie opgevangen. Dit was een oplossing met 11,5 mg derivaat, waarbij de Η-eindgroep van glucagon (16-29) een 3-(2'-benzothiazolyl-dithio)propionylgroep droeg. Deze_oplossing werd vervolgens op pH 7,0 gebracht en ^5 mg gemodificeerd BSA, tevoren behandeld met natriumlaurylsulfaat en mereaptoëthanol (een 10 nacht bij kamertemperatuur) daaraan toegevoegd, waarna men het geheel nog 1 uur bij kamertemperatuur liet reageren. Het verkregen reactiemengsel werd gedialyseerd tegen gedestilleerd water en gelyofiliseerd tot de geconjugeerde vorm van glucagon(16-29) met gemodificeerd BSA (bindings-verhouding gemodificeerd BSA: glucagon = ca. 1:10. Opbrengst: 52 mg.(2) The conjugated form of glucagon (16-29) with modified BSA: 15 mg glucagon (16-29) was dissolved in 0.0001 N sodium hydroxide and adjusted to pH 8 as a 20 ml solution. Then, 0.1 # 3005703-9 of a dimethylforamide solution of 3- (2'-benzothiazolyl-dithio) propimate succinimide ester (1.575 cm 2) was added and reacted therewith for 1 hour at 5 ° C. The resulting reaction mixture was passed through a 5 x 50 cm column of Sephadex G-15, wetted with a pH 5 acetate buffer containing 5-dimethylformamide and the passed fraction collected. This was a solution containing 11.5 mg of derivative, the Η-terminal group of glucagon (16-29) bearing a 3- (2'-benzothiazolyl-dithio) propionyl group. This solution was then adjusted to pH 7.0 and mg5 mg of modified BSA, previously treated with sodium lauryl sulfate and mereaptoethanol (overnight at room temperature) added thereto, and the whole was left to react for 1 hour at room temperature. The resulting reaction mixture was dialyzed against distilled water and lyophilized to the conjugated form of glucagon (16-29) with modified BSA (binding ratio of modified BSA: glucagon = about 1:10. Yield: 52 mg.

15 Het boven weergegeven glucagon (16-29) werd vervangen door glu cagon (IT-29), glucagon (19-29) en glucagon (l-29) (produkt van Sigma Co) en op dezelfde wijze behandeld tot de geconjugeerde vorm van BSA of gemodificeerd BSA met glucagon (17-29), glucagon (19-29) of glucagon (1-29) was verkregen.The glucagon (16-29) shown above was replaced with glucagon (IT-29), glucagon (19-29) and glucagon (1-29) (product of Sigma Co) and treated in the same manner to the conjugated form of BSA or modified BSA with glucagon (17-29), glucagon (19-29) or glucagon (1-29) was obtained.

20 Voorbeeld III: I. Antiliehaampr odukt i e onder toepassing van een conjugaat van glucagon (16-29) en BSA: (1) De geconjugeerde vorm van glucagon (16-29) en BSA (l mg) met daarinExample III: I. Antibody product using a conjugate of glucagon (16-29) and BSA: (1) The conjugated form of glucagon (16-29) and BSA (1 mg) containing

OO

2k8 /ag glucagon (l6-29) werd opgelost in 1,0 cm 10 mM fosfaatbuffer 3 25 met pH 7,2 met daarin 0,15 M HaCl. 1,0 cm Freund's compleet adjuvans werd hieraan toegevoegd en het geheel goed gemengd tot een emulsie.2k8 / ag glucagon (16-29) was dissolved in 1.0 cm 10 mM phosphate buffer 3, pH 7.2 containing 0.15 M HaCl. 1.0 cm Freund's complete adjuvant was added to this and the whole mixed well into an emulsion.

0,5 cm van deze emulsie werd geïnjecteerd in de huid van de vinger en diverse subcutane delen van de rug van een cavia. Dezelfde hoeveelheid emulsie werd subcutaan zesmaal geïnjecteerd met tussenpozen 30 van 2 weken. 10 dagen na de laatste injectie werd al het bloed opgevangen en dit liet men 60 minuten coaguleren. Een antiglucagon (16-29)-serum werd verkregen door 10 minuten bij 3000 tpa te centrifugeren.0.5 cm of this emulsion was injected into the skin of the finger and various subcutaneous parts of the back of a guinea pig. The same amount of emulsion was injected subcutaneously six times at 2-week intervals. All the blood was collected 10 days after the last injection and allowed to coagulate for 60 minutes. An anti-glucagon (16-29) serum was obtained by centrifugation at 3000 tpa for 10 minutes.

(2) De geconjugeerde vorm van glucagon (17-29) met BSA (l mg), de geconjugeerde vorm van glucagon (19-29) en BSA (1 mg) en de geconjugeerde(2) The conjugated form of glucagon (17-29) with BSA (1 mg), the conjugated form of glucagon (19-29) and BSA (1 mg) and the conjugated

35 vorm van glucagon (1—29) met BSA (2,5 mg) verkregen volgens voorbeeld IIForm of glucagon (1-29) with BSA (2.5 mg) obtained according to example II

8005703 * -10- verden op dezelfde wijze gebruikt en behandeld als boven is weergegeven in voorbeeld II(l). Aldus werden een antiglucagon (17-29)serum, een anti-glucagon (19-29)serum en een antiglucagon (l-29)serum verkregen.8005703 * -10- were used and treated in the same manner as shown above in Example II (1). Thus, an anti-glucagon (17-29) serum, an anti-glucagon (19-29) serum and an anti-glucagon (1-29) serum were obtained.

II) ünmunoreactiviteit van het antiserum: 5 (l) Analysemethode op de immunoreactiviteit:II) immunoreactivity of the antiserum: 5 (l) Method of analysis of the immunoreactivity:

De' boven weergegeven antisera werden verdund tot 200, UOO, 800, 3200, 61i00, 12800, 25600 en 51200 maal met 10 mM fosfaatbuffer met-pH 7,U met daarin 0,25 l BSA, 1 nM MgClg, 0,1 % NaUg, 3 mM EDTA en 0,15 M NaCl.The antisera shown above were diluted to 200, UOO, 800, 3200, 6100, 12800, 25600, and 51200 times with 10 mM phosphate buffer pH 7, U containing 0.25 L BSA, 1 nM MgClg, 0.1% NaUg, 3 mM EDTA and 0.15 M NaCl.

10 Elke 0,1 cm daarvan werd omgezet met' 0,1 cm fosfaatbuffer oplossing (met dezelfde samenstelling als de bovenstaand^ van gemerkt glucagon (l-29) of gemerkt glucagonfragment (merk: β-galactosidase; glucagonfragment: glucagon (l6-29), glucagon (17-29), glucagon (19-29)) en wel l6 uren bij 5°C. CaviadgG (1+ ^ig) en anti-cavia-IgG konijneserum werden hieraan toege-15 voegd en 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Het precipitaat werd opgevangen door 10 minuten bij 3000 tpm te centrifugeren en werd vervolgens toegevoegd aan 200 jul 10 mM fosfaatbuffer met pH 6,7 en daarin 0,1#Each 0.1 cm thereof was reacted with 0.1 cm phosphate buffer solution (with the same composition as the above of labeled glucagon (1-29) or labeled glucagon fragment (β-galactosidase brand; glucagon fragment: glucagon (16-29)). ), glucagon (17-29), glucagon (19-29)) for 16 hours at 5 ° C. CaviadgG (1+ µg) and anti-guinea pig IgG rabbit serum were added and 1 hour at room temperature The precipitate was collected by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes and then added to 200 µl of 10 mM phosphate buffer pH 6.7 and containing 0.1 #

OO

ESA, 1 mM MgClg, 0,1# NaNg en 0,15 M NaCl alsmede 5 mg/cm 0-nitrofenyl-P-D-galactopyranoside en U5 minuten bij 37°C geïncubeerd cm de A-galac-20 tosidaseactiviteit bij 1*20 nm colorimetrisch te bepalen. De gecombineerde verhouding tot gemerkt glucagon en gemerkt glucagonfragment in elke verdunningsconcentratie van het antiserum door de immunoreactie werd bepaald.ESA, 1 mM MgClg, 0.1 # NaNg and 0.15 M NaCl as well as 5 mg / cm O-nitrophenyl-PD-galactopyranoside and incubated at 37 ° C for 5 minutes at A-galac-20 tosidase activity at 1 * 20 nm to be determined colorimetrically. The combined ratio of labeled glucagon and labeled glucagon fragment in each dilution concentration of the antiserum by the immunoreaction was determined.

(a) Gemerkt glucagon (l-29): 25 Met &-galactosi dase gemerkt glucagon (l-29)fi*0 pg als glucagon (I-P9 )J verkregen volgens de hieronder beschreven methode werd gebruikt.(a) Labeled glucagon (1-29): β-galactosidase labeled glucagon (1-29) fi00 µg when glucagon (I-P9) J obtained according to the method described below was used.

(b) Gemerkte glucagonf ragmenten:(b) Labeled Glucagon Fragments:

Met -galactosidase gemerkt glucagon (16-29), glucagon (17-29) en glucagon (19-29), bereid volgens de hieronder beschreven methode 30 werden hierbij gebruikt in een hoeveelheid van ca. 20 pg aan elk glucagonfragment.Galactosidase-labeled glucagon (16-29), glucagon (17-29) and glucagon (19-29), prepared according to the method described below, were used in an amount of about 20 µg of each glucagon fragment.

(2) Resultaten en bespreking van de immunore activiteit:(2) Results and Discussion of Immunore Activity:

De verhoudingen van combinaties bij de immunoreactiviteit berekend door hoeveelheden precipitaat op elk antiserum zijn weergegeven 35 in de tabel in de gevallen van 800, 6U00, en 51200-verdunningen.The ratios of combinations in the immunoreactivity calculated by amounts of precipitate on each antiserum are shown in the table in the cases of 800, 6U00, and 51200 dilutions.

8005703 é - -11-8005703 é - -11-

Ccmbinatieverhoudingen in de andere gevallen van de overige verdunningen geven de overeenkomsten "bij deze resultaten weer. In de tabel is +++ een ccmbinatieverhouding van meer dan 75%>, ++ een cambinatieverhouding 50-75%, + een cambinatieverhouding 25-50%, - een ccmbinatieverhouding 5 0-25%·Combination ratios in the other cases of the other dilutions reflect the similarities "to these results. In the table +++ is a combination ratio of more than 75%>, ++ a combination ratio of 50-75%, + a combination ratio of 25-50% , - a combination ratio 5 0-25% ·

Als weergegeven in de tabel kamt glucagon (16-29) volgens de uitvinding enigermate overeen met glubagon (17-29) en glucagon (19-29)» althans wat betreft de structuur; de immunoreaetiviteit van het anti-lichaam in de antisera verkregen door een injectie van elk fragment 10 vertoont echter grote verschillen.As shown in the table, glucagon (16-29) of the invention is somewhat similar to glubagon (17-29) and glucagon (19-29), at least in structure; however, the immunoreactivity of the antibody in the antisera obtained by an injection of each fragment 10 shows great differences.

Het antilichaam geproduceerd door glucagon (ΐβ-29) volgens de uitvinding is bijzonder sensitief en sterk immunogeen reactief niet alleen tegen glucagon (16-29) maar ook tegen glucagon (17-29)» glucagon (19-29) en glucagon (1-29).The antibody produced by glucagon (ΐβ-29) according to the invention is particularly sensitive and highly immunogenic reactive not only against glucagon (16-29) but also against glucagon (17-29) »glucagon (19-29) and glucagon (1- 29).

15 Deze resultaten tonen aan, dat C-texminaal specifiek antilichaam (antilichaamtiter) kwantitatief, kan worden bepaald door toepassing van het glucagonfragment volgens de uitvinding.These results demonstrate that C-texminal specific antibody (antibody titer) can be quantitatively determined using the glucagon fragment of the invention.

8005703 i -12- •Q P » Pi8005703 i -12- • Q P »Pi

0 p CÖ (D0 p CÖ (D

H SH S

« <1)«<1)

60 60 G60 60 G

1 o wi ο 6οσ\ >* 01 OS CV1 + d u I f + + + +>'döH + + + ++| ill + + + OJ ·Η H ^ ! H a to ϋ CÖ gj, QJ d 60 μ p ο '1 o wi ο 6οσ \> * 01 OS CV1 + d u I f + + + +> 'döH + + + ++ | ill + + + OJ · Η H ^! H a to ϋ CÖ gj, QJ d 60 μ p ο '

I G Pi 60 ONI G Pi 60 ON

¢5 Ό f-ι CÖ CJ + + oj υ i + + + +> 5 I so; + + + ++i ill ++i¢ 5 Ό f-ι CÖ CJ + + oj υ i + + + +> 5 I so; + + + ++ i ill ++ i

O) O 5) Η HO) O 5) Η H

g P 60 60-w____g P 60 60-w ____

0J0J

WW.

GG

'ö a"a

•Η O• Η O

' ca 60 O «3 +5 oabout 60 O 3 + 5 o

0 G CÖ H0 G CÖ H

H 60 ,H 60,

COCO

60 P60 P

J Pi ON + +J Pi ON + +

*5. C\1 + + + l+l III + + I* 5. C \ 1 + + + 1 + 1 III + + I

OJ I P g t— OJ 0J rt g 60"-__________ 1 "" • H G\OJ I P g t— OJ 0J rt g 60 "-__________ 1" "• H G \

m OJ O I 43 p VOm OJ O I 43 p VO

« # H aJ Ph —'«# H aJ Ph - '

I—I 0JI-I 0J

G g GG g G

60 S O + + 160¾) + + + III III ++1 co 0J o p ra G OJ G rl g Ό 60 _______ OJ / to / d $ / OJ OJ 5m as / p Vh O G / pi O G/60 S O + + 160¾) + + + III III ++ 1 co 0J o p ra G OJ G rl g Ό 60 _______ OJ / to / d $ / OJ OJ 5m as / p Vh O G / pi O G /

Hop-/ dJ P /Hop- / dJ P /

v s m Lv s m L

OJ /G · o o oOJ / G o o o

60/ίπΌ OO OO OO OO60 / ίπΌ OO OO OO OO

/ 0J k OOOd OOCM OOOJ OOCVI/ 0J k OOOd OOCM OOOJ OOCVI

/tflOJ Ο P Η Ο P Η ΟΡΗ OPH/ tflOJ Ο P Η Ο P Η ΟΡΗ OPH

/•ri> co no in Φ no in o no in oo no u\/ • ri> co no in Φ no in o no in oo no u \

/ -P K H * WWW WWW WWW/ -P K H * WWW WWW WWW

/ S ·__;__ / G~i / I a) 3/ S · __; __ / G ~ i / I a) 3

/ G P g G G G G/ G P g G G G G

/ O G I O'-" 8—' O 8 M C 60 C -HP 60 ON 60 ON 60 ON 60'"" cdajGg.H a oj g cm gcnj coon/ O G I O'- "8— 'O 8 M C 60 C -HP 60 ON 60 ON 60 ON 60'" "cdajGg.H a oj g cm gcnj coon

CJO60GQJ ΟΙ ΟΙ1 ΟΙ V CVICJO60GQJ ΟΙ ΟΙ1 ΟΙ V CVI

G G G G Ο p gvo ΠΡ G On g IG G G G Ο p gvo ΠΡ G On g I

·· Η Ο H G Ο ·Η HH ri Η HH HH·· Η Ο H G Ο · Η HH ri Η HH HH

H 60 60 60 Vi t» fl 60"- 60·^ 60w bO'-' 0) 8H 60 60 60 Vi t »fl 60" - 60 · ^ 60w bO'- '0) 8

EHEH

8005703 -13- III. Bereiding van gemerkt glucagon (l-29) en de gemerkte glucagonfrag-menten : (1) Gemerkt glucagon (l-29): 10 van een waterige 100 mM EDCA-oplossing en 0,1 % 3—(2f—8005703 -13- III. Preparation of labeled glucagon (1-29) and labeled glucagon fragments: (1) Labeled glucagon (1-29): 10 of an aqueous 100 mM EDCA solution and 0.1% 3— (2f—

OO

5 benzothiazoly1-dithio)propionaatsuecinimideëster in 261+,1+. mm dimethyl-Benzothiazolyl-dithio) propionate suecinimide ester in 261 +, 1 +. mm dimethyl

formamide werden toegevoegd aan 1 mg glucagon (1-29) opgelost in 50 mMformamide were added to 1 mg glucagon (1-29) dissolved in 50 mM

fosfaatbuffer met pH 8,0 (0,1+ cm^) en 1 uur bij 5°C omgezet. Het reactiemengsel werd geleid door een Sephadex G-15 kolom van 1,5 x 1+0 cm voor een gelfiltratie en de doorgelaten fractie opgevangen, waarbij een 10 oplossing werd verkregen met daarin een derivaat met de 3-(2'-benzo- thiazolyl-dithio)propionylgroep aan de aminogroep van glucagon (l-29).phosphate buffer with pH 8.0 (0.1+ cm 3) and reacted at 5 ° C for 1 hour. The reaction mixture was passed through a 1.5 x 1 + 0 cm Sephadex G-15 column for gel filtration and the fraction passed through to obtain a solution containing a derivative containing the 3- (2'-benzothiazolyl) -dithio) propionyl group to the amino group of glucagon (1-29).

i^-galactosidase (een produkt van Boehringer te Mannheim) (2,78 mg) werd toegevoegd aan 2 cm^ 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 met daarin 25 Jig 3—(2f-benzothiazolyldithio)propionyl-glucagon (l-29) derivaat en * 15 1 uur bij kamertemperatuur omgezet.galactosidase (a product of Boehringer of Mannheim) (2.78 mg) was added to 2 cm ^ 50 mM phosphate buffer of pH 8.0 containing 25 µg of 3 (2-benzothiazolyldithio) propionyl glucagon (1-29) ) derivative and reacted at room temperature for 1 hour.

Dit reactiemengsel werd geleid door een kolcm Sephadex G-150 van 1,5 x 90 cm voor een gelfiltratie en de doorgeleide fractie opgevangen, waarbij met f3-galactosidase gemerkt glucagon (l-29) werd verkregen, waarbij de aminogroep van het glucagon (l-29) was gecombineerd met de 20 thiolgroep van de ^-galactosidase.This reaction mixture was passed through a 1.5 x 90 cm column of Sephadex G-150 for gel filtration and the fraction passed through to obtain f3-galactosidase labeled glucagon (1-29) to give the amino group of the glucagon (1 -29) was combined with the thiol group of the β-galactosidase.

(2) Gemerkte glucagonfragmenten: 10 ^ul 100 mM EDTA en 0,l5 3-(2'-benzothiazoly1-dithio)propionaat-(2) Labeled glucagon fragments: 10 µl 100 mM EDTA and 0.15 3- (2'-benzothiazoly1-dithio) propionate-

OO

succinimideëster in 625 mnr dimethylformamide werden toegevoegd aan 0,5 mg glucagon (16-29)» opgelost in 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 25 (0,1+ cm^) en dit geheel 1 uur bij 5°C omgezet. Het reactiemengsel werd geleid door een Sephadex G-15 kolom (l,5 X 1+0 cm) voor een gelfiltratie en de doorgeleide fractie opgevangen, waarbij een oplossing werd verkregen met daarin een 3-(2'-benzothiazoly1-dithio)propionylderivaat van glucagon (l6-29).succinimide ester in 625 mnr dimethylformamide was added to 0.5 mg glucagon (16-29) dissolved in 50 mM phosphate buffer with pH 8.0 (0.1 + cm 2) and reacted completely at 5 ° C for 1 hour. The reaction mixture was passed through a Sephadex G-15 column (1.5 X 1 + 0 cm) for gel filtration and the fraction passed through to obtain a solution containing a 3- (2'-benzothiazoly1-dithio) propionyl derivative of glucagon (16-29).

30 6,10 mg β-galactosidase werd toegevoegd aan 2 cm 50 mM fosfaat buffer met pH 8,0 met daarin 25 ;ug derivaat van 3-(2'-benzothiazolyl-dithio)propionylglucagon (l6-29) en dit geheel 1 uur bij kamertemperatuur omgezet. Het reactiemengsel werd geleid door een kolom van 1,5 x 90 cm Sephadex G-150 voor een gelfiltratie en de doorgeleide fractie 35 opgevangen, waarbij met /^-galactosidase gemerkt glucagon (l6-29) werd verkregen, en waarbij de aminogroep van het glucagon was verbonden met6.10 mg of β-galactosidase was added to 2 cm 50 mM phosphate buffer, pH 8.0 containing 25 µg derivative of 3- (2'-benzothiazolyl-dithio) propionyl glucagon (16-29) for 1 hour converted at room temperature. The reaction mixture was passed through a 1.5 x 90 cm Sephadex G-150 column for gel filtration and the pass-through fraction collected to give β-galactosidase labeled glucagon (16-29), and the amino group of the glucagon was associated with

o A a K ~7 A Jo A a K ~ 7 A J

Q li w -j j 'j ^ * -lilde thiolgroep van de $ -galactosidase.Q li w -j j 'j ^ * -lild thiol group of the $ galactosidase.

Werd glucagon (16-29) vervangen door glucagon (17129) of glucagon (19-29) en dezelfde behandeling toegepast, dan werden met β -galactosidase gemerkt glucagon (17-29) resp. (19—29) verkregen.If glucagon (16-29) was replaced with glucagon (17129) or glucagon (19-29) and the same treatment was applied, β-galactosidase labeled glucagon (17-29) and 5 mg. (19-29).

90057039005703

Claims (3)

1. Peptide met de formule H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH.1. Peptide of the formula H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH. 2. Geconjugeerde vorm van het peptide met de foimule H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-TTp-Leu^Iet-Asn-Thr-OH en een 5 eivit.2. Conjugated form of the peptide having the formula H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-TTp-Leu-Asn-Thr-OH and an egg protein. 3. Geconjugeerde vorm volgens conclusie 2, vaartij het eivit' een albumine of een gemodificeerde vorm daarvan is. k. Werkwijze voor het bereiden van specifieke antilichamen, met het kenmerk, dat men een dier sensitiseert door toediening van de - 10 geconjugeerde vorm van het peptide met de formule H-Ser-Arg-Arg-Ma-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH en een eivit, en vervolgens de door dit dier gevormde antilichamen vint. 8005703Conjugated form according to claim 2, the egg protein being an albumin or a modified form thereof. k. Method for preparing specific antibodies, characterized in that an animal is sensitized by administering the conjugated form of the peptide of the formula H-Ser-Arg-Arg-Ma-Gln-Asp-Phe-Val-Gln -Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH and an egg vit, and then find the antibodies formed by this animal. 8005703