NL8000127A - METHOD FOR FORMING PROKARYOTIC OR EUKARYOTIC PROTEINS AND A GENERALLY COUPLED GENE. - Google Patents

Description

v * kv * k

Werkwijze voor het vormen vaii prokaryotische of eukaryotische proteïnen alsmede een daarbij toepasbaar gekoppeld gen.A method of producing prokaryotic or eukaryotic proteins as well as a coupled gene applicable thereto.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het vormen van prokaryotische of eukaryotische proteïnen in native, niet gekoppelde vorm en vrij van vreemde peptiden, in bacteriën.The invention relates to a method of producing prokaryotic or eukaryotic proteins in native, unlinked form and free of foreign peptides, in bacteria.

5 DNA-recombinaties in vitro zijn toegepast om verschillende eukaryotische genen in Escherichia coli plasmiden in te bouwen ten einde te trachten deze bacteriën aan te zetten tot het vormen van eukaryotische proteïnen. De meeste van deze genen hebben echter geen invloed gehad op de synthese van native 10 proteïnen omdat de eukaryotische genen die coderen voor initiering van transscriptie en/of translatie niet goed in IS. coli functioneren. Om deze moeilijkheid op te lossen heeft men voorgesteld om het eukaryotisch gen te koppelen met een bacterieel gen. Dit resulteerde in de vorming van een hybrid proteïne waarvan het deel 15 aan de terminale carboxylgroep wordt gevormd door het eukaryotisch proteïne. In één geval is men er in geslaagd om een klein biologisch actief proteïne te scheiden van een koppelingsprodukt (K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)).In vitro DNA recombinations have been used to incorporate various eukaryotic genes into Escherichia coli plasmids to attempt to induce these bacteria to form eukaryotic proteins. However, most of these genes have not affected the synthesis of native proteins because the eukaryotic genes encoding transcription and / or translation initiation are not good in IS. coli function. To overcome this difficulty, it has been proposed to couple the eukaryotic gene to a bacterial gene. This resulted in the formation of a hybrid protein, the portion of which on the terminal carboxyl group is formed by the eukaryotic protein. In one case, it has been successful to separate a small biologically active protein from a coupling product (K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)).

Gen-expressie vindt plaats door transscriptie tot 20 mRNA gevolgd door translatie tot proteïne. Daartoe moet het DNA dat aan het gen voorafgaat, een struktuur bezitten die 800 0 127 tf .*4r 2 a) tot een doeltreffende binding van bacterieel RNA polymerase en doeltreffende initiering van transscriptie leidt, en b) codeert voor een mRNA dat tot een doeltreffende binding van mRNA aan de ribosomen en initiering van translatie tot proteïne 5 leidt.Gene expression takes place by transcription to 20 mRNA followed by translation to protein. To this end, the DNA that precedes the gene must have a structure that leads to 800 0 127 tf. * 4r 2 a) leads to an effective binding of bacterial RNA polymerase and transcription initiation, and b) encodes an mRNA that leads to an effective binding of mRNA to the ribosomes and initiation of translation leads to protein 5.

Volgens de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor het vormen van natief, niet gekoppeld prokaryotisch of eukaryotisch proteïne in bakteriën door in bakterieel plasmide een gen voor een prokaryotisch of eukaryotisch proteine in te 10 bouwen alsmede een verplaatsbare promotor bestaande uit een DNA fragment met een voor RNA polymerase herkenbare transscriptie-initieringsplaats maar zonder proteïne translatie startplaats waarbij deze promotor boven een proteïne-translatie-startplaats van het gen wordt ingebracht onder vorming van een gekoppeld gen 15 met een hybride ribosoom bindingsplaats, waarna het plasmide in de bakteriën wordt gebracht die daardoor worden getransformeerd, en de getransformeerde bakteriën worden gekweekt onder vorming van prokaryotisch of eukaryotisch proteïne.In accordance with the invention there is provided a method of generating native, unlinked prokaryotic or eukaryotic protein in bacteria by incorporating a gene for a prokaryotic or eukaryotic protein in a bacterial plasmid and a displaceable promoter consisting of a DNA fragment with an for RNA polymerase recognizable transcription initiation site but without protein translation start site where this promoter is introduced above a protein translation start site of the gene to form a linked gene with a hybrid ribosome binding site, after which the plasmid is introduced into the bacteria to be transformed thereby , and the transformed bacteria are grown to form prokaryotic or eukaryotic protein.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding worden 20 nucleasen, restrictie-enzymen en DNA ligase toegepast om de verplaatsbare promotor bestaande uit een DNA fragment met een trans-scriptieplaats maar zonder een translatie-initieringsplaats nabij het beginpunt van het gen dat voor het gewenste proteïne codeert, in te bouwen onder vorming van een hybride ribosomale bindings-25 plaats. De door dit hybrid getransformeerde bakterie vormt een proteïne dat het natieve derivaat van het geïmplanteerde gen is.In the method of the invention, nucleases, restriction enzymes and DNA ligase are used to transfer the promoter consisting of a DNA fragment with a transcription site but without a translation initiation site near the starting point of the gene encoding the desired protein, to be incorporated to form a hybrid ribosomal binding site. The bacterium transformed by this hybrid forms a protein which is the native derivative of the implanted gene.

Gevonden is, dat het endonuclease afbraak produkt van het E. coli lac operon, een DNA fragment met een transscriptie-initieringsplaats maar zonder translatie-startplaats, over de 30 vereiste eigenschappen beschikt om als een verplaatsbare promotor die in een hoog rendement door bakterieel RNA polymerase wordt overgeschreven, te functioneren. Het gevormde mRNA bevat een ribo-somele bindingsplaats (Shine-Dalgerno (S-D) sequence) maar geen voor translatie-initiering benodigd AUG of GUG. Volgens de uitvin-35 ding wordt echterjeen hybrid gevormd dat bestaat uit de S-D sequens 800 0 1 27 **.It has been found that the endonuclease degradation product of the E. coli lac operon, a DNA fragment with a transcription initiation site but without translation initiation site, has the required properties to act as a displaceable promoter in high efficiency by characteristic RNA polymerase. is transcribed, to function. The mRNA formed contains a ribo-somal binding site (Shine-Dalgerno (S-D) sequence) but no AUG or GUG required for translation initiation. However, according to the invention a hybrid consisting of the S-D sequence 800 0 1 27 ** is formed.

3 *♦ en initiator afkomstig van het lac operon en de AUG sequens van het gen. Dit gekoppeld gen wordt met een hoog rendement vertaald en overgeschreven. Door gebruik te maken van de enzymen exonuclease III en SI kan de promotor op elke gewenste plaats voor de trans-5 latie startplaats van het gen worden ingebouwd om een optimale proteïneproduktie te bereiken. Omdat de promotor op een restrictie-plaats boven de translatie startplaats van het gen kan worden ingebouwd, kan het gen eerst op de restrictieplaats worden geknipt waarna het gewenste aantal base-paren en elke enkel-stengige 10 uiteinden kunnen worden verwijderd door behandelen met nuclease gedurende een passend gekozen tijd, gevolgd door hereniging.3 * ♦ and initiator from the lac operon and the AUG sequence of the gene. This linked gene is translated and transferred with high efficiency. Using the enzymes exonuclease III and SI, the promoter can be incorporated at any desired site for the translation start site of the gene to achieve optimal protein production. Since the promoter can be incorporated into a restriction site above the translation start site of the gene, the gene can first be cut at the restriction site after which the desired number of base pairs and any single-stranded ends can be removed by nuclease treatment for an appropriately chosen time, followed by reunification.

Voorbeeld 15 Een konijne β-globine gen werd eerst gekloneerd aan de Hin III plaats van pBR322, een E.. coli plasmide, via met restrictie-enzym verknipt oorspronkelijk DNA, reconstitutie van het gen met T4 ligase, inbrengen van het gereconstitueerde gen aan de Hin III plaats onder gebruikmaking van gesynthetiseerde 20 Hin III verenigers, en hereniging onder gebruikmaking van DNA ligase.Example 15 A rabbit β-globin gene was first cloned to the Hin III site of pBR322, an E .. coli plasmid, via restriction enzyme digested original DNA, reconstitution of the gene with T4 ligase, introduction of the reconstituted gene to the Hin III site using synthesized Hin III aggregators, and reunification using DNA ligase.

Het Hin III brokstuk aan het carboxyl uiteinde van het gekloneerde gen werd verwijderd door gedeeltelijke afbraak met Hin III. De daarbij ontstane "kleverige uiteinden" van het Hin 25 III werden gekoppeld onder gebruikmaking van E. coli DNA polymerase I waarna de segmenten met behulp van T4 ligase aan elkaar werden geplakt. Het aldus gevormde plasmide bevatte een enkel Hin III stuk dat 25 base-paren voor de eindstandige aminogroep van het globine gen lag.The Hin III debris at the carboxyl end of the cloned gene was removed by partial degradation with Hin III. The resulting "sticky ends" of the Hin 25 III were coupled using E. coli DNA polymerase I and the segments were then joined together using T4 ligase. The plasmid thus formed contained a single Hin III stretch that was 25 base pairs for the terminal amino group of the globin gene.

30 Uit verschillende monsters van het gekloneerde gen werden verschillende aantallen van de 25 base-paren tussen het Hin III brokstuk en het ATG dat codeert voor het translatie startpunt, als volgt verwijderd: het plasmide werd met Hin III verknipt, gedurende verschillende tijdsduren variërend van 0,5 tot 10 min.Different numbers of the 25 base pairs between the Hin III debris and the ATG encoding the translation starting point were removed from different samples of the cloned gene as follows: the plasmid was cut with Hin III, for different durations ranging from 0 , 5 to 10 min.

35 behandeld met Exo III, en daarna met SI om enkel-strengige uiteinden 80 0 0 1 27 4 te verwijderen.35 treated with Exo III, then with SI to remove single stranded ends 80 0 0 1 27 4.

Hierna werd de verplaatsbare promotor van het lac operon, een Rl-Alu restrictie-fragment van E. coli DNA, ingébracht door elk monsters van het plasmide te behandelen met Rl, 5 een enzym dat op een specifieke plaats enkele 30 base-paren boven de Hin III plaats knipt. De promotor werd op deze plaats ingebracht waarvoor ëén "kleverig uiteinde" en ëén "flush" uiteinde nodig zijn die aan elkaar worden geplakt met hetzelfde ligase.After this, the displaceable promoter of the lac operon, an R1-Alu restriction fragment of E. coli DNA, was introduced by treating each sample of the plasmid with R1.5 an enzyme which, in a specific location, is some 30 base pairs above the Hin III snaps place. The promoter was introduced at this site requiring one "tacky end" and one "flush" end which are glued together with the same ligase.

Vervolgens werden kolonies van E_. coli die elk 10 een van de aldus gevormde plasmiden bevatten, geselekteerd op β-globine vorming onder gebruikmaking van RIA-screening technieken.Then colonies of E_. coli each containing one of the plasmids thus formed, selected for β-globin formation using RIA screening techniques.

Het globine gen in voornoemde plasmiden kan elk gen zijn dat codeert voor prokaryotische of enkaryotische proteïnen terwijl in plaats van de Hin III-plaats elke andere specifieke 15 restrictie-plaats in aanmerking komt. Wanneer de restrictie-plaats te ver van het begin van het gen ligt en daardoor moeilijk toegankelijk is, kan hij worden opgeschoven (een Hin III plaats bijvoorbeeld kan opgeschoven door het plasmide te openen met Hin III, behandelen met Exo III en SI, en de plasmide segmenten weer aan 20 elkaar te plakken bij aanwezigheid van overmaat Hin III verenigers). De Rl-plaats kan door elke andere restrictie-plaats die geschikt is om de verplaatsbare promotor in te brengen, worden vervangen bijvoorbeeld Pst, BAM of Sal I.The globin gene in said plasmids may be any gene encoding prokaryotic or enkaryotic proteins, while any other specific restriction site may be substituted for the Hin III site. When the restriction site is too far from the beginning of the gene and is therefore difficult to access, it can be advanced (for example, a Hin III site can be advanced by opening the plasmid with Hin III, treating with Exo III and SI, and Plasmid the plasmid segments back together in the presence of excess Hin III aggregators). The R1 site can be replaced by any other restriction site suitable for introducing the displaceable promoter, e.g. Pst, BAM or Sal I.

Met natL-ruk wordt er op gewezen, dat de moeilijk-25 ste stap, het kloneren van het gen aan het plasmide, eenmaal plaats vindt en intakt wordt gelaten. Het promotor-fragment draagt zijn constitutieve expressie over op de cel zodat eenvoudig geconstateerd kan worden of de promotor intakt is.It is pointed out with natL-jerk that the most difficult step, the cloning of the gene to the plasmid, takes place once and is left intact. The promoter fragment transfers its constitutive expression to the cell so that it is easy to determine whether the promoter is intact.

30 0 Θ 1 2730 0 Θ 1 27

Claims (9)

1. Gekoppeld gen dat codeert voor een hybride ribosoom bindingsplaats, gekenmerkt door 5 de regio van een bakterieel gen bestaande uit,in volgorde van transscriptie de SD-regio, en ten minste ëên base-paar dat aan voornoemde SD-regio grenst, gekoppeld met de regio van een gen dat codeert voor een prokaryo- 10 tisch of eukaryotisch proteïne, bestaande uit,in volgorde van transscriptie ten minste één base-paar dat aan een translatie-startplaats grenst, en voornoemde translatie-startplaats.1. A linked gene encoding a hybrid ribosome binding site, characterized by the region of a biological gene consisting of, in order of transcription, the SD region, and at least one base pair adjacent to said SD region, linked with the region of a gene encoding a prokaryotic or eukaryotic protein, comprising, in order of transcription, at least one base pair adjacent to a translation start site, and said translation start site. 2. Gekoppeld gen volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gen verder boven de SD-regio de promotor regio van het bakteriële gen bevat en onder de translatie-startplaats van het gen dat codeert voor prokaryotisch of eukaryotisch proteïne de regio van laatst genoemd gen. 20A linked gene according to claim 1, characterized in that the gene further above the SD region contains the promoter region of the character gene and below the translation start site of the gene encoding prokaryotic or eukaryotic protein the region of the latter. gene. 20 3. Werkwijze voor het vormen van natief niet gekoppeld prokaryotisch of eukaryotisch proteïne in bakteriën, met het kenmerk, dat in een bakteriëel plasmide een gen wordt ingebracht dat codeert voor prokaryotisch of eukaryotisch proteïne, en een ver- 25 plaatsbare promotor bestaande uit een DNA fragment met een voor RNA polymerase herkenbare transscriptie-initieringsplaats maar zonder proteïne-translatie-startplaats, welke promotor boven een proteïne-translatie-startplaats van het gen wordt ingebracht onder vorming van een gekoppeld gen met een hybride ribosoom-bindings- 30 plaats, waarna het plasmide in de bakteriën wordt gebracht onder transformatie daarvan en de getransformeerde bakteriën worden gekweekt onder vorming van prokaryotisch of eukaryotisch proteïne.3. A method of generating native unlinked prokaryotic or eukaryotic protein in bacteria, characterized in that a gene encoding prokaryotic or eukaryotic protein is introduced into a bacterial plasmid, and a displaceable promoter consisting of a DNA fragment with an RNA polymerase recognizable transcription initiation site but without a protein translation start site, which promoter is introduced above a protein translation start site of the gene to form a linked gene with a hybrid ribosome binding site, after which the plasmid is brought into the bacteria under transformation thereof and the transformed bacteria are grown to form prokaryotic or eukaryotic protein. 4. werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, 35 dat de bakterie Escherichia coli is. 800 0 1 ik *4. method according to claim 3, characterized in that the bacterium is Escherichia coli. 800 0 1 I * 5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de verplaatsbare^Jmotor het restrictie-endonuclease afbraak-produkt van een operon is.5. A method according to claim 3, characterized in that the displaceable motor is the restriction endonuclease degradation product of an operon. 6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de verplaatsbare promotor het restrictie-endonuclease afbraak-produkt van het E. coli lac operon is.A method according to claim 5, characterized in that the displaceable promoter is the restriction endonuclease degradation product of the E. coli lac operon. 7. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, 10 dat het gen wordt ingebracht door kloneren aan het plasmide, instellen van de afstand tussen het ingebrachte gen en een voorgaande specifieke restrictie-plaats door behandelen met een nuclease, en kloneren van de verplaatsbare promotor aan deze restrictie-plaats , 15A method according to claim 3, characterized in that the gene is introduced by cloning to the plasmid, adjusting the distance between the inserted gene and a previous specific restriction site by nuclease treatment, and cloning the displaceable promoter to this restriction site, 15 8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gen wordt ingebracht door kloneren aan het plasmide, instellen van de afstand tussen het ingebrachte gen en een '-oorgaande specifieke restrictie-plaats door behandelen met een nucl». ise, 20 en kloneren aan deze restrictie-plaats van een verplaatsbare promotor gevormd door endonuclease afbraak van het IS. coli lac operon.8. A method according to claim 1, characterized in that the gene is introduced by cloning to the plasmid, adjusting the distance between the inserted gene and a "leading specific restriction site by treatment with a nucl". ise, 20 and cloning to this restriction site of a displaceable promoter formed by endonuclease degradation of the IS. coli lac operon. 9. Werkwijzen en daarmee verkregen produkten 25 zoals beschreven in de beschrijving en voorbeelden. 80 0 0 1 279. Methods and products obtained therewith as described in the description and examples. 80 0 0 1 27