NL192326C

NL192326C - A method of preparing a medicament in which a purified, detoxified endotoxin is brought into a form suitable for therapeutic administration together with a carrier and optionally other additives.

Info

Publication number: NL192326C
Application number: NL8402515A
Authority: NL
Original assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Priority date: 1983-08-26
Filing date: 1984-08-16
Publication date: 1997-06-04
Also published as: IT1177974B; FR2550945B1; DK389384A; NL192326B; DK389384D0; FR2550945A1; IT8448757A0; DE3431058C2; IT8448757A1; NL8402515A; ES8606883A1; ES535124A0; AU554039B2; IL72675A0; FI843204A; DE3448164C2; JPH0556326B2; SE8404090D0; HUT34887A; CA1225592A

Abstract

A composition which is capable of producing an effective adjuvant response or stimulating the immune response of a warm blooded animal which comprises an effective amount of a refined detoxified endotoxin material, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.

Description

1 1923261 192326

Werkwijze voor het bereiden van een geneesmiddel, waarbij een gezuiverd, ontgift endotoxlne samen met een drager en eventueel andere toevoegingen in een voor therapeutische toediening geschikte vorm wordt gebracht 5 De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een geneesmiddel waarbij een gezuiverd, ontgift endotoxine samen met een drager en eventueel andere toevoegingen in een voor therapeutische toediening geschikte vorm wordt gebracht.The present invention relates to a method of preparing a medicament in which a purified, detoxified endotoxin together with a carrier and optionally other additives is brought into a form suitable for therapeutic administration. detoxifies endotoxin together with a carrier and optionally other additives in a form suitable for therapeutic administration.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit de Franse octrooiaanvrage 7.716.473. Deze literatuurplaats beschrijft een werkwijze voor het winnen van bacteriële endotoxinen, met name endotoxine van Bordetella 10 pertussis, en het scheiden van deze endotoxinen in verschillende lipidefracties, waarbij men eventueel gezuiverd endotoxine onderwerpt aan een milde hydrolyse bij een pH van 2-4; na verwijdering van de bovenstaande vloeistof onderwerpt men het gevriesdroogde bezinksel aan een extractie die enerzijds leidt tot een extract en anderzijds tot een residu, en men extraheert het extract met een ander oplosmiddel, hetgeen een tweede extract en een tweede residu oplevert. Verder beschrijft deze literatuurplaats genees-15 middelen die verschillende mengsels van voomoemde fracties bevatten. Vermeld wordt dat de verschillende fracties bruikbaar kunnen zijn voor het versterken van de werking van bacteriële en virale vaccins, voor het versterken van het afweermechanisme en voor het bestrijden van bepaalde infectueuze bacteriën en dat zij bovendien werkzaam kunnen zijn tegen bepaalde tumoren.Such a method is known from French patent application 7,716,473. This reference describes a method for recovering bacterial endotoxins, in particular Bordetella 10 pertussis endotoxin, and separating these endotoxins into different lipid fractions, subjecting optional purified endotoxin to mild hydrolysis at a pH of 2-4; after removal of the supernatant, the freeze-dried sediment is subjected to an extraction which results in an extract on the one hand and a residue on the other, and the extract is extracted with another solvent to yield a second extract and a second residue. Furthermore, this reference describes drugs containing various mixtures of the aforementioned fractions. It is stated that the different fractions may be useful for enhancing the action of bacterial and viral vaccines, for enhancing the defense mechanism and for fighting certain infectious bacteria, and may also be effective against certain tumors.

Gevonden is nu dat een geneesmiddel dat wordt bereid met een op een specifieke wijze ontgift en 20 gezuiverd endotoxine, bij een warmbloedig zoogdier een hulprespons teweeg kan brengen en de immuun-respons kan stimuleren.It has now been found that a drug prepared with a specific detoxification and purified endotoxin can elicit an auxiliary response and stimulate the immune response in a warm-blooded mammal.

Aldus voorziet de uitvinding in een werkwijze als in de aanhef omschreven, met het kenmerk, dat het endotoxine wordt gezuiverd en ontgift door (a) een endotoxine-extract, verkregen uit micro-organismen van de familie Enterobacteriaciae met een 25 anorganisch of organisch zuur te hydrolyseren.The invention thus provides a method as described in the preamble, characterized in that the endotoxin is purified and detoxified by (a) treating an endotoxin extract obtained from micro-organisms of the family Enterobacteriaciae with an inorganic or organic acid. hydrolyzing.

(b) het gehydrolyseerde product tot ruw lipide A te vriesdrogen.(b) freeze-drying the hydrolyzed product to crude lipid A.

(c) het ruwe lipide A te behandelen met een eerste oplosmiddel, dat vetzuren en verontreinigingen kan oplossen zonder het mwe lipide A op te lossen, (d) het verkregen onoplosbare product op te lossen in een tweede oplosmiddel, waarin het ruwe lipide A 30 oplosbaar is, en (e) ter verkrijging van het gewenste gezuiverde ontgifte endotoxine de verkregen oplossing door een chromatografiekolom te leiden, en uit het verkregen product een geneesmiddel voor het teweegbrengen van een doeltreffende hulprespons of het stimuleren van de immuunrespons van een warmbloedig dier wordt bereid.(c) treating the crude lipid A with a first solvent, which can dissolve fatty acids and impurities without dissolving the mwe lipid A, (d) dissolving the obtained insoluble product in a second solvent, wherein the crude lipid A is soluble, and (e) to obtain the desired purified detoxified endotoxin, pass the resulting solution through a chromatography column, and from the obtained product a medicament for effecting an auxiliary auxiliary response or stimulating the immune response of a warm-blooded animal is prepared .

35 Gewezen kan nog worden op de niet-voorgepubliceerde Franse octrooiaanvrage 8.308.548, waarin de bereiding van het in het onderhavige geneesmiddel toegepaste, gezuiverde, ontgifte endotoxine op zich wordt beschreven. Deze literatuurplaats leert echter niet dat een dergelijk endotoxine toegepast kan worden voor het bereiden van een farmaceutisch preparaat dat een hulprespons teweeg kan brengen en de immuunrespons kan stimuleren bij een warmbloedig dier, maar vermeldt uitsluitend de tumorgroei-40 terugdringende werking van een preparaat dat ontgift, gezuiverd endotoxine in combinatie met celwand-skelet bevat.Reference may also be made to the non-prepublished French patent application 8,308,548, which describes the preparation of the purified, detoxified endotoxin used in the present medicament per se. However, this literature does not teach that such an endotoxin can be used to prepare a pharmaceutical composition which can elicit an auxiliary response and stimulate the immune response in a warm-blooded animal, but only mentions the tumor growth-reducing effect of a detoxifying composition, purified endotoxin in combination with cell wall skeleton.

Het bij (e) verkregen gezuiverde ontgifte endotoxine wordt verder als RDE aangeduid; hiermee is dus uitsluitend het met de stappen (a) t/m (e) verkregen product bedoeld.The purified detoxified endotoxin obtained in (e) is further referred to as RDE; this means therefore only the product obtained with steps (a) to (e).

Endotoxine-extracten van het type, dat gebruikt wordt als uitgangsstof voor het bereiden van het RDE, 45 dat bij de onderhavige uitvinding gebruikt wordt, kunnen worden verkregen uit allerlei Enterobacteriaciae met inbegrip van moederorganismen en mutanten. Zo zijn bijvoorbeeld de volgende genera illustratief voor het type micro-organisme, dat men kan gebruiken:Endotoxin extracts of the type used as a starting material for preparing the RDE 45 used in the present invention can be obtained from a variety of Enterobacteriaciae including parent organisms and mutants. For example, the following genera are illustrative of the type of microorganism that can be used:

Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella en Serratia.Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella and Serratia.

50 De volgende species worden met name gebruikt: G. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E coji, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni en S. abortus equi.50 The following species are used in particular: G. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E coji, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni and S. abortus equi.

De endotoxine-extracten die als uitgangsstof worden gebiuikt, kunnen worden bereid volgens één of meer bekende werkwijzen (zie bijvoorbeeld Webster, M.E., Sagin, J.F., Landy, M. en Johnson, A.G., J.The endotoxin extracts used as starting material can be prepared by one or more known methods (see, e.g., Webster, M.E., Sagin, J.F., Landy, M. and Johnson, A.G., J.

55 Immunol. 1955, 744, 55; Westphal, O., Luderitz, O., en Bister, F., Z. Naturforsch, 78,148 (1952); Westphal, O., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (George F. Springer, ed.), Madison, N.J. Madison Printing Co., 1957,115; Galanos, C., Luderitz, 0., Westphal, 0., Eur. J. Biochem, 9, 245 (1969); Chen, C.H., Johnson, A.G., Kasai, N., Key, B.A., Levin, J., Nowotny, A., J. Infect. Pis. 128, 543 (1973); Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K.C., The Journal of Experimental Medicine 114, 647 (1961); Leive, L., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21,290 (1965) en Ribi, E., Milner, K.C., en Perrine, T., J. Immunol. 82, 75 (1959)).55 Immunol. 1955, 744, 55; Westphal, O., Luderitz, O., and Bister, F., Z. Naturforsch, 78.148 (1952); Westphal, O., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (George F. Springer, ed.), Madison, N.J. Madison Printing Co., 1957,115; Galanos, C., Luderitz, 0., Westphal, 0., Eur. J. Biochem, 9, 245 (1969); Chen, C.H., Johnson, A.G., Kasai, N., Key, B.A., Levin, J., Nowotny, A., J. Infect. Piss. 128, 543 (1973); Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K.C., The Journal of Experimental Medicine 114, 647 (1961); Leive, L., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21,290 (1965) and Ribi, E., Milner, K.C., and Perrine, T., J. Immunol. 82, 75 (1959)).

5 Een zeer geschikte methode voor het verkrijgen van het endotoxine-extract is die beschreven door Chen, et al in J. Infect. Dis. 128, 543-551 (1973) namelijk methanol-chloroformprecipitatie.A very suitable method for obtaining the endotoxin extract is that described by Chen, et al in J. Infect. Dis. 128, 543-551 (1973) namely, methanol-chloroform precipitation.

Het methanol-chloroformprecipitaat (MCP) wordt gezuiverd volgens de in de Franse octrooiaanvrage 8.308.584 beschreven werkwijze. Men laat het methanol-chloroformprecipitaat (MCP) reageren met een organisch of anorganisch zuur en vriesdroogt het daarna onder verkrijging van een gehydrolyseerd ruw 10 lipide A met verminderde toxiciteit en pyrogeniciteit, vergeleken met het endotoxinemateriaal, waarvan men is uitgegaan. Daarna behandelt men het resulterende product met een oplosmiddel, dat specifiek vetzuren en andere onzuiverheden kan oplossen zonder het ruwe lipide A op te lossen. Een voor dit doel geschikt oplosmiddel is aceton. Het fosfaatgehalte van het ontgifte, gezuiverde lipide A is ongeveer de helft van wat is waargenomen bij de toxische tegenhanger, wat doet vermoeden, dat het fosfaatgehalte verband houdt 15 met de toxische effecten van endotoxinen.The methanol-chloroform precipitate (MCP) is purified by the method described in French patent application 8,308,584. The methanol-chloroform precipitate (MCP) is reacted with an organic or inorganic acid and then freeze-dried to obtain a hydrolysed crude lipid A with reduced toxicity and pyrogenicity compared to the starting endotoxin material. The resulting product is then treated with a solvent, which can specifically dissolve fatty acids and other impurities without dissolving the crude lipid A. A solvent suitable for this purpose is acetone. The phosphate content of the detoxified, purified lipid A is about half of what has been observed in the toxic counterpart, suggesting that the phosphate content is related to the toxic effects of endotoxins.

Voor reactie met MCP geschikte anorganische zuren zijn zoutzuur, zwavelzuur of fosforzuur en de geschikte organische zuren zijn tolueensulfonzuur of trichloorazijnzuur. De reactie kan goed worden uitgevoerd bij een temperatuur van 90-130°C gedurende een ter voltooiing van hydrolyse voldoende tijd, gewoonlijk 15-60 minuten.Inorganic acids suitable for reaction with MCP are hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid and the suitable organic acids are toluene sulfonic acid or trichloroacetic acid. The reaction can be carried out well at a temperature of 90-130 ° C for a time sufficient to complete hydrolysis, usually 15-60 minutes.

20 Men kan ruw, ontgift endotoxine ook bereiden door als eerste stap de uitgangsstof met het uitgekozen zuur te laten reageren in aanwezigheid van een organisch oplosmiddel, zoals chloroform, methanol, ethanol of combinaties daarvan.Raw, detoxified endotoxin can also be prepared by reacting the starting material with the selected acid in the presence of an organic solvent such as chloroform, methanol, ethanol or combinations thereof as the first step.

Men lost het resulterende ruwe lipide A op in aceton, dat bijzonder geschikt is voor de verwijdering van vetzuurcomponenten. Daarna verwijdert men het oplosmiddel onder verkrijging van ruw, ontgift endotoxine. 25 Daarna lost men het ruwe, ontgifte endotoxine op in een oplosmiddel en leidt men de oplossing door een geschikte chromatografiekolom, bijvoorbeeld een moleculaire uitsluitingschromatografiekolom, teneinde de RDE-fracties af te scheiden, die men vervolgens, na verwijdering van het oplosmiddel combineert. Bij één uitvoeringsvorm leidt men de ruwe, ontgifte endotoxine-oplossing door een Sephadexkolom in aanwezigheid van een oplosmiddel, zoals chloroform, methanol, aceton, pyridine, ether of azijnzuur, of combinaties 30 daarvan. De druk van de kolom kan variëren, maar bedraagt met name atmosferische druk tot 690 kPa en de stroomsnelheid bedraagt 0,1-10 ml/min.The resulting crude lipid A is dissolved in acetone, which is particularly suitable for the removal of fatty acid components. The solvent is then removed to yield crude detoxified endotoxin. The crude detoxified endotoxin is then dissolved in a solvent and the solution is passed through a suitable chromatography column, for example a molecular exclusion chromatography column, to separate the RDE fractions which are then combined after removal of the solvent. In one embodiment, the crude detoxified endotoxin solution is passed through a Sephadex column in the presence of a solvent, such as chloroform, methanol, acetone, pyridine, ether, or acetic acid, or combinations thereof. The pressure of the column can vary, but typically atmospheric pressure is up to 690 kPa and the flow rate is 0.1-10 ml / min.

Eventueel leidt men de ruwe, ontgifte endotoxine-oplossing door een DEAE-cellulosekolom onder dezelfde druk als bovengenoemd voor de Sephadexkolom. De stroomsnelheid kan op 2-15 ml/min worden gehouden. De gebruikte oplosmiddelen zijn ook hetzelfde als bij de Sephadexkolom, hoewel men water 35 en/of diethylamine aan alle mengsels kan toevoegen in een concentratie tot 1%.Optionally, the crude detoxified endotoxin solution is passed through a DEAE cellulose column under the same pressure as above for the Sephadex column. The flow rate can be kept at 2-15 ml / min. The solvents used are also the same as for the Sephadex column, although water and / or diethylamine can be added to all mixtures at a concentration of up to 1%.

Andere werkwijzen voor het bereiden van RDE uit ruw, ontgift endotoxine zijn het leiden van de oplossing door een lage druk silicagel 60 kolom met een deeltjesgrootte van 15-63 micron en gebruikmaking van een geschikt oplosmiddel, zoals chloroform, methanol, water of ammoniumhydroxide. De volume verhouding van bovengenoemd oplosmiddel bedraagt bij voorkeur 50:25:4:2.Other methods for preparing RDE from crude detoxified endotoxin are passing the solution through a low pressure silica gel 60 column with a particle size of 15-63 microns and using a suitable solvent such as chloroform, methanol, water or ammonium hydroxide. The volume ratio of the above solvent is preferably 50: 25: 4: 2.

40 De uitvinding beoogt dan ook het gebruik van een aldus verkregen gezuiverd, ontgift, endotoxineproduct, dat men doeltreffend kan gebruiken voor de stimulering van het immuunsysteem van een warmbloedig dier. RDE kan vooral worden gebruikt als B-celmitogeen ter stimulering van de productie van lymfokinen, ter stimulering van microfagen en als hulpmiddel, dat de immuunrespons van een warmbloedig dier verhoogt.The invention therefore contemplates the use of a thus obtained purified, detoxified, endotoxin product, which can be used effectively for stimulating the immune system of a warm-blooded animal. RDE can mainly be used as a B-cell mitogen to stimulate the production of lymphokines, to stimulate microphages and as an aid that increases the immune response of a warm-blooded animal.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op het gebruik van aldus verkregen gezuiverd, ontgift 45 endotoxine (RDE) voor de bereiding van een geneesmiddel dat een stimulant van het immuunsysteem is. Het bij de uitvinding gebruikte RDE bevat geen waarneembaar 2-keto-3-deoxyoctanaat bij 350-475 nmolen/mg fosfor en 1700-2000 nmolen/mg vetzuren.The present invention relates to the use of purified, detoxified endotoxin (RDE) thus obtained for the preparation of a medicament which is a stimulant of the immune system. The RDE used in the invention contains no detectable 2-keto-3-deoxyoctanate at 350-475 nmoles / mg phosphorus and 1700-2000 nmoles / mg fatty acids.

Men kan het RDE bevattend geneesmiddel, verkregen volgens de onderhavige uitvinding gebruiken als stimulator van de immuunrespons bij warmbloedige dieren tegen antigenen, zoals microbacteriële en 50 fungicellen, microbacteriële celfragmenten, virussen, virusonderdelen en synthetische peptiden, die cel en virusonderdelen nabootsen. Antigenen die met name worden aangetast door de immuunrespons, die wordt verhoogd door de toediening van RDE zijn Cryptococcus neoformans, Candida spp., Chlamydia spp., Legionella spp., Clostridia, hepatitis menginitis, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Klebsiella spp., herpes-virus, Brucella spp., Bordetella spp., Salmonella spp., Shigella spp., Camphylobacter spp., Versinia 55 spp., Pasturella spp., Francisella spp., Listeria spp. en dergelijke.The RDE-containing drug obtained according to the present invention can be used as a stimulator of the immune response in warm-blooded animals against antigens, such as microbial and fungal cells, microbial cell fragments, viruses, virus parts and synthetic peptides, which mimic cell and virus parts. Antigens particularly affected by the immune response, which is enhanced by the administration of RDE, are Cryptococcus neoformans, Candida spp., Chlamydia spp., Legionella spp., Clostridia, hepatitis menginitis, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Klebsiella spp. , herpes virus, Brucella spp., Bordetella spp., Salmonella spp., Shigella spp., Camphylobacter spp., Versinia 55 spp., Pasturella spp., Francisella spp., Listeria spp. and such.

Het bij de uitvinding gebruikte RDE vertoont B-celmitogeniciteit, dat wil zeggen, dit RDE activeert bij toediening aan een warmbloedig dier in een geschikte dosis B-lymcofyten, die de cellen zijn, die voor de 3 192326 productie van antilichamen verantwoordelijk zijn.The RDE used in the invention exhibits B cell mitogenicity, that is, it activates RDE when administered to a warm-blooded animal in an appropriate dose of B lymcophytes, which are the cells responsible for the production of antibodies.

Bereiding gezuiverd, ontgift endotoxinePurified preparation, detoxifies endotoxin

In een driehalskolf met koeler werd in 150 ml 0,1 N HCI 650 mg volgens de procedure van Chen et al (J.In a three-necked flask with cooler, in 150 ml 0.1 N HCl 650 mg according to the procedure of Chen et al (J.

5 Infect. Dis., 128, 543 (1973)) bereid MCP gesuspendeerd. De kolf bracht men in een ’’sonicator”, en na het toepassen van supersone trillingen bracht men de glazen kolf in een oliebad dat op 120°C gehouden werd, zodat de inhoud van de kolf aan de kook kwam. Oververhitting van de oplossing werd beperkt door via een capillair in één van de zijhalzen stikstof door te leiden; dit doorblazen gebeurde tijdens de gehele hydrolyse, welke 30 minuten duurde.Infect. Dis., 128, 543 (1973)) prepared MCP suspended. The flask was placed in a sonicator, and after applying supersonic vibrations, the glass flask was placed in an oil bath kept at 120 ° C to boil the contents of the flask. Overheating of the solution was limited by passing nitrogen through a capillary into one of the side necks; this purging occurred during the entire hydrolysis, which lasted 30 minutes.

10 Daama werd de oplossing met een ijsbad afgekoeld, opnieuw aan supersone trillingen onderworpen, en over Corex-buizen verdeeld. De kolf werd met gedestilleerd water nagespoeld om alle vaste stof van de zijkanten af te krijgen en deze vaste stof werd ook in de Corex-buizen gebracht. De buizen werden 80 minuten op 12000 rpm gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd afgeschonken en weggedaan. Het vaste residu werd opnieuw in gedestilleerd water gesuspendeerd, supersoon getrild totdat de suspensie 15 goed gedispergeerd was, en weer gecentrifugeerd. Dit centrifugerend uitwassen werd nog eens herhaald.Then the solution was cooled with an ice bath, again subjected to supersonic vibrations, and distributed to Corex tubes. The flask was rinsed with distilled water to remove any solid from the sides and this solid was also placed in the Corex tubes. The tubes were centrifuged at 12000 rpm for 80 minutes. The supernatant was decanted and discarded. The solid residue was resuspended in distilled water, vibrated individually until the suspension was well dispersed, and centrifuged again. This centrifugation wash was repeated once more.

Het residu werd toen in gedestilleerd water opgenomen, ingevroren en gedroogd, wat 382 mg product gaf.The residue was then taken up in distilled water, frozen and dried to give 382 mg of product.

Van dit materiaal werd 150 mg met koud aceton van 0°C uitgetrokken om vetzuren te verwijderen, supersoon getrild en bij 5°C door Whatman papier no. 1 gefiltreerd. Na drogen was er 100 mg mw ontgift endotoxine.150 mg of this material was extracted with cold acetone at 0 ° C to remove fatty acids, vibrated individually and filtered at 5 ° C through Whatman paper No. 1. After drying, there was 100 mg of detoxified endotoxin.

20 Een mengsel van 110 g LH-20-100 (van de firma Pharmacia, deeltjesgrootte 25-100 pm) met 600 ml chloroform/methanol 2:1 liet men 30 minuten staan en bracht men daama in een kolom van 25 x 1000 mm voor chromatografie (met klemaansluitingen, van de BRL Laboratories). Nadat de kolom volledig gezet was werd hij met een persslang van Teflon aangesloten op een pomp model 132 van Isco. Met een debiet van 3 ml/min werd 400 ml chloroform/methanol 4:1 door de kolom gepompt. Via een zijlus werd 100 mg van het 25 hiervoor verkregen ruwe ontgifte endotoxine in 2,5 ml chloroform/methanol 4:1 ingebracht. Het debiet werd tot 1 ml/min verlaagd, en nadat 150 ml loopvloeistof opgevangen was werd de uitlaat van de kolom op een fractieverzamelaar aangesloten. Er werden fracties van 4 ml opgevangen en met dunlaagchromatografie (0,25 mm dikke platen van de firma Merck, chloroform/methanol/water/ammoniak 50:25:4:2 als loopvloeistof) werden de fracties die geen verontreinigingen bevatten, uitgezocht. Deze fracties werden gecombineerd en 30 drooggedampt, wat 30 mg gezuiverd ontgift endotoxine als wit poeder gaf.A mixture of 110 g of LH-20-100 (from Pharmacia, particle size 25-100 µm) with 600 ml of chloroform / methanol 2: 1 was left for 30 minutes and then placed in a column of 25 x 1000 mm chromatography (with clamp connections, from the BRL Laboratories). After the column was fully set, it was connected to a Isco pump 132 with a Teflon discharge hose. 400 ml of chloroform / methanol was pumped 4: 1 through the column at a flow rate of 3 ml / min. 100 mg of the previously obtained raw detoxified endotoxin in 2.5 ml chloroform / methanol 4: 1 was introduced via a side loop. The flow rate was reduced to 1 ml / min, and after 150 ml of running liquid was collected, the column outlet was connected to a fraction collector. Fractions of 4 ml were collected and thin-layer chromatography (0.25 mm thick plates from Merck, chloroform / methanol / water / ammonia 50: 25: 4: 2 as running liquid), the fractions containing no impurities were selected. These fractions were combined and evaporated to give 30 mg of purified detoxified endotoxin as a white powder.

Proeven (1) B-celmitogeniciteit.Tests (1) B cell mitogenicity.

RDE wordt gekenmerkt door zijn vermogen tot het activeren van B-lymfocyten, die de cellen zijn, die 35 verantwoordelijk zijn voor de productie van antilichamen en wel als volgt:RDE is characterized by its ability to activate B lymphocytes, which are the cells responsible for the production of antibodies as follows:

Mitogene werking van gezuiverd, ontgift endotoxine.Mitogenic effect of purified, detoxified endotoxin.

Dosis 3H-thymidineopneming (pgml) CPM* SI** 40 -:-;- BALB/c nu/+ 10 34.500 5,0 BALB/c nu/nu 10 38.693 5,6Dose 3H thymidine incorporation (pgml) CPM * SI ** 40 -: -; - BALB / c nu / + 10 34,500 5.0 BALB / c nu / nu 10 38,693 5.6

Protocol: 45 1 x 106 cellen/ml van elke stam met of zonder mytogenen gekweekt in 0,2 mg RPMI-1640 (5% FCS) in 96 puts microtiterplaten. Men voegde 1 pel H-thymidine toe aan elke put gedurende de laatste 18 uur van een 48-uurs incubatie en 3H-opneming werd gemeten door standaardscintillatiemethoden.Protocol: 45 1 x 106 cells / ml from each strain with or without mytogens grown in 0.2 mg RPMI-1640 (5% FCS) in 96 well microtiter plates. 1 µl H-thymidine was added to each well during the last 18 hours of a 48-hour incubation, and 3H incorporation was measured by standard scintillation methods.

*CPM: tellingen per minuut. **SI: stimuleringsindex.* CPM: counts per minute. ** SI: stimulation index.

(2) Interieukine-l-productie 50 Men kan het RDE gebruiken voor de stimulering van de productie van lymfokinen die door macrofagen worden afgegeven. Interieukine-I is een oplosbare immuunregulator, die wordt afgegeven door macrofagen en verantwoordelijk is voor de activering van lymfocyten ter plaatse van een infectie. Interleukine-I speelt een kritische rol als versterker van de immuunrespons.(2) Interieukin-1 production 50 The RDE can be used to stimulate the production of lymphokines released by macrophages. Interieukin-I is a soluble immune regulator, which is released by macrophages and is responsible for the activation of lymphocytes at the site of an infection. Interleukin-I plays a critical role in enhancing the immune response.

Murine-macrofagen werden gehecht op microtiterplaten (1 x 106/punt), waarbij elke bepaling in drievoud 55 werd gedaan. De eerste putten ontvingen 1 ml 50 pg/ml oplossing van standaaidendotoxine-extract, dat bereid was volgens de procedure van Chen et al (J. Infect. Dis 128, blz. 543 (1973)). Aan de tweede reeks putten voerde men 1 ml 50 pg/ml oplossing van RDE dat op de hierin beschreven wijze is bereid toe. Elk 192326 4 middel werd gesolubiliseerd in M 199 medium met 5% FCS (foetaal kalfsserum). 1 ml M 199 medium met 5% FCS werd aan de derde reeks putten toegevoegd, teneinde als controle te dienen.Murine macrophages were adhered to microtiter plates (1 x 106 / dot), each assay 55 made. The first wells received 1 ml 50 µg / ml solution of standard endotoxin extract prepared according to the procedure of Chen et al (J. Infect. Dis 128, 543 (1973)). To the second series of wells, 1 ml of 50 µg / ml solution of RDE prepared in the manner described herein was added. Each 192326 medium was solubilized in M 199 medium with 5% FCS (fetal calf serum). 1 ml of M 199 medium with 5% FCS was added to the third series of wells to serve as a control.

Men incubeerde de platen 20 uur bij 37°C. De bovenstaande vloeistof werd verwijderd en verdund onder verkrijging van een oplossing met 1:10 verhouding van bovenstaande vloeistof tot gedestilleerd water. Men 5 beproefde de bovenstaande vloeistof op interleukine*l productie volgens de methode van Gery, et al.,Plates were incubated at 37 ° C for 20 hours. The supernatant was removed and diluted to give a solution with a 1:10 ratio of the supernatant to distilled water. The supernatant was tested for interleukin * 1 production according to the method of Gery, et al.,

Cellular Immun. 64, 293 (1981).Cellular Immun. 64, 293 (1981).

De na verwijdering van de bovenstaande vloeistof overblijvende cellen werden gelyseerd onder gebruikmaking van 0,1% Triton X-100. De resulterende oplossing werd verdund met RPM11640 medium met 5% foetaal kalfsserum bij een verdunningsverhouding 1:10.The cells remaining after removal of the supernatant were lysed using 0.1% Triton X-100. The resulting solution was diluted with RPM11640 medium containing 5% fetal calf serum at a dilution ratio 1:10.

10 Men beproefde de verdunde oplossing op lnterteukine-l productie door meting van een verhoging van door PHA opgewekte macrofaagopneming van H1-thymidine als beschreven in Gery et al. boven. De resultaten worden getoond in tabel A.The diluted solution was tested for Intertukin-1 production by measuring an increase in PHA-induced macrophage uptake of H1-thymidine as described in Gery et al. Supra. The results are shown in Table A.

TABEL ATABLE A

15 -15 -

Proefmateriaal Bovenstaande vloeistof Lysaat (50 pg/ml) respons respons (1:10 verdunning) (1:10 verdunning) 20 Endotoxinestandaard 31.137 ±1.721 51.695 ±2.797 RDE 16.782 ± 1.295 66.178 ± 2.332Test Material Supernatant Lysate (50 pg / ml) Response Response (1:10 Dilution) (1:10 Dilution) 20 Endotoxin Standard 31,137 ± 1,721 51,695 ± 2,797 RDE 16,782 ± 1,295 66,178 ± 2,332

Controle 3.232 ±31 12.153 ±497 25 Zoals in tabel A wordt getoond overschreed de lnterieukine-l productie uit RDE dat op de hierin beschreven wijze is bereid, in de gelyseerde cellen sterk de lnterieukine-l productie uit het standaardendoxine-extract.Control 3,232 ± 31 12,153 ± 497 As shown in Table A, Interdeukin-1 production from RDE prepared in the manner described herein greatly exceeded Interieukin-1 production from the standard toxin extract in the lysed cells.

Dezelfde proef werd uitgevoerd met menselijke monocyten in plaats van murine-macrofagen.The same experiment was performed with human monocytes instead of murine macrophages.

De resultaten zijn als volgt: 30 TABEL AaThe results are as follows: 30 TABLE Aa

Proefmateriaal Bovenstaande vloeistof Lysaat (10 pg/ml) respons respons 35 (1:50 verdunning) (1:50 verdunning)Test Material Supernatant Lysate (10 pg / ml) Response Response 35 (1:50 dilution) (1:50 dilution)

Endotoxinestandaard 42.418 ±1.763 51.821 ±1.348 RDE 17.910 ±1.983 50.626 ±813Endotoxin standard 42,418 ± 1,763 51,821 ± 1,348 RDE 17,910 ± 1,983 50,626 ± 813

Controle 1.693 ± 289 15.173 ± 1.292 40 ...............................Control 1,693 ± 289 15,173 ± 1,292 40 ...............................

Macrofaagactivering RDE dat op de hierin beschreven wijze is bereid stimuleert ook macrofagen als gemeten aan het vermogen van macrofagen tot fagocytiseren (verzwelgen) van fluorescerende parels.Macrophage Activation RDE prepared in the manner described herein also stimulates macrophages as measured by the ability of macrophages to phagocytize (engulf) fluorescent beads.

45 1x10® peritoneaalexudaatcellen werden vermengd met 5 μΙ oplossing van een proefmateriaal, dat respectievelijk bestond uit standaardendotoxine, RDE dat op de hierin beschreven wijze is bereid, en zout ter controle, teneinde drie proefoplossingen te vormen. Elke oplossing bevatte 1 pg proefmateriaal en 20 μΙ suspensie van fluorescerende parels. De proefoplossingen werden op afzonderlijke microscoopglaasjes gebracht en daarna 90 minuten bij 37°C geïncubeerd.45 1x10® peritoneal exudate cells were mixed with 5 µl solution of a test material, which consisted respectively of standard toxin, RDE prepared as described herein, and salt for control, to form three test solutions. Each solution contained 1 µg of test material and 20 µl suspension of fluorescent beads. The test solutions were placed on separate microscope slides and then incubated at 37 ° C for 90 minutes.

50 Na incubatie werden de glaasjes geobserveerd onder een fluorescerende microscoop. Door visuele waarneming bepaalde men het aantal cellen, dat de fluorescerende parels gefagocytoseerd had, alsmede het aantal parels/cel.After incubation, the slides were observed under a fluorescent microscope. Visual observation determined the number of cells that phagocytosed the fluorescent beads as well as the number of beads / cell.

De fagocytische index werd berekend volgens de formule: FAGOCYTISCHE INDEX = % fagocytoserende cellen x aantal parels/100 cellen 55 1000 5 192326 en de resultaten van de twee proeven worden gegeven in tabel B.The phagocytic index was calculated according to the formula: PHAGOCYTIC INDEX =% phagocytosing cells x number of beads / 100 cells 55 1000 5 192326 and the results of the two tests are given in Table B.

TABEL BTABLE B

5 Fagocytische index*5 Phagocytic index *

Proef 1 Proef 2Trial 1 Trial 2

Endotoxinestandaard 5,0 3,6 RDE 5,4 4,1 10 Controle 1,0 0,5Endotoxin standard 5.0 3.6 RDE 5.4 4.1 10 Control 1.0 0.5

Zoals uit tabel B blijkt was de fagocytische index voor RDE dat op de hierin beschreven wijze is bereid, aanzienlijk groter dan die van standaardendotoxine, waardoor is vastgesteld, dat dit RDE een uitermate 15 potente stimulator van macrofagen is.As shown in Table B, the phagocytic index for RDE prepared in the manner described herein was significantly greater than that of standard toxin, thus establishing that this RDE is an extremely potent macrophage stimulator.

(4) Hulpwerking(4) Auxiliary operation

Teneinde het gebruik van RDE als stimulator van het immuunsysteem van warmbloedige dieren verder te onderzoeken, beproefde men RDE op hulpwerking als bepaald door zijn vermogen tot het versterken van de immuunrespons op schapenrodebloedcellen (SRBC) door meting van het vermogen van antilichamen tot het 20 lyseren van de schapenrodebloedcellen. Men bereidde drie proefmaterialen, die elk een hoeveelheid van 1 x 107 SRBC bevatte. Proefmateriaal nummer 2 bevatte bovendien 20 pg standaardendotoxine + SRBC, terwijl proefmateriaal nummer 3 20 pg RDE van de uitvinding + SRBC bevatte.In order to further investigate the use of RDE as a stimulant of the immune system of warm-blooded animals, RDE was tested for auxiliary activity as determined by its ability to enhance the immune response to sheep red blood cells (SRBC) by measuring the ability of antibodies to lyse the sheep red blood cells. Three test materials were prepared, each containing 1 x 107 SRBC. Sample No. 2 also contained 20 µg of standard toxin + SRBC, while Sample No. 3 contained 20 µg RDE of the invention + SRBC.

Het proefmateriaal werd interperitioneaal geïnjecteerd in muizen van de stam BALB/C. Na 4-5 dagen werden de proefdieren afgemaakt en werden de milten verwijderd en fijngemalen in een weefselmolen. Men 25 bereidde een standaardcellensuspensie van elke milt onder gebruikmaking van een hemocytometer en elk van de bovengenoemde suspensie werd op microscoopglaasjes gebracht samen met het doel SRBC, medium en agar.The test material was injected interperitionally into mice of the BALB / C strain. After 4-5 days, the test animals were sacrificed and the spleens removed and ground in a tissue mill. A standard cell suspension of each spleen was prepared using a hemocytometer and each of the above suspension was placed on microscope slides along with the target SRBC, medium and agar.

Men incubeerde de glaasjes 2 uur bij 37°C en bracht op elk glaasje als complementbron serum van de guinese big aan, gevolgd door 30 minuten incubatie bij 37°C.Slides were incubated for 2 hours at 37 ° C and serum was applied to each slide as complement source of guinea pig, followed by incubation at 37 ° C for 30 minutes.

30 Daarna onderzocht men de glaasjes ter bepaling van de hoeveelheid plaatvormende cellen, die gebieden zijn, waarin antilichamen de SRBC-cellen vernietigden met behulp van het complement, dat wordt aan getroffen in het serum van de guinese big.Slides were then examined to determine the amount of plate-forming cells, which are regions in which antibodies destroyed the SRBC cells using the complement found in the guinea pig serum.

De resultaten worden getoond in tabel C.The results are shown in Table C.

35 TABEL C35 TABLE C

Proefmateriaal PFC/2X105 miltcellen SRBC 88 40 SRBC + endotoxinestandaard 165 SRBC + RDE 219Test material PFC / 2X105 spleen cells SRBC 88 40 SRBC + endotoxin standard 165 SRBC + RDE 219

Zoals uit tabel C blijkt is het aantal plaatvormende cellen, dat resulteert uit het gebruik van RDE, 45 vergeleken bij standaardendotoxine aanzienlijk hoger, waaruit blijkt, dat RDE een potent hulpmiddel is.As shown in Table C, the number of plate-forming cells resulting from the use of RDE, 45, is significantly higher compared to standard toxin, showing that RDE is a potential vehicle.

Bij de bereiding van een geneesmiddel volgens de uitvinding kan een farmaceutisch aanvaardbaar medium zoals zout of een oliedruppelemulsie, worden toegepast. Het met de werkwijze van de uitvinding bereide geneesmiddel kan bijvoorbeeld worden gestabiliseerd volgens een vriesdroogmethode en daarna zonder potentieveriies worden geréconstitueerd.In the preparation of a medicament according to the invention, a pharmaceutically acceptable medium, such as salt or an oil droplet emulsion, can be used. For example, the drug prepared by the method of the invention can be stabilized by a freeze-drying method and then reconstituted without any potential differences.

50 Als boven beschreven kan men het preparaat ter behandeling van warmbloedige dieren en mensen gebruiken in de vorm van een oliedruppelemulsie. De gebruikte hoeveelheid olie bedraagt 0,5-3,0 volt%, berekend op het totale volume van het preparaat. Het verdient de voorkeur 0,75-1,5 vol% olie te gebruiken. Voorbeelden van geschikte oliën zijn lichte minerale olie, squalaan, 7-n-hexyloctadecaan, Conoco superoil en Drakeol 6 VR mineral oil (geproduceerd door Pennreco Company, Bulter, Pennsylvania).As described above, the preparation for the treatment of warm-blooded animals and humans can be used in the form of an oil droplet emulsion. The amount of oil used is 0.5-3.0 vol%, based on the total volume of the preparation. It is preferable to use 0.75-1.5 vol% oil. Examples of suitable oils are light mineral oil, squalane, 7-n-hexyloctadecane, Conoco superoil and Drakeol 6 VR mineral oil (produced by Pennreco Company, Bulter, Pennsylvania).

55 Daarna combineert men het gehomogeniseerde olie bevattende mengsel met een oppervlakte-actieve stof, die voor vermenging eventueel kan worden opgelost in een zoutoplossing. De hoeveelheid oppervlakte-actieve stof bedraagt met name 0,02-0,20 vol% en bij voorkeur 0,10-0,20 vol%, berekend op het totaleThe homogenized oil-containing mixture is then combined with a surfactant, which can optionally be dissolved in a salt solution before mixing. The amount of surfactant is in particular 0.02-0.20 vol% and preferably 0.10-0.20 vol%, based on the total

Claims

192326 6 volume van het preparaat. Men kan elke gewone oppervlakte-actieve stof gebruiken, met inbegrip van Tween-80 en Aiiacel (geproduceerd door Atlas Chemical Company). Daarna homogeniseert men het mengsel, dat resulteert na de toevoeging van oppervlakte-actieve stof tot een suspensie met een hoog percentage oliedruppels die met RDE zijn bekleed, als bepaald door 5 observatie onder een microscoop. De hoeveelheid RDE die met één injectie wordt toegediend, bedraagt 5-500 pg, bij voorkeur 10-100 pg voor een volwassen persoon van 70 kg. 1-3 injecties werden toegediend over een periode van 2 maanden. RDE dat op de hierin beschreven wijze is bereid, vertoont aanzienlijk minder pyrogene werking dan een 10 preparaat dat standaardendotoxine bevat, als blijkt uit het volgende voorbeeld. Drie konijnen van de Nieuw Zeelandstam werden geïnjecteerd (in een oorader) met een standaardendotoxine bevattend preparaat. De voor het veroorzaken van een lichaamstemperatuursverhoging van ten minste 0,46°C in 50% van de proefpopulatie benodigde hoeveelheid standaardendotoxine werd bepaald over een periode van 3 uur onder gebruikmaking van een rectaalthermometer. 15 Drie andere proefkonijnen werden ook geïnjecteerd met een RDE bevattend preparaat en men voerde dezelfde proef op pyrogene werking uit. De resultaten worden getoond in de volgende tabel D. TABEL D Pyrogeniciteit 20 - Proefmateriaal Werking bij konijn* (in pg/kg) Endotoxinestandaard 0,012 RDE 10 (dat wil zeggen geen koorts bij hoogste dosis = 10 pg) 25 - * De dosis die nodig is voor het veroorzaken van een koortsrespons van meer dan 0,46°C bij 50% van een proefpopulatie. Zoals uit tabel D blijkt, gaf standaardendotoxine een koortsrespons bij 50% van de proefdieren bij een dosis van 0,012 pg/kg. RDE gaf echter geen koortsrespons bij 10 pg/kg, wat 850 maal de dosis van standaard-30 endotoxins is.192326 6 volume of the preparation. Any ordinary surfactant can be used, including Tween-80 and Aiiacel (manufactured by Atlas Chemical Company). The mixture is then homogenized, resulting after the addition of surfactant to a suspension with a high percentage of oil droplets coated with RDE, as determined by observation under a microscope. The amount of RDE administered with one injection is 5-500 µg, preferably 10-100 µg for a 70 kg adult. 1-3 injections were administered over a 2 month period. RDE prepared in the manner described herein exhibits significantly less pyrogenic activity than a formulation containing standard toxin, as shown in the following example. Three rabbits from the New Zealand strain were injected (into an ear vein) with a standard toxin-containing preparation. The amount of standard toxin required to cause a body temperature increase of at least 0.46 ° C in 50% of the test population was determined over a 3 hour period using a rectal thermometer. Three other guinea pigs were also injected with an RDE-containing preparation and the same fumigation test was performed. The results are shown in the following table D. TABLE D Pyrogenicity 20 - Test Material Rabbit Effect * (in pg / kg) Endotoxin Standard 0.012 RDE 10 (i.e. no fever at highest dose = 10 pg) 25 - * The dose required is for causing a fever response of more than 0.46 ° C in 50% of a test population. As shown in Table D, standard toxin gave a fever response in 50% of the test animals at a dose of 0.012 pg / kg. However, RDE did not produce a fever response at 10 pg / kg, which is 850 times the dose of standard 30 endotoxins.

1. Werkwijze voor het bereiden van een geneesmiddel waarbij een gezuiverd, ontgift endotoxine samen met een drager en eventueel andere toevoegingen in een voor therapeutische toepassing geschikte toedieningsvorm wordt gebracht, met het kenmerk, dat het endotoxine wordt gezuiverd en ontgift door (a) een endotoxine-extract, verkregen uit micro-organismen van de familie Enterobacteriaciae met een anorganisch of organisch zuur te hydrolyseren, 40 (b) het gehydrolyseerde product tot ruw lipide A te vriesdrogen, (c) het ruwe lipide A te behandelen met een eerste oplosmiddel, dat vetzuren en verontreinigingen kan oplossen zonder het ruwe lipide A op te lossen, (d) het verkregen onoplosbare product op te lossen in een tweede oplosmiddel., waarin het ruwe lipide A oplosbaar is, en 45 (e) ter verkrijging van het gewenste gezuiverde ontgifte endotoxine de verkregen oplossing door een chromatografiekolom te leiden, en uit het verkregen product een geneesmiddel voor het teweegbrengen van een doeltreffende hulprespons of het stimuleren van de immuunrespons van een warmbloedig dier wordt bereid.A method for the manufacture of a medicament in which a purified, detoxified endotoxin is introduced into a dosage form suitable for therapeutic use together with a carrier and optionally other additives, characterized in that the endotoxin is purified and detoxified by (a) an endotoxin extract obtained from microorganisms of the Enterobacteriaciae family with an inorganic or organic acid, 40 (b) freeze-drying the hydrolyzed product to crude lipid A, (c) treating the crude lipid A with a first solvent, which can dissolve fatty acids and impurities without dissolving the crude lipid A, (d) dissolving the resulting insoluble product in a second solvent, in which the crude lipid A is soluble, and 45 (e) to obtain the desired purified detoxification endotoxin, pass the resulting solution through a chromatography column, and from the resulting product a drug for triggering a effective auxiliary response or stimulation of the immune response of a warm-blooded animal is prepared.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat doses van 5 tot 500 pg worden bereid.A method according to claim 1, characterized in that doses of 5 to 500 µg are prepared.