NL1033431C2 - Bepaling van kwaliteitskenmerken bij land- of tuinbouwproducten. - Google Patents

Description

Titel: Bepaling van kwaliteitskenmerken bij land- of tuinbouwproducten

De uitvinding heeft betrekking op het bepalen van merkers voor kwaliteits kenmerken en daaraan gekoppeld het bepalen van het optimale oogsttijdstip en/of het optimale postharvesttraject van land- en tuinbouwproducten door middel van moleculair biologische technieken.

5

Kwaliteitsbepaling van verse land- en tuinbouwproducten wordt steeds belangrijker voor de producenten, de handel en de afnemers. Het bewustzijn over het belang van kwaliteit neemt zienderogen toe. Strikte eisen worden gesteld ten aanzien van versheid, uiterlijk kenmerken, geur en smaak van 10 het eetbare product. Om kwaliteit zo goed mogelijk te kunnen garanderen worden door de handel zogenaamde “tracking and tracing” systemen geïntroduceerd in de productieketen. Om tegemoet te kunnen komen aan deze striktere eisen wordt het naoogsttraject geoptimaliseerd. Hierdoor veranderen de transport- en opslagcondities voortdurend. Testsystemen 15 waarmee de kwaliteitskenmerken (kwaliteitsparameters) objectief bepaald kunnen worden, zijn daarom absoluut noodzakelijk om kwaliteit vast te stellen, een verwachting over de toekomstige kwaliteit uit te spreken of de kwaliteit te verbeteren.

Kwaliteit is een combinatie van harde (goed meetbare) en zachte (moeilijker 20 meetbare en vaak ogenschijnlijk subjectieve) kwaliteitsfactoren. Zachte factoren, zoals mate van beschadiging, smaak, geur of aroma, conditie en gezondheid en gehalte aan afwijkingen (“disorders”), kunnen soms eenvoudig subjectief worden vastgesteld, maar zijn vaak moeilijk kwantificeerbaar. Harde factoren zoals kleur, zuurgraad (pH), stevigheid, 25 suikergehalte, grootte of lengte en gewicht zijn meestal goed kwantitatief te bepalen. Sommige kwaliteitsfactoren, zoals dormancy status (diepte van de rust) of ontwikkelingsstadium zijn alleen dan hard indien ze kwantitatief 1033431 2 gemeten kunnen worden op basis van bijvoorbeeld moleculaire merkers die bepalend zijn voor een specifiek stadium of een specifieke status. Zachte factoren zijn alleen dan bruikbaar indien er een kwantitatieve schaal aan gekoppeld kan worden. Dit kan bijvoorbeeld door voor de kwaliteits-5 parameter een vergelijking te maken met een aantal referenties, bijv. een referentie voor goede kwaliteit die op 100% wordt gesteld en een referentie voor slechte kwaliteit, die op 0% wordt gesteld. Een (semi)kwantitatieve schaal voor de kwaliteitswaarde van die parameter ontstaat dan door een relatieve waarde t.o.v. de referenties te bepalen. Marktwerking bepaalt 10 vervolgens welke range van waarden bij zowel zachte als harde kwaliteitsparameters acceptabel is voor die specifieke kwaliteitsparameter en dat specifieke land- of tuinbouwproduct.

Productkwaliteit wordt meestal bepaald door meer dan één kwaliteitsparameter en vaak door een groot aantal. Het is niet noodzakelijkerwijze zo 15 dat op een bepaald moment in de tijd of na een bepaalde naoogstbehandeling de waarden van de verschillende kwaliteitsparameters allemaal liggen in de optimale range die is vastgesteld voor dat product. Een optimale smaak hoeft bijvoorbeeld niet samen te gaan met een optimaal gewicht of een optimale kleur. De totale productkwaliteit is vaak een 20 compromis van alle waarden van de kwaliteitsfactoren. Productkwaliteit hangt bovendien af de gewenste afzetmarkt of van de tijd van het jaar. Een product kan lokaal worden verhandeld waardoor andere kwaliteitsfactoren van belang zijn dan wanneer het product wordt opgeslagen of wordt getransporteerd. Ook kan de range die optimaal worden geacht voor een 25 kwaliteitsparameter verschillen. Per kwaliteitsparameter is er echter een range van waarden aan te wijzen die als optimaal kan worden beschouwd voor die specifieke situatie. Het is echter niet noodzakelijk dat dit de meest optimale waarden zijn in een andere situatie aangezien meerdere kwaliteitsfactoren de totale productkwaliteit bepalen. Een bepaalde 30 kwaliteitsparameter kan in een specifieke situatie een lagere rangschikking 3 krijgt doordat in een bepaalde situatie een andere parameter belangrijker is, waardoor de meest optimale waarde voor de eerste parameter niet gerealiseerd kan worden op datzelfde moment.

Het naoogst traject heeft een grote invloed op de verschillende 5 kwaliteitsparameters. Het naoogst traject kan zeer divers zijn afhankelijk van het type land- of tuinbouwproduct, de locatie waar geproduceerd wordt en/of de locatie van de afzetmarkt. Bovendien kan het zijn dat het land- of tuinbouwproduct geoogst wordt in een bepaalde tijd van het jaar terwijl het op andere momenten in het jaar wordt afgezet, de tijdsduur van het naoogst 10 traject is dus ook wisselend. In het naoogst traject kan sprake zijn van allerlei soorten opslag, variërend van opslag bij kamertemperatuur, opslag bij verlaagde temperatuur en soms zelfs invriezen. Er kan opgeslagen of bewaard worden onder gemodificeerde gas samenstelling (“modified/controlled atmosphere storage/packaging”) er kunnen remmers 15 worden toegevoegd, zoals stoffen die de werking van bepaalde plantenhormonen tegengaan. Al deze maatregelen en condities in het naoogst traject hebben invloed op de kwaliteitsparameters van het land- of tuinbouwproduct. Bovendien kunnen voor verschillend cultivars van een land- of tuinbouwproduct verschillende kwaliteitsparameters van belang 20 zijn of kunnen de optimale waarden anders liggen.

Het optimale moment waarop een land- of tuinbouw product geoogst kan worden is sterk afhankelijk van het naoogst traject en de kwaliteitsparameter waar naar wordt gekeken. Voor een specifiek product is het optimale oogstraam (de tijdperiode waarover het geoogste product voor 25 een bepaalde kwaliteitsparameter de meest optimale waardes oplevert) in relatie tot een kwaliteitsparameter dus afhankelijk van het naoogst traject dat zal worden gekozen en de criteria die de afzetmarkt stelt. Kijkend naar totale productkwaliteit of naar een specifieke kwaliteitsparameter bestaat er dus niet zoiets als een optimaal oogstraam voor alle situaties. Het 4 optimale oogstraam moet dus van situatie tot situatie worden bepaald en ook van product (cultivar of variëteit) tot product (cultivar of variëteit).

Het is voor kwaliteitsbewaking dus essentieel dat de belangrijkste kwaliteitsparameters na afloop van het naoogsttraject voorspeld kunnen 5 worden op het moment van de oogst of gedurende het naoogsttraject. Op basis van deze verwachting kan vervolgens worden bepaald wat op een gegeven moment voor een gegeven situatie het optimale oogstraam is voor een specifiek land- of tuinbouw product.

10 Voor het specifieke product fruit worden twee typen van fruitrijping onderscheiden: fruit dat afrijpt onder het door de plant zelf geproduceerde hormoon ethyleen (climacterisch fruit) en fruit dat hier min of meer onafhankelijk van is (niet-climacterisch fruit). Echter, uit recent onderzoek blijkt dat deze indeling arbitrair is omdat sommige fruitsoorten of 15 variëteiten niet aan deze indeling voldoen en een tussenvorm innemen (Golding et al., 2005, Stewart Postharvest Review 3:5). De climacterische fruitsoorten hebben tijdens rijping een moment waarop de productie van ethyleen gaat beginnen. Het moment hier juist vóór, het pre-climacterium, is fysiologisch gezien het optimale moment van plukken. Echter, dit moment 20 valt niet noodzakelijkerwijs samen met het optimale moment voor commerciële kwaliteitsparameters zoals bijvoorbeeld afmeting van het fruit, gewenste zoetheid en kleur. Als om deze commerciële redenen een later plukmoment de voorkeur verdient, heeft dit directe gevolgen voor de bewaarkwaliteit en bewaarduur. Bij niet-climacterisch fruit bepalen 25 momenteel voornamelijk commerciële kwaliteitsparameters het plukmoment.

Na het plukken van fruit duurt het in het algemeen enige tijd voordat het fruit verkooprijp is, d.w.z. dat het fruit door de consumenten gegeten kan worden. Een groot deel van deze tijd is nodig voor het transport 30 naar een plaats waar het fruit verwerkt (bv. ingepakt) wordt en het 5 transport van daar naar de verkoopplaatsen, bijvoorbeeld de veiling en vandaar naar de detaillist. Dit is in het bijzonder het geval als het fruit van het ene werelddeel naar het andere werelddeel moet worden vervoerd, bijvoorbeeld bij tropische vruchten. Gedurende deze tijd, echter, gaat het 5 rijpingsproces door, en het komt veelvuldig voor dat hetzij het fruit overrijp is als het verkoopklaar is, of juist nog niet rijp genoeg voor de verkoop. In het eerste geval is het fruit onverkoopbaar of slechts verkoopbaar voor een lagere prijs, in het tweede geval moet het fruit worden opgeslagen tot het wel voldoende gerijpt is. In beide gevallen wordt dus economische schade 10 geleden. Het naoogst traject heeft ook veel invloed op het ontstaan van negatieve kwaliteitskenmerken bijv. afwijkingen (disorders) zoals bv “hol en bruin” of “slappe nekken” bij sommige peer cultivars.

Het juiste oogsttijdstip zal dus afhankelijk zijn van de commerciële parameters en de benodigde tijd na de oogst, die nodig is voor de verwerking 15 en transport van het fruit. Echter, de conditie van de plant (grootte, aantasting door ziekte) en de klimatologische omstandigheden tijdens de ontwikkeling van het fruit (temperatuur, hoeveelheid zonlicht), of de teeltcondities (bv mate van bemesting) zijn zowel bepalend voor de fysiologische als de commerciële parameters. Er is dus nooit een optimaal 20 oogsttijdstip te geven, dat van toepassing is op alle situaties. Daarnaast is het bepalen van het optimale oogsttijdstip van groot belang voor de teler in verband met de planning en inzet van personeel. Aangezien in sommige gevallen niet het na-oogsttraject verantwoordelijk is voor het ontstaan van afwijkingen tijdens of na bewaar, maar de voorgeschiedenis van het fruit, is 25 het van groot belang om die parameters objectief te kunnen meten.

Rijping van fruit wordt bepaald door de afbraak van chlorofyl en de ophoping van pigmenten, het zachter worden door textuurveranderingen voornamelijk door afbraak van celwanden, veranderingen in de ophoping van verschillende suikers en organische zuren, waarvan de laatste 30 voornamelijk de smaak bepalen, en productie van vluchtige stoffen, die voor 6 het aroma zorgen. Een fruit wordt als 'rijp' beoordeeld indien het op dat stadium is, waarop het een voldoende ontwikkeling heeft bereikt, zodat na oogst en behandeling daarna de kwaliteit tenminste minimaal acceptabel is voor de uiteindelijke consument (Reid, M.S., 1992, In: Peaches, Plums and 5 nectarines: Growing and Handling for Fresh Market., LaRue, J.H. en Johnson, R.S. (red.), Univ. Calif. Dept. Agricult. Nat. Resourc. Publ. Nr. 3331, 21-28). Om dit moment te bepalen en/of een uitspraak van de te verwachten kwaliteit te kunnen geven, wordt gezocht naar een geschikte rijpingsindex (maturity index). In de loop der jaren zijn verschillende, vaak 10 externe kenmerken van fruit voorgesteld om als zodanig te dienen. Crisoto beschrijft voor steenfruit het gebruik van de parameters 'afmeting en vorm', 'hardheid van het vruchtvlees', 'concentratie van oplosbare vaste stoffen’, 'zuurgraad' en 'kleur' (Crisoto, C.H., 1994, Postharvest News and Inf., 5(6):65N-68N). Voor appel noemt Herrera de kenmerken 'grondkleur', 15 'plukbaarheid', 'hardheid van het vruchtvlees', 'concentratie van oplosbare vaste stoffen', 'zetmeelgehalte', 'aantal dagen vanaf bloei', 'roodheid' en 'kleur van de zaden' (Herrera E., 1998, http://cahe.nmsu.edu/pubs/_h/h-314.html). Echter, dergelijke methoden blijken in de praktijk niet goed bruikbaar omdat de betreffende rijpingsindex niet nauwkeurig genoeg is, of 20 dat de index nauwelijks voorspellende waarde heeft ten aanzien van verwachte kwaliteit voor bepaalde fruitsoorten of variëteiten.

Van het specifieke product tulp (Tulipa gesneriana) worden in Nederland in het voorjaar de bollen geoogst (gelift) op het moment dat de diepte van de 25 rust (dormancy) optimaal wordt geacht. Indien te lang wordt gewacht met oogsten zal de grond (door regen) te nat worden, waardoor de kans op schimmel sterk toeneemt en de apparatuur niet meer het veld op kan. Het is van groot belang om exact te kunnen bepalen wat de diepte van de rust is op het moment van de oogst. Het oogstraam wordt bepaald door het moment 30 dat de rust maximaal is en kent eigenlijk slechts een einde, dat afhankelijk 7 is van de weerscondities. De kwaliteitsparameters die op het moment van oogst bepaald moet worden is in dit geval de diepte van de rust. Optimale rust zorgt voor een bepaalde bolmaat zodat maximale lengte en dikte van de bloemsteel na het naoogst traject kan worden verkregen. De bolmaat 5 verandert niet meer nadat de diepte van de rust maximaal is geworden. De kwaliteitsparameter lengte en dikte van de bloemstengel is afhankelijk van de diepte van de rust op het oogstmoment; het optimale moment en daarmee samenhangend de best mogelijke waarden voor de kwaliteit wordt bereikt indien de diepte van de rust maximaal is. Momenteel wordt het moment van 10 bruinverkleuring van het vliesje aan de buitenkant van de bol gebruikt als indicator dat de diepte van de rust maximaal is, maar dit blijkt in veel gevallen onbetrouwbaar. Een goede moleculaire merker waarmee de waarde van de kwaliteitsparameter lengte en breedte van de bloemstengel correleert en waaruit de diepte van de rust dus kan worden afgeleid is hier 15 zeer belangrijk. Het naoogst traject bij tulpenbollen bestaat in dit geval uit opslag bij hogere temperatuur totdat het groeipunt in de bol is overgegaan van de vegetatieve fase naar de generatieve fase. Vervolgens worden de bollen opgeslagen bij lagere temperatuur totdat de koude afhankelijk doorbreking van de rust volledig is bereikt. Tenslotte, vindt uitplanten van 20 de bol in potgrond en teelt (strekken van de bloemstengel gevolgd door bloei) plaats.

Moleculaire testen zijn ook gewenst om te bepalen wanneer de bol voldoende kou heeft gehad om de rust te doorbreken. Dit is het moment waarop uitgeplant kan worden. Onvoldoend rustdoorbreking door een te korte 25 koude periode geeft ook een slechtere kwaliteit. De kwaliteitsparameter maximale lengte die de bloemstengel kan bereiken is ook hier van belang. Een kortere periode van koude resulteert ook hier weer in een geringere lengte van de bloemstengel. De kwaliteitsparameter die in het laatste traject van de naoogst bepaald moet worden is de mate van rustdoorbreking. 30 De uiteindelijke kwaliteitsparameter maximale lengte (en dikte) van de 8 bloemstengel bij de tulp is dus afhankelijk van meerdere kwaliteitsparameters tijdens het naoogst traject, met als eerste de diepte van de rust tijdens de oogst, vervolgens de volledige transitie van het groeipunt in de bol van vegetatief naar generatief en tenslotte de volledige 5 doorbreking van de rust door een periode van verlaagde temperatuur.

Vergelijkbare problemen waarvoor moleculaire merkers nodig zijn treden op bij andere bol- en knolgewassen, zoals lelie, narcis, hyacint, fresia, uien, knoflook en amaryllis.

10 Voor het specifieke product snijbloemen is het moment van oogst met betrekking tot knoprijping van belang voor het bepalen van de belangrijke kwaliteitsparameter "lengte van het vaasleven". Moleculaire merkers tijdens de oogst, en met name merkers die te maken hebben met de bloemveroudering en waarvan de mate van genexpressie of de concentratie 15 eiwit correleert met de lengte van het vaasleven zijn goede kandidaten voor gebruik in een test voor de te verwachten lengte van het vaasleven. Tijdens het naoogst traject beïnvloedt de mate van stress de lengte van het vaasleven. Voor bijna alle snijbloemen, waaronder, tulp, roos, alstroemeria, iris, lelie, Dendranthema (chrysant), gerbera, anjer, fresia, Cymbidum, en 20 Gypsophila is het voorspellen van een verwachting van het vaasleven met moleculaire merkers van belang.

Voor het specifieke product sierpot- of kuipplant heeft stress een directe invloed op het niveau van het proces van bladveroudering. Bladveroudering 25 is direct gerelateerd aan de mate van bladvergeling. In het geval van potplanten is de oogst meestal niet hetzelfde als oogst van bijvoorbeeld fruit, tenzij dit gebeurt door te stekken, maar wordt de oogst gekenmerkt door het weghalen van de plant uit bv de kas en het transport naar bijvoorbeeld de veiling. Voor bijna alle pot- en kuipplanten, waaronder, Pelargonium, 30 Petunia, Dendranthema (chrysant), ficus, kalanchoë, Dracaena, 9

Phalaenopsis, Hedera, Begonia, Spathiphyllum, Hydrangia en Euphorbia is het van belang om met behulp van moleculaire merkers de (aan stress gerelateerde) kwaliteit te kunnen meten.

5 Voor het specifieke product komkommer hebben het rijpingstadium en stress beide een negatief effect op de kwaliteit van de komkommer. Een van de (negatieve) kwaliteitsfactoren voor komkommer is het geel worden van de komkommer. Ook voor andere groentegewassen is een dergelijke verwachting van de kwaliteit van zeer groot belang, bijvoorbeeld bij sla, 10 andijvie, prei, koolsoorten zoals broccoli, bloemkool, Chinese, rode en ander koolsoorten en lof. Voor groentegewassen die in gesneden vorm al of niet voorverpakt worden verkocht is het tevens van belang om na het snijden het effect van stress op de veroudering te kunnen meten via moleculaire merkers om zo de kwaliteit van het gesneden product te kunnen monitoren. 15

Voor het specifieke product druif is de samenstelling van de stoffen die op een bepaald moment in de druif worden geproduceerd van groot belang voor de kwaliteit van het product (wijn, port, champagne en dergelijke). De kwaliteitsparameter smaak van bijvoorbeeld port kan worden 20 gekwantificeerd via bijvoorbeeld een smaakpanel. Correlatie van smaak met het niveau van moleculaire merkers op het moment van de oogst, of tijdens het naoogst traject is van belang om de kwaliteit van het eindproduct al in een vroegtijdig stadium te onderkennen. Dit geldt ook voor andere gewassen, zoals kruiden en specerijen, bepaalde soorten bessen, bv. olijven 25 en jeneverbes en andere land- tuinbouwproducten waar de aanwezigheid van componenten die smaakbepalend zijn via moleculaire merkers vastgesteld kan worden zodat de smaakkwaliteit van het uiteindelijke product voorspeld kan worden.

30 10 - Moleculair-biologische technieken zoals genoom- en transcriptoomanalyse zijn in de laatste jaren op grote schaal gebruikt om allerlei processen die een rol spelen bij productkwaliteit te onderzoeken. Zo zijn bijv. processen die bij rijping van fruit betrokken zijn verder onderzocht 5 en men heeft getracht de enzymen die daarbij een rol spelen te identificeren (zie o.a. Golding J.B. et al., 2005, Brummell, D.A., 2005, en Owino, W.O. et al., 2005, allen in: Stewart Postharvest Review 3:5). De in bovenstaande overzichtsartikelen besproken resultaten zijn voornamelijk gebruikt om de verschillende processen, waaronder het rijpingsproces te beïnvloeden, bv.

10 door transgene planten te maken met overexpressie of geblokkeerde expressie van bepaalde genen die coderen voor enzymen die een rol zouden spelen bij het proces. Echter tot op heden worden moleculair-biologische technieken nog niet gebruikt om de verwachte waarde van een kwaliteitsparameter te voorspellen of het optimale oogstraam vast te stellen 15 voor een gegeven situatie.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze die nodig is om moleculaire merkers, genen of eiwitten, waarvoor de waarde van respectievelijk de genactiviteit of de eiwitconcentratie op een bepaald 20 moment tijdens de oogst of het naoogst traject correleert met een specifieke kwaliteitsparameter op een gegeven moment, te identificeren en te isoleren en de werkwijze om na meting van de waarde van deze merker tijdens de oogst of tijdens het naoogst traject de waarde van de kwaliteitsparameter tijdens de oogst, het naoogst traject of aan het eind van het naoogst traject 25 de verwachting voor een specifieke situatie te voorspellen.

Omschrijving van de Figuren

Fig. 1 Verloop van de rijping in de tijd bij peer cv. Bon Chretien in vijf boomgaarden. In de grafiek is een gemiddelde waarde voor de totaliteit 11 van de gebruikte merkers (βχγΐ, PG en peroxidase 424/87) afgezet tegen de tijd in dagen.

Fig. 2 a. Correlatie van genexpressie van marker 1 (PG1) tijdens oogst en de hardheid op het afzetgebied voor peer cv. Bon Cretien. b.

5 Correlatie genexpressie marker 6 (424/87) na afloop van korte opslag en hardheid op afzetgebied. Op de x-as staat de hardheid aan het eind van de opslag (de druk in N/m2, die nodig is om het fruit in te drukken) en op de y-as logaritmisch het expressie niveau van de merker. De verticale lijn geeft de grenswaarde aan van de hardheid, die nog acceptabel is voor de bedoelde 10 afzetmarkt.

Fig. 3. a. Correlatie genexpressie merker 6 (βχγΐ) tijdens oogst en hardheid op afzetgebied voor peer cv. Forelle. b. Correlatie genexpressie merker 1 (PG1) na afloop korte opslag en hardheid op afzetgebied. Op de x-as staat de hardheid aan het eind van de opslag en op de y-as logaritmisch 15 het expressie niveau van de merker.

Fig. 4 Verloop van de rijping in de tijd bij appel cv. Granny Smith in vijf boomgaarden. In de grafiek is een gemiddelde waarde voor de totaliteit van de gebruikte merkers $xyl en PG) afgezet tegen de tijd in dagen.

20 Fig. 5 a. Correlatie genexpressie βxyl tijdens oogst en hardheid op afzetgebied voor appel cv. Granny Smith, b. Correlatie genexpressie βxyl na afloop korte opslag en hardheid op afzetgebied. Op de x-as staat de hardheid aan het eind van de opslag en op de y-as logaritmisch het expressie niveau van de merker.

25 Fig. 6 Verloop van de rijping in de tijd bij appel cv. Golden

Delicious in vijf boomgaarden. In de grafiek is een gemiddelde waarde voor de totaliteit van de gebruikte merkers $xyl en PG) afgezet tegen de tijd in dagen.

12

Fig. 7 Correlatie genexpressie merker M8 (actine) na afloop korte opslag en hardheid op afzetgebied. Op de x-as staat de hardheid aan het eind van de opslag en op de y-as logaritmisch het expressie niveau van de merker. De verticale lijn geeft de grenswaarde aan van de hardheid, die nog 5 acceptabel is voor de bedoelde afzetmarkt.

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding

Onderstaand wordt de uitvinding in detail toegelicht voor het 10 bepalen van de verwachting (c.q. voorspellen) van de rijping en/of het oogstmoment van fruit, in het bijzonder appel en peer. De algemene technologie is uiteraard ook bruikbaar voor het bepalen van merkers voor kwaliteitskenmerken en daaraan gekoppeld het bepalen van het optimale oogsttijdstip van land- en tuinbouwproducten anders dan fruit.

15 Rijping van fruit is een proces waarbij het chlorofyl wordt afgebroken en zich pigmenten gaan vormen, waarbij het fruit zijn hardheid verliest, waarbij suikers ontstaan en organische zuren en waarbij vluchtige aromastoffen worden gevormd. Deze activiteiten noodzaken een aanschakelen of uitschakelen van bepaalde biochemische processen in de 20 cellen van het fruit. Een van de meest bestudeerde veranderingen in het metabolisme is de productie en de effecten van ethyleen, dat voornamelijk bij climacterisch fruit (bv. tomaat, meloen, appel, avocado, kiwi en banaan) een rol speelt. Ethyleen is bij deze vruchten vereist voor de rijping omdat het werkt als hormoon dat transcriptiefactoren kan activeren, die op hun 25 beurt genexpressie in de cel beïnvloeden (zgn. ethyleen signalering route).

Het blijkt onder meer uit de huidige uitvinding, echter, dat onder andere genen, die te maken hebben met de textuur van het fruit, in beginsel een geschikte parameter zouden kunnen zijn voor het bepalen van de verwachting van de rijpheid en het juiste plukmoment voor fruit. Echter, uit 30 de hiervoor geciteerde literatuur en uit de hieronder gepresenteerde 13 voorbeelden kan worden geconcludeerd dat het de voorkeur verdient om gedurende de rijping van het fruit meerdere rijpingsindices te onderzoeken. Genen, die betrokken zijn bij hardheidsveranderingen van het fruit en die kandidaat zijn om te worden onderzocht zijn onder andere: β-xylosidase 5 (pxyl), polygalacturonidase I en II (PGI en PGII), putative celwandperoxidase 424/87 (87), Xyloglucan endotransglycosylase (XET), actine merker M8, expansine en glucanases zoals endo-P-l,4-glucanase, NADP-dependent D-sorbitol-6-phosphate dehydrogenase en/of alpha amylase.

10 Essentie van de uitvinding is nu om eerst voor elke variëteit een ijklijn te ontwikkelen, waarbij de expressie van de bovengenoemde genen (in verband met de rijpheid van fruit) of andere genen (in verband met andere hierboven genoemde kwaliteitsparameters) wordt vervolgd in de loop van het rijpingsproces. Hierbij kan worden bepaald welke van de 15 bovengenoemde genen de beste correlatie hebben met een kwaliteitskenmerk na afloop van dit traject, met andere woorden, welke genen het beste bepalend zullen zijn voor de verwachting m.b.t. de waarde van dit kwaliteitskenmerk. Het blijkt, dat gedurende de rijping - in ieder geval bij sommige van de geteste fruitvariëteiten - zoals getoond in de 20 voorbeelden, verschillende genen op een gegeven moment de beste correlatie geven met in dit geval het kwaliteitskenmerk hardheid.

Bepalen van expressie profielen van genen en eiwitten.

Belangrijk voor het verkrijgen van een betrouwbare resultaten en tests is 25 dat de monstername op een reproduceerbare wijze plaatsvindt.

Het "bepalen van een expressieprofiel" van genen wordt hierin gebruikt als gebruikelijk in het veld van de techniek en heeft betrekking op een werkwijze voor het meten van de transcriptionele status (mRNA) of de translationele status (eiwit) van een of meerdere genen in een cel. Voor de 14 mRNA en eiwit isolatie uit planten kan gebruik worden gemaakt van beschikbare standaard protocollen. In een aantal gevallen zullen die kleine aanpassingen behoeven indien het weefsel een erg dikke celwand heeft of erg veel suikers bevat. Deze protocollen en aanpassingen behoren tot de 5 kennis van de vakman. Afhankelijk van de gebruikte werkwijze kunnen zulke metingen een genoombrede bepaling van expressie inhouden, maar ook de meting van slechts het expressieprofïel van enkele genen, hetgeen het totstandkoming van een "gen expressie profiel" of een "expressieprofiel" tot gevolg heeft, welke termen hieronder als zodanig zullen worden 10 gebruikt. Een "expressieprofiel" omvat een of meer waarden die betrekking hebben op een meting van de relatieve aanwezigheid van een genexpressie product. Zulke waarden omvatten metingen van RNA niveaus of eiwitconcentraties. Dus kan het expressieprofiel waarden omvatten, die de meting van de transcriptionele status of de translationele status van het gen 15 weergeven. Met betrekking hiertoe wordt verwezen naar VS Octr. Nrs. 6.040.138, 5.800.992, 6.020.135, 6.344.316 en 6.033.860.

De transcriptionele status van een monster omvat de identiteit en het relatieve voorkomen van de RNAs, in het bijzonder mRNAs, die in het monster aanwezig zijn. Bij voorkeur wordt een voldoende aantal genen 20 gemeten om de transcriptionele status van het monster te bepalen. De transcriptionele status kan ook geschikt worden bepaald door de aanwezigheid van transcript te meten via elk van de bestaande genexpressie technologieën.

De translationele status omvat de identiteit en het relatieve voorkomen van 25 de samenstellende eiwitten in het monster. Ook hier kan volstaan worden met een voldoende aantal eiwitten om de translationele status van het monster te bepalen. Zoals bekend is aan de vakmensen zijn de transcriptionele status en de translationele status vaak gecorreleerd.

Elke waarde in de expressieprofielen, zoals bepaald en gemeten in de 30 onderhavige uitvinding is een meting die de absolute of relatieve expressie 15 voorstelt van een gen. De expressieniveaus van deze genen kunnen via elke in het veld bekende methode voor het bepalen van het niveau van een RNA of en eiwit in een monster worden bepaald. Als eerste zullen de expressie profielen van een grote hoeveelheid genen dienen te worden geanalyseerd.

5 Technieken die hiervoor gebruikt kunnen worden zijn directe sequencing: zoals transcriptome sequencing (Roche & 454 Sequencing); digitale profielen met Clonal Single Molecule Array™ (Solexa); elektronische Northern wordt gebruikt voor het berekenen van gen expressie niveaus in verschillende monsters, en is gebaseerd op het aantal sequenties voor een bepaald gen die 10 zijn geïdentificeerd in een set van cDNA bibliotheken. Variaties hierop zijn Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), Tandem Array Ligation of Expressed Sequence Tags (TALEST) en cDNA AFLP (amplified fragment length polymorphism), die allen de detectie van differentieel tot expressie komen transcripten mogelijk maken.

15 Daarnaast zijn er technieken om met hybridisatie de aanwezigheid van transcripten te bepalen zoals micro-arrays. Een dergelijk micro-array kan een DNA array, een oligonucleotide array of, in algemene termen, een nucleïnezuur array zijn. De vakman zal in staat zijn om arrays naar eigen ontwerp en daarbij behorende array uitleesapparatuur te verkrijgen bij 20 daarin gespecialiseerde toeleveranciers (bijvoorbeeld Affymetrix Corp.,

Santa Clara, CA, USA).

Voor het monitoren van een kleiner aantal transcripten kan gebruik worden gemaakt van: Northern analyse, dit is een van de standaard technieken voor de detectie en kwantificeren van mRNA niveaus. Met deze techniek kunnen 25 de grootte van het mRNA en eventuele alternatieve splicing en multigene families worden gedetecteerd. Met reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) analyse is het mogelijk om zeer gevoelig mRNA moleculen te detecteren omdat er exponentiële amplificatie van de transcripten plaatsvindt, deze techniek wordt ook wel kwantitatieve PCR 30 genoemd. Deze techniek is met name geschikt voor het zeer nauwkeurig 16 kwantificeren van mRNA transcripten. Omdat met deze techniek zeer grote aantallen monsters te analyseren zijn en deze techniek ook te automatiseren is (Applied Biosystems 7900HT system, Foster City, USA), verdient dit op dit moment de voorkeur voor het analyseren van 5 transcripten. Daarnaast zijn ook andere technologie platformen te gebruiken zoals bijvoorbeeld de PAMChip® (Pamgene, Den Bosch, Nederland) of de BioTrove OpenArray™ technologie (BioTrove Inc., Woburn, USA). De kennis over het bedienen van de betreffende platformen kan ook door de fabrikant worden geleverd indien de vakman onbekend is met een 10 specifiek platform.

Relatieve transcriptieniveaus worden berekend met betrekking tot geschikte controles, die in het monster aanwezig zijn. Dergelijke controles zijn bijvoorbeeld genen die constitutief tot expressie komen, zoals bv. bepaalde 'house-keeping' enzymen. Bijzonder de voorkeur genieten de 15 constitutieve merkers fosfoglyceraatkinase (PGK, EC 2.7.2.3) of elongatiefactor la (eFla), zie ook de voorbeelden.

Daarnaast kunnen expressie profielen bepaald worden aan de hand van eiwit profielen. Ook hier zullen in eerste instantie voor de detectie technieken worden toe gepast waarmee zeer veel eiwitprofielen tegelijkertijd 20 kunnen worden bestudeerd. Een voorbeelden hiervan is gelelectroforese. Hierbij worden eiwitten in eerste instantie op basis van hun molecuulgewicht gescheiden. Eventueel kan hierna een tweede scheiding plaatsvinden voor een tweede dimensie (2D) op basis van het isolektrisch punt van de eiwitten (pH gradiënt). Vervolgens kan van differentieel tot 25 expressie komende eiwitten de aminozuursequentie worden bepaald met behulp van massaspectrografie. Een andere techniek om veel eiwitten tegelijkertijd te bekijken is het gebruik van de zogenaamde eiwit arrays (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, USA), waarbij van zeer veel verschillende eiwitten en eiwitpeptiden de hoeveelheid gekwantificeerd kan 30 worden. Ook hier kan met behulp van massaspectrografie de 17 aminozuursequentie van de eiwitten bepaald worden. In deze uitvoeringsvorm worden de waarden in het expressieprofiel verkregen door de concentratie van de eiwitproducten van de merkergenen te meten. De concentratie van deze eiwitproducten kan worden bepaald door, 5 bijvoorbeeld, specifieke antilichamen voor deze eiwitproducten te gebruiken. De term "antilichaam", zoals hierin gebruikt, heeft betrekking op een immunoglobuline molecuul of immunologisch actief deel daarvan, d.w.z. een antigen bindend gedeelte. Voorbeelden van immunologische actieve gedeelten van immunoglobuline moleculen zijn bijvoorbeeld F(ab) en F(ab')2 10 fragmenten, die kunnen worden gegenereerd door het antilichaam met en enzym zoals pepsine te behandelen. Het antilichaam kan een polyklonaal, monoklonaal, recombinant en bijvoorbeeld een chimeer of 'single-chain' antilichaam zijn. Detectie van het genproduct wordt makkelijker gemaakt door het antilichaam te koppelen aan een detecteerbare stof (d.w.z. het 15 labelen van het antilichaam). Voorbeelden van detecteerbare stoffen zijn onder meer verscheidene enzymen, prosthetische groepen, fluorescente materialen, luminiscente materialen, bioluminescente materialen en radioactieve materialen. Voorbeelden van geschikte enzymen zijn onder meer mierikswortel peroxidase, alkalische fosfatase, β-galactosidase en 20 acetylcholinesterase; voorbeelden van geschikte prosthetische groepen zijn onder meer streptavidine, of avidine en biotine; voorbeelden van geschikte fluorescente materialen zijn onder meer umbelliferon, fluoresceïne, fluoresceïne isothiocyanaat, rhodamine, dichloortriazinylamine fluoresceïne, dansylchloride en fycoerythrine; een voorbeeld van een luminscent 25 materiaal is onder andere luminol; voorbeelden van bioluminescente materialen zijn onder meer luciferase, luciferine en aequorine; en voorbeelden van geschikte radioactieve materialen zijn onder andere 125I, 131I, ass en 3H.

Op dit moment vindt de detectie van eiwitten meestal plaats met behulp 30 van antilichamen en zijn er verschillende detectie systemen hiervoor 18 beschikbaar zoals laterale flow assays, maar ook detectie apparatuur die gebruik maakt van chemoluminiscentie zoals de GeneGnome (Syngene, Cambridge, Groot Brittanie). Ook is het mogelijk de directe interactie tussen antilichaam en eiwit te meten met bijvoorbeeld de Biacore™ (Biacore 5 AB Corp., Uppsala, Sweden) of de IBIS iSPR (IBIS technologies, Hengelo, Nederland) of paramagnetische bolletjes (Europees Octr. Applic. Nr. 20040744572). Afhankelijk het aantal eiwit markers kan het beste detectie platform worden gekozen door de vakman. De kennis over het bedienen van de betreffende platformen kan ook door de fabrikant worden geleverd indien 10 de vakman onbekend is met een specifiek platform.

In principe kan voor elk kwaliteitskenmerk dat objectief kan worden vastgesteld een ijklijn gemaakt worden waarop de expressie van markers (mRNA of eiwit) kan worden uitgezet tegen het kwaliteitskenmerk. Dit kan 15 zowel voor, tijdens als na de oogst gebeuren. Op grond van de correlatie van de merkers met het kenmerk wordt voor een bepaalde periode bepaald welke merker(s) het meest correleert (en dus het meest betrouwbaar is als voorspeller). Kwaliteitskenmerken waar bijvoorbeeld aan gedacht kan worden zijn: hardheid van fruit, rustdoorbreking bij bolgewassen en 20 vaasleven bij snijbloemen en andere in de inleidinggenoemde parameters. Het is uiteraard zaak, om de omstandigheden voor en na de oogst zoveel mogelijk gelijk te houden aan de omstandigheden zoals die ook later zullen worden gebruikt. Het valt bijvoorbeeld in te zien dat een ijklijn die gemaakt is bij opslag van fruit bij 4°C niet hetzelfde zal zijn als de ijklijn van fruit dat 25 bij 20°C of kamertemperatuur wordt bewaard. Een ijklijn gemaakt bij 4°C kan echter wel gebruikt worden om een voorspelling te doen voor de verwachte afrijping van fruit bij andere temperaturen, omdat de gemeten expressie de mate van rijping aangeeft. Onnauwkeurigheid wordt dan veroorzaakt doordat het uit de ijklijn niet af te leiden valt hoe lang de opslag 30 onder die andere omstandigheden nog nodig is (omdat de snelheid van 19 afrijping anders is). Een ijklijn die specifiek is voor een bepaalde situatie verdient derhalve de voorkeur. Vervolgens moet de ijklijn aangeven wanneer verwacht mag worden dat een product aan een gegeven kwaliteitscriterium zal voldoen. Dit kan bijvoorbeeld betekenen dat de 5 merkers een verwachting geven over de tijdsperiode dat fruit gekoeld opgeslagen kan worden, of hoelang bollen nog koude nodig zullen hebben voordat hun rust wordt doorbroken. Het is uiteraard zaak om op het moment dat de monsters zich nog niet in een gecontroleerde omgeving bevinden, regelmatig een monster te nemen en het expressieprofiel te 10 bepalen om de verwachting bij te stellen en te optimaliseren. Het kan namelijk zijn dat de monsters zich sneller of juist langzamer ontwikkelen op basis van de omstandigheden. In feite zou een op de nieuwe situatie gebaseerde ijklijn steiler of vlakker worden. Het valt in te zien, dat een ijklijn die is gemaakt op basis van een fruitrijping in een hete, droge zomer 15 niet een nauwkeurige voorspelling zal geven voor de te verwachten duur van de rijping in een koele, natte zomer. Echter, omdat - zoals ook al gezegd bij de variaties in de omstandigheden bij opslag - de gemeten expressiewaarden wel de rijpheidstoestand van het fruit aangeven, zal op grond van een vergelijking met de ijklijn toch kunnen worden bepaald of het 20 fruit oogstrijp is.

Zoals ook al uit de voorbeelden blijkt zijn voor bepaalde kwaliteitskenmerken reeds ijklijnen gemaakt.

Bij snijbloemen kan via een combinatie van een merker voor 25 bloemsenescentie en een merker voor de mate van stress, die beide correleren met de lengte van het vaasleven tijdens het naoogst traject de lengte van het vaasleven worden voorspeld. Hiervoor kunnen een cysteine protease en een GDSL-motief lipase worden gebruikt.

Zoals boven aangegeven is bij sierpotplanten bladvergeling een belangrijke 30 kwaliteitsparameter. Tijdens de oogst of tijdens het naoogst traject kan deze 20 negatieve kwaliteitsparameter (die direct afhankelijk is aan de ouderdom van het blad) worden voorspeld door merkers die betrokken zijn bij het proces van bladveroudering, die correleren met de mate van bladvergeling, eventueel in combinatie met merkers met een hogere expressie in oudere 5 dan jongere bladeren en die correleren met de mate bladvergeling. De kwaliteitsparameter "geel worden" bij komkommer kan op een vergelijkbare manier als bij potplanten door moleculaire merkers tijdens de oogst of tijdens het naoogst traject worden voorspeld.

Op een dergelijke manier kan bij druiven, indien aan de smaak een waarde 10 voor de kwaliteit gehangen kan worden die reproduceerbaar is, de smaak worden voorspeld tijdens de oogst of het naoogst traject door gebruik te maken van een combinatie van merkers die betrokken zijn bij de biosynthese van smaakcomponenten en waarvan de genexpressie correleert met de mate van smaak.

15

Naast de in de voorbeelden genoemde fruitsoorten appel en peer is de onderhavige uitvinding van het bepalen van merkers van de rijpheid en oogstmoment en het voorspellen van de te verwachten kwaliteitskenmerken van toepassing op alle fruitsoorten waarvoor het oogstmoment en de duur 20 van de narijping belangrijke factoren zijn voor de consumeerbaarheid en de economische omstandigheden omtrent het beschikbaar maken van het fruit (transport, opslag). Naast appel en peer kan daarom de uitvinding geschikt worden gebruikt bij de volgende fruitsoorten: citrusvruchten zoals sinasappel, mandarijn, citroen en minneola, meloen, tomaat, perzik, 25 nectarine, pruim, druif, aalbes, kruisbes, braam, framboos, kers, ananas, mango, kiwi, lychee, banaan, papaja, paprika, dadels, kokosnoot en avocado, inclusief alle variëteiten en cultivars daarvan

Daarnaast is de uitvinding van toepassing op alle land- en tuinbouwproducten, waarvan de kwaliteit voor een groot gedeelte wordt 30 bepaald door het moment van het oogst en het na-oogsttraject. Voorbeelden 21 van gewassen die hieraan voldoen zijn de reeds in de inleiding genoemde snijbloemen, sierpotplanten, bolgewassen en komkommers, maar verder ook voor vrijwel alle andere soorten groenten en graan, zoals bv. sla, tomaat, aardappel, alfalfa, asperge, tapioca, yam, alle koolsoorten (bloemkool, 5 boerenkool, spruiten, savooiekool, spitskool, e.d.), witlof, worteltjes, winterpeen, peulvruchten, tarwe, maïs, rijst, haver, gerst en planten, die als kruid worden gebruikt, bv. peper, dille, kervel, rozemarijn, enz. Tevens is de uitvinding van toepassing op gewassen die niet op zichzelf geconsumeerd worden, maar gebruikt worden voor de productie van in de handel 10 belangrijke producten, zoals bv. vruchten van de olie palm, olijven, suikerriet, suikerbiet, zonnebloemen, sojabonen, koffiebonen, cacaobonen, houtproducerende planten, en alle gewassen zoals vermeld op de website van de Voedsel en Landbouw Organisatie (FAO) van de Vereenigde Naties (httn://www.fao.org/ en http://faostat.fao.orgA 15

Praktische applicatie van het testen van merkers in monsters.

Merkers kunnen getest worden in een applicatie lab (off-site) of onsite in een simpele (lab)omgeving.

Bij het verzenden van monsters naar een applicatie lab bestaan 20 diverse mogelijkheden. Een eerste mogelijkheid is dat de monsters volledig intact naar het applicatielab worden gebracht. Dit kan bijvoorbeeld met (intact) fruit. Zolang de transportcondities niet extreem zijn (temperatuurverschillen, druk op monsters etc.) zal het transport geen invloed hebben op de uitkomst van de testen. Na aankomst op het applicatie 25 lab moeten de monsters zo snel mogelijk worden gefixeerd, bijvoorbeeld door invriezen in vloeibare stikstof of meteen worden opgewerkt voor verder analyse. Bij grote aantallen monsters kan de bemonstering, extractie en detectie gerobotiseerd worden

De tweede mogelijkheid wordt gevormd door het op locatie testen van 30 monsters. Hierbij zal het aantal stappen en de complexiteit van de 22 handelingen beperkt moeten zijn, opdat de test door minder getrainde mensen uitgevoerd kan worden. Bij de eerste stap zal het monster genomen moeten worden. In sommige gevallen zal dat het hele product kunnen betreffen, maar in de meeste gevallen zal het om een deel van het product 5 gaan. In het geval van een gedeelte van het product moet dit deel wel representatief voor het hele product zijn. Zo kan gekozen worden voor bijvoorbeeld een deel van het vruchtvlees of een deel van het blad of de bloem. Zo kan er bij fruit een stukje schil of een blokje vruchtvlees genomen worden om de test op te doen. Indien een test betrekking moet hebben op de 10 kwaliteit van een hele batch van het betreffende product, dan dient een representatieve steekproef uit de batch genomen te worden. De grootte van de steekproef in relatie tot de grootte van de batch bepaalt dan de betrouwbaarheid. Voor het bepalen van de steekproefgrootte die nodig is om een bepaalde betrouwbaarheid te realiseren zijn uit de vakliteratuur 15 statische berekenmethoden te halen. Op basis van de steekproef kan daarna een mengmonster worden gemaakt of er kunnen diverse testen op elk productmonster worden genomen. Via het afzonderlijk bepalen van elk monster is het dan ook mogelijk om de spreiding in de batch te bepalen. Daarna zal het materiaal gefixeerd en geëxtraheerd moeten worden. Dit kan 20 gebeuren door malen, persen of disruptie van de celwand in combinatie met chemicaliën (bv buffers), die ervoor zorgen dat de markers in het monster niet worden afgebroken. Dit kan bijvoorbeeld FTA papier (Whatman International Ltd., Engeland) zijn, maar ook buffers met proteinase of RNAse remmers. De keuze hiervoor zal afhangen van het type monster en 25 kan door de vakman gemaakt worden. Voor eiwit markers zullen in het algemeen andere materialen nodig zijn dan voor RNA markers. In sommige gevallen zal er eerst een zuivering van de markers moeten plaats vinden, in andere gevallen zal direct detectie van de markers mogelijk zijn. Heel geschikt voor snelle detectie van eiwitten zijn laterale flowtesten, die met 30 behulp van antilichamen tegen de te detecteren eiwitten zijn gericht 23 (GenScript Corp. Piscataway, NJ, VS; BioGenenes GmbH Berlijn,

Duitsland), Deze testen kunnen gemakkelijk gemaakt worden (Whatman International Ltd., Engeland) en deze technologie wordt al in ruime mate commercieel toegepast, bijvoorbeeld in de voor de ‘consument’ verkrijgbare 5 zwangerschapstesten.

De uitvinding, in een andere uitvoeringsvorm, omvat ook kits voor het detecteren en voorspellen van de te verwachten kwaliteitkenmerken bij fruit, bijvoorbeeld de hardheid van fruit, c.q. het voorspellen van het te 10 verwachten oogstraam of het bepalen van het geschikte plukmoment van het fruit. Een dergelijke kit zal specifiek zijn voor een bepaalde variëteit fruit en middelen bevatten voor de kwantitatieve detectie van de voor die variëteit fruit vooraf bepaalde genen die voorspellend zijn voor de te verwachten waarde van het kwaliteitmerk, tezamen met ijklijnen van het 15 expressiepatroon van die corresponderende genen voor die bepaalde fruitvariëteit, zodat het gemeten expressiepatroon kan worden vergeleken met de ijklijnen en op grond daarvan een voorspelling kan worden gedaan van de te verwachte overblijvende rijpingstijd en van daaruit ook een voorspelling kan worden gedaan voor het te verwachten plukmoment. Deze 20 ijklijnen kunnen ook inbegrepen zijn in een geautomatiseerd systeem, zodat automatisch de waarden die door de meting van het expressieprofiel worden gegenereerd worden afgezet op deze ijklijnen en als uitkomst wordt de voorspelling van de verwachte waarde van het kwaliteitskenmerk gegeven. Dit gehele proces, inclusief de meting van het expressieprofiel zelf kan in 25 een geautomatiseerd systeem plaatsvinden. Dit geautomatiseerd systeem omvat dan de volgende elementen: a) middelen voor de meting van de expressie van een aantal voor de bepaling van bv voor de hardheid van fruit belangrijke en/of hiermee correlerende genen in een of meer bepaalde fruitvariëteiten, zoals β-30 xylosidase (Pxyl), polygalaturonidase I en II (PGI en PGII), peroxidase 24 424/87 (87), Xyloglucan endotransglycosylase (XET), expansin en glucanases zoals endo-P-l,4-glucanase, NADP-dependent D-sorbitol-6-phosphate dehydrogenase, alfa amylase; b) middelen voor de meting van de expressie van controle genen, zoals 5 bijvoorbeeld house-keeping enzymen, zoals fosfofglyceraatkinase (PGK) of elongatiefactor lalfa (eFla) of andere daarvoor geschikte genen, zoals bijvoorbeeld beschreven in Nicot et al., J. Exp. Botany, 56:2907-2914, 2005. Al deze genen moeten (kunnen) meegenomen worden bij het bepalen van het expressie patroon. Als een van deze genen eenzelfde expressie niveau heeft 10 in alle geteste monsters is dat gen geschikt als constitutief gen.

c) middelen voor het bepalen van het (relatieve) expressieprofiel van de onder a) genoemde genen; d) een of meerdere ijklijnen die de correlatie weergeven van de expressieprofielen van een of meer van de onder a) genoemde genen en de 15 hardheid/rijping van genoemde een of meerdere fruitvariëteiten; en e) middelen om de gemeten expressieprofielen van de een of meerdere fruitvariëteiten te interpreteren met betrekking tot de daarbij horende ijklijn(en) en op grond daarvan een indicatie af te geven omtrent de rijpheid van de een of meerdere fruitvariëteiten, welke indicatie tevens een indicatie 20 inhoudt van de tijd die nodig is tot volledige rijping en/of tot het optimale oogstmoment.

In een dergelijk geautomatiseerd systeem kunnen dus meerdere ijklijnen beschikbaar zijn, zodat het systeem voor meerdere fruitvariëteiten te gebruiken is zonder dat steeds de juiste ijklijn dient te worden 'geladen'.

25 Een bijkomende mogelijkheid is, dat de gebruiker het systeem ook kan voorzien van gegevens, die specifiek zijn voor de omstandigheden na de oogst van het betreffende fruit, zoals bv. de tijd dat het fruit lokaal wordt opgeslagen, de duur van transport, etc. zodat het systeem ook flexibel kan zijn voor wat betreft die gegevens.

30 25

Op basis van de beschreven methode kan ook een testkit worden ontwikkeld voor het verwachten of bepalen van de waarde van een specifiek kwaliteitskenmerk voor een specifiek land- of tuinbouwproduct. Hiervoor moeten de volgende merkers beschikbaar zijn: minimaal twee merkers, 5 waarbij bij voorkeur een van de twee een constitutieve merker is (waarmee de absolute expressie herleid kan worden). De relatie tussen de merker(s) en de eigenschap is vastgelegd in een model (ijklijn). Dit model beschrijft de verschillende expressieniveaus van merkers in de tijd. Het model kan onder andere in een computerprogramma gebruikt worden om de bepaalde 10 expressieniveaus te correleren aan de kwaliteit/eigenschap van het monster. De kwantificering van de mRNA (genexpressie) niveaus kan plaatsvinden met bijvoorbeeld kwantitatieve PCR (Applied Biosystems, VS). De kwantificering van eiwitten kan plaatsvinden met behulp van antilichamen in bijvoorbeeld een laterale flow immunobepaling. De gemeten data kunnen 15 vervolgens in het computermodel worden ingevoerd (al dan niet automatisch), waarbij vervolgens de uitslag van de test wordt gegenereerd. Deze uitslag kan vervolgens al dan niet elektronisch worden getoond.

VOORBEELDEN

20

Huishoudgenen welke gebruikt kunnen worden als constitutieve genen/ interne controle zijn onder andere beschreven in Nicot et al., Journal of Experimental Botany, Vol 56:2907-2914, 2005.

25 VOORBEELD 1

Bepaling van correlatie van genexpressie en fruitrijping in een aantal variëteiten van appel en peer.

Gegevens werden verzameld op diverse boomgaarden voor twee 30 peer cultivars, Bon Chretien en Forelle en twee appel cultivars, Golden 26

Deliceous en Granny Smith. Deze 4 cultivars zijn in Zuid Afrika geoogst voor de Zuid Afrikaanse situatie (oogst, korte opslag, geconditioneerd transport naar afzetmarkten als Europa). Vlak na de oogst (binnen 48 uur) is de waarde van de diverse merkers bepaald in het vruchtvlees. Hiervoor 5 werd mRNA geïsoleerd uit een mengmonster van vruchten met behulp van een CTAB protocol (Plant Molecular Biology Reporter Vol. 11(2), 1993, pag. 113-116). De diverse merkers werden geïdentificeerd via de eerder genoemde technieken van expressie profiling en gevalideerd via RT-PCR Er is gebruik gemaakt van de volgende primer sets om alle monsters te testen: 10 Forward Primer Reverse Primer

PG GCCCTAATACGGACGGAATTC AATAC AGTCATCACCTGTTCCTATAAC C

βΧΥΧι AACTAATTGGTGCTGCTGAGGTT GTCCGGTCTCTGAACTCTGCTT

424/87 TGGCTCAGGAACATCTTTCATG CTTGTTGAGTCCAGCAGCAGAG

M8 GGTGGCGGCATGGAGTT CCCTTTCCCGTAGGCTTCC

15 EFla TGGGTTTGAGGGTGACAACA TGATCAGGTCAAGAGCCTCAAG

PGK CCTGAATTCGCCAAGAAGCT TGCATGAGCCCTATGAGCAGTA

Van dezelfde monsters werd met een standaard methode en een automatische penetrometer de stevigheid van de vrucht bepaald. Daarnaast zijn ook ander fysiologische parameters bepaald zoals: kleur, zetmeel 20 gehalte, suiker gehalte en malaatzuur concentratie.

Dit materiaal is gevolgd gedurende de opslag in Zuid Afrika (voor appel enkele weken en voor peer ongeveer 10 dagen). Na deze opslag is de waarde van de merkers wederom bepaald en is een transportsimulatie uitgevoerd (containertransport naar bv Europa). Daarna zijn er wederom fysiologische 25 bepalingen uitgevoerd.

Granny Smith (appel) wordt vroeg tijdens de rijping geoogst en rijpt niet sterk af (blijft redelijk hard). Forelle wordt ook vroeg geoogst maar rijpt wel sterk af. Als de peren niet vroeg worden geoogst vallen ze van de boom omdat ze te zwaar zijn. Golden Deliceous en Bon Chretien worden later in 30 het rijpingstraject geoogst en rijpen aan de boom dus verder af.

27

Voor peer zijn met name de textuur merkers betaxylosidase (bxyl), polygalacturonase I (PG1), en putative Cell Wall peroxidase 424/87 (87) relevant. Het begin van de rijping en het verloop van de rijping kan worden vastgesteld door te bepalen wanneer de genactiviteit van deze merkers gaat 5 oplopen (zie fig. 1).

Figuur 1 laat zien dat de rijping in de verschillende boomgaarden op verschillende momenten begint. Met name de boomgaarden Bo Radyn lopen voor op de andere. Later afrijpen kan ook veroorzaakt worden door het gebruik van bepaalde remmers zoals bv Retain (een ethyleen remmer). Voor 10 de grafiek in figuur 1 zijn de activiteiten van alle drie de merkers gecombineerd, maar dit is niet strikt nodig. In principe is elk van bovengenoemde merkers een goede maat. De waarden van de merkers zijn telkens gecorrigeerd door deze te vergelijken met de activiteit van een constitutieve merker (phosphogluceratekinase (PGK) of elongatiefactor 1 15 alfa (eFla).

De te verwachten hardheid bij aankomst in het afzetgebied (bv Europa) is op het moment van de oogst, maar ook na de eerste opslag te voorspellen afhankelijk van de na-oogst behandeling door de waarde van de textuurmerkers te bepalen tijdens de oogst of na de bewaar en deze te 20 vergelijken met een ijklijn. De ijklijn verschilt natuurlijk afhankelijk van de behandeling (bv koeltemperatuur, behandelen met ethyleenremmer ed.). Het blijkt dat er een volgorde is in de effectiviteit van de textuurmerker, afhankelijk van het moment in het rijpingstraject. Vroeg in het rijpingstraject is Bxyl belangrijk, daarna PG1 en daarna 424/87.

25 Figuur 2 laat duidelijk zien dat de hardheid op het afzetgebied een duidelijke relatie heeft met de waarde van deze textuur merkers op het moment van de meting. Vroeg tijdens de rijping (oogst) geeft Ml (PG1) de beste waarden en later 424/87 (na afloop korte opslag). Voor Fore He, die vroeger wordt geoogst, geeft eerst Bxyl de beste correlatie en daarna PG1.

30 28

Voor appel geldt in principe hetzelfde. Ook hier is het rijpingsstadium te bepalen via een combinatie van textuur merkers. In dit geval betreft het de combinatie βχγΐ en PGl aangezien bij Granny Smith de rijping langzaam verloopt (zie fig. 4).

5 De te verwachten hardheid in het afzetgebied is met name te voorspellen via de waarde van de genactiviteit van de merker Bxyl zowel tijdens de oogst als na afloop van de korte bewaar. Dit komt omdat de rijping (en met name het verzachten) bij Granny Smith, maar heel langzaam verloopt (zie fig. 5). Bij appel cv. Golden Delicious is de situatie weer vergelijkbaar.

10 De merkers PGl en Bxyl zijn samen weer van belang, doordat de rijping zeer snel verloopt en er ook later in het rijpingsproces wordt geoogst komt er bij deze cv nog een merker bij. Deze merker M8 heeft de volgende sequentie: gtacatgttcaccactactgctgaacgggaaattgtccgtgatatgaaggagaagcttgcatatgttgctctggactatgagcaa gaacttgagactgccaagagcagctcttcagttgagaagaactatgagcttcccgatggccaagtcatcacaattggagctgag 15 agattccggtgcccagaagtcctctttcaaccatctcttattggaatggaagctgctggcattcatgagactacttacaactctatc atgaagtgtgatgtggatatcagaaaagacctatatggaaacatcgtgctcagtggtgggtcaactatgttccctggtattgcag accgtatgagccgggagatcactgctcttgctccaagcagcatgaagatcaaggttgtagctccaccagagagaaagtacgcg gggacgatagccaatcagaaaaagaaaaaggcacaagtccggcaaaaatgtctgcctcagttatggcttgttccgtgagccta aaaccatctcccttcactgttcagaagtcagcagtgagaggccttccctctctttccaggtcttctgcttcattcaaggtgcaagcc 20 agtggcgtcaagaaaatcaagactgccaccccatatggaactggtggcggcatggagttgaggaacggtgttgatgcctctggg aggaagcctacgggaaagggtgtctaccagtttgtagacaagtac. De merker M8 heeft de hoogste homologiescore met een actine uit peer, De NCBI entry hiervoor is http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi7val-60e501ie

Figuur 7 geeft nog een correlatie van de activiteit van dit gen in relatie tot 25 hardheid na de eerste opslag.

1033431

Claims (12)

1. Werkwijze voor het bepalen van genetische of eiwit/enzymatische merkers voor het, op het moment van de oogst, voorspellen van de te 5 verwachten waarde van het voor een land- en of tuinbouwproduct relevant kwaliteitskenmerk op een gegeven moment tijdens of na de oogst, omvattende de stappen: a. definiëren van een kwantitatieve of relatieve meetwaarde voor het relevante kwaliteitskenmerk voor het specifieke land- of tuinbouwproduct; 10 b. bepalen van de expressieniveaus van een set, bij voorkeur aan het specifieke kwaliteitskenmerk gerelateerde, genen of de eiwitconcentratie van een set, bij voorkeur aan het specifieke kwaliteitskenmerk gerelateerde, eiwitten/enzymen, op meerdere momenten in de tijd vóór, tijdens en na de oogst; 15 c. bepalen van de correlatie van de in b) bepaalde expressieniveaus, of de in b) bepaalde eiwitconcentraties met de waarde (volgens de definitie bepaald in a)) van het, voor dat land- of tuinbouwproduct specifieke, kwaliteitskenmerk op een gegeven moment tijdens of na de oogst; en d. identificatie van die genen uit b), die een oplopend of aflopend 20 expressieniveauprofiel laten zien of die eiwitten/enzymen uit b), die een oplopend of aflopend concentratieverloop laten zien en een correlatie coëfficiënt met de waarde van de kwaliteitsfactor op een gegeven moment tijdens of na de oogst hebben, in het bereik van 0,3-1, bij grotere voorkeur in het bereik van 0,4-1, bij grotere voorkeur in het bereik van 0,5-1, bij grotere 25 voorkeur in het bereik van 0,6-1, bij grotere voorkeur in het bereik van 0,7-1, bij grotere voorkeur in het bereik van 0,8-1, bij grootste voorkeur in het bereik van 0,9-1. e. bepalen van een ijklijn die, voor een specifiek naoogst traject, de relatie vastlegt tussen de genactiviteit van het gen of de waarde van de 1033431 concentratie van het eiwit/enzym op het moment van de oogst met de onder ld bepaalde hoogste correlatie coëfficiënt en de waarde van het specifieke kwaliteitskenmerk op een gegeven moment tijdens of na de oogst voor het specifieke land- of tuinbouwproduct,. 5 f. en optioneel bepalen van specifieke ijklijnen op basis van bovenstaande procedure voor verschillende typen naoogst trajecten.

2. Werkwijze voor het bepalen van genetische of eiwit/enzymatische merkers voor het, gedurende een specifiek naoogst traject, voorspellen van 10 de te verwachten waarde van het voor dat land- en of tuinbouwproduct relevante kwaliteitskenmerk, omvattende de stappen: a. definiëren van een kwantitatieve of relatieve meetwaarde voor het relevante kwaliteitskenmerk voor het specifieke land- of tuinbouwproduct; b. bepalen van de expressieniveaus van een set, bij voorkeur aan het 15 specifieke kwaliteitskenmerk gerelateerde, genen of de eiwitconcentratie van een set, bij voorkeur aan het specifieke kwaliteitskenmerk gerelateerde, eiwitten/enzymen, op meerdere momenten in de tijd tijdens het naoogst traject; c. bepalen van de correlatie van de in b) bepaalde expressieniveaus, 20 of de in b) bepaalde eiwitconcentraties met de waarde (volgens de definitie bepaald in a)) van het, voor dat land- of tuinbouwproduct specifieke, kwaliteitskenmerk op een gegeven moment na de oogst; en d. identificatie van die genen uit b), die een oplopend of aflopend expressieniveauprofiel laten zien of die eiwitten/enzymen uit b), die een 25 oplopend of aflopend concentratieverloop laten zien en een correlatie coëfficiënt met de waarde van de kwaliteitsfactor op een gegeven moment na de oogst hebben, in het bereik van 0,3-1, bij grotere voorkeur in het bereik van 0,4-1, bij grotere voorkeur in het bereik van 0,5-1, bij grotere voorkeur in het bereik van 0,6-1, bij grotere voorkeur in het bereik van 0,7-1, bij grotere voorkeur in het bereik van 0,8-1» bij grootste voorkeur in het bereik van 0,9-1. e. bepalen van een ijklijn die, voor genoemd specifieke naoogst traject, de relatie vastlegt tussen de genactiviteit van het gen of de waarde 5 van de concentratie van het eiwit/enzym tijdens genoemd naoogst traject met de onder ld bepaalde hoogste correlatie coëfficiënt en de waarde van het specifieke kwaliteitskenmerk op een gegeven moment tijdens of na de oogst voor het specifieke land- of tuinbouwproduct. f. en optioneel bepalen van specifieke ijklijnen op basis van 10 bovenstaande procedure voor verschillende typen naoogst trajecten.

3. Werkwijze voor het voorspellen van de te verwachten waarde van een specifiek kwaliteitskenmerk voor een specifiek land- of tuinbouwproduct aan het eind van het naoogst traject omvattende de stappen van: 15 a. het bepalen van het expressie niveau van een of meer genetische merkers of de concentratie van een of meer eiwit/enzymatische merkers in het te testen fruit vóór het naoogst traject (bv. tijdens de oogst) of gedurende het naoogst traject; b. voorspellen van de te verwachten waarde van het specifieke 20 kwaliteitskenmerk voor het specifieke land- of tuinbouwproduct na afloop van het naoogst traject op basis van het verloop van de volgens conclusie 1 of 2 bepaalde ijklijn , die voor dat specifieke meetmoment en die specifieke naoogst situatie is bedoeld met de onder a) gemeten genexpressie of eiwitconcentratie, waarbij de op basis van de specifieke expressie of 25 eiwitconcentratie voorspelde waarde van het specifieke kwaliteitskenmerk kan worden afgelezen uit de grafiek van de specifieke ijklijn.

4. Werkwijze voor het voorspellen van de te verwachten waarde van de kwaliteit met betrekking tot een specifiek kwaliteitskenmerk voor een specifiek land- of tuinbouwproduct aan het eind van het naoogst traject omvattende de stappen van: a. definiëren van het bereik van waarden die voor het specifieke land-of tuinbouw product door de markt voor het specifieke kwaliteitskenmerk 5 als acceptabel wordt beschouwd; b. op basis van de volgens conclusie 3 bepaalde waarde voor een specifiek kwaliteitskenmerk en de onder a) gedefinieerde range de voorspelde kwaliteit als acceptabel of niet-acceptabel voor dat kwaliteitskenmerk beschouwen. 10

5. Werkwijze voor het vaststellen van het begintijdstip en het eindtijdstip van de optimale oogsttijd van een land- of tuinbouwproduct omvattende de stappen van: 15 a. het bepalen van het expressieniveauprofiel van een of meer genetische merkers of het concentratieverloop van een of meer eiwit/enzymatische merkers met de hoogste correlatie coëfficiënt zoals bepaald volgens stap d) van conclusie 1 in het te testen land- of tuinbouwproduct op meerdere oogstmomenten in de tijd; 20 b. bepalen van de waarde van het specifieke kwaliteitskenmerk dat hoort bij de waarde van de genactiviteit van het gen of van de concentratie van het merkereiwit/enzym in het tijdstraject van de oogst; c. vaststellen van het eerste moment in de tijd dat een waarde van het specifieke kwaliteitskenmerk dat valt in de in stap a) van conclusie 4 25 bepaalde acceptabele kwaliteitsrange wordt bereikt, en dit moment in de tijd aanduiden als het begintijdstip van de optimale oogsttijd; d. vaststellen van het laatste moment in de tijd dat een waarde van het specifieke kwaliteitskenmerk dat valt in de in stap a) van conclusie 4 bepaalde acceptabele kwaliteitsrange wordt bereikt, en dit moment in de 30 tijd aanduiden als het eindtijdstip van de optimale oogsttijd.

6. Testkit voor het voorspellen van de te verwachten waarde van een specifiek kwaliteitskenmerk voor een specifiek land- of tuinbouwproduct aan het eind van het naoogst traject omvattende 5 a) een ijklijn voor het verband tussen de expressie van een of meer van de te testen genen of de concentratie van een of meer van de merker eiwitten en de waarde van een specifiek kwaliteitskenmerk voor een specifiek land- of tuinbouwproduct; of instructies hoe een dergelijke ijklijn te maken, 10 b) middelen om de expressie van een of meer van de testen genen, respectievelijk de concentratie van een of meer van de testen eiwitten te bepalen.

7. Geautomatiseerd systeem voor het voorspellen van de te 15 verwachten waarde van een specifiek kwaliteitskenmerk voor een specifiek land- of tuinbouwproduct aan het eind van het naoogst traject of voor het vaststellen van het begintijdstip en het eindtijdstip van de optimale oogsttijd van een land- of tuinbouwproduct met betrekking tot een specifiek kwaliteitskenmerk, omvattende: 20 a) middelen voor de meting van de expressie van een aantal voor de bepaling van de expressie van een of meer belangrijke genen voor genoemd kwaliteitskenmerk in een of meer specifieke land- of tuinbouwproducten; b) middelen voor de meting van de expressie van controle genen, zoals bijvoorbeeld house-keeping enzymen, zoals fosfoglyceraatkinase (PGK) of 25 elongatiefactor la (eFla); c) middelen voor het bepalen van het (relatieve) expressieprofiel van de onder a) genoemde genen; d) een of meerdere ijklijnen die de correlatie weergeven van de expressieprofielen van een of meer van de onder a) genoemde genen en het 30 genoemde kwaliteitskenmerk; en e) middelen om de gemeten expressieprofielen van de een of meerdere land- of tuinbouwgewassen te interpreteren met betrekking tot de daarbij horende ijklijn(en) en op grond daarvan een indicatie af te geven omtrent de het kwaliteitskenmerk van de een of meerdere land- of tuinbouwproducten, 5 welke indicatie tevens een indicatie inhoudt van de tijd die nodig is voor het naoogst traject en/of tot het optimale oogsttijdstip.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 1-5 of testkit volgens conclusie 6 of systeem volgens conclusie 7, waarin het genoemde land- of 10 tuinbouwproduct gekozen wordt uit de groep bestaande uit fruit, groenten, aardappelen, zaden (zoals graan), noten, snijbloemen, bloembollen, sierpotplanten en oogstbare kruiden.

9. Werkwijze, testkit of systeem volgens conclusie 8, waarin het 15 genoemde land- of tuinbouwproduct fruit is en wordt gekozen uit de groep bestaande uit appel, peer, citrusvruchten zoals sinasappel, mandarijn, citroen en minneola, meloen, tomaat, perzik, pruim, druif, aalbes, kruisbes, braam, framboos, kers, ananas, mango, kiwi, lychee, banaan, paprika, en avocado, inclusief alle variëteiten en cultivars daarvan. 20

10. Werkwijze, testkit of systeem volgens conclusie 9, waarin het genoemde kwaliteitskenmerk gekozen wordt uit de groep bestaande uit de hardheid van het fruit, de zoetheid van het fruit, de kleur van het fruit, de afmeting van het fruit, en een combinatie van een of meer van deze. 25

11. Werkwijze, testkit of systeem volgens conclusie 10, waarin het kwaliteitskenmerk hardheid van het fruit is, en het fruit appel of peer is en waarin de genetische en/of eiwitmerkers worden gekozen uit de groep bestaande uit β-xylosidase (Pxyl), polygalaturonidase I en II (PGI en PGII), 30 putative celwandperoxidase 424/87 (87), xyloglucan endotransglycosylase (XET), expansin en glucanases zoals endo-P-l,4-glucanase en de genen die daarvoor coderen.

12. Werkwijze, testkit of systeem volgens conclusie 8, waarin het 5 genoemde land- of tuinbouwproduct groente is en wordt gekozen uit sla, tomaat, aardappel, tapioca, yam, alle koolsoorten (bloemkool, boerenkool, spruiten, savooiekool, spitskool, e.d.), worteltjes, winterpeen en peulvruchten. 1033431