NL1032224C2 - Werkwijze voor sample preparatie voor cryo-elektronenmicroscopie (CEM), microreactor en laadperron. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze voor sample preparatie voor cryo-elektronenmicroscopie (CEM), microreactor en laadperron

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor sample preparatie voor cryo-elektronenmicroscopie (CEM).

Tevens heeft de uitvinding betrekking op een microreactor voor gebruik bij CEM.

5 Daarnaast heeft de uitvinding betrekking op een laadperron voor gebruik bij CEM.

CEM wordt veelal toegepast voor onderzoek aan biologische samples. Hierbij wordt een sample onder lage temperatuur gekoeld, bijvoorbeeld onder de ongeveer 150° K. Na de koeling wordt het sample in 10 nog steeds gekoelde toestand in een elektronenmicroscoop gebracht, in het bijzonder een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). Door de koeling wordt mogelijke door de elektronenstraling veroorzaakte schade aan het sample beperkt.

Het sample bevindt zich veelal in een vloeistof en/of bevat veel 15 vloeistof, waarbij in deze beschrijving als voorbeeld water wordt gebruikt, omdat deze vloeistof veel wordt gebruikt bij CEM. Om tijdens de koeling zo weinig mogelijk modificatie van het sample door kristallisatie van het water te realiseren dient het water zeer snel tot amorf ijs te worden gevormd. De amorfe vorm van het ijs voorkomt morfologische verandering van het 20 sample, bijvoorbeeld een cel, door kristallisatie van het water, bijvoorbeeld door doorboring van een celwand. Bovendien heeft kristalvorming het ontstaan van ongewenste contrasten in het beeldresultaat van de elektronenmicroscoop tot gevolg.

Voor de snelle koeling wordt in CEM een quench-freese proces, ook 25 plunge-freese genoemd, toegepast. Hierbij wordt het sample bij voorkeur onder de 15Ö°K gekoeld, bij voorkeur op of onder ongeveer 140°K, waarbij 1 0 3 2 22* 2 het sample in een tijdsbestek van bijvoorbeeld ongeveer 10‘5 seconden wordt ingevroren. Hierna wordt de vloeistof koel gehouden, in het bijzonder ongeveer op de genoemde 140°K zodat de vloeistof daarin, in het bijzonder water, zoveel mogelijk de amorfe vorm behoudt en niet een kristallijne vorm 5 aanneemt.

Door de amorfe, bevroren toestand van het sample die is verkregen door het quench-freese proces is het mogelijk het sample in een chemisch nagenoeg onveranderde toestand te bestuderen. Door te koelen volgens het quench-freese proces kan bovendien een sample op een bepaald moment 10 en/of in een bepaalde toestand worden vastgelegd, bijvoorbeeld tijdens een biologische of chemische reactie of ontwikkeling.

Om in een kort tijdsbestek volgens het quench-freese te kunnen invriezen is het voordelig indien het sample dun is. Het kan bijvoorbeeld zijn dat een sample vóór het invriezen dun wordt gemaakt of in dunne 15 plakjes wordt gesneden, echter zijn niet alle samples hiertoe geschikt.

Een sample dient ook dun te zijn voor een voldoende mate van elektronentransparantie. Daartoe kan het sample, na het quench-freese proces, bijvoorbeeld bij ongeveer 100°K in dunne plakjes worden gesneden, bijvoorbeeld met behulp van een cryo-ultramicrotoom. Deze plakjes kunnen 20 bijvoorbeeld tussen de 20 en 200 nm dik zijn. Een andere methode is het onder koeling wegnemen van lagen van het samplemateriaal, bijvoorbeeld van een bepaalde celstructuur, met behulp van een gefocusseerde ionenbundel ('ion milling') tot het gewenste te bestuderen punt is bereikt, bijvoorbeeld de kern van de celstructuur.

25 Om het sample in ongemodificeerde toestand in de elektronenmicroscoop te kunnen plaatsen wordt het sample gebruikelijk in een laadperron geplaatst waar deze koel wordt gehouden, bijvoorbeeld op of onder ongeveer 140° K. Hier moet tevens worden voorkomen dat water uit de omgeving zich afzet als ijs op het oppervlak van het sample. Daartoe 3 dienen de temperatuur en vochtigheid in het laadperron goed te worden gecontroleerd.

Het gehele proces dat het sample doormaakt tot en met het in de elektronenmicroscoop plaatsen van het sample wordt in deze beschrijving 5 aangeduid als sample preparatie. Een goede sample preparatie zorgt voor het in de gewenste ingevroren toestand overbrengen van het sample in de elektronenmicroscoop.

De ruimte waarin bij CEM de sample preparatie zich afspeelt wordt veelal vochtvrij en op juiste temperatuur gehouden. Het gaat hierbij 10 veelal om ruimtes waarin zich tevens mensen bevinden en er worden dan ook hoge eisen aan de klimaatbeheersing gesteld. Genoemd controleren van de gehele omgeving is relatief moeilijk, en te beschouwen als een oorzaak waarom veelal pas na vele herhalingen van het CEM proces een geschikt beeldresultaat wordt verkregen.

15 Een werkwijze voor sample preparatie voor cryo- elektronenmicroscopie (CEM) volgens de uitvinding omvat in een eerste aspect, het houden van een sample in een microreactor, waarbij de condities in de microreactor worden geregeld ten opzichte van de omgeving, waarbij het sample in de microreactor volgens een quench-freese proces wordt 20 ingevroren, waarna het sample in ingevroren toestand in de elektronenmicroscoop wordt geplaatst.

Met een dergelijke werkwijze wordt mogelijk gemaakt dat de condities van het sample in de microreactor tenminste tijdelijk, bijvoorbeeld tot aan het quenche-freese proces, beter kunnen worden geregeld dan 25 conventionele methoden, aangezien de microreactor het mogelijk maakt de omstandigheden relatief plaatselijk te regelen. Het plaatselijk in de microreactor regelen van condities, zoals bijvoorbeeld temperatuur, luchtvochtigheid, druk, etc. is eenvoudiger dan het regelen van dergelijke condities voor grotere ruimte. Ook na het quenche-freese proces kan de 30 microreactor tegengaan dat bepaalde uitwisselingen plaatsvinden, 4 bijvoorbeeld van vocht, tussen het sample en de omgeving. In een microscoop geplaatst dient de microre actor daarbij bij voorkeur voldoende elektronentransparant te zijn voor het bestuderen van de sample.

In bepaalde uitvoeringsvormen van de werkwijze worden de 5 condities na het quench-freese proces geregeld, bijvoorbeeld door de sample in de microreactor in gekoelde omgeving op eenvoudige wijze in een samplehouder te schuiven. Hierdoor wordt ongewenste vervorming van het sample en/of kristallisatie na het quench-freese proces voorkomen. Doordat het proces van sample preparatie voor CEM door de uitvinding minder vaak 10 hoeft te worden herhaald dan bij conventionele wijzen, wordt door de uitvinding het rendement van de sample preparatie verhoogd.

In een tweede aspect omvat de uitvinding een microreactor voor gebruik bij cryo-elektronenmicroscopie (CEM), omvattende een eerste en tweede membraan, welke membranen tenminste in gebruiktoestand een 15 kamer insluiten, waarbij de membranen zijn geconfigureerd om stand te houden tot aan althans het begin van een quench-freese proces

De dunne membranen van de microreactor, veelal tenminste plaatselijk slechts enkele nanometers dik, blijken bij bepaalde uitvoeringsvormen onder de extreme temperatuursomstandigheden van het 20 CEM proces tot op het gewenste tijdpunt nog voldoende stand te kunnen houden.

In bepaalde uitvoeringsvormen kunnen bovendien de membranen worden geconstrueerd zodat ze over ten opzichte van de membraandikte relatief grote membraanoppervlakken transparantie bieden voor 25 elektronenbundels.

Een groter elektronentransparant gebied levert onder andere een hogere trefkans. Dat wil bijvoorbeeld zeggen dat meer sampledeeltjes kunnen worden waargenomen en/of dat sampledeeltjes meer kunnen worden verspreid binnen het elektronentransparante gebied van de 30 membranen.

5

In een derde aspect omvat de uitvinding een laadperron voor cryo-elektronenmicroscopie (CEM), omvattende een bodem en tenminste een opstaande wand, waarbij in een wand een opening is voorzien voor het inbrengen van een CEM samplehouder, waarbij in de bodem van het 5 laadperron een eerste uitsparing is voorzien, bij voorkeur met een rechthoekige vorm, zodat een microreactor, cartridge en/of samplehouder ten minste deels in genoemde eerste uitsparing kan rusten, waarbij de eerste uitsparing aansluit op de opening, zodat, indien de samplehouder door de opening deels in het laadperron is gebracht, de microreactor en/of 10 cartridge in hoofdzaak evenwijdig aan de bodem van de eerste uitsparing in de samplehouder kan worden geschoven.

Ter verduidelijking van de uitvinding zullen uitvoeringsvoorbeelden van een werkwijze, laadperron en microreactor volgens de uitvinding nader worden toegelicht aan de hand van de tekening. 15 Daarin toont:

Fig. 1 schematisch een CEM proces;

Fig. 2 schematisch een uitvoeringsvorm van een microreactor in perspectief;

Fig. 3 schematisch een uitvoeringsvorm van een microreactor in 20 bovenaanzicht;

Fig. 4A - 4D schematisch verschillende alternatieve uitvoeringsvormen van microreactors in vooraanzicht;

Fig. 5 schematisch een laadperron in gebruik;

Fig. 5B schematisch in zijaanzicht een deel van een doorsnede van 25 laadperron in gebruik;

Fig. 5C schematisch in bovenaanzicht een deel van een laadperron in gebruik;

Fig. 6A-6I een illustraties in stappen van uitvoeringsvormen van het schuiven van een sample in een samplehouder; 6

Fig. 7 een cartridge voor gebruik in een werkwijze volgens de uitvinding;

Fig. 8A - 8C schematisch een alternatieve uitvoeringsvorm van een microreactor.

5 In deze beschrijving hebben gelijke of corresponderende delen gelijke of corresponderende verwijzingscijfers. In de tekening zijn slechts als voorbeeld uitvoeringsvormen van de uitvinding getoond. De daarbij gebruikte elementen zijn slechts ter illustratie genoemd en dienen geenszins beperkend te worden uitgelegd. Ook andere onderdelen, uitvoeringsvormen 10 en werkwijzen kunnen worden toegepast binnen het raam van de onderhavige uitvinding. Ook de verhoudingen in de tekeningen dienen zuiver als schematisch en ter illustratie te worden uitgelegd.

In figuur 1 worden vier stappen 1, 2, 3, 4 van een werkwijze volgens een uitvoeringsvorm van een sample preparatie voor CEM (cryo-15 elektronenmicroscopie) volgens de uitvinding getoond. Een opstelling waarmee deze werkwijze volgens een uitvoeringsvorm kan worden uitgevoerd bevat bijvoorbeeld een optische microscoop 32, een quench-freeser 7, een laadperron 33 en een transmissie elektronenmicroscoop 11.

In stap 1 wordt een te bestuderen sample 6 met behulp van 20 bijvoorbeeld water in een microreactor 5 gevloeid. De microreactor 5 omvat een kamer 19, welke is ingesloten door twee membranen 16, 17 waarbinnen zich het sample 6 bevindt, zie bijvoorbeeld figuur 2 ter illustratie. De microreactor 5 wordt verderop in de beschrijving nader uitgelegd. Voor het in de microreactor 5 vloeien van het sample 6 omvat de microreactor 5 een 25 inlaat 14 en een uitlaat 15, welke leiden respectievelijk naar en van de kamer 19. Dit wil zeggen dat water door de microreactor 5 stroomt, waarbij het water een deel van een sample 6, of één, of meerdere samples 6 met zich meeneemt. Uiteraard kan in plaats van water ook een ander fluïdum worden gebruikt voor het in microreactor 5 vloeien. Het sample 6 kan ook, 7 bijvoorbeeld met vloeistof, in een open microreactor 5 worden gelegd, waarna de microreactor 5 wordt gesloten.

Het sample 6 kan bijvoorbeeld een zeer dun plakje van een bulk sample 6 zijn. Tevens kan het zo zijn dat het te bestuderen sample 6 nog 5 moet worden gevormd in de microreactor 5 of dat het sample 6 bijvoorbeeld een hele cel is. Het zij opgemerkt dat de types sample 6 zoals in de beschrijving worden besproken zuiver ter illustratie dienen en niet als beperkend voor de uitvinding dienen te worden uitgelegd. Zo dient de uitvinding niet te worden beperkt tot onderzoek aan biologische samples, 10 maar kan deze tevens op andere gebieden worden toegepast.

In de in figuur 1 getoonde uitvoeringsvorm wordt de microreactor 5 onder een meetinstrument 32 geplaatst, bijvoorbeeld een optische microscoop of röntgenstraling diffractiometer 32. De microreactor 5 staat bijvoorbeeld toe dat het sample 6 daarbinnen onder relatief gecontroleerde 15 omstandigheden stabiel blijft, een bepaald proces of een reactie ondergaat en/of kan worden geselecteerd. Tevens is de microreactor 5 tenminste ten dele voldoende transparant voor licht in het zichtbare spectrum, zodat het sample 6 met een optische microscoop 32 kan worden waargenomen.

In stap 2 is een quenche-freezer 7, ook wel plunge-freezer genoemd, 20 opgesteld. De microreactor 5 met daarin het sample 6 wordt op een gekozen moment in de quenche-freezer 7 geplaatst. Hierin bevindt zich een bad 31 vloeibaar ethaan 8 dat is opgesteld in een bad 30 met vloeibare stikstof 9. In de quenche-freezer 7 wordt het sample 6 volgens het quench-freese proces binnen een kort tijdsbestek op lage temperatuur, bijvoorbeeld 140° K, in 25 hoofdzakelijk amorfe toestand, bevroren.

In stap 3 wordt de microreactor 5 met het sample 6 in een gekoeld laadperron 33 geplaatst, dat met behulp van vloeibare stikstof op lage temperatuur wordt gehouden, bij voorkeur onder de 150° K, in het bijzonder op of onder de 140° K. Een koelhouder 34 koelt een samplehouder 10. In het 8 onderhavige vakgebied zijn de koelhouder 34 en samplehouder 10 soms geïntegreerd waarbij de geïntegreerde koelhouder 34 en samplehouder 10 veelal 'cryohouder' 10, 34 worden genoemd. In deze beschrijving dient onder samplehouder 10 ook een dergelijke cryohouder 10, 34 te worden verstaan.

5 De gekoelde samplehouder 10 steekt in het laadperron 33, zodat de sample 6 houdende microreactor 5 in de samplehouder 10 kan worden geschoven en in stap 4 in bij voorkeur nagenoeg amorfe toestand in de elektronenmicroscoop 11 kan worden gepositioneerd.

In stap 4 wordt het sample 6 met behulp van de samplehouder 10 10 in de transmissie elektronenmicroscoop (TEM) 11 geplaatst, althans in een elektronenbundel daarvan gebracht, zodat een bij voorkeur nauwkeurig beeld van het sample 6 kan worden verkregen.

In figuur 2 is een uitvoeringsvorm van genoemde microreactor 5 schematisch getoond, omvattende wanden, hier uitgevoerd als een eerste 15 chip 12 en een tweede chip 13. In de eerste chip 12 zijn een inlaat 14 en een uitlaat 15 voor het doorlaten van vloeistof en het sample 6 ingericht. Een eerste membraan 16 en een tweede membraan 17 zijn aangebracht, welke een kamer 19 insluiten binnen welke kamer 19 de vloeistof en het sample 6 van de inlaat 14 richting de uitlaat 15 kunnen vloeien. Twee vensters 18A, 20 18B zijn in de chips 12,13 voorzien om een elektronenbundel te laten passeren en/of om het sample 6 tussen de membranen 16, 17 bijvoorbeeld visueel en/of in een ander type meetinstrument 32 dan een TEM 11 te kunnen bestuderen.

De chips 12, 13 kunnen worden gemaakt met behulp van 25 chip technologie, bijvoorbeeld lithografie. Hiermee kunnen de chips 12, 13 bijvoorbeeld uit meerdere lagen zijn geconstrueerd. Materialen die bijvoorbeeld worden toegepast zijn SiN (siliciumnitride), Si02 (siliciumoxide) en/of C (koolstof). De dunne membranen 16, 17 zijn bijvoorbeeld tussen de chips 12, 13 ingeklemd. Gunstige materialen voor de 30 membranen 16, 17 zijn bijvoorbeeld SiN (siliciumnitride) of C (koolstof).

9

In een toepassing worden de eerste chip 12 met membraan 16 en de tweede chip 13 met membraan 17 pas na het aanbrengen van het sample 6 met elkaar verbonden. Dit kan gunstig zijn bij grote samples 6, bijvoorbeeld indien sprake is van een relatief grote bulk sample 6 of een hele cel. Hierbij 5 wordt de cel in een open microreactor 5 geplaatst, waarna de microreactor 5 wordt dichtgemaakt. Bij deze uitvoeringsvorm kunnen bijvoorbeeld de inlaat 14 en uitlaat 15 zijn weggelaten. In deze microreactor 5 kunnen bijvoorbeeld bepaalde condities, zoals bijvoorbeeld de luchtvochtigheid,, tijdelijk worden gehandhaafd.

10 De membranen 16, 17 zijn voldoende elektronen transparant en hebben bij voorkeur een zoveel mogelijk elektronentransparante dikte d (zie figuur 2A) over het oppervlak van het venster. De dikte d kan bijvoorbeeld 20 nm zijn en afhankelijk van de grootte van het vensteroppervlak 20A, 20B kan deze dikte d, bijvoorbeeld plaatselijk, groter of kleiner worden gekozen, 15 bijvoorbeeld 5 of 100 nm, of daartussen. Hierbij dient onder vensteroppervlak 20A, 20B te worden verstaan het oppervlak van het membraan 16 of 17 waardoorheen tenminste een elektronenbundel kan stralen. Dit vensteroppervlak 20A, 20B is getoond in een schematisch bovenaanzicht in figuur 3. Bij voorkeur hebben de membranen 16, 17 20 voldoende elektronentransparantie over het vensteroppervlak 20A, 20B voor het verkrijgen van een zo goed mogelijk beeldresultaat. Indien het membraan 16 of 17 een zo groot mogelijk vensteroppervlak 20A, 20B heeft is de kans dat het gewenste deel van het sample 6 of de samples 6 door de elektronenbundel wordt geraakt groter. Zo kunnen bijvoorbeeld bepaalde 25 sampledeeltjes 6 die een verschillende toestand vertegenwoordigen over een groter vensteroppervlak worden verspreid, waarbij bij een kleiner vensteroppervlak 20A, 20B de kans zou bestaan dat deze deeltjes 6 elkaar zouden beïnvloeden. Tevens is de kans dat binnen het vensteroppervlak 20A, 20B zich het gezochte sampledeeltje 6 bevindt groter.

10

Het membraan 16 of 17 houdt bij voorkeur tenminste tot aan het begin van het quench-freese proces stand. Na het quench-freese proces is het sample 6 in principe gefixeerd in de microreactor 5, waarbij de membranen 16, 17 wel of niet stand hebben gehouden. Het sample 6 kan 5 met een elektronenbundel worden bestraald met gebroken of in stand gehouden membranen 16, 17. Tevens kan ervoor worden gekozen de membranen 16, 17 en/of een deel van de microreactor 5 te verwijderen alvorens het sample 6 met elektronen wordt bestraald.

Denkbaar is een vensteroppervlak 20A, 20B met een lengte 1 en 10 een breedte b van ongeveer 100 micron bij 100 micron, maar ook groter, bijvoorbeeld lmm bij lmm. De maximale handhaafbare grootte van het vensteroppervlak 20A, 20B hangt bijvoorbeeld af van het te gebruiken drukverschil binnen en buiten de kamer 19, maar bijvoorbeeld ook van het type en/of aantal sample(s) 6, de dikte d van het membraan 16 of 17 en/of 15 het materiaal van het membraan 16 of 17.

In een uitvoeringsvorm volgens de uitvinding zijn tegendrukmiddelen 21 voorzien, in de uitvoeringsvorm van figuur 2 uitgevoerd als tussenschotten 21. Deze zijn ingericht ter ondersteuning van het membraan 16 of 17 binnen of buiten de kamer 19 en/of om een 20 tegendruk uit te oefenen. Tegendrukmiddelen 21 gaan tegen dat dunne membranen 16, 17 breken, met andere woorden, zorgen voor een verstevigingen en/of zorgen ervoor dat de membranen 16, 17 plaatselijk of over het gehele membraan 16,17 op een bepaalde afstand ten opzichte van elkaar worden gehouden. Over het algemeen kunnen de tegendrukmiddelen 25 21 op verschillende manieren worden gerealiseerd, bijvoorbeeld door het uitoefenen van een fluïdumdruk 21D op de membranen 16, 17 binnen of buiten de kamer 19 als in figuur 4A, 4B en 4D. Tevens kunnen mechanische tegendrukmiddelen zijn voorzien, bijvoorbeeld in de vorm van tussenschotten 21, als in figuur 2 en 3, kolommen 21A, 21B, 21C, als in 30 figuur 4C, verdikkingen 21E in de membranen 16, 17 als in figuur 4D, en 11 combinaties daarvan. Nadere uitleg over deze verschillende uitvoeringsvormen van tegendrukmiddelen 21 volgt in deze beschrijving.

In bepaalde uitvoeringsvormen van een microreactor 5 kunnen verschillende types samples 6 worden gevloeid. Bijvoorbeeld kan een sample 5 6 met een relatief grote doorsnede in de microreactor 5 worden gebruikt door een groter vensteroppervlak 20 in te richten. De verhouding tussen de dikte van de membranen 16, 17 en het vensteroppervlak 18 dient daarbij zo gunstig mogelijk te worden gekozen. Het kan daarbij gunstig zijn eerdergenoemde tegendrukmiddelen 21 te voorzien, om te voorkomen dat 10 een membraan 16, 17 met een groot oppervlak en een relatief geringe membraandikte voortijdig breekt. Het is bijvoorbeeld realiseerbaar dat de membraandikte d ongeveer 20nm is bij een membraanoppervlak van 50 bij 200 micron. In een andere uitvoeringsvorm is de dikte d bij een gelijk of groter oppervlak ongeveer 5 nm of 10 nm, of daar tussenin, maar zijn 15 bijvoorbeeld tegendrukmiddelen 21 te voorzien, bijvoorbeeld in de vorm van microkolommen 21A, 21B, 21C tussen de membranen 16, 17, zoals te zien in figuur 4C.

Tegendrukmiddelen 21 kunnen in meerdere configuraties worden toegepast. Bijvoorbeeld kan een onderdruk in de kamer 19 worden 20 gerealiseerd via de in- en uitlaat 14, 15, zoals te zien in de in figuur 4C weergegeven uitvoeringsvorm. Hierbij zijn de in- en uitlaat 14, 15 bijvoorbeeld aangesloten op een drukregelaar. Pijlen 21D geven fictieve tegendrukmiddelen 21 aan de buitenkant aan waarmee als gevolg van de onderdruk in de kamer 19 de membranen 16, 17 naar binnen worden 25 geduwd. In een ander geval wordt bijvoorbeeld een overdruk toegepast in de kamer 19 zodat de membranen 16A, 17A, in figuur 4C met een stippellijn aangegeven, naar buiten worden gedrukt. In weer andere gevallen wordt buiten de microreactor 5 een bepaalde druk toegepast om drukverschil tussen binnen en buitenzijde van de kamer 19 de bewerkstelligen.

12

De microkolommen 21A — 21C in de kamer 19 houden de membranen 16, 17 tenminste plaatselijk bij elkaar en/of op een bepaalde afstand, zoals te zien in figuur 4C. Tevens dragen de kolommen 21A - 21C in combinatie met het variëren van de gasdruk binnen en/of buiten de kamer 5 19 bij aan het plaatselijk kunnen controleren van de afstand tussen de membranen 16, 17, 16A, 17A. In bepaalde uitvoeringsvormen wordt door de membranen 16, 17 door toepassing van bepaalde drukverschillen tussen de druk in en buiten de kamer 19 een luchtdichte afsluiting 25 gecreëerd doordat de membranen 16, 17 plaatselijk tegen elkaar worden gedrukt. Deze 10 eigenschap kan bijdragen aan betere controle van de omstandigheden in de microre actor 5.

Zoals te zien in figuur 4D, zijn in een uitvoeringsvorm te gendrukmiddelen 21 voorzien in de vorm van verdikkingen 2 IE in het membraan 16 en/of 17. Bijvoorbeeld is de dikte di van de membranen 16, 17 15 over de oppervlakte ongeveer 5nm en de dikte d2 plaatselijk bij de verdikkingen 2IE dikker, bijvoorbeeld ongeveer lOOnm. Een grid van der ge lijke verdikkingen 2 IE kan zijn voorzien zodat over een relatief groot oppervlak een gemiddeld relatief dun membraan 16, 17 worden bereikt dat, tenminste tot aan het quenche-freese proces en bij voorkeur nog daarna, 20 standhoudt. Een gunstige uitvoeringsvorm van een venster 18 met verdikkingen 21E met genoemde diktes di, d2 van heeft bijvoorbeeld een vensteroppervlak 20 van ongeveer lmm bij lmm.

Een membraandikte d van 50 nm kan voor sommige toepassingen voldoende elektronentransparantie bieden. Indien deze 25 elektronentransparantie toch onvoldoende is zou bijvoorbeeld na het quench-freese proces met behulp van een gefocusseerde ionenbundel ('ion milling') nog tenminste een laag van een membraan 16 en/of 17 kunnen worden verwijderd of eventueel en/of beide membranen in het geheel, in genoemd venster of een deel daarvan. Uiteraard hangt de keuze van het 30 vensteroppervlak 18, de keuze de dikte(s) d, di, d2 en de keuze of een 13 bepaald type tegendrukmiddelen 21 worden toegepast af van de toepassing. Bovenstaande uitvoeringsvormen dienen ter illustratie en kunnen per toepassing worden gecombineerd en/of gevarieerd.

In een uitvoeringsvorm varieert de afstand h (zie figuur 2) tussen 5 de membranen 16, 17. Zo zijn bepaalde uitvoeringsvormen voorzien van afstanden bijvoorbeeld tussen de 10 en 200 nm tussen de membranen 16, 17. Bijvoorbeeld kan een vloeistoflaag van ongeveer lOOnm met daarin een plak preparaat 6 in de microreactor worden gevloeid, zodat vervolgens de microreactor 5 met het sample 6 in stap 2 volgens een quench-freese proces 10 kan worden bevroren. Uit testen is overigens gebleken dat de membranen 16, 17 de thermische schok kunnen weerstaan, ook indien zich vloeistof in de microreactor 5 bevindt.

In nog een uitvoeringsvorm zijn grotere afstanden tussen de membranen 16, 17 voorzien, bijvoorbeeld 5 pm. Deze uitvoeringsvorm is 15 bijvoorbeeld gunstig bij grote samples 6, waarbij een sample 6 met bijvoorbeeld een diameter van 5 pm, bijvoorbeeld een complete cel 6, in de microreactor 5 wordt gevloeid waarna het in de quench-freezer 7 wordt geplaatst.

De membranen 16, 17 kunnen bijvoorbeeld een buiging vertonen, 20 zoals is te zien in figuur 4A, waardoor samples van nog grotere diameters D dan 5 pm in de microreactor kunnen worden geplaatst. Voor elektronentransparatie wordt het sample 6 vervolgens, bijvoorbeeld laag na laag, dunner gemaakt tot het elektronentransparant is, bijvoorbeeld met behulp van een gefocusseerde ionenbundel of een cryo-ultramicrotoom.

25 Aangezien bij het bevriezen het sample 6 in de microreactor 5 gefixeerd raakt hoeft het niet nadelig te zijn indien de microreactor 5 beschadigt. De membranen 16, 17 mogen in principe breken en/of worden weggenomen tijdens/na het quench-freese proces.

14

Zoals gezegd geschiedt het beheersen van de condities in bepaalde uitvoeringsvormen van de microreactor 5 via de inlaat 14 en uitlaat 15. Hierbij worden bijvoorbeeld de luchtvochtigheid, temperatuur en druk beheerst. Door de condities te beheersen kunnen bijvoorbeeld bepaalde 5 processen in de microreactor 5 worden bekeken en zelfs aangestuurd.

Tevens worden door de microreactor bepaalde reacties en/of uitwisselingen tussen het sample 6 en de omgeving tegengegaan. Bijvoorbeeld bij dunne plakjes van het sample 6 levert de beheersing, met name vóór het quench-freese proces, voordelen op aangezien het relatief grote oppervlak zeer 10 gemakkelijk water verliest en/of opneemt, hetgeen met de microreactor 5 kan worden voorkomen. Over het algemeen is het eenvoudiger de omstandigheden plaatselijk in de kamer 19 te controleren dan in een relatief grotere omgeving zoals bij de conventionele wijzen van sample preparatie gebeurt. Vervolgens kan op een gekozen moment de microreactor 5 met het 15 sample 6 in de quench-freezer 7 volgens het quench-freese proces worden bevroren. Dit kan bijvoorbeeld op een gekozen moment zijn, bijvoorbeeld wanneer een sampledeeltje 6 zich in een bepaalde toestand bevindt, hetgeen wordt waargenomen door een meetinstrument 32. Ook na het quenche-freese proces kan de microreactor 5 contact en/of uitwisseling tussen het 20 sample 6 en de omgeving op gunstige wijze voorkomen.

In bepaalde uitvoeringsvormen zijn additionele positioneringsmiddelen voorzien in de microreactor 5 waarmee het sample 6 kan worden gepositioneerd. In een uitvoeringsvorm zijn bijvoorbeeld de binnenkanten van de membranen 16, 17 plaatselijk hydrofiel dan wel 25 hydrofoob gemaakt, zodat een laagje water met het sample 6 zich op het hydrofiele gedeelte zal fixeren. Een hydrofobe sample 6 zal zich bijvoorbeeld na het in de reactor 5 vloeien op een tevens hydrofoob deel van een membraan 16, 17 kunnen bevinden. Positionering van het sample 6 kan ook geschieden door plaatselijk druk uit te oefenen op het buigzame membraan 30 16, 17, zoals geïllustreerd in de figuren 4A en 4B.

15

Een andere wijze van positioneren van het sample 6 is bijvoorbeeld door te 'spelen' met vloeistofstromen door drukverschillen toe te passen via de inlaat 14 en de uitlaat 15.

In een uitvoeringsvorm is het laadperron 33 ingericht om een 5 samplehouder 10 en een microreactor 5 op te nemen, zoals schematisch is getoond in figuur 5A. De samplehouder 10 is bij voorkeur tevens speciaal ingericht om de microreactor 5 op te nemen en gekoeld te houden, althans het sample 6 in de microreactor 5.

In een uitvoeringsvorm van de laadperron 33 is een bodem 22 en 10 een ronde opstaande wand voorzien. In de bodem 22 is een eerste uitsparing 23 voorzien voor het plaatsen van de microreactor 5. Aan de zijden van de eerste uitsparing 23 zijn tweede uitsparingen 26 voorzien voor het plaatsen en oppakken van een microreactor 5 respectievelijk in en uit de eerste uitsparing 23, met een schematisch aangegeven hulpmiddel 27. Een opening 15 24 is voorzien voor het in het laadperron 33 schuiven van tenminste het uiteinde van de samplehouder 10. Zodoende kan de microreactor 5 in het laadperron 33 in een inschuifopening 28 van de samplehouder 10 worden gebracht. Daartoe sluit de eerste uitsparing 23 aan op de opening 24, waardoor het uiteinde van de samplehouder 10 in de eerste uitsparing 23 20 ligt en de microreactor 5 relatief eenvoudig en veilig via de inschuifopening 28 in de samplehouder 10 kan worden geschoven.

Bij voorkeur omsluit de eerste uitsparing 23 de microreactor 5 tenminste ten dele aan de zijden, zodat de microreactor 5 wordt geleid bij het in de samplehouder 10 schuiven en met relatief weinig moeite in de 25 samplehouder 10 kan worden geschoven. Een en ander is aangetoond in figuur 5B en 5C. Het is tevens gunstig indien een verdieping 23B in de eerste uitsparing 23 is voorzien, zodat de hoogte van de ligging van de microreactor 5 aansluit op de hoogte van de inschuifopening 28 in de samplehouder 10. Zo kan de microreactor 5 evenwijdig aan de bodem van de 30 eerste uitsparing 23 in de samplehouder 10 worden geschoven.

16

De samplehouder 10 is voorzien van een klemspie 29 zodat de microreactor 5 in de samplehouder 10 wordt geklemd. Ten minste een, bij voorkeur meerdere wanddelen van de microreactor 5 sluiten aan op de binnenzijde van de samplehouder 10, althans de binnenzijde nabij de 5 inschuifopening 28. Hierdoor kan een zo groot moge lijk thermisch contact tussen de samplehouder 10 en de microreactor 5 worden bewerkstelligd zodat het sample 6 via de gekoelde samplehouder 10 koel wordt gehouden. Door deze maatregel worden de cryo-omstandigheden van het sample 6 beter gecontroleerd. Ter plaatse in de houder 10 wordt een lage temperatuur 10 behouden voor het naar de elektronenmicroscoop 11 vervoeren van de samplehouder 10 met een sample 6 zodat niet alsnog kristallen worden gevormd in het bevroren vloeistof. De samplehouder 10 kan in principe een bekende samplehouder 10 of cryo-houder 10, 34 zijn, maar in een gunstige uitvoeringsvorm is het uiteinde van de samplehouder 10, althans nabij de 15 inschuifopening 28, speciaal ingericht om een microreactor 5 koel te houden bijvoorbeeld door genoemd zo groot mogelijk thermische contact tussen samplehouder 10 en microreactor 5. Hierbij sluiten bijvoorbeeld de afmetingen van de binnenzijden van de samplehouder 10 aan op de afmetingen van de microreactor 5. Dit, in tegenstelling tot conventionele 20 gekoelde samplehouders 10 voor CEM, welke in principe niet zijn ingericht voor het houden van microreactors 5 volgens de uitvinding.

In figuur 6A - 61 is het schuiven van het sample 6 in de samplehouder 10 in stappen geïllustreerd. In figuur 6A is te zien dat de samplehouder 10 door de opening 24 in het laadperron 33 is gebracht en dat 25 de microreactor 5 in de eerste uitsparing 23 van de bodem 22 van het laadperron 33 ligt. De microreactor 5 bevindt zich nog niet in de houder 10. In figuur 6B wordt de microreactor 5 via de inschuifopening 28 van de samplehouder 10 in de samplehouder 10 geschoven en vervolgens wordt in figuren 6C tot 6E de klemspie 29 gepositioneerd, zodat de microreactor 5 bij 30 voorkeur met voldoende thermisch contact tussen microreactor 5 en 17 samplehouder 10 vastzit in de samplehouder 10. Het moge duidelijk zijn dat in plaats van een microreactor 5 tevens andere tussenmiddelen voor het houden van het sample 6, zoals bijvoorbeeld een cartridge 36, geschikt kunnen zijn voor het volgens een dergelijk principe in de samplehouder 10 5 schuiven van het sample 6.

In een bekende uitvoeringsvorm van een samplehouder 10 dient het sample 6 zich hierbij ter hoogte van het gat 41 te bevinden. Nadat deze samplehouder 10 vervolgens in de elektronenmicroscoop 11 is gebracht zal de elektronenbundel door het gat 41 door het vensteroppervlak 20 het 10 sample 6 bestralen. Zoals te zien in figuur 6F wordt vóór het in de elektronenmicroscoop 11 plaatsen een afsluithuls 35 over het einde van de samplehouder 10 geschoven zodat het gat 41 wordt gedicht en het sample 6 enigszins afgeschermd tegen ijsformatie tijdens transport naar de elektronenmicroscoop 11. In de elektronenmicroscoop 11 wordt de 15 afsluithuls 35 weer teruggeschoven en het gat 41 geopend.

Een alternatieve wijze voor afschermen wordt met een uitvoeringsvorm van een samplehouder 10 geboden, zoals te zien in figuur 6G-6I waarbij de microreactor 5 verschuifbaar is binnen de samplehouder 10. Hierbij kan het sample 6 onder het gat 41 worden geschoven. Echter 20 wordt bij deze uitvoeringsvorm niet het gat 41 afgeschermd, zoals te zien in figuur 6F, maar zoals weergegeven in figuur 6H en 61 wordt het sample van het gat 41 weggeschoven, zodat het sample 6 met voldoende thermische uitwisseling met de samplehouder 10 buiten het laadperron 33 naar bijvoorbeeld een elektronenmicroscoop 11 kan worden getransporteerd. Zo is 25 het sample 6 alsnog afgeschermd. Zelfs indien het nog enigszins buiten de samplehouder 10 steekt, wordt het sample 6 nog voldoende gekoeld, mede doordat de samplehouder 10 de microreactor 5 op een thermisch geleidende wijze omsluit, waarbij de microreactor 5 tevens in een lengterichting 1 van de samplehouder 10 wordt geleid langs de binnenzijden van de 30 samplehouder 10. De afsluithuls 35 is daarmee niet noodzakelijk. Als de 18 samplehouder 10, althans het gat 41, in de elektronenmicroscoop 11 is gepositioneerd zal het sample 6 onder het gat 41 worden geschoven.

Indien andere sampledragers (bijvoorbeeld cartridges 36) dan een microreactor 5 worden gebruikt voor het houden van het sample 6 is het 5 gunstig indien het contactoppervlak tussen de samplehouder en de andere sampledrager zodanig is dat de koeling van de samplehouder 10 wordt overgebracht. Zo kan de samplehouder 10 zijn ingericht om het sample 6 in de andere sampledrager op eenvoudige en veilige wijze over te brengen naar een elektronenmicroscoop 11, waarbij het ijs de nagenoeg amorfe vorm niet 10 verliest en het sample 6 nagenoeg onveranderd zal blijven. Sampledragers voor het houden van het sample 6 kunnen bijvoorbeeld een cartridge 36 (zie figuur 7) omvatten, waarbij voor de uitvinding de afmetingen van de cartridge 36 worden aangepast zodat het op voordelige wijze in de samplehouder 10 volgens de uitvinding past. Ook hier wordt bij voorkeur 15 een voor de cartridge 36 geschikte klemspie 29 voorzien, die de cartridge 36 in de samplehouder 10 klemt.

Een voorbeeld van een cartridge 36 die geschikt is voor CEM is weergegeven in figuur 7. De cartridge 36 is uitgerust met een klapmechanisme 37 met scharnier 37A. Het klapmechanisme 37 kan 20 worden opgeklapt zodat het sample 6, bijvoorbeeld op een grid of tussen membranen, in de cartridge 36 kan worden geplaatst. Vervolgens wordt het klapmechanisme 37 dichtgeklapt waarbij een borging 38 is voorzien voor het dichthouden. Het sample 6 kan nu door het venster 18 worden bestraald met elektronen of ionen. Een voordeel van het gebruik van de cartridge 36 25 kan bijvoorbeeld zijn dat relatief eenvoudig lagen van het sample 6 kunnen worden verwijderd, bijvoorbeeld met de gefocusseerde ionenbundel, aangezien voor een zo goed mogelijk resultaat de ionenbundel onder een bij voorkeur vlakke hoek de sample 6 dient te bestralen, hetgeen hieronder nog eens wordt uitgelegd. Een cartridge 36 biedt veelal de mogelijkheid hiertoe 30 aangezien deze veelal relatief plat zijn uitgevoerd. Tevens kan de cartridge 19 36 op vergelijkbare wijze als de microreactor 5 in de samplehouder 10 worden geschoven. Een nadeel kan bijvoorbeeld zijn dat bij gebruik van een cartridge 36 de omgevingsfactoren, zoals bijvoorbeeld de druk, temperatuur en vochtigheid, vlakbij het sample 6 minder goed kunnen worden 5 gecontroleerd als bij de microreactor 5.

Figuur 8A-C tonen schematisch een uitvoeringsvorm van een microreactor 5 waarmee relatief eenvoudig laagjes materiaal van het sample 6 kunnen worden verwijderd, in het bijzonder met behulp van bijvoorbeeld een gefocusseerde ionenbundel en/of een ultramicrotoom. Tevens is deze 10 uitvoeringsvorm voordelig voor gebruik bij cryo-tomografïe. Bij deze microreactor 5 worden omgevingsomstandigheden van het sample 6, zoals vochtigheid en temperatuur, alsnog gecontroleerd. Daartoe zijn een inlaat 14 en een uitlaat 15 voorzien die voeren naar en van de kamer 19 tussen de membranen 16, 17. Ook hier omvat de microreactor een eerste en een 15 tweede chip, waartussen de membranen 16, 17 kunnen worden geplaatst, zoals weergegeven in figuur 8B.

Bij gebruik van een microreactor 5 volgens figuur 8A wordt het sample 6, dat ten behoeve van de duidelijkheid van de tekening hier niet is weergegeven, in de kamer 19 gevloeid of op andere wijze daarin geplaatst.

20 Bij deze uitvoeringsvorm is het venster 18 in een relatief plat deel 39 geplaatst. De constructie van het platte deel 39 kan enigszins worden versterkt door de inlaat 14 en uitlaat 15, waarmee enige versteviging van het platte deel 39 wordt bereikt. Het is gunstig indien het vensteroppervlak 20 relatief groot is ten opzichte van de diepte d3 van het venster 18, althans 25 de dikte van het platte deel 39. Dit maakt het namelijk mogelijk dat het sample 6 onder een relatief vlakke hoek oc kan worden nabehandeld met bijvoorbeeld een ionen- of elektronenbundel 40. In deze kan onder hoek α worden verstaan de hoek tussen het vensteroppervlak 20 en genoemde bundel 40. Dit is gunstig aangezien bij ionenbundel beschieting over het 30 algemeen uniforme dunning van het sample 6 beter wordt bereikt naarmate 20 de hoek a vlakker is. Tevens maakt het platte deel 39 het eenvoudiger het sample 6 te snijden, bijvoorbeeld met een ultramicrotoom. Het wordt eenvoudiger gemaakt een deel van de microreactor 5 mee te verwijderen.

Zoals gezegd kan door het vlakke deel 39 met het relatief grote 5 vensteroppervlak 20 een gefocusseerde ionenbundel 40 op het sample 6 worden gestraald voor het verwijderen van lagen materiaal, zoals te zien in figuur 8C. Tevens kan een elektronenbundel 40 van een elektronenmicroscoop 11 het sample 6 onder relatief vlakke hoek α bestralen. Deze vlakke hoek α wordt bereikt door de microreactor 5 met 10 behulp van de samplehouder 10 te kantelen, bijvoorbeeld om verschillende assen, ten opzichte van de elektronenbundel 40. Het moge duidelijk zijn dat met een dergelijk vlak deel 39 van de microreactor 5 en het om bepaalde assen kantelen van de microreactor 5, het sample 6 onder meer hoeken kan worden bestraald. Daarmee is de onderhavige uitvoeringsvorm gunstig voor 15 cryo-tomografie.

In een uitvoeringsvorm van de microreactor 5 steekt het vlakke deel 39 nog uit de samplehouder 10 indien deze in de samplehouder 10 is geplaatst. Hierbij wordt de microreactor 5 nog voldoende gekoeld terwijl het mogelijk is onder een grotere veelvoud van hoeken en onder relatief 20 vlakkere hoeken α het sample 6 te bestralen dan wanneer de microreactor 5 geheel in de samplehouder 10 is geplaatst.

De beschreven en vele vergelijkbare variaties, evenals combinaties daarvan, worden geacht binnen het door de conclusies geschetste raam van de uitvinding te vallen. Uiteraard kunnen verschillende aspecten van 25 verschillende uitvoeringsvormen en/of combinaties daarvan met elkaar worden gecombineerd en uitgewisseld binnen het raam van de uitvinding en dient niet tot slechts de genoemde uitvoeringsvormen te worden beperkt.

30

103222A

Claims (27)

1. Werkwijze voor sample preparatie voor cryo-elektronenmicroscopie (CEM), waarbij het sample in een microreactor wordt gehouden, waarbij de condities in de microreactor worden geregeld ten opzichte van de omgeving, waarbij het sample in de microreactor volgens een quench-freese proces 5 wordt ingevroren, waarna het sample in ingevroren toestand in de elektronenmicroscoop wordt geplaatst.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de gecontroleerde condities tenminste vochtigheid, temperatuur en/of druk omvatten.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij een deel van het 10 sample dat in de microreactor is geplaatst in ingevroren toestand wordt weggenomen, in het bijzonder bij een temperatuur onder de 150°K, meer in het bijzonder onder ongeveer 140°K, met behulp van daarvoor geschikte middelen, bijvoorbeeld een gefocusseerde ionenbundel en/of ultramicrotoom.

4. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, waarbij de 15 sample houdende microreactor in een gekoelde omgeving, bijvoorbeeld een laadperron, is geplaatst en in een gekoelde samplehouder wordt geschoven, bij een temperatuur onder de 150°K, bij voorkeur op ongeveer 140°K.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij de gekoelde samplehouder over een relatief groot contactoppervlak contact maakt met de daarin 20 geplaatste microreactor.

6. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, waarbij de microreactor is voorzien van een relatief plat deel met een venster, waarbij de microreactor tenminste deels in een gekoelde samplehouder wordt geschoven, zodanig dat het venster van de microreactor tenminste deels 25 buiten de samplehouder uitsteekt. f032224

7. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, waarbij het -sample in de microreactor vóór het invriezen middels een optische microscoop of een röntgenstraling diffractie microscoop wordt waargenomen.

8. Microreactor voor gebruik bij cryo-elektronenmicroscopie (CEM), 5 omvattende een eerste en tweede membraan, welke membranen tenminste in gebruiktoestand een kamer insluiten, waarbij de membranen zijn geconfigureerd om stand te houden tot aan althans het begin van een quench-freese proces.

9. Microreactor volgens conclusie 8, waarbij tenminste een inlaat 10 en/of uitlaat is voorzien voor het in en/of door de kamer voeren van fluïdum.

10. Microreactor volgens conclusie 8 of 9, waarbij de membranen ten minste gedeeltelijk transparant zijn voor een elektronenbundel van een elektronenmicroscoop

11. Microreactor volgens conclusie 10, waarbij de membranen zijn 15 geconfigureerd om over een ten opzichte van de dikte van de membranen relatief groot oppervlak transparantie te bieden voor elektronenbundels.

12. Microreactor volgens een der conclusies 8 - 11, waarbij de membranen zich, tenminste in gesloten toestand van de microreactor, op een onderling ongeveer gelijke afstand van elkaar tegenover elkaar 20 uitstrekken en/of waarbij de microreactor is ingericht om de afstand tussen de membranen te laten variëren.

13. Microreactor volgens een der conclusies 8 - 12, waarbij tegendrukmiddelen voor de membranen zijn voorzien

14. Microreactor volgens een der conclusies 8 - 13, waarbij de 25 tegendrukmiddelen tenminste een kolom en/of tussenschot aan de binnen en/of buitenzijde van de kamer omvatten.

15. Microreactor volgens een der conclusies 8 - 14, waarbij de tegendrukmiddelen een drukregeling omvatten.

16. Microreactor volgens een der conclusies 8 - 15, waarbij de tegendrukmiddelen tenminste een verdikking in tenminste een membraan omvatten.

17. Microreactor volgens een der conclusies 8 - 16, waarbij de dikte van 5 de membranen tenminste plaatselijk kleiner of gelijk is aan ongeveer 50 nm, in het bijzonder kleiner of gelijk aan ongeveer 20 nm, meer in het bijzonder kleiner of gelijk aan ongeveer 10 nm.

18. Microreactor volgens een der conclusies 8 - 17, waarbij de membranen langer en/of breder zijn dan ongeveer 50 μιη, in het bijzonder 10 langer en/of breder dan ongeveer 200 pm.

19. Microreactor volgens een der conclusies 8 - 18, waarbij de afstand tussen de membranen kleiner is dan 5 pm, bij voorkeur kleiner dan ongeveer 200 nm.

20. Microreactor volgens een der conclusies 8 - 19, voor toepassing in 15 een werkwijze volgens een der conclusies 1-7.

21. Cryo-elektronenmicroscopie (CEM) samplehouder voor het koelen en houden van een microreactor volgens een der conclusies 8 - 20, waarbij nabij het uiteinde van de samplehouder, binnenzijden van de samplehouder aansluiten op buitenzijden van de microreactor.

22. Cartridge voor het houden van een sample, waarbij de afmetingen van de cartridge zijn uitgevoerd voor plaatsing in een samplehouder volgens conclusie 21.

23. Klemspie voor het klemmen van een microreactor en/of cartridge volgens conclusie 22 in een samplehouder volgens conclusie 21.

24. Laadperron voor gebruik bij cryo-elektronenmicroscopie (CEM), omvattende een bodem en tenminste een opstaande wand, waarbij in een wand een opening is voorzien voor het inbrengen van een CEM samplehouder, waarbij in de bodem van het laadperron een eerste uitsparing is voorzien, bij voorkeur met een rechthoekige vorm, zodat een 30 microreactor, cartridge en/of samplehouder ten minste deels in genoemde eerste uitsparing kan rusten, waarbij de eerste uitsparing aansluit op de opening, zodat, indien de samplehouder door de opening deels in het laadperron is gebracht, de microreactor en/of cartridge in hoofdzaak evenwijdig aan de bodem van de eerste uitsparing in de samplehouder kan 5 worden geschoven.

25. Laadperron volgens conclusie 24, waarbij eerste uitsparing een verdieping bevat zodat de microreactor en/of cartridge in hoofdzaak horizontaal in de samplehouder kan worden geschoven.

26. Laadperron volgens conclusie 24 of 25, waarbij tweede 10 uitsparingen bij de eerste uitsparing zijn voorzien om ruimte te creëren voor een hulpmiddel voor het plaatsen en/of wegnemen van de microreactor.

27. Systeem welke geschikt is voor toepassing van een werkwijze volgens een der conclusie 1-7, omvattende een microreactor volgens een der conclusies 8-20 en/of een laadperron volgens een der conclusies 24 - 27 15 en een elektronenmicroscoop. 1 0 3 2 22 4