NL1024404C2

NL1024404C2 - Optische microscoop en werkwijze voor het vormen van een optisch beeld.

Info

Publication number: NL1024404C2
Application number: NL1024404A
Authority: NL
Inventors: Yuval Garini; Ian Theodore Young
Original assignee: Univ Delft Tech
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2005-03-31
Also published as: JP2007507744A; CA2540710A1; WO2005031430A1; US20060250686A1; EP1671171A1

Description

Optische microscoop en werkwijze voor het vormen van een optisch beeld

De uitvinding heeft betrekking op een optische microscoop tenminste omvattende een lichtbron, een drager voor een te onderzoeken object, een detector voor registratie van het belichte object, en een lichtweg die tijdens bedrijf in 5 hoofdzaak verloopt van de lichtbron naar het object en van het object naar de detector, waarbij in de lichtweg tussen de lichtbron en het object een metallische dunne film met een periodiek gatenpatroon is geplaatst en dat de drager van het object voorzien is van een aandrijving voor het in het vlak 10 van de drager verstellen daarvan.

Tevens heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het vormen van een optisch beeld van een object onder gebruikmaking van een lichtbron voor het belichten en/of doorlichten van het object, en een detector voor het 15 registreren van licht dat van het object afkomstig is, en waarbij tussen de lichtbron en het object een metallische dunne film met een periodiek gatenpatroon is geplaatst, en waarbij het object in een vlak verplaatst wordt dat in hoofdzaak evenwijdig verloopt aan de metallische plaat.

20 Een dergelijke optische microscoop en werkwijze zijn bekend uit de Amerikaanse octrooiaanvrage nr. 09/981.280, gepubliceerd onder nummer ÜS 2002/0056816 Al.

Uit deze publicatie is een zogenaamde surface plas-mon enhanced microscopy-inrichting bekend waarbij een object 25 geplaatst is boven een lens van de microscoop, en waarbij een meervoudige fiberbundel, dat wil zeggen een van meerdere uitgangen voorziene glasfiberprobe, zeer dicht nabij het object wordt gebracht ter belichting daarvan. Voor de belichting kan gebruik gemaakt worden van iedere geschikte lichtbron zoals 30 een gepompte laser, een lichtemitterende diode, een booglamp of een andere generator voor wit licht dat na passage van een filter en een polarisator de fiberbundel wordt ingebracht.

Het licht dat de fiberbundel aan het uiteinde dat zich bij het object bevindt verlaat, resulteert in een aantal op het 1024404 I 2

I object geprojecteerde lichtspots die in het verre veld met I

I daartoe gebruikelijke optica worden waargenomen en gedetec- I

I teerd met een detector vormgegeven als een gekoelde CCD- I

I inrichting. Het object is geplaatst op een drager die is uit- I

I 5 gevoerd als een in het horizontale vlak verstelbare tafel. I

I Hiermee kan het object in horizontale xy-richting versteld I

I worden, zodat het oppervlak van het object geheel in beeld I

I kan worden gebracht. I

I Hoewel de publicatie een meervoudige fiberbundel I

I 10 toepast voor de belichting van het object, kan de meervoudige I

I lichtbundel volgens deze publicatie eveneens verkregen worden I

I door gebruikmaking van een metallische dunne film. De metal- I

I lische dunne film volgens deze publicatie is echter vrij ge- I

I compliceerd van constructie, waarbij aan onder- en bovenzijde I

I 15 van de film verschillende metalen worden toegepast. I

I Het is een doelstelling van de uitvinding om te I

I voorzien in een werkwijze en een optische microscoop waarmee I

I objecten met hoge resolutie driedimensionaal kunnen worden I

I weergegeven. I

I 20 Het is tevens een doelstelling de optische micro- I

I scoop waarvan een metallische dunne film conform de aanhef I

I deel uitmaakt, eenvoudiger te construeren. I

I In een eerste aspect van de uitvinding wordt de I

I voorgestelde werkwijze erdoor gekenmerkt dat het object en de I

I 25 metallische plaat van elkaar af of naar elkaar toe bewogen I

worden en dat het door de detector geregistreerde licht ver- I

I werkt wordt ter vorming van een driedimensionaal beeld van I

I het object. I

I In deze werkwijze volgens de uitvinding is het moge- I

I 30 lijk dat het object stilstaat en de metallische plaat be- I

I weegt. In het geval de metallische plaat beweegbaar is uitge- I

I voerd, kan de inrichting waarin deze is opgenomen stationair I

I zijn opgesteld. Ook is denkbaar om het object stationair op I

I te stellen terwijl de metallische plaat met inbegrip van de I

I 35 inrichting waarvan deze deel uitmaakt beweegbaar is opge- I

I steld. I

I Doelmatiger is evenwel dat de inrichting en de me- I

I tallische plaat stationair zijn opgesteld en dat het object I

I 1024404- I

3 ten behoeve van de driedimensionale beeldvorming in de inrichting versteld wordt. Daartoe wordt de optische microscoop volgens de uitvinding erdoor gekenmerkt dat de aandrijving is ingericht voor verstelling van de drager voor het object in 5 een richting loodrecht op het vlak van de drager, en dat voorzien is in een verwerkingsorgaan dat aangesloten is op de detector voor het construeren van een driedimensionaal beeld van het object.

Deze driedimensionale beeldvorming van het object 10 die de uitvinding mogelijk maakt, is in het bijzonder doelmatig wanneer onderzoek verricht wordt aan biologische cellen of ander biologisch materiaal. Dergelijke cellen worden daarbij door het van de lichtbron afkomstige licht geheel doorlicht .

15 In een verder aspect van de uitvinding is de opti sche microscoop erdoor gekenmerkt dat de metallische dunne film homogeen en eendelig is. Het door het periodieke gatenpatroon van deze metallische dunne film tredende licht bezit een gunstig kleine spreiding.

20 Bovendien maakt dit dat de optische microscoop vol gens de uitvinding eenvoudig geconstrueerd kan worden en tegen lage kosten beschikbaar kan komen. De microscoop volgens de uitvinding bezit bovendien gunstige confocale eigenschappen.

25 De beeldvorming van het object kan eenvoudig verlo pen in een uitvoering van de optische microscoop die erdoor gekenmerkt is dat het periodiek gatenpatroon is voorzien van gaten die een onderlinge afstand hebben zodanig dat licht dat door naburige gaten schijnt een onderling niet-interfererend 30 diffractiepatroon bezitten.

Wanneer snellere beeldacquisitie wenselijk is, kunnen de gaten dichter bij elkaar geplaatst worden en is het wenselijk dat het verwerkingsorgaan dat aangesloten is op de detector is ingericht voor het verwerken van een spreidings-35 functie van iedere belichtingsplek op het object.

Het verkrijgen van hoge objectresoluties kan daarbij effectief ondersteund worden doordat het verwerkingsorgaan op de spreidingsfuncties van de belichtingsplekken op het object 1024404

een deconvolutiebewerking uitvoert. I

In een bepaalde uitvoeringsvorm van de optische mi-

croscoop volgens de uitvinding kan de driedimensionale beeld- I

vorming van het object effectief verlopen doordat de aandrij- I

5 ving is ingericht voor a) een verstelling over het gehele be- I

reik in het vlak van de drager, gevolgd door b) een stapver- I

stelling loodrecht op het vlak van de drager, waarna c) we- I

derom een verstelling over het gehele bereik in het vlak van I

de drager plaatsvindt, en dat de verstellingen a, b en c wor- I

10 den herhaald tot het object geheel is belicht. I

In een alternatieve uitvoeringsvorm kan de driedi- I

mensionale beeldvorming effectief bereikt worden doordat de I

optische microscoop het kenmerk heeft dat de aandrijving is I

ingericht voor d) een verstelling over het gehele bereik I

15 loodrecht op het vlak van de drager, gevolgd door e) een ver- I

stelling in het vlak van de drager, waarna f) wederom een I

verstelling over het gehele bereik loodrecht op het vlak van I

de drager plaatsvindt, en dat de verstellingen d, e en f wor- I

den herhaald tot het object geheel is belicht. I

20 De uitvinding zal in het navolgende verder worden I

toegelicht aan de hand van een niet-beperkend uitvoerings- I

voorbeeld en onder verwijzing naar de tekening. I

In de tekening toont: I

- figuur 1 een metallische dunne film (figuur IA) en I

25 een metallische dunne film met een periodiek gatenpatroon I

(figuur 1B), I

- figuur 2 een sterk vergroot weergegeven typisch voorbeeld van een metallische dunne film, met een periodiek

gatenpatroon overeenkomstig de uitvinding, I

30 - figuur 3 een 3D-beeld van de waargenomen intensi-

teitsverdeling van licht dat door de metallische dunne film I

volgens figuur 2 treedt, I

- figuur 4 een schematische weergave van de optische microscoop volgens de uitvinding, 35 - figuur 5 enkele spreidingsfuncties zoals verkregen

met gebruikmaking van de metallische dunne film volgens fi- I

guur 2 in een optische microscoop volgens de uitvinding, I

- figuur 6 een tweede schematische weergave van de I

1024404 I

5 optische microscoop volgens de uitvinding.

Figuur IA toont een deel van een metallische dunne film, welke een dikte bezit die ligt in het bereik 50 nm tot 5 μπι. Figuur 1B toont de metallische dunne film van figuur 5 IA, zoals voorzien van een periodiek gatenpatroon.

In werkelijkheid bezit een dergelijke metallische dunne film met een periodiek gatenpatroon afmetingen tussen de gaten van omstreeks 1 pm zoals getoond in figuur 2. De in deze figuur 2 getoonde metallische dunne film is vervaardigd 10 uit 600 nm dik zilver, welke opgedamd is op een glassubstraat en waarbij de gaten zijn voorzien van een diameter van circa 200 nm en een hart-tot-hartafstand in x- en y-richting van 800 nm. Voor het beoogde doel van toepassing in een optische microscoop kan de metallische dunne film ieder geschikt me-15 taal zijn, bij voorkeur echter zilver, aluminium, goud of dergelijke.

Gebruikmaking van de in figuur 2 getoonde metallische dunne film bij het belichten van een object levert bijzondere resultaten op. Een hoog percentage van het licht dat 20 de gaten bereikt treedt daar doorheen en wordt wat betreft de spectrale samenstelling beïnvloed door de metallische dunne film. Het doortredende licht bezit bij geschikte uitvoering van de metallische dunne film bovendien een zeer kleine dif-fractiehoek.

25 Het licht dat van het via de metallische dunne film belichte object afkomstig is, kan waargenomen worden met gebruikelijke verre-veldoptica, onder gebruikmaking van bijvoorbeeld een op een geschikte afstand van het te onderzoeken object opgesteld objectief. Het licht kan vervolgens met een 30 CCD-camera of dergelijke worden gemeten. Wanneer de afstanden tussen de gaten van de metallische dunne film ver genoeg van elkaar verwijderd zijn zodat de verre-velddiffractie van twee naburige belichte punten op het object niet overlappen, dan kan het met de CCD-camera gemeten signaal eenvoudig gebruikt 35 worden voor de beeldvorming van het object. Het object kan in zijn geheel in beeld gebracht worden door deze op bekende wijze in xy-richting te verstellen totdat een volledige belichting en beeldvorming van het oppervlak is gerealiseerd.

i 024404 -

6 I

Ter toelichting toont figuur 3 een driedimensionale I

weergave van de gemeten lichtintensiteit over een beperkt ge- I

bied van de metallische dunne film wanneer deze gebruikt I

wordt voor de belichting van een object op de hiervoor be- I

5 schreven wijze. I

Figuur 4 toont het werkingsprincipe van de optische I

microscoop volgens de uitvinding. Licht 1 afkomstig van een I

geschikte lichtbron valt op een metallische dunne film 2 wel- I

ke voorzien is van een periodiek gatenpatroon. Het door de I

10 gaten 3 van de metallische dunne film 2 tredende licht bezit I

een geringe mate van diffractie, bijvoorbeeld circa 6°. Het I

te onderzoeken object 4 bevindt zich zo dicht mogelijk in de I

lichtweg achter de metallische dunne film 2. Het door de ga- I

ten 3 tredende licht kan fluorescerende punten van het object I

15 4 belichten, hetgeen voor een enkel punt 5 in de figuur is I

getoond. I

In de lichtweg achter het object 4 bevindt zich con- I

ventionele optica voor waarneming in het verre veld van het I

licht dat van het object 4 afkomstig is. Van deze optica kan I

20 bijvoorbeeld een lens 6 deel uitmaken, een filter 7 en een I

CCD-inrichting 8 of een andere geschikte detector. I

Het licht dat van het fluorescerende punt 5 van het I

object 4 afkomstig is, zal door de CCD-inrichting 8 worden I

waargenomen in de vorm van een spreidingsfunctie zoals ge- I

25 toond in figuur 5. Figuur 5 toont deze spreidingsfunctie voor I

diverse afstanden "U" van de metallische dunne film 2 ten op- I

zichte van het object 4. Duidelijk is dat de afstand "Uw het I

maximum van de spreidingscurve beïnvloedt, alsmede de mate I

van spreiding in het vlak van de CCD-detector. I

30 Figuur 6 toont een schematische weergave van de op- I

tische microscoop volgens de uitvinding. Licht dat afkomstig I

is van een lichtbron 9 wordt via optica 10, 11, 12 naar een I

metallische dunne film 13 met een periodiek gatenpatroon ge- I

richt zoals hiervoor toegelicht onder verwijzing naar de fi- I

35 guren 1, 2, 3 en 4. Het licht dat de metallische dunne film I

13 passeert, belicht een te onderzoeken object 14. Het licht I

dat ten gevolge daarvan van dit object 14 afkomstig is, wordt I

via conventionele optica 15, 16 geleid naar en gedetecteerd I

1024404 I

7 met een detector 17. Deze detector 17 is bijvoorbeeld uitgevoerd als CCD-camera. Het met de detector 17 waargenomen licht wordt verwerkt in een verwerkingsorgaan, bijvoorbeeld in de vorm van een computer 18 die voorzien is van een VDU-5 eenheid voor weergave van het gereconstrueerde beeld van het object 14.

De metallische dunne plaat 13 is gekoppeld met een aandrijfeenheid 20 voor het verstellen van de metallische dunne plaat 13 in zowel xy-richting als in z-richting lood-10 recht op het xy-vlak, zodat een driedimensionale verstelling van de metallische dunne plaat 13 mogelijk is en daarmee een belichting van het object 14 zodanig dat het beeld van dit object 14 driedimensionaal kan worden geconstrueerd door het verwerkingsorgaan 18. Hiertoe dient de aandrijving te voor-15 zien in stapgrootten in xy- en z-richting in het bereik 5 tot 500 nm.

Zoals hiervoor reeds toegelicht is ook denkbaar om het object 14 stationair op te stellen en de metallische dunne plaat 13 verplaatsbaar in zowel xy-richting als in z-20 richting uit te voeren. Bij deze laatste uitvoering is het bovendien mogelijk om de inrichting waarvan de metallische dunne plaat deel uitmaakt als zodanig stationair op te stellen en uitsluitend de metallische dunne plaat verstelbaar uit te voeren. In het verwerkingsorgaan 18 dat is aangesloten op 25 de detector 17 dient in dat geval een geschikte (softwarematige) aanpassing van de gemeten lichtpunten op het object 14 plaats te vinden. Minder praktisch maar theoretisch denkbaar is om het object 14 stationair op te stellen en de gehele inrichting waarvan de metallische dunne plaat 13 deel uitmaakt 30 beweegbaar op te stellen. Ter completering van het uitsluitend recht dat aan aanvraagster toekomt, wordt niettemin deze mogelijkheid genoemd.

De hiervoor gegeven toelichting aan de hand van het besproken uitvoeringsvoorbeeld is niet beperkend ten aanzien 35 van de navolgende conclusies. Diverse varianten in de uitvoering van de in figuur 6 schematisch getoonde optische microscoop zijn mogelijk zonder verlaten van de uitvindingsgedach-te die gespecificeerd is in de navolgende conclusies. Zo is 1024404 8 het bijvoorbeeld mogelijk om de detector en de optica die dient voor het geleiden en richten van het door het object gefluoresceerde licht aan de zijde te plaatsen waar ook de I lichtbron is geplaatst. Hoewel de lichtopbrengst ter plaatse I 5 van de detector dan lager is, is een voordeel dat in die uit- I voering een verder verbeterde resolutie bereikbaar is.

I 1024404 -

Claims

1. Optische microscoop tenminste omvattende een lichtbron, een drager voor een te onderzoeken object, een detector voor registratie van het belichte object, en een 5 lichtweg die tijdens bedrijf in hoofdzaak verloopt van de lichtbron naar het object en van het object naar de detector, waarbij in de lichtweg tussen de lichtbron en het object een metallische dunne film met een periodiek gatenpatroon is geplaatst en dat de drager van het object voorzien is van een 10 aandrijving voor het in het vlak van de drager verstellen daarvan, met het kenmerk, dat de aandrijving is ingericht voor verstelling van de drager in een richting loodrecht op het vlak van de drager, en dat voorzien is in een verwer-kingsorgaan dat aangesloten is op de detector voor het con-15 strueren van een driedimensionaal beeld van het object.

2. Optische microscoop volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het periodiek gatenpatroon is voorzien van gaten die een onderlinge afstand hebben zodanig dat licht dat door naburige gaten schijnt een onderling niet-interfererend dif- 20 fractiepatroon bezitten.

3. Optische microscoop volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de aandrijving is ingericht voor a) een verstelling over het gehele bereik in het vlak van de drager, gevolgd door b) een stapverstelling loodrecht op het vlak van 25 de drager, waarna c) wederom een verstelling over het gehele bereik in het vlak van de drager plaatsvindt, en dat de verstellingen a, b en c worden herhaald tot het object geheel is belicht.

4. Optische microscoop volgens conclusie 1 of 2, met 30 het kenmerk, dat de aandrijving is ingericht voor d) een verstelling over het gehele bereik loodrecht op het vlak van de drager, gevolgd door e) eeri verstelling in het vlak van de drager, waarna f) wederom een verstelling over het gehele bereik loodrecht op het vlak van de drager plaatsvindt, en dat 35 de verstellingen d, e en f worden herhaald tot het object geheel is belicht. 1024404 *

10 I

5. Optische microscoop volgens een der voorgaande I conclusies, met het kenmerk, dat het verwerkingsorgaan dat I aangesloten is op de detector is ingericht voor het verwerken I 5 van een spreidingsfunctie van iedere belichtingsplek op het I object. I

6. Optische microscoop volgens conclusie 5, met het I kenmerk, dat het verwerkingsorgaan op de spreidingsfuncties I van de belichtingsplekken op het object een deconvolutiebe- I 10 werking uitvoert. I

7. Optische microscoop volgens een der voorgaande I conclusies, met het kenmerk, dat de metallische dunne film I homogeen en eendelig is. I

8. Werkwijze voor het vormen van een optisch beeld I 15 van een object onder gebruikmaking van een lichtbron voor het I belichten en/of doorlichten van het object, en een detector I voor het registreren van licht dat van het object afkomstig I is, en waarbij tussen de lichtbron en het object een metalli- I sche dunne film met een periodiek gatenpatroon is geplaatst, I 20 en waarbij het object in een vlak verplaatst wordt dat in I hoofdzaak evenwijdig verloopt aan de metallische plaat, met I het kenmerk, dat het object en de metallische plaat van el- I kaar af of naar elkaar toe bewogen worden, en dat het door de I detector geregistreerde licht verwerkt wordt ter vorming van I 25 een driedimensionaal beeld van het object. I 1024404- I