NL1021420C2 - Werkwijze voor de niet-invasieve detectie van micro-organismen in een gesloten container. - Google Patents

Description

f Τ%/»Λ^ΛΛ\ΤΤ Λ/\ rbuouuiNi-iUu

Titel: Werkwijze voor de niet-invasieve detectie van micro-organismen in een gesloten container.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de niet-invasieve detectie van een besmetting met een micro-organisme in een afgesloten container. De uitvinding heeft met name betrekking op een werkwijze voor het detecteren van extracellulaire enzymactiviteit van een 5 micro-organisme in een afgesloten container.

Besmetting van een product met micro-organismen, zoals een besmetting van een (steriele) weefselkweek met bacteriën, leidt in de meeste gevallen tot verlies van het product. Aangezien bepaalde kiemen van micro-organismen kunnen resideren in een grondstof en/of gedurende het 10 productieproces in het product terecht kunnen komen, is het gebruikelijk 1 dat grondstoffen en/of eindproducten, bij voorkeur op een zo laat mogelijk tijdstip in het productieproces, een sterilisatie ondergaan. Deze sterilisatie wordt uitgevoerd met het doel de (eventueel) aanwezige kiemen te doden en kan bijvoorbeeld bestaan uit een hittebehandeling, een chemische 15 behandeling of een stralingsbehandeling.

Óm besmetting van een gesteriliseerd product zoveel als mogelijk uit te sluiten worden deze producten bij voorkeur in een gesloten container gehouden, of omgeven door een voor micro-organismen ondoordringbare barrière.

20 Bij de meeste toepassingen die betrekking hebben op gesloten en steriele containers, zoals bijvoorbeeld het geval is bij steriele weefselkweek, is het van belang dat er zekerheid bestaat over het al dan niet aanwezig zijn van micro-organismen.

Conventionele werkwijzen voor het detecteren van micro-25 organismen in een voedingsmiddel of een klinische monster in een gesloten container of omgeven door een barrière vereisen echter dat de container of ï ƒ·% r ί : / , ; 2 de barrière kortstondig wordt geopend, dat een monster wordt genomen en dat dit monster wordt gecontroleerd op de aanwezigheid van micro-organismen. Iedere opening van de container of de barrière, hoe kortstondig ook, verhoogt echter het risico van besmetting.

5 In veel gevallen kan alleen achteraf en na openen van de container worden vastgesteld of de container steriel was. Alleen in die gevallen waarin een zeer grote mate van besmetting is, kan mogelijk visueel worden vastgesteld of de container besmet is zonder deze te openen.

Een ander nadeel van de noodzaak tot openen van een container 10 voor het vaststellen van de steriliteit daarvan, heeft betrekking op het gevaar van verspreiding en uitbreiding van een in de container aanwezige besmetting. Daarbij is het van groot belang dat een besmette container niet verder wordt gebruikt of zomogelijk zelfs niet wordt geopend. Dit speelt bijvoorbeeld een rol bij steriele weefselkweek, waar regelmatig het medium 15 ververst moet worden, of bij een steriele kweek van plantenweefsel, waar na een initiële groei van enkele weken de plantjes verspeend moeten worden.

De mogelijkheid om een besmetting in de container vast te stellen zonder deze te hoeven openen levert een bijdrage aan de verhoging van de kwaliteit en efficiëntie van de handelingen.

20 US 6,197,577 beschrijft de toepassing van een sensor voor de detectie van micro-organismen waarbij een container niet hoeft te worden geopend (niet-invasieve methode), bestaande uit een (specifiek) groeimedium dat zich als laag op een sensor (indicator laag) bevindt. Deze methode heeft echter het nadeel dat het micro-organisme alleen lokaal, ter 25 plekke van de locatie van de sensor, gedetecteerd kan worden. Indien het micro-organisme en de sensor niet met elkaar in direct contact staan is detectie van de aanwezigheid van het micro-organisme niet mogelijk.

Er is nu gevonden dat een besmetting met een micro-organisme in een afgesloten container kan worden gedetecteerd door de aanwezigheid van 30 een extracellulair enzym van een micro-organisme in de container te 3 detecteren. De detectie van een extracellulair enzym kan bijvoorbeeld zeer geschikt plaatsvinden door middel van het toevoegen van een substraat van genoemd extracellulair enzym aan de container en de detectie van de omzetting van dit substraat door genoemd extracellulair enzym middels een 5 sensor. Een dergelijk toegevoegd substraat kan bijvoorbeeld homogeen over de inhoud van de container zijn verdeeld of eventueel als coating op de binnenwand van de container zijn aangebracht.

De onderhavige uitvinding lost het probleem op van de werkwijzen voor de detectie van micro-organismen uit de stand der techniek.

10 De onderhavige uitvinding verschaft een werkwijze voor het detecteren van een besmetting met een micro-organisme in een afgesloten container, waarin een extracellulair enzym van genoemd micro-organisme wordt gedetecteerd. Door het detecteren van de extracellulaire enzymen van het micro-organisme of het detecteren van een specifiek omzettingsproduct 15 is de plaats van het micro-organisme zelf en de indicator of sensor minder beperkt.

In principe kan iedere willekeurige besmetting met een micro-organisme middels een werkwijze volgens de uitvinding worden gedetecteerd. De onderhavige uitvinding is met name geschikt voor 20 toepassingen waarbij een besmetting in een afgesloten container dient te worden gedetecteerd zonder de container daartoe te hoeven openen. De uitvinding verschaft daarmee een niet-invasieve werkwijze voor het detecteren van een besmetting met een micro-organisme.

Micro-organismen die kunnen worden gedetecteerd door toepassing 25 van een werkwijze volgens de uitvinding zijn in het bijzonder micro-organismen die extracellulaire enzymen produceren. Een dergelijke productie van extracellulaire enzymen is bekend bij plantaardige cellen, protozoën, schimmels, gisten, archaea en bacteriën. Al deze micro-organismen kunnen dus worden gedetecteerd middels een werkwijze van de 30 uitvinding. Afhankelijk van de keuze van het toevoegde substraat kunnen * r * 4 2.0 4 groepen van micro-organismen worden gedetecteerd, bijvoorbeeld bacteriën of schimmels, en kan mogelijk zelfs vrijwel de hele groep van micro-organismen worden gedetecteerd. In dat laatste geval is sprake van een generiek methode voor het aantonen van de aanwezigheid van micro-5 organismen. Bij voorkeur worden schimmels, gisten en bacteriën als groep gedetecteerd. Bijzondere voorkeur gaan uit naar de detectie van bacteriën.

De detectie van een extracellulair enzym van een micro-organisme (waarvan de aanmaak eventueel kan worden geïnduceerd door het toevoegen van een inducerende stof aan de container) kan bijvoorbeeld 10 plaatsvinden door het aantonen van het enzym zelf.

Extracellulaire enzymen die worden geproduceerd door micro-organismen die kunnen worden gedetecteerd middels een werkwijze van de uitvinding zijn bijvoorbeeld amylase, protease,lipase, esterase, peroxidase, alcoholdehydrogenase, pectinase, xylanase, cellulase, chitinase, gelatinase, 15 collagenase, hyaluronidase, alkaline phosphatase, elastase, phospholipase en endoglucanase. Middels de detectie van de aanwezigheid van ten minste één van dergelijke extracellulaire enzymen kan een micro-organisme dat deze extracellulaire enzymen produceert worden gedetecteerd.

Het aantonen van een extracellulair enzym kan plaatsvinden op 20 voor de vakman bekende wijze, bijvoorbeeld middels werkwijzen voor detectie van eiwitten (zoals enzymen). Zo kan bijvoorbeeld een immunoassay worden toegepast voor het detecteren van een extracellulair enzym, maar ook andere werkwijzen, zoals het gebruik van lectines zijn geschikt. Bij voorkeur is deze directe vorm van detectie specifiek voor een 25 bepaald extracellulair enzym en is deze gebaseerd op een optische verandering (absorptie, fluorescentie, e.d.) waarmee een niet-invasieve meting mogelijk wordt.

Ook is het mogelijk om niet het enzym zelf, maar de activiteit daarvan te detecteren. Als voorbeeld hiervan kan genoemd worden het 30 detecteren van een omzetting van bijvoorbeeld een fluorogeen substraat 5 naar een product, via een reactie die door het extracellulair enzym wórdt gekatalyseerd.

In bepaalde uitvoeringsvormen van de uitvinding zal het niet nodig zijn een substraat voor een extracellulair enzym aan de container toe te 5 voegen. Een dergelijk substraat kan reeds in de container aanwezig zijn, bijvoorbeeld als component van het kweekmedium.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt vóór gebruik een substraat voor een extracellulair enzym aan de container toegevoegd met het doel om daarvan de activiteit te kunnen vaststellen. Dit toegevoegde substraat 10 wordt bij voorkeur zo homogeen mogelijk over de container verdeeld aangebracht. In een dergelijke uitvoeringsvorm kan het substraat bijvoorbeeld in een groeimedium of eventueel als coating op de binnenwand van de container worden aangebracht.

Bij voorkeur vindt detectie van een extracellulair enzym plaats 15 door reactie daarvan met een substraat dat zich bevindt in een sensorlaag (indicatorlaag) zoals hieronder beschreven. Dit substraat kan een natuurlijk of een synthetisch substraat voor het extracellulaire enzym zijn. Het substraat is in dat geval bij voorkeur gelabeld, bijvoorbeeld met een kleurstof of een fluorescentie indicator om de aanwezigheid van het 20 extracellulaire enzym te detecteren.

Bij grotere voorkeur omvat een werkwijze volgens de uitvinding het detecteren van de omzetting van de hoeveelheid van een substraat en/of het detecteren van een reactieproduct van een door een extracellulair enzym gekatalyseerde reactie.

25 De keuze voor het extracellulair enzym en/of reactieproduct worden bij voorkeur zo gemaakt dat deze alleen afkomstig kunnen zijn van een micro-organisme, en bijvoorbeeld niet van een weefsel in een weefselkweek. De keuze voor het substraat wordt bij voorkeur zo gemaakt dat dit alleen door het micro-organisme kan worden omgezet. Zo kan bijvoorbeeld een 30 micro-organisme dat het substraat opneemt en omzet tot een product

i Ar 'i ··· A

6 worden gedetecteerd door detectie van het gevormde en uitgescheiden product of door detectie van de hoeveelheid opgenomen en geconsumeerd substraat. In feite kan iedere substraatomzetting die specifiek is voor een micro-organisme worden toegepast voor de detectie van een micro-5 organisme in een werkwijze volgens de uitvinding. Voorkeur gaat uit naar substraten die door grote groepen van micro-organismen kunnen worden omgezet, waardoor de methode een generiek karakter krijgt.

Geschikte substraten die kunnen worden toegepast in uitvoeringsvormen van de uitvinding zijn bijvoorbeeld zetmeel, bepaalde 10 eiwitten, glyoxalaat, stoffen met een aldehyde functie, carboxylesters of azijnzure esters en bepaalde vitaminen.

Zoals hierboven vermeld is het mogelijk om een substraat, zoals bijvoorbeeld aanwezig in de sensorlaag of bijvoorbeeld homogeen verdeeld over de container, te labelen om daarvan de omzetting door een 15 extracellulair enzym van een micro-organisme vast te stellen. Zeer geschikte labels zijn bijvoorbeeld labels die een fluorescent, kleur- (chromogeen), of lichtsignaal (luminescent) produceren en waarbij de omzetting van het substraat optisch en derhalve niet-invasief kan worden gedetecteerd. Hierbij kan het label bijvoorbeeld zodanig worden gekozen dat de omzetting van het 20 substraat het afsplitsen van het label tot gevolg heeft of dat de omzetting een optische verandering in het label teweegbrengt.

Ook is het mogelijk om een substraat en/of reactieproduct middels een indicator te detecteren. Zo kan bijvoorbeeld jodium worden gebruikt als indicator om de afbraak van zetmeel als gevolg van de aanwezigheid van 25 amylase in een gesloten container te detecteren. Het optreden van een reactie van een extracellulair enzym met een substraat kan dus worden gedetecteerd door directe detectie van het omgezette substraat, bijvoorbeeld doordat dit van kleur verandert of een (veranderd) fluorescent karakter krijgt, maar tevens indirect, bijvoorbeeld door het additioneel toevoegen van 30 een indicator-stof zoals bijvoorbeeld jodium.

7

Een dergelijke indicator kan ook gevormd worden door bijvoorbeeld kristal violet lactonen die specifiek zijn voor alcoholen, Amplex Red voor de detectie van peroxiden, broomthymolblauw in een geschikte matrix voor de detectie van ammonia, of een O2 of pH indicator als deze parameters bij de 5 enzymatische reactie zijn betrokken. Bekende zuurstof indicatoren zijn fluorescente ruthenium complexen, bekende pH indicatoren zijn bijvoorbeeld fenolrood, (broom)thymol blauw, congo rood, cresolrood, congo rood, etc. Deze indicatoren kunnen zeer geschikt worden geïmmobiliseerd in een polymere matrix, hetzij covalent gebonden hetzij ingevangen.

10 Indicatoren kunnen aan het geheel of aan een gedeelte van de inhoud van de container worden toegevoegd. Bij voorkeur wordt een indicator aan de container toegevoegd door de indicator op te nemen in een materiaal, bijvoorbeeld op een polymeerbasis, dat aan de binnenzijde van de

, I

I container kan worden bevestigd. Zo kan een indicator bijvoorbeeld worden 15 opgenomen in een coating die zich aan de binnenzijde van genoemde container bevindt, hetzij over het hele oppervlak van de container of lokaal in de vorm van een soort ‘sticker’.

De uitvinding is van groot voordeel bij toepassingen waar de container bij voorkeur niet wordt geopend omdat dan reeds in een vroeg 20 stadium besmetting kan worden gesignaleerd en tijdig maatregelen kunnen worden genomen (zoals verwijdering van de besmette container en/of in gang zetten van een nieuw productieproces dat het besmette product kan vervangen).

Om een extracellulair enzym of een substraat of een reactieproduct 25 daarvan te detecteren wordt daarom bij voorkeur een meting toegepast waarbij de container niet wordt geopend. Zeer geschikt kan daartoe zoals gezegd een optische meting worden toegepast. Bij voorkeur wordt een optische meting toegepast waarbij de meting door de wand van de container plaatsvindt. Hiertoe dient ten minste een gedeelte van de wand van de 30 container transparant te zijn.

4 «- ; ft ? * ·' ' ζ j : s t i 8

Een optische meting voor de detectie van een extracellulair enzym, een substraat daarvan of een reactieproduct van een omzetting daarvan kan, zoals gezegd, bijvoorbeeld de meting van een fluorescent, kleur- of (chemi)luminescent lichtsignaal omvatten. Hiertoe kan bijvoorbeeld een 5 substraat van een extracellulair enzym fluorescent of (chemi)luminescent gelabeld worden dat bij omzetting een fluorescent of (chemi)luminescent lichtsignaal verschaft. Dit lichtsignaal kan vervolgens worden gemeten middels een daartoe geschikte optische meetinrichting, of middels visuele inspectie. Een belangrijk voordeel van een instrumentele detectie is dat 10 daarmee de methode te automatiseren is en er geen menselijke factor meer noodzakelijk is.

Een voorkeursuitvoeringsvorm volgens de uitvinding maakt gebruik van een sensor systeem, bij grotere voorkeur een optische sensor, waarmee een optochemische meting kan worden uitgevoerd waarbij deze is 15 aangebracht op ten minste een gedeelte van de binnenzijde van de container.

Optochemische sensoren zijn bij de vakman bekend. Zo kunnen optochemische sensoren worden toegepast zoals beschreven in US 5.541.113, US 5.611.998, US 5.866.433, EP 1 199 556, US 6.254.829 of WO 20 01/69243.

In een ander aspect verschaft de uitvinding een container voor steriele weefselkweek welke een indicator of een optochemische sensorfunctie voor het detecteren van een extracellulair enzym van een micro-organisme omvat.

25 Figuur 1 toont in schematische weergave een voorbeeld van een container volgens de uitvinding zoals die kan worden toegepast in steriele weefselkweek van planten met in de bodem van de container aangebrachte sensoren voor instrumentele uitlezing.

Figuur 2 toont in schematische weergave een voorbeeld van een 30 container volgens de uitvinding zoals die kan worden toegepast in steriele 1021*' ;:-o verpakkingen voor medische of paramedische middelen met visuele uitlezing, waarbij de gehele binnenzijde van de containerwand (in dit geval de verpakking) is bekleed met een indicatorlaag.

9 5 De werkwijze en container volgens de uitvinding kunnen uitstekend worden toegepast bij weefselkweek procedures, waarbij het van · belang is dat de container, waarin het weefsel zich bevindt, tijdens de kweek niet meer wordt geopend, en waarin detectie van besmetting gewenst is.

Werkwijzen en containers volgens de uitvinding kunnen uitstekend 10 worden toegepast bij steriel verpakte geneesmiddelen, steriel verpakte medische hulpmiddelen zoals injectienaalden of chirurgische instrumenten, steriel verpakte pleisters en andere medische verpakkingen.

Tevens kan de uitvinding worden toegepast voor de detectie van bijvoorbeeld cel-lysis van gekweekt materiaal in een weefselkweek. In dit 15 geval kunnen enzymen van het weefselkweekproduct worden gedetecteerd door toepassing van een werkwijze volgens de uitvinding wanneer deze door lysis vrijkomen in het medium. Op deze wijze kan de kwaliteit van het product worden gecontroleerd.

De uitvinding zal nu worden geïllustreerd aan de hand van de 20 volgende, niet als beperkend op te vatten voorbeelden.

Voorbeeld 1. Steriele (weefsel) kweek van planten

Een container voor steriele weefselkweek van planten wordt vervaardigd volgens een werkwijze die bekend is bij de vakman. Het 25 substraat wordt daarin bijvoorbeeld gevormd door een steenwolblok dat verzadigd is met een (vloeibaar) medium om te dienen als voedingsbodem voor de plant. Aan het steenwolblok worden vervolgens met plantenweefsel geënte bolletjes of bijvoorbeeld stukjes weefsel van de plant toegevoegd op een voor de vakman bekende wijze. Het geheel wordt volledig omsluitend 30 ingepakt in een aseptische, voor micro-organismen ondoordringbare, 10 ademend folie. Alle bestanddelen, met uitzondering van het levende plantenweefsel, zijn vooraf gesteriliseerd en het geheel is onder steriele omstandigheden ingepakt, bijvoorbeeld in een flow kabinet.

Na een periode van 4 tot 6 weken dienen de plantjes te worden 5 verspeend en worden de foliezakken (containers) opengesneden. Dit kan eventueel volledig geautomatiseerd plaatsvinden. *

Voorafgaand aan het moment van opensnijden van de containers wordt bepaald of de betreffende container al dan niet besmet is met een micro-organisme. Dit geschiedt middels toepassing van een werkwijze 10 volgens de uitvinding. Daartoe wordt aan het medium, voorafgaand aan het toevoegen daarvan aan het steenwolsubstraat of eventueel daarna, een substraat van een extracellulair enzym toegevoegd zoals hierboven beschreven eventueel in combinatie met een indicator-stof, waardoor hetzij een specifieke verkleuring van het medium of een optische verandering in 15 een sensor die zich aan de binnenwand van het folie bevindt kan worden waargenomen. Enkele specifieke voorbeelden van deze uitwerking worden hieronder uitgewerkt.

Voorbeeld 2. Toevoeging van zetmeel en detectie van a-amylase-20 producerende micro-organismen.

Aan het medium zoals toegepast in Voorbeeld 1 wordt ca. 1,0 gew.% zetmeel worden toegevoegd. Hierdoor worden α-amylasen (EC

3.2.1.1.) geïnduceerd (zowel in bacteriën, schimmels als gisten) die het zetmeel omzetten in polysaccharide fragmenten. Aan het toegevoegde 25 zetmeel is een kleurstof gebonden die bij reactie tussen het α-amylase en het zetmeel wordt afgesplitst en vrijkomt in het medium. Bij voldoende enzymactiviteit zal als gevolg hiervan zal het medium verkleuren. Deze verkleuring wordt met een optisch inspectiesysteem of visueel vastgesteld.

ί; I"'' , 11

Voorbeeld 3. Toevoeging van zetmeel en detectie van a-amylase-producerende micro-organismen met een sensor.

Dit voorbeeld wordt uitgevoerd op dezelfde wijze als Voorbeeld 2 met het verschil dat het hier een toevoeging van zetmeel zonder een 5 daaraan gebonden kleurstof betreft. In plaats daarvan wordt de aanwezigheid van oc-amylasen aangetoond met een sensor (een soort sticker) die zich aan de binnenwand van het folie bevindt. Deze sensor omvat een fluorescent gelabeld substraat dat door α-amylasen omgezet wordt. Bij deze omzetting veranderen de fluorescentie-eigenschappen hetgeen met een 10 optische uitleesunit wordt vastgesteld. In dit geval zal de aanmaak van amylasen in het hele medium plaatsvinden, maar vindt de detectie daarvan lokaal plaats.

j Voorbeeld 4. Toevoeging van riboflavine.

1 15 In dit voorbeeld wordt riboflavine in een hoeveelheid tussen bijvoorbeeld 1 - 100 ppm toegevoegd aan het medium van voorbeeld 1. Hierdoor wordt riboflavinase geïnduceerd (in ieder geval bij veel bacteriën) ' die riboflavine omzetten in ribitol en lumichroom. De detectie methode is vergelijkbaar met die van Voorbeeld 2 of 3: lumichroom is een fluorescente 20 stof die in het medium zelf met een inspectie systeem kan worden aangetoond zoals uiteengezet in Voorbeeld 2, maar de aanwezigheid van riboflavinase kan ook plaatsvinden in een sensor (lokaal) zoals uiteengezet in Voorbeeld 3.

25 Voorbeeld 5. Toevoeging van asparagine of glutamine.

In dit voorbeeld wordt riboflavine in een hoeveelheid tussen bijvoorbeeld 1 - 100 ppm toegevoegd aan het medium van voorbeeld 1. Hierdoor wordt asparaginase- of glutaminaseactiviteit geïnduceerd. Als gevolg hiervan wordt in het medium ammonia (NH3) gevormd. Er zijn 12 diverse opto-chemische sensoren in de literatuur beschreven (verkleuring van polyaniline of dmv een pH indicator) die selectief en gevoelig ammonia kunnen bepalen. Deze sensoren kunnen allen op niet-invasieve wijze worden uitgelezen.

Claims (13)

1. Werkwijze voor het detecteren van een besmetting met een micro-organisme in een afgesloten container, waarin een extracellulair enzym, of de activiteit daarvan, van genoemd micro-organisme wordt gedetecteerd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de activiteit van genoemd 5 extracellulair enzym wordt gedetecteerd middels het verschaffen van een substraat voor genoemd enzym aan de inhoud van de container en het detecteren van de omzetting van genoemd substraat door genoemd enzym.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin genoemd detecteren van de omzetting het detecteren van de hoeveelheid substraat en/of het detecteren 10 van een reactieproduct omvat.

4. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin | genoemd enzym, genoemd substraat en/of genoemd reactieproduct middels ' een indicator wordt gedetecteerd.

5. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin 15 genoemde indicator zich in een coating aan de binnenzijde van genoemde container bevindt.

6. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin genoemd micro-organisme een plantaardige cel, protozo, schimmel, gist, archae of bacterie is.

7. Werkwijze volgens conclusie één van de voorgaande conclusies, waarin amylase, protease,lipase, esterase, peroxidase, alcoholdehydrogenase, pectinase, xylanase, cellulase, chitinase, gelatinase, collagenase, hyaluronidase, alkaline phosphatase, elastase, phospholipase en/of endoglucanase wordt gedetecteerd.

8. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin genoemd detecteren een optische meting omvat.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarin de optische meting een fluorescente of (chemi)luminescente meting omvat. i f ·

10. Werkwijze volgens conclusie 8, waarin een optische sensor wordt toe gepast.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, waarin genoemde optische sensor een chemo-optische substantie omvat.

12. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin genoemd substraat zetmeel, glyoxalaat, stoffen met een aldehyde functie, een carboxylester of een azijnzure ester omvat.

13. Container voor steriele weefselkweek, welke een indicator voor het detecteren van een extracellulair enzym van een micro-organisme omvat. 10