NL1018568C2 - Winning van polysachariden uit plantaardig en microbieel materiaal. - Google Patents

Description

Winning van polysachariden uit plantaardig en microbieel materiaal

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze ter behandeling van biologisch materiaal, zoals gistcellen en resten en extracten van plantaardig materiaal met het oog op het winnen en benutten van polysachariden en derivaten daarvan.

5 De celwand van diverse gistsoorten zoals bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) bestaat voor grotendeels (80-90% van de droge stof) uit polysachariden. Dit zijn meest glucanen en mannanen, en een kleine hoeveelheid chitine. De binnenlaag bevat β-1,3-en β-Ι,ό-glucanen en de buitenlaag bevat mannoproteïnen, die op hun beurt vaak covalent aan de inwendige glucaanlaag zijn gebonden. Verder bevatten gistcelwanden 10 wisselende hoeveelheden eiwitten, vetten en anorganisch fosfaat. In industriële gistcel-wandpreparaten is het eiwitgehalte vaak hoger (15-30%) en het polysacharidegehalte dienovereenkomstig lager.

De β-glucanen en mannoproteïnen hebben nuttige eigenschappen. De β-glucanen, die bestaan uit een keten van β-1,3 gekoppelde glucopyranosyl-eenheden met zijdelings 15 β-1,6 gekoppelde glucopyranosyl-eenheden versterken het menselijk afweersysteem.

Dit leidt tot tumorwerende, antibacteriële, antivirale, stollingsremmende en wond-helende werkingen (Bohn, J.A. en BeMiller, J.N. (1995) Carbohydrate Polymers, 28,3-14). De mannoproteïnen blijken bruikbaar als emulgator (Cameron, D.R. c.s. (1998) Appl. Environm. Microbiol 54, 1420-1425); die zijn daarbij alleen winbaar door 20 enzymatische afbraak van de glucanen en dus zonder benutting daarvan.

Plantaardig restmateriaal, zoals suikerbietenpulp, suikerrietresten en bierbostel, bevat vaak aanzienlijke hoeveelheden waardevolle polysachariden, zoals β-glucanen, arabinoxylanen en cellulose, die geschikt zouden kunnen zijn als voedingsvezels voor mens en dier, prebiotica, vetvervangers, verdikkingsmiddelen, emulgatoren, bevochti-25 gingsmiddelen en degelijke.

Hoewel de gistcelresten en ander microbieel en plantaardig restmateriaal dus een potentiëel waardevolle grondstof vormen, is de benutting van dit materiaal tot nu toe nauwelijks tot ontwikkeling gekomen. Een belangrijke oorzaak is dat de tot nu toe beschikbare methoden van winning van de polysachariden en eiwitten, zoals autoclaaf-30 extractie (zie Torabizadeh e.a. (1996) Lebensm.-Wiss. u. -Technol. 29, 734), te duur zijn.

Gevonden is nu dat polysachariden uit biologische grondstof doelmatig kunnen worden gesolubiliseerd en, indien gewenst, geïsoleerd door lichte oxidatie met zodanige 1018568« 2 middelen en onder zodanige omstandigheden dat uitsluitend of vrijwel uitsluitend primaire hydroxylgroepen worden geoxideerd. Gevonden is verder dat de aldus geoxideerde en geïsoleerde polysachariden hun nuttige biologische eigenschappen hebben behouden, en door hun verhoogde oplosbaarheid ruimer toepasbaar zijn dan de 5 onbehandelde polysachariden.

Onder polysachariden worden hier verstaan sachariden met gemiddeld meer dan 10 monomeereenheden, alsmede derivaten van polysachariden, proteoglycanen, glyco-proteïnen en dergelijke. In het bijzonder gaat het om vooraf in water niet of slecht in water oplosbare (minder dan 2 g per 100 g) polysachariden. De ketenlengte (poly-10 merisatiegraad, DP) kan oplopen tot bij voorbeeld 10.000 of meer (molgewicht ca. 2.500.000) en is in het bijzonder 20-3000, meer in het bijzonder 40-1000. De polysachariden zijn in de biologische grondstof aanwezig in hoeveelheden van 1-75 gew.%, in het bijzonder 2-40 gew.% (droog gewicht), waarbij het overige materiaal gewoonlijk eiwit omvat.

15 De oxidatie van primaire hydroxylgroepen in polysachariden is op zichzelf bekend. Deze oxidatie is onder andere beschreven voor zetmeel, cellulose en andere glucanen en kan bij voorbeeld worden uitgevoerd met stikstofoxiden (NO2/N2O4 of nitriet/nitraat, zie Nederlandse octrooiaanvrage 9301172) en vooral met nitroxyl-verbindingen in aanwezigheid van een reoxidator zoals hypochloriet, perazijnzuur, per-20 zwavelzuur (zie WO 95/07303, WO 99/57158). De reoxidator voor de nitroxyl-verbindingen kan ook waterstofperoxide of zuurstof zijn, waarbij bijvoorbeeld een oxidatief enzym zoals een peroxidase, een laccase of een ander fenoloxidase, of een metaalcomplex aanwezig is, zie WO 00/50388 en WO 00/50621). Bij deze wijzen van oxidatie kan in eerste instantie een aldehyde worden gevormd, dat vervolgens wordt 25 omgezet in een carbonzuur.

De nitroxylverbindingen zijn in het bijzonder 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPO) en derivaten (zoals 4-hydroxy-, 4-acetoxy-, 4-aceetamido-TEMPO) en analoge oxazolidine- en pyrrolidineverbindindingen. Deze kunnen in katalytische hoeveelheden, bij voorbeeld 0,1-5 mol% ten opzichte van de verwachte hoeveelheid 30 polysacharide (in monosacharide-equivalenten) worden toegepast. Daarbij bepaalt de hoeveelheid reoxidator (zoals hypochloriet of zuurstof) de uiteindelijke oxidatiegraad van het product. Ook kan de nitroxylverbinding vooraf, bijvoorbeeld met zuurstof of waterstofperoxide en oxidatief enzym) worden geoxideerd tot nitrosoniumverbinding, 1018568· 3 die als zodanig in de gewenste hoeveelheid aan het biologische materiaal wordt toegevoegd, en achteraf wordt geregenereerd.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding wordt het polysacharide bij voorkeur slechts gedeeltelijk geoxideerd, bij voorbeeld voor 3-30%, wanneer het polysacharide 5 bestemd is voor toepassing in geneesmiddelen of voedingsmiddelen. Indien gewenst voor de beoogde toepassing kan de oxidatie ook verdergaand worden uitgevoerd, bij voorbeeld tot 90% oxidatie van de aanwezige anhydroglycose-eenheden.

Na de oxidatie tot het gewenste niveau kan het geoxideerde polysacharide eenvoudig worden geïsoleerd, bij voorbeeld door scheiding van het reactiemengsel in 10 een oplosbare fractie, die het geoxideerde polysacharide tezamen met zouten en ander gemakkelijk afscheidbare componenten bevat, en een onoplosbare fractie, die vooral uit eiwitten en ander voor de toepassing van het polysacharide ongewenst biologisch materiaal bevat.

De werkwijze volgens de uitvinding is niet alleen geschikt voor het isoleren van 15 glucanen uit celwanden van gisten, schimmels, bacteriën en ander micro-organismen, maar ook van soortgelijke glucanen of andere polysachariden uit ander biologisch materiaal waarin de polysachariden samen met eiwitmateriaal en andere moeilijk scheidbare componenten aanwezig zijn. Voorbeelden daarvan zijn grassen, suiker-bietenresten, bietenpulp (arabinoxylanen en arabinogalactanen), bierbostel, plantencel-20 wanden en andere plantaardige resten. Het grote voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is dat geen of weinig voorscheiding van andere biologische componenten uit het uitgangsmateriaal nodig is.

Wel is nodig dat de te solubiliseren en/of te isoleren polysachariden primaire hydroxylgroepen bezitten, zoals in 1,2-, 1,3- en 1,4-verknoopte polyhexoaldopyrano-25 siden, 2,1- en 2,6-verknoopte polyhexoketofuranosiden, 1,2- en 1,3-verknoopte poly-aldopentofuranosiden e.d.

Hoewel met minder voorkeur, kan de gedeeltelijke oxidatie van de polysachariden ook aan andere dan primaire hydroxylgroepen plaatsvinden, zoals door 2,3-oxidatie in het geval van (arabino)xylanen en (arabino)galactanen en andere polysachariden die 30 eenheden -CHOH-CHOH- bevatten, waarbij deze eenheid in twee aldehydgroepen en/of carboxylgroepen wordt omgezet. Deze oxidatie kan geschieden met bijvoorbeeld hypochloriet of peqodaat/chloriet zoals op zichzelf bekend voor de oxidatie van polysachariden. In dit geval wordt de oxidatie bij voorkeur aan slechts 1-10 % van de beschikbare anhydroglycose-eenheden uitgevoerd, ter voorkoming van te veel 1018568· 4 ketenverkorting en te sterke verandering van de ruimtelijke structuur van het polysacharide. Eventueel kan deze oxidatie worden gecombineerd met oxidatie van primaire hydroxylgroepen zoals boven beschreven.

De geoxideerde polysachariden, in het bijzonder p-l,3-glucanen volgens de 5 uitvinding zijn bruikbaar als gezondheidsbevorderend middel of geneeshulpmiddel, in het bijzonder als immuunversterkend middel. Zij kunnen ook worden gebruikt als voedingscomponent, hetzij vanwege de calorische waarde, bij voorbeeld in diervoeders, hetzij vanwege de waarde als voedingsvezel of als prebioticum in voedingsmiddelen of nutraceutica voor mens of ander (zoog)dier. Voor dergelijke toepassingen kunnen zijn 10 in hoeveelheden van bijvoorbeeld 10 mg tot 2 g per kg lichaamsgewicht, in het bijzonder 50 mg - 1 g per kg, worden toegediend. Verder zijn zij bruikbaar als bindmiddelen, absorptiemiddelen, bevochtigingsmiddelen voor cosmetica of lichaamsverzorging, verdikkingsmiddelen, emulgatoren, metaalcomplexanten en dergelijke. Voor die toepassingen kunnen zij als zodanig, gemengd met dragers of vulmiddelen, in 15 waterige oplossing, al of niet combinatie met andere werkzame stoffen, worden toegepast, in preparaten in hoeveelheden van bijvoorbeeld 0,1-500 g, in het bijzonder 1-100 g per kg preparaat.

Ook kan het eiwitmateriaal uit de biologische grondstof vaak nuttig worden gebruikt. Wanneer de polysachariden zijn afgescheiden, kan het resterende materiaal, na 20 eventuele verdere zuivering als eiwitmateriaal worden benut. In het geval van glyco-proteïnen, zoals de mannoproteïnen die in de gistcelwanden aanwezig zijn, kunnen deze ook met de werkwijze volgens de uitvinding deels worden geoxideerd en gesolubiliseerd en eventueel gefractioneerd van de polysachariden worden geïsoleerd.

25 Voorbeeld 1: Oxidatie van geïnactiveerde, droge gist met hypochloriet/TEMPO

Geïnactiveerde, droge gist (20 gram, hieronder startmateriaal genoemd) werd met 2 M loog op pH 11 gebracht en gedurende een uur geroerd. Vervolgens werd de pH met 4 M zoutzuur op 10 gebracht. Aan het monster werden 200 mg TEMPO en 100 mg natriumbromide toegevoegd. De reactie startte na het gedoseerd toevoegen van 150 ml 30 (0,129 mol) van een oplossing van natriumhypochloriet in water, waarbij de pH met behulp van een pH-stat constant gehouden werd op pH 10. De reactie werd gestopt nadat 246 ml 0,5 M (0,123 mol) loogoplossing was verbruikt. De oplossing werd neergeslagen met ethanol (eindconcentratie 75%), vervolgens gefiltreerd over een P3 filter, gespoeld met 75 % ethanol en aan de lucht gedroogd. Vervolgens werd het 1018568· 5 product opgelost in 400 ml water en gecentrifugeerd (30 minuten, 10.000 rpm). Het verkregen supernatant wordt de wateroplosbare fractie genoemd en werd vervolgens gevriesdroogd. De opbrengst was 11,2 gram, overeenkomend met 56 % van het startmateriaal.

5 Het gehalte aan totaal uronzuur (6-COOH van hexopyranose-eenheden) is bepaald met de methode volgens Blumenkrantz et al. {Anal. Biochem. (1973) 54, 484), waarbij wordt gehydrolyseerd met boorzuur (0,0125 M) in geconcentreerd zwavelzuur en vervolgens 3-hydroxybifenyl wordt toegevoegd en de extinctie wordt gemeten bij 520 nm. Daarnaast zijn de gehaltes aan glucose, glucuronzuur en mannuronzuur bepaald met 10 DIONEX HPAEC, door eerst het materiaal volledig te hydrolyseren.

Startmateriaal Wateroplosbare fractie

Drooggewicht (g) 20 11,2

Glucose (g) 7,9 0,9

Glucuronzuur (g) 8,0

Mannuronzuur (g) 0,4

Voorbeeld 2: Oxidatie van geïnactiveerde, droge gist met laccase/TEMPO Geïnactiveerde, droge gist (10 g) en TEMPO (2,5 g) werden opgenomen in 1 liter 20 15 mM succinaat-buffer, pH 5,5 en op 38 °C gebracht. Het reactievat werd geroerd en doorborreld met zuurstof. De reactie werd gestart door toevoeging van 60 units laccase {Trametes versicolor laccase, Wacker Chemie; TEMPO Units). Tijdens de reactie, met een totale duur van 6 uur, werden ieder uur 20 Units laccase toegevoegd en werd de pH constant gehouden met een pH-stat. Na afloop van de reactie werd het product 20 gecentrifugeerd en werd van het supernatant, de wateroplosbare fractie, het droog gewicht bepaald. Dit bleek 3,1 gram te zijn, overeenkomend met 31% van het startmateriaal.

1018568*

Claims (17)

1. Werkwijze voor het solubiliseren en/of isoleren van polysachariden uit een biologische grondstof die naast de polysachariden ook ander biologisch materiaal bevat, met het kenmerk dat men de grondstof behandelt met een oxidatiemiddel dat 5 leidt tot oxidatie van uitsluitend of vrijwel uitsluitend primaire hydroxylgroepen in het glucaan.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het oxidatiemiddel een katalytische hoeveelheid van een nitroxylverbinding omvat.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij het oxidatiemiddel een hypohalogeniet 10 omvat.

4. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij het oxidatiemiddel een peroxidase, een laccase of een polyfenoloxidase omvat.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, waarbij men een zodanige hoeveelheid oxidatiemiddel toepast dat 3-30 hydroxylgroepen per 100 anhydroglycose-eenheden 15 tot carboxylgroepen kunnen worden geoxideerd.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1-5, waarbij de biologische grondstof tevens een eiwitmateriaal omvat.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1-6, waarbij men geen voorafgaande scheiding tussen de polysachariden en ander biologisch materiaal uitvoert.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 1-7, waarbij men na de oxidatie de behandelde polysachariden van ander biologisch materiaal, in het bijzonder eiwitten, scheidt door oplossen in een waterig medium.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij men tevens de eiwitten, eventueel in geoxideerde vorm, solubiliseert en/of isoleert.

10. Werkwijze volgens een der conclusies 1-9, waarbij de polysachariden β-glucanen omvatten, waarvan de anhydroglucose-eenheden voor een deel via 1,3-bindingen zijn gekoppeld. 1018568* %

11. Werkwijze volgens conclusie 10, waarbij men gistcellenresten als bron van de poly-sachariden toepast.

12. Werkwijze volgens een der conclusies 1-9, waarbij de polysachariden arabino-xylanen omvatten.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, waarbij men bietenpulp of graanresten als bron van de polysachariden toepast.

14. Geoxideerd β-glucaan waarvan de anhydroglucose-eenheden tenminste voor een deel via 1,3-bindingen zijn gekoppeld en waarvan 3-30, bij voorkeur 3-15 primaire hydroxylgroepen per 100 anhydroglucose-eenheden tot carboxylgroep en zijn 10 geoxideerd.

15. Geoxideerd β-glucaan volgens conclusie 14, met een ketenlengte van 10-3000, bij voorkeur 20-1000 anhydroglucose-eenheden.

16. Toepassing van een geoxideerd polysacharide volgens conclusie 14 of 15, of bereid volgens een der conclusies 1-13 als bevochtigingsmiddel of emulgator.

17. Toepassing van een geoxideerd polysacharide volgens conclusie 14 of 15, of bereid volgens een der conclusies 1-13 als immuunstimulerend middel of als prebioticum. 1018568«