NL1009044C2 - Strikte zelfbevruchters met een gemodificeerde bloemmorfologie. - Google Patents

Description

STRIKTE ZELFBEVRUCHTERS MET EEN GEMODIFICEERDE BLOEMMORFOLOGIE

De onderhavige uitvinding betreft een werkwijze voor het vervaardigen van planten van een van oorsprong strikt zelfbevruchtende soort, in het bijzonder slaplanten, die toch geschikt zijn voor kruisbevruchting. De 5 uitvinding betreft verder de op deze wijze vervaardigde planten en zaad daarvan, alsmede het gebruik van de planten in een werkwijze voor het verkrijgen van hybride planten, en de op deze wijze verkregen hybride planten en daarvan afgeleid zaad.

10 Hybride rassen zijn in vrijwel alle cultuurge- wassen commercieel aantrekkelijk, onder andere vanwege de uniformiteit van hybriden en de mogelijkheid om heterosis te benutten. Heterosis is het verschijnsel dat hybride-planten, die zijn ontstaan door kruising van (min of 15 meer) ingeteelde ouderplanten een betere prestatie hebben voor bepaalde kenmerken, zoals bijvoorbeeld opbrengst, dan beide ouders. Verder is een groot voordeel van hybride rassen dat zij gemiddeld beter en stabieler presteren onder wisselende milieuomstandigheden.

20 Zo hebben zaadvaste slarassen bijvoorbeeld vaak een zeer beperkt teeltmilieu (plaats, grondsoort, seizoen) waaronder ze goed presteren. Hybride slarassen zouden geschikt kunnen zijn voor grotere teeltgebieden en/of milieus. Hybride sla kan verder bijvoorbeeld een 25 interessant product zijn vanwege de genoemde uniformiteit, verhoogde groeikracht en stabiliteit door heterosis effecten, en combinatie van eigenschappen. Een grotere groeikracht is vooral voor winterteelten en voor donkerrood gekleurde slatypen van belang.

30 In hybride sla zou het ook gemakkelijker zijn om genen uit wilde soorten te benutten. Sommige interessante genen uit L.virosa zijn bijvoorbeeld gekoppeld aan genen, die ingekruist in een genoom van cultuursla gereduceerde groei veroorzaken. Dit is met name gevonden voor 35 een gen voor resistentie tegen Bremia en tegen de bladluis Nasonovia ribisniori. De verminderde groei, die in principe ongewenst is, komt alleen tot expressie in de 1009044 2 homozygoot, en bij een juiste keuze van de ouderplanten dus niet in de hybride, terwijl de aan de verminderde groei gekoppelde resistentie dominant is, en dus in de hybride wel tot resistentie leidt. In een hybride zou een 5 dergelijk gen voor verminderde groei bovendien vanuit de optiek van zaadbedrijven gunstig zijn, omdat dit nateelt nog eens extra onaantrekkelijk maakt.

Om verschillende redenen is het kunnen verkrijgen van hybride rassen derhalve interessant en gewenst.

10 Om hybride rassen te kunnen maken is het een vereiste dat er binnen de soort kruisbestuiving kan optreden. Echter, sommige cultuurgewassen zijn van nature strikt zelfbe-vruchtend. Binnen een genus kunnen naast zelfbevruchtende soorten wel kruisbevruchtende soorten voorkomen.

15 Een voorbeeld van een strikt zelfbevruchtende soort is de cultuursla. Sla behoort tot het genus Lactu-ca. dat weer kan worden onderverdeeld in een aantal secties, waarbinnen weer subsecties te onderscheiden zijn. De in Europa voorkomende Lactuca soorten worden 20 onderverdeeld in vier secties, te weten Lactuca. Lactu-copsis. Mulqedium en Phaenixopus. Binnen de sectie Lactuca zijn twee subsecties te onderscheiden: Lactuca en Cvanicae. De cultuursla (Lactuca sativa L.) behoort, evenals de kruisbare verwanten (L.serriola. L.aculeata.

25 L.scarioloides. L.azerbaiianica, L.qeorqica. L.dreqeana. L.altaica. L.saliqna en L.virosa) tot sectie Lactuca. subsectie Lactuca.

Tot de sectie Lactuca. subsectie Cvanicae behoren L.tenerrima. L.perennis en L.qraeca.

30 Tot de sectie Mulqedium behoren L.tatarica en L.sibirica. Deze soorten staan taxonomisch dicht bij het genus Mulqedium. Van L.tatarica is kruisbaarheid gerapporteerd met Mulqedium bourgaei. en met de amerikaanse amphidiploide (2n=34) Lactuca soorten L.floridana.

3 5 L. canadensis en L.qraminifolia.

Binnen het genus Lactuca komen zowel strikt zelfbevruchtende (autogame) als kruisbevruchtende (xeno-game) soorten voor. Het probleem is echter dat de soorten 1009044 3 in de sectie Lactuca. subsectie Lactuca. waartoe de cultuursla behoort, strikte zelfbevruchters zijn. Van L.sativa werden natuurlijke kruisbevruchting percentages gevonden van slechts 1-3% bij teelt in de open lucht met 5 verschillende genotypen aangrenzend aan elkaar geteeld (Thompson, R.C., T.W. Whitaker, & G. W. Bohn, Proc. Natl. Soc. Horticul. Sci. 36 (1958)).

Het is nu het doel van de uitvinding de mogelijkheid te verschaffen om planten, die van nature zelf-10 bevruchtend zijn en bloemen hebben, die onaantrekkelijk zijn voor bestuivende insecten, aantrekkelijk te maken voor bestuivers, zodat deze planten gebruikt kunnen worden voor de productie van hybride zaad in commercieel vereiste hoeveelheden.

15 Dit wordt volgens de uitvinding bereikt door een werkwijze voor het vervaardigen van fusieplanten, voor gebruik in de verkrijging van planten die geschikt zijn voor natuurlijke kruisbestuiving, omvattende het vervaardigen van fusieplanten door het bereiden van 20 protoplasten van een eerste ouderplant en protoplasten van een tweede ouderplant, het fuseren van de eerste protoplasten met de tweede protoplasten ter verkrijging van een fusieproduct, en het uit het fusieproduct regenereren van fusieplanten, waarbij tenminste een van beide 25 ouderplanten een of meer voor natuurlijke kruisbestuiving gunstige eigenschappen bezit, waarvan er tenminste een in de fusieplant tot uitdrukking komt.

De fusieplanten zijn zelf niet direct geschikt voor gebruik als kruisingsouder in de vervaardiging van 30 hybriden. De uitvinding betreft derhalve verder een werkwijze voor het vervaardigen van planten die geschikt zijn voor natuurlijke kruisbestuiving, omvattende: a) het vervaardigen van fusieplanten door het bereiden van protoplasten van een eerste ouderplant en 35 protoplasten van een tweede ouderplant, het fuseren van de eerste protoplasten met de tweede protoplasten ter verkrijging van een fusieproduct, en het uit het fusieproduct regenereren van fusieplanten, waarbij tenminste 1009044 4 een van beide ouderplanten een of meer voor natuurlijke kruisbestuiving gunstige eigenschappen bezit, waarvan er tenminste een in de fusieplant tot uitdrukking komt, en b) het verder tenminste eenmaal (terug)kruisen 5 van de fusieplanten met elkaar en/of met een niet-fusieplant met gewenste eigenschappen ter verkrijging van planten, die geschikt zijn voor natuurlijke kruisbestuiving en de gewenste eigenschappen bezitten.

Onder "natuurlijke kruisbestuiving" wordt in 10 deze aanvrage begrepen elke vorm van kruisbestuiving, die niet door actief menselijk ingrijpen tot stand gebracht wordt. Een dergelijke natuurlijke vorm van kruisbestuiving is bijvoorbeeld bestuiving door insecten.

De wens om hybride planten te kunnen maken is 15 in het bijzonder voor sla groot. Kruisbevruchtende Lactu-ca spp., zoals L.perennis, worden meestal bestoven door insecten. Binnen het genus Lactuca is aangetoond dat bloemgrootte en -morfologie in sterke mate samenhangen met de mate van kruisbevruchting, en dus ook met de 20 aantrekkelijkheid van de bloem voor bestuivende insecten. Xenogamy is sterk gecorreleerd met grote bloemhoofdjes met een blauwe of helder gele kleur. Het heeft daarom de voorkeur om er voor te zorgen dat de voor kruisbestuiving gunstige eigenschappen in sla tenminste een voor insecten 25 aantrekkelijke bloemgrootte en/of bloemkleur omvatten.

In een uitvoeringsvorm van de uitvinding zijn de beide ouderplanten derhalve slaplanten van het genus Lactuca en de voor kruisbestuiving gunstige eigenschappen afkomstig van een ouderplant van het species L.tatarica 30 en bestaan deze eigenschappen uit grote en/of blauwpaarse of vrijwel witte bloemen. De van fusieplanten afgeleide planten kunnen gele of blauw-paarse bloemen hebben. In beide kleuren komt variatie in kleurintensi-teit voor. De mate van paars-blauw kleuring kan sterk 35 variëren. Sommige paars-blauwe bloemen zijn zo bleek dat ze vrijwel wit van kleur lijken.

Als de andere ouderplant kan direct een cul-tuursla gekozen worden, of een zogeheten "brugsoort". In 1009044 5 de klassieke betekenis staat de term "brugsoort" voor een soort, die bij soortkruisingen gebruikt wordt als de twee te kruisen soorten te ver van elkaar afstaan voor directe kruisingen. Een brugsoort moet tussen beide te kruisen 5 ouders in staan en liefst tenminste een beetje met beiden kruisbaar zijn. In geval van fusies wordt de term "brugsoort" gebruikt voor een kruisbare verwant van de soort waar men genetisch materiaal naar wil overbrengen, maar die voor het fusieproces betere of wenselijker eigen-10 schappen heeft, zoals een beter fusievermogen of een beter regeneratievermogen.

Wanneer direct een cultuursla (in plaats van een brugsoort) wordt gekozen voor de vervaardiging van fusieplanten, is de andere ouderplant bijvoorbeeld van 15 het cultuursla-species L.sativa. In het tweede geval, waarbij gebruik gemaakt wordt van een brugsoort, kan gedacht worden aan L.serriola.

Planten die verkregen worden na (terug)kruising van een fusieplant met een plant van een cultuursla 20 species, zijn niet direct meer als fusieplanten te beschouwen en worden hierin daarom ook wel "fusieplant-afgeleiden" genoemd. Het eindresultaat van meerdere (terug)kruisingen en/of zelfbestuivingen worden hierin "planten die geschikt zijn voor natuurlijke kruisbestui-25 ving" genoemd. "Fusieplanten", "fusieplant-afgeleiden" en "planten die geschikt zijn voor natuurlijke kruisbestuiving" worden tezamen "planten volgens de uitvinding" genoemd.

De uitvinding verschaft verder fusieplanten, 30 fusieplant-afgeleiden en planten die geschikt zijn voor natuurlijke kruisbestuiving, die te verkrijgen zijn door middel van de werkwijze volgens de uitvinding. In beginsel omvatten deze drie typen voor natuurlijke kruisbestuiving geschikt gemaakte planten volgens de uitvinding 35 allen het meer of minder ver gevorderde resultaat van fusie van willekeurig gekozen protoplasten. Echter, planten van cultuursla vormen hiervan een bijzonder voordelige uitvoeringsvorm.

1009044 6

Een specifieke uitvoeringsvorm van planten volgens de uitvinding is te verkrijgen door fusie van protoplasten van L.tatarica met protoplasten van Lsativa en regeneratie van planten uit het zo verkregen fusiepro-5 duet. In een alternatieve uitvoeringsvorm kunnen fusie-planten verkregen worden door fusie van protoplasten van L.tatarica met protoplasten van L.serriola. of andere met cultuursla kruisbare wilde slasoorten, ter verkrijging van een fusieproduct en vervolgens planten, die gerege-10 nereerd zijn uit het verkregen fusieproduct, terug te kruisen met L.sativa. Hieruit ontstaat een fusieplant-afgeleide.

Door kruising tussen fusieplanten of fusie-plant-afgeleiden en een plant met gewenste cultuurgewas-15 eigenschappen kunnen de voor kruisbestuiving gunstige eigenschappen uit de fusieplant of fusieplant-afgeleide gecombineerd worden met gewenste cultuurgewas-eigenschappen. Via terugkruising met cultuurgewas-planten eventueel gecombineerd met generaties waarin zelfbestuiving wordt 20 toegepast, kan dit proces herhaalde malen doorlopen worden tot de gewenste combinatie van cultuurgewas-eigen-schappen en voor kruisbestuiving gunstige eigenschappen is gevonden. Van de op deze wijze verkregen planten worden inteeltlijnen gemaakt om zuivere lijnen te produ-25 ceren, die geschikt zijn als ouderlijn voor de productie van hybride zaad. Het eindresultaat van dit proces zullen hierin "voor hybride-zaadproductie geschikte ouderplan-ten" genoemd worden.

Zowel de fusieplanten, als de fusieplant-afge-30 leiden, als alle door kruising van dezen of hun volgende generatie nakomelingen met andere planten verkregen planten, waaronder voor hybride-zaadproductie geschikte ouderplanten, die de voor kruisbestuiving gunstige eigenschappen bevatten, maken onderdeel uit van de uitvinding. 35 "Hybrideplanten" komen voort uit het zaad van de kruising tussen (eventueel niet-hybride) ouderplanten, waarvan er tenminste één, in het bijzonder de moeder 1009044 7 plant, de voor kruisbestuiving gunstige eigenschappen bezit. Dit zaad is "hybride zaad".

Eveneens onderdeel van de uitvinding zijn zaden afkomstig van zowel de fusieplanten, fusieplant-afgelei-5 den en alle andere daaruit voortkomende planten volgens de uitvinding, die voor kruisbestuiving gunstige eigenschappen bezitten, in het bijzonder een veranderde bloem-kleur en -morfologie, zoals blauwe of vrijwel witte bloemkleur en relatief grote bloemen. In een voorkeurs-10 uitvoeringsvorm zijn deze planten (cultuur)slaplanten.

De onderhavige uitvinding zal verder worden verduidelijkt aan de hand van de begeleidende voorbeelden. In de voorbeelden wordt sla gebruikt als modelspe-cies. De uitvinding is hiertoe echter niet beperkt.

15 In de voorbeelden wordt verwezen naar de bege leidende figuren.

Figuur 1 toont de verschillen tussen een fusie-plant en de beide ouders.

Figuur 2 toont de verschillen tussen bladeren 20 van een fusieplant en de beide ouders.

Figuur 3 toont de verschillen tussen de bloemen van een fusieplant en de beide ouders.

Figuur 4 toont de verschillen tussen de bloemen van een fusieplant, de beide ouders van de fusieplant en 25 een nakomeling van een vervolgkruising met een fusieplant .

Figuur 5 toont verschillen in PCR-patroon van fusieplanten, fusieplant-afgeleiden en de beide ouders.

Figuur 6 toont de variatie in bloemkleur en 30 bloemgrootte van een nakomeling van een vervolgkruising met een fusieplant.

Figuur 7 toont de zaadzetting bij een nakomeling van een vervolgkruising met een fusieplant met herstelde fertiliteit.

35 Figuur 8 toont insectbezoek op een van een fusieplant afgeleide plant.

1009044 8 VOORBEELDEN VOORBEELD 1

Het opzetten van een in vitro stock van plantjes

De protoplasten worden geïsoleerd uit bladmate-5 riaal van de ouderplanten. In dit voorbeeld wordt beschreven hoe dit bladmateriaal wordt verkregen.

Zaad wordt gesteriliseerd door eerst te spoelen met 70% ethanol en daarna met 0.7% NaOCl gedurende 20 minuten. Vervolgens wordt 3x gespoeld met steriel demi 10 water.

De zaden worden gezaaid op Murashige en Skoog (MS) voedingsmedium met 2% saccharose, en zonder hormonen. Om groene plantjes te verkrijgen, worden de zaden eerst 2 dagen bij 15°C in het donker voorgekiemd, waarna 15 ze bij 25°C in het licht (3000 lux, fotoperiode van 16 uur) verder groeien. Als het eerstë blad zichtbaar wordt, worden de scheuttopjes afgesneden en overgezet op MS voedingsmedium met 3 % saccharose, zonder hormonen. Onder dezelfde omstandigheden worden de steriele scheuten in 20 subcultuur gekweekt.

Om wit weefsel te verkrijgen, bijvoorbeeld hypocotylen, wordt op dezelfde manier gekiemd, maar worden de plantjes niet in het licht weggezet, en na de koudebehandeling van 15°C ook bij 25°C in het donker 25 bewaard.

Het gebruik van groen weefsel van de ene fusie-ouder en wit weefsel van de andere maakt het mogelijk om in het fusiemengsel de gewenste fusie-producten microscopisch te onderscheiden van niet gefuseerde cellen of van 30 autofusies (fusies tussen cellen afkomstig van dezelfde fusieouder).

VOORBEELD 2

Isolatie van protoplasten 35 Drie weken oud steriel bladmateriaal wordt fijn gesneden en gedurende 1 uur in het donker gepreplasmoly-seerd in PG oplossing (54,66 g/1 sorbitol en 7,35 g/1 CaCl2.2H20). De PG oplossing wordt daarna vervangen door »41 1009044 9 een enzymoplossing met 1% cellulase en 0,25% macerozym. Het materiaal wordt gedurende 16 uur geïncubeerd in het donker bij 25°C.

Vervolgens wordt de suspensie gefiltreerd door 5 een nylon filter (45 μιη) en gewassen met een derde volume van CPW16S oplossing (Frearson, E.M., Power, J.B. & Cocking, E.S. (1973) Developmental Biology 33: 130-137) door te centrifugeren bij 700 rpm gedurende 8 minuten. Hierdoor vormt zich in de centrifugebuis een bandje met 10 intacte protoplasten. De protoplasten worden verzameld en gewassen met W5-oplossing (9 g/1 NaCl, 18,38 g/1 CaCl2.2H20, 0,37 g/1 KC1, 0,99 g/1 glucose, en 0,1 g/1 Mes buffer) door te centrifugeren bij 600 rpm gedurende 5 minuten.

15 In het geval van hypocotylen wordt de isolatie identiek uitgevoerd.

VOORBEELD 3

Fusie van protoplasten 20 Protoplasten, geïsoleerd volgens voorbeeld 2, worden 1:1 gemengd tot een eindconcentratie van 6xl05 protoplasten/ml. De protoplastensuspensie wordt 1:1 gemengd met steriele fusie-oplossing 1 (500 g/1 PEG 1500, 1,5 g/1 CaCl2.2H20 en 0,1 g/1 KH2P04) en enige minuten bij 25 kamertemperatuur weggezet. Vervolgens wordt 1 ml fusie-oplossing 2 (50 g/1 glucose, 7,35 g/1 CaCl2.2H20 en 0,22 g/1 Caps (3-(Cyclohexylamino)-1-propaansulfonzuur) buffer) toegevoegd, waarna het geheel 10 tot 25 minuten bij kamertemperatuur wordt weggezet. Hierna wordt enkele 30 malen gewassen door te centrifugeren bij 700 rpm gedurende 5 minuten. De pellet wordt geresuspendeerd in B-sla (½ B5 (Gamborg et al. (1968) Exp. Cell Res. 50:151), 300 mg/1 CaCl2.2H20, 14 mg/1 Fe-330, 270 mg/1 natriumsucci-naat, 103 g/1 saccharose, 0,1 mg/1 2,4-Dichloorfenoxya-35 zijnzuur (2,4-D) en 0,3 mg/1 6-benzylaminopurine (BAP)).

1009044 10 VOORBEELD 4

Selectie en groei van fusieproducten

De protoplastensuspensie uit voorbeeld 3 (inclusief fusieproducten) wordt 1:1 gemengd met B-sla 5 medium met agarose. Dit mengsel wordt in een dun laagje uitgegoten om het te laten stollen. Hierna wordt het in vieren gesneden en laat men ze per 2 stukken in 8 ml B-sla medium drijven. De petrischalen worden dichtgetaped en weggezet bij 25°C. Na enkele dagen wordt het medium 10 verdund met vers B-sla medium. Als de calli ± 0,5 mm groot zijn, worden ze op callusgroeimedium (SH2 (Schenk, R.U. & Hildebrandt, A.C. (1972) Can. J. Bot. 50:199) met 30 g/1 saccharose, 5 g/1 agarose, 0,1 mg/1 a-naftaleen-azijnzuur (NAA) en 0,1 mg/1 BAP) gelegd. Na ± 2 weken 15 kunnen de calli overgelegd worden op regeneratie-medium (SHreg (Schenk & Hildebrand, supra) met 15 g/1 saccharose, 15 g/1 glucose, 5 g/1 agarose, 0,1 mg/1 NAA en 0,1 mg/1 BAP). Na ongeveer 6 weken kunnen de eerste plantjes geoogst worden en op bewortelingsmedium worden gezet 20 (Schenk & Hildebrand met 30 g/1 saccharose en 8 g/1 agar). De selectie van de fusieproducten kan visueel (op basis van hun van beide fusie-ouders afwijkende hybride uiterlijk) of met behulp van moleculair biologische technieken, zoals PCR, AFLP, RFLP, plaatsvinden.

25 VOORBEELD 5

Analyse van fusieplanten en daarvan afgeleide generaties 1. Inleiding

In een fusie-experiment volgens voorbeelden 1-4 30 werden protoplasten van L.tatarica gefuseerd met protoplasten van L.serriola. Fusieplanten werden geregenereerd en gecontroleerd met behulp van PCR-analyse, flow-cytome-trie en op grond van uiterlijke kenmerken.

35 2. Uiterlijk

De verkregen fusieplanten hadden een sterke vegetatieve groei en grote lichtblauw gekleurde bloemen.

1 0 0 9 0 A A

11

De figuren 1-4 laten de verschillen zien tussen de ouders van de fusies en de fusieplanten zelf.

Figuur 1 toont links een L.tatarica-ouderplant, in het midden een fusieplant en rechts een L.serriola-5 ouderplant.

Figuur 2 toont linksboven een blad van L.tatarica, in het midden een blad van een fusieplant en rechtsonder een blad van de L.serriola-fusie-ouder.

Figuur 3 toont links 5 bloemen van L.tatarica. 10 in het midden 5 bloemen van een fusieplant en rechts 5 L.serriola-bloemen.

3. Kruisingen met fusieplanten

Fusieplanten werden in de kas in potten opge-15 kweekt en tot bloei gebracht. Een deel van de bloemen werd niet bestoven, een deel van de bloemen van de fusieplanten werd bestoven met pollen van het slaras 'Norden' en een deel van de bloemen van fusieplanten werd gebruikt om mannelijk steriele (MS) slaplanten te bestuiven. Zowel 20 uit zelfbestuiving als uit de aangegeven kruisingen, werden zaden verkregen. De populaties die zo ontstonden worden als volgt aangeduid.

Fusieplanten : T(+)S

Zelfbestuivingszaad op fusieplanten: I1(T(+)S)

25 Zaad uit kruising van een fusieplant als moeder met het slaras 'Norden' : (T(+)S) x N

Zaad uit kruising van een MS-slaplant (als moeder) met een fusieplant : MS x (T(+)S) 30 4. Bepaling ploïdieniveau van fusieplanten

Via flowcytometrie werd het DNA-gehalte bepaald van een aantal planten van bovengenoemde populaties. Controles waren de L.serriola-liin. L.sativa "Norden", L.sativa "Flora", en L.tatarica.

35 De flowcytometrie bepaling werd volgens stan daard procedure uitgevoerd door Iribov, Laboratorium voor weefselkweek, veredeling en flowcytometrie, Westeinde 149a, 1601 BM Enkhuizen. Alle planten werden met een 1009044 12 interne standaard gemeten. Er werden zes planten in duplo bepaald.

Bij de in duplo gemeten planten was het grootste verschil tussen de twee gemeten waarden 1.2%. In de 5 onderstaande tabel worden de relatieve DNA-gehaltes van de verschillende typen materiaal gegeven.

Tabel 1

Relatief DNA-gehalte (L.sativa cv."Norden"=100) met range 10 en standaardafwijking van enkele controles, van de fusie-producten en van de van de fusieproducten afgeleide Lactuca-planten.

Populatie Aantal Relatief Range Standaard- planten DNA-gehalte afwijking L.sativa cv. Norden (N) 1 100,0 15 L.sativa cv. Flora 2 99,7 99,6-99,8 0,14 L.serriola (S) 2 99,0 98,9-99,0 0,07

Ltatarica (T) 2 156,7 156,2-157,1 0,64 T(+)S 5 257,0 254,7-259,2 2,02 I1(T(+)S) 35 254,4 233,6-266,9 4,79 20 (T(+)S) x N 4 178,0 177,6-178,5 0,44

Ms x (T(+)S) 6 177,8 177,5-182,1 2,28

Uit de tabel blijkt dat het DNA-gehalte van L.serriola (99%) vrijwel identiek is aan dat van L.sativa en dat 25 L.tatarica ongeveer anderhalf maal zoveel DNA heeft (157%). De fusieproducten hebben een DNA-gehalte dat overeenkomt met de som van het DNA-gehalte van de fusie-ouders: 257 is ongeveer 99 + 157. De uit zelfbestoven zaad van de fusieplanten verkregen I1(T(+)S) planten 30 hadden een gemiddeld DNA-gehalte dat ongeveer overeenkwam met dat van de fusieplanten, namelijk 254,4. Echter, deze II-planten vertoonden wel een grotere spreiding (233,6-266,9), wat verklaard zou kunnen worden door het optreden 1009044 13 van aneuploïde planten in deze generatie. Ook fenotypi-sche waarnemingen (sterk afwijkende, gedrongen groei) doen vermoeden dat enkele van de 35 getoetste planten aneuploid waren.

5 Het DNA-gehalte van de kruisingsplanten ver kregen door de fusieplanten te kruisen met cv. "Norden" of met een mannelijk steriele sla-lijn komt overeen met een triploïd niveau met twee sets chromosomen van het niveau van L.serriola/L.sativa en één set van het niveau 10 van L.tatarica: 178 komt ongeveer overeen met 100 +

Ji* (157) .

Op grond van deze flowcytometrie bepalingen kan geconcludeerd worden dat de fusieplanten en de meeste van de uit zelfbestuivingszaad op de fusieplanten verkregen 15 planten het totale diploïde genoom van de L.tatarica ouderplant en het totale diploïde genoom van de L.serrio-la ouderplant bevatten. Deze planten zijn dus allotetra-ploïd. De planten die verkregen werden door fusieplanten te kruisen met L.sativa genotypen hebben een DNA-gehalte 20 dat overeenkomt met het totaal van een volledige haploïde set van L.serriola chromosomen, een volledige haploïde set van L.sativa chromosomen en een volledige haploïde set van L.tatarica chromosomen. Deze planten hebben dus een triploïd DNA-niveau.

25 VOORBEELD 6

Teruakruisina op (L.tatarica (+) L.serriola) x Norden-planten

Planten verkregen uit kruising van fusieplanten 30 als moeder met het slaras 'Norden', hieronder kortheidshalve aangeduid als (T(+)S) xN, werden in de kas opgekweekt en tot bloei gebracht. De (T(+)S) x N-planten hadden grote, zeer lichtblauw getinte bloemen, die gemiddeld iets kleiner van omvang waren dan bloemen van de 35 fusieplanten. Figuur 4 toont karakteristieke bloemen van L.tatarica. L.serriola. een fusieplant, het slaras 'Norden' (L.sativa) en van een (T(+)S) x N-plant (Tl). Bloe- 1009044 14 men van de (T(+)S) x N-planten werden bestoven met pollen van planten van het slaras 'Norden'.

Op niet bestoven bloemen van (T(+)S) x N-plan-ten werd geen zaadzetting waargenomen. Na bestuiving met ; 5 pollen van 'Norden' werd wel zaad verkregen. De populatie verkregen uit deze kruising wordt hieronder aangeduid als ! ((T(+)S) x N) x N-planten. De planten van de ((T(+)S) x N) x N-populatie werden in de kas opgekweekt en tot bloei gebracht. Via flow-cytometrie werd het DNA-gehalte be-10 paald. Als controles werden monsters van T(+)S en (T(+)S) : x N meegenomen.

De flow-cytometrie-bepalingen werden op dezelfde wijze uitgevoerd als in voorbeeld 5. Er werden 11 planten in duplo gemeten. Bij de in duplo gemeten planten 15 was het grootste verschil tussen de twee gemeten waarden 2,2%. In de onderstaande tabel worden de relatieve DNA-gehaltes van de verschillende populaties gegeven.

Tabel 2 20 Frequentie-verdeling, gemiddelde- en standaardafwijking voor relatief DNA-gehalte (L.sativa. cv. Norden = 1,0) van ((T(+)S) x N)x N-planten) en van enkele controle populaties

Populatie Relatief DNA-gehalte N Gemid- Standaard- ~1 deld afwijking <1,0 1,0-1,3 1,3-2,0 >2,0 25 T(+)S 3 3 2,67 0,04 (T(+)S) x N 2 2 1,86 0,02 ((T(+)S) x N) 12 106 21 2 141 1,18 0,21

xN

30 Figuur 5 toont een PCR-patroon van de L.tata- rica- en L.serriola-fusie-ouders. van fusieplanten en van fusieplant-afgeleiden. Van links naar rechts: 1. DNA-ladder (voor bepaling fragmentgrootte) 2. L.tatarica (T), relatief DNA-gehalte: 1,61 tl 5 X» " 1009044 l Λ r 1 f 1 15 3. L.sativa "Norden" (N) , relatief DNA-gehalte: 1,00 4. L.serriola (S), relatief DNA-gehalte: 0,99 5. fusieplant (T (+) S), relatief DNA-gehalte: 2,62 6. fusieplant (T (+) S), relatief DNA-gehalte: 2,66 5 7. fusieplant (T (+) S), relatief DNA-gehalte: 2,71 8. (T (+) S) x N-plant, relatief DNA-gehalte: 2,36 9. (T (+) S) x N-plant, relatief DNA-gehalte: 1,84 10. (T (+) S) x N-plant, relatief DNA-gehalte: 1,85 11. ((T (+) S) x N) x N-plant, relatief DNA-gehalte: 10 1,11, blauwbloeiend 12. ((T (+) S) x N) x N-plant, relatief DNA-gehalte: 1,04, blauwbloeiend 13. ((T (+) S) x N) x N-plant, relatief DNA-gehalte: 1,44, blauwbloeiend 15 14. ((T (+) S) x N) x N-plant, relatief DNA-gehalte: 1,00, geelbloeiend

De plant uit laan 8 is mogelijk een Ιχ (T (+) S)-plant ontstaan door zelfbevruchting van een fusieplant .

20 Figuur 5 toont aan dat de fusieplanten en de door kruising van fusieplanten met het slaras "Norden" verkregen (T (+) S) x N-planten een merkerpatroon hebben dat bestaat uit de som van de merkers die in beide fusie-ouders werden aangetroffen. Planten verkregen na tweemaal 25 kruisen met "Norden" [((T (+) S) x N)-planten] vertoonden in deze PCR-reactie enkel nog de merkers van L.serriola-of L.sativa-ouders.

In de ((T(+)S) x N) x N-populatie, ontstaan door kruising van triploïde (T(+)S) x N-moederplanten met 30 diploïde N-vaderplanten, worden voornamelijk diploïde planten of aneuploïde planten met een of enkele extra chromosomen boven het diploïde niveau verwacht. Voor het diploïde niveau wordt een relatief DNA-gehalte van 1,0 verwacht indien de plant geen L.tatarica-chromosomen 35 bevat, en van 1,3 (0,5 + 0,8) indien de plant nog het totale haploïde genoom van L.tatarica bevat. Een groot deel (84%) van de ((T(+)S) x N) x N-planten heeft een DNA-gehalte in de range van 0,98 - 1,30.

1009044 16 21 ((T(+)S) χ Ν) x N-planten hebben een relatief DNA-gehalte tussen 1,3 en 1,8 hetgeen duidt op een aneuploïde chromosoom-aantal.

Twee ((T(+)S) x N) x N-planten hebben een 5 relatief DNA-gehalte boven 2,0 (2,18 en 2,31). Een plant met een relatief DNA-gehalte van 2,3 kan ontstaan door bevruchting van een ongereduceerde (triploïde) gameet: 2,3 = 1,8 + 0,5.

De ((T(+)S) x N) x N-planten werden onderzocht 10 op bloemmorfologie en op zaadzetting bij zelfbestuiving.

Figuur 6 toont variatie voor bloemgrootte en bloemkleur in ((T(+)S) x N) x N-planten (= T2-fusie). In de ((T(+)S) x N) x N-populatie werd een aanzienlijke variatie gevonden voor bloemgrootte en bloemkleur (van 15 zeer lichtgeel tot zeer intensief geelgekleurd naast blauw (tot soms vrijwel wit) bloeiende bloemen).

1009044 17 m__ <u ---- n ns ° H S ...

rH

p-J (N------ I s Λ a | « - s ,,.

CD__________ 03 <-- I—I § 0 n a ° H w ° o -I » ,,, π 4) <N ^ jj ·Η ·-------- - r* *-> m

pH <0 - H

OrH H vo rtj - π μ α ο ίο *· u> ©

IN Η CN rH

' _________«4-1 C

0) Q fc

_ I z r- 2 E

1 1 ® -S 0) Λ) x - E 0

Ü^VOfN^J·»-* X rH

ZC <D Η fN Η O ,Q

a * w------2 .

<1> Λ r. C 8

— CN CD Φ 1J

_ Μ » Φ 0 1-4 ajOJ^r-HCOH 5 fl) —· rH rH rH rH c^4

^ Z ______. ______£ ID

fn H C *0 Φ"-’ r» ιΛ Φ — - rH jj ij U fN r· MfNfD «ΛΙ —I rH «—I Η (N rH AJ g C -------- 4> c (0 v ay Ή « «

Qa CQ i · i I i q, I *2 ------~ 5 φ

2 CN

Ν' «0 σι Li V X Co CQiAin nr-rn -h o <N IN fN TJ s

_ 2 H

<U

^7 — μ c* ^ + a — 6Γ μ

Sr1 Φ ?S Η 4) Ό Ό

"r rH f—I C

~__-_____i s 0

W * - ï f H

cn tr g «Q Φ

—-· T ffi n« r~ ocor* _ ® S

+ «J ” " no< i Ü ; - s H "88 3_______q μ ai r, 3 ----φ m σι c

r £ 5 - S 8 s .· I

-Htninr* ocovo m a 'θ' rH

U fN CNN ^Λ25 C 2 - 0) o b ^ E Ό 0 4)

aj j® cd E c λ 4J

>iJ H 4) E ®>

J aj C E Φ C

~ j= ή o o h * υ M rH 1>

CU___ _ _ _ «o ai μ Λ rH

U ? Ό § aj M

n fi * S 3 S > ü « O 1) * * o δ u X potDt- o®«0 rwcu W μ «H <H Ή «4-1 t 4> (¾ 4) ^ £ ° g | > e

CD * I rH 4) AJ

öï Λ 4> aJ C

1 —-----——.. μ Ό aj re

C m 4J Q rH

7[ ~ « 4» v o a <L) cd a λ μ μ c φ σ> 4) . -η ·· c ϊ Τ3 I g CQ flj 4) i . 4)-0^,^. > AJ T3 μ

H C 0 -H g £ * C Ή Q

rH 4) rH J4)4)rH4Jfl{4)0 rr jj A Ή00 4)AJrHO> (U r. c ITJ rH rH Jl Λ 5 r μφ4> τ3λλ σι ο -μ e ΓΊ I—I 3 rH τι μ </ 4J a h N m 4) 4) "' fci £ r^3 rH 4) 4) Φ AJ AJ Ü Id Ö4 CD *ri lHC Ü X rH T3 AJ TJ row

nirti e 1 <0 Ό AJ C AJ C

ΜτΙφ E 4) AJ Ή Q Ιβ O ‘rH

no S o c ε o aj o 4>

S i 5 4» μ W μ rH

(¾ H ^ tn^ocD'-uk: f-t an - ______ 1009044 18

Op 141 ((T (+) S) x N) x N-planten bloeiden er 33 blauw. Ook waren er planten met duidelijk grotere bloemen dan het slaras "Norden".

Een groot deel van de ((T(+)S) x N) x N-planten 5 vertoonde een volledig herstelde fertiliteit, hetgeen mogelijk maakte grote hoeveelheden zelfbestuivingszaad (>> 1000 per plant) te verkrijgen.

Figuur 7 toont de zaadzetting op een zeer lichtblauwbloeiende ((T(+)S) x N) x N-plant met herstelde 10 fertiliteit.

VOORBEELD 7

Geschiktheid van fusienlanten voor insectenbestuivina

Twee isolatiekooien van insect-dicht gaas, elk 15 met een oppervlakte van ongeveer 10 m2, werden geplaatst in een kas. Van acht slarassen en van II(T(+)S)-planten werden steeds negen planten per kooi geplant (mei 1997) . De rassen waren Camaro RZ (rood batavia-type), Remco RZ (groene kropsla), Kublaï RZ (rood eikenblad-type), Pan-20 theon RZ (groen batavia-type), Kristine RZ (groen eiken-blad-type), Roxette RZ (ijssla), Loretta RZ (rood lollo-type) en Remus RZ (groene bindsla). Bij aanvang van de bloei (half juni 1997) werden honingbijen (Apis mellife-ra) en hommels (Bombus terrestris) in de kooi gebracht.

25 Vervolgens werd op 6 data tijdens de bloei het aantal bijen en hommels dat op bloemen van de rassen of de II(T(+)S)-planten werd waargenomen, genoteerd.

j i ! 1 0 Ü 9 0 4 4 19 <υ

Ti

rH

<υ

Ti

Ti Ή ε <υ Q) Ti tn £

<D

4J O

ai c Λ <L)

Cn c fÖ <u nj Ό m c ...........

cd T3 > g rH ij 0) C § e <y 3.

H £ vcntT'fNmr^r'OO

Λ, -HrooofsmHvor*· vU 0) « ......

J> Q prlf*lrHmOC>r-i

rH

• Λ ---------

Ö Q)OU>OOOOrH

(DQ^ Dooooooo 4-J O ¢)0000000 P * flj Λ --------- rH U - ft -H u

, .. UHOOOOOfN

IN OlfHOOOOOO

u ......

_ OOOOOOOO

CO ft 3

Ή ., I·— .. . - — I---— I

+ 4-)

v CQ S

Hrr-< 4JpH^*OOOVOO

^ 0)Η^ΟΟΟΟιΗ

'— TH X

, , ο00®0000 ι—I Ή (2 Μ JJ __________ ρ ν s Q) XJ ·Η

^ Η jJtT'J'OOOOiH

ι—I n^-coooom ö d) vJhoooooo <ΰ £ «

Cfl Jh --------- ca <υ ft t> c U o VJ , 4) dj JJ j^fHrN^JOooo

_I fli U«-4<NOOOOO

r-i QJ c ......

0} ^ A50000000 ft ft ---------- 0 0 njoo*noou>®

i-HOlT|rHOOO(N

C 4J Λ.......

<1)03 |rwoooooo TH ___________

H

Λ - frj ij or-r-tooooin ë c g-;^00000 _1 W 4)0000000 Ή (y Qj C rH _________ O ft

rC

Li . O

. Γ] ._, MCO*HVÖVOOVD*i C d) Tj m ^r-rHOOCOm fÖ ft C <Öflj0r-*00000 >0 κ u ü >--------- d)d) o o o o o o d) TH ^ Ό oonomo O ·Η ·η (Λ co <τ> cn σ\ ο

Nil) Η Η ^ 0 -Η---------

Α Ή CQ

ι—ι £ cd w Λ\ Λΐ . 1 Λ\ C C0 00 CO C0 00 00 0)(D4-><iJ 3 ο ο ο ο ο ο _η Ο d η ^ .

'-j . d Γ» * Γ- cn -q· in (Ν σ> 4) (ΰ rH Π3 U Q Η -> Η Ρ1 (Ί Ο Η ffl πί nJ II— ... ------- - 1009044 20 α> τ3 φ -η η φ ε Ό Φ Ό Ο •Η Ö ε <υ φ Cη σι φ 4J τ3 φ Λ G Π3 α > (0 ΓÖ Ö I, . , — -U Φ CQ 0 c

α) S

τ3 ο ϊ

(—I ι—I

S'r-for-ojr-im^ C -HyjLnvor~rHrnrr

L« Q. W

rl M4 τοΟΟΟΟΟΟ fl) Ο tu > ^ ---------- • Π ηοοοοοοο -i 30000000 ^ 0)0000000 +J * α a --------- <Τ5 ·Η *υ

rH 4-J jJOOOOOVOrH

ρ| φ 0)0000000 I Τ3 οοοοοοοο — ·η 13 C0 -Η ----------

— 4J

+

iJOVOOVOOOCN

ν—" QJ 0)0000000 Ε-* ΟΟΟΟΟΟΟΟ ^ rH « Η (ϋ --------- Μ £ Μ Η £ Ijvohhoooui Φ S <noHi-»oooo οοοοοοοο £ XJ * 0) (L) --------- CQ ^ β w 8

(Τ5 Q-I .COOVOOOOrH

^ Q JJOOOOOOO

teooooooo ι—I 4-) co as ---------- f), fOOVOOOOHrn

0 i-HOOOOOHO

xi ......

j \ 30000000

Cfl G ___*________

r—I aS

(U rH ΟΟΟΟΟΟΟΟ g οοοοοοοο 0 Οοοοοοοο OM * ^ ω --------- ft ο

£j ^ WlOOHOOOCN

it η c „ι°οΗ. °°°° >__l ο re οοοοοοοο ΓΠ Ir' οί υ Φ > λ; ε φ--------- Φ ε 1-0 ο ο ο ο ο ο QQ Ό ο ο η ο η ο

• Ν Λ Φ ΙήΙ I σ\ I col σ\ ! O' I ^ I ο I II

ΙΓι φ -Η Η w 4 rH w--------- Η Ε It ΙΟ φφ4-ϊφ 3 ο ο ο ο σ ο · Λ Ο Ö Ο Α γν <r in <ν cn υ Π5 r-I Π3 U ο ^Hr-iMiso Η PQ Π3 (Ο Η- 1009044 21

Uit de resultaten blijkt dat de I1(T(+)S)-planten zowel door honingbijen als hommels veel frequenter bevlogen worden dan de slarassen. Gemiddeld ten opzichte van alle getoetste slarassen werd op bloemen van 5 de II(T(+)S)-planten een 12 maal zo hoog bijenbezoek waargenomen. Ten opzichte van het meest frequent door honingbijen bezochte slaras (Camaro RZ) hadden de II(T(+)S)-planten een vijf maal zo hoog bijenbezoek. Het hommelbezoek was op bloemen van II(T(+)S)-planten gemid-10 deld 28 maal zo hoog als op de slarassen, en ongeveer 10 maal hoger dan op het meest frekwent door hommels bezochte slaras (Kristine RZ). Dit toont dat de I1(T(+)S)-planten een duidelijk betere geschiktheid hebben voor natuurlijke kruisbestuiving door insekten dan de getoets-15 te slarassen.

Figuur 8 toont een bloem van een I1(T(+)S)-plant die bezocht wordt door een honingbij.

1009044

Claims (20)

1. Werkwijze voor het vervaardigen van fusie-, planten, voor gebruik in de verkrijging van planten die i geschikt zijn voor natuurlijke kruisbestuiving, omvat tende het vervaardigen van fusieplanten door het bereiden 5 van protoplasten van een eerste ouderplant en protoplasten van een tweede ouderplant, het fuseren van de eerste protoplasten met de tweede protoplasten ter verkrijging - van een fusieproduct, en het uit het fusieproduct regenereren van fusieplanten, met het kenmerk, dat tenminste 10 een van beide ouderplanten een of meer voor natuurlijke - kruisbestuiving gunstige eigenschappen bezit, waarvan er tenminste een in de fusieplant tot uitdrukking komt.

~ 2. Werkwijze voor het vervaardigen van planten die geschikt zijn voor natuurlijke kruisbestuiving, 15 omvattende: a) het vervaardigen van fusieplanten door het bereiden van protoplasten van een eerste ouderplant en protoplasten van een tweede ouderplant, het fuseren van de eerste protoplasten met de tweede protoplasten ter = 20 verkrijging van een fusieproduct, en het uit het fusie product regenereren van fusieplanten, waarbij tenminste een van beide ouderplanten een of meer voor natuurlijke kruisbestuiving gunstige eigenschappen bezit, waarvan er tenminste een in de fusieplant tot uitdrukking komt, en 25 b) het verder tenminste eenmaal (terug)kruisen van de fusieplanten met elkaar en/of met een niet-fusieplant met gewenste eigenschappen ter verkrijging van planten, die geschikt zijn voor natuurlijke kruisbestuiving en de gewenste eigenschappen bezitten.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de voor kruisbestuiving gunstige eigenschappen tenminste een voor insecten aantrekkelijke bloem-grootte en/of bloemkleur omvatten.

4. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, met het 35 kenmerk, dat de gewenste eigenschappen cultuurgewas-Π eigenschappen zijn. jT" 1 0 0 9 0 4 4

5. Werkwijze volgens conclusie 3 of 4, met het kenmerk, dat de beide ouderplanten slaplanten van het genus Lactuca zijn en de voor kruisbestuiving gunstige eigenschappen afkomstig zijn van een ouderplant van het 5 species L.tatarica en bestaan uit grote bloemen met een blauw-paarse of witte kleur.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de andere ouderplant een plant van het cultuursla-species L.sativa is.

7. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de andere ouderplant een plant van een Lactuca species is welke in hoofdzaak volledig kruisbaar is met een plant van het cultuursla-species L.sativa.

8. Werkwijze volgens conclusie 6, met het 15 kenmerk, dat de andere ouderplant, die een plant van een Lactuca species is welke in hoofdzaak volledig kruisbaar is met een plant van het cultuursla-species L.sativa. een plant van het species L.serriola is.

9. Fusieplant te verkrijgen door middel van de 20 werkwijze volgens conclusies 1 en 3-8.

10. Fusieplant volgens conclusie 9, te verkrijgen door fusie van protoplasten van L.tatarica met protoplasten van L.sativa en regeneratie van planten uit het zo verkregen fusieproduct.

11. Fusieplant volgens conclusie 9 te verkrij gen door fusie van protoplasten van L.tatarica met protoplasten van L.serriola en regeneratie van planten uit het zo verkregen fusieproduct.

12. Fusieplant-afgeleiden te verkrijgen door 30 een fusieplant volgens conclusie 11 te kruisen met L.sativa .

13. Plant die geschikt is voor natuurlijke kruisbestuiving, te verkrijgen door middel van de werkwijze volgens conclusies 1-8.

14. Plant volgens conclusies 9-13 voor gebruik in de vervaardiging van hybride planten door kruising van de plant met een kruisingspartner, die gewenste eigenschappen bezit. 1 o 0 9 0 4 4

15. Plant volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat de gewenste eigenschappen cultuurgewas-eigen-schappen zijn.

16. Zaad van een plant volgens een van de 5 conclusies 9-15 te verkrijgen door zelfbestuiving van een dergelijke plant.

17. Werkwijze voor het vervaardigen van hybride zaad, omvattende het vervaardigen van een zuivere lijn uit een plant volgens een der conclusies 9-15 of een door 10 één of meer kruisingen van een dergelijke plant met een plant met gewenste cultuurgewas-eigenschappen verkregen plant, het kruisen van een plant van de zuivere lijn als eerste ouderplant met een tweede ouderplant uit een zuivere lijn, en het verzamelen van uit deze kruising 15 verkregen zaad.

18. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat het vervaardigen van een zuivere, homozygote lijn gebeurt door inteelt van de voor natuurlijk kruisbevruchting geschikte plant met de vereiste cultuureigen- 20 schappen, door productie van verdubbelde haploiden, of op enigerlei andere in de techniek bekende wijze ter verkrijging van homozygote lijnen.

19. Hybride zaad, te verkrijgen door middel van een werkwijze volgens conclusie 17 of 18.

20. Werkwijze voor het vervaardigen van hybride planten, omvattende het doen ontkiemen van hybride zaad verkregen met behulp van de werkwijze volgens conclusie 17 of 18, en het daaruit opkweken van hybride planten. 1009044