NL1008674C2

NL1008674C2 - Werkwijze voor het bereiden van tromboplastine uit dierlijk weefsel.

Info

Publication number: NL1008674C2
Application number: NL1008674A
Authority: NL
Inventors: Hendrikus Bernardus Jo Roodink; Gerjan Thomas Van Zeeburg
Original assignee: Harimex Bv
Priority date: 1998-03-23
Filing date: 1998-03-23
Publication date: 1999-09-24
Also published as: WO1999048922A1; US6472194B1; BR9909455A; AU2963899A; DE69919688D1; EP1066326A1; EP1066326B1

Description

Korte aanduiding: Werkwijze voor het bereiden van tromboplastine uit dierlijk weefsel.

Beschrijving.

5

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van tromboplastine uit dierlijk weefsel, onder toepassing van een extractie met een waterige zoutoplossing, gevolgd door centrifugeren, om een tromboplastine-bevattende zoutoplossing te verkri j-10 gen.

Deze werkwijze is bekend uit Europese octrooiaanvrage EP-A-0.083.773. Volgens de bekende werkwijze wordt van het dierlijke weefsel, met name zoogdierweefsel, in het bijzonder hersenweefsel, eerst een acetonpoeder bereid. Vervolgens wordt het acetonpoeder geëxtraheerd 15 met een waterige zoutoplossing die 1-20 mM calciumionen en eventueel een oppervlakte-actieve stof omvat.

Uit recent wetenschappelijk onderzoek is gebleken dat het gebruik van hersenweefsel en zenuwweefsel van runderen het overdragen van de ziekteverwekkers van BSE (Bovine Spongiform Encephalitis) tot gevolg 20 kan hebben ("Spongiform Encephalopathy Advisory Committee, Sept. 1994.

Transmissible Spongiform Encephalopathies. A summary of Present Knowledge and Resarch." HMSO, London, U.K.). Bovendien is uit onderzoek van aanvraagster gebleken dat het voor het bereiden van een tevredenstellende tromboplastine-oplossing niet nodig is eerst een acetonpoeder van het 25 betrokken weefsel te maken, en vervolgens de extractie uit te voeren met een oplossing van calciumzouten en eventueel een oppervlakte-actieve stof bevat.

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is gekenmerkt doordat als dierlijk weefsel spierweefsel wordt gebruikt, dat 30 rechtstreeks met een waterige zoutoplossing wordt geëxtraheerd.

Door de onderhavige werkwijze kan het BSE-probleem worden vermeden. Bovendien wordt een eenvoudige en minder bewerkelijke bereidingswijze verkregen, aangezien volgens de uitvinding de stap van het bereiden van een acetonpoeder overbodig is. Het spierweefsel wordt 35 gewoon verkleind en vervolgens geëxtraheerd. Voor de extractie kan worden 1008674 z volstaan met een zoutoplossing zonder calciumionen of een oppervlakte-actieve stof.

Het toegepaste spierweefsel is bij voorkeur afkomstig van zoogdieren, in het bijzonder van runderen, aangezien een dergelijk 5 spierweefsel in grote hoeveelheden kan worden verkregen. De werkwijze kan eveneens worden toegepast op spierweefsel van pluimvee of van vissen.

Uit experimenteel onderzoek is gebleken dat het voorkeur verdient dat het toegepaste spierweefsel niet afkomstig is van een pas geslacht dier, maar dat het een "ouderdom" van 4-7 dagen heeft. Extracten 10 van een dergelijk "verouderd" spierweefsel hebben een hogere tromboplasti-ne-activiteit. Een hogere tromboplastine-activiteit wordt ook verkregen met vacuüm-verpakt spierweefsel met een ouderdom van 2 weken.

Wat betreft de samenstelling van de voor het extraheren toegepaste waterige zoutoplossing, verdient het de voorkeur dat deze op 15 een pH-waarde van 6,0-7,5 is gebufferd. Toepassing van een fosfaatzout verdient in het bijzonder de voorkeur, aangezien dit zout ook een goede bufferende werking heeft.

Tijdens de bereiding volgens de uitvinding wordt in beginsel een temperatuur van 0 - 4 °C instandgehouden. Een hogere opbrengst 20 aan tromboplastine-activiteit wordt echter verkregen wanneer de extractie wordt uitgevoerd met een zoutoplossing met een temperatuur van 40 - 50 °C.

Het onder toepassing van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding verkregen tromboplastine kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor voedingsdoeleinden. Voor een dergelijke toepassing moet de 25 extractie worden uitgevoerd met een oplossing van voor voedingsproducten toegelaten zouten, zoals keukenzout, fosfaten en acetaten. Bij een toepassing in vleesproducten is het tromboplastine vanzelfsprekend bij voorkeur afkomstig van dezelfde diersoort als die van het vlees zelf.

De onderhavige uitvinding is hierna toegelicht aan de 30 hand van voorbeelden.

Voorbeeld 1.

Een hoeveelheid van 100 g van spierweefsel van runderen, in casu schoudervlees, met een ouderdom van 5 dagen werd bij 4 °C verkleind tot stukjes van ongeveer 1 cm3. Een hoeveelheid van 400 g van een oplossing 35 van 150 mM keukenzout (8,77 g/1 NaCl in water) werd, eveneens bij 4 °C, toegevoegd. De vleesstukken werden gedurende 1 minuut bij 11.000-13.000 t 1008674 3 omwentelingen per minuut gehomogeniseerd met behulp van een homogenisator. Vervolgens werd het homogenaat gedurende 30 minuten bij 3.200 g gecentrifugeerd, bij een temperatuur van 0 °C. Uit de hoeveelheid van 500 g homogenaat werd een hoeveelheid van 225 g supernatans met een 5 eiwitgehalte van 20 mg/ml gewonnen. Het supernatans bevatte tromboplastine.

De tromboplastine-activiteit werd bepaald door het supernatans toe te voegen aan een oplossing van protrombine en, na een bepaalde reactietijd, de activiteit van het gevormde trombine te meten. Aan een hoeveelheid van 10 ml protrombine-oplossing (390 NIH-U/ml) werd 10 50 ml van 20 mM Tris-HCl, pH 6,5, 1 ml 3 M CaCl2 en 250 μΐ van de te bepalen tromboplastine-oplossing toegevoegd. Tenslotte werd het geheel met 20 mM Tris-HCl, pH 6,5 op een volume van 100 ml gebracht . Het reactiemengsel werd gedurende 60 minuten geïncubeerd bij 25 °C. De activiteit van het verkregen trombine werd op een gebruikelijke wijze 15 gemeten onder toepassing van een chromogeen substraat (0,1 mM S-2238 van Chromogenix, hierbij wordt bijvoorbeeld verwezen naar Hemker H.C. (1983) Handbook of Synthetic Substrates, hoofdstuk IV, Martinus Nijhoff Publishers, Boston). Deze metingen werden ook uitgevoerd met 250 μΐ van een supernatans van hersenweefsel als positieve controle. Tenslotte werd 20 de tromboplastine-activiteit van het supernatans uit schouderspierweefsel uitgedrukt als het percentage van de activiteit van het supernatans uit hersenweefsel (%RTP). De verkregen %RTP-waarde voor het supernatans uit schouderspierweefsel van runderen bedroeg 28.

De bereiding werd herhaald met 150 mM natriumfosfaat-25 buffer, pH 7,0 (17,37 g/1 Na2HP04.2H20 en 8,19 g/1 NaH2P04.2H20 in water) en met 150 mM acetaatbuffer (op pH 7,0 gesteld met azijnzuur). De onder toepassing van de gebufferde zoutoplossingen verkregen activiteiten was aanzienlijk hoger dan degene die was verkregen onder toepassing van NaCl, en de %RTP-waarde bedroeg 64.

30 Wanneer de hierboven beschreven bereidingen werden toegepast op schouderweefsel van varkens, werden vergelijkbare resultaten verkregen.

Voorbeeld 2.

De invloed van de pH-waarde van de extractie-oplossing 35 werd nagegaan onder toepassing van fosfaatbuffers van 150 mM NaH2P04/Na2HP04 met verschillende pH-waarden. Het verkleinen, extraheren en bepalen van 1008674 4 de tromboplastine-activiteit werd uitgevoerd zoals beschreven in Voorbeeld 1. De verkregen resultaten zijn samengevat in de hiernavolgende Tabel 1.

Tabel 1.

5 pH-waarde bij extractie Tromboplastine-activiteit (%RTP) 5.0 56,7 6.0 58,8 6,5 65,0 7.0 62,5 10 7,5 61,1

Bij extractie met op pH 8,0 en pH 8,5 gestelde buffers was het homogenaat zeer viskeus en werd nauwelijks een pellet verkregen. Uit deze proefnemingen blijkt dat de beste resultaten worden verkregen 15 bij een pH-waarde van 6,0 - 7,5.

Voorbeeld 3.

De invloed van de ouderdom (besterftijd) van het spierweefsel op de hoeveelheid geëxtraheerde tromboplastine-activiteit werd nagegaan door hoeveelheden van 100 g schouderspierweefsel van runderen 20 te verkleinen en te extraheren zoals beschreven in Voorbeeld 1, onder toepassing van een 150 mM natriumfosfaatbuffer, pH 7,0. De meting van de tromboplastine-activiteit werd uitgevoerd zoals beschreven in Voorbeeld 1. De verkregen resultaten zijn samengevat in de hiernavolgende Tabel 2.

25 Tabel 2.

Ouderdom/besterftijd (dagen) Activiteit (%RTP) 3 63,7 5 78,2 7 68,7 30 10 67,6

Hieruit blijkt dat de hoogste tromboplastine-activiteit werd verkregen uitgaande van spierweefsel met een ouderdom van 4-7 dagen.

1 1008674 5

Voorbeeld 4.

De bereiding volgens Voorbeeld 1 werd herhaald door bij 4 °C te extraheren met een 150 mM fosfaatbuffer. Vervolgens werd een bereiding uitgevoerd door te extraheren met een fosfaatbuffer met een 5 temperatuur van 50 °C. Na homogeniseren bedroeg de temperatuur van het homogenaat 40 °C. De overige stappen werden uitgevoerd zoals beschreven in Voorbeeld 1. De bij verhoging van de extractietemperatuur verkregen tromboplastine-activiteit was 34% hoger dan de activiteit verkregen bij koude extractie.

1008674

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van tromboplastine uit dierlijk weefsel, onder toepassing van een extractie met een waterige 5 zoutoplossing, gevolgd door centrifugeren, om een tromboplastine-bevattende oplossing te verkrijgen, met het kenmerk, dat als dierlijk weefsel spierweefsel wordt gebruikt, dat rechtstreeks met een waterige zoutoplossing wordt geëxtraheerd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat 10 spierweefsel van zoogdieren wordt geëxtraheerd.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat spierweefsel van runderen wordt geëxtraheerd.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat spierweefsel van pluimvee wordt geëxtraheerd.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat spierweefsel van vissen wordt geëxtraheerd.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat spierweefsel met een ouderdom van 4-7 dagen wordt geëxtraheerd.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat vacuüm-verpakt spierweefsel met een ouderdom van 2 weken wordt geëxtraheerd.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 1-7, met het kenmerk, dat een op pH 6,0-7,5 gebufferde waterige zoutoplossing wordt 25 toegepast.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat een fysiologische zoutoplossing wordt toegepast.

10. Werkwijze volgens conclusie 8 of conclusie 9, met het kenmerk, dat een fosfaatzout wordt toegepast.

11. Werkwijze volgens een der conclusies 1 - 10, met het kenmerk, dat de waterige zoutoplossing bij het extraheren een temperatuur van 40 °C - 50 °C heeft. 1008674 SAMENWERKINGSVERDRAG (PCT) RAPPORT BETREFFENDE NIEUWHEIDSONDERZOEK VAN INTERNATIONAAL TYPE IOENTIPIKATIE VAN OE NATIONALE AANVRAGE Kenmerk van d· janvrager of van de gemachtigde 39223/EP/mb Nederlandse aanvrage nr. Indieningsdatum 1008674 23 maart 1998 Ingeroepen voorrangsdatum Aanvrager (Naam) HARIMEX B.V. Datum van het verzoek voor een onderzoek van internationaal type Door de Instantie voor Internationaal Onderzoek (ISA) aan het verzoek voor een onderzoek van internationaal type toegekend nr. SN 31000 NL I. CLASSIFICATIE VAN HET ONDERVtëRPIbij toepassing van verschillende classificaties, alle dassificatiesymbolen opgeven) Volgens de Internationale classificatie (IPCJ Int.Cl.6: C 07 K 14/745, C 07 K 14/705 II. ONDERZOCHTE GEBIEDEN VAN DE TECHNIEK Onderzochte minimum documentatie Classificatiesysteem Clatsificatiesympolen Int.Cl.6: C 07 K Onderzochte andere documentatie dan de minimum documentatie voor zover dergelijke documenten in de onderzochte gebieden zijn opgenomen HI- | | GEEN ONDERZOEK MOGELUK VOOR BEPAALDE CONCLUSIES (opmerkingen op aanvullingsblad) IV· I ] GEBREK AAN EENHEID VAN UITVINDING (opmerkingen op aanvullingsblad) Form PCT/ISd/301(«l 07.1979