NL1006266C2 - Werkwijze voor de bereiding van ampicilline. - Google Patents

Description

- 1 -

WERKWIJZE VOOR DE BEREIDING VAN AMPICILLINE

5 De uitvinding betreft een werkwijze voor de bereiding van ampicilline waarbij 6-aminopenicilline-zuur (6-APA) wordt onderworpen aan een enzymatische acyleringsreactie met behulp van een fenylglycinederivaat waarbij de totale concentratie van 10 in het reactiemengsel aanwezige 6-APA plus ampicilline groter is dan 250 mM, de concentratie 6-APA in oplossing lager dan 300 mM wordt gehouden en de toegepaste molaire verhouding acyleringsmiddel tot 6-APA kleiner is dan 2,5.

15 In WO-A-92/01061 wordt de bereiding van β- lactamderivaten, waaronder ampicilline beschreven via enzymatische acylering van een β-lactamkern, bijvoorbeeld 6-APA, bij hoge concentraties van acyleringsmiddel plus β-lactamderivaat. De concentratie 20 van de β-lactamkern wordt relatief laag gehouden. Uit de voorbeelden valt af te leiden dat bij hoge molaire verhouding acyleringsmiddel tot β-lactamkern, hoge conversies worden gerealiseerd, terwijl bij lagere molaire verhouding acyleringsmiddel tot β-lactamkern de . 25 conversie beduidend lager is. Een nadeel van het toepassen van een hoge molaire verhouding acyleringsmiddel tot β-lactamkern is dat ten gevolge van optredende hydrolyse van het acyleringsmiddel, grote hoeveelheden acyleringsmiddel verloren gaan.

30 Bovendien is gebleken dat de opwerking van ampicilline bemoeilijkt wordt, doordat een relatief grote hoeveelheid D-fenylglycine ten opzichte van ampicilline aanwezig is in het na de enzymatische acyleringsreactie verkregen reactiemengsel, waardoor een kleinere 35 hoeveelheid ampicilline kan worden geïsoleerd.

1 0 0 6"2 6 e - 2 -

Gebleken is dat het, voor het behalen van een hoge conversie in het proces, van groot belang is de reactie bij hoge concentraties, dus ook bij hoge concentratie β-lactamkern, te kunnen uitvoeren.

5 In WO-A-96/02663 wordt een proces beschreven waarin de enzymatische acyleringsreactie van β-lactamkernen bij een constante concentratie van de reactanten wordt uitgevoerd. In het hier beschreven continu proces wordt een zo hoog mogelijk 10 concentratieniveau van beide reactanten nagestreefd.

Gebleken is dat wanneer de bereiding van ampicilline wordt uitgevoerd bij hoge concentratie 6-APA, er toch slechts een relatief lage conversie werd bereikt, vergeleken met conversies die konden worden 15 bereikt in de bereiding van andere β-lactamderivaten, zoals cefalexine.

Aanvraagster heeft nu verrassenderwijze gevonden dat door ervoor te zorgen dat de concentratie 6-APA in opgeloste vorm aanwezig in het reactiemengsel, 20 relatief laag wordt gehouden, een hogere conversie kon worden bereikt, dan wanneer de concentratie opgelost 6-APA zo hoog mogelijk werd gekozen. Bovendien is gebleken dat de roerbaarheid van het reactiemengsel aanzienlijk beter was wanneer de concentratie opgelost 25 6-APA laag werd gehouden.

Onder conversie wordt in het kader van deze uitvinding verstaan de molaire verhouding gevormd ampicilline tot ingezette hoeveelheid 6-APA.

De concentratie opgelost 6-APA wordt uitgedrukt als de 30 hoeveelheid 6-APA in molen per kg reactiemengsel; de totale concentratie, opgelost en niet opgelost, 6-APA en ampicilline wordt uitgedrukt als de hoeveelheid 6-APA plus ampicilline in molen per kg totaal reactiemengsel; het totale reactiemengsel kan naast de 35 oplossing een aantal vaste stoffen bevatten, bijvoorbeeld 6-APA, ampicilline, fenylglycine en 1006266 -3- geïmmobiliseerd enzym.

De molaire verhouding acyleringsmiddel tot 6-APA, d.w.z. de totale hoeveelheid toegevoegd fenylglycinederivaat gedeeld door de totale hoeveelheid 5 toegevoegd 6-APA uitgedrukt in molen, is kleiner dan 2,5. Bij voorkeur ligt de molaire verhouding tussen 1,0 en 2,0, in het bijzonder tussen 1,2 en 1,8.

De enzymatische acyleringsreactie wordt bij voorkeur als batch proces uitgevoerd. Desgewenst is het 10 ook mogelijk om de reactie continu uit te voeren, waarbij in line de concentratie opgelost 6-APA wordt geregeld.

De totale concentratie 6-APA plus ampicilline (in opgeloste en in onopgeloste vorm) in het 15 reactiemengsel wordt in de werkwijze volgens de uitvinding hoger dan 250 mM, bij voorkeur hoger dan 300 mM, in het bijzonder hoger dan 350 mM gekozen.

De concentratie van opgelost 6-APA wordt gedurende de bereiding van ampicilline in essentie 20 lager dan 300 mM, bij voorkeur lager dan 250 mM gehouden. Bij hogere concentratie van het acyleringsmiddel kan eventueel een hogere concentratie opgelost 6-APA, worden gekozen dan bij lagere concentratie. Bij een hogere concentratie van het 25 acyleringsmiddel is de reactiesnelheid namelijk hoger, waardoor 6-APA slechts relatief kort in hoge concentratie in opgeloste vorm aanwezig is.

De concentratie 6-APA in opgeloste vorm in het reactiemengsel aanwezig, kan op diverse manieren 30 laag worden gehouden. Een mogelijkheid om de concentratie opgelost 6-APA laag te houden is, slechts een deel van de totale hoeveelheid 6-APA voorleggen en de rest doseren tijdens de reactie. Een nadeel hiervan is echter dat 6-APA dan als vaste stof moet worden 35 gedoseerd hetgeen praktische bezwaren oplevert. Bij voorkeur wordt dan ook de totale hoeveelheid 6-APA in 1006266 - 4 - een batch proces voorgelegd aan het begin van de reactie, waarna gedurende de enzymatische acyleringsreactie de concentratie 6-APA in het reactiemengsel zal afnemen en de concentratie 5 ampicilline zal toenemen. Een geschikte methode om toch een lage concentratie opgelost 6-APA te bereiken is bijvoorbeeld door de pH op een lagere waarde te houden vergeleken met de pH-waarde waarbij een maximale oplosbaarheid van de reactanten wordt bereikt. Een 10 bijzonder geschikte methode om de 6-APA concentratie in opgeloste vorm laag te houden is bijvoorbeeld door ervoor te zorgen dat de concentratie van het fenylglycinederivaat laag wordt gehouden, bijvoorbeeld door het fenylglycinederivaat gedeeltelijk in de loop 15 van de reactie te doseren.

Gebleken is namelijk dat wanneer de fenylglycinederivaat-concentratie laag wordt gehouden, er weinig 6-APA in oplossing gaat, zodat door dosering van het fenylglcyinederivaat, de concentratie 6-APA in 20 oplossing kan worden geregeld.

In de (enzymatische) acyleringsreaktie kan als acyleringsmiddel fenylglycine in geaktiveerde vorm bijvoorbeeld een amide of een ester, in het bijzonder een methylester worden toegepast. Bij voorkeur wordt D-25 fenylglycineamide (FGA) toegepast.

Een bijzonder geschikte uitvoeringsvorm wordt verkregen wanneer FGA wordt toegevoegd in de vorm van een zout ervan, bij voorkeur het zout van FGA en een mineraal zuur, bijvoorbeeld FGA.HC1, FGA.1/2H2S04 en 30 FGA.HNO3. Op deze wijze is het namelijk eenvoudig mogelijk om via het constant houden van de pH een optimale dosering van het FGA te bewerkstelligen. Bij voorkeur wordt FGA.1/2H2S04 toegepast omdat dit zout een zeer hoge oplosbaarheid heeft.

35 De temperatuur waarbij de enzymatische acyleringsreaktie wordt uitgevoerd ligt meestal lager 1006266 - 5 - dan 40°C, bij voorkeur tussen -5 en 35°C. De pH waarbij de enzymatische acyleringsreactie wordt uitgevoerd ligt meestal tussen 5,5 en 8,0, bij voorkeur tussen 6,0 en 6,8.

5 Als enzym kan in principe elk enzym worden toegepast dat geschikt is als katalysator in de koppelingsreaktie. Dergelijke enzymen zijn bijvoorbeeld de enzymen die bekend zijn onder de algemene aanduiding penicilline amidase of penicilline acylase. Dergelijke 10 enzymen zijn bijvoorbeeld beschreven in J.G. Shewale et. al. Process Biochemistry, Augustus 1989 p. 146-154 en in J.G. Shewale et. al. Process Biochemistry International, Juni 1990, p. 97-103. Voorbeelden van geschikte enzymen zijn enzymen afgeleid van 15 Acetobacter. in het bijzonder Acetobacter pasteurianum, Aeromonas. Alcaliaenes. in het bijzonder Alcaliaenes faecal is. Aphanocladium, Bacillus sp.. in het bijzonder Bacillus meoaterium, Cephalosporium. Escherichia. in het bijzonder Escherichia coli, Flavobacterium.

20 Fusarium. in het bijzonder Fusarium oxvsporum en

Fusarium Solani. Kluvvera. Mvcoplana. Protaminobacter. Proteus. in het bijzonder Proteus rettaari. Pseudomonas en Xanthomonas. in het bijzonder Xanthomonas citrii.

Bij voorkeur wordt een geïmmobiliseerd enzym 25 toegepast, aangezien het enzym dan eenvoudig afgescheiden en hergebruikt kan worden. Een geschikte immobilisatietechnologie is bijvoorbeeld beschreven in EP-A-222462. Een andere geschikte technologie wordt gevormd door het Penicilline G acylase te immobiliseren 30 op een drager die een gelerend agens, bijvoorbeeld gelatine, en een polymeer met vrije aminogroepen, bijvoorbeeld alginaat amine, chitosan of polyethyleenimine bevat. Daarnaast kunnen enzymen ook als kristallijne stof worden ingezet (Clecs).

35 Van de geïmmobiliseerde enzymen zdie commerciëel verkrijgbaar zijn, zijn bijvoorbeeld 1006266 - 6 - bijzonder geschikt gebleken het Escherichia coli enzym van Boehringer Mannheim GmbH dat onder de naam Enzygel® commerciëel verkrijgbaar is, het geïmmobiliseerde Penicilline-G acylase van Recordati en het 5 geïmmobiliseerde Penicilline-G acylase van Pharma Biotechnology Hannover.

De (enzymatische) acyleringsreactie en de verdere opwerking van het reactiemengsel wordt in de praktijk meestal uitgevoerd in water. Desgewenst kan 10 het reactiemengsel ook een organisch oplosmiddel of een mengsel van organische oplosmiddelen bevatten, bij voorkeur minder dan 30 vol.%. Voorbeelden van organische oplosmiddelen die kunnen worden toegepast zijn alcoholen met 1-7 C-atomen, bijvoorbeeld een 15 monoalcohol, in het bijzonder methanol of ethanol; een diol, in het bijzonder ethyleenglycol of een triol, in het bijzonder glycerol.

Bij voorkeur wordt de reactie vrijwel volledig gestopt wanneer nagenoeg de maximale conversie 20 is bereikt. Een geschikte uitvoeringsvorm om dit te bereiken is het verlagen van de pH, bij voorkeur tot een waarde tussen 4,0 en 6,3, in het bijzonder tussen 5,0 en 5,7. Een andere geschikte uitvoeringsvorm is het verlagen van de temperatuur van het reactiemengsel 25 zodra de maximale conversie is bereikt. Ook een combinatie van beide uitvoeringsvormen is mogelijk.

Nadat de reactie vrijwel gestopt is bij het bereiken van maximale conversie, is het reactiemengsel meestal aanwezig in de vorm van een suspensie die 30 meerdere vaste stoffen, bijvoorbeeld ampicilline, D-fenylglycine en geïmmobiliseerd enzym bevat. Het geïmmobiliseerde enzym wordt, vanwege de proceseconomie, bij voorkeur teruggewonnen. Dit kan bijvoorbeeld geschikt worden uitgevoerd door het 35 reactiemengsel roerend te filteren over een zeef, waarbij bij voorkeur de draairichting van de roerder 1066266 - 7 - zodanig wordt gekozen dat de suspensie in het centrum van de roerder omhooggepompt wordt. Vervolgens kunnen waardevolle componenten, bijvoorbeeld AMPI en FG, worden gewonnen; bijvoorbeeld met behulp van pH-shift.

5 De resterende moederloog bevat slechts weinig nevenproducten, en kan desgewenst vervolgens worden gerecirculeerd.

In het kader van deze uitvinding kunnen de verschillende componenten in de vrije vorm of als 10 zouten in het reaktiemengsel aanwezig zijn. Met de genoemde pH-waarde wordt steeds de pH-waarde gemeten met een pH-elektrode geijkt bij kamertemperatuur bedoeld.

De uitvinding zal verder worden toegelicht 15 aan de hand van de voorbeelden, zonder evenwel daartoe te worden beperkt.

Afkortingen: 20 AMPI.3H20 = ampicilline trihydraat 6-APA = 6-aminopenicillinezuur FGA = D-fenylglyc ineamide FG = D—fenylglycine

Assemblase™ is een geïmmobiliseerde Escherichia coli 25 penicilline acylase uit E. coli ATCC 1105, zoals beschreven in WO-A-97/04086. De immobilisatie is uitgevoerd als beschreven in EP-A-222462, waarbij gelatine en chitosan als gellerend agens en glutaaraldehyde als crosslinker zijn gebruikt.

30 De uiteindelijke activiteit van de Escherichia coli penicilline acylase wordt bepaald door de hoeveelheid enzym die aan de geactiveerde bolletjes is toegevoegd en bedroeg 3 ASU/g drooggewicht waarbij 1 ASU (Amoxicilline Synhese Unit) is gedefinieerd als de 35 hoeveelheid enzym die per uur 1 g Amoxiccilline.3H20 genereert uit 6-APA en HPGM (bij 20°C; 6,5% 6-APA en 1006260 - 8 - 6,5% HPGM).

Voorbeeld I

Bereiding van FGA.1/2H2S04 oplossing.

5 301,6 g FGA (2,00 mol) werd gesuspendeerd in 650 g water bij T = 5°C. Onder roeren werd in 1 uur 102,1 g 96% H2S04 (1,00 mol) toegedruppeld, waarbij de temperatuur d.m.v. koelen op T < 25°C werd gehouden.

10 Voorbeeld II

Synthese van Ampicilline

Een enzymreactor (1,5 1, diameter 11 cm), voorzien van een zeef bodem met 175 μτα gaas, werd gevuld met 300 g netto-nat Assemblase™.

15 Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 131,6 g 6-APA (0,600 mol), 30,2 g FGA (0,200 mol) en 400 ml water (T = 10°C). Dit mengsel werd 15 minuten geroerd bij T = 10°C en vervolgens op t = 0 m.b.v. 100 ml water (T = 10°C) in de enzymreactor overgebracht.

20 Op t - 0 werd de roerder in de enzymreactor aangezet. Gedurende 283 minuten werd 423,7 g (0,800 mol) FGA.1/2H2S04 oplossing met constante snelheid toegevoegd, waarbij de temperatuur op 10°C werd gehouden. De pH was ca. 6,3. Vanaf t = 328 minuten werd 25 de pH op 6,3 gehouden d.m.v. titratie met 6N H2S04.

Op t = 540 minuten was de hoeveelheid Ampicilline maximaal en werd de pH verlaagd naar 5,6 d.m.v. toevoegen van 6N H2S04.

De enzymreactor bevatte nu: 30 575 mmol AMPI (=96% t.o.v. de ingezette hoeveelheid 6-APA)

15 mmol 6-APA 50 mmol FGA 365 mmol FG

35 De concentraties tijdens de reactie zijn weergegeven in grafiek 1.

1006266 - 9 -

Vergelijkend Experiment A Synthese van Ampicilline

Een enzymreactor (1,5 1, diameter 11 cm), voorzien van een zeef bodem met 175 μπι gaas, werd gevuld 5 met 300 g netto-nat Assemblase™.

Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 143,2 g (0,950 mol) FGA in 500 ml water bij 10°C. Bij 10°C werd onder koelen in 15 minuten 131,6 g 6-APA (0,600 mol) in kleine porties toegevoegd, terwijl de pH op 7,0 werd 10 gehouden d.m.v. titratie met 6N H2S04. In totaal was er 54,5 ml 6N H2S04 nodig. Het mengsel werd 15 minuten geroerd bij T = 10°C en vervolgens op t = 0 m.b.v. 100 ml water (T = 10°C) in de enzymreactor overgebracht.

Op t = 0 werd de roerder in de enzymreactor aangezet.

15 De pH werd op 7,0 gehouden d.m.v. titratie met 6N H2S04. De temperatuur werd op 10°C gehouden. Op t = 160 minuten was de hoeveelheid Ampicilline maximaal en werd de pH verlaagd naar 5,6 d.m.v. 6N H2S04. In totaal was 147,6 ml 6N H2S04 toegevoegd aan de enzymreactor. Het 20 mengsel was relatief visceus en moeilijk roerbaar.

De enzymreactor bevatte nu: 551 mmol AMPI (= 92% t.o.v. de ingezette hoeveelheid 6-APA)

24 mmol 6-APA

25 50 mmol FGA

330 mmol FG

De concentraties tijdens de reactie zijn weergegeven in grafiek 2.

UG 6 2 6 6

Claims (12)

1. Werkwijze voor de bereiding van ampicilline waarbij 6-aminopenicillinezuur (6-APA) wordt 5 onderworpen aan een enzymatische acyleringsreactie met behulp van een fenylglycinederivaat waarbij de totale concentratie van in het reactiemengsel aanwezige 6-APA plus ampicilline groter is dan 250 mM, de concentratie 6-APA in oplossing lager dan 10 300 mM wordt gehouden en de toegepaste molaire verhouding acyleringsmiddel tot 6-APA kleiner is dan 2,5.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de concentratie van in het reactiemengsel aanwezige 15 6-APA plus ampicilline groter is dan 300 mM.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarin de concentratie van 6-APA in oplossing lager wordt gehouden dan 250 mM.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, waarin 20 de molaire verhouding totaal toegepast acyleringsmiddel tot 6-APA kleiner is dan 2,0.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat het 6-APA gedeeltelijk wordt gedoseerd in de loop van de enzymatische 25 acyleringsreactie.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat het fenylglycinederivaat gedeeltelijk in de loop van de enzymatische acyleringsreactie wordt gedoseerd.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het fenylglycinederivaat wordt gedoseerd als een zout van D-fenylglycineamide en een zuur.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het fenylglycinederivaat wordt gedoseerd in de 35 vorm van een oplossing van D-fenylglycineami de. 1/2H2S04 in water. 1006266 - 11 -

9. Werkwijze volgens een der conclusies 6-8, met het kenmerk, dat de dosering wordt geregeld middels pH-meting.

10. Werkwijze volgens een der conclusies 1-9, met het 5 kenmerk, dat de pH van het reactiemengsel wordt verlaagd zodra nagenoeg de maximale conversie is bereikt.

11. Werkwijze volgens een der conclusies 1-10, met het kenmerk, dat de temperatuur van het reactiemengsel 10 wordt verlaagd zodra nagenoeg de maximale conversie is bereikt.

12. Werkwijze voor de bereiding van ampicilline zoals beschreven en toegelicht aan de hand van de voorbeelden. 1006266