MXPA99011320A - Metodos para tratar la obesidad - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para tratar la obesidad, los cuales comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una amilina o un agonista de amilina solos o en conjunto con otro agente para el alivio de la obesidad;se describen además métodos para reducir el aumento de peso inducido por insulina, los cuales comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una amilina o un agonista de amilina.

Description

MÉTODOS PARA TRATAR LA OBESIDAD Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente estadounidense No. de serie 08/870,762, presentada el 6 de junio de 1997, cuyos contenidos quedan incorporados aquí mediante esta referencia, en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para tratar la obesidad. Más en lo particular, ia invención se refiere al uso de una amilina o un agonista de amilina para tratar la obesidad.

ANTECEDENTES LA AMILINA Se había resumido previamente la estructura y la biología de la amilina. Véase, por ejemplo, Rink y coautores, Trends in Pharmaceutical Sciences, 14:113-118 (1993); Gaeta y Rink, ed. Chem. Res., 3:483-490 (1994); y Pittner y coautores, J. Cell. Biochem., 55S:19-28 (1994). La amilina es una hormona proteínica de 37 aminoácidos. Fue aislada, purificada y caracterizada químicamente como el principal componente de depósitos amiloides en las isletas del páncreas de diabéticos de tipo 2 humanos, fallecidos (Cooper y coautores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84:8628-8632 (1987)). La molécula de amilina tiene dos modificaciones post-translacionales importantes: el extremo C está amidado (o sea, el 37o residuo de aminoácido es tirosinamida) y las cisteínas en las posiciones 2 y 7 están entrelazadas para formar un rizo N-terminal (mediante un residuo cistina). La secuencia del marco de lectura abierta del gene de amilina humano muestra la presencia de la señal de división proteolítica del aminoácido dibásico Lys-Arg, antes del codón N-terminal para Lys, y la Gly, antes de la señal proteolítica Lys-Arg, en la posición C-terminal, una secuencia típica para amidación por enzima amidante de proteína PAM (Cooper y coautores, Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258 (1989)). La amilina está descrita y reivindicada en la patente estadounidense No. 5,367,052, expedida el 22 de noviembre de 1994. En la diabetes de tipo 1 se ha demostrado que la amilina es deficiente y se ha propuesto reemplazo combinado con insulina, como tratamiento preferido respecto a la insulina sola, en todas las formas de diabetes. El uso de amilina y otros agonistas de amilina, para el tratamiento de la diabetes mellitus es el objeto de la patente estadounidense No. 5,175,145, expedida el 29 de diciembre de 1992. Las composiciones farmacéuticas que contienen amilina y amilina más insulina están descritas y reclamadas en la patente estadounidense No. 5,124,314, expedida el 23 de junio de 1992.

Se ha dicho que la acción del exceso de amilina imita los aspectos claves de la diabetes de tipo 2, y se ha propuesto el bloqueo de amilina como una estrategia terapéutica novedosa. Se ha descrito en la patente estadounidense No. 5,266,561 , expedida el 30 de noviembre de 1993, que la amilina provoca reducción en la incorporación basal, y estimulada por insulina, de la glucosa marcada en el glicógeno del músculo esqueletal. También se describió que este último efecto era compartido por el péptido relacionado con el gene de calcitonina (CGRP, acrónimo por su designación en inglés: Calcitonin Gene Related Peptide) (véase también Leighton y Cooper, Nature, 335:632-635 (1988)). También se informa que la amilina reduce la absorción de glucosa, estimulada por la insulina, en el músculo esqueletal y que reduce el contenido de glicógeno (Young y coautores, Amer. J. Physiol., 259:45746-1 (1990)). Se describe el tratamiento de diabetes del tipo 2 y la resistencia a la insulina, con antagonistas de amilina. La secuencia de la amilina tiene una homología aproximada de 50% con los CGRP; también con las proteínas de 37 aminoácidos que son neurotransmisores de amplia difusión, con muchas acciones biológicas potentes, incluyendo vasodilatación. La amilina y los CGRP comparten el puente de disulfuro 2Cys-7Cys y un residuo amida de aminoácido C-terminal, siendo ambos esenciales para la plena actividad biológica (Cooper y coautores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 857763-7766 (1988)). Se informa que la amilina puede ser un miembro de una familia de péptidos relacionados que incluye CGRP, insulina, factores de crecimiento parecidos a insulina, y las relaxinas, y que comparten una herencia genética común (Cooper y coautores, Prog. Growth Factor Research, 1 :99-105 (1989)). La amiiina es sintetizada primariamente en las células pancreáticas beta y es secretada en respuesta a estímulos nutrientes, como la glucosa y la arginina. Los estudios con líneas de tumores en células beta, clonadas (Moore y coautores, Biochem. Biophys. Res. Commun., 179(1 ) (1991 )), han demostrado que los secretagogos de nutrientes, como glucosa y arginina, estimulan la liberación de amilina, así como de insulina. La razón molar de amilina:insulina de las proteínas secretadas varía entre preparaciones desde alrededor de 0.01 a 0.4, pero no parece variar mucho con estímulos agudos en ninguna preparación. Sin embargo, durante el estímulo prolongado por elevada cantidad de glucosa, la razón amilina: insulina puede aumentar progresivamente (Gedulin y coautores, Biochem. Biophys. Res. Commun., 180(1 ):782-789 (1991)). Así pues, la amilina y la insulina no siempre son secretadas en una razón constante. Se ha descubierto y se ha informado que ciertas acciones de la amilina son similares a algunas acciones no metabólicas de CGRP y calcitonina; sin embargo, las acciones metabólicas de la amilina, descubiertas durante las investigaciones de esta proteína recién identificada, parecen reflejar su papel biológico primario. Por lo menos algunas de estas acciones metabólicas son imitadas por CGRP; sin embargo, a dosis que son notablemente vasodilatadoras (véase, por ejemplo, Leighton y coautores, Nature, 335:632-635 (1988)); Molina y coautores, Diabetes, 39:260-265 (1990)). La primera acción descubierta de la amilina fue la reducción de la incorporación de glucosa a glicógeno, estimulada por la insulina, en el músculo esqueletal de ratas (Leighton y coautores, Nature, 335:632-635 (1988)); el músculo se hizo "resistente a la insulina". Un trabajo subsecuente con el músculo soleus de rata ex vivo e in vitro ha indicado que la amilina reduce ia actividad de sintasa del glicógeno, promueve la conversión de glicógeno-fosforilasa de la forma inactiva "b" a la forma activa "a", promueve la pérdida neta de glicógeno (en presencia o ausencia de insulina), aumenta los niveles de 6-fosfato de glucosa y puede aumentar la salida de lactato (véase, por ejemplo, Deems y coautores, Biochem. Biophys. Res. Co/77m?<77.,181 (1):116-120 (1991 )); Young y coautores, FEBS Letts., 281(1 ,2):149-151 (1991)). Parece que la amilina no afecta el transporte de glucosa per se ( por ejemplo, Pittner y coautores, FEBS. Letts., 365(1 ):98-100 (1995)). Los estudios de las relaciones de respuesta a la dosis de amilina e insulina muestran que la amílina actúa como un antagonista no competitivo o funcional de la insulina en el músculo esqueletal (Young y coautores, Am. J. Physiol., 263(2): E274-E281 (1992)). No hay evidencia de que la amilina interfiera con la unión de insulina a sus receptores, o con la activación subsecuente de la tirosinacinasa receptora de insulina (Follett y coautores, Clinical Research, 39(1): 39A (1991 )); Koopmans y coautores, Diabetologia, 34:218-224 (1991 )).

Se cree que la amilina actúa por medio de los receptores presentes en las membranas del plasma. Los estudios de amilina y CGRP y el efecto de antagonistas selectivos, sugieren que la amilina actúa por medio de su propio receptor (Beaumont y coautores, Br. J. Pharmacol., 115(5):713-715 (1995); Wang y coautores, FEBS Letts., 219:195-198 (1991 b)), contra la conclusión de otros investigadores de que la amilina actúa primariamente en los receptores de CGRP (por ejemplo, Chantry y coautores, Biochem. J., 2772:139-143 (1991 )); Galeazaa y coautores, Peptides, 12:585-591 (1991)); Zhu y coautores, Biochem. Biophys. Res. Commun., 177(2):771-776 (1991)). Los receptores de amilina y su uso en métodos para seleccionar y analizar los compuestos agonistas y antagonistas de amilina, están descritos en la patente estadounidense No. 5,264,372, expedida el 23 de noviembre de 1993. Si bien la amilina tiene efectos notables sobre el metabolismo del combustible hepático in vivo, no hay acuerdo general en cuanto a qué acciones de amilina se ven en los hepatocitos aislados o en hígado perfundido. Los datos de que se dispone no apoyan la idea de que la amilina promueva la glicogenólisis hepática, es decir, no actúa como glucagón (por ejemplo, Stephens y coautores, Diabetes, 40:395-400 (1991); Gomez-Foix y coautores, Biochem. J., 276:607-610 (1991)). Se ha sugerido que la amilina puede actuar sobre el hígado para promover la conversión de lactato a glicógeno y para incrementar la cantidad de glucosa capaz de ser liberada por glucagón (véase Roden y coautores, Diabetologia, 35:116-120 (1992)). De esta manera, la amilina podría actuar como un partícipe anabólico de la insulina en el hígado, en contraste con su acción catabólica en el músculo. En células grasas, al contrario de su acción en el músculo, la amilina no tiene acciones detectables sobre la absorción de glucosa, estimulada por insulina, la incorporación de glucosa en los triglicéridos, la producción de CO2 (Cooper y coautores, Proc. Nati. Acad. Sci., 85:7763-7766 (1988)), la lipólisis estimulada por epinefrina, o la inhibición de lipólisis por insulina (Lupien y Young Diabetes Nutrition and Metabolism - Clinical and Experimental, tomo 6(1 ), páginas 1318 (febrero 1993)). De tal manera, la amilina ejerce efectos específicos al tejido, con acción directa sobre el músculo esqueletal, efectos indirectos notables (mediante suministro de substrato) y quizás directos sobre el hígado, al mismo tiempo que los adipocitos parecen "enceguecer" ante la presencia o ausencia de amilina. Se ha informado que la amilina puede tener efectos notables sobre ia secreción de la insulina. Los experimentos en ratas intactas (Young y coautores, Mol. Cell. Endocrinol., 85:R1-R5 (1992)) indican que la amilina inhibe la secreción de insulina. Sin embargo, otros investigadores no han sido capaces de detectar los efectos de la amilina sobre células beta aisladas, sobre isletas aisladas, o en el animal entero (véase Broderick y coautores, Biochem. Biophys. Res. Commun., 177:932-938 (1991 )). La amilina o los agonistas de amilina inhiben de manera potente el vaciado gástrico en ratas (Young y coautores, Diabetologia, 38/6):642-648 (1995)); en perros (Brown y coautores, Diabetes 4 (Suplemento 1 ): 172A (1994); y en humanos (Macdonald y coautores, Diabetologia38 (Suplemento 1 ):A32 (resumen 118) (1995)). Se informa que se acelera el vaciado gástrico en ratas BB diabéticas tipo 1 , deficientes en amilina (Young y coautores, Diabetologia, supra, Nowak y coautores, J. Lab. Clin. Med., 123(1): 110-6 (1994)) y en ratas tratadas con el antagonista de amilina selectivo AC187 (Gedulin y coautores, DiabetologiaZQ (Suplemento 1 ):A244 (1995). Parece que el efecto de la amilina sobre ei vaciado gástrico es fisiológico (operativo a concentraciones a las que circula normalmente). Las acciones no metabólicas de la amiiina incluyen efectos vasodilatadores que pueden ser mediados por interacción con receptores vasculares de CGRP. Se informa de pruebas ¡n vivo que sugieren que la amilina por lo menos es alrededor de 100 a 1000 veces menos potente que CGRP como vasodilatador (Brain y coautores, Eur. J. Pharmacol., 183:2221 (1990); Wang y coautores, FEBS Letts., 291 :195-198 (1991)). El efecto de la amilina sobre las acciones hemodinámicas regionales, incluyendo el flujo sanguíneo renal, en ratas conscientes, ha sido informado (Gardiner y coautores, Diabetes, 40:948-951 (1991)). Los autores hicieron notar que la infusión de amilina de rata estuvo asociada con mayor vasodilatación renal y menos vasoconstricción mesentérica que la que se ve con infusión de alfa-CGRP humano. Concluyeron que al promover la hiperemia renal en mayor medida que alfa-CGRP, la amilina de rata pudo provocar estímulo menos marcado del sistema renina-angiotensina y, de tal manera, menos vasoconstricción secundaria, mediada por angiotensina II. Sin embargo, también se hizo notar que, durante la coinfusión de aifa8" 37CGRP humana y amilina de rata, no se enmascaró las vasoconstricciones renal ni mesentérica, presumiblemente debido a los efectos vasoconstrictores carentes de oposición, de la angiotensina II, y que este descubrimiento es similar al que se ve durante la coinfusión de A-CGRP humano y alfa-8"37CGRP humano (id. en 951 ). También se ha informado que la amilina tiene efectos tanto sobre los osteoclastos aislados, cuando provocó inactividad de células, como in vivo, cuando se informó que bajaba el calcio de plasma hasta en 20% en ratas, en conejos y en humanos, con el mal de Paget (véase, por ejemplo, Zaidi y coautores, Trends in Endrocrinal. and Metab., 4:255-259 (1993)). De los datos disponibles, parece que la amilina es de 10 a 30 veces menos potente que la calcitonina humana, para estas acciones. Es interesante que se informó que la amilina parecía aumentar la producción de cAMP de osteoclasto, pero que no aumentaba el Ca2" citosólico, mientras que la calcitonina provoca ambos resultados (Alam y coautores, Biochem. Biophys. Res. Commun., 179(1 ):134-139 (1991 )). Se sugirió, aunque no se estableció, que la calcitonina puede actuar mediante dos tipos de receptor y que la amilina puede interactuar con uno de ellos. Se ha descubierto también que, sorprendentemente en vista de sus propiedades vasodilatadoras renales y otras, anteriormente descritas, la amilina aumenta notablemente la actividad de resina del plasma en ratas intactas, cuando se administra subcutáneamente de una manera que evite cualquier alteración en la presión sanguínea. Este último punto es importante debido a que la presión sanguínea baja es un estímulo fuerte para la liberación de renina. Los antagonistas de amilina, tales como los antagonistas de receptor de amilina para CGRP y/o los receptores de calcitonina, pueden ser usados para bloquear la elevación de actividad de renina del plasma, evocada por la amilina. El uso de antagonistas de amilina para tratar trastornos relacionados con la renina, está descrito y reivindicado en la patente estadounidense No. 5,376,638, expedida el 27 de diciembre de 1994. En humanos normales, se ha informado de niveles de amilina en ayunas, de 1 a 10 pM y de niveles post-prandiales o post-glucosa, de 5 a 20 pM (por ejemplo, Koda y coautores, The Lancet, 339:1179-1180 (1992)). En individuos obesos, resistentes a la insulina, los niveles de amilina después de los alimentos pueden subir más, alcanzando hasta aproximadamente 50 pM. En comparación, los valores para insulina en ayunas y después de ingerir alimentos (post-prandiales) son de 20 a 50 pM y de 100 a 300 pM, respectivamente, en gente sana, con niveles quizás 3 a 4 veces mayores en gente resistente a la insulina. En la diabetes de tipo 1 , en la que son destruidas las células beta, los niveles de amilina están a, o por debajo de los niveles de detección, y no se elevan en respuesta a la glucosa (Koda y coautores, The Lancet, 339:1179:1180 (1992)). En ratones y ratas normales, se ha informado de niveles de amilina basal de 30 a 100 pM, mientras que se ha medido valores hasta de 600 pM en ciertas cepas diabéticas, resistentes a la insulina, de roedores (por ejemplo, Huang y coautores, Hypertension, 19:1- 101-1-109 (1991 ). Inyectada en el cerebro o administrada periféricamente, se ha informado que la amilina suprime la ingesta de alimento, por ejemplo, Chance y coautores, Brain Res., 607:352-354 (1991 ) y Chance y coautores, Brain Res., 607:185-188 (1993), una acción compartida con CGRP y con la calcitonina. Se desconoce las concentraciones efectivas en células que medían esta acción. El uso de amilina y de agonistas de amilina para el tratamiento de anorexia está descrito y reivindicado en la patente estadounidense No. 5,656,590, expedida el 12 de agosto de 1997. Las composiciones que incluyen un agonista de colecistocinina y un agonista de amilina o una molécula híbrida para uso en reducir la ingesta de alimento o controlar el apetito o el peso del cuerpo, están descritas y reivindicadas en la patente estadounidense No. 5,739,106, expedida el 14 de abril de 1998.

LA OBESIDAD La obesidad es una enfermedad crónica que es sumamente prevalente en la sociedad moderna y está asociada no únicamente con un estigma social, sino también con una esperanza de vida disminuida y numerosos problemas médicos, incluyendo desarrollo psicológico adverso, trastornos reproductores, como enfermedades poliquísticas de los ovarios, trastornos dermatológicos, como infecciones, venas varicosas, Acanthosis nigrícans y eczema; intolerancia al ejercicio, diabetes mellitus, resistencia a la insulina, hipertensión, hipercolesterolemia, colelitiasis, osteoartritis, daños ortopédicos, enfermedades tromboembólicas, cáncer y enfermedades cardiacas coronarias. Rissanen y coautores, British Medical Journal, 301:835-837 (1990). La obesidad, y especialmente la obesidad de la parte superior del cuerpo, es un problema de salud pública muy serio en los Estados Unidos y en todo el mundo. De acuerdo con estadísticas recientes, más del 25 por ciento de la población estadounidense y el 27 por ciento de la población canadiense tienen sobrepeso. Kuczmarski, Amer. J. of Clin. Nut., 55:495S-502S (1992); Reeder y coautores, Can. Med. Ass. J., 23:226-233 (1992). La obesidad del cuerpo es el factor de riesgo más fuerte conocido para la diabetes mellitus de tipo II, y es un fuerte factor de riesgo para enfermedades cardiovasculares y cáncer también. Estimaciones recientes del costo médico de la obesidad arrojan un resultado de 150 mil millones de dólares en todo el mundo. El problema se ha vuelto tan serio que el Ministro de Sanidad ha tomado la iniciativa de combatir la adiposidad cada vez mayor, que priva en la sociedad estadounidense. Mucha de esa patología inducida por la obesidad puede ser atribuida a una fuerte asociación con dislipidemia, hipertensión y resistencia a la insulina. Muchos estudios han demostrado que la reducción de la obesidad por medio de dieta y ejercicio reduce dramáticamente esos factores de riesgo. Desafortunadamente esos tratamientos son en gran medida insatisfactorios con una tasa de fallas que llega al 95%. Esa falla puede deberse al hecho de que la condición está fuertemente asociada con factores genéticamente heredados, que contribuyen a un apetito incrementado, la preferencia por alimentos con muchas calorías, la actividad física reducida y el metabolismo lipógeno incrementado. Esto indica que la tente que hereda estas tendencias genéticas son susceptibles de volverse obesas, independientemente de sus esfuerzos por combatir la condición. Por consiguiente, es necesario un nuevo agente farmacológico que pueda corregir esta desventaja de adiposidad y permita que el médico trate exitosamente a pacientes obesos, pese a su herencia genética. Las terapias existentes para la obesidad incluyen dietas y ejercicios normales, dietas muy bajas en calorías, terapia conductal, farmacoterapia que implica supresores del apetito, fármacos termógenos, inhibidores de la absorción de alimentos, dispositivos mecánicos, como frenos mandibulares, cordones formadores de cintura y globos, así como cirugía. Jung y Chong, Clinical Endocrinology, 35:11-20 (1991 ); Bray, Am. J. Clin. Nutr., 55:538S-544S (1992). Se ha informado que el ayuno modificado con proteína adicional es efectivo para reducir peso en adolescentes. Lee y coautores, Clin. Pediatr., 31 : 234-236 (abril de 1991). La restricción calórica como tratamiento para la obesidad provoca catabolismo del almacenamiento proteínico del cuerpo y produce un equilibrio negativo del nitrógeno. Por consiguiente, las dietas complementadas con proteínas han alcanzado popularidad como un medio para disminuir la pérdida de nitrógeno durante la restricción de calorías. Debido a que esas dietas producen únicamente modesto consumo de nitrógeno, es necesaria una manera más efectiva de mantener la masa magra de cuerpo y ei almacenamiento de proteína.

Adicionalmente, el tratamiento de la obesidad mejoraría si dicho régimen también diera por resultado la pérdida acelerada de la grasa del cuerpo. Diversas técnicas para dicho tratamiento incluyen las discutidas por Weintraub y Bray, Med. Clinics N. Amer., 73:237 (1989); Bray, Nutrition Reviews, 49:33 (1991 ). Considerando la elevada prevalencia de la obesidad en la sociedad actual y las serias consecuencias asociadas con ella, que se discuten arriba, cualquier fármaco terapéutico potencialmente útil para reducir el peso de las personas obesas podría tener un efecto benéfico profundo sobre su salud. Hay necesidad de un fármaco que reduzca el peso total del cuerpo de los sujetos obesos hasta su peso de cuerpo ideal y ayude a mantener el nivel de peso reducido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto ahora, sorprendentemente, que la amilina y los agonistas de amilina, por ejemplo, el análogo de agonista de amilina 25,28,29pro_n amj|¡na (también denominado "pramlintide" y conocido anteriormente como "AC-'137") pueden ser usados para tratar la obesidad en humanos.

La presente invención está dirigida a métodos novedosos para tratar o prevenir la obesidad en humanos, que comprende administrar una amilina o un agonista de amilina, por ejemplo, el análogo de agonista de amilina 25,28'29Pro-h-amilina. La amilina o el agonista de amilina pueden ser administrados solos o junto con otro agente para aliviar la obesidad. En un aspecto, la invención está dirigida a un método para tratar la obesidad en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una amilina, o dicho agonista de amilina. Por "tratar" se quiere decir el manejo y cuidado de un paciente con el propósito de combatir la enfermedad, la condición o el trastorno, e incluye la administración de una amilina o un agonista de amilina para prevenir la aparición de síntomas o complicaciones, el alivio de síntomas o complicaciones, o la eliminación de la condición de enfermedad o el trastorno. Tratar la obesidad, por lo tanto, incluye la inhibición del aumento de peso y la inducción de pérdida de peso en pacientes que tengan necesidad de ello. Adicionalmente, tratar ia obesidad quiere decir incluir control de peso para fines cosméticos en humanos, es decir, controlar el peso del cuerpo para mejorar la apariencia física. Se entiende que el término "amilina" incluye compuestos como los definidos en la patente estadounidense No. 5,234,906, expedida el 10 de agosto de 1993, para "Composiciones hiperglicémicas", cuyo contenido queda incorporado aquí mediante esta referencia. Por ejemplo, incluye la hormona de péptido humano denominada amilina y secretada por las células beta del páncreas, y variaciones de especie de la misma. "Agonista de amilina" es también un término conocido en la técnica, y se refiere a un compuesto que duplica o imita los efectos de la amilina. Un agonista de amilina puede ser un péptido o un compuesto no peptídico, e incluye análogos agonistas de amilina. El término "análogo de agonista de amilina" se entiende como refiriéndose a derivados de una amilina que se cree actualmente que actúan como agonistas de amilina, normalmente, en virtud de la unión a, o la interacción de otra manera, sea directa o indirecta con un receptor de amilina u otro u otros receptores, con los que la propia amilina puede interactuar para provocar una respuesta biológica. Los análogos agonistas de amilina, útiles, incluyen los identificados en una solicitud de patente internacional WPI No. de acceso 93-182488/22, titulada "Nuevos péptidos agonistas de amilina, usados para tratar y prevenir la hipoglicemia y la diabetes mellitus", cuyo contenido queda incorporado también en la presente, mediante esta referencia. En una modalidad preferida, el agonista de amilina es un análogo de agonista de amilina, de preferencia 25,28,29Pro-h-amilina. 25'2829pro-h-amilinay otros análogos agonistas de amilina están descritos y reivindicados en la patente estadounidense No. 5,686,411 , expedida el 11 de noviembre de 1997, cuyos contenidos también quedan incorporados aquí mediante esta referencia. En otro aspecto, la presente invención está dirigida a métodos novedosos para reducir el aumento de peso inducido por insulina en sujetos humanos que están tomando insulina, administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de una amilina o de un agonista de amilina. En una modalidad, el sujeto tiene diabetes mellitus, por ejemplo, diabetes mellitus de tipo 1 o de tipo 2. En una modalidad preferida, el agonista de amilina es ,28,29pro_h_am¡|¡na_ DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El estudio descrito en el ejemplo 1 mostró que la administración del agonista de amilina 25,28,29Pro-h-amilina (pramlintide) a diabéticos que usan insulina (tipo 2) dio por resultado una disminución en el peso del cuerpo después de 4 semanas, que alcanzó significación estadística dentro de dos grupos de dosis: 60 µg TID y 60 µg QID. El estudio descrito en el ejemplo 2 mostró que la administración de pramlintide (30 µg o 60 µg QID) a diabéticos de tipo 1 , dio por resultado una disminución estadísticamente significativa en el peso del cuerpo, en comparación con un placebo, a las 13, 26 y 52 semanas. El estudio descrito en el ejemplo 3 mostró que la administración de pramlintide (30, 75 o 150 µg TID) a pacientes con diabetes de tipo 2, que requieren de insulina, dio por resultado una disminución estadísticamente importante en el peso del cuerpo, en comparación con el placebo a las 13, 26 y 52 semanas. Estos resultados están en contraste total con el tratamiento con insulina sola en pacientes con diabetes de tipo 1 o de tipo 2, que habitualmente está asociada con aumento de peso.

Los análogos agonistas de amilina, útiles en esta invención, incluyen los análogos agonistas de amilina descritos y reivindicados en la patente estadounidense anteriormente anotada No. 5,686,411. Los agonistas de amiiina incluyen los análogos agonistas de amilina, como siguen: 1.- Un análogo agonista de amilina que tiene la secuencia de aminoácidos: ^ArX-Asn-Thr^Ala-Thr-Y-Ala-Thr-^GIn-Arg-Leu-B Asn- 15Phe-Leu-CrD Ei-^FrG Asn-H GIy-^Pro- -Leu-Pro-Jr^Thr-K Val-Gly-Ser-35Asn-Thr-Tyr-Z; en la cual: Ai es Lys, Ala, Ser o hidrógeno; Bi es Ala, Ser o Thr; C -i es Val, Leu o lie; D -i es His o Arg; Ei es Ser o Thr; F^ es Ser, Thr, Gln o Asn; G 1 es Asn, Gln o His; H 1 es Phe, Leu o Tyr; 11 es lie, Val, Ala o Leu; J 1 es Ser, Pro o Thr; X e Y son residuos seleccionados independientemente que tienen cadenas laterales que están unidas químicamente entre sí para formar un enlace intramolecular, donde el enlace intramolecular comprende una ligadura disulfuro, un enlace lactama o un enlace tioéter; y Z es amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y a condición de que, cuando Ai es Lys, B-? es Ala, Ci es Val, D-i es Arg, Ei es Ser, F-? es Ser, Gi es Asn, Hi es Leu, es Val, J-i es Pro y Ki es Asn, entonces uno o más de Ai a Ki es un D-aminoácido y Z está seleccionado del grupo que consiste de alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi. 2.- Un análogo agonista de amilina que tiene la secuencia de aminoácidos: 1A?-X-Asn-Thr-5Ala-Thr-Y-Ala-Thr-10Gln-Arg-Leu-B Asn- 5Phe-Leu-d-DrEr^FrGrAsn-HrGIy-^Pro- -Leu-JrPro-^Thr-KrVal-Gly-Ser-35Asn-Thr-Tyr-Z; en la que: Ai es Lys, Ala, Ser o hidrógeno; Bi es Ala, Ser o Thr; Ci es Val, Leu o lie; Di es His o Arg; E 1 es Ser o Thr; Fi es Ser, Thr, Gln o Asn; G 1 es Asn, Gln o His Hi es Phe, Leu o Tyr; l-i es lie, Val, Ala o Leu; J -i es Ser, Pro, Leu, lie o Thr; Ki es Asn, Asp o Gln; X e Y son residuos seleccionados independientemente que tienen cadenas laterales que están unidas químicamente entre sí para formar un enlace intramolecular; donde dicho enlace intramolecular comprende una ligadura disulfuro, un enlace lactama o tioéter; y Z es amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y a condición de que cuando: (a). Ai es Lys, B-? es Ala, Ci es Val, Di es Arg, Ei es Ser, Fi es Ser, Gi es Asn, Hi es Leu, li es Val, J 1 es Pro y Ki es Asn; o (b). Ai es Lys, Bi es Ala, Ci es Val, D-i es His, Ei es Ser, F-? es Asn, G 1 es Asn, Hi es Leu, li es Val, Ji es Ser y Ki es Asn; entonces uno o más de Ai a Ki es un D-aminoácido y Z está seleccionado del grupo que consiste de alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi. 3.- Un análogo agonista de amilina que tiene la secuencia de aminoácidos: 1A?-X-Asn-Thr-5Ala-Thr-Y-Ala-Thr-10Gln-Arg-Leu-B?-Asn-15Phe-Leu-d-Di-Er^Fi-G Asn-HrGIy-^lrJrLeu-Pro-Pro-^Thr-KrVal-GIy-Ser-35Asn-Thr-Tyr-Z; en la que: Ai es Lys, Ala, Ser o hidrógeno; Bi es Ala, Sero Thr; Ci es Val, Leu o lie; Di es His o Arg; Ei es Ser o Thr; Fi es Ser, Thr, Gln o Asn; Gi es Asn, Gln o His; Ji es lie, Val, Ala o Leu; Ki es Asn, Asp o Gln; X e Y son residuos seleccionados independientemente que tienen cadenas laterales que están unidas químicamente entre sí para formar un enlace intramolecular; donde el enlace intramolecular comprende una ligadura disulfuro, una ligadura lactama o tioéter; y Z es amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquiiamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y a condición de que cuando Ai es Lys, Bi es Ala, Ci es Val, Di es Arg, Ei es Ser, Fi es Ser, d es Asn, Hi es Leu, li es Pro, Ji es Val y Ki es Asn; entonces uno o más de Ai a Ki es un D-aminoácido y Z está seleccionado del grupo que consiste de alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, ariiamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi. 4.- Un análogo agonista de amilina que tiene la secuencia de aminoácidos: 1Ai-X-Asn-Thr-5Ala-Thr-Y-Ala-Thr-10Gln-Arg-Leu-B?-Asn-15Phe- Ñeu-C?-D?-E?-20F?-G?-Asn-H?-Gly-25Pro-l?-Leu-Pro-Pro-30Thr-J?-Val-Gly-Ser-35Asn-Thr-Tyr-Z; en la que: Ai es Lys, Ala, Ser o hidrógeno; Bi es Ala, Ser o Thr; Ci es Val, Leu o He; Di es His o Arg; Ei es Ser o Thr; Gi es Asn, Gln o His; Hi es Phe, Leu o Tyr; h es lie, Val, Ala o Leu; Ji es Asn, Asp o Gln; X e Y son residuos seleccionados independientemente, que tienen cadenas laterales que están unidas químicamente entre sí para formar un enlace intramolecular; en donde dicho enlace intramolecular comprende una ligadura disulfuro, un enlace lactama o tioéter; y Z es amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y a condición de que cuando Ai es Lys, Bi es Ala, Ci es Val, Di es Arg, Ei es Ser, Fi es Ser, Gi es Asn, Hi es Leu, h es Val y Ji es Asn; entonces uno o más de Ai a Ki es un D-aminoácido y Z está seleccionado del grupo que consiste de alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi. Los análogos agonistas de amilina preferidos incluyen 25,28,29Pro-h-amilina, 18Arg25'28'29Pro-h-amilina y 18Arg25-28Pro-h-amiiina. La actividad como agonistas de amilina puede ser confirmada y cuantificada efectuando diversos análisis de selección, incluyendo el análisis de unión al receptor del núcleo acumbente, descrito más adelante en el ejemplo 7, seguido por ei análisis del músculo soleus descrito más adelante en el ejemplo 8; un análisis de vaciado gástrico descrito más adelante en el ejemplo 9 o 10, o mediante la capacidad de inducir hipocalcemia o reducir la hiperglicemia postprandial en mamíferos, tal como se describe en la presente. El análisis de unión al receptor, un análisis de competencia, que mide la capacidad de los compuestos para unirse a receptores de amilina unidos a la membrana, está descrito y reivindicado en la patente estadounidense No. 5,264,372, expedida el 23 de noviembre de 1993, cuya descripción queda incorporada aquí mediante esta referencia. El análisis de unión al receptor también está descrito en el ejemplo 7 que viene después. Una fuente preferida de las preparaciones de membrana usadas en el análisis es el antecerebro basal, que comprende membranas del núcleo acumbente y de las regiones circundantes. Los compuestos que se someten a análisis compiten por la unión a esas preparaciones receptoras, con la 125l-amilina de rata Bolton-Hunter. Se analiza por medio de computadora las curvas de competición, en las que está graficada la cantidad de unión (B) como una función del logaritmo de la concentración de ligando; usando análisis de regresión no lineal a una ecuación logística de 4 parámetros (programa Inplot; GraphPAD Software, San Diego, CA, E. U. A), o el programa ALLFIT de DeLean y coautores (ALLFIT, versión 2.7 (NIH, Bethesda MD 20892)). Munson y Rodbard, Anal. Biochem., 107:220-239 (1980).

Los análisis de la actividad biológica de los agonistas de amilina en el músculo soleus pueden ser efectuados usando los métodos descritos previamente (Leighton, B y Cooper, Nature, 335:632-635 (1988); Cooper y coautores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85:7763-7766 (1988); en los que se puede determinar la actividad agonista de amilina, midiendo la inhibición de la síntesis de glicógeno estimulada por insulina. También está descrito el análisis del músculo soleus en el ejemplo 8 que viene después. Los métodos para medir el régimen de vaciado gástrico están descritos, por ejemplo, en Young y coautores, Diabetologia, 38(6):642-648 (1995). En un método al rojo fenol, que está descrito en el ejemplo 9 que viene después, ratas conscientes reciben mediante la alimentación un gel acolórico que contiene metilcelulosa y un indicador rojo fenol. Veinte minutos después de la administración, se anestesia los animales usando halothane; se expone el estómago y se pinza en los esfínteres pilórico y esofágico inferior; se retira y se abre hacia una solución alcalina. Se puede derivar el contenido estomacal de la intensidad del rojo fenol presente en la solución alcalina, se lo mide por absorbencia a la longitud de onda de 560 nm. En un método de glucosa tritiada, que está descrito en el ejemplo 10 que viene después, se alimenta ratas conscientes con glucosa tritiada en agua. Se restringe suavemente las ratas por la cola, cuya punta se anestesia usando lidocaína. Se recoge el tritio del plasma separado de la sangre caudal, en diversos puntos del tiempo y se detecta en un contador beta. Normalmente se administra compuestos de prueba aproximadamente un minuto antes de la administración. Los efectos de las amilinas o los agonistas de amilina sobre el peso del cuerpo pueden ser identificados, evaluados o seleccionados para usar los métodos descritos en los ejemplos 1-3 que vienen después, u otros métodos conocidos en la técnica o equivalentes, para determinar los efectos sobre el peso del cuerpo. Los compuestos agonistas de amilina preferidos exhiben actividad en el análisis de unión al receptor, del orden de menos de alrededor de 1 a 5 nM, de preferencia, menos de alrededor de 1 nM y, más preferible, menos de alrededor de 50 pM. En el análisis del músculo soleus, los compuestos agonistas de amilina preferidos muestran valores de CE50 del orden de menos de alrededor de 1 a 10 micromolar. En los análisis de vaciado gástrico, los compuestos agonistas preferidos muestran valores DE50 del orden de menos de 100 µg/rata. Se puede preparar la amilina y los agonistas peptídicos de amilina usando técnicas de síntesis de péptido en fase sólida, comunes y corrientes, y de preferencia un sintetizador de péptido automático o semiautomático. Típicamente, mediante el uso de esas técnicas, se acopla un aminoácido protegido con alfa-N-carbamoílo, y un aminoácido unido a la cadena de péptido que crece, en una resina, a la temperatura ambiente, en un solvente inerte tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidinona o cloruro de metileno, en presencia de agentes de acoplamiento, tales como diciciohexilcarbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol, en presencia de una base como diisopropiietiiamina. Se separa el grupo protector aifa-2N-carbamoílo dei péptido-resina resultante, utilizando un reactivo tal como ácido trifluoroacético o piperidina, y se repite la reacción de acoplamiento con el siguiente aminoácido N-protegido, deseado, que se va a añadir a la cadena de péptido. Los grupos N-protectores adecuados son bien conocidos en la técnica, prefiriéndose en la presente el terbutoxicarbonilo (tBoc) y el fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Se puede adquirir los solventes, los derivados de aminoácido y la resina 4-metilbenzhidrilamina, usados en el sintetizador de péptido, de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA, E. U. A.). Se puede adquirir los siguientes aminoácidos con cadena lateral protegida, de Applied Biosystems, Inc.: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg(Pmc), Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bz1 ), Fmoc-Serít-Bu), Boc-Tyr(BrZ), Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(CI-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Asn(Trt), y Fmoc-G?n(Trt). Se puede adquirir Boc-His(BOM) de Applied Biosystems, Inc. o de Bachem Inc. (Torrance, CA, E. U. A.). Se puede obtener anisol, sulfuro de metilo, fenol, etanoditiol y tioanisol de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wl, E. U. A.); Air Products and Chemicals (Allentown, PA, E. U. A.) proveen HF. Se puede comprar éter etílico, ácido acético y metanol de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Se puede llevar a cabo la síntesis de péptido en fase sólida con un sintetizador automático de péptido (Modelo 430A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, E. U. A.), usando el sistema NMP/HOBt (opción 1) y química de Tboc o Fmoc (véase el Manual de Usuario de Applied Biosystems para el sintetizador de péptido ABI 430A, versión 1.3B, 1 de julio de 1988, sección 6, páginas 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, E. U. A.), con tapa.

Se puede dividir las resinas Boc-péptido con HF (-5°C a 0°C, una hora). Se puede extraer el péptido de la resina alternando agua y ácido acético, y se liofiliza los filtrados. Se puede dividir las resinas Fmoc-péptido de acuerdo con métodos comunes y corrientes (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, páginas 6-12). Se puede ensamblar también los péptidos usando un sintetizador Advanced Chem Tech (modelo MPS 350, Louisville, KY, E. U. A.). Se puede purificar los péptidos mediante RP-HPLC (preparatoria y analítica) utilizando el sistema Waters Delta Prep 3000. Se puede usar una columna preparatoria de C4, C8 o C18 (10 µ, 2.2 x 25 cm; Vydac, Hesperia, CA, E. U. A.), para aislar los péptidos; y se puede determinar la pureza usando una columna analítica de C4, C8 o C18 (5 µ, 0.46 x 25 cm; Vydac). Se puede suministrar los solventes (A = 0.1% de TFA/agua y B = 0.1% de TFA/CH3CN) a la columna analítica, a un caudal de 1.0 ml/min y a la columna preparatoria a 15 ml/min. Se puede efectuar los análisis de aminoácidos en el sistema Waters Pico Tag, y se puede procesar usando el programa Máxima. Se puede hidrolizar los péptidos mediante hidrólisis con ácido en fase vapor (115°C, 20-24 horas). Se puede formar derivados de los hidrolizados y se los puede analizar mediante métodos comunes y corrientes (Cohén y coautores, The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, páginas 11-52, Millipore Corporation, Milford, MA (1989)). Se puede llevar a cabo análisis mediante bombardeo con átomos rápidos, por M-Scan, Incorporated (West Chester, PA, E. U. A.). Se puede efectuar la calibración de masa usando yoduro de cesio o yoduro de cesio/glicerol. Se puede llevar a cabo el análisis de ionización por desabsorción de plasma, utilizando un tiempo de detección de vuelo, en un espectrómetro de masa Applied Biosystems Bio-lon 20. Los compuestos peptídicos útiles en la invención también pueden ser preparados usando técnicas de ADN recombinante, usando métodos conocidos ahora en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y coautores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor (1989). Se puede preparar compuestos no peptídicos, útiles en la presente invención, mediante métodos conocidos en la técnica. Los compuestos a los que se hace referencia arriba pueden formar sales con diversos ácidos y bases inorgánicos y orgánicos. Esas sales incluyen las sales preparadas con ácidos orgánicos e inorgánicos, por ejemplo, HCl, HBr, H2SO4, H3PO4, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, ácido metansulfónico, ácido toluensulfónico, ácido maleico, ácido fumárico y ácido alcanforsulfónico. Las sales preparadas con bases incluyen: sales de amonio, sales de metal alcalino, por ejemplo, sales de sodio y de potasio y sales alcalino-térreas, por ejemplo, sales de calcio y de magnesio. Se prefiere las sales acetato, clorhidrato y trifluoroacetato. Se prefiere las sales acetato sobre las demás. Se puede formar las sales por medios convencionales, por ejemplo, haciendo reaccionar el ácido libre o la forma de base del producto con uno o más equivalentes de la base o del ácido apropiados en un solvente o en un medio en el que sea insoluble la sal, o en un solvente tal como agua, que se elimina luego al vacío o mediante secado por congelación, o cambiando los iones de una sal existente por otro ¡on, en una resina de cambio de iones adecuada. Las composiciones útiles en la invención pueden ser provistas convenientemente en la forma de formulaciones adecuadas para administración parenteral (que incluye intravenosa, intramuscular y subcutánea) o nasal u oral. El formato de administración adecuado puede ser determinado mejor por un médico practicante, individualmente para cada paciente. Los portadores farmacéuticamente aceptables, adecuados, y su formulación, están descritos en los tratados comunes y corrientes de formulación, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin. Véase también Wang, Y. J. y Hanson, M. A., Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology, informe técnico No. 10, suplemento 42:2S (1988). Se puede suspender, por ejemplo, los compuestos provistos como composiciones parenterales para inyección o para infusión, en un aceite inerte, adecuadamente un aceite vegetal, tal como aceite de ajonjolí, de cacahuate, de oliva) u otro portador aceptable. Se prefiere suspenderlos en un portador acuoso, por ejemplo, en una solución reguladora isotónica, a un pH aproximado de 5.6 a 7.4. Se puede esterilizar estas composiciones mediante técnicas de esterilización convencionales, o pueden ser filtradas para esterilizarlas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, que sean necesarias para aproximarse a condiciones fisiológicas, tales como agentes reguladores de pH. Los reguladores útiles incluyen, por ejemplo, los reguladores de acetato de sodio/ácido acético. Una forma de preparación de acumulación o "depósito" de liberación lenta puede ser usada, de manera que se suministra al torrente sanguíneo cantidades terapéuticamente efectivas de la preparación, durante muchas horas o días después de la inyección transdérmica o del suministro. Se prefiere que estas formas de dosis parenteral sean preparadas de acuerdo con la solicitud de patente de la misma causahabiente, titulada "Formulaciones líquidas parenterales para Péptidos agonistas de amilina", No. de serie 60/035,140, presentada el 8 de enero de 1997, y en la solicitud de patente estadounidense No. 09/005,262, presentada el 8 de enero de 1998, la cual queda incorporada aquí mediante esta referencia; e incluyen aproximadamente 0.01 a 0.5% (en peso/volumen), respectivamente, de una amilina o un agonista de amilina, en un sistema acuoso junto con aproximadamente 0.02 a 0.5% (en peso/ volumen) de un regulador acetato, fosfato, citrato o glutamato, para obtener un pH de la composición final de aproximadamente 3.0 a 6.0 (más preferible, 3.0 a 5.5), así como aproximadamente 1.0 a 10% (en peso/volumen) de un carbohidrato o un tonificador de alcohol polihídrico, en una fase acuosa continua. También está presente aproximadamente 0.005 a 1.0% (en peso/volumen) de conservador antimicrobiano, seleccionado del grupo que consiste de m-cresol, alcohol bencílico, metil-, etil-, propil- y butil-parabenos, y fenol; en la formulación preferida de producto, destinada a permitir que se administre al paciente dosis múltiples. No es necesario un estabilizador. Se usa una cantidad suficiente de agua para inyección, para obtener la concentración deseada de la solución. También pueden estar presentes cloruro de sodio así como otros excipientes, si se desea. Sin embargo, dichos excipientes deben mantener la estabilidad general de la amilina o del péptido agonista de amilina. Las formulaciones líquidas deben ser sustancialmente isotónicas, es decir, dentro de ±20% de la isotonicidad y, de preferencia, dentro de 10% de la isotonicidad. Es muy preferible que en la formulación de amilina o de agonista de amilina para administración parenteral, el alcohol polihídrico sea mannitol, el regulador sea regulador acetato, el conservador sea aproximadamente 0.1 a 0.3% (en peso/volumen) de m-cresol y el pH sea aproximadamente 3.7 a 4.3. Se puede lograr la isotonicidad deseada usando cloruro de sodio u otras sales farmacéuticamente aceptables. Si se desea, se puede espesar las soluciones de las composiciones anteriores, con un agente espesador, tal como metilcelulosa. Pueden ser preparadas en forma emulsificada, ya sea de agua en aceite o de aceite en agua. Se puede usar cualquiera de una variedad amplia de agentes emulsificantes farmacéuticamente aceptables, incluyendo, por ejemplo: polvo de acacia, un agente tensioactivo no iónico (tal como Tween) o un agente tensioactivo iónico (tal como sulfatos o sulfonatos de alcohol de poliéter alcalino, por ejemplo, un Tritón). Las composiciones útiles en la invención son preparadas mezclando los ingredientes siguiendo procedimientos generalmente aceptados. Por ejemplo, simplemente se puede mezclar los componentes en un mezclador u otro dispositivo común y corriente para producir una mezcla concentrada que se puede ajustar a continuación a la concentración y viscosidad finales añadiendo agua o un agente espesador, y posiblemente un regulador para controlar el pH, o un soluto adicional para controlar la tonicidad. Para uso por el médico, las composiciones serán provistas en forma de dosis unitaria que contiene una cantidad de una amilina o un agonista de amilina, por ejemplo, un compuesto análogo agonista de amilina, que sea efectiva en una o en múltiples dosis, para controlar la obesidad al nivel seleccionado. Las cantidades terapéuticamente efectivas de una amilina o un agonista de amilina, como un análogo agonista de amilina, para uso en el control de la obesidad, son las que disminuyan el peso del cuerpo. Como lo reconocerán los expertos en la materia, una cantidad efectiva de agente terapéutico variará con muchos factores, incluyendo la edad y el peso del paciente, la condición física del paciente, la acción que vaya a obtenerse, y otros factores. Las dosis analgésicas individuales, divididas o continuas de los compuestos, por ejemplo, incluyendo 25,28'29Pro-h-amilina, 18Arg-25,28'29Pro-h- amilina y 19Arg-25,28Pro-h-amilina típicamente estarán en la escala aproximada de 0.01 a 5 mg/día, de preferencia aproximadamente 0.05 a 2 mg/día y, más preferible, aproximadamente 0.1 a 1 mg/día, para un paciente de 70 kg, administradas como una sola dosis, como dosis divididas o como dosis continuas. La dosis exacta que va a ser administrada es determinada por el médico que atiende, y depende de numerosos factores incluyendo los anotados más arriba. Se debe comenzar la administración al primer signo de obesidad. La administración puede efectuarse por inyección o por infusión, de preferencia intravenosa, subcutánea o intramuscular. Se puede tomar oralmente compuestos activos oralmente; sin embargo, se debe incrementar de 5 a 10 veces las dosis. En general, al tratar o prevenir la obesidad, se puede administrar los compuestos de esta invención a pacientes que necesiten de dicho tratamiento en escalas de dosis similares a las dadas aquí anteriormente; sin embargo, se puede administrar los compuestos con mayor frecuencia, por ejemplo, una, dos o tres veces al día, o continuamente. Se prefiere que se administre las dosis de agonistas peptídicos, por ejemplo, pramlintide, subcutáneamente a dosis de 30-300 µg, dadas de una a cuatro veces al día y, más preferible, dosis de 30 a 120 µg, administradas de dos a cuatro veces por día. Para ayudar a entender la presente invención están incluidos los siguientes ejemplos, que describen ios resultados de una serie de experimentos. Los estudios que se refieren a esta invención, por supuesto, no deben ser tomados como limitación específica para la presente invención, y se considera que aquellas variaciones de la invención, conocidas ahora o desarrolladas posteriormente, que estén dentro de lo sabido por los expertos en la materia, caen dentro del alcance de la invención tal como se describe aquí y se reclama posteriormente.

EJEMPLO 1 MEDICIÓN DEL PESO DEL CUERPO: ESTUDIO DE 4 SEMANAS EN DIABÉTICOS DEL TIPO 2, QUE REQUIEREN DE INSULINA Los participantes en el estudio fueron hombre y mujeres de 25 a 78 años de edad, con una historia de diabetes mellitus de tipo II, que requiere tratamiento con insulina durante al menos seis meses antes de la visita de preselección. Los pacientes tenían un peso de cuerpo que no variaba más de 45% del peso deseable antes de admisión al estudio (con base en las tablas de la Metropolitan Life). El estudio empleó métodos descritos en Thompson y coautores, Diabetes 46:632-636 (1997). Después de un periodo conducido con placebo, se distribuyó aleatoriamente los pacientes para que recibieran placebo o uno de tres regímenes de dosis de 25,28'29Pro-h-amilina (pramlintide) durante cuatro semanas: 30 µg QID (antes del desayuno, el almuerzo, la comida y la merienda), 60 µg TID (antes del desayuno, el almuerzo y la comida) o 60 µg QID (antes del desayuno, el almuerzo, la comida y la merienda). Durante todo el periodo con el fármaco de estudio, los pacientes se auto-administraron cuatro inyecciones del fármaco de estudio diariamente, en el término de 15 minutos respecto a cada alimento, y las meriendas por la tarde. Durante el periodo doblemente ciego, se distribuyó a los pacientes aleatoriamente pramlintide, 60 µg o placebo administrado antes de la merienda vespertina. Se administró tanto pramlintide como el placebo como inyecciones separadas en el tejido subcutáneo de la pared abdominal anterior; se alternó el sitio específico después de cada inyección. Se dio instrucciones al paciente de permanecer a su dieta usual, insulina y regímenes de ejercicio durante todo el estudio, a menos que el investigador diera instrucciones en contrario, y que se abstuviesen de bebidas alcohólicas antes de todas las visitas clínicas. Como se muestra en el cuadro I, hubo una reducción de peso estadísticamente significativa de la línea básica de peso, a la semana 4 dentro de los grupos de 60 µg de pramlintide TID (significado = -0.89 kg, p = 0.0056) y 60 µg de pramlintide QID (significado = -0.72 kg, p ) 0.0014). Con el ajuste de Hochberg para comparaciones múltiples, no hubo cambio estadísticamente importante en el peso del cuerpo con respecto a la línea básica, en la semana 4, en ninguno de los tres grupos de pramlintide, en comparación con ei grupo de placebo. Así pues, la administración de pramlintide con uso continuo de insulina mejoró el control glicémico, con una disminución en el peso del cuerpo que alcanzó significación estadística dentro de los grupos de 60 µg ID y QID. Esta disminución está en contraste fuerte con el aumento de peso habitualmente asociado con el control mejorado de glucosa logrado con insulina solamente, en pacientes con diabetes de tipo 2.

CUADRO I PESO DE CUERPO. CAMBIO DE LINEA BÁSICA EN SEMANA 4 *prueba t de Student (dentro de la comparación con el grupo de fármaco en estudio). ANOVA de dos vías (comparación con placebo) con el ajuste de Hochberg. NS = no estadísticamente importante; NAP = no aplicable.

EJEMPLO 2 MEDICIÓN DEL PESO DEL CUERPO: ESTUDIO DE 52 SEMANAS EN DIABÉTICOS DE TIPO 1 Este estudio fue un estudio en grupo paralelo de centros múltiples, doblemente ciego, controlado con placebo, con una escalación de dosis potencial. Los participantes en el estudio fueron hombres y mujeres entre las edades de 16 y 70 años, con diabetes mellitus de tipo 1. Se autoadministraron diariamente cuatro inyecciones subcutáneas de 30 µg de pramlintide o de placebo, una antes de cada alimento y de una merienda antes de dormir. Ciertos pacientes (los de la rama de pramlintide que tuvieron una reducción de HbAlc desde la línea básica de menos de 1.0% después de 13 semanas de tratamiento) fueron reasignados aleatoriamente a las 20 semanas con 30 µg o 60 µg QID durante ei resto del estudio. Los pacientes de este estudio fueron tratados con la medicación en estudio, formulada a pH 4.0, a una concentración que permitía la inyección de 0.1 ml por dosis. Cuatrocientos setenta y siete pacientes recibieron por lo menos una dosis de la medicación en estudio (pramlintide o placebo). De los 477 pacientes distribuidos y dosificados aleatoriamente, 341 completaron el estudio de 52 semanas. Los pacientes tratados con pramlintide experimentaron una disminución de peso del cuerpo clínicamente significativa y estadísticamente significativa, en comparación con el placebo, a las 13, 26 y 52 semanas (cuadro II). Se observó la máxima diferencia a las 26 semanas y a las 52 semanas (disminución de cuando menos 1.2 kg en comparación con el placebo, en cada punto de tiempo). Ocurrió pérdida de peso particularmente en aquellos pacientes que tenían un índice de masa de cuerpo en línea básica (BMI) de por lo menos 17.0 kg/m2, lo que indica el máximo beneficio entre esos pacientes obesos (cuadro lll). Los pacientes que tomaron pramlintide dentro del subgrupo de pacientes con niveles de HbAlc de línea básica de por lo menos 8.0% y estables con insulina, experimentaron una disminución media en el peso del cuerpo, en comparación con el placebo, en los tres puntos de tiempo (cuadro IV). Esta observación es consistente con el efecto bien conocido de la insulina, de facilitar el aumento de peso del cuerpo. Así pues, parece que el pramlintide reduce el aumento de peso inducido por la insulina. Se analizó datos normalmente distribuidos, utilizando análisis de variación de dos vías. En los casos en los que se encontró que los datos no seguían una distribución normal, se empleó métodos no paramétricos (prueba de Kruskal-Wallis), basados en rangos. En estos casos, se presenta el estimador de Hodges-Lehman para la diferencia respecto al placebo, en lugar de la media.

CUADRO II CAMBIOS EN EL PESO DEL CUERPO DESDE LOS PESOS DE LINEA ** Prueba de Kruskal-Wallis *** ANOVA de dos vías *Diferencia estadísticamente significativa comparada con el placebo.

CUADRO PESO DEL CUERPO: CAMBIOS DESDE LINEA BÁSICA PARA PACIENTES CON BMI DE LÍNEA BÁSICA > 27.0 KG/M2 O <27.0 KG/M2. PESOS A LAS SEMANAS 13, 26 Y 52 CUADRO IV PESO DEL CUERPO: CAMBIOS DESDE LÍNEA BÁSICA.- PACIENTES ON HBA1C >8.0%, INSULINA DENTRO DE ±10% DE PESOS DE LÍNEA BÁSICA EN LAS SEMANAS 13, 26 Y 52 ANOVA de dos vías ^Diferencia estadísticamente importante comparada con el placebo.

EJEMPLO 3 MEDICIÓN DE PESO DEL CUERPO: ESTUDIO DE 52 SEMANAS EN DIABÉTICOS DE TIPO 2, QUE REQUIEREN DE INSULINA Este estudio fue un estudio de variación de dosis en grupo paralelo, de centros múltiples, doblemente ciego, controlado con placebo. Los participantes en el estudio son hombres y mujeres entre las edades de 18 y 75 años, con diabetes meilitus de tipo 2, que requieren de insulina. Se auto-administró diariamente tres inyecciones subcutáneas de pramlintide (30, 75 o 150 µg TID) o placebo (TID), una antes de cada alimento, durante 52 semanas. Se trató los pacientes de este estudio con la medicación en estudio, formulada a pH 4.7, a una concentración que requería la inyección de 0.3 mi por dosis. El periodo de tratamiento doblemente ciego estuvo precedido por un periodo de inducción con placebo, individualmente ciego, de 3 a 10 días. De los 539 pacientes asignados aleatoriamente y dosificados aleatoriamente, 381 completaron el estudio de 52 semanas. Los pacientes tratados con cualquiera de las tres dosis de pramlintide experimentaron una disminución clínicamente significativa y estadísticamente importante en el peso del cuerpo, en comparación con el placebo, a las 13, 26 y 52 semanas (cuadro V). Se observó la máxima diferencia con respecto al placebo a las 26 semanas y a las 52 semanas (disminuciones de 2.3 y 2.7 kg, en comparación con el placebo, en estos puntos del tiempo). El peso de los pacientes tratados con placebo aumentó con respecto a la línea de base en los tres puntos de tiempo, en contraste con disminuciones de peso en los tres grupos de pramlintide, en todos los puntos del tiempo. Ocurrió pérdida de peso en los pacientes que tenían un índice de masa de cuerpo(BMI) de línea básica de cuando menos 27.0 kg/m2 así como en los que tenían un BMI de línea básica de menos de 27.0 kg/m2 (cuadro VI). Los pacientes con Pramlintide en los tres grupos, con niveles de HbAlc de línea básica de cuando menos 8.0% y estables con insulina, experimentaron una disminución en el peso del cuerpo, en comparación con el placebo en todos los puntos del tiempo (cuadro Vil). La magnitud de la respuesta en general fue comparable con la observada para todos los pacientes, lo que sugiere un efecto independiente de los cambios en la dosis de insulina. Se analizó los datos normalmente distribuidos usando análisis de variación, de dos vías (con el ajuste de Hochberg al procedimiento de Bonferroni para comparaciones múltiples). En los casos en que se encontró que los datos no seguían una distribución normal, se empleó métodos no paramétricos (prueba de Kruskal-Wallis), basados en rangos. En estos casos, se presenta el estimador de Hodges-Lehman para la diferencia desde el placebo, en lugar de la media.

CUADRO V PESO DEL CUERPO: CAMBIOS DESDE PESOS DE LÍNEA BÁSICA EN LAS SEMANAS 13, 26 Y 52 ** prueba de Kruskal-Wallis con ajuste de Hochberg para comparaciones múltiples, frente a placebo. *Diferencia estadísticamente importante en comparación con el placebo.

CUADRO VI PESO DEL CUERPO: CAMBIOS DESDE LA LÍNEA BÁSICA PARA PACIENTES CON BMI DE LÍNEA BÁSICA MAYOR O IGUAL A 27.0 KG/M2 O MENOR QUE 27.0 KG/M2.- PESOS A LAS SEMANAS 13. 26 Y 52 CUADRO Vil PESO DEL CUERPO: CAMBIOS DESDE LA LINEA BÁSICA.- PACIENTES CON HBA MAYOR QUE O IGUAL A 8.0%. INSULINA DENTRO DE ±10% DE PESOS DE LÍNEA BÁSICA. A LAS SEMANAS 13. 26 Y 52 **Prueba de Kruskal-Wailis con ajuste de Hochberg para comparaciones múltiples contra el placebo. ***ANOVA de doble vía con ajuste de Hochberg para comparaciones múltiples contra el placebo. *Diferencia estadísticamente importante, comparada con el placebo.

EJEMPLO 4 PREPARACIÓN DE 25 829PRO-H-AMILINA Se llevó a cabo la síntesis en fase sólida de 25,28'29Pro-h-amilina usando anclaje metilbenzhidrilamina/resina de unión, y protección de cadena lateral con Na-Boc/bencilo, mediante métodos comunes y corrientes de síntesis de péptido. Se obtuvo la 2,r — [disulfurojamilin-MBHA-resina mediante tratamiento de cisteínas protegidas con Acm, con trifluoroacetato de talio (lll) en ácido trifluoroacético. Después de obtener la ciclización, se dividió la resina y los grupos protectores de cadena lateral, con HF líquido, en presencia de sulfuro de dimetilo y anisol. Se purificó la 25,28,29Pro-h-am¡l¡na mediante HPLC de fase inversa, preparatoria. Se encontró que el péptido era homogéneo al HPLC analítico y electroforesis capilar y se confirmó la estructura por medio de análisis de aminoácido y análisis de secuencia. El producto dio el ¡on de masa deseado. FAB espectro de masa: (M+H)+ = 3,949.

EJEMPLO 5 PREPARACIÓN DE 18Arq252829Pro-h-AMILINA Se llevó a cabo la síntesis en fase sólida de 18Arg25,28,29Pro-h-amiiina, utilizando anclaje de metilbenzhidril-amina-resina de unión y protección de cadena lateral de Na-Boc/bencilo, mediante métodos de síntesis de péptido comunes y corrientes. Se obtuvo la 2'7-[disulfuro]amil¡n-MBHA-resina mediante tratamiento de cisteínas protegidas con Acm, con trifluoroacetato de talio (lll) en ácido trifluoroacético. Después de ciclizar se obtuvo la resina y se dividió los grupos protectores de cadena lateral con HF líquido, en presencia de sulfuro de dimetilo y anisol. Se purificó la i8Arg25,28.29pro.h_ami|ina mediante HpLC preparatoria, en fase inversa. Se encontró que el péptido era homogéneo mediante HPLC analítico y electroforesis capilar, y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácido y análisis de secuencia. El producto dio el ion de masa deseado. FAB espectro de masa: (M+H)+ = 3,971.

EJEMPLO 6 PREPARACIÓN DE 18Ara252829Pro-h-AMILINA Se llevó a cabo síntesis en fase sólida de 18Arg 25,28Pro-h-amilina, utilizando anclaje de metilbenzhidrilamina-resina de unión, y protección de cadena lateral con Na-Boc/bencilo, mediante métodos comunes y corrientes de síntesis de péptidos. Se obtuvo 2,7-[disulfuro]amilin-MBHA-resina, mediante tratamiento de cisteínas protegidas con Acm, con trifluoroacetato de talio (III) en ácido trifluoroacético. Después de ciclizar se obtuvo la resina y se dividió los grupos protectores de cadena lateral, con HF líquido, en presencia de sulfuro de dimetilo y anisol. Se purificó la 18Arg25,28Pro-h-amilina, mediante HPLC preparatoria de fase inversa. Se encontró que el péptido era homogéneo mediante HPLC analítica y electroforesis capilar, y se confirmó la estructura mediante análisis de aminoácidos y análisis de secuencia. El producto dio el ion de masa deseado.

FAB espectro de masa: (M+H)+ = 3,959.

EJEMPLO 7 ANÁLISIS DE UNIÓN A RECEPTOR Se llevó a cabo la evaluación de la unión de los compuestos a receptores de amilina, de la siguiente manera: Se compró 125l-amilina de rata (Bolton Hunter, marcada en la lisina N-terminal) de Amersham Corporation (Arlington Heights, IL, E. U. A.). Las actividades específicas en el momento de uso variaron de 1950 a 2000 Ci/mmol. Se obtuvo péptidos no marcados de BACHEM Inc. (Torrance, CA, E. U. A.) y Península Laboratories (Belmont, CA, E. U. A.). Se sacrificó por decapitación ratas machos Sprague-Dawley, de 200-250 gramos. Se extirpó los cerebros a salina fría regulada con fosfato (PBS). Se hizo cortes de la superficie ventral, rostrales con respecto al hipotáiamo, unidos lateralmente por los tractos olfatorios, y que se extienden a ángulo de 45° en sentido medial desde estos tractos. Este tejido de antecerebro basal, que contiene el núcleo acumbente y las regiones circundantes, fue pesado y homogeneizado en 20 mM de regulador HEPES enfriado con hielo (20 mM de ácido HEPES, pH ajustado a 7.4 con NaOH a 23°C). Se lavó las membranas tres veces en regulador nuevo, centrifugando durante 15 minutos a 48,000 x g. Se volvió a suspender la pella final de membrana en 20 mM de regulador HEPES que contenía 0.2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF).

Para medir la unión a 125l-amilina, se incubó membranas de 4 mg de peso húmedo original de tejido, con 125l-amilina a 12-16 pM en 20 mM de regulador HEPES, que contenía 0.5 mg/ml de bacitracina, 0.5 mg/ml de albúmina de suero bovino y 0.2 mM de PMSF. Se incubó soluciones durante 60 minutos a 23°C. Se terminó las incubaciones mediante filtración a través de filtros de fibra de vidrio GF/B (Whatman Inc., Clifton, NJ, E. U. A.), que se había remojado previamente durante cuatro horas en 0.3% de polietilenimina, a fin de reducir la unión no específica de los péptidos radiomarcados. Se lavó los filtros inmediatamente antes de la filtración con 5 ml de PBS frío e inmediatamente después de filtración con 15 mi de PBS frío. Se eliminó los filtros y se determinó la radioactividad en un contador de rayos gamma, a una eficiencia de conteo de 77%. Se generó curvas de competición midiendo la unión en presencia de 10"12 a 10"6 M de compuesto de prueba sin marcar, y se analizó mediante regresión no lineal, usando una ecuación logística de 4 parámetros (programa Inplot, GraphPAD Software, San Diego, CA, E. U. A.). En este análisis la amilina humana purificada se une a su receptor a una Cl50 medida de alrededor de 50 pM. Los resultados para los compuestos de prueba están señalados en el cuadro VIII, que muestra que cada uno de los compuestos tiene actividad de unión a receptor, importante.

EJEMPLO 8 ANÁLISIS DEL MÚSCULO "SOLEUS" Se Nevó a cabo la determinación de la actividad agonista de amilina de los compuestos, utilizando el análisis de músculo soleus, de la siguiente manera. Se utilizó ratas machos Harían Sprague-Dawley, de aproximadamente 200 g de masa, a fin de mantener la masa del músculo soleus dividido, a menos de 40 mg. Se dejó en ayunas los animales durante 4 horas antes de sacrificar por decapitación. Se desprendió la piel del miembro inferior, que se sujetó con chinches en un tablero de corcho. Se cortó el tendón de Aquiles justo encima del hueso calcáreo y se reflejó hacia fuera el m. gastrocnemius desde el aspecto posterior de la tibia. Luego se desprendió totalmente el músculo soleus, un músculo liso, pequeño, de 15-20 mm de largo, 0.5 mm de grueso, en la superficie del hueso de m. gastrocnemius, y se limpió del perimysium utilizando tijeras finas y fórceps. A continuación se dividió el músculo soleus en partes iguales, usando una cuchilla pasada en sentido antero-posterior, a través del vientre del músculo, para obtener un total de cuatro tiras de músculo de cada animal. Después de disecar el músculo del animal, se mantuvo durante un periodo breve en salina fisiológica. No fue necesario mantener el músculo en tensión, ya que esto no tenía efectos demostrables sobre la incorporación de radioglucosa en el glicógeno.

Se añadió los músculos a matraces Erlenmeyer de 50 ml que contenían 10 ml de regulador bicarbonato de Krebs-Ringer, previamente gasificado, que contenía (por cada litro): NaCI, 118.5 mmol (6.93 g)K KCI, .94 mmol (443 mg); CaCI2, 2.54 mmol (282 mg); MgSO4, 1.19 mmol (143 mg), KH2PO4, 1.19 mmol (162 mg), NaHCO3, 25 mmol (2.1 g), 5.5 mmol de glucosa (1 g), e insulina humana recombinante (Humulin-R, Eli Lilly, IN, E. U. A.) y el compuesto de prueba, como se detalla a continuación. Se verificó que el pH estuviera a 37°C entre 7.1 y 7.4. Se asignó los músculos a diferentes matraces, de manera que estuviesen uniformemente distribuidos 4 trozos de músculo de cada animal entre las diferentes condiciones de análisis. Se gasificó los medios de incubación, burbujeando suavemente carbógeno (95% de O2, 5% de CO2) sobre la superficie, mientras se agitaba continuamente a 37°C en un baño de agua oscilante. Después de un periodo de "preincubación" de media hora, se añadió 0.5 µCi de U-14C-glucosa a cada matraz, que se incubó durante otros 60 minutos. Luego se sacó rápidamente cada trozo de músculo, se tiñó y congeló en nitrógeno líquido, se pesó y almacenó para determinación subsecuente de 1 C-glicógeno. Se llevó a cabo la determinación de 14C-glicógeno en una ampolla de destello de 7 ml. Se colocó cada muestra de músculo congelado en una ampolla y se digirió en 1 ml de hidróxido de potasio al 60% a 70°C durante 45 minutos, bajo agitación continua. Se precipitó el glicógeno disuelto, sobre la ampolla, mediante la adición de 3 ml de etanol absoluto, y se enfrió durante la noche a -20°C. Se aspiró suavemente el sobrenadante, se lavó el glicógeno nuevamente con etanol, se aspiró y se secó el precipitado al vacío. Se evapora todo el etanol para evitar la inactivación durante el conteo por destello. Se volvió a disolver el glicógeno restante en 1 ml de agua y 4 ml de fluido de destello y se efectuó el conteo para carbono 14. Se obtuvo la tasa de incorporación de glucosa en el glicógeno (expresada en µmol/g/hr) a partir de la actividad específica de 14C-glucosa en los 5.5 mM de glucosa del medio de incubación, y los conteos totales de carbono 14 que quedan en el glicógeno extraído de cada músculo. Se ajustó las curvas de dosis/respuesta a un modelo logístico de 4 parámetros, utilizando una rutina iterativa mínima-cuadrática (ALLF1T, v2.7, NIH, MD, E. U. A.) para deriva las CE50. Puesto que la CE50 está distribuida normalmente de forma logarítmica, se expresa ± el error de norma del logaritmo. Se llevó a cabo comparaciones por pares utilizando rutinas de base de prueba t, de SYSTAT (Wilkinson, SYSTAT: the system for statistics, SYSTAT Inc., Evanston, IL, E. U. A. (1989)). Se generó las curvas de dosis-respuesta con músculos añadidos a medios que contenían 7.1 nM (1000 µU/ml) de insulina y se añadió cada compuesto de prueba a concentraciones finales (nominales) de 0, 1 , 3, 10, 30, 100, 300 y 1000 nM. Cada análisis también contenía controles positivos internos, que consistieron en una sola carga de amilina de rata archivada, liofilizada y almacenada a -70°C. Se sabe que la amilina humana es un péptido hiperglicémico, y las mediciones de CE50 de preparaciones de amilina en el análisis del músculo soleus varían típicamente de alrededor de 1-10 nM, aunque algunas preparaciones comerciales que tienen una pureza menor que 90% tienen CE50 más altas, debido a la presencia de contaminantes, lo que da por resultado menor actividad medida. Los resultados para los compuestos de prueba están dados en el cuadro VIH.

CUADRO VIII EJEMPLO 9 ANÁLISIS DE VACIADO GÁSTRICO AL ROJO FENOL Se midió el vaciado gástrico utilizando una modificación (Plourde y coautores, Life Sci., 53:857-862 (1993)) del método original de Scarpignato y coautores (Arch. int. Pharmacodyn. Ther., 246:286-295 (1980)). Brevemente, ratas conscientes recibieron mediante alimentación, 1.5 ml de gel acolórico que contenía 1.5% de metilcelulosa (M-0262, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, E. U. A.) y 0.05% de indicador rojo fenol. Veinte minutos después de la administración, se anestesió las ratas usando halothane al 5%, se expuso el estómago y se sujetó con pinzas en los esfínteres pilórico y esofágico inferior, utilizando fórceps para arterias; se los sacó y abrió en una solución alcalina, que estaba constituida a un volumen fijo. Se derivó el contenido estomacal de la intensidad del rojo fenol en la solución alcalina, medida por absorbencia a una longitud de onda de 560 nm. En la mayoría de los experimentos el estómago estaba claro. En otros experimentos se centrifugó los contenidos gástricos en partículas, para aclarar la solución para medir la absorbencia. Cuando los contenidos gástricos diluidos permanecieron turbios, se derivó la absorbencia espectroscópica debida al rojo fenol como la diferencia entre la presente en diluyente alcalino frente a diluyente acetificado. En experimentos separados en 7 ratas se extirpó tanto el estómago como el intestino delgado y se los abrió en una solución alcalina. La cantidad de rojo fenol que pudo recuperarse del tracto gastrointestinal superior, dentro de los 29 minutos de la administración, fue 89 ± 4%; el tinte que pareció unirse irrecuperablemente a la superficie luminal del intestino, puede tomarse en cuenta para el resto.

Para compensar esta pequeña pérdida, se expresó el porcentaje de contenidos estomacales que quedó después de 20 minutos como una fracción de los contenidos gástricos recuperados de las ratas de control sacrificadas inmediatamente después de la administración, en el mismo experimento. El porcentaje de contenidos del vaciado gástrico remanentes es igual a (absorbencia a los 20 minutos)/(absorbencia a los 0 minutos). Se ajustó las curvas de dosis-respuesta para el vaciado gástrico a un modelo logístico de 4 parámetros, utilizando una rutina iterativa mínima cuadrática (ALLFIT, v2.7, NIH, Bethesda, MD, E. U. A.) para derivar las DE5o- Puesto que la DE50 está distribuida normalmente de forma logarítmica, se expresa ± el error de norma del logaritmo. Se llevó a cabo comparaciones por pares usando análisis de variación de una sola vía y la prueba de comparaciones múltiples de Student-Newman-Keuls (Instat v2.0, GraphPad Software, San Diego, CA, E. U. A), utilizando P <0.05 como nivel de significación. En estudios de dosis-respuesta, se administró amilina de rata (Bachem, Torrance, CA, E. U. A.), disuelta en 0.15M de salina, como un bolo subcutáneo de 0.1 ml, en dosis de 0, 0.01 , 0.1 , 1 , 10 o 100 µg, 5 minutos antes de forrajear en ratas Harían Sprague Dawley (no diabéticas) dejadas en ayunas durante 20 horas, y en ratas BB diabéticas, dejadas en ayunas durante 6 horas. Cuando se administró inyecciones subcutáneas de amilina 5 minutos antes de forrajear, con indicador de rojo fenol, hubo una supresión de vaciado gástrico, dependiente de la dosis (datos no mostrados). La supresión de vaciado gástrico fue completa en ratas HSD normales, a las que se administró 1 µg de amilina y en ratas diabéticas a las que se administró 10 µg (P = 0.22, 0.14). La DE50 para la inhibición del vaciado gástrico en ratas normales fue de 0.43 µg (0.60 nmol/kg) ± 0.19 unidades logarítmicas, y fue 2.2 µ (2.3 nmol/kg) ± 0.18 unidades logarítmicas en ratas diabéticas.

EJEMPLO 10 ANÁLISIS DE VACIADO GÁSTRICO CON GLUCOSA TRITIADA Se sujetó por la cola a ratas Harían Sprague Dawley conscientes, no dejadas en ayunas, y la punta de la cola se anestesió usando 2% de lidocaína. Se detectó el tritio del plasma separado de la sangre caudal a los 0, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos después de forrajear, en un contador de rayos beta. Se inyectó subcutáneamente las ratas con 0.1 ml de salina que contenía 0, 0.1 , 0.3, 1 , 10 o 100 µg de amilina de rata 1 minuto antes de forrajear (n = 8, 7, 5, 5, 5, respectivamente). Después de administrar las ratas previamente inyectadas con salina, glucosa tritiada, el tritio del plasma aumentó rápidamente (t de alrededor de 8 minutos) a una asímptota que declinó lentamente. La inyección subcutánea con amilina disminuyó y/o retardó la absorción de la etiqueta o marcador, dependiendo de la dosis. Se integró la actividad dei tritio del plasma durante 30 minutos para obtener las áreas bajo la curva dibujada como una función de la dosis de amiiina. La DE 0 derivada del ajuste logístico fue de 0.35 µg de amilina.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de una amilina o de un agonista de amilina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de obesidad en un sujeto humano.

2 - El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el agonista de amilina es un análogo agonista de amilina.

3.- El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde el análogo agonista de amilina es ^^Pro-h-amilina.

4.- El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el medicamento que contiene la amilina o el agonista de amilina se administra por vía subcutánea.

5.- El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde el medicamento que contiene la amilina o el agonista de amilina se administra de 1 a 4 veces al día y provee de 30 mg a 300 mg/dosis de amilina o el agonista de amilina al paciente.

6.- El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde el medicamento que contiene la amilina o el agonista de amilina se administra tres veces al día y provee aproximadamente 80 µg por dosis de amilina o el agonista de amilina al paciente.

7.- El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde el medicamento que contiene la amilina o el agonista de amilina se administra cuatro veces al día y provee aproximadamente 60 µg por dosis de amilina o el agonista de amilina al paciente. 8.- El uso de amilina o un agonista de amilina para la fabricación de un medicamento para reducir el aumento de peso, inducido por insulina, en un sujeto humano gue recibe insulina. 9.- El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el agonista de amilina es ^^Pro-h-amilina. 10.- El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el sujeto tiene diabetes mellitus. 11.- El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el sujeto tiene diabetes mellitus de t¡po 1. 12.- El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el sujeto tiene diabetes de tipo 2. 13.- El uso de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, en donde el agonista de amilina es ^ Pro- -amilina.