MXPA99007883A - Metodos y composiciones para prevernir y tratar el envejecimiento cronológico en la piel humana - Google Patents

Abstract

Los efectos destructivos del paso del tiempo en la piel humana (es decir, envejecimiento cronológico de la piel humana) pueden ser prevenidos y tratados con la aplicación tópica de un retinoide, preferiblemente retinol. Se ha encontrado que algunas de las mismas trayectorias principalmente las trayectorias activadas de estrés, SAPs) activadas en el fotoenvejecimiento de la piel humana (es decir envejecimiento de la piel prematuro inducido por el sol) son similarmente elevados en la piel de las personas de edad. Hemos también encontrado que otras trayectorias (principalmente la trayectoria ERK activada del mitógeno) son reducidas en la misma piel. El tratamiento de la piel envejecida cronológicamente con un retinoide, ambos inhiben la degradación del colágeno dérmico y promotores de síntesis de procolágeno. Las secciones Biopsied de la piel de edad(mayores de 80 años) muestra que un tratamiento sencillo puede incrementar el espesor epidérmico, mejora la densidad de colágeno dérmico y fomenta la formación de púas de retículo y papila dérmica (véase Figura 13), y puede disminuir la cantidad de c-Jun e incrementar las cantidades del procolágeno de los Tipos I Y III (véase 7igura 18). Tales beneficios también sonútiles en la prevención de mayugación, desgarramiento y ulceración de la piel de edad.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA PREVENIR Y TRATAR EL ENVEJECIMIENTO CRONOLÓGICO EN LA PIEL HUMANA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta solicitud está basada en parte en las solicitudes provisionales copendientes 60/040,594, presentada el 25 de febrero de 1997, y 60/042,976, presentada el 7 de abril de 1997, la descripción de las cuales se incorporan en la presente por referencia. Esta invención está relacionada con métodos y composiciones, especialmente aquellos que comprenden retinoides, preferiblemente aplicados tópicamente, los cuales son útiles para mejorar la proliferación de los queratinocitos y fibroblastos, disminuir la expresión de la matriz de metaloproteinasa (MMP) , y mejorar la síntesis de colágeno en la piel envejecida, de este modo proporcionando como un efecto el rejuvenecimiento de la piel envejecida. En cuanto a los mamíferos, los humanos son esencialmente lampiños; esto es, la mayoría de la piel del cuerpo humano se puede ver sin interferencia del vello. La piel de este modo está expuesta a cualquier tipo de inclemencia (natural y humana) que el ambiente pueda crear. Ya que en un principio se pensó que el sol provoca eritema, la gente tomó medidas para evitar sus "rayos dañinos". Hace un siglo, en Inglaterra durante el periodo de la reina Isabel, estaba de moda evitar el sol a cualquier costo. Aún así, la piel de aquellas personas todavía se arrugaba y desplegaba otros signos de envejecimiento cronológico. La piel humana es un órgano complejo el cual se extiende por todo el cuerpo. Hay diferentes tipos de piel en diferentes porciones del cuerpo; por ejemplo, la piel facial es diferente de aquella del cuero cabelludo, y aún la piel de la palma de la mano es diferente de aquella del torso de la mano. Aunque el tipo de piel puede variar por todo el cuerpo en la persona, la piel generalmente está compuesta de dos capas principales de tejido. La epidermis o cutícula, la capa más externa, está compuesta de capas superficiales (desde afuera hacia adentro: stratum comeum, stra tum lucidem y stra tum granulosum) y capas más profundas ( stra tum spinosum y stratum básale) . La dermis, cutis vera, o la piel natural, está compuesta de una capa papilar encima y una capa reticular debajo. Desde hace mucho tiempo, una variedad de sustancias han sido aplicadas a la piel para mejorar su apariencia, generalmente afectando la capa más exterior de la piel, o para tratar algún mal de la piel, generalmente afectando la piel natural. Más recientemente, se han hecho esfuerzos para rejuvenecer la piel y reclamar la elasticidad y la suavidad pérdidas por la exposición a la luz solar (radiación UV) y el clima .

Existe una diferencia entre la fisiología de la piel cronológicamente envejecida o la piel intrínsecamente envejecida (piel vieja) en comparación con aquella de la piel fotoenvejecida (es decir, piel que parece vieja debido al daño por la irradiación solar UV) . La piel vieja típicamente mantiene una apariencia sin defecto lisa en comparación con la apariencia correosa, manchada y muy a menudo profundamente arrugada de la piel fotoenvejecida . La epidermis de la piel vieja típicamente es más delgada de lo normal, mientras que aquella de la piel vieja fotoenvejecida típicamente es más gruesa de lo normal (acantótica) y se atrofia con el tiempo.

La piel fotoenvejecida normalmente tiene una gran zona Grenz (una banda ancha de material eosinofílico justo debajo de la epidermis, y la formación de colágeno y estructuras que indican el sanado de lesiones, la cual, está ausente en la piel cronológicamente envejecida. Ver también N.A. Fenske and C.W. Lober, "Structural and functional changes of normal aging skin", J. Am . Acad . Derma tol . , 15:571-585 (1986). Kligman et al . , en EP-A2-0 379,367 describe un método para el tratamiento o prevención de piel intrínsecamente envejecida con retinoides. Kligman e£ al . , probó todos los ácidos trans-retinoicos (como crema Retin-A®) en ratones lampiños albinos y en 5 mujeres mayores caucásicas, solamente se hicieron observaciones clínicas en las mujeres antes y después del estudio, y solamente se reportó una biopsia y esto ocurrió seis meses después del tratamiento (es decir, no hay una descripción sobre esta publicación de una biopsia de referencia tomada del sujeto sometido a la biopsia antes del tratamiento o de un periodo temprano del tratamiento) . * Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,932,665 y 4,934,114 describen el uso de retinol (Vitamina A aldehido), para el tratamiento de acné y para el tratamiento de la queratosis de la piel, respectivamente, ver también la Patente de los Estados Unidos NO. 3,060,229. El retinol y sus derivados también han sido sugeridos como útiles en el tratamiento de tales condiciones como son las arrugas, los mezquinos, la psoriasis, el eczema, la caspa y similares (ver EP-A2-0 391 033) . También existe evidencia que indica que la tretinoina (todos los ácidos retinoicos trans) mejoran la apariencia de la piel fotoenvejecida . Albert M. Kligman, "Current Status of Topical Tretinoin in the Treatment of Photoaged Skin," Drug & Aging, 2(1): 7-13 (1992); y Chas. N. Ellis et al., "Tretinoin: Its Use in Repair of Photodamage", y A.S. Zelickson et al., "Topical Tretinoin in Photoaging: An Ultrastructural Study," ambos en Journal of Cutaneous Aging & Cosmetic Dermatology, Vol. 1, No. 1, p. 33-40 y 41-47 (1988) . Burger et al . , en la Patente de los Estados Unidos ,665,367, describe composiciones para aplicaciones tópicas sobre la piel que contienen naringenina y/o quercetina, y un retinoide. Las composiciones se describen como útiles para tratar muchas condiciones de la piel no relacionadas, como arrugas, acné, aclaramiento de la piel, y manchas por la edad. La acción de su composición en la piel humana se describe con respecto a una enzima (transglutaminasa) importante en la formación de la envoltura de la célula y de este modo la epidermis. En contraste, la presente invención está dirigida a cambios en la dermis y en la proliferación de células de estructuras dérmicas benéficas . La invención principal es el descubrimiento de un método para rejuvenecer la piel humana. Como se utiliza con respecto a la descripción y las reivindicaciones de esta invención, "rejuvenecer" incluye los pasos de simultáneamente prevenir la degradación de colágeno y estimular la formación de colágeno nuevo en la piel humana envejecida. La invención está basada en biopsias de piel humana protegida del sol tratada y no tratada de voluntarios mayores (80 o más años) comparada con las biopsias de piel protegida de individuos más jóvenes. En comparación con la piel de las personas más jóvenes, la piel envejecida es delgada, tiene pocas células en la epidermis (queratinocitos) y la dermis (fibroblastos), tiene menos densidad y más tejido conectivo desorganizado, tiene niveles más altos de actividad cinasa cJun y matriz de metaloproteinasas (MMP) , y tiene niveles reducidos de actividad ERK, ciclina D2, y procolágeno de los Tipos I y III. En resumen, se ha encontrado como una invención que la piel humana envejecida se puede rejuvenecer por la administración tópica de uno o más compuestos en cantidades efectivas para inhibir la degradación del colágeno y para promover la síntesis del procolágeno, la aplicación preferiblemente se realiza en una base regular. La clase preferida de compuestos que realizan ambas funciones son los retinoides, especialmente retinol y todos los ácidos trans-retinoicos . La piel humana envejecida se puede beneficiar mejorando la síntesis de procolágeno. Se ha encontrado como otra invención que los niveles de procolágeno se pueden aumentar en la piel humana envejecida mediante la aplicación preferiblemente regular sobre la piel de cantidades efectivas de un retinoide, en modalidades preferidas, el tratamiento también incluye la inhibición de la degradación de colágeno por el uso de un inhibidor MMP. Además de tratar y/o prevenir el envejecimiento cronológico de la piel, el descubrimiento de que cantidades efectivas de un retinoide aplicado a la piel puede aumentar la síntesis de procolágeno proporciona otra invención en la prevención (profilaxis) de las úlceras de piel. Al aumentar el contenido de colágeno de la piel, la forma, fortaleza y función de la piel se mejoran. El aumento en la síntesis de procolágeno, y de este modo un aumento en el contenido de colágeno de la piel, mitigan la pérdida de fuerza y soporte debido al colágeno reducido degradado, y así la síntesis de procolágeno mejorada se espera que disminuya la ocurrencia y/o severidad de úlceras de piel. En conjunto con lo anterior, se ha encontrado como aún otras invenciones, que los queratinocitos y los fibroblastos, cada uno benéfico a la integridad de la piel, se aumentan en número por la aplicación tópica del retinoide, una vez más aplicado preferiblemente en una base regular. Los fibroblastos son trópicos a la epidermis; bajo condiciones normales segregan un número de factores de crecimiento (por ejemplo, FGF, IGF, y KGF, entre otros) y producen procolágeno que entra en la matriz dérmica y se convierte en colágeno estructural . Aún otra invención es la disminución de la actividad cJUN y/o reducir la cantidad de proteína c-Jun presente en la piel, y aumentar la actividad ERK, ambos en la piel envejecida, por la aplicación tópica de una cantidad efectiva del retinoide sobre la piel envejecida. En modalidades adicionales, la profilaxis y tratamiento del envejecimiento cronológico de la dermis cada uno se mejora aplicándolo junto con el ingrediente activo a por lo menos un compuesto adicional seleccionado de: un filtro solar, por lo menos uno de UVA1, UVA2 y UVB; un antioxidante; un inhibidor de MMP (matriz de metaloproteinasa) ; y mezclas de los mismos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa la representación de ciertos caminos de ERK y SAP en una célula de piel idealizada. La Figura 2 representa la densidad de fibroblastos (2A) , las características de tejido conectivo dérmico (2B) , en el espesor epidérmico (2C) y la densidad de queratinocitos (2D) en poblaciones de todas las edades que fueron estudiadas y a través de biopsia. La Figura 3 representa el potencial de crecimiento relativo (medido como el número de colonias de células por biopsia) de queratinocitos humanos (3A) y fibroblastos (3B) en poblaciones de varias edades estudiadas. La Figura 4 representa la actividad relativa de tres MMP (MMP-1 en 4A; MMP-9 en 4B, y MMP-2 en 4C) encontrados en cada una de las poblaciones de diferentes edades estudiadas. La Figura 5 representa las diferencias en la expresión de colagenasa intersticial in vivo entre la piel joven y envejecida. La Figura 6 representa las diferencias en la expresión del procolágeno Tipo I in vivo entre la piel joven y la piel envejecida.

La Figura 7 representa las diferencias en la actividad ERK in vivo entre la piel joven y la piel envejecida . La Figura 8 representa las diferencias en la expresión de ERK (activado) fosforilado in vivo entre la piel joven y la piel envejecida. La Figura 9 representa las diferencias en la expresión de ciclina D2 in vivo entre la piel joven y la piel envejecida. La Figura 10 representa las diferencias en la actividad de cinasa cJUN in vivo entre la piel joven y la piel envejecida. La Figura 11 representa el cambio en la densidad de fibroblastos (HA), las características de tejido conectivo dérmico (11B), espesor epidérmico (11C), y densidad de queratinocitos (11D) en piel envejecida (80 años o más), al aplicar un retinoide (1% de retinol; una aplicación, ocluida, y examinada siete días después) . La Figura 12 representa el efecto del tratamiento de retinoide (retinol) en el crecimiento de células de fibroblastos queratinocitos humanos cultivadas ex vivo de las muestras de la biopsia. La Figura 13 muestra acercamientos y secciones transversales teñidas de la piel de un individuo joven (13A y 13B) , un individuo mayor (13C y 13D) y el mismo individuo mayor (13E y 13F) después de una sola aplicación de 1% de retinol (ocluido, durante siete días, y luego se realizó la biopsia) . La Figura 14 describe el efecto en las actividades de tres enzimas MMP (MMP 1, 2 y 9; análogo a la Figura 4), después de una sola aplicación de retinol a la piel envejecida como se determinó por la biopsia. La Figura 15 representa la inducción del ácido mediado retinoico de la síntesis de colágeno del Tipo I en fibroblastos de piel humana cultivados. La Figura 16 representa la inducción in vivo del procolágeno al(III) ARNm del Tipo III provocado por la administración de retinol a la piel envejecida. La Figura 17 representa la inducción in vivo de la actividad ERK provocada por la administración de retinol a la piel envejecida. La Figura 18 es una fotomicrografía que muestra en biopsias seccionadas teñidas de piel envejecida que, siete días después de una sola aplicación de retinol al 1%, se disminuye la proteína c-Jun y el aumento en las cantidades de procolágeno de los Tipos I y III en la piel. La Figura 1 representa ciertos caminos degradadores que verifican el funcionamiento de una célula de piel idealizada basada en los descubrimientos. Las causas particularmente importantes del envejecimiento cronológico de la piel humana, probablemente varían entre una población de humanos mayores, incluyendo tales factores como dieta, genética, y el ambiente. En general, aunque se cree que el envejecimiento cronológico de la piel se debe a la activación de las trayectorias activadas por el estrés (SAP) , y a una represión de las trayectorias activadas por mitógenos (ERK) . Al contrario del conocimiento convencional, en comparación con las invenciones que están relacionadas con el fotoenvej ecimiento de la piel humana, se ha encontrado que el envejecimiento cronológico y el fotoenvej ecimiento de la piel humana tienen patofisiología molecular similar. El ERK sirve como mediador de las acciones de los factores de crecimiento necesarios para la piel sana. La interferencia con el ERK puede llegar al adelgazamiento de la piel cronológicamente envejecida debida al número reducido de células en la epidermis y la dermis. Casi por el contrario, los SAP activan factores (por ejemplo, c-Jun) que promueven tanto la inhibición de la síntesis de procolágeno como la degradación de colágeno maduro, y con esto llevan a una forma, fuerza y función reducida de la piel. Se puede esperar que el envejecimiento cronológico de la piel incluya alguna interferencia con el ERK y/o alguna activación de los SAP. Se ha encontrado que ambos casos ocurren en piel humana cronológicamente envejecida. Como se muestra en la Figura 1, la célula de piel idealizada 101 tiene una membrana celular 103 a través de la cual varios compuestos pasan o en la cual interactúan con los receptores vía la célula en la superficie de la célula. Un grupo de entrada indicado por 105 activa la trayectoria ERK la cual activa el ERK por fosforilación. El ERK activado induce la formación de ciclina de D2 107 en el núcleo de la célula, con el resultado de que el crecimiento de la célula se promueve. Otro grupo de entrada se indica por 109, el cual activa la trayectoria activada por el estrés, la cual lleva al aumento en la actividad de cinasa cJUN. Una vez activada (una vez más fosforilación) , la c-Jun se convierte en un componente de AP-1, lo cual lleva a la formación de MMP 111 y la exportación de las MMP de la célula, dando como resultado la degradación del colágeno en la matriz dérmica. Las matrices de metaloproteinasas (MMP), incluyen colagenasas, gelatinasas y otras enzimas que ocurren naturalmente en la piel humana que degradan las moléculas de matriz extracelular, como es el colágeno. En tanto no se desea estar atados a una teoría en particular, se cree que el aumento en la actividad de la cinasa cJUN interfiere con la síntesis del procolágeno (precursor del colágeno soluble) , el cual entonces se exporta (113, con referencia a la Figura 1) de la célula dentro de la matriz para convertirse en colágeno estructural (colágeno insoluble) . Se cree que el cJUN activado inhibe uno o más pasos en la síntesis del procolágeno, como se muestra en la figura.

La invención generalmente está dirigida a la administración tópica, preferiblemente en una base regular, de una cantidad de retinoide, preferiblemente retinol o ácido retinoico, sobre la piel de una persona mayor en cantidades efectivas para inducir la proliferación de por lo menos uno de queratinocitos y fibroblastos, para reducir la expresión de MMP, para estimular la síntesis de procolágeno en la piel de las personas mayores de regreso a niveles normales, y/o para aumentar el nivel de ERK activado y para reducir la actividad de la cinasa cJUN y para reducir el nivel de la proteína c-Jun en la piel envejecida. Análisis de la Piel Envejecida Se ha encontrado que hay una disminución asociada con la edad en el número de queratinocitos y fibroblastos como se determinó para las comparaciones de las repeticiones de las biopsias con perforaciones de 4 mm obtenidas de la piel protegidas del sol de 40 individuos, variando desde los 18 hasta más de 80 años. Los queratinocitos son las células principales que comprenden la epidermis. Las células de la epidermis surgen por la diferenciación de los queratinocitos básales, algunos de los cuales se diferencian a través de capas subyacentes sucesivas para convertirse en el comeum (capa más externa de la piel) . Las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D representan los datos morfométicos basados en todo el estudio de la población que fue conducida. Las biopsias de nuestra población voluntaria dio como evidencia una disminución media de 27% (queratinocitos) y 39% (fibroblastos) cuando el grupo de menor edad (18-29 años) fue comparado con el grupo de mayor edad (de 80 años o más) (p < 0.1 para ambos tipos de células) , como se muestra en las Figuras 2A y 2D; también se notó que los cambios asociados con la edad en la piel se ven como una disminución en los fibroblastos por encima de la edad de los 30 y otra disminución por encima de la edad de 80 (Figura 2A) . Este estudio de población también evidenció un incremento en el número de características de tejido conectivo dérmico indeseable por encima de la edad de 60 (Figura 2B) y una disminución en el espesor epidérmico por encima de la edad de 60 (Figura 2C) . Estos datos muestran que hay un aumento asociado con la edad en la desorganización del tejido conectivo y/o la degeneración (un aumento del doble de 2.25 en el grupo de mayor edad comparado con el grupo de menor edad; p<0.05), como se mostró en la Figura 2B. La desorganización y degeneración de los tejidos conectivos fueron medidos por una examinación histológica microscópica del tejido de la piel tomado de la biopsia obtenido de estos sujetos mayores y comparado con la histología de la piel tomada de la biopsia de los individuos más jóvenes. Estos resultados fueron confirmados más adelante por el descubrimiento de las disminuciones asociadas con la edad en los queratinocitos (54% de disminución) y el crecimiento de los fibroblastos (50% de disminución) , determinados como el número de colonias celulares, en el cultivo del tejido tomado de la biopsia, comparado entre los dos mismos grupos de edad (p <0.1 para ambos tipos de célula), como se muestra en la Figura 3. Como se muestra en la Figura 4, se ha descubierto un aumento relacionado con la edad en las actividades relativas de MMP-1, MMP-2 y MMP-9, cuando estos grupos de individuos jóvenes y de edad se comparan (respectivamente, aumentos promedio de 40%, 82% y 53%, y respectivamente p < 0.01, p < .001 y P < 0.01). estos resultados fueron determinados utilizando repeticiones de biopsias con perforaciones de 4-mm de los 40 sujetos voluntarios. Como se muestra en la Figura 5, las mediciones de colagenasa intersticial de la piel tomada de la biopsia de 16 individuos en cada uno de los dos grupos (joven y de edad), revelaron que la expresión relativa de la proteína colagenasa estuvo presente en la piel de los sujetos mayores en cantidades cercanas al doble en comparación con aquella encontrada en los sujetos jóvenes. La Figura 6 representa el análisis para determinar la presencia del procolágeno del Tipo I en muestras in vivo de la piel no expuesta tomada de cada uno de los dos grupos de individuos probados (jóvenes y viejos) . Se ha encontrado que alrededor del doble de procolágeno del Tipo I se expresa en piel de sujetos jóvenes no expuesta (protegida del sol) que en la piel de los sujetos de edad no expuesta. La Figura 7 muestra los descubrimientos para la actividad en estado uniforme de ERK en las biopsias de piel de nuestros voluntarios, tanto de los de edad (más de 80 años) como los jóvenes (19-29 años), generalmente de acuerdo con los métodos descritos aquí. La histografía en la Figura 7 muestra que la actividad relativa de la ERK en la piel de voluntarios de edad es casi la mitad de su nivel de actividad en la piel de los jóvenes. La actividad reducida de la ERK puede resultar de los niveles reducidos de ERK o de la activación reducida de ERK en la piel envejecida, o de una combinación de ambas. Por lo tanto, se probaron quince voluntarios para determinar las cantidades relativas de ERK presentes en la piel, tanto en la forma total como en la activada (fosforilada) , la forma activada estimula el crecimiento celular. Como se muestra en la Figura 8, los sujetos de edad tienen esencialmente la misma cantidad de ERK total en su piel que los sujetos medio siglo más jóvenes, pero tienen significativamente menos ERK en su forma activa fosforilada. Por consiguiente, se ha encontrado que la -^actividad reducida de la ERK en la piel de las personas de edad no se debe a una reducción en la cantidad total de ERK, sino a la baja concentración de la forma activada.

En la trayectoria de la ERK mostrada en la Figura 1, la ERK induce la ciclina D2, que se requiere para el crecimiento celular. Una vez más, se espera que la interferencia con este determinante ERK llevará a una reparación y crecimiento celular retardados, y por lo tanto los efectos del envejecimiento en la piel se promoverán. La Figura 9 representa los resultados analizando en doce sujetos jóvenes y once sujetos viejos para la expresión de la ciclina D2 en piel normalmente cubierta (protegida del sol) . La histografía de la Figura 9 muestra que la cantidad de ciclina D2 expresada en la piel cronológicamente envejecida significativamente se reduce en comparación con su expresión en la piel joven. Se probaron quince sujetos en dos grupos de edad, sujetos jóvenes (19-29) y sujetos de edad (más de 80) , para determinar el grado de activación de la proteína cinasa activada por el estrés ("SAPK") en cada grupo; la actividad de la SAPK se mide por la fosforilación de la proteína cJUN. La Figura 10 muestra que las muestras in vivo de la piel no expuesta de los sujetos jóvenes, tuvo aproximadamente 25% de la actividad relativa de la cinasa cJUN en comparación con la piel no expuesta de los sujetos de edad. A partir de estos resultados, uno puede esperar que los niveles elevados de c-Jun activada en la piel de las personas de edad llevan al aumento de la actividad de la MMP.

Tratamiento de la Piel Envejecida con Retinoide Volviendo de nuevo a la Figura 1, la activación de las SAP (trayectorias activadas por estrés 109) promueve la degradación del colágeno de la piel a través de la producción de MMPS, que incluye colagenasa y la gelatinasa 92 kDa. Las SAP se pueden activar o regular por la radiación UV (como se describe en la solicitud copendiente 08/588,771, registrada en enero 16 de 1996, y las solicitudes provisionales 60/048,520, depositada el 4 de junio de 1997, y 60/057,976, presentada el 5 de septiembre de 1997, todas relacionadas con el fotoenvej ecimiento de la piel humana, cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia) , los factores de necrosis tumoral (por ejemplo, TNF-a), interlucina (por ejemplo, IL-la) , y otros estrés. Como se describe en la solicitud antes mencionada ?771 y las solicitudes provisionales ?520 y 976, la AP-1 induce las MMP, enzimas que degradan el colágeno. En tanto que se ha mostrado en las solicitudes de patente de fotoenvej ecimiento antes mencionadas de que se puede interferir con la producción inducida por UV de las colagenasas, hay trayectorias adicionales involucradas con el envejecimiento cronológico, y tales trayectorias determinan el envejecimiento cronológico de la piel (por ejemplo, la trayectoria ERK) , no necesariamente pretenden determinar cuando un paciente debe de ser tratado por fotoenvej ecimiento de la piel (por ejemplo, usando un compuesto que solamente inhibe la formación de las MMP no necesariamente determinará la trayectoria ERK) . Para investigar el tratamiento de la piel envejecida cronológicamente 17 sujetos que tienen las edades de por lo menos 80 años fueron suministrados con un tratamiento tópico con 1% de retinol o con el vehículo por sí solo, el área de prueba fue ocluida durante siete días, y entonces se tomaron biopsias del área de prueba. La composición del vehículo fue de una mezcla de etanol y polietilenglicol en una proporción volumétrica de 70:30. En comparación la piel tratada con el vehículo con la piel no tratada de individuos del mismo rango de edad, no hubo diferencias estadísticamente significativas en ninguno de los parámetros descritos con referencia a la Figura 2, es decir, el número de fibroblastos y queratinocitos, el espesor epidérmico y las características de tejido conectivo dérmico indeseables . Al comparar la piel tratada con retinol con la piel tratada con vehículo de los mismos individuos, como se muestra en la Figura 11, se aumentaron los números de queratinocitos (HA) y fibroblastos (11D) por sección en la piel tratada con retinol (273% (p < 0.001) y 30% (p < 0.05), aumentos promedio, respectivamente) . Además, el tratamiento con retinoides aumentó el espesor epidérmico sustancialmente (11C) . Debido a la corta duración del tratamiento con retinoide (retihol) , hubo pequeños cambios obvios en el número de características de tejido conectivo dérmico perjudicial (11B). Las Figuras 12A y 12B demuestran los efectos del tratamiento con retinol durante 7 días in vivo en un crecimiento ex vivo de queratinocitos y fibroblastos extraídos de biopsias de piel protegidas del sol tomadas de nuestros individuos voluntarios de más de 80 años de edad. Esto es, un voluntario de edad fue tratado con retinol (una aplicación de retinol al 1%), ocluido durante siete días), se tomó una biopsias del área tratada, y los queratinocitos y fibroblastos de la biopsia se cultivaron ex vivo . Este tratamiento con retinol de las células in vivo dio como resultado un aumento sustancial en el crecimiento ex vivo de ambos tipos de células. En particular, el crecimiento de los queratinocitos aumentó aproximadamente el 30% (12A) mientras que el crecimiento de los fibroblastos aumentó aproximadamente 200% (12B), con p < 0.05 para ambos. Por consiguiente, se espera que la aplicación tópica de un retinol sobre piel envejecida aumentará el número de queratinocitos y/o el número de fibroblastos en la piel. Los resultados gráficos de los tratamientos novedosos se muestran en la Figura 13. Las Figuras 13A y 13B son fotomicrografías que muestran la apariencia histológica de la piel protegida del sol de un individuo de 22 años de edad, la porción en la Figura 13B es una vista ampliada del área dentro de un cuadro en la Figura 13A. Como se muestra dentro de éste, la piel está compuesta de la epidermis E subyacente a la dermis D. Parte de la adhesión entre la epidermis y la dermis se facilita por una gran área interfacial entre la epidermis y la dermis. Esta interfase está definida por las salientes o rebordes R que se extienden hacia abajo de la epidermis dentro de la dermis y por la papila dérmica P que se extiende hacia arriba desde la dermis dentro de la epidermis. Esta saliente y papila crean las dobles vistas en sección transversal de la Figura 13A y aumentan el área de superficie interfacial entre las dos capas de piel. La sección en la parte inferior (Figura 13B) muestra una vista más detallada de la dermis que contiene pocas células C y es en su mayoría colágeno L. Como se ve en esta sección de un individuo joven, el colágeno en la dermis es relativamente denso y de una estructura uniforme. Las Figuras 13C y 13D muestran la histología de la piel protegida del sol tratada con el vehículo de un individuo de 86 años. Como se ve en la Figura 13C, la epidermis es más delgada en la piel envejecida y esencialmente no hay salientes y esencialmente no hay papila dérmica. Esta vista detallada en la Figura 13D muestra que la dermis de la piel envejecida generalmente tiene menos células y tiene colágeno que es menos denso y más denso uniformemente distribuido que el que se encuentra en individuos más jóvenes. La epidermis más delgada y la disminución del área de superficie interfacial entre la epidermis y la dermis tienden a causar que las personas de edad tengan una incidencia más alta de moretones y condiciones ulcerosas como es la púrpura de Bateman. Las Figuras 13E y 13F representan piel protegida del sol, tratada con retinol del mismo individuo del cual se mostró una biopsia en las Figuras 13C y 13D después de 7 días de haber sido tratado como se describió anteriormente (una aplicación de retinol) . Los cambios mostrados en la piel son realmente notables e inesperados. La epidermis engrosada, el área de superficie interfacial aumentó como evidencia por la presencia de nuevas salientes y papila dérmica y como se muestra en la vista detallada el colágeno dérmico se hizo más denso y más regular en su apariencia. De este modo, la aplicación tópica de una cantidad efectiva de un retinoide actúa para aumentar el espesor de la epidermis (por ejemplo, normalizar con respecto a lá piel joven) , para promover la formación de salientes y papila dérmica, y para aumentar la cantidad, densidad y regularidad del colágeno en la dermis. Estos cambios invirtieron los cambios histológicos aparentes vistos en la piel envejecida y ayudaron a prevenir el amoretonamiento, la rasgadura, la ulceración y trauma similares en la piel envejecida que no ocurren en piel joven.

También se usaron biopsias de los voluntarios antes mencionados para determinar el efecto con el mismo tratamiento con retinoide en la actividad relativa de las mismas enzimas de colagenasa estudiadas para los resultados mostrados en la Figura 4. Las Figuras 14A, 14B y 14C representan los niveles de actividad promedio de MMP (para colagenasa MMP-1 y gelatinasas MMP-9 y MMP-2, respectivamente) , después del tratamiento de individuos de edad con retinol. Como se muestra en la Figura 14, siete días después de un solo tratamiento con retinol, las actividades de la MMP-1 y la MMP-9 ambas disminuyeron (48% y 39% de disminución, respectivamente con p < 0.001 para ambas enzimas) . No se notaron cambios significativos en la actividad de la MMP-2. Los niveles de actividad de enzima significativamente se redujeron para las MMP 1 y 9, en comparación con el tratamiento control del vehículo por sí solo. (En las Figuras 14A-14C, el número de sujetos para cada figura fue de 10, "*" indica p < 0.5 contra los valores de 18-29 años de edad, "**" indica p < 0.1, y "***" indica p < 0.001) . Usando lo anterior y las técnicas análogas, utilizando muestras de siete voluntarios de más de 80 años, y fibroblastos cultivados de muestras de biopsia de su piel no expuesta (protegida del sol) , se encontró que una concentración de ácido retinoico de 0.25 µg/ml aumentó la expresión relativa de colágeno al triple de aquella de las células no tratadas, y 0.5 y 1.0 µg/ml generalmente aumentaron la biosíntesis de colágeno en estas células cultivadas al quíntuple a partir de células no tratadas como se muestran en la Figura 15. Siete individuos de más de 80 años de edad fueron tratados clínicamente con una crema al retinol al 1% aplicada una vez a la piel protegida del sol, cubierta con un parche, se dejó sin alterar durante siete días. Las biopsias de estas áreas tratadas debajo del parche revelaron que el procolágeno ARNm del tipo III, aumentó en la piel de estos individuos aproximadamente 2.5 veces en comparación con las áreas de control (tratadas con vehículo) tratadas con el mismo método (una sola aplicación y cubiertas durante siete días) . Estos resultados se muestran en la Figura 16. Usando la misma técnica descrita previamente para el tratamiento con retinoide (retinol al 1% aplicado a la piel protegida del sol, ocluida y examinada siete días después), se trataron y luego se probaron tres de los voluntarios de más de 80 años de edad para determinar el efecto del tratamiento con retinoide en la actividad ERK. Los resultados de las biopsias de estos individuos mostraron que después del tratamiento, la actividad ERK in vi vo fue más del doble comparada con una biopsia del área tratada con el vehículo de los mismos voluntarios. Estos resultados se muestran en la Figura 17 (en la cual el control, la piel tratada con el vehículo, se normalizó a un valor de uno) . Biopsias teñidas y seccionadas adicionales del grupo de edad (mayores de 80) de los voluntarios después del tratamiento con retinoide se representan en la Figura 18. Como se mencionó anteriormente, la AP-1 induce la formación de MMP y está formada por la heterodimerización de proteínas c-Jun y c-Fos. La Figura 18A muestra que después de una semana de tratamiento con retinoide (retinol, "ROL"), el nivel de c-Jun en la piel envejecida (c-Jun estando teñida de rojo) significativamente se redujo (casi ausente) comparada con una sección tomada de la biopsia de la piel tratada con el vehículo. De este modo, la invención parece inhibir la formación de c-Jun y por lo tanto inhibir la formación de AP-1 y las MMP resultantes. Las Figuras 18B y 18C muestran que los niveles de procolágeno Tipos I y III (teñidos de rojo) se mejoran en la piel tratada con retinoide. (La densidad aparentemente más baja del procolágeno en la dermis en la Figura 18C es un artefacto de la sección hecha; claramente, hay un nivel más alto de tinción en la sección tratada con retinol que en la sección tratada con vehículo) . Por consiguiente, en una modalidad, la invención comprende un método para rejuvenecer la piel envejecida, mediante la aplicación de una cantidad efectiva no tóxica de un retinoide durante un periodo efectivo de tiempo. El periodo efectivo de tiempo generalmente es diario, preferiblemente una sola aplicación/administración de la composición cada día. El tratamiento y los regímenes de mantenimiento preferidos utilizan una cantidad efectiva de aproximadamente 0.4% de retinoide, aunque dosis más altas se pueden usar donde se garantiza. El retinol es un retinoide preferido . En otra modalidad, la invención proporciona un método para inducir queratinocitos y/o la proliferación de fibroblastos in vivo mediante la administración tópica de una cantidad efectiva no tóxica de retinoide (preferiblemente retinol o todos los ácidos trans retinoicos) durante un periodo efectivo de tiempo. Una vez más, el tratamiento es preferiblemente diario, una o dos veces, con la cantidad de retinoide preferiblemente de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1.0%. En aún otra modalidad, la invención reduce y/o inhibe la expresión de MMP-1 y/o MMP-9 en piel envejecida, mediante la administración tópica de una cantidad efectiva de un retinoide durante un periodo efectivo de tiempo; una vez más los retinoides preferidos son retinoides y todos los ácidos trans retinoicos. Una vez más, el tratamiento preferiblemente es diario, una o dos veces, con la cantidad de retinoide preferiblemente entre aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1.0%.

Como se mencionó anteriormente, la disminución en queratinocitos y fibroblastos, y el aumento en la expresión de MMP, se pueden ver como una condición relacionada con la edad sin recurrir a agravios tales como daño solar. Esta invención de este modo proporciona una profilaxis contra un cambio perjudicial en cualquiera de estos parámetros relacionados con la edad, al igual que proporcionar un tratamiento para aminorar estos cambios etiológicos perjudiciales inducidos por la edad. En otro aspecto, esta invención está dirigida para mejorar, o estimular, la síntesis de procolágenos Tipos I y III en la piel de las personas mayores. Se ha encontrado que hay una reducción significativa en la síntesis de procolágeno Tipos I y III en la piel protegida del sol de muchos individuos de edad (por lo menos 50% de) y que esta condición se puede tratar mediante la aplicación tópica del retinoide. El procolágeno es una proteína sintetizada por células de fibroblastos _de la piel y luego segregada dentro del medio extracelular, donde se convierte en colágeno por enzimas que ocurren naturalmente. La síntesis de procolágeno reducida en la piel de una persona mayor se manifiesta como la presencia reducida de proteína de procolágeno tanto en la dermis superior (extracelular) como en los fibroblastos a través de la dermis, y se puede determinar (por ejemplo) por inmunohistoquímica.

Tomadas en conjunto, la investigación de las trayectorias de control mostradas en la Figura 1, indican que el crecimiento cronológico de la piel puede ser causado por la desactivación de la ERK y/o por la activación de las SAP. De hecho, se ha encontrado que ambos casos ocurren en pieles de cultivo. Los resultados presentados en la Figura 7-9 muestran que la piel protegida del sol de las personas mayores (cuya piel generalmente no ha sido expuesta al sol en una base crónica) tiene cantidades reducidas de ERK activa y una cantidad reducida de ciclina D2, lo cual lleva a una reducción en el crecimiento de la célula. También se ha mostrado en la piel de personas mayores que hay una reducción en la cantidad de procolágeno sintetizado de los Tipos I y III (ver Figura 6) . Si hay menos crecimiento de célula en la dermis, entonces la cubierta epidérmica también probablemente esté comprometida. Los resultados de las pruebas de varios componentes de señalamiento de la trayectoria de la ERK importantes para fomentar el crecimiento en la piel humana indican que el envejecimiento cronológico en la piel humana se caracteriza por una reducción en la activación de por lo menos dos componentes de la trayectoria que promueve el crecimiento de la célula. A medida que envejece la piel, la activación reducida de la ERK y la producción reducida de la ciclina D2 llevan al crecimiento de células reducido que da como resultado, finalmente, en una piel envejecida. Los resultados mostrados en las Figuras 15-17 prueban la efectividad in vivo del tratamiento con retinoide aumentando el nivel de actividad de la ERK y la producción de procolágeno de los Tipos I y III. Por otro lado (la degradación de la dermis al contrario de la creación de una nueva dermis), los resultados representados en las Figuras 4, 5 y 10 muestran que la piel no expuesta de las personas mayores ha aumentado las actividades de la cinasa cJUN y MMP. La regulación ascendente de las enzimas MMP degradadoras y la regulación descendente de la síntesis de procolágeno da como resultado una deficiencia de colágeno, provocando el envejecimiento de la piel y el impedimento para reparar la piel envejecida. Un incremento en la actividad de la trayectoria que provoca un índice aumentado de descomposición de la piel (como a través de la degradación mediada por MMP de la matriz dérmica y la inhibición de la síntesis de procolágeno) , concomitante con la disminución en la actividad de la trayectoria que promueve el crecimiento de la célula (como es la disminución en la actividad de ERK) ambos contribuyen al envejecimiento cronológico de la piel humana. Los métodos para prevenir y rejuvenecer la piel cronológicamente envejecida, probados en piel no expuesta, protegida del sol, muy a menudo con oclusión del lugar tratado, son aplicables para tratar el envejecimiento cronológico de la piel en todo el cuerpo, incluyendo la cara y las manos. Tomada junto con las enseñanzas de la patente antes mencionada y las solicitudes provisionales dirigidas al fotoenvejecimiento, la aplicación diaria de un retinoide sobre la piel aminorará los efectos del envejecimiento natural, al igual que los efectos de exacerbación del sol en el envejecimiento de la piel. De este modo, ya que no se desea estar sujeto a una teoría particular de función, se cree que los resultados mostrados, por ejemplo, en las Figuras 13E y 13F se deben, debido en parte a alguna combinación de la activación mejorada de ERK, cantidades disminuidas de c-Jun, y cantidades aumentadas de procolágeno de los Tipos I y/o III. Utilizando la misma técnica descrita para el tratamiento con retinoide (retinol al 1% aplicado sobre la piel protegida del sol, ocluida, y examinada siete días después) , se probaron tres de los voluntarios mayores de 80 años. Los resultados de las biopsias de estos individuos muestran que después del tratamiento, la actividad de la ERK in vivo fue más del doble, como se muestra en la Figura 13 (en la cual la piel tratada con el vehículo control se normalizó a un valor de uno) . Los retinoides son una clase de inhibidores de MMP. Los inhibidores de MMP pueden actuar directamente sobre las MMP y/o sobre los factores de transcripción AP-1 y NF-KB mediante los cuales las MMP se producen naturalmente. La aspirina y E5510 (descrita por Fujimori, T., et al., Jpn J Pharmacol (1991) 55(1):81-91) inhibe la activación NF-?B . Los retinoides como aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 4,877,805 y los retinoides disociados que son específicos para el antagonismo A-l (como aquellos descritos por Fanjul et al., en Nature (1994) 372:104-110), glucocorticoides, y Vitamina D3 objetivo AP-1. Los compuestos para mejorar el efecto terapéutico de la vitamina D3 están descritos en la solicitud copendiente con número de serie 08/832,865 (J. Voorhees et al., "Method for Assessing 125 (OH) 2D3" ) , presentada el 4 de abril de 1997, la descripción de la cual se incorpora aquí para referencia . Otros retinoides además del retinol, incluyen análogos naturales y sintéticos de vitamina A (retinol) , aldehido de vitamina A (retinal) , ácido de vitamina A (ácido retinoico (RA) ) , que incluyen todos los ácidos retinoicos trans, 9- cis y 13-cis) , etretinato y otros como se describe en la EP-A2-0 379367, y Patentes de los Estados Unidos 4,887,805 y 4,888,342 (las descripciones de las cuales se incorporan aquí para referencia) . Se espera que varios retinoides y compuestos sintéticos que tienen actividad retinoide sean útiles en esta invención, hasta el punto de que exhiban actividad retinoide in vivo, y tales se describen en varias patentes asignadas en su fase a Allergan Inc., tales como en las siguientes Patentes de los Estados Unidos números: 5,514,825; 5,698,700; ,696,162; 5,688,957; 5,677,451; 5,677,323; 5,677,320; 5,675,033; 5,675,024; 5,672,710; 5,688,175; 5,663,367; 5,663,357; 5,663,347; 5,648,514; 5,648,503; 5,618,943; 5,618,931; 5,618,836; 5,605,915; 5,602,130. Todavía otros compuestos descritos teniendo actividad retinoide se describen en otras Patentes de los Estados Unidos numeradas: 5,648,563; 5,648,385; 5,618,839; 5,559,248; 5,616,712; 5, 616,597; 5,602,135; 5,599,819; 5,556,996; 5,534,516; 5,516,904; 5,498,755; 5,470,999; 5,468,879; 5,455,265; 5,451,605; 5,343,173; 5,426,118, 5,414,007; 5,407,937; 5,399,586, 5,399,561; 5,391,753; y similares, las descripciones de todas las anteriores y las siguientes patentes y referencias de literatura se incorporan aquí para referencia . Las MMP también se inhiben por BB2284 (descrito por Gearing, A. J.H et al., Nature (1994) 370:555-557), GI129471 (descrito por McGeehan G.M., et al., Nature (1994) 370:558-561), y TIMP (inhibidores de tejido de metaloproteinasas, que inhiben colagenasas vertebradas y otras metaloproteinasas, incluyendo gelatinasa y estromelisina) . Aún otros compuestos útiles para la presente invención incluyen hidroxamato y derivados de hidroxi-urea, tal como Galardina, Batimastato y Marimastato, y aquellos descritos en EP-A1-0 558635 y EP-Al-O 558648 (descritos aquí como útiles para inhibir las MMP en el tratamiento de, entre otras etiologías, úlceras de piel, cáncer de piel y epidermólisis bulosa) . Se han reportado por Goldsmith, L.A. ( Physiology, Biochemistry, and Molecular Biology of the Skin , 2nd. De. (New York: Oxford Univ. Press, 1991), capítulo 17) que los retinoides provocan un aumento en los niveles de estado uniforme de TIMP ARNm que sugieren un control transcripcional; aunque, se ha encontrado que esto no es verdad basado en los descubrimientos aquí en la piel humana in vivo . Aún otros inhibidores de la MMP que se pueden aplicar tópicamente para aplicar la invención reclamada incluyen las tetraciclinas y derivados de éstas, tales como minociclina, roliteraciclinas, clortetraciclinas, metaciclina, oxitetraciclina, doxiciclina, demeclociclina y las diversas sales de las misma. Debido a las posibles reacciones alérgicas de sensibilidad, la administración tópica de tetraciclinas deberá ser vigilada cuidadosamente para que no haya dichas reacciones indeseables. Otros inhibidores de MMP incluyen genisteina y quercetina (como se describen en las Patentes de los Estados Unidos 5637703 5665367 y FR-A-2 , 671 , 724 , las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia) y compuestos relacionados, al igual que otros antioxidantes como NAC (N-acetil cisteína), extracto de té verde y otros . La cantidad efectiva del ingrediente activo aplicado sobre la piel preferiblemente está en el rango de aproximadamente 0.001-5% de peso, más preferiblemente aproximadamente 0.01-2% en peso, y aún más preferiblemente de 0.1-1% en peso del peso total de la composición. Las composiciones se formulan para proporcionar preferiblemente aproximadamente 5 µg/cm2 de piel cuando se aplica. Por ejemplo, una composición preferida para usar en esta invención es ácido retinoico Retin-A® en gel y crema (disponible 'de Ortho Pharmaceuticals para el tratamiento de acné vulgaria) , en concentraciones desde 0.01% a 0.1%; el vehículo preferiblemente incluye, dependiendo de la formulación particular, por lo menos uno de hidroxitolueno butilado, alcohol (desnaturalizado con alcohol t-butílico y sulfato de brucina) , ácido esteárico, miristato de isopropilo, estearato de polioxilo 40, alcohol estearílico, y similares, y mezclas compatibles de estos. Se probaron quince sujetos en dos grupos de edades diferentes, sujetos jóvenes (19-29 años de edad) y sujetos de edad (más de 80 años) para determinar el grado de activación de la cinasa SAP en cada grupo. La actividad de la cinasa SAP se mide por la fosforilación de c-Jun. La Figura 10 muestra que las muestras in vi vo de la piel no expuesta de los sujetos jóvenes tuvo aproximadamente 25% de actividad de cinasa cJUN relativa que la piel no expuesta de los sujetos de edad. A partir de estos resultados, uno puede esperar correspondientemente niveles elevados de AP-1 y MMP en la piel de los sujetos de edad.

Se ha encontrado inesperadamente que el tratamiento tópico en la piel cronológicamente envejecida de los sujetos de edad con un retinoide, da como resultado una restitución de los niveles de proteínas procolágeno intracelular similar a aquella observada en los individuos jóvenes (tales como aquellos con edades de 40 y más jóvenes) . En particular, se ha encontrado que una sola aplicación de retinol al 1% sobre la piel cronológicamente envejecida, cubierta con un vendaje adhesivo permeable al aire, y examinada siete días después, dio como resultado niveles de proteína de procolágeno comparable a aquellos encontrados en la piel protegida del sol de individuos significativamente más jóvenes (por ejemplo por debajo de 40 años) . Sería más preferible que se aplicaran retinoides a las personas de edad una o dos veces diario para mantener un régimen terapéutico, aunque en la gente se puede aplicar menos frecuentemente, pero preferiblemente en una base regular (por ejemplo, un día sí, un día no, o dos veces por semana) . También puede ser deseable que la piel sea ocluida de -las inclemencias del ambiente, particularmente fuentes de luz UV, detergentes y otros químicos potentes, y similares. Por consiguiente, sería benéfico mencionar a la composición con retinoide un filtro solar UV, un antioxidante y similares . La estimulación de la producción del procolágeno es un factor importante para obtener la integridad de la piel cronológicamente envejecida. La piel envejecida es delgada y frágil debida en parte, al contenido reducido de colágeno y la armonización de fibras de colágeno reducido. Se espera que la estimulación de la síntesis de procolágeno por retinoides y su conversión subsecuente al colágeno, reduzca la fragilidad, aumento en espesor, y mejore la apariencia de la piel envejecida. Por consiguiente, esta invención proporciona métodos para aumentar las concentraciones de procolágeno, tanto intra como extracelularmente, y también para mejorar las concentraciones de colágenos, todas en la piel cronológicamente envejecida. Adicionalmente, como se muestra aquí, los niveles de MMP aumentan en la piel envejecida en comparación con aquellos encontrados en la piel de personas mayores. La producción mejorada de procolágeno se vería frustrada si el colágeno resultante fuera degradado en la piel, y por eso el tratamiento de la piel envejecida tanto con un retinoide como un inhibidor de MMP es importante para lograr los beneficios deseados de la biosíntesis mejorada de procolágeno. De hecho, se ha encontrado que en una piel que no tiene un nivel reducido de colágeno, el tratamiento con un retinoide no eleva los niveles de colágeno por encima de lo normal; por lo tanto, la invención muestra que la aplicación de un retinoide puede restaurar los niveles de colágeno a su valor de línea de base deseada. De este modo, el tratamiento inventivo con un retinoide aumenta tanto la producción de fibroblastos como la de (pro) colágeno e interfiere con las actividades de la MMP que provocan el adelgazamiento de la epidermis . Aunque el retinol es el compuesto preferido para la administración tópica, los derivados efectivos de retinol que se espera que sean útiles para practicar esta invención incluyen retinal, ácido retinoico (incluyendo todos los isómeros trans, 9-cis, y 13-cis) y derivados del mismo (como ácido 7 , 8-didehidroretinoico) , y otros como se describen por Kligman et al., referido anteriormente, cuya descripción se incorpora aquí por referencia, incluyendo sales, esteres reversibles y esteres de estos cosméticamente aceptables, conjugados de estos y mezclas de los mismos. Las composiciones descritas aquí formuladas en una base comercial pueden incluir varios colorantes convencionales, fragancias, espesantes (como goma de xantano), conservadores, humectantes, emolientes, emulsificadores, tensioactivos, dispersantes, mejorados de penetración, y similares se pueden adicionar para proporcionar beneficios adicionales y mejorar la textura y/o apariencia de la preparación tópica. De igual manera, la composición se puede formular como crema, loción, ungüento, jabón o loción corporal, champú, o una mascarilla. La descripción anterior y los siguientes métodos pretenden ser ilustrativos de la invención y no limitantes.

Varios cambios, modificaciones y adiciones pueden ser obvias para aquellos expertos en la técnica al leer cuidadosamente esta especificación, y se pretende que estén dentro del alcance y espíritu de la invención como se definen por las reivindicaciones . Métodos Utilizados en los Ejemplos Las referencias hechas en esta sección se incorporan aquí por referencia. Histología y morfometría. El duplicado de las biopsias con una perforación de 4-mm se obtuvieron de la piel de la nalga de cada individuo. Piezas de tejido fijas con formalina se seccionaron, tiñeron con hematoxilina y eosina, se alearon y se segaron. Las secciones se examinaron utilizando un microscopio Olympus BX40 junto con una cámara de alta resolución Sony DCX-151. Las áreas bloqueadas de 200 µm en un lado se aislaron utilizando un NIH Imager software y la altura epidérmica se evalúo en cuatro lugares (25 µm de separación) en cada una de las dos áreas. Las mismas dos áreas bloqueadas se utilizaron para la cuenta de células epiteliales. El número de núcleos de células intersticiales (es decir, núcleos debajo de la unión clermo-epidémica no asociados con los capilares) en toda la sección histológica se determinó como una medida de celularidad dérmica. Las mismas secciones segadas se clasificaron para separaciones de fibra de tejido colectivo, espesor, grado de desorganización y profundidad de desorganización, usando una escala de 1-9 para cada parámetro. Preparación de sobrenadantes de piel para análisis bioquímicos . Las muestras de piel se molieron en un mortero con nitrógeno líquido, y se homogeneizaron en un moledor de tejido Dounce un amortiguador de PH que contenía 10 M Hepes, 1 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 50 mM glicerofosfato, 5 M NaV04, 2 mM DTT, 0.5 PMSF, un 10 µg/ml aprotinina, 10 µg/ml leupeptina, y 10 µg/ml pepstatina, y 0.5% NP-40. Los homogenados se centrifugaron a 14,000 g por 15 minutos, y los sobrenadantes se recolectaron y se usaron para las determinaciones bioquímicas como se describe aquí. Crecimiento de Células ex vivo . Las biopsias se cortaron para formar fragmentos pequeños (aproximadamente 15 fragmentos por pieza de tejido) y los fragmentos de tejido se transfirieron a matraces de plástico de cultivo de célula. El medio de cultivo consistió de un Medio Esencial Mínimo Modificado Dulbeco de Eagle con sales de Earle, aminoácidos no esenciales y 10% de suero fetal de bovino. Los fragmentos de tejido se incubaron a 37°C y 5% de C02/95% de aire hasta un mes. Cada fragmento se evalúo para saber si los queratinositos y/o los fibroblastos crecieron fuera del tejido y a partir de esto, se determinó el porcentaje de fragmentos de los cuales los queratinocitos y los fibroblastos fueron aislados de acuerdo con el método de Varani, J. et al . , J. Cl in . Inves t . , 96, 1747-1756 (1994). Ensayo de matriz de metaloproteinasa . Las piezas de tejido se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la biopsia, se homogeneizaron en 20 mM Tris HCl (pH 7.6) mas 5 mM CaCl2 y se centrifugaron a 3000 x g durante 10 minutos para remover las partículas. La habilidad para liberar los fragmentos radioactivos solubles del colágeno Tipo I fibrilar etiquetado 3H (descrito por Fisher, G.J., et al . , Na ture, 379. 335-339 (1996) y Hu, C-L et al . , Ana ly t ic . Bi ochem , 88, 638-643 (1978)), se utilizó como medida de actividad colagenolítica . Los extractos de tejido se incubaron durante 3 horas con 1 mM de acetato mercúrico de aminofenilo (APMA) para convertir la forma inactiva de la matriz de metaloproteinasa en su forma activa. Subsecuentemente, se incubó un sustrato de colágeno de 0.2 µCi de (NEN-DuPont, Boston, MA) durante 24 horas con 50 µl de extracto de tejido. Al final del periodo de incubación de 24 horas, las muestras se centrifugaron a 12,000 x g durante 10 minutos para formar granulos de la proteína intacta. La radioactividad restante en el fluido sobrenadante se midió y a partir de esto, se determinó el porcentaje de sustrato hidrolizado. La zimografía de gelatina (Varani et al . , op . cit.) se utilizó para evaluar la actividad de la MMP-2 (gelatinasa 72-kD; gelatinasa A) y la actividad de la MMP9 (gelatinasa 92-kD; gelatinasa B) . Los extractos de tejido sufrieron electroforesis en un gel de poliacrilamida SDS al 8.5% conteniendo 1 mg/ml de gelatina. Después de la electroforesis, el SDS fue removido por tres lavados secuenciales en 1% de Tritón X-100. Los primeros dos lavados fueron durante 20 minutos cada uno y el último fue durante la noche. La cuantificación del ancho de la zona de hidrólisis se hizo por una densitometría por láser. Ensayos de actividad y de fosforilación de ERK. La ERK1 y ERK2 en los sobrenadantes de piel se inmunoprecipitaron con anticuerpos de la Santa Cruz Biotechnology Inc. y se ensayaron para evaluar la actividad enzimática usando proteína básica de mielina como sustrato, como se describió por J.D. Weber et al . ("la activación sostenida de la cinasa I (ERK1) regulada por una señal extracelular se requiere para la expresión continuada de la ciclina Di en la fase Gl," Biochem , J. , 326:61-68 (1997)) . Los ERKl y ERK2 fosforilados y totales en los sobrenadantes se determinaron por el análisis Western, usando anticuerpos de los New England Biolabs Inc. (Beverly, MA) . Ensayo de actividad de cinasa c-Jun. La actividad de la c-Jun en los sobrenadantes se determinó por los ensayos de cinasa de fase sólida (como se describió, por ejemplo, por M. Hibi et al., "Identification of an oncoprotein and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain" Genes Dev. , 7. - 2135-21 48 (1 993) ) . Análisis Northen de ARN. El ARN total (por ejemplo, para la c-Jun, procolágeno al(III)) fue aislado de la muestra de piel mediante la lisis de hidrocloruro de guanidinio y la ultracentrifugación (como se describió por G.J. Fisher et al., "Cellular, Immunologic and Biochemical Characterization of topical retinoic acid-trated human skin", J. Inves tig. Derma tol . , 96:699-707 (1991)). Análisis Northern del ARN total (40 µg/ruta) con probetas de ADNc etiquetadas aleatoriamente con la prima 3 P para el ARNm a ser determinado fueron realizados como se describió por G.J. Fisher et al., (en "All trans retinoic acid induces cellular retinol-binding protein in human skin in vivo", J. Inves tig . Derma tol . , 105-80-86 (1995) ) . El ARNm de procolágeno Tipo III se determinó utilizando una reacción de cadena de polimerasa transcriptasa inversa . Análisis Western de proteínas. Las proteínas Jun, la ciclina D2 (ambos anticuerpo de la Santa Cruz Biotechnology Inc.), y el c-Jun fosforilado (anticuerpo de New England Biolabs Inc.) fueron detectados en extractos nucleares de la piel humana mediante el análisis huésped como se describió por G.J. Ficher et al. (en "Immunological identification and fuctional quantitation of retinoic acid and retinoid X receptor proteins in human skin" J. Biol . Chem, 269:20629-20635 (1994)). Las proteínas inmunoreactivas se visualizaron por una detección de quimioflorecencias mejorada y cuantificada por densitometría por láser, o por la detección de la quimiofluorescencia mejorada y cuantificada por un Storm imager (Molecular Dynamics, Palo Alto, CA) .

Claims (25)

1. REI INDICACIONES 1. Un método para rejuvenecer piel cronológicamente envejecida, caracterizado porque comprende la aplicación de una cantidad no tóxica efectiva de por lo menos un ingrediente activo que inhibe las MMPs y promueve la síntesis de procolágeno.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ingrediente activo es un retinoide que tanto inhibe las MMPs como promueve la síntesis de procolágeno.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el retinoide se selecciona de retinol, retinal, ácido retinoico, una sal de ácido retinoico, un derivado o análogo de estos o una mezcla de los mismos .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el retinoide es un retinol o un ácido retinoico .
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la piel es piel protegida del sol.
6. 6 . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor MMP se selecciona de aspirina, E5510, glucocorticoides, Vitamina D3, GI12947, TIMPs, hidroxa atos y derivados de hidroxiurea, y tetraciclina y derivados de estas y las diversas sales de las mismas .
7. 7. Un método para mejorar la proliferación de queratinocit s y/o fibroblastos en una piel cronológicamente envejecida, caracterizado porque comprende la aplicación de una cantidad no tóxica efectiva de un retinoide sobre la piel .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la piel está protegida del sol.
9. 9. Un método para prevenir el envejecimiento cronológico de la piel, caracterizado porque comprende proporcionar una cantidad no tóxica tópicamente administrable de un retinoide en un vehículo cosméticamente adecuado y aplicando dicho retinoide sobre la piel por lo menos una vez a la semana en una cantidad efectiva para normalizar la síntesis de procolágeno e inhibir la degradación de colágeno.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la piel es piel protegida del sol.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el retinoide se selecciona de retinol, retinal, ácido retinoico y sal de ácido retinoico, un derivado o análogo de estos, o una mezcla de los mismos.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el retinoide es retinol.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el retinoide se aplica diariamente.
14. 14. Un método para normalizar la producción de procolágeno en la piel cronológicamente envejecida, caracterizado porque comprende los pasos de proporcionar un retinoide no tóxico tópicamente administrable y administrar dicho retinoide sobre la piel en una cantidad efectiva para normalizar la producción de procolágeno.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el retinoide es retinol.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el retinoide se aplica en una base regular .
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el retinoide se aplica diariamente.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende el paso de simultáneamente inhibir la degradación de colágeno, el método además comprende los pasos de proporcionar una cantidad no tóxica tópicamente administrable de un inhibidor MMP y administrar una cantidad efectiva para inhibir MMP sobre la piel cronológicamente envejecida en una base regular.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el inhibidor MMP se selecciona de aspirina, E5510, glucocorticoides, vitamina D3, GI12947, TIMPs, hidroxamatos y derivados de hidroxiurea y tetraciclina y derivados de estos y las diversas sales de estos, y mezclas compatibles de los mismos .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el retinoide y el inhibidor MMP están presentes en una sola formulación tópicamente administrada .
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la piel cronológicamente envejecida es piel protegida del sol.
22. 22. Un método para mejorar el nivel de actividad del ERK en la piel humana envejecida caracterizado porque comprende la aplicación tópica de una cantidad no tóxica efectiva de un retinoide sobre la piel.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el retinoide es retinoide o ácido retinoico .
24. 24. El método para reducir el nivel de proteína c-Jun y/o la actividad de la cinasa cJUN en la piel humana envejecida caracterizado porque comprende la aplicación tópica de una cantidad no tóxica efectiva de un retinoide sobre dicha piel.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el retinoide es retinoide o ácido retinoico.