MXPA99005693A - Preparado vacunal para la inmuno-castracion reversible de mamiferos - Google Patents

Abstract

La presente invención esta relacionada con el campo de la Ingeniería y la Biotecnología y en particular con el uso de un péptido derivado de la GnRH para la inmunocastración de mamíferos;en mamíferos, se ha ensayado la vacunación con la hormona liberadora de la gonodatropina (GnRH, siglas en ingles), con el fin de provocar una respuesta inmune que neutralice la actividad de dicha hormona. La presente invención se refiere al uso de una variante de la GnRH de mamíferos que presenta un cambio de un residuo glicina por un residuo prolina en la posición 6:Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Pro-Leu-Arg-Pro-Gly. Este cambio ha mostrado inducir una respuesta inmune superior a la de la GnRH natural, cuando ambas están acopladas a una misma proteína portadora, en experimentos realizados en cerdos;este mismo resultado es de esperar en cualquier otro mamífero ya que esta hormona es conservada en todas las especies.

Description

PREPARADO VACUNAL PARA LA INMUNO-CASTRACIÓN REVERSIBLE DE MAMÍFEROS SECTOR TÉCNICO La presente invención está relacionada con el campo de la Ingeniería Genética y la Biotecnología y en particular con el uso de un péptido derivado de la GnRH para la inmunocastración de mamífero.

TÉCNICA ANTERIOF En animales domésticos, como pera gatos, cerdos y vacunos, es frecuente la conveniencia de prevenir la reprc cción. Los métodos más frecuentemente usados son la castración y la adp listración de esteroides. Ambos métodos tienen inconvenientes, el primero requiere de personal especializado para llevarse a cabo y es irreversible y el segundo provoca efectos secundarios. Por estas razones se ha ensayado la inmuno-castración de animales con el uso de péptidos análogos a la GnRH conjugados con proteínas, con el objetivo de levantar anticuerpo que neutralicen la función de la GnRH.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN La secuencia aminoacídica de GnRH de gran número de especies es conocida. Todas las secuencias de mamíferos reportadas hasta hoy representan la siguiente secuencia aminoacídica: PGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-LeuArg-Pro-Gly Por lo que ésta es referida en la literatura como la GnRH de mamíferos. En la mayoría de las secuencias conocidas incluyendo secuencias de aves, peces y reptiles, en la posición 6 =e encuentran un residuo aminoacídico glicina. La glicina es el menor de DS aminoácidos y provoca flexibilidad en la cadena polipeptídica. La substitu ón de glicina por prolina, un residuo que confiere rigidez, puede influir en t aumento de la respuesta inmume. Además este cambio provocaría que este oéptido resulte ajeno para el sistema inmune, estimulando la producción de an uerpos. La producción de anticuerpo contra la GuRH se logra conjugando la GnRH a una proteína portadora apropiada. Esta conjugación se puede realizar por métodos químicos o de Ingeniería Genética. En nuestros casos hemos seleccionado para la conjugación dos proteínas portadoras ampliamente usadas con estos fines, la proteína BSA y un epítope del toxoide del tétanos. La BSA se conjuga por un método químico conocido, el epítope del toxoide del tétanos y las variantes de GnRH se sintetizan en un solo péptido utilizando dos residuos glicina como separadores. En este caso se utiliza la síntesis química por que el tamaño del péptido así lo permite, en caso de que la proteína portadora fuera de gran tamaño ia vía más factible sería por Ingeniería Genética, insertando las variantes de la GnRH parte de su secuencia aminoacídica. Este procedimiento es posible hacerlo prácticamente con cualquier proteína, de aquí que sea necesario que la presente invención quede protegida contra cualquier proteína que pueda incluir la secuencia de péptido en cuestión, ya sea obtenida por síntesis química o por manipulación genética.

NOVEDAD Y VENTAJAS DE LA SOLUCIÓN PROPUESTA Anteriormente se han introducido c? Tibios en la posición 6 de la GnRh introduciendo D-aminoácidos y compues, :>s análogos a aminoácidos (Rivier y otros, U.S. Patent 4,215,038, Vale, Jr. y tros, US Patent 4,410,514). La novedad de esta invención consiste en la substitución del aminoácido glicina en la sexta posición de la GnRH por un L-aminoácido prolina, o sea un aminoácido que se encuentra de forma natural en las proteínas. Esta variante ha demostrado ser más efectiva que la GnRH natural cuando ambas están conjugadas a la misma proteína. El hecho de introducir un aminoácido que ocurre de forma natural nos da además la posibilidad de incluir esta variante en construcciones genéticas, algo imposible en variantes que incluyan D-aminoácidos o compuestos análogos.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN EJEMPLO 1 Síntesis de los péptidos: Todos los péptidos fueron sintetizados utilizando la estrategia Boc- en fase sólida sobre la resina 4-metil-benzhidrilamina (resina MBHA de la casa comercial BACHEM, Suiza). Los aminoácidos protegidos fueron suministrados por BACHEM. La protección de los grupos reactivos de las cadenas laterales de los aminoácidos fue la siguiente: Arg (Tos), Asp (OBzl), Cys (4-MeBzl), Glu (OBzl), Lys (2-CI-Z), Trp (CHO), Tyr (Cl2-Bzl), Thr (Bzl) y Ser (Bzl). La Asn, la Gln y la Pro se utilizaron sin protección en las cadenas laterales. La síntesis se realizó siguiendo los pasos que se relacionan a continuación: Paso veces x min Lavados con diclormetano 1 x 1 Desprotección del grupo Boc- del 1 x 30 amino terminal Lavados con diclormetano 2 x 1 Lavados con 2-propanol 2 x 1 Lavados con diclormetano 2 x 1 Neutralización de los grupos aminos 3 x 2 Lavados con diclormetano 2 x 1 Reacción de acoplamiento 1 x 60 Lavados con N,N-dimetilformamida 2 x 1 Lavados con diclormetano 1 x 1 Se repiten los pasos hasta completar la secuencia Eliminación de las proteínas de las cadenas laterales y recuperación del péptido La desprotección del grupo protector Boc- se realizó en todos los casos con ácido trifluoroacético (TFA) al 37.5% en diclorometano (DCM). La neutralización de los aminos libres se llevó a cabo con N,N-etildiisopropilamina al 5% en DCM. Para la reacción de acoplamiento de cadena residuo se utilizó el método de activación con N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) in situ, a excepción de los aminoácidos Asn y Gln que fueron activados con DIC y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) en N,N-dimetilformamida (DMF). La eliminación de las protecciones de las cadenas laterales y la liberación del péptido de la resina se realizaron en un equipo especial para este fin. El procedimiento empleado fue el conocido como "Low-High" HF. En la primera parte del procedimiento (Low HF), el sistema péptido protegido-resina se trató con la mezcla HF (25%): DMS (65%): p-Cresol (10%) durante 120 min. a 0°C. En el caso de los péptidos con Trp en la secuencia, la mezcla se substituyó por HF (25%): DMS (60%): EDT (10%): p-Cresol (5%). Posterior a este tratamiento el péptido-resina se lavó con éter dietílico, diclorometano y 2-propanol varías veces y se secó al vacío. En la segunda parte (High HF), el péptido-resina se trató con la mezcla HF (90%): Anisol (10%) durante 60 min. a 0°C. El producto crudo se lavó con éter, se extrajo con una solución de ácido acético al 30% en agua y se liofilizó. Los péptidos se caracterizaron finalmente por RP-HPLC en una columna VYDAC C-18 (4.6 x 100) mm y por espectrometría de masas usando el FAB como método de ionización en un equipo JEOL HX-110HF. La purificación de los péptidos se realizó por el mismo procedimiento pero en una columna VYDAC C-18 preparativa. Los péptidos sintetizados fueron: a) QHWSYGLRPG, identificado como GnRH secuencia correspondiente a la hormona liberadora de gonadotropina, la cual es estructuralmente conservada en varias especies de mamíferos incluyendo al cerdo. b) QHWSYGLRPGGGQYIKANSKFIGITEL, identificado como GnRH-TT, donde la hormona liberadora de gonadotropina esta conjugada en el N-terminal a un epítope de la toxina del tétanos (residuos 830-844) (Panina-Bordingnon y otros, 1989) utilizando dos glicinas como separadores. c) QHWSYPLRPG, nuevo péptido análogo de la GnRH, identificado como GnRHml , donde la GnRH tiene un cambio en la posición número 6 del aminoácido glicina por una prolina. d) QHWSYPLRPGGGQYIKANSKFIGITEL, identificado como GnRHm1-TT. En este caso el péptido análogo GnRHml está conjugado en el N-terminal al mismo epítope y de igual forma que el péptido GnRH-TT. En la figura 2 se pueden observar los cromatogramas de los péptidos GnRH (figura 2a), GnRHml (figura 2b), GnRHTT (figura 2c) y GnRHmITT (figura 2d).

PREPARACIÓN DE LOS CONJUGADOS La conjugación de los péptidos a BSA se realizó por el siguiente protocolo: pesar igual cantidad de BSA (bovine serum albumin, Sigma) que de péptido (3 mg). Disolver la BSA en 0.5 mL de 0.1 M de Na2CO3 en tubo de ensayo. Disolver aparte los 3 mg de péptido en 0.5 mL de 0.1 M de Na2C03 en tubo de ensayo.

Añadir con agitación lenta y poco a poco 3 µL de Giutaraldehido al 25% (grado I, Sigma) a la BSA resuspendida y posteriormente el péptido resuspendido gota a gota. Llevar hasta 1.5 mL con 0.1 M de Na2CO3. - Mezclar con agitación lenta y protegido de la luz durante 12 horas a 25°C. Dializar contra PBS 1X durante 12 horas a 4°C. Llevar el volumen hasta 3 mL con PBS 1X. Repartir 1 mL (1 mg de péptido conjugado) para cada jeringuilla de 5 mL. Adicionar 1 mL de Adjuvante Completo de Freund (Sigma) en la primera inmunización y 1 mL Adjuvante Incompleto para la segunda. Mezclar con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. - Conservar el inmunógeno a 4°C hasta su empleo.

EJEMPLO 2 Formulación de la vacuna y vacunación Para la elaboración de las vacunas se empleo en cada caso 1 mg de péptido resuspendido en 1 mL de PBS 1X y emulsificado con 1 mL del Adjuante Completo de Freund (CFA). Un mg de los péptidos GnRH-TT y GnRHml -TT equivale a 0.4 mg de GnRH y GnRHml respectivamente. La emulsión agua en aceite estable se logró por agitación con el empleo de un agitador con impelente. En todos los casos los inmunógenos se prepararon momentos antes de la vacunación. La segunda vacunación realizada 8 semanas después de la primera tenía la misma composición pero esta vez emulsificada con Adjuvante Incompleto. Animales: un total de quince cerdos machos híbridos procedentes de carnadas diferentes fueron asignados al azar a cinco grupos de tres animales cada uno para el tratamiento que a continuación se describe. Vacunación: los cinco grupos fueron vacunados la primera vez entre las 11 y 12 semanas de nacidos y recibieron una revacunación 8 semanas más tarde. En ambas ocasiones cada animal fue inyectado intramuscularmente en el cuello con 2 mL de vacuna. Todos los animales fueron sacrificados 8 semanas después de la segunda inmunización. El primer grupo de animales fue vacunado solamente con PBS 1X y CFA y se utilizó como control negativo del experimento. Un segundo y tercer grupo se vacunaron con GnRH-BSA y con GnRH-TT respectivamente y se emplearon como controles positivos teniendo en cuenta que GnRH es la hormona endógena. Un cuarto y un quinto grupo fueron vacunados con el nuevo péptido GnRHml conjugado a BSA (GnRHml -BSA) y al epítope de la toxina del tétanos (GnRHml -TT) respectivamente. El esquema de vacunación duró cuatro meses (enero-abril de 1996).

EJEMPLO 3 Evaluaciones realizadas durante el esquema de vacunación Comenzando desde el día 0 y cada 4 semanas hasta momentos antes del sacrificio se realizó la medición de los testículos y se verificó el peso de cada animal. Al mismo tiempo se tomaron muestras de suero por punción del seno retro-orbital para la determinación de los testículos anti-GNRH. Además en la semana 16 se comprobó durante tres días el desarrollo de los reflejos primarios de la cópula: acercamiento, monta, erección y eyaculación. La estimulación de los verracos se realizó, en unos casos con una cerda en celo natural y en otros con una cerda a la cual se le indujo el celo con gonadotropina sérica. a) Cuadro 1. Medición de los testículos: nd- no determinado por imposibilidad de localizar el testículo. D e l - testículos derecho e izquierdo respectivamente. b) Cuadro 2. Peso corporal de los cerdos to nd- no determinado. c) Cuadro 3. Incremento del peso corporal de cada grupo durante el tiempo del experimento. d) Cuadro 4. Resultados de la comprobación del desarrollo de los reflejos primarios de la cópula en los cerdos inmunizados. a) reflejo de acercamiento: - B (bueno), - B(*), significa acercamiento agresivo, - R (regular), M (malo, significa que no hubo acercamiento, b) reflejo de monta: - b (bueno), significa buen reflejo, - R (regular), significa que el intento de monta fue pobre, - M (malo),' significa que no hubo monta.

EJEMPLO 4 Evaluaciones realizadas después del sacrificio. Después del sacrificio, los testículos extirpados y separados de los epidídimos fueron medidos y pesados, mientras que los epidídimos fueron solamente pesados. Dos muestras de tejido testicular y epididimal fueron fijadas para histología. Después de haber fijado la parte del medio de cada sección transversal y sagital de estos tejidos, se procedió a la inclusión en parafina y al corte de secciones de 5 µm de espesor. La tinción se realizó por el método de hematoxilina y eosina. a) Cuadro 5. Medición de los testículos y pesaje de los epidídimos y testículos.

De los resultados del cuadro anterior podemos calcular la relación peso de los testículos/peso del animal para cada testículo, obteniendo los siguientes valores y sus medias.

CUADRO 6 Relación peso de los testículos/peso del animal Al calcular las probabilidades asociadas al test de Student para cada par de grupo de valores obtenemos la siguiente matriz de probabilidades: CUADRO 7 Probabilidades asociadas al test de Student para los valores del cuadro 6 Nota: existe diferencia significativa cuando el valor de la probabilidad asociada es menor que 0.05. Observándose que no existen diferencias estadísticamente significativas entre el grupo placebo y las dos variantes de GnRH conjugada a la BSA. Por el contrario, entre cualquiera de estos tres grupos y los grupos conjugados al epítope de la toxina del tétanos si existen diferencias estadísticamente significativas. Y al comparar estos dos últimos grupos entre si encontramos también diferencias significativas, siendo la media de la variante GnRHml la mas pequeña entre todos los grupos y por lo tanto la que tiene un mayor efecto en la reducción del tamaño de los testículos. Los mismo hacemos para los epidídimos, obteniendo: CUADRO 8 Relación pesos de los epidídimos/peso del animal Al igual que el caso de los testículos obtenemos la siguiente matriz de probabilidades: CUADRO 9 Probabilidades asociadas al test de Student para los valores del cuadro 8 En el caso de los epídidimos se repite el mismo resultado que con los testículos. No existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos placebo y los grupos conjugados a BSA, pero si entre estos y los dos grupos conjugados al péptido de la toxina del tétanos y los dos grupos asociados a la toxina del tétanos presentan diferencias significativas entre si (ver figura 2), lo que implica que el cambio del residuo glicina. Como se puede observar los resultados obtenidos con los péptidos GnRH y GnRHml conjugados a BSA son muy similares a los obtenidos para el grupo control negativo o placebo. Esto pudiera explicarse teniendo en cuenta que la homología existente entre la albúmina bovina y la porcina es muy elevada (80%), por lo que ésta sería reconocida como propia por los cerdos. Al comparar el grupo GnRHml -TT con el placebo se observa una reducción en el peso del epidídimo de 2.3 veces, una reducción de 5.0 veces en el peso de los testículos, y una reducción total de 3.8 veces. Al comparar los resultados del grupo GnRH-TT con el placebo se observa una reducción en el peso del epidídimo de 1.6 veces, una reducción de 2.8 veces en el peso de los testículos, y una reducción total de 2.4 veces. A modo de conclusión podemos decir que estamos en presencia de un nuevo péptido análogo de GnRH el cual resulta ser entre 1.4 y 1.8 veces más efectivo que la propia hormona endógena estando ambos conjugados al epítope universal de la toxina tetánica.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : testículos de los grupos placebo (izquierda), GnRH-TT (centro) y GnRHml -TT (derecha). Es evidente el efecto producido en los dos grupos conjugados a la toxina del tétanos. Entre estos dos grupos también se puede observar un mayor efecto de la variante GnRHml -TT. Figura 2. Cromatogramas de los péptidos a) GnRH, b) GnRHml , c) GnRHTT y d) GnRHmITT. En todos los casos se utilizó una columan de fase reversa C18 VYDAC (4.6 x 100 mm) con un gradiente de 5-60% de acetonitrilo (0.05% de TFA) en agua (0.1 % de TFA) en 35 min. Los péptidos se detectaron a una longitud de onda de 226 nm.

LISTA DE SECUENCIAS (1 ) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA (B) DIRECCIÓN: Ave. 31 entre 158 y 190, Playa (C) CIUDAD: Ciudad de La Habana (D) PROVINCIA: Ciudad de La Habana (E) PAÍS: Cuba (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 10600 (G) TELEFONO: 53 7 218466 (H) TELEFAX: 53 7 218070/336008 (¡i) TITULO DE LA INVENCIÓN: PREPARADO VACUNAL PARA LA INMUNO-CASTRACIÓN REVERSIBLE DE MAMÍFEROS, (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 1 (iv) FORMA DE LECTURA COMPUTARIZADA: (A) TIPO DE MEDIO: Floppy disk (B) COMPUTADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (vi) DATOS DE SOLICITUD DE PRIORIDAD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: CU 120/96 (B) FECHA DE SOLICITUD: 17-DEC-1996 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LENGTH: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoacídica (C) CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídica (iii) HYPOTHETICA: NO (iv) ANIT-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Mutante de la hormona deliveradora de Gonadotropina. (C) AISLAMIENTO: Mamíferos (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO. 1 : pGlu His Trp Ser Tyr Pro Leu Arg Pro Gly 1 5 10

Claims (2)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una preparación de vacuna para la inmunocastración de mamíferos, que consta del péptido: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Pro-Leu-Arg-Pro-Gly en combinación con una proteína portadora.

2.- Una preparación de vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteína portadora es el epítope Th de toxoide del tétanos (residuos 830-844).