MXPA98009945A

MXPA98009945A - Metodos y composiciones utiles para la inhibicionde angiogenesis

Info

Publication number: MXPA98009945A
Application number: MXPA/A/1998/009945A
Authority: MX
Inventors: Brooks Peter; A Cheresh David
Original assignee: Brooks Peter; A Cheresh David; The Scripps Research Institute
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1998-11-27
Publication date: 1999-04-27

Abstract

La presente invención describe métodos para la inhibición de angiogénesis en tejidos usando antagonistas de alfavbeta3 vitronectina y particularmente para inhibir la angiogénesis en tejidos inflamados y en tejidos tumorales y metástasis usando composiciones terapéuticas que contienen antagonistas de alfavbet3.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES ÚTILES PARA LA INHIBICIÓN DE ANGIOGÉNESIS Campo -Cécn-Lco La presente invención se relaciona generalmente con el campo de la medicina, y se relaciona específicamente con métodos y composiciones para inhibir la angiogénesis de tejidos, que usan antagonistas del receptor avß3 de vitronectina. Antecedentes Las integrinas son una clase de receptores celulares de las que se sabe fijan proteínas de matriz extracelular, y por lo tanto median las interacciones de célula-célula y célula-matriz extracelular, a las que se hace referencia como eventos de adhesión. Sin embargo, aunque en la literatura se describen muchas integrinas y los ligandos que se fijan a una integrina, la función biológica de muchas de las integrinas permanece evasiva. Los receptores de integrina constituyen una familia de proteínas con caracteristicas estructurales compartidas de complejos de glucoproteinas heterodiméricos, no covalentes, formados de subunidades OÍ y ß. Ahora se sabe que el receptor de vitronectina, llamado por su característica original de fijación preferencial a la vitronectina, se refiere a tres integrinas diferentes, designadas vß., o¡vß3 y avß5. Horton, Int. J. Exp. Pathol., 71:741-759 (1990). avßi se fija a la fibronectina y a la vitronectina. c-vß3 se fija a una gran variedad de ligandos, incluyendo fibrina, fibrinógeno, laminina, trombospondina, vitronectina, factor de Willebrand, osteoespontina y sialoproteína I de hueso. o;vß5 se fija a la vitronectina. Los papeles de adhesión celular específicos que juegan estas tres integrinas en las muchas interacciones celulares en tejidos, todavía están bajo investigación, pero está claro que existen diferentes integrinas con funciones biológicas diferentes . Un sitio de reconocimiento importante en el ligando para muchas integrinas es la secuencia de tripéptido de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD) . El RGD se encuentra en todos los ligandos identificados anteriormente para las integrinas de receptor de vitronectina. Este sitio de reconocimiento de RGD se puede imitar mediante los polipéptidos ("péptidos") que contienen la secuencia RGD, y estos péptidos RGD son inhibidores conocidos de la función de la integrina. Es importante notar, sin embargo, que dependiendo de la secuencia y la estructura del péptido RGD, se puede alterar la especificidad de la inhibición para dirigirse a integrinas específicas. Para discusiones del sitio de reconocimiento RGD, ver Pierschbacher y colaboradores, Nature, 309:30-33 (1984), y Pierschbacher y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 81:5985-5988 (1984). También se han descrito diferentes polipép-tidos RGD de especificidad as la integrina variable, en Grant y Colaboradores, Cell, 58:933-943 (1989), Cheresh y colaboradores, Cell, 58:945-953 (1989), Aumailley y colaboradores, FEBS Letts. , 291:50-54 (1991), y Pfaff y colaboradores, J. Biol. Chem., 269:20233-20238 (1994), y en las patentes de los Estados Unidos 4,517,686, 4,578,079, 4,589,881, 4,614,517, 4,661,111, 4,792,525, 4,683,291, 4,879,237, 4,988,621, 5,041,380, y 5,061,693. La angiogénesis es un proceso de vascularización de tejido, que envuelve el crecimiento de vasos sanguíneos en desarrollo reciente entro de un tejido, y también se hace refe-rencia a ella como neovascularización. El proceso está mediado por la infiltración de células endoteliales y células de músculo liso. Se cree que el proceso procede en cualquiera de tres maneras: los vasos pueden brotar a partir de vasos existentes previamente, el desarrollo de-novo de vasos puede surgir de células precursoras (vasculogénesis) , o vasos pequeños existentes pueden agrandarse en diámetro. Blood y colaboradores, Bioch. Biophvs. Acta., 1032:89-118 (1990). Se sabe que las células endoteliales vasculares contienen cuando menos cinco integrinas dependientes de RGD, incluyendo el receptor (c.vß3 ó ?fvß5) de vitronectina, el receptor ( vßx) de colágeno Tipos I y IV, el receptor (o-aßx) de laminina, el receptor (oc3ß?) de fibronecti-na/laminina/colágeno y el receptor (o¡5ß?) de fibronectina. Davis y colaboradores, J. Cell. Biochem., 51:206-218 (1993). Se sabe que la célula de músculo liso contiene cuando menos seis integri-ñas dependientes de RGD, incluyendo Q-sßi, avß3 Y o^-ßs- La angiogénesis es un proceso importante en el crecimiento neonatal, pero también es importante en la curación de lesiones y en la patogénesis de una gran variedad de enfermedades clínicas, incluyendo inflamación de tejido, artritis, crecimiento de tumores, retinopatía diabética, degeneración macular y neovascularización de retina y condiciones similares. Se hace referencia a estas manifestaciones clínicas asociadas con la angiogénesis como enfermedades angiogénicas . Folkman y colaboradores, Science, 235:442-447 (1987) . La angiogénesis generalmen-te está ausente en tejidos adultos o maduros, aunque si ocurre en la curación de lesiones y en el ciclo de crecimiento del corpeus leuteum. Ver, por ejemplo, Moses y colaboradores, Science, 248:1408-1410 (1990) . Se ha propuesto que la inhibición de la angiogénesis sería una terapia útil para restringir el crecimiento de tumores. Se ha propuesto la inhibición de la angiogénesis mediante (1) la inhibición de la liberación de "moléculas angiogénicas" tales como bFGF (factor de crecimiento de fibroblasto básico) , (2) la neutralización de las moléculas angiogénicas, tal como mediante el uso de anticuerpos anti-ßbFGF, y (3) la inhibición de la respuesta de las células endoteliales a los estímulos angiogéni-cos . Esta última estrategia ha recibido atención, y Folkman y colaboradores, Cáncer Biolosy, 3:89-96 (1992), han descrito muchos inhibidores de respuesta de células endoteliales, inclu-yendo el inhibidor de colagenasa, los inhibidores de movimiento total de membrana básica, esteroides angioestáticos, inhibidores de angiogénesis derivados de hongos, factor 4 de plaquetas, trombospondina, fármacos para la artritis tales como D-penicila-mina y tiomalato dorado, análogos de vitamina D3, alfa-interfe-ron, y similares que se pueden usar para inhibir la angiogénesis. Para inhibidores propuestos adicionales, vea- Blood y colaboradores, Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses y colaboradores, Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber y colaboradores, Lab . Invest . , 59:44-51 (1988), y las patentes de los Estados Unidos 5,092,885, 5,112,946, 5,192,744, y 5,202,352. Ninguno de los inhibidores de angiogénesis descritos en las referencias anteriores están dirigidos a la inhibición de vß3. También se han descrito los péptidos que contienen RGD que inhiben al receptor ?ívß3 de vitronectina. Aumailley y colaboradores, FEBS Letts. , 291:50-54 (1991), Choi y colaboradores, J. Vasc. Surs. , 19:125-134 (1994), Smith y colaboradores, J. Biol. Chem., 265:12267-12271 (1990), y Pfaff y colaboradores, J. Biol. Chem., 269:20233-20238 (1994). Sin embargo, nunca se ha sugerido ni identificado el papel de la integrina avß3 en la angiogénesis, hasta la presente invención. Por ejemplo, Hammes y colaboradores, Nature Med. , 2:529-53 (1996) confirma los descubrimientos de la presente invención. Específicamente, el documento muestra que los péptidos cíclicos que incluyen RGDfv cíclico, la estructura y función de los últimos de los cuáles se ha descrito previamente en las solicitudes de prioridad en las cuáles se basa la presente solicitud, inhibieron la neovascularización retinal en un modelo de ratón de neovascularización retinal inducida por hipoxia. En un estudio separado que también apoya la presente invención, así como las solicitudes de prioridad, Luna y colaboradores, Lab. Invest . , 75:563-573 (1996) describieron dos péptidos que contienen RGD metilados cíclicos particulares, que fueron parcialmente efectivos al inhibir la neovascularización retinal en el modelo de ratón de retinopatía isquémica inducida por oxígeno. En contraste, los péptidos de la presente invención exhiben la inhibición casi completa de la neovascularización en los sistemas de los modelos descritos en la presente. La inhibición de la adhesión celular in vitro, usando anticuerpos monoclonales inmunoespecíficos para diferentes subunidades OÍ o ß de integrina, ha implicado avß3 en la adhesión celular de una diversidad de tipos de células, incluyendo células endoteliales microvasculares . Davis y colaboradores, J. Cell. Biol . , 51:206-218 (1993). En adición, Nicosia y colaboradores, Am. J. Pathol., 138:829-833 (1991), describieron el uso del péptido de RGD GRGDS para inhibir in vitro la formación de "microvasos" de aorta de rata cultivada en gel de colágeno. Sin embargo, la inhibición de la formación de "microvasos" in vitro en cultivos de gel de colágeno no es un modelo para la inhibición de la angiogénesis en un tejido, porque no se ha mostrado que las estructuras de los microvasos sean iguales que los brotes capila- res, ni que la formación de los microvasos en cultivo de gel de colágeno sea igual que el crecimiento neovascular dentro de un tejido intacto, tal como el tejido artrítico, el tejido tumoral o el tejido enfermo en donde es deseable la inhibición de la angiogénesis . Para que ocurra la angiogénesis, primero se deben degradar las células endoteliales y cruzar la membrana básica de los vasos sanguíneos de una manera similar a la que usan las células tumorales durante la invasión y la formación de la metástasis. Los inventores previamente han reportado que la angiogénesis depende de la interacción entre integrinas vasculares y proteínas de matriz extracelular. Brooks y colaboradores, Science, 264:569-571 (1994) . Por otra parte, se reportó que la muerte (apóptosis) celular programada de las células vasculares angiogénicas se inicia mediante la interacción, la cuál se inhibiría mediante ciertos antagonistas de la integrina avß3 vascular. Brooks y colaboradores, Cell, 79:1157-1164 (1994). Más recientemente, los inventores han reportado que la fijación de la metaloproteinasa-2 de matriz (MMP-2) al receptor de vitronectina (?ívß5) se puede inhibir usando los antagonistas de vß5, y mediante lo mismo inhibir la función enzimática de la proteinasa. Brooks y colaboradores, Cell, 85:683-693 (1996). Aparte de los estudios que se reportan en la presen-te, los Solicitantes no están informados de ninguna otra demos- tración de que la angiogénesis se pueda inhibir en el tejido usando inhibidores de adhesión celular. En particular, otros nunca han demostrado previamente que se requiera la función de o-vß3 para la angiogénesis en un tejido, o que los antagonistas de o-vß3 puedan inhibir la angiogénesis en un tejido. Breve Descripción de la Invención La declaración de la presente invención demuestra que la angiogénesis en tejidos requiere la integrina avß3, y que los inhibidores de avß3 pueden inhibir la angiogénesis. La declaración también demuestra que los antagonistas de otras integrinas, tales como o-IIbß3, o oívß1, no inhiben la angiogénesis, presumiblemente debido a que estas otras integrinas no son esenciales para que ocurra la angiogénesis. La invención, por lo tanto, describe métodos para la inhibición de la angiogénesis en un tejido, que comprende administrar al tejido una composición que comprende una cantidad inhibidora de la angiogénesis de un antagonista de avß3. El tejido que se va a tratar puede ser cualquier tejido en el que sea deseable la inhibición de la angiogénesis, tal como tejido enfermo en donde esté ocurriendo neovascularización. Los tejidos ejemplares incluyen tejido inflamado, tumores sólidos, metástasis, tejidos que estén sufriendo restenosis, y tejidos similares. Un antagonista de avß3 para usarse en los presentes métodos es capaz de fijarse a avß3, e inhibir competitivamente la habilidad de c_vß3 para fijarse a un ligando natural. De preferencia, el antagonista exhibe especificidad por vß3 sobre otras integrinas. En una modalidad particularmente preferida, el antagonista de vß3 inhibe la fijación de fibrinógenos u otros ligandos que contienen RGD a vß3, pero no inhibe sustancialmente la fijación del fibrinógeno a ?ívß3. Un antagonista preferido de avß3 puede ser un polipéptido de fusión, un polipéptido cíclico o lineal, un polipéptido derivatizado, un anticuerpo monoclonal que inmunorreaccione con avß3, un mimético orgánico de vß3 o un fragmento funcional de los mismos. Breve Descripción de los Dibujos En los dibujos que forman una porción de la declaración: Las Figuras 1A-1D ilustran la distribución de tejido de las subunidades de integrina, ß3 y ßx, en piel normal y en piel que está experimentando la curación de una herida, designada como tejido de granulación. Se realizó la inmunohistoquímica con anticuerpos para ß3 y l r como se describe en el Ejemplo 3A. Las Figuras ÍA y IB ilustran respectivamente la inmunorreactividad de anti-ß3 en piel normal y en tejido de granulación. Las Figuras 1C y ID ilustran respectivamente la inmunorreactividad de anti-ßi en piel normal y en tejido de granulación. Las Figuras 2A-2D ilustran la distribución de tejido del factor de Von illebrand y ligandos de laminina que se fijan respectivamente a las subunidades ß3 y ßx de integrina, en piel normal y en piel que está experimentando la curación de una herida, designada como tejido de granulación. Se realizó la inmunohistoquímica con anticuerpos para el factor de Von ille-brand (anti-vWF) y laminina (anti-laminina) como se describe en el Ejemplo 3B. Las Figuras 2A y 2B ilustran respectivamente la inmunorreactividad de anti-vWF en piel normal y en tejido de granulación. Las Figuras 2C y 2D ilustran respectivamente la inmunorreactividad de anti-laminina en piel normal y en tejido de granulación. Las Figuras 3A-3D ilustran la distribución de tejido del receptor de integrina de vitronectina, avß3, en biopsias de tejido de cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de pecho, y cáncer de pulmón, respectivamente. Se realizó la inmunohistoquímica con el anticuerpo LM609 contra avß3, como se describe en el Ejemplo 3C. La Figura 4 ilustra una fotomicrografía típica de una membrana corioalantoica de pollo de esta invención, desprovista de vasos sanguíneos, en un embrión de polluelo de 10 días de edad sin tratar. La preparación se describe en el Ejemplo 5B. Las Figuras 5A-5C ilustran la distribución del tejido de las integrinas ßx y avß3 en la preparación de membrana corioalantoica de pollo de esta invención. La Figura 5A muestra la distribución de la subunidad ßx en una preparación de membrana corioalantoica de pollo de 10 días de edad sin tratar, según se detectó mediante inmunorreactividad de inmunofluorescencia con CSAT, un anticuerpo anti-ß-. La Figura 5B muestra la distribución del receptor vß3 en una preparación de membrana corioalantoica de pollo de 10 días de edad sin tratar, según se detectó mediante inmunorreactividad de inmunofluorescencia con LM609, un anticuer-po anti-c-vß3. La Figura 5C muestra la distribución del receptor c-vß3 en una preparación de membrana corioalantoica de pollo de 10 días de edad, tratada con bFGF, según se detectó mediante inmunorreactividad de inmunofluorescencia con LM609, un anticuerpo anti-o-vß3. Los tratamientos y resultados se describen en el Ejemplo 5C. La Figura 6 ilustra la cuantificación en una gráfica de barras de la expresión relativa de avß3 y ßx en membranas corioalantoicas de pollo de 10 días de edad sin tratar y tratados con bFGF, como se describe en el Ejemplo 6. Se traza la intensi-dad de fluorescencia media en el eje Y, con los perfiles de integrinas trazados en el eje X. Las Figuras 7A-7C ilustran la apariencia de una membrana corioalantoica de pollo de 10 días de edad sin tratar, una membrana corioalantoica de pollo tratada con bFGF, y una membrana corioalantoica de pollo tratada con TNFo-, respectivamente, cuyos procedimientos y resultados se describen en el Ejemplo 6A. Las Figuras 8A-8E ilustran el efecto del tratamiento de anticuerpos local en la angiogénesis inducida por bFGF en una membrana corioalantoica de pollo de 10 días, como se describe en el Ejemplo 7A1) . La Figura 8A muestra una preparación de membrana corioalantoica de pollo sin tratar que está desprovisto de vasos sanguíneos. La Figura 8B muestra la infiltración de vasculatura nueva dentro de un área previamente desprovista de vasculatura, inducida por el tratamiento con bFGF. Las Figuras 8C, 8D y 8E respectivamente, muestran los efectos de los anticuerpos contra ßx (anti-ß-L,- CSAT) , avß5 (anti-c.vß5; P3G2) y vß3 (anti-avß3; LM609) . Las Figuras 9A-9C ilustran el efecto de la inyección intravenosa del péptido sintético 66203 sobre la angiogénesis inducida por tumores, como se describe en el Ejemplo 7E2) . La Figura 9A muestra la carencia de efecto inhibidor del tratamiento intravenoso con un péptido de control (tumor de péptido de control) sobre la angiogénesis que resulta de la inducción del tumor. En la Figura 9B se muestra la inhibición de tal angiogéne-sis mediante la inyección intravenosa del péptido 66203 (tumor RGD cíclico) . En la Figura 9 C se muestra la carencia de efectos inhibidores o citotoxicidad en vasos maduros existentes previamente, después de la infusión intravenosa del péptido 66203 en un área adyacente al área tratada del tumor (membrana corioalantoica de pollo adyacente al RGD cíclico) . Las Figuras 10A-10C ilustran el efecto de la aplicación intravenosa de anticuerpos monoclonales a la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento, como se describe en el Ejemplo 7B1) . La Figura 10A muestra la angiogénesis inducida por bFGF no expuesta a tratamiento con anticuerpos (control) . No resultó ninguna inhibición de la angiogénesis cuando se trató una preparación similar con el anticuerpo P3G2 anti- vß5, como se muestra en la Figura 10B. La inhibición de la angiogénesis resultó con el tratamiento del anticuerpo LM609 anti-?ívß3, como se muestra en la Figura 10 C. Las Figuras 11A-11C ilustran el efecto sobre la angiogénesis embriónica después de la aplicación local de anticuerpos anti-integrina, como se describe en el Ejemplo 7C. La angiogénesis no se inhibió mediante el tratamiento de una membra-na corioalantoica de pollo de 6 días con los anticuerpos anti-ß-L y anti-avß5, que se muestran respectivamente en las Figuras HA y 11B. En contraste, el tratamiento con el anticuerpo LM609 anti-o.vß3 dio como resultado la inhibición de la formación de vasos sanguíneos, como se muestra en la Figura 11C. La Figura 12 ilustra la cuantificación del número de vasos que entran en un tumor en una preparación de membrana corioalantoica de pollo, como se describe en el Ejemplo 7D1) . La gráfica muestra el número de vasos según se trazaron en el eje Y, que resultan de la aplicación local ya sea de CSAT (anti-ß-t) , LM609 (anti-avß3) o P3G2 (anti-avß5) . Las Figuras 13A-13D ilustran una comparación entre los pesos de los tumores húmedos 7 días después del tratamiento y los pesos iniciales de los tumores, como se describe en el ejemplo 9Al)a. Cada barra representa el promedio ± S.E. de 5-10 tumores por grupo. Los tumores se derivaron de preparaciones de membrana corioalantoica de pollo de melanoma humano (M21-L) (Figura 13A) , carcinoma pancreático (Fg) (Figura 13B) , carcinoma de pulmón (UCLAP-3) (Figura 13C) , y carcinoma laríngeo (HEp3) (Figura 13D) , y se trataron intravenosamente con PBS, CSAT (anti-ßx) , ó LM609 (anti-?ívß3) . Las gráficas muestran el peso del tumor, según se trazó en el eje Y, que resultó de la aplicación intravenosa de ya sea CSAT (anti-ß , LM609 (anti-avß3) o PBS, como se indica en el eje X. Las Figuras 14A y 14B ilustran las secciones histoló-gicas de los tumores tratados con el P3G2 (anti-o-vß5) (Figura 14A) y LM609 (anti-avß3) (Figura 14B) , y manchados con hematoxilina y eosina, como se describe en el Ejemplo 9Al)b. Como se muestra en la Figura 14A, los tumores tratados con el anticuerpo de control (P3G2) mostraron numerosas células tumorales viables y dividién-dose activamente, como se indica por las figuras mitóticas (cabezas de flecha) , así como mediante múltiples vasos sanguíneos (flechas) a lo largo del estroma tumoral. En contraste, se detectaron pocas, si alguna, células tumorales o vasos sanguíneos en los tumores tratados con LM609 (anti-avß3) en la Figura 14B. Las Figuras 15A-15E corresponden a tumores M21L tratados con péptidos, como se describe en el Ejemplo 9A2) y son como sigue: Figura 15A, péptido RAD cíclico de control (69601); Figura 15B, péptido RGD cíclico (66203); Figura 15C, tejido de membrana corioalantoica de pollo adyacente tomado de los mismos embriones tratados con péptido RGD cíclico (66203) y alta ampli- ficación (13x) de tumores tratados con el RAD de control (69601) en la Figura 15D o el péptido RGD cíclico (66203) en la Figura 15E. La Figura 15D ilustra los vasos normales del tumor tratado con el péptido (69601) de control RAD. La Figura 15E ilustra los ejemplos de los vasos sanguíneos rotos de tumores (flechas) tratados con el péptido RGD cíclico (66203) . Las Figuras 16A-16E representan la inhibición de angiogénesis mediante los antagonistas de angiogénesis en el ensayo modelo de ojo de conejo in vivo, como se describe en el Ejemplo 10. Las Figuras 16A y 16B ilustran la angiogénesis del ojo de conejo en la presencia de bFGF y mAb LM609 (anti-cevß3) . Las Figuras 16C, 16D y 16E ilustran la inhibición de angiogénesis del ojo de conejo en la presencia de bFG y mAb LM609 (anti-avß3) . La Figura 17 representa un diagrama de flujo de cómo se generó el modelo de ratón quimérico de ratón: humano in vivo, como se describe en el Ejemplo 11. Se reemplazó una porción de piel de un ratón SCID con prepucio neonatal humano, y se permitió que sanara durante 4 semanas. Después de que hubo sanado el injerto, se inoculó el prepucio humano con células tumorales humanas. Durante el siguiente período de 4 semanas, se estableció un tumor que se podía medir, el cuál comprendía un tumor humano con vasculatura humana creciendo desde la piel humana dentro del tumor humano. La Figura 18 ilustra el porcentaje de células indivi-duales derivadas de membranas corioalantoicas de pollo tratadas con mAb y tratados con péptido, y se mancharon con Apop Tag, según se determinó mediante análisis FACS y se describe en el Ejemplo 12. Las barras negras y punteadas representan células de embriones tratados 24 horas y 48 horas antes del ensayo, respec-tivamente. Cada barra representa el promedio ± S.E. de tres réplicas. Las membranas corioalantoicas de pollo se trataron con mAb LM609 (anti-arvß3) , o CSAT (anti-ß].) , o PBS. Las membranas corioalantoicas de pollo también se trataron con el péptido cíclico 66203 (ciclo-RGDfV, indicado como Péptido 203) o el péptido cíclico de control 69601 (ciclo-RADfV, indicado como Péptido 601) . Las Figuras 19A y 19B ilustran los resultados combinados de suspensiones de células individuales de membranas corioalantoicas de pollo de embriones tratados ya sea con CSAT (anti-ßj.) (Figura 19A) o LM609 (anti-avß3) (Figura 19B) , manchados con Apop Tag y yoduro de propidio, y se analizaron mediante FACS, como se describe en el Ejemplo 12C. El eje Y representa el manchado de Apop Tag en números de células (Apóptosis), el eje X representa el manchado de yoduro de propidio (contenido de ADN) . La línea horizontal representa la compuerta negativa para el manchado de Apop Tag. Los paneles izquierdo y derecho indican las células de membrana corioalantoica de pollo de embriones tratados con CSAT (anti-ß (Figura 19A) y LM609 (anti-avß3) (Figura 19B) , respectivamente. Se realizó el análisis de ciclo celular mediante el análisis de aproximadamente 8,000 eventos por condición.

Las Figuras 20A-20C representan el tejido de membrana corioalantoica de pollo de embriones tratados con CSAT , y las Figuras 20D-20F representan el tejido de membrana corioalantoica de pollo de embriones tratados con LM609 (anti-oívß3) preparados como se describió en el Ejemplo 12C. Las Figuras 20A y 20D ilustran tejidos manchados con Apop Tag y visualizados mediante fluorescencia (FITC) sobrepuesta en una imagen D.I.C. Las Figuras 20B y 20E ilustran los mismos tejidos manchados con mAb LM609 (anti-c_vß3) y visualizados mediante fluorescencia (rodamina) . Las Figuras 20C y 20F representan las imágenes combinadas de los mismos tejidos manchados tanto con Apop Tag como con LM609, en donde el manchado amarillo representa la co-localización. La barra representa 15 y 50 µm en los paneles izquierdo y derecho, respectivamente. La Figura 21 muestra el resultado de una inhibición del ensayo de unión celular con el péptido 85189, como se describe en el Ejemplo 4A. Se evaluaron los efectos del antagonista de péptido sobre un rango de dosis de .001 a 100 µM, según se trazó en el eje X. La unión celular se traza en el eje Y medido a una densidad óptica (O.D.) de 600 nm. Se midió la unión celular sobre superficies recubiertas con vitronectina- (líneas quebradas) contra laminina- (líneas llenas) . Las Figuras 22A y 22B muestran la secuencia consecutiva de ADNc de MMP-2 de pollo junto con la secuencia de aminoá-cidos deducida que se muestra en la segunda línea. La tercera y cuarta líneas respectivamente, muestran la secuencia de aminoácidos deducida de MMP-2 de humano y ratón, como se describe en el Ejemplo 4A. La secuencia de ADNc de pollo se enlista en la SEQ ID NO 29 junto con la secuencia de aminoácidos codificada que también se representa por separado como la SEQ ID NO 30. La numeración del primer nucleótido de la región 5 ' no trasladada y la región que codifica la secuencia de proenzimas que se muestra en la Figura 22A como un número negativo, está representada de hecho como el número 1 en el Listado de Secuencias, haciendo que la última parezca más larga que la figura; sin embargo, la secuencia de nucleótidos en la figura es idéntica en longitud y secuencia a aquella, como se presenta en el listado con la excepción de la numeración. De conformidad con lo anterior, las referencias a la posición de nucleótidos para MMP-2 de pollo y humano en la especificación, tal como en cebadores para usarse en la amplificación de fragmentos de MMP-2, se basan en la posición del nucleótido, como se indica en la figura, y no como se enlista en el Listado de Secuencias. La Figura 23 muestra los resultados en forma de gráfica de barras de un ensayo de fijación de receptor de fase sólida de MMP-2 tratada con yodo para fijarse a avß3, con y sin la presencia de inhibidores, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 4B. Los datos se trazan como CPM fijado en el eje Y contra los diferentes inhibidores potenciales y controles. La Figura 24 muestra la especificidad de composicio- nes de MMP-2 derivada de pollo para los receptores de integrina ya sea vß3 y IIBß3 en la presencia de inhibidores de MMP-2, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 4B. Los datos se presentan como se describe en la leyenda en la Figura 23. La Figura 25 muestra el efecto de la proteína de fusión GST de MMP-2 (410-637) de pollo sobre la angiogénesis inducida por bFGF, como se describe en el Ejemplo 7A3) . Las Figuras 25A-B y 25C-D respectivamente, muestran los efectos del control (un fragmento no MMP-2 que contiene proteína de fusión) y de la proteína de fusión GST del fragmento de MMP-2. Las Figuras 26 y 27 ilustran en forma de gráficas de barras el índice de angiogénesis (una medición de puntos de ramificación) de los efectos de la proteína de fusión GST (etiquetada CTMMP-2) de MMP-2 (410-637) de pollo contra el control (RAP-GST o GST-RAP) en membranas corioalantoicas de pollo tratadas con bFGF, como se describe en el Ejemplo 7A3) . El índice angiogénico está trazado en el eje Y contra los tratamientos separados en.el eje X. La Figura 28 muestra los efectos de péptidos y compuestos orgánicos sobre la angiogénesis inducida por bFGF, como se midió mediante el efecto sobre los puntos de ramificación trazados en el eje Y contra los diferentes tratamiento en el eje X, incluyendo bFGF solo, y membranas corioalantoicas de pollo tratadas con bFGF con los péptidos 69601 ó 66203 y los compuestos orgánicos 96112, 96113 y 96229, como se describe en los Ejemplos 7B y 14. La Figura 29 muestra gráficamente la respuesta a la dosis del péptido 85189 en la inhibición de angiogénesis inducida por bFGF como se describe adicionalmente en el Ejemplo 7B2), en donde el número de puntos de ramificación se trazan en el eje Y contra la cantidad de péptido administrado al embrión en el eje X. La Figura 30 muestra la actividad inhibidora de los péptidos 66203 (etiquetado 203) y 85189 (etiquetado 189) en la angiogénesis inducida por bFGF en el ensayo de membrana corioalantoica de pollo, como se describe en el Ejemplo 7B2) . Los controles no incluyeron ningún péptido en las membranas corioalantoicas de pollo tratadas con bFGF y el péptido 69601 (etiquetado 601) . Los datos están trazados como se describe en la leyenda de la Figura 27. Las Figuras 31A-L muestran el efecto de diferentes tratamientos contra las preparaciones de membrana corioalantoica de pollo no tratadas durante un curso de tiempo empezando en 24 horas y terminando en 72 horas, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 7B3) . En las Figuras 31A-C, 31D-F, 31G-I, y 31J-L se muestran las fotografías para las categorías etiquetadas no tratadas, bFGF, bFGF + MAID (tratadas con bFGF seguido con la exposición a la proteína de fusión GST de MMP-2(2-4) de pollo) y bFGF + control (tratamiento con bFGF seguido por MMP-2(10-1) de pollo), respectivamente.

Las Figuras 32, 33 y 34 respectivamente muestran la reducción en el peso del tumor para los tumores UCLAP-3, M21-L y FgM después de la exposición intravenosa al péptido 69601 de control y al antagonista 85189, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 9A. Los datos están trazados con el peso del tumor en el eje Y contra los tratamientos de péptidos en el eje X. La Figura 35 ilustra el efecto de los péptidos y los anticuerpos sobre el crecimiento tumoral el melanoma en el modelo ratón quimérico : humano, como se describe adicionalmerite en el Ejemplo 11B. Los péptidos evaluados incluyeron el control 69601 (etiquetado 601) y el antagonista 85189 (etiquetado 189) . El anticuerpo probado fue LM609. El volumen del tumor en milímetros cúbicos está trazado en el eje Y contra los diferentes tratamientos en el eje X. Las Figuras 36A y B respectivamente muestran el efecto del antagonista 85189 (etiquetado 189) comparado con el péptido 69601 de control (etiquetado 601) en la reducción del volumen y el peso húmedo de los tumores M21L sobre un rango de dosis de 10, 50 y 250 µg/inyección, como se describe adicional-mente en el Ejemplo 11C. Las Figuras 37A y 37B muestran la efectividad del péptido 85189 antagonista (etiquetado 189 con una línea sólida y círculos rellenos) contra el péptido 69601 de control (etiquetado 601 en una línea de puntos y cuadros abiertos) en la inhibición del volumen del tumor M21L en el modelo de ratón: humano con dos diferentes regímenes de tratamiento, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 11C. El volumen del tumor en milímetros cúbicos está trazado en el eje Y contra los días en el eje X. Las Figuras 38 a 42 ilustran esquemáticamente las diferentes síntesis químicas de los antagonistas de la molécula avß3 orgánica, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 13. Las Figuras 43 y 44 muestran los efectos de diferentes moléculas orgánicas sobre la angiogénesis inducida por bFGF en un ensayo de membrana corioalantoica de pollo, como se descri-be adicionalmente en el Ejemplo 14. Los puntos de ramificación están trazados en el eje Y contra los diferentes compuestos usados a 250 µg/mililitro en el eje X en la Figura 43, y 100 µg/mililitro en la Figura 44. Descripción Detallada de la Invención A. Definiciones Residuo de aminoácido: Un aminoácido formado después de la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces de péptido. Los residuos aminoácidos descritos en la presente están, de preferencia, en la forma isomérica "L" . Sin embargo, se pueden sustituir los residuos en la forma isomérica "D" por cualquier residuo aminoácido L, siempre y cuando el polipéptido retenga la propiedad funcional deseada. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el término amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el término carboxi de un polipéptido. En armonía c n la nomencla-tura de polipéptidos estándar (descrita en J. Biol . Chem. , 243:3552-59 (1969), y adoptada en 37 CFR §1.822 (b) (2)), en la siguiente Tabla de Correspondencia se muestran las abreviaturas para los residuos aminoácidos: Tabla de Correspondencias Sími 3?l? Aminoácido I-Letra 3-Letras Y Tyr tirosina G Gly glicina F Phe fenilalanina M Met metionina A Ala alanina S Ser serina I He isoleucina L Leu leucina T Thr treonina V Val valina P Pro prolina K Lys lisina H His histidina Q Gln glutamina E Glu ácido glutámico Z Glx Glu y/o Gln Trp triptóf no R Arg arginina D Asp ácido aspártico N Asn asparagina B Asx Asn y/o Asp C Cys cisteína X xaa desconocido/otro En adición, los siguientes tienen los significados a continuación : BOC tert-butiloxicarbonilo DCCI diciclohexilcarbodiimida DMF dimetilformamida OMe metoxi HOBt 1-hidroxibenzotriazol Se debe notar que todas las secuencias de residuos aminoácidos están representadas en la presente mediante las fórmulas cuya orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional de término amino a término carboxi. Por otra parte, se debe notar que un guión al principio o final de una secuencia de residuos aminoácidos indica un enlace péptido a otra secuencia de uno o más residuos aminoácidos. Polipéptido: se refiere a una serie lineal de residuos aminoácidos conectados unos a los otros mediante enlaces péptidos entre el grupo alfa-amino y el grupo carboxi de residuos aminoácidos contiguos . Péptido: como se usa en la presente, se refiere a una serie lineal de no más de aproximadamente 50 residuos aminoácidos conectados unos a los otros como en un polipéptido. Péptido Cíclico: se refiere a un compuesto que tiene una estructura de anillo de heteroátomo que incluye muchos enlaces de amida, como en un péptido típico. El péptido cíclico puede ser un polipéptido lineal ciclizado de "cabeza a cola" en el que un término n del péptido lineal ha formado un enlace de amida con el carboxilato terminal del péptido lineal, o éste puede contener una estructura de anillo en la que el polímero es homodético o heterodético, y comprende enlaces de amida y/u otros enlaces para cerrar el anillo, tal como puentes de disulfuro, tioésteres, tioamidas, guanidino, y enlaces similares. Proteína : se refiere a una serie lineal de más de 50 residuos aminoácidos conectados unos a los otros como en un polipéptido. Proteína de fusión: se refiere a un polipéptido que contiene cuando menos dos dominios de polipéptido diferentes, enlazados de manera operable mediante un enlace péptido típico ("fusionado"), en donde los dos dominios corresponden a péptidos que no se encuentran fusionados en la naturaleza. Péptido sintético: se refiere a una cadena de residuos aminoácidos producidos químicamente, enlazados juntos mediante enlaces péptidos, que está libre de proteínas naturalmente ocurrentes y fragmentos de las mismas. B. Consideraciones Generales La presente invención se relaciona generalmente con el descubrimiento de que la angiogénesis está mediada por el receptor específico de vitronectina ?ívß3, y de que la inhibición de la función de c-vß3 inhibe la angiogénesis. Este descubrimiento es importante debido al papel que juega la angiogénesis en una diversidad de procesos de enfermedades. Mediante la inhibición de la angiogénesis, uno puede intervenir en la enfermedad, aliviar los síntomas, y en algunos casos curar la enfermedad.

En donde el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos es la causa de, o contribuye a, la patología asociada con una enfermedad, la inhibición de la angiogénesis reducirá los efectos nocivos de la enfermedad. Los ejemplos incluyen artritis reuma-toide, retinopatía diabética, enfermedades inflamatorias, restenosis, y similares. En donde se requiere el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos para apoyar el crecimiento de un tejido nocivo, la inhibición de la angiogénesis reducirá el suministro de sangre al tejido y, mediante lo mismo, contribuirá a la reducción en la masa del tejido en base a los requerimientos de suministro de sangre. Los ejemplos incluyen el crecimiento de tumores en donde la neovascularización es un requerimiento continuo, con el objeto de que el tumor crezca más allá de unos pocos milímetros en grosor, y para el establecimiento de metástasis de tumor sólido. Los métodos de la presente invención son efectivos en parte debido a que la terapia es altamente selectiva para la angiogénesis y no otros procesos biológicos. Como se muestra en los Ejemplos, solamente el crecimiento de nuevos vasos contiene sustancial vß3, y por lo tanto, los métodos terapéuticos no afectan adversamente a los vasos maduros. Por otra parte, el vß3 no está ampliamente distribuido en tejidos normales, sino más bien se encuentra selectivamente en vasos nuevos asegurando, mediante lo mismo, que la terapia se puede dirigir selectivamente al crecimiento de vasos nuevos . El descubrimiento de que la inhibición de ?í-.ß3 sola inhibirá efectivamente la angiogénesis, permite el desarrollo de composiciones terapéuticas con potencialmente alta especificidad, y por lo tanto relativamente baja toxicidad. Por lo tanto, aunque la invención describe el uso de reactivos basados en péptidos, que tienen la habilidad de inhibir una o más integrinas, uno puede diseñar otros reactivos que inhiban más selectivamente a avß3 Y- P°r 1° tanto, no tengan el efecto secundario de inhibir otros procesos biológicos aparte de aquellos mediados por avß3. Por ejemplo, como se muestra mediante las presentes enseñanzas, es posible preparar anticuerpos monoclonales altamente selectivos para inmunorreacción con avß3, que son igualmente selectivos para la inhibición de la función de vß3. En adición, se pueden diseñar los péptidos que contienen RGD para que sean selectivos para la inhibición de o¡vß3, como se describe adicional-mente en la presente. Antes de los descubrimientos de la presente invención, no se sabía que la angiogénesis, y cualquiera de los procesos dependientes de la angiogénesis, se podían inhibir in vivo mediante el uso de reactivos que antagonizan la función biológica de ?fvß3. C. Métodos Para la Inhibición de la Angiogénesis La invención proporciona un método para la inhibición de la angiogénesis en un tejido, y por lo tanto, la inhibición de eventos en el tejido que dependen de la angiogénesis. Generalmen-te, el método comprende la administración al tejido de una composición que comprende una cantidad inhibidora de angiogénesis de un antagonista de avß3. Como se describió antes, la angiogénesis incluye una diversidad de procesos que envuelven la neovascularización de un tejido, incluyendo "germinación", vasculogénesis, o agrandamiento del vaso, procesos de angiogénesis que están mediados todos por, y dependen de la expresión de ?ívß3. Con la excepción de la curación de herida traumática, la formación de Corpus leuteum y la embriogénesis, se cree que la mayoría de los procesos de angiogénesis están asociados con procesos de enfermedades, y por lo tanto, el uso de los presentes métodos terapéuticos son selectivos para la enfermedad, y no tienen efectos secundarios dañinos . Existe una diversidad de enfermedades en las cuáles se cree que es importante la angiogénesis, a las que se hace referencia como enfermedades angiogénicas, incluyendo, pero no limitándose a, desórdenes inflamatorios tales como inflamación inmune y no inmune, reumatismo articular crónico y psoriasis, desórdenes asociados con la invasión inapropiada o inoportuna de vasos tales como retinopatía diabética, glaucoma neovascular, restenosis, proliferación capilar en placas arteroscleróticas y osteoporosis, y desórdenes asociados con cáncer, tales como tumores sólidos, metástasis de tumor sólido, angiofibromas, fibroplasia retrolental, hemangiomas, sarcoma de Kaposi y cánce-res similares que requiere la neovascularización para apoyar el crecimiento del tumor. Por lo tanto, los métodos que inhiben la angiogénesis en un tejido enfermo alivian los síntomas de la enfermedad y, dependiendo de la enfermedad, pueden contribuir a la cura de la enfermedad. En una modalidad, la invención contempla la inhibición de la angiogénesis, por sí misma, en un tejido. La extensión de la angiogénesis en un tejido, y por lo tanto la extensión de la inhibición conseguida mediante los presentes métodos, se puede evaluar mediante una diversidad de métodos, tales como los que se describen en los Ejemplos para detectar las estructuras de vasos inmaduros y nacientes vß3-inmunopositivas mediante inmunohisto-química. Como se describe en la presente, cualquiera de una diversidad de tejidos, u órganos formados por tejidos organiza-dos, puede soportar la angiogénesis en condiciones de enfermedad, incluyendo la piel, los músculos, los intestinos, el tejido conectivo, las articulaciones, los huesos y los tejidos similares en los que los vasos sanguíneos pueden invadir después de estímulos angiogénicos . Por lo tanto, en una modalidad relacionada, un tejido que se va a tratar es un tejido inflamado y la angiogénesis que se va a inhibir es angiogénesis de tejido inflamado, en donde hay neovascularización o tejido inflamado. En esta clase el método contempla la inhibición de la angiogénesis en tejidos artríticos, tal como en un paciente con reumatismo articular crónico, en tejidos inflamados inmunes o no inmunes, en tejido psoriático y similares . El paciente tratado en la presente invención en sus muchas modalidades es deseablemente un paciente humano, aunque se entenderá que los principios de la invención indican que la invención es efectiva con respecto a todos los mamíferos, los cuáles se pretende que estén incluidos en el término "paciente". En este contexto, se entiende que un mamífero incluye cualesquier especies mamíferas en las que es deseable el tratamiento de enfermedades asociadas con la angiogénesis, particularmente especies mamíferas agrícolas y domésticas. En otra modalidad relacionada, un tejido que se va a tratar es un tejido retinal de un paciente con una enfermedad retinal tal como retinopatía diabética, degeneración macular o glaucoma neovascular, y la angiogénesis que se va a inhibir es angiogénesis de tejido retinal en donde hay neovascularización de tejido retinal. En una modalidad relacionada adicional, un tejido que se va a tratar es un tejido tumoral de un paciente con un tumor sólido, una metástasis, un cáncer de piel, un cáncer de pecho, un hemangioma o angiofibroma y cánceres similares, y la angiogénesis que se va a inhibir es angiogénesis de tejido tumoral en donde hay una neovascularización de un tejido tumoral. Los tejidos tumorales sólidos típicos que se pueden tratar mediante los presentes métodos incluyen pulmón, páncreas, pecho, colon, laríngeo, ovárico, y tejidos similares. En los Ejemplos se describe la angiogénesis de tejido tumoral ejemplar, y la inhibición de la misma. La inhibición de la angiogénesis de tejido tumoral es una modalidad particularmente preferida debido al importante papel que juega la neovascularización en el crecimiento del tumor. En la ausencia de neovascularización de tejido tumoral, el tejido tumoral no obtiene los nutrientes requeridos, se retarda en crecimiento, cesa el crecimiento adicional, retrocede y finalmente se vuelve necrótico, dando como resultado la eliminación del tumor. Declarado en otras palabras, la presente invención proporciona un método de inhibición de la neovascularización tumoral, mediante la inhibición de la angiogénesis del tumor, de conformidad con los presente métodos. De manera similar, la invención proporciona un método de inhibición de crecimiento tumoral mediante la práctica de los métodos de inhibición de la angiogénesis . Los métodos también son particularmente efectivos contra la formación de la metástasis porque (1) su formación requiere la vascularización de un tumor primario, de tal manera que las células de cáncer metastásico puedan salir del tumor primario y (2) su establecimiento en un sitio secundario requiere la neovascularización para apoyar el crecimiento de la metásta-sis.

En una modalidad relacionada, la invención contempla la práctica del método en conjunción con otras terapias, tales como quimioterapia convencional dirigida contra tumores sólidos y para el control del establecimiento de la metástasis. La administración del inhibidor de angiogénesis típicamente se conduce durante o después de la quimioterapia, aunque se prefiere inhibir la angiogénesis después de un régimen de quimioterapia en momentos en los que el tejido tumoral esté respondiendo a la agresión tóxica, por medio de inducir que la angiogénesis se recupere mediante la provisión de un suministro de sangre y nutrientes al tejido tumoral. En adición, se prefiere administrar los métodos de inhibición de angiogénesis después de cirugía, en donde se hayan removido tumores sólidos como una profilaxis contra la metástasis. En tanto que los presentes métodos aplican a la inhibición de la neovascularización tumoral, los métodos también pueden aplicar a la inhibición del crecimiento del tejido tumo-ral, a la inhibición de la formación de metástasis tumoral, y a la regresión de tumores establecidos. Los Ejemplos demuestran la regresión de un tumor establecido después de una sola administración intravenosa de un antagonista de o¡vß3 de esta invención. La restenosis es un proceso de migración y proliferación de células de músculo liso (SMC) en el sitio de angioplastia coronaria transluminal percutánea que dificulta el éxito de la angioplastia. La migración y proliferación de las SMCs durante la restenosis se puede considerar un proceso de angiogénesis que se inhibe mediante los presentes métodos. Por lo tanto, la invención también contempla la inhibición de la restenosis por medio de la inhibición de la angiogénesis de conformidad con los presente métodos, en un paciente después de los procedimientos de la angioplastia. Para la inhibición de la restenosis, el antagonista de vß3 se administra típicamente después del procedimiento de angioplastia durante desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 28 días, y más típicamente durante aproximadamente los prime-ros 14 días después del procedimiento. El presente método para la inhibición de la angiogénesis en un tejido, y por lo tanto para también practicar los métodos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, comprende poner en contacto un tejido en el que esté ocurriendo la angiogénesis, o que esté en riesgo de ocurrir, con una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de vß3 capaz de inhibir la fijación de o-vß3 a su ligando natural. Por lo tanto, este método comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición fisiológicamente tolerable que contenga un antagonista de o.vß3 de la invención. Los rangos de dosis para la administración del antagonista de c-vß3 depende de la forma del antagonista, y su potencia, como se describe adicionalmente en la presente, y son cantidades lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado en el que se alivia la angiogénesis y los síntomas de la enfermedad mediados por la angiogénesis. La dosis no debe ser tan grande como para ocasionar efectos secundarios adversos, tales como síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, falla conges-tiva del corazón, y similares. Generalmente, la dosis variará con la edad, condición, sexo y grado de la enfermedad en el paciente, y uno de experiencia en la técnica la puede determinar. La dosis también la puede ajustar el médico individual en el caso de cualquier complicación. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad de antagonista de o¡vß3 suficiente para producir una inhibición de angiogénesis, que se pueda medir, en el tejido que se esté tratando, es decir, una cantidad inhibidora de la angiogénesis. La inhibición de la angiogénesis se puede medir in situ mediante inmunohistoquímica, como se describe en la presente, o mediante otros métodos conocidos para un experto en la técnica. En tanto que un antagonista de ocvß3 puede tomar la forma de un mimético de vß3, un péptido que contiene RGD, un anticuerpo monoclonal anti- vß3, o un fragmento de los mismos, se notará que la potencia, y por lo tanto una expresión de una cantidad "terapéuticamente efectiva" puede variar. Sin embargo, como se muestra mediante los presente métodos de ensayo, un experto en la técnica puede evaluar rápidamente la potencia de un antagonista de o;vß3 candidato de esta invención. La potencia de un antagonista de o¡vß3 se puede medir mediante una diversidad de medios, incluyendo la inhibición de la angiogénesis en el ensayo de membrana corioalantoica de pollo, en el ensayo de ojo de conejo in vivo, en el ensayo de ratón quimérico: humano in vivo, y mediante la medición de la inhibición de fijación del ligando natural a ?ívß3, todos como se describen en la presente, y ensayos similares. Un antagonista de vß3 preferido tiene la habilidad de inhibir sustancialmente la fijación de un ligando natural tal como un fibrinógeno o vitronectina a ?ívß3 en solución, a concen-traciones antagonistas de menos de 0.5 micromolares (µm) , de preferencia menos de 0.1 µm, y de más preferencia menos de 0.05 µm. Con "sustancialmente" se quiere decir que se observa cuando menos una reducción del 50 por ciento en la fijación del fibrinógeno, mediante la inhibición en la presencia del antagonista de ?ívß3, y en la presente se hace referencia a una inhibición al 50 por ciento como un valor IC50. Un antagonista de vß3 más preferido exhibe selectividad por avß3 sobre otras integrinas. Por lo tanto, un antagonista de c-vß3 preferido inhibe sustancialmente la fijación del fibrinó-geno a c-vß3, pero no inhibe sustancialmente la fijación del fibrinógeno a otra integrina tal como o-vßi, ?ívß5 ó ?íIIbß3. Particularmente preferido es un antagonista de oívß3 que exhibe una actividad IC50 de 10 veces a 100 veces más baja en la inhibición de la fijación del fibrinógeno a avß3 en comparación con la actividad IC50 en la inhibición de la fijación del fibrinógeno a otra integrina. En los Ejemplos se describen los ensayos ejemplares para medir la actividad IC50 en la inhibición de la fijación del fibrinógeno a una integrina. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un antago-nista de avß3 de esta invención, en la forma de un anticuerpo monoclonal, típicamente es una cantidad tal que cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable, es suficiente para conseguir una concentración de plasma de desde aproximadamente 0.01 microgramo (µg) por mililitro (ml) hasta aproximadamente 100 microgramos/mililitro, de preferencia desde aproximadamente 1 microgramo/mililitro hasta aproximadamente 5 microgramos/mililitro, y usualmente aproximadamente 5 microgramos/mililitro. Declarado de otra manera, la dosis puede variar desde aproximadamente 0.1 miligramo/kilogramo hasta aproximada-mente 300 miligramos/kilogramo, de preferencia desde aproximadamente 0.2 miligramos/kilogramo hasta aproximadamente 200 miligramos/kilogramo, de más preferencia desde aproximadamente 0.5 miligramos/kilogramo hasta aproximadamente 20 miligramos/kilogramo, en una o más administraciones de dosis diariamente, durante uno o muchos días. En donde el antagonista está en la forma de un fragmento de un anticuerpo monoclonal, la cantidad se puede ajustar rápidamente en base a la masa del fragmento con relación a la masa del anticuerpo total. Una concentración de plasma preferida en molaridad es desde aproximadamente 2 micromolares (µM) hasta aproximadamente 5 milimolares (mM) , y de preferencia aproximadamente 100 µM a 1 mM de antagonista de anticuerpo. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de avß3 de esta invención, en la forma de un polipéptido, u otro mimético de avß3 de molécula pequeña igualmente dimensionado, es típicamente una cantidad de polipéptido tal que cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable, es suficiente para conseguir una concentración de plasma de desde aproximadamente 0.1 microgramo (µg) por mililitro (ml) hasta aproximadamente 200 microgramos/mililitro, de preferencia desde aproximadamente 1 microgramo/mililitro hasta aproximadamente 150 microgramos/mililitro. En base a un polipéptido que tenga una masa de aproximadamente 500 gramos por mol, la concentración de plasma preferida en moralidad es desde aproximadamente 2 micromo-lares (µM) hasta aproximadamente 5 milimolares (mM) , y de preferencia aproximadamente 100 µM a 1 mM de antagonista de anticuerpo. Declarado de otra manera, la dosis por peso corporal puede variar desde aproximadamente 0.1 miligramo/kilogramo hasta aproximadamente 300 miligramos/kilogramo, y de preferencia desde aproximadamente 0.2 miligramos/kilogramo hasta aproximadamente 200 miligramos/kilogramo, en una o más administraciones de dosis diariamente, durante uno o muchos días. Los anticuerpos monoclonales o polipéptidos de la invención se pueden administrar parenteralmente mediante inyec-ción o mediante infusión gradual a través del tiempo. Aunque típicamente se puede tener acceso al tejido que se va a tratar en el cuerpo mediante administración sistémica, y por lo tanto, se pueden tratar más frecuentemente mediante la administración intravenosa de las composiciones terapéuticas, se contemplan otros tejidos y elementos de liberación en donde hay la probabilidad de que el tejido objetivo contenga la molécula objetivo. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales o polipéptidos de la invención se pueden administrar intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente, intracavidad, transdérmicamente, y se pueden liberar mediante elementos peristálticos . Las composiciones terapéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal o un polipéptido de esta invención se administran convencionalmente de manera intravenosa, como median-te la inyección de una dosis única, por ejemplo, El término "dosis única" cuando se usa con referencia a una composición terapéutica de la presente invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitaria para el sujeto, cada unidad conteniendo una cantidad determinada previa-mente de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el diluyente requerido; es decir, el portador, o vehículo. En una modalidad preferida, como se muestra en los Ejemplos, el antagonista de avß3 se administra en una sola dosis intravenosamente.

Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de dosis, y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La cantidad que se va a administrar y el tiempo dependen del sujeto que se vaya a tratar, la capacidad del sistema del sujeto para utilizar el ingrediente activo, y el grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo que se requiere para administrarse depende del juicio del especialista médico, y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, en la presente se describen los rangos de dosis adecuados para la aplicación sistémica, y dependen de la ruta de administración. Los regímenes adecuados para la administración también son variables, pero se tipifican mediante una administración inicial seguida por dosis repetidas a intervalos de una hora o más mediante una inyección subsecuente u otra administración. De manera alternativa, se contempla una infusión intravenosa continua suficiente para mantener las concentraciones en la sangre en los rangos especificados para las terapias in vivo . Como se demuestra mediante los presentes Ejemplos, la inhibición de la angiogénesis y la regresión de tumor ocurre tan pronto como 7 días después del contacto inicial con el antagonista. La exposición adicional o prolongada al antagonista es de preferencia durante 7 días a 6 semanas, de preferencia aproximadamente de 14 a 28 días. En una modalidad relacionada, los Ejemplos demuestran la relación entre la inhibición de vß3 y la inducción de apópto-sis en las células de neovasculatura que llevan avß3. Por lo tanto, la invención también contempla métodos para la inhibición de la apóptosis en la neovasculatura de un tejido. El método se practica sustancialmente como se describe en la presente, para la inhibición de la angiogénesis en todos los tejidos y condiciones descritas para el mismo. La única diferencia notable es una del tiempo de efecto, que es que la apóptosis se manifiesta rápidamente, típicamente aproximadamente 48 horas después de tener contacto con el antagonista, mientras que la inhibición de la angiogénesis y la regresión del tumor se manifiesta más lentamente, como se describe en la presente. Esta diferencia afecta el régimen terapéutico en términos de tiempo de administración, y efecto deseado. Típicamente, la administración para la apóptosis de la neovasculatura puede ser de 24 horas a aproximadamente 4 semanas, aunque se prefiere de 48 horas a 7 días. D. Composiciones Terapéuticas La presente invención contempla composiciones terapéuticas útiles para practicar los métodos terapéuticos descritos en la presente. Las composiciones terapéuticas de la presente invención contienen un portador fisiológicamente tolerable junto con un antagonista de oívß3 como se describe en la presente, disuelto o dispersado en las mismas como un ingrediente activo. En una modalidad preferida, la composición terapéutica de antago-nista de ?ívß3 no es inmunogénica cuando se administra a un paciente mamífero o humano para propósitos terapéuticos. Como se usa en la presente, los términos "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y las variaciones gramáticas de los mismos, puesto que se refieren a composi-ciones, portadores, diluyentes y reactivos, se usan intercambiablemente, y representan que los materiales son capaces de administración a o sobre un mamífero, sin la producción de efectos fisiológicos indeseables tales como nauseas, mareo, malestar gástrico y similares. La preparación de una composición farmacológica que contenga los ingredientes activos disueltos o dispersados en la misma es bien conocida en la técnica, y no se debe limitar en base a la formulación. Típicamente esas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones, sin embargo, también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución, o suspensiones, en líquido antes de usarse. La presentación también se puede emulsificar. El ingrediente activo se puede mezclar con excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo, y en cantidades adecuadas para usarse en los métodos terapéuticos descritos en la presente. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. En adición, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes reguladores del pH y similares, que mejoren la efectividad del ingrediente activo. La composición terapéutica de la presente invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componen-tes en la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales acidas de adición (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales que se forman con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares. Son particularmente preferidas las sales de TFA y HCl, cuando se usan en la preparación de antagonistas de polipéptido cíclico avß3 . En los Ejemplos se describen las sales representativas de los péptidos. Los portadores fisiológicamente tolerables son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de portadores líquidos son soluciones acuosas estériles que no contienen ningún material en adición a los ingredientes activos y agua, o contienen un regulador de pH tal como fosfato de sodio al valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tal como solución salina regulada con fosfato. Todavía además, los portadores acuosos pueden contener más de una sal de regulador del pH, así como sales tales como cloruros de sodio y de potasio, dextrosa, glicol de polietileno y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas en adición a, y para la exclusión de agua. Los ejemplos de esas fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón, y emulsiones de agua-aceite. Una composición terapéutica contiene una cantidad inhibidora de angiogénesis de un antagonista de o-vß3 de la presente invención, formulada típicamente para que contenga una cantidad de cuando menos 0.1 por ciento en peso de antagonista por peso de composición terapéutica total. Un porcentaje en peso es una proporción en peso de inhibidor a la composición total. Por lo tanto, por ejemplo, el 0.1 por ciento en peso es 0.1 gramo de inhibidor por 100 gramos de composición total. E . Antagonistas de la Integrina a-tß3 Los antagonistas de avß3 se usan en los presentes métodos para inhibir la angiogénesis en tejidos, y puede tomar una diversidad de formas que incluyen compuestos que interactúan con vß3 de una manera tal que se interfieren las interacciones funcionales con los ligandos naturales de avß3. Los antagonistas ejemplares incluyen análogos de o-vß3 derivados del sitio de fijación del ligando en vß3, miméticos ya sea de avß3 o de un ligando natural de o-vß3, que imitan la región estructural envuelta en las interacciones de fijación de avß3-ligando, polipéptidos que tienen una secuencia que corresponde a un dominio de fijación funcional del ligando natural específico para ?ívß3, que corresponde particularmente al dominio que contiene RGD de un ligando natural de avß3, y anticuerpos que inmunorreaccionan ya sea con avß3 o con el ligando natural, todos los cuáles exhiben la actividad antagonista como se define en la presente. 1. Polipéptidos En una modalidad, la invención contempla los antago-nistas de vß3 en la forma de polipéptidos. Un antagonista de polipéptido (péptido) ?ívß3 puede tener las características de secuencia ya sea del ligando natural de ?ívß3 o avß3 mismo en la región envuelta en la interacción de vß3-ligando, u exhibe actividad antagónica hacia vß3 como se describe en la presente. Un péptido antagonista de -xvß3 contiene el tripéptido RGD y corresponde en secuencia al ligando natural en la región que contiene RGD. Los polipéptidos que contienen RGD preferidos tienen una secuencia que corresponde a la secuencia de residuos aminoá-cidos de la región que contiene RGD de un ligando natural de ?ívß3 tal como fibrinógeno, vitronectina, factor de von Willebrand, laminina, trombospondina, y ligandos similares. La secuencia de estos ligandos de vß3 es bien conocida. Por lo tanto, el péptido antagonista de avß3 se puede derivar a partir de cualquiera de los ligandos naturales, aunque se prefieren el fibrinógeno y la vitronectina . Un péptido antagonista de o;vß3 particularmente preferido, inhibe preferencialmente la fijación de ?fvß3 a su(s) ligando (s) natural (es) cuando se compara con otras integrinas, como se describió anteriormente. Estos péptidos específicos para vß3 se prefieren particularmente cuando menos debido a que la especificidad por ?ívß3 reduce la incidencia de efectos secundarios indeseables tales como la inhibición de otras integrinas. La identificación de los péptidos antagonistas de avß3 que tienen selectividad por oívß3, se puede identificar rápidamente en un ensayo típico de inhibición de fijación, tal como el ensayo inmunosorbente enlazado con enzima descrito en los Ejemplos. Un polipéptido de la presente invención comprende típicamente no más de aproximadamente 100 residuos aminoácidos, de preferencia no más de aproximadamente 60 residuos, de más preferencia no más de aproximadamente 30 residuos. Los péptidos pueden ser lineales o cíclicos, aunque los péptidos particularmente preferidos son cíclicos. En donde el polipéptido es mayor de aproximadamente 100 residuos, éste típicamente se proporciona en la forma de una proteína de fusión o fragmento de proteína, como se describe en la presente. En la Tabla 1 en los Ejemplos se muestran los péptidos cíclicos y lineales preferidos y sus designaciones. Se debe entender que un polipéptido objeto no necesi- ta ser idéntico a la secuencia de residuos aminoácidos del ligando natural de o:vß3, siempre y cuando éste incluya la secuencia requerida y sea capaz de funcionar como un antagonista de avß3 en un ensayo tal como aquellos que se describen en la presente. Un polipéptido objeto incluye cualquier análogo fragmento o derivado químico de un polipéptido cuya secuencia de residuos aminoácidos se muestra en la presente, siempre y cuando el polipéptido sea un antagonista de ?ívß3- Por lo tanto, un polipéptido presente puede ser sujeto a diferentes cambios, sustituciones, inserciones, y supresiones, en donde tales cambios proporcionen ciertas ventajas en su uso. A este respecto, el polipéptido antagonista de avß3 de esta invención corresponde a, más bien que ser idéntico a, la secuencia de un péptido citado en donde se hacen uno o más cambios y éste retiene la habilidad de funcionar como un antagonista de c-vß3 en uno o más de los ensayos, como se describe en la presente. Por lo tanto, un polipéptido puede estar en cualquiera de una diversidad de formas de derivados de péptido, eso incluye amidas, conjugados con proteínas, péptidos cíclicos, péptidos polimerizados, análogos, fragmentos, péptidos químicamente modificados, y derivados similares. El término "análogo" incluye cualquier polipéptido que tenga una secuencia de residuos aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia que se muestra específicamente en la presente, en la que se han sustituido conservadoramente uno o más residuos con un residuo funcionalmente similar, y que despliega la actividad antagonista para vß3, como se describe en la presente. Los ejemplos de las sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrofílico) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina, por otro, o la sustitución de un residuo acídico, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, por otro . La frase "sustitución conservadora" también incluye el uso de un residuo químicamente derivatizado en lugar de un residuo no derivatizado, con la condición de que ese polipéptido despliegue la actividad de inhibición requerida. Un "derivado químico" se refiere a un polipéptido objeto que tiene uno o más residuos químicamente derivatizados mediante la reacción de un grupo lateral funcional . En adición a las derivaciones de grupo lateral, un derivado químico puede tener una o más modificaciones de la estructura base, incluyendo sustituciones a-amino tales como N-metilo, N-etilo, N-propilo y similares, y sustituciones a-carbonilo tales como tioéster, tioamida, guanidino y similares. Esas moléculas derivatizadas incluyen por ejemplo, aquellas moléculas en las que se han derivatizado los grupos amino libres para formar hidrocloruros de amina, grupos p-toluensulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo, o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres se pueden derivatizar para formar sales, esteres de metilo y etilo u otros tipos de esteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres se pueden derivatizar para formar derivados O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno de imidazol de histidina se puede derivatizar para formar N-imbencilhistidina. También incluidos como derivados químicos están aquellos péptidos que contienen uno o más derivados aminoácidos naturalmente ocurrentes de los veinte aminoácidos estándares. Por ejemplo: la 4-hidroxiprolina se puede sustituir por prolina; la 5-hidroxili-sina se puede sustituir por lisina; la 3-metilhistidina se puede sustituir por histidina; la homoserina se puede sustituir por serina; y la ornitina se puede sustituir por lisina. Los polipéptidos de la presente invención también incluyen cualquier polipéptido que tenga una o más adiciones y/o supresiones o residuos relativos a la secuencia de un polipéptido cuya secuencia se muestra en la presente, siempre y cuando se mantenga la actividad requerida. Un derivado particularmente preferido es un péptido cíclico de conformidad con la fórmula ciclo (Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal), abreviada c (RGDf-NMeV) , en el que hay un grupo c--amino sustituido con N-metilo en el residuo de valina del péptido, y la ciclización ha unido los términos amino primario y carboxi del péptido. El término "fragmento" se refiere a cualquier poli-péptido objeto que tenga una secuencia de residuos aminoácidos más corta que aquella de un polipéptido cuya secuencia de residuos aminoácidos se muestra en la presente. Cuando un polipéptido de la presente invención tiene una secuencia que no es idéntica a la secuencia de un ligando natural de avß3, esto se debe típicamente a que se han hecho una o más sustituciones conservadoras o no conservadoras, usualmente se sustituyen no más de aproximadamente 30 por ciento en número, y de preferencia no más de 10 por ciento en número de los residuos aminoácidos. También se pueden añadir residuos adicionales en cualquier término de un polipéptido, con el propósito de proporcionar un "enlazador" mediante el cuál se puedan fijar convenientemente los polipéptidos de esta invención a una etiqueta o matriz sólida, o portador. Posteriormente en la presente se describen las etiquetas, matrices sólidas y portadores que se pueden usar con los polipéptidos de esta invención. Los enlazadores de residuos aminoácidos usualmente son cuando menos un residuo y pueden ser 40 o más residuos, más frecuentemente de 1 a 10 residuos, pero no forman epítopos de ligando de avß3. Los residuos aminoácidos típicos que se usan para enlazar son tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico y aspártico, o similares. En adición, un polipéptido objeto puede diferir, a menos que se especifique de otra manera, de la secuencia natural de un ligando de avß3 mediante la modificación de la secuencia mediante la acilación de NH2 terminal, por ejemplo, acetilación, o amidación de ácido tioglicólico, mediante carboxi-lamidación terminal, por ejemplo, con amoníaco, metilamina, y modificaciones terminales similares. Las modificaciones terminales son útiles, como es bien sabido, para reducir la susceptibi-lidad por la digestión de proteinasa, y por lo tanto sirven para prolongar la vida media de los polipéptidos en las soluciones, particularmente los fluidos biológicos en donde pueden haber proteasas presentes. A este respecto, la ciclización del polipéptido también es una modificación terminal útil, y también se prefiere particularmente debido a las estructuras estables formadas mediante la ciclización, y en vista de las actividades biológicas observadas para esos péptidos cíclicos, como se describe en la presente. Se puede usar cualquier péptido de la presente invención en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los ácidos adecuados que son capaces de formar sales con os péptidos de la presente invención incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido trifluoroacético (TFA) , ácido clorhídrico (HCl) , ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico, ácido sulfónico de metano, ácido acético, ácido fosfórico acético, ácido propiónico, ácido glucólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido cinámico, ácido sulfónico de naftaleno, ácido sulfanílico, o similares. Se prefieren particularmente las sales de ácido clorhídrico y ácido trifluoroacético. Las bases adecuadas capaces de formar sales con los péptidos de la presente invención incluyen bases inorgánicas tales como hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, y similares; y las bases orgánicas tales como mono-, di-y tri-alquil y arilaminas (por ejemplo, trietilamina, diisopropi-lamina, metilamina, dimetilamina, y similares) y etanolaminas opcionalmente sustituidas (por ejemplo, etanolamina, dietanolamina y similares) . En adición, se puede preparar un péptido de esta invención como se describe en los Ejemplos, sin incluir una sal iónica libre en la que el ácido o los grupos base cargados presentes en los grupos laterales de residuos aminoácidos (por ejemplo, Arg, Asp, y similares) se asocien y neutralicen entre sí para formar un compuesto de "sal interna". Un péptido de la presente invención al que también se hace referencia en la presente como un polipéptido objeto, se puede sintetizar mediante cualquiera de las técnicas que son conocidas para aquellos expertos en la técnica de polipéptidos, incluyendo técnicas de ADN recombinante. Se prefieren las técnicas de química sintética, tal como una síntesis tipo Merrifield de fase sólida, por razones de pureza, especificidad antigénica, exención de productos laterales indeseables, facilidad de producción y similares. Se puede encontrar un compendio excelente de las muchas técnicas disponibles en Steward y colaboradores, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co . , San Francisco, 1969; Bodanszky, y colaboradores, "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, Segunda Edición, 1976; J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Volumen 2, página 46, Academic Press (Nueva York) , 1983; Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-96, 1969; Fields y colaboradores, Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214, 1990; y en la patente de los Estados Unidos No. 4,244,946 para la síntesis del péptido de fase sólida, y Schroder y colaboradores, "The Peptides", Volumen 1, Academic Press (Nueva York) , 1965 para la síntesis de solución clásica, cada uno de los cuales está incorporado a la presente como referencia. Los grupos protectores apropiados que se pueden usar en esas síntesis se describen en los textos anteriores y en J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Nueva York, 1973, que está incorporado a la presente como referencia. En general, los métodos de síntesis de fase sólida contemplados comprenden la adición secuencial de uno o más residuos aminoácidos, o residuos aminoácidos adecuadamente protegidos a una cadena de péptido en crecimiento. Normalmente, ya sea el grupo amino o carboxilo del primer residuo aminoácido se protege mediante un grupo protector adecuado, que se puede remover selectivamente. Se utiliza un grupo protector diferente, que se puede remover selectivamente para los aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo tal como lisina. Usando una síntesis de fase sólida como ejemplo, el aminoácido protegido o derivatizado se une a un soporte sólido inerte, a través de su grupo carboxilo o amino desprotegido. Después se remueve selectivamente el grupo protector del grupo amino o carboxilo, y se combina el siguiente aminoácido en la secuencia que tenga el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido, y se hace reaccionar bajo condiciones adecuadas para formar el enlace amida con el residuo ya unido al soporte sólido. Después se remueve el grupo protector del grupo amino o carboxilo de su residuo aminoácido recién añadido, y después se añade el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido) , y así sucesivamente. Después de que se han enlazado todos los aminoácidos deseados en la secuencia apropiada, y se remueven secuencial o concurrentemente los grupos protectores de los grupos terminales y laterales restantes, para producir el poli-péptido lineal final. Los polipéptidos lineales resultantes preparados por ejemplo, como se describió anteriormente, se pueden hacer reaccionar para formar sus péptidos cíclicos correspondientes. Zimmer y colaboradores, Peptides 1992, páginas 393-394, ESCOM Science Publishers, B.V., 1993 describen un método ejemplar para preparar un péptido cíclico. Típicamente, se disuelve el éster de metilo del péptido protegido por terbutoxicarbonilo en metanol, y se añade una solución de hidróxido de sodio, y se hace reaccionar la mezcla a 20°C (20C) para remover hidrolíticamente el grupo protector de éster de metilo. Después de evaporar el solvente, se extrae el péptido protegido por terbutoxicarbonilo, con acetato de etilo de solvente acuoso acidificado. Después se remueve el grupo protector terbutoxicarbonilo bajo condiciones ligeramente acídicas en cosolvente de dioxano. El péptido lineal desprotegido con términos amino y carboxi libres, así obtenido, se convierte a su péptido cíclico correspondiente mediante la reacción de una solución diluida de péptido lineal, en una mezcla de diclorometano y dimetilformamida, con diciclohexilcarbodiimida en la presencia de 1-hidroxibenzotriazol y N-metilmorfolina. Después se purifica mediante cromatografía el péptido cíclico resultante. Los métodos alternativos para la síntesis del péptido cíclico se describen en Gurrath y colaboradores, Eur. J. Biochem. , 210:911-921 (1992), y se describen en los Ejemplos. En adición, se puede proporcionar el antagonista de oívß3 en la forma de una proteína de fusión. Las proteínas de fusión son proteínas producidas mediante métodos de ADN recombinante, como se describen en la presente, en los que el polipéptido objeto se expresa como una fusión con una segunda proteína portadora tal como una transferasa de sulfhidrilo de glutationa (GST) u otro portador bien conocido. Las proteínas de fusión preferidas comprenden un polipéptido de MMP-2 descrito en la presente. En los Ejemplos de describe la preparación de una proteína de fusión de MMP-2. Los péptidos y péptidos derivativos particularmente preferidos para usarse en los presentes métodos son c- (GrGDFV) (SEQ ID NO 4), c-(RGDfV) (SEQ ID NO 5), c- (RADfV) (SEQ ID NO 6), c-(RGDFv) (SEQ ID NO 7), c- (RGDf-NMeV) (SEQ ID NO 15) y péptido lineal YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID NO 8), en donde "c-" indica un péptido cíclico, las letras mayúsculas son códigos de una sola letra para un aminoácido L- y las letras minúsculas son códigos de una sola letra para aminoácidos D. La secuencia de residuos aminoácidos de estos péptidos también se muestran en las SEQ ID NOs 4, 5, 6, 7, 15 y 8, respectivamente. También se prefieren los polipéptidos derivados de MMP-2 descritos en la presente, que tienen las secuencias que se muestran en las SEQ ID NOs 17-28 y 45. 2. Anticuerpos Monoclonales La presente invención describe, en una modalidad, antagonistas de avß3 en la forma de anticuerpos monoclonales que inmunorreaccionan con avß3 e inhiben la fijación de avß3 a su ligando natural, como se describe en la presente. La invención también describe líneas celulares que producen los anticuerpos, métodos para producir las líneas celulares, y métodos para producir los anticuerpos monoclonales. Un anticuerpo monoclonal de esta invención comprende las moléculas de anticuerpos que 1) inmunorreaccionan con ?ívß3 aislado, y 2) inhiben la fijación del fibrinógeno a o¡vß3. Los anticuerpos monoclonales preferidos que se fijan preferencialmente a o-vß3 incluyen un anticuerpo monoclonal que tiene las caracte-rísticas de inmunorreacción de mAb LM 609, secretado por la línea celular de hibridoma ATCC HB 9537. La línea celular de hibridoma ATCC HB 9537 se depositó de acuerdo con los requerimientos del Tratado de Budapest con la Colección de Cultivos Tipo Americano (ATCC) , 1301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, Estados Unidos, el 15 de septiembre de 1987. El término "anticuerpo o molécula de anticuerpo" en las diferentes formas gramaticales se usa en la presente como un sustantivo colectivo que se refiere a una población de moléculas de inmunoglobulina y/o porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de combinación de anticuerpos o parátopo. Un "sitio de combinación de anticuerpos" es aquella porción estructural de una molécula de anticuerpo formada por regiones variables e hipervariables de cadena ligera que fijan específicamente al antígeno. Los anticuerpos ejemplares para usarse en la presente invención son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas, y aquellas porciones de una molécula de inmunoglobulina que contiene el parátopo, inclu-yendo aquellas porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab')2 Y F(v), y a las que también se hace referencia como fragmentos de anticuerpos. En otra modalidad preferida, la invención contempla una molécula de inmunoglobulina truncada que comprende un frag-mentó Fab derivado de un anticuerpo monoclonal de esta invención.

El fragmento Fab, que carece de receptor Fe, es soluble, y proporciona ventajas terapéuticas en la vida media del suero, y las ventajas de diagnóstico en los modos de uso del fragmento Fab soluble. La preparación de un fragmento Fab soluble generalmente se conoce en la técnica inmunológica, y se puede conseguir mediante una diversidad de métodos. Por ejemplo, las porciones (fragmentos) Fab y F(ab')2 de los anticuerpos se preparan mediante la reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, en anticuerpos sustancial-mente intactos mediante métodos que son bien conocidos. Vea por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4,342,566 de Theofilopolous y Dixon. Las porciones de anticuerpo Fab' también son bien conocidas, y se producen a partir de las porciones F(ab')2 seguidas por la reducción de los enlaces de disulfuro que enlazan las dos porciones de cadena pesada como con mercaptoetanol, y seguida por la alquilación del mercaptano de proteína resultante con un reactivo tal como yodoacetamida . Se prefiere un anticuerpo que contenga moléculas de inmunoglobulina intacta, y en la presente se utilizan como se ilustrativas. La frase "anticuerpo monoclonal" en sus diferentes formas gramáticas se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente una especie de sitio de combinación de anticuerpos, capaces de inmunorreaccionar con un epítope particular. Un anticuerpo monoclonal típicamente desplie-ga, por lo tanto, una sola afinidad de fijación para cualquier epítopo con el cuál éste inmunorreacciona . Un anticuerpo monoclonal puede, por lo tanto, contener una molécula de anticuerpo que tenga una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpos, cada uno inmunoespecífico para un epítope diferente, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico . Un anticuerpo monoclonal está compuesto típicamente de anticuerpos producidos mediante los clones de una sola célula llamada un hibridoma, que secreta (produce) solamente una clase de molécula de anticuerpo. La célula de hibridoma se forma mediante la fusión de una célula productora de anticuerpos y un mieloma u otra línea celular de auto-perpetuación. La preparación de esos anticuerpos la describió primero Kohier y Milstein, Nature, 256:495-497 (1975), cuya descripción está incorporada como referencia. Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techni-ques, CRC Press, Inc. (1987) se describen métodos adicionales. Los sobrenadantes de hibridoma así preparados se pueden rastrear para ver la presencia de moléculas de anticuerpo que inmunorreaccionan con avß3, y para la inhibición de la fijación de avß3 a ligandos naturales. Brevemente, para formar el hibridoma a partir del cuál se produce la composición de anticuerpos monoclonales, se fusiona un mieloma u otra línea celular de autoperpetuación, con los linfocitos obtenidos del bazo de un mamífero hiperinmunizado con una fuente de avß3, tal como avß3 aislado de células de melanoma humanas M21, como lo describen Cheresh y colaboradores, J. Biol. Chem., 262:17703-17711 (1987). Se prefiere que la línea celular de mieloma que se usa para preparar un hibridoma sea de la misma especie que los linfocitos. Típicamente, el mamífero preferido es un ratón de la cepa 129 G1X+. Los mielomas de ratón adecuados para usarse en la presente invención incluyen las líneas celulares P3X63-Ag8.653, y Sp2/0-Agl4 sensibles a hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) , que están disponibles en la Colección de Cultivos Tipo Americano, Rockville, Maryland, Estados Unidos, bajo las designaciones CRL 1580 y CRL 1581, respectivamente. Los esplenocitos típicamente se fusionan con las células de mieloma usando glicol de polietileno (PEG) 1500. Los híbridos fusionados se seleccionan por su sensibilidad a HAT. Los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal de esta invención se identifican usando el ensayo inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA) descrito en los Ejemplos. Un anticuerpo monoclonal de la presente invención también se puede producir mediante la iniciación de un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio nutriente que contie-ne un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpo de la especificidad apropiada. El cultivo se mantiene bajo condiciones, y durante un período de tiempo suficiente para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo dentro del medio. Después se recolecta el medio que contiene el anticuerpo. Después se pueden aislar adicionalmente las moléculas de anticuerpo mediante técnicas bien conocidas. Los medios útiles para la preparación de estas composiciones son bien conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles, e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones endogámicos y similares. Un medio sintético ejemplar es el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco y colaboradores, Virol. 8:396, 1959) complementado con 4.5 gramos/1 de glucosa, 20 mM de glutamina, y 20 por ciento de suero bovino fetal. Una cepa de ratón endogámico ejemplar es la Balb/c. También son bien conocidos otros métodos para producir un anticuerpo monoclonal, una células de hibridoma, o un cultivo celular de hibridoma. Vea, por ejemplo, el método de aislamiento de anticuerpos monoclonales a partir de un repertorio inmunológico, como lo describen Sastry y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 86:5728-5732 (1989); y Huse y colaboradores, Science, 246:1275-1281 (1989). Esta invención también contempla la célula de hibridoma, y los cultivos que contienen una célula de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de esta invención. Es particu-larmente preferida la línea celular de hibridoma que secreta el anticuerpo monoclonal mAb LM 609 designado ATCC HB 9537. El mAb LM609 se preparó como lo describen Cheresh y colaboradores, J. Biol . Chem. , 262:17703-17711 (1987), y su preparación también se describe en los Ejemplos. La invención contempla, en una modalidad, un anti- cuerpo monoclonal que tiene las características de inmunorreacción de mAb LM609. También es posible determinar, sin experimentación indebida, si un anticuerpo monoclonal tiene la misma (es decir, equivalente) especificidad (características de inmunorreacción) que un anticuerpo monoclonal de esta invención, por medio de averiguar si el anterior evita que el último se fije a una molécula objetivo seleccionada previamente. Si el anticuerpo monoclonal que se está probando compite con el anticuerpo raono-clonal de la invención, como se muestra por una disminución en la fijación por el anticuerpo monoclonal de la invención, en ensayos de competencia estándares para la fijación a la molécula objetivo cuando está presente en la fase sólida, entonces es probable que los dos anticuerpos monoclonales se fijen a la misma, o a un epítope cercanamente relacionado. Todavía otra manera de determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la invención es incubar previamente el anticuerpo monoclonal de la invención con la molécula objetivo con la cuál éste es normal-mente reactivo, y después añadir el anticuerpo monoclonal que se esté probando para determinar si el anticuerpo monoclonal que se está probando se inhibe en su habilidad para fijar la molécula objetivo. Si se inhibe el anticuerpo monoclonal que se está probando, entonces, con toda probabilidad, éste tiene la misma, o funcionalmente equivalente, especificidad epitópica que el anticuerpo monoclonal de la invención. Una manera adicional de determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la invención es determinar la secuencia de residuos aminoácidos de las regiones CDR de los anticuerpos en cuestión. Las moléculas de anticuerpos que tienen secuencias idénticas, o funcionalmente equivalentes, de residuos aminoácidos en sus regiones CDR, tienen la misma especificidad de fijación. Los métodos para secuenciar polipéptidos son bien conocidos en la técnica. La inmunoespecificidad de un anticuerpo, su capacidad de fijación a la molécula objetivo, y la afinidad concomitante que exhibe el anticuerpo por el epítope, las define el epítopo con el cual inmunorreacciona el anticuerpo. La especificidad del epítope se define cuando menos en parte por la secuencia de residuos aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina del anticuerpo, y en parte por la secuencia de residuos aminoácidos de la región variable de cadena ligera. El uso del término "que tiene la especificidad de fijación de" india que los anticuerpos monoclonales equivalentes exhiben las mismas, o similares características de inmunorreacción (fijación), y compiten por la fijación a una molécula objetivo seleccionada previamente. Los anticuerpos monoclonales humanizados ofrecen ventajas sobre los anticuerpos monoclonales de murino, particu-larmente en cuanto a que éstos se pueden usar terapéuticamente en humanos. Específicamente, los anticuerpos humanos no se despejan de la circulación tan rápidamente como los antígenos "extraños", y no activan el sistema inmune de la misma manera que los antígenos extraños y los anticuerpos extraños. Los métodos para prepa-rar anticuerpos "humanizados" generalmente son bien conocidos en la técnica, y se pueden aplicar rápidamente a los anticuerpos de la presente invención. Por lo tanto, la invención contempla, en una modalidad, se humaniza un anticuerpo monoclonal de esta invención por medio de injertar para introducir componentes del sistema inmune humano sin interferir sustancialmente con la habilidad del anticuerpo para fijar el antígeno. 3. Miméticos Específicos de a-,ß3 La presente invención demuestra que los antagonistas de o-vß3 generalmente se pueden usar en la presente invención, antagonistas que pueden incluir polipéptidos, anticuerpos, y otras moléculas, designados "miméticos", que tienen la capacidad para interferir con la función de avß3. Se prefieren particularmente los antagonistas que interfieren específicamente con la función de o¡vß3, y que no interfieren con la función de otras integrinas . En este contexto, se nota que pueden ser adecuados una diversidad de reactivos para usarse en los presentes métodos, siempre y cuando estos reactivos posean la actividad biológica requerida. Genéricamente se hace referencia a estos reactivos como miméticos porque poseen la habilidad de "imitar" un dominio de fijación ya sea en avß3 o en el ligando de ?ívß3 envueltos en la interacción funcional del receptor y el ligando, e interferir mediante lo mismo con (es decir, interferir) la función normal. Un mimético de ?ívß3 es cualquier molécula, aparte de un anticuerpo o péptido derivado del ligando, que exhiba las propiedades descritas anteriormente. Este puede ser un péptido sintético, un análogo o derivado de un péptido, un compuesto que está conformado igual que el bolsillo de fijación del dominio de fijación descrito anteriormente, tal como una molécula mimética orgánica, u otra molécula. Un mimético preferido de esta invención es una molécula con base orgánica, y por lo tanto, se hace referencia a él como mimético orgánico. Las moléculas miméticas orgánicas particularmente preferidas, que funcionan como antagonistas de avß3 por medio de ser un mimético para un ligando de ?ívß3, son los Compuestos 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 y 18, como se describe en el Ejemplo 10. El diseño de un mimético de avß3 se puede conducir mediante cualquiera de una diversidad de métodos de análisis estructurales para diseño de fármacos conocidos en la técnica, incluyendo modelación molecular, análisis de resonancia magnética nuclear bidimensional (2-D NMR) , cristalografía de rayos X, rastreo aleatorio de péptidos, análogo de péptidos u otras genotecas de polímeros químicos o compuestos, y metodologías de diseño de fármacos similares. En vista de la amplia evidencia estructural presentada en la presente especificación, que muestra que un antagonista de ?ívß3 puede ser un polipéptido de fusión (por ejemplo, una proteína de fusión de MMP-2), un polipéptido pequeño, un péptido cíclico, un péptido derivado, una molécula mimética orgánica, o un anticuerpo monoclonal, que son estructuras químicas diversamente diferentes que comparten la propiedad funcional de la inhibición selectiva de o;vß3, la estructura de un antagonista de o;vß3 objeto útil en los presentes métodos no debe limitarse así, sino que incluye cualquier mimético de ?£vß3, como se define en la presente . F . Métodos Para Identificar Antagonistas de Q-..B-- La invención también describe métodos de ensayo para identificar antagonistas de avß3 candidatos, para usarse de conformidad con los presente métodos. En estos métodos de ensayo se evalúan las moléculas para ver su potencia en la inhibición de la fijación de o-vß3 a los ligandos naturales, y además se evalúan para ver su potencia en la inhibición de la angiogénesis en un tejido. El primer ensayo mide la inhibición de la fijación directa del ligando natural a avß3, y en los Ejemplos se describe en detalle una modalidad preferida. El ensayo típicamente mide el grado de inhibición de la fijación de un ligando natural, tal como fibrinógeno, a avß3 aislado en la fase sólida, mediante ensayo inmunosorbente enlazado con enzima. En ensayo también se puede usar para identificar los compuestos que exhiben especificidad por ensayo inmunosorbente, y no inhibir que los ligandos naturales se fijen a otras integri-ñas. El ensayo de especificidad se conduce por medio de realizar ensayos inmunosorbentes enlazados con enzima paralelos, en donde tanto ?ívß3 como otras integrinas se rastrean concurrentemente en cámaras de ensayo separadas para ver sus habilidades respectivas para fijarse a un ligando natural, y para ver el compuesto candidato para inhibir las habilidades respectivas de las integrinas para fijarse a un ligando seleccionado previamente. En los Ejemplos se describen los formatos de ensayo de rastreo preferidos . El segundo ensayo mide la angiogénesis en la membrana corioalantoica de pollo (CAM) y se hace referencia a éste como el ensayo CAM. Otros han descrito en detalle el ensayo CAM, y además se ha usado para medir tanto la angiogénesis como la neovascularización de tejidos tumorales. Vea Ausprunk y colaboradores, Am. J. Pathol . , 79:597-618 (1975) y Ossonski y colaboradores, Cáncer Res.. 40:2300-2309 (1980). El ensayo de membrana corioalantoica de pollo es un modelo de ensayo bien reconocido para la angiogénesis in vivo porque está ocurriendo la neovascularización de todo el tejido, y los vasos sanguíneos del embrión de pollo actuales están creciendo dentro de la membrana corioalantoica de pollo o dentro del tejido que creció en la membrana corioalantoica de pollo. Como se demuestra en la presente, el ensayo e membrana corioalantoica de pollo ilustra la inhibición de la neovascularización en base tanto a la cantidad como a la extensión del crecimiento de nuevos vasos. Por otra parte, es fácil supervisar el crecimiento de cualquier tejido trasplantado sobre la membrana corioalantoica de pollo, tal como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es particularmente útil porque hay un control interno para la toxicidad en el sistema de ensayo. El embrión de pollo se expone a cualquier reactivo de prueba, y por lo tanto la salud del embrión es una indicación de toxicidad. El tercer ensayo mide la angiogénesis en el modelo de ojo de conejo in vivo, y se hace referencia a éste como el ensayo de ojo de conejo. Otros han descrito en detalle el ensayo de ojo de conejo, y además se ha usado para medir tanto la angiogénesis como la neovascularización en la presencia de inhibidores angio-génicos tales como talidomida. Vea D' Amato y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 91:4082-4085 (1994) . El ensayo de ojo de conejo es un modelo de ensayo bien reconocido para la angiogénesis in vivo porque el proceso de neovascularización, ejemplificado por los vasos sanguíneos del conejo en crecimiento de la orilla de la córnea dentro de la córnea, se visualiza fácilmente a través de la córnea naturalmente transparente del ojo. Adicionalmente, tanto la extensión como la cantidad de estimulación o inhibición de la neovascularización o regresión de la neovascularización, se pueden supervisar fácilmente a través del tiempo. Finalmente, el conejo se expone a cualquier reactivo de prueba, y por lo tanto la salud del conejo es una indicación de la toxicidad del reactivo de prueba. El cuarto ensayo mide la angiogénesis en el modelo de ratón de ratón quimérico : humano, y se hace referencia a éste como el ensayo de ratón quimérico. Otros han descrito en detalle el ensayo, y además se ha descrito en la presente para medir la angiogénesis, la neovascularización, y la regresión de tejidos tumorales. Vea Yan, y colaboradores, J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993) . El ensayo de ratón quimérico es un modelo de ensayo útil para ver la angiogénesis in vivo, porque los injertos de piel trasplantados se asemejan mucho histológicamente a la piel humana normal, y está ocurriendo la neovascularización de todo el tejido, en donde los vasos sanguíneos humanos actuales están creciendo a partir de la piel humana injertada, dentro del tejido tumoral humano en la superficie de la piel humana injertada. El origen de la neovascularización dentro del injerto humano se puede determinar mediante el manchado inmunohistoquímico de la neovasculatura con marcadores de células endoteliales específicos del humano . Como se demuestra en la presente, el ensayo de ratón quimérico demuestra la regresión de la neovascularización en base a tanto la cantidad como la extensión de regresión del crecimien- to de vasos nuevos. Por otra parte, es fácil supervisar los efectos sobre el crecimiento de cualquier tejido trasplantado sobre la piel injertada, tal como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es útil porque hay un control interno para toxicidad en el sistema de ensayo. El ratón quimérico se expone a cualquier reactivo de prueba, y por lo tanto la salud del ratón es una indicación de la toxicidad. G. Artículo de Fabricación La invención también contempla un artículo de fabri-cación, el cuál es un contenedor etiquetado para proporcionar un antagonista de avß3 de la invención. Un artículo de fabricación comprende material de empaque y un agente farmacéutico contenido adentro del material de empaque. El agente farmacéutico en un artículo de fabricación es cualquiera de los antagonistas de oívß3 de la presente invención, formulado en una forma farmacéuticamente aceptable, como se describe en la presente, de conformidad con las indicaciones descritas. El artículo de fabricación contiene una cantidad de agente farmacéutico suficiente para usarse en el tratamiento de una condición indicada en la presente, ya sea en dosis únicas o múltiples . El material de empaque comprende una etiqueta que indica el uso del agente farmacéutico contenido en el mismo, por ejemplo, para tratar condiciones asistidas por la inhibición de la angiogénesis, y condiciones similares descritas en la presen-te. La etiqueta también puede incluir instrucciones para usarse, e información relacionada que se pudiera requerir para mercadeo. El material de empaque puede incluir contenedor (es) para almacenamiento del agente farmacéutico. Como se usa en la presente, el término material de empaque se refiere a un material tal como vidrio, plástico, papel, papel aluminio, y similares, capaz de mantener dentro de elementos fijos un agente farmacéutico. Por lo tanto, por ejemplo, el material de empaque puede ser frascos de plástico o vidrio, sobres laminados y contenedores similares que se usan para contener una composición farmacéutica, incluyendo el agente farmacéutico . En las modalidades preferidas, el material de empaque incluye una etiqueta que es una expresión tangible que describe el contenido del artículo de fabricación, y el uso del agente farmacéutico contenido en el mismo. Ejemplos Los siguientes ejemplos relacionados con esta invención son ilustrativos y, por supuesto, no se deben considerar como limitando específicamente la invención. Por otra parte, las variaciones de la invención, conocidas ahora o desarrolladas posteriormente, que estarían dentro del alcance de un experto en la técnica, se considerará que caen dentro del alcance de la presente invención reivindicada posteriormente en la presente. 1. Preparación de Péptidos Sintéticos a . Procedimiento de Síntesis Se sintetizaron los polipéptidos lineales y cíclicos enlistados en la Tabla 1, usando técnicas de síntesis de fase sólida estándares como, por ejemplo, las descritas por Merri-field, Adv. Enzvmol., 32:221-96, (1969), y Fields, G.B. y Noble, R.L., Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214, (1990). Primero se disolvieron dos gramos (g) de BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe (SEQ ID NO 1) en 60 mililitros (ml) de metanol, al cuál se añadieron 1.5 mililitros de 2 N de solución de hidróxido de sodio, para formar una mezcla. Después se agitó la mezcla durante 3 horas a 20 grados C (20C) . Después de la evaporación, se tomó el residuo en agua, se acidificó a un pH de 3 con HCl diluido, y se extrajo con acetato de etilo. Se secó el extracto sobre Na2S04, se evaporó nuevamente, y se agitó el BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO 2) resultante a 20C durante 2 horas, con 20 mililitros de 2 N de HCl en dioxano. Se evaporó la mezcla resultante para obtener H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO 3), el cuál se disolvió subsecuentemente en una mezcla de 1800 mililitros de diclorometano y 200 mililitros de dimetilformamida (DMF) seguido por enfriamiento a 0C. Después de eso, se añadieron sucesivamente 0.5 gramos de diciclohexil-carbodiimida (DCCI), 0.3 gramos de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y 0.23 mililitros de N-metilmorfolina, con agitación. Se agitó la mezcla resultante durante otras 24 horas a OC, y después a 20C durante otras 48 horas. Se concentró la solución y se trató con un intercambiador de iones de lecho mezclado para librarla de sales. Después de que se removió la resina resultante mediante filtración, se evaporó la solución clarificada y se purificó el residuo mediante cromatografía, dando como resultado la recuperación de ciclo (-Gly-D-Arg-Gly-Asp- Phe-Val) (SEQ ID NO 4) . Se obtuvieron análogamente los siguientes péptidos, enlistados en la Tabla 1 usando las abreviaturas de residuos aminoácidos de código de una sola letra, e identificados por una designación de número de péptido: ciclo (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO 5); ciclo (Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO: 6); ciclo (Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO 9); ciclo (Arg-Gly- Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID NO 7); y ciclo (Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal) (la metilación es en el nitrógeno alfa-amido del enlace amida del residuo valina) (SEQ ID NO 15) . Un péptido designado como 66203, que tuvo una secuencia idéntica a aquella del péptido 62184, solamente difirió del último por contener la sal HCl más bien que la sal TFA presente en 62184. Lo mismo es cierto para los péptidos 69601 y 62185 y para 85189 y 121974. b. Procedimiento de Síntesis Alternativo i . Síntesis de ciclo (Arg-Glv-Asp-DPhe-NmeVal) , sal TFA Se sintetizó Fmoc-Arg (Mtr) -Gly-Asp (OBut) -DPhe-NMeVal-ONa, usando procedimientos tipo Merrifield de fase sólida, mediante la adición secuencial de NMeVal, DPhe, Asp (OBut), Gly y Fmoc-Arg (MTr) de una manera por pasos, a una resina de 4- hidroximetil-fenoximetil-poliestireno (resina tipo Wang) (los • métodos tipo Merrifield acostumbrados de la síntesis del péptido se aplican como se describe en Houben-Weyl, l.c., Volumen 15/11, Páginas 1 a 806 (1974) . La resina de poliestireno y los precursores de residuos aminoácidos están comercialmente disponibles con las compañías químicas Aldrich, Sigma o Fluka) . Después de la terminación de la adición secuencial de los residuos aminoácidos, se elimina la resina de la cadena del péptido usando una mezcla 1:1 de ácido trifluoroacético/ diclorometano, lo cuál proporciona el producto Fmoc-Arg (Mtr) -Gly-Asp (OBut) -DPhe-NMeVal-OH. Después se remueve el grupo Fmoc con una mezcla 1:1 de piperidina/dimetilformamida, lo cuál proporciona el precursor Arg (Mtr) -Gly-Asp (OBut) -DPhe-NMeVal-OH, el cuál se purifica después mediante cromatografía de líquido de alto rendimiento de la manera acostumbrada. Para la ciclización, una solución de 0.6 gramos de Arg (Mtr) -Gly-Asp (OBut) -DPhe-NMeVal-OH (sintetizada anteriormente) en 15 mililitros de DMF (dimetilformamida; Aldrich) se diluye con 85 mililitros de diclorometano (Aldrich) , y se añaden 50 miligramos de NaHC03. Después de enfriar en una mezcla de hielo seco/acetona, se añaden 40 µl de azida de difenilfosforilo (Aldrich) . Después de reposar a la temperatura ambiente durante 16 horas, se concentra la solución. El concentrado se filtra por gel (columna Sephadex G10 en isopropanol/agua 8:2) y después se purificó mediante cromatografía de líquido de alto rendimiento de la manera acostumbrada. El tratamiento con TFA (ácido trifluoroacético) /H20 (98:2) da ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x TFA, el cuál se purifica después mediante cromatografía de líquido de alto rendimiento de la manera acostumbrada; RT = 19.5; FAB-MS (M+H) : 589. ii . Síntesis de "Sal Interna" Se remueve la sal de ácido trifluoroacético del péptido cíclico producido anteriormente, por medio de suspender el ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x TFA en agua, seguido por evaporación bajo vacío, para remover el ácido trifluoroacético.

Se hace referencia al péptido cíclico formado como una "sal interna", y se designa ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) . Se usa el término "sal interna" porque el péptido cíclico contiene dos residuos opuestamente cargados que se contrabalancean intraelec-trónicamente uno al otro para formar una molécula global no cargada. Uno de los residuos cargados contiene una fracción acida, y el otro residuo cargado contiene una fracción amino.

Cuando la fracción acida y la fracción amino están en proximidad cercana una a la otra, se puede desprotonar la fracción acida mediante la fracción amino, lo cuál forma una especie de sal de carboxilato/amonio con una carga neutra global. iii . Tratamiento de HCl para dar ciclo- (Arg-Gly-Asp- DPhe-NMeVal) x HCl Se disolvieron 80 miligramos de ciclo- (Arg-Gly-Asp- DPhe-NMeVal) en 0.01 M de HCl de cinco a seis veces, y se secó por congelamiento después de cada operación de disolución. La purificación subsecuente mediante cromatografía de líquido de alto rendimiento dio ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x HCl; FAB-MS (M+H) : 589. iv. Tratamiento de ácido metansulfónico para dar ciclo- (Arq-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x MeSO.H Se disolvieron 80 miligramos de ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) en 0.01 M de MeS03H (ácido metansulfónico) de cinco a seis veces, y se secó por congelamiento después de cada operación de disolución. La purificación subsecuente mediante cromatografía de líquido de alto rendimiento dio ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x MeS03H; RT = 17.8; FAB-MS (M+H) : 589. Los métodos alternativos de ciclización incluyen la derivatización de las cadenas de grupo lateral de un precursor de péptido acíclico con fracciones de sulfhidrilo, y cuando se exponen a condiciones de pH ligeramente más elevadas que las condiciones fisiológicas de pH normales (pH 7.5), forman intramolecularmente enlaces de disulfuro con otros grupos sulfhidrilo presentes en la molécula, para formar un péptido cíclico. Adicionalmente, la fracción de carboxilato con término C de un precursor de péptido acíclico, se puede hacer reaccionar con una fracción de sulfhidilo libre presente adentro de la molécula, para producir péptidos ciclizados de tioéster. En la inhibición de los ensayos de angiogénesis, como se describe en el Ejemplo 7, en donde se usaron los péptidos sintéticos, el péptido 66203 en HCl fue ligeramente más efectivo en la inhibición de la angiogénesis que el péptido idéntico en ácido trifluoroacético.

Tabla 1 Designación del Secuencia de Aminoácidos SEO ID NO Péptido 62181 ciclo (GrGDFV) 4 62184 (66203*) ciclo (RGDfV) 5 62185 (69601*) ciclo (RADfV) 6 62187 ciclo (RGDFv) 7 62880 YTAECKPQVTRGDVF 8 62186 ciclo (rADFV) 9 62175 ciclo (ARGDfL) 10 62179 ciclo (GRGDfL) 11 62411 TRQVVCDLGNPM 12 62503 GVVRNNEALARLS 13 62502 TDVNGDGRHDL 14 121974 (85189*) ciclo (RDGf-NH2Me--V) 15 112784 ciclo (RGEf-NH2Me--V) 16 huMMP-2 (410-631)** 17 huMMP-2 (439-631)** 18 huMMP-2 (439-512)** 19 huMMP-2 (439-546)** 20 huMMP-2 (510-631)** 21 huMMP-2 (543-631)** 22 chMMP-2 (410-637)*** 23 chMMP-2 (445-637)*** 24 chMMP-2 (445-518)*** 25 chMMP-2 (445-552)*** 26 chMMP-2 (516-637)*** 27 chMMP-2 (549-637)*** 28 *Los péptidos ¡ designados con un asterisco se preparan en ácido clorhídrico y son idénticos en secuencia al péptido designado en la misma línea; los péptidos sin un asterisco se preparan en ácido trifluoroacético. Las letras minúsculas indican un aminoácido D; las letras mayúsculas indican un aminoácido L. "Las secuencias de residuos aminoácidos de MMP-2 de humano para los péptidos sintéticos se indican mediante las posiciones de residuo correspondientes que se muestran en las Figuras 22A y 22B. (MMP-2 se refiere a un miembro de la familia de enzimas de metaloproteinasa de matriz) . Las secuencias de MMP-2 de humano están enlistadas con los residuos de cisteína natura-les, pero no están enlistadas con los residuos de cisteína diseñados, como se describe para los péptidos de fusión. Se sustituyeron los residuos de cisteína no naturales por el residuo aminoácido natural en las posiciones de residuo indicadas, con el objeto de facilitar la solubilidad de las proteínas de fusión sintéticas así como expresadas, y para asegurar el plegado apropiado para la presentación del sitio de fijación. ***Las secuencias de residuos aminoácidos de MMP-2 de pollo para los péptidos sintéticos se indican mediante las posiciones de residuo correspondientes que se muestran en las Figuras 22A y 22B. Las secuencias de MMP-2 de pollo se enlistan con los residuos de cisteína naturales, pero no con los residuos de cisteína diseñados, como se describe para los péptidos de fusión como se describió anteriormente. 2. Anticuerpos Monoclonales El anticuerpo monoclonal LM609 secretado por el hibridoma ATCC HB 9537 se produjo usando métodos de hibridoma estándares, mediante inmunización con avß3 aislada, absorbida sobre lechos de Sefarosa-lentillectina . La avß3 se ha aislado a partir de células de melanoma humano designadas M21, y el anti-cuerpo se* produjo como lo describieron Cheresh y colaboradores, J. Biol. Chem., 262:17703-17711 (1987). Las células M21 las proporcionó el Doctor D. L. Morton (Universidad de California en Los Angeles, CA) y crecieron en cultivos de suspensión en medio de cultivo RPMI 1640 que contenía 2 mM de L-glutamina, 50 mili-gramos/mililitro de sulfato de gentamicina y suero de bovino fetal al 10 por ciento. Se ha mostrado que el anticuerpo monoclonal LM609 inmunorreacciona específicamente con el complejo de avß3, y no inmunorreacciona con la subunidad ocv, con la subunidad ß3, ni con otras integrinas. 3. Caracterización de la Distribución de Tejido de la Expresión de a„ß? A. Inmunofluorescencia con Anticuerpos de Receptor de Anti-Inteqrina Durante la curación de heridas, las membranas básicas de los vasos sanguíneos expresan muchas proteínas adhesivas, incluyendo el factor de von Willebrand, fibronectina, y fibrina. En adición, se expresan muchos miembros de la familia de integrinas de los receptores de adhesión, sobre la superficie de músculo liso cultivo y células endoteliales. Vea, Cheresh, Proc.

Nati. Acad. Sci., USA, 84:6471 (1987); Janat y colaboradores, J. Cell Phvsiol. , 151:588 (1992); y Cheng y colaboradores, J. Cell Phvsiol. , 139:275 (1989). Entre estas integrinas está avß3, el receptor de células endoteliales para el factor de von Wille-brand, fibrinógeno (fibrina) , y fibronectina, como lo describe Cheresh, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 84:6471 (1987). Esta integrina inicia una trayectoria de señalización dependiente de calcio que lleva a la migración de células endoteliales, y por lo tanto parece que juega un papel fundamental en la biología celular vascular, como lo describe Leavelsey y colaboradores, J. Cell Biol. , 121:163 (1993). Para investigar la expresión de avß3 durante la angiogénesis, se obtuvo tejido de granulación herido de humano o piel normal adyacente de pacientes que dieron su consentimiento, se lavó con 1 mililitro de solución salina regulada con fosfato, y se incrustó en medio O. .C (tejido Tek) . Los tejidos incrustados se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido durante aproximadamente 30 a 45 segundos. Se cortaron secciones de seis mieras de grosor de los bloques congelados en un micrótomo de crióstato para manchado subsecuente de inmunoperoxidasa con anticuerpos específicos para cualesquier integrinas ß3 (?ívß3 ó ?íIIbß3) o la subfamilia ßx de las integrinas. En las Figuras 1A-1D se muestran los resultados del manchado de piel de humano normal y tejido de granulación herido. Los anticuerpos monoclonales AP3 y LM534, dirigidos a las inte-grinas ß3 y ß1A respectivamente, se usaron para el análisis inmunohistoquímico de las secciones congeladas. Los experimentos con el tejido de cuatro donadores humanos diferentes produjeron resultados idénticos . Las fotomicrografías se muestran a una ampliación de 300x. La integrina ?ívß3 se expresó abundantemente en los vasos sanguíneos en el tejido de granulación (Figura IB), pero no fue detectable en la dermis ni en el epitelio de piel normal del mismo donador (Figura ÍA) , En contraste, las integrinas ßx se expresaron abundantemente en los vasos sanguíneos y las células estromales tanto en piel normal (Figura ÍC) como en tejido de granulación (Figura ID) y, como se mostró previamente como lo describió Adams y colaboradores, Cell, 63:425 (1991), en las células básicas adentro del epitelio. B . Inmunofluorescencia con Anticuerpos Anti-Liaan- do También se examinaron las secciones adicionales de la piel normal y los tejidos de granulación de humano, preparados anteriormente, para ver la presencia de los ligandos para las integrinas ß3 y ßl r el factor de von Willebrand y laminina, respectivamente. El factor de von Willebrand se localizó a los vasos sanguíneos en piel normal (Figura 2A) y tejido de granulación (Figura 2B) , mientras que la laminina se localizó a todos los vasos sanguíneos así como a la membrana básica epitelial en ambas preparaciones de tejido (Figuras 2C y 2D) .

C . Distribución de Anticuerpos Anti-oi„ß3 en Tejido Canceroso En adición a los análisis anteriores, también se examinaron las biopsias de tejido canceroso de pacientes humanos, para ver la presencia y la distribución de avß3. Se prepararon los tejidos como se describe en el Ejemplo ÍA, con la excepción de que éstos se mancharon con el anticuerpo monoclonal LM609 preparado en el Ejemplo 2, que es específico para el complejo de receptor de integrina, avß3. En adición, también se prepararon tumores para análisis histológicos microscópicos mediante la fijación de ejemplos representativos de tumores en Bulinas Fijadoras durante 8 horas y secciones en serie cortadas t manchadas con H&E. En las Figuras 3A-3D se muestran los resultados del manchado con inmunoperoxidasa de tejidos cancerosos de vejiga, colon, pecho, y pulmón, respectivamente. avß3 se expresó abundantemente solamente en los vasos sanguíneos presentes en las cuatro biopsias de cáncer analizadas, y no en ninguna otra célula presente en el tejido. Los resultados descritos en la presente muestran, de esta manera, que el receptor de integrina avß3 se expresa selectivamente en tipos de tejido específicos, a saber granulados, tejidos metastáticos y otros tejidos en los que esté ocurriendo la angiogénesis, y no en tejido normal en donde se ha detenido la formación de nuevos vasos sanguíneos. Estos tejidos, por lo tanto, proporcionan un objetivo ideal para los aspectos terapéuticos de esta invención. 4. Identificación de Péptidos Sintéticos Específicos a a„ß?. Detectados mediante la Inhibición de la Unión Celular, y mediante un Ensavo de Fijación de Receptor de Ligando A. Inhibición de la Unión Celular Como un medio para determinar la especificidad del receptor de integrina de los antagonistas de esta invención, se realizaron ensayos de unión celular como se describe posteriormente . Brevemente, primero se transfectaron células de melanoma de hámster CS-1 que carecían de expresión de ?ívß3 y c¿vß5, con un plásmido para expresar la subunidad ß3 como lo describió previamente Filardo y colaboradores, J. Cell Biol . , 130:441-450 (1995) . Se determinó la especificidad de los antagonistas potenciales de ?ívß3, mediante la habilidad para bloquear la fijación de células CS-1 que expresaban avß3 a placas recubiertas con VN o laminina. Como un ejemplo de un ensayo típico, primero se recubrieron los pozos con sustrato de 10 microgramos/mililitro durante la noche. Después de enjuagar y bloquear con BSA desnaturalizado por calor al 1 por ciento en PBS a la temperatura ambiente durante 30 minutos, se mezcló por separado el péptido 85189 (SEQ ID NO 15) sobre un rango de concentración de 0.0001 uM a 100 uM, con células CS-1 para aplicación a los pozos con un número de células de 50,000 células/pozo. Después de una incubación de 10-15 minutos a 37C, se desechó la solución que contenía las células y los péptidos. Entonces se determinó el número de células unidas después del manchado con violeta cristal al 1 por ciento. Se lixivió la violeta cristal asociada con las células, mediante la adición de 100 microlitros (µl) de ácido acético al 10 por ciento. Se cuantificó la adhesión celular mediante la medición de la densidad óptica de la violeta cristal lixiviada a una longitud de onda de 600 nm. La Figura 21 muestra el resultado de un ensayo típico con un antagonista de ?ívß3, aquí el péptido 85189. No se detectó ninguna inhibición con el péptido en superficies recubiertas con laminina. En contraste, la inhibición completa de la fijación se obtuvo en superficies recubiertas con VN con una concentración de péptido de 10 µM o más, como se muestra con la curva de dosis-respuesta . Se realizaron ensayos similares con proteínas de fusión que contenían diferentes regiones de la proteína de MMP-2. Los polipéptidos derivados de MMP-2 incluyen regiones del término C de MMP-2 activas en la interacción de fijación con oívß3 y, mediante lo mismo, son capaces de inhibir la activación de MMP-2 y de las actividades asociadas. Estos polipéptidos se preparan ya sea como polipéptidos sintéticos que tienen una secuencia derivada de del dominio con terminal C de MMP-2, como se describe en el Ejemplo 1, o como proteínas de fusión que incluyen todo o una porción del dominio con terminal C de MMP-2, preparadas como se describe posteriormente. Se presentan moléculas con terminal C de MMP-2 para secuencias específicas tanto de pollo como de humano. El dominio con terminal C de MMP-2 derivada de pollo, al que también se hace referencia como el dominio de hemopexina, inmediatamente continuo a la región de bisagra, comprende los residuos aminoácidos 445-637 de MMP-2. Posteriormente se describe el nucleótido completo y la secuencia de aminoácidos codificada de MMP-2 de pollo. Posteriormente también se describe el nucléotido y la secuencia de aminoácidos codificada de MMP-2 de humano. El dominio con terminal C en la MMP-2 de humano que corresponde a la región del pollo de 445-637 empieza en el residuo aminoácido 439 y termina con el 631 debido a seis residuos faltantes de la secuencia de humano, como se muestra en las Figuras 22A y 22B. En la Tabla 1 se enlistan los péptidos sintéticos de MMP-2 con terminal C derivados ya sea de humano o de pollo, para usarse en la práctica de los métodos de esta invención. Las secuencias de residuos aminoácidos de los péptidos sintéticos son iguales que aquellas generadas por las contrapartes de la proteína de fusión recombinante, pero sin el componente de fusión GST. Se prepararon proteínas de fusión de MMP-2 con terminal C, derivadas tanto de pollo como de humano, como se describe posteriormente. Una proteína de fusión de MMP-2 es un polipéptido que tiene una secuencia de dominio con terminal C de MMP-2 o una porción del mismo fusionada (operativamente enlazado por el enlace de péptido covalente) a una proteína portadora (fusión) , tal como transferasa de glutationsulfhidrilo (GST) . Para amplificar diferentes regiones de MMP-2 de pollo y humano, se diseñaron las secuencias cebadoras en base a las secuencias de ADNc respectivas conocidas de MMP-2 de pollo y humano. En las Figuras 22A y 22B se muestra la cadena superior completa de la secuencia de nucleótidos de ADNc de MMP-2 de pollo sin procesar, a la que también se hace referencia como progelati-nasa, junto con la secuencia de aminoácidos deducida que se muestra en la segunda línea (Aimes y colaboradores, Biochem. J. , 300:729-736, 1994) . La tercera y cuarta líneas de la figura muestran respectivamente la secuencia de aminoácidos deducida de MMP-2 de humano (Collier y colaboradores, J. Biol . Chem. , 263:6579-6587 (1988)) y de ratón (Reponen y colaboradores, J^. Biol. Chem., 267:7856-7862 (1992)). Se indican los residuos idénticos con puntos, mientras que los residuos diferentes se dan por su inscripción IUPAC de una letra. Los residuos faltantes están indicados con un guión. La numeración de los residuos aminoácidos empieza desde el primer residuo de la proenzima, dando a los residuos del péptido de señal números negativos. La secuencia de nucleótidos está numerada de conformidad con lo anterior. La iniciación putativa de traslación (ATG) está marcada con tres cabezas de flecha delanteras, y la señal de terminación de traslación (TGA) está indicada por un asterisco. Las secuen-cias con terminal amino para la proenzima y la enzima activa de pollo están contenidas con diamantes y cabezas de flecha individuales. Las secuencias de nucleótidos de progelatinasa y de residuos aminoácidos de pollo están enlistadas juntas como la SEQ ID NO 29, mientras que la secuencia de residuos aminoácidos codificada está enlistada pro separado como la SEQ ID NO 30. Las plantillas para generar regiones amplificadas de MMP-2 de pollo fueron ya sea un ADNc que codifica al polipéptido de MMP-2 de pollo maduro de longitud completa, proporcionado por el Doctor J. P. Quigley de la Universidad Estatal de Nueva York en Stoney Brook, Nueva York, o un ADNc generado de una muestra extirpada de tejido de membrana corioalantoica de pollo. Para el último, el ADNc se obtuvo con transcriptasa inversa de MuLV y un cebador corriente abajo específico para los nucleótidos con terminal 3', 5 'ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3 ' (SEQ ID NO 31), cuyos extremos 5' y 3' fueron respectivamente complementarios para los nucleótidos 1932-1912 de la secuencia de MMP-2 de pollo publicada. Se realizó la reacción de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) , de conformidad con las especificaciones del fabricante para el estuche GeneA p RNA PCR (Perkin Elmer) . El cebador también se diseñó para contener un sitio de restricción EcoRI interno. A partir de cualquiera de las plantillas de ADNc descritas anteriormente, se obtuvieron muchas regiones con terminal C de MMP-2 de pollo, cada una teniendo el residuo de cisteína natural en la posición 637 en el término carboxi, mediante reacción de cadena de polimerasa con el cebador 3 ' enlistado anteriormente (SEQ ID NO 31) , emparejado con uno de muchos cebadores 5' enlistados posteriormente. Las regiones amplificadas codificaron las siguientes proteínas de fusión de MMP-2, que tienen secuencias que corresponden a las posiciones de residuos aminoácidos, como se muestra en las Figuras 22A y 22B, y también enlistadas en la SEQ ID NO 30: 1) 203-637; 2) 274-637; 3) 292-637; 4) 410-637; 5) 445-637. Los cebadores corriente arriba o 5 ' para amplificar cada una de las regiones de nucleóti-dos para codificar las proteínas de fusión de MMP-2 enlistadas anteriormente, se diseñaron para codificar los sitios 3' de inicio del polipéptido a un sitio de restricción BamHl interno diseñado, es decir, introducido mediante reacción de cadena de polimerasa, para permitir la ligación direccional dentro de los vectores de expresión ya sea pGEX-l?T ó pGEX-3X. Los cebadores 5' incluyeron las siguientes secuencias, cuyos extremos 5' y 3' corresponden con las posiciones de los nucleótidos 5' y 3' indicadas de la secuencia de MMP-2 de pollo, como se muestra en las Figuras 22A y 22B (también se indican los sitios de inicio de posición del residuo aminoácido para cada cebador) : 1) Nucleótidos 599-619, que codifican un sitio de inicio 203 5 ' ATGGGATCCACT-GCAAATTTC3' (SEQ ID NO 32); 2) Nucleótidos 809-830, que codifican un sitio de inicio 274 5 ' GCCGGATCCATGACCA-GTGTA3 ' (SEQ ID NO 33); 3) Nucleótidos 863-883, que codifican un sitio de inicio 292 5 ' GTGGGATCCCTGAAG-ACTATG3 ' (SEQ ID NO 34); 4) Nucleótidos 1217- 1237, que codifican un sitio de inicio 410 5 ' GGGGATCCTTAAGG-GGATTC3' (SEQ ID NO 35); y 5) Nucleótidos 1325-1345, que codifican un sitio de inicio 445 5 ' CTCGGATCCTCTGCA-AGCACG3 ' (SEQ ID NO 36) . Las regiones de nucleótidos indicadas del ADNc de la plantilla se amplificaron subsecuentemente por 35 ciclos (temperatura de templado 55C) , de conformidad con las instrucciones del fabricante para el Sistema Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) . Los productos de la reacción de cadena de polimerasa resultantes se purificaron por gel, se digirieron con las enzimas de restricción BamHl y EcoRI, y se volvieron a purificar antes de la ligación dentro de su vector ya sea pGEX-l?T ó pGEX-3X (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) que se han digerido de la misma manera, así como también se desfosforilaron antes de la reacción de ligación. La elección del plásmido se baso en el marco de lectura requerido del producto de amplificación. Se transformaron las células BSJ72 ó BL21 de la cepa de E . coli competentes, con las construcciones separadas mediante choque de calor. Se rastrearon las colonias resultantes para ver la incorporación del plásmido de codificación de la proteína de fusión de MMP-2 respectivo mediante reacción de cadena de polimerasa, para el secuenciamiento por didesoxi de clones positivos, para verificar la integridad de la secuencia de codificación introducida. En adición, se confirmó la verificación de la incorporación del plásmido mediante la expresión de la proteína de fusión GST-MMP-2 apropiadamente dimensionada. La purificación de cada una de las proteínas de fusión GST-MMP-2 recombinantes se realizó usando cultivos de fase de orden de magnitud inducidos por IPTG, esencialmente como lo describe el fabricante para el Sistema GST Gene Fusión System (Pharmacia Biotech) . Brevemente, las bacterias recuperadas se destruyeron por la acción de las usinas mediante sonificación, y se incubaron con detergente antes de la clarificación e inmovilización de la proteína recombinante en glutaniona 4B-acoplada con sefarosa (Pharmacia Biotech) . Después de lavado extenso, se lixiviaron por separado las proteínas de fusión inmovilizadas de la matriz de afinidad con 10 mM de glutationa reducida en 50 mM de Tris-HCl, pH 8.0, y se dializaron extensamente contra PBS para remover la glutationa residual antes de su uso. Los intentos anteriores para producir las proteínas de fusión entre los residuos de MMP-2 de pollo 445 y 637 que solamente tenían un residuo de cisteína codificado dieron como resultado productos insolubles. Por lo tanto, con el objeto de generar proteínas de fusión de MMP-2 solubles adicionales, derivadas a partir de la región con terminal C que no incluía un residuo de cisteína terminal endógeno, como está presente en la proteína de fusión descrita previamente, se introdujeron secuencias de nucleótidos dentro de las regiones de MMP-2 amplificadas, para codificar un residuo de cisteína s fuera necesario, depen-diendo de la proteína de fusión particular. Un residuo de cisteí-na está naturalmente presente en la secuencia de MMP-2 de pollo en la posición 446 y en la posición 637. En la secuencia de humano, estas posiciones corresponden respectivamente a 440 y 631. Por lo tanto, se diseñaron las proteínas de fusión para contener residuos de cisteína terminales diseñados en el término amino- o carboxi- de las secuencias de MMP-2 de pollo de interés, con el objeto de permitir la fijación por disulfuro con la cisteína naturalmente ocurrente en el otro término, como lo requiere la construcción. Se diseñaron los cebadores de oligonucleótido de conformidad con lo anterior, para permitir la amplificación de las regiones con terminal C de MMP-2 de pollo, para la expresión de las proteínas de fusión de MMP-2/GST solubles. Las regiones con terminal C de MMP-2 de pollo amplificadas incluyeron aquellas para codificar las posiciones de residuos aminoácidos 445-518, 445-552, 516-637 y 549-637. Para las proteínas de fusión que contienen el residuo 517, se sustituyó el residuo de tirosina naturalmente codificado por una cisteína, para permitir la fijación por disulfuro con cisteína en la posición de residuos ya sea 446 ó 637. Para las proteínas de fusión que contienen el residuo 551, se sustituyó el residuo de triptófano naturalmente codificado por una cisteína para permitir la fijación por disulfuro con la cisteína naturalmente codificada en la posición de residuo ya sea 446 ó 637. Brevemente, la construcción del plásmido pGEX-3X que codifica la proteína de fusión GST/MMP-2 (410-637) recombinante, preparada anteriormente, se usó como una plantilla para amplificación, de conformidad con el protocolo del fabricante para el Estuche Expand High Fidelity PCR (Boehringer Mannheim) , utilizan-do un conjunto de cebadores de oligonucleótido cuyo diseño se basó en la secuencia de MMP-2 de pollo publicada (que también se muestra en las Figuras 22A y 22B) . Un cebador corriente arriba, diseñado para codificar un sitio de inicio de la proteína de MMP-2 de pollo en la posición 445, después de un sitio de restricción de endonucleasa BamHl interno diseñado, para inserción dentro del vector pGEX-3X, tuvo la secuencia de nucleótidos (5'CTCGGATCCTTCTGCAAGCACG3' (SEQ ID NO 37)) . Los extremos 5' y 3* del cebador correspondieron respectivamente a las posiciones 1325-1345 de la secuencia de MMP-2 de pollo en la figura. Otro cebador corriente arriba, diseñado para codificar un sitio de inicio de la proteína de MMP-2 de pollo en la posición 516, después de un sitio de restricción BamHl interno diseñado, para inserción dentro del vector pGEX-l?T GST, y para codificar un residuo de cisteína en la posición 517, tuvo la secuencia de nucleótidos (5 ' GCAGGATCCGAGTGCTGGGTTTATAC3 ' (SEQ ID NO 38)). Los extremos 5 ' y 3 ' del cebador correspondieron respectivamente a las posiciones 1537-1562 de la secuencia de MMP-2 de pollo. Un tercer cebador corriente arriba, diseñado para codificar un sitio de inicio de la proteína de MMP-2 de pollo en la posición 549, después de un sitio de restricción de endonucleasa EcoRI interno diseñado, para inserción dentro del vector pGEX-l?T GST, y para codificar un residuo de cisteína en la posición 551, tuvo la secuencia de nucleótidos ( 5 * GCAGAATTCAACTGTGGCAGAAACAAG3 ' (SEQ ID NO 39) ) . Los extremos 5' y 3' del cebador correspondieron respec-tivamente a las posiciones 1639-1665 de la secuencia de MMP-2 de pollo . Estos cebadores corriente arriba se usaron por separado con uno de los siguientes cebadores corriente abajo enlistados posteriormente, para producir las regiones descritas anteriormente del dominio con terminal C de MMP-2 de pollo. Un primer cebador corriente abajo (anti-sentido), diseñado para codificar un sitio de terminación de la proteína de MMP-2 de pollo en la posición 518, para codificar un residuo de cisteína en la posición 517, y para contener un sitio de restricción de endonucleasa EcoRI interno para inserción dentro de un vector GST, tuvo la secuencia de nucleótidos (5 ' GTAGAATTCCAGCACTCAT-TTCCTGC3' (SEQ ID NO 40)). Los extremos 5' y 3' del cebador, escritos en la dirección 5 ' -3 ' , fueron respectivamente complementarios en parte a las posiciones 1562-1537 de la secuencia de MMP-2 de pollo. Un segundo cebador corriente abajo, diseñado para codificar un sitio de terminación de la proteína de MMP-2 de pollo en la posición 552, para codificar un residuo de cisteína en la posición 551, y para contener un sitio de restricción de endonucleasa EcoRI interno para inserción dentro de un vector GST, tuvo la secuencia de nucleótidos (5 ' TCTGAATTCT-GCCACAGT-TGAAGG3 ' (SEQ ID NO 41)). Los extremos 5' y 3' del cebador, escritos en la dirección 5 ' -3 ' , fueron respectivamente complementarios en parte a las posiciones 1666-1643 de la secuencia de MMP-2 de pollo. Un tercer cebador corriente abajo, diseñado para codificar un sitio de terminación de la proteína de MMP-2 de pollo en la posición 637, y para contener un sitio de restricción de endonucleasa EcoRI interno para inserción dentro de un vector GST, tuvo la secuencia de nucleótidos (5 ' TTGAA-TTCTTCTACAGTTCA3 ' (SEQ ID NO 42)) . Los extremos 5' y 3' del cebador, escritos en la dirección 5 ' -3 ' , fueron respectivamente complementarios en parte a las posiciones 1932-1912 de la secuencia de MMP-2 de pollo. Las regiones del término carboxi de MMP-2 de pollo fijadas mediante los cebadores corriente arriba y corriente abajo anteriores, que se usan en combinaciones particulares para producir las proteínas de fusión que contienen cuando menos un residuo de cisteína diseñado como se describió anteriormente, se amplificaron por separado por 30 ciclos con una temperatura de templado de 55C, de conformidad con las instrucciones del fabricante para el Sistema Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) . Los productos de amplificación resultantes se purificaron por separado, se digirieron con las enzimas de restricción BamHl y/o EcoRI según fue necesario, y se volvieron a purificar antes de la ligación dentro del vector de proteína de fusión GST apropiado, ya sea pGEX-3X ó pGEX-l?T, como se indicó anteriormen-te por el marco de lectura del cebador de oligonucleótido co-rriente arriba. Para ligar los productos de MMP-2 amplificados, se digirieron igualmente los vectores, así como también se desfosforilaron antes de la reacción de ligación. Después se transformaron por separado las células BL21 de la cepa de E. coli competentes, con las construcciones de vector que contenían MMP-2 resultantes mediante choque de calor. Después se rastrearon las colonias resultantes para ver la incorporación del plásmido de codificación de la proteína de fusión apropiada mediante reacción de cadena de polimerasa, y la producción de la proteína de fusión de GST dimensionada apropiada, antes del secuenciamiento por dideoxi de clones positivos, para verificar la integridad de la secuencia de codificación introducida. Después se realizó la purificación de las proteínas de fusión de GST recombinante, usando cultivos de fase de orden de magnitud inducidos por IPTG, esencialmente como se describió anteriormente para producir las otras proteínas de fusión GST-MMP-2. Los resultados de la inhibición de los ensayos de unión celular con diferentes proteínas de MMP-2 de pollo, así como con otros péptidos, indican que la MMP-2 intacta, la proteí-na de fusión CTMMP-2 (2-4) de los residuos 445-637 y el péptido 66203 (SEQ ID NO 5), pero no MMP-2 (1-445) y el péptido 69601 de control, inhibieron la adhesión de células CS-1 que expresan ß3 a la vitronectina pero no a la laminina, y mediante lo mismo, inhibieron la fijación del receptor de vitronectina (o¡vß3) a la vitronectina por medio de interferir con la actividad de fijación de c-vß3 normal. Otras proteínas de fusión CTMMP-2 7-1 de los residuos 274-637, 10-1 de los residuos 292-637 y 4-3 de los residuos 274-400 tuvieron menos efecto en la adhesión celular en comparación con 2-4. En adición a las proteínas de fusión de GST de MMP-2 de pollo descritas anteriormente, se produjeron dos proteínas de fusión de GST de MMP-2 de humano, para expresar las regiones de aminoácidos 203-631 y 439-631 del polipéptido de proenzima MMP-2 de humano madura. Las regiones indicadas corresponden respectiva-mente a las regiones de MMP-2 de pollo 203-637 y 445-637. Las proteínas de fusión de MMP-2-GST de humano se produjeron mediante reacción de cadena de polimerasa, como se describió anteriormente para las proteínas de fusión de MMP-2-GST de pollo, utilizando una plantilla de ADNc que codificó todo el marco de lectura abierto de MMP-2 de humano proporcionado por el Doctor W. G. Stetler-Stevenson en el Instituto Nacional de Cáncer, Bethesda, Maryland, Estados Unidos. La secuencias del cebador 5' corriente arriba se diseñaron en base a la secuencia previamente publicada de MMP-2 de humano (Collier y colaboradores, J. Biol . Chem. , 263:6579-6587 (1988), y para codificar un sitio de restricción EcoRI interno introducido, para permitir la inserción de los productos amplificados, dentro del vector de expresión apropiado. Un cebador corriente arriba, diseñado para codificar un sitio de inicio de la proteína de MMP-2 de humano en la posición 203 después de un sitio de restricción de endonucleasa EcoRI interno diseñado, para inserción dentro del vector GST de pGEX-l?T, tuvo la secuencia de nucleótidos ( 5 ' GATGAATTCTACTG-CAAGTT3* (SEQ ID NO 43)). Los extremos 5' y 3' del cebador correspondieron respectivamente a las posiciones 685-704 de la secuencia del marco de lectura abierto de MMP-2 de humano. Otro cebador corriente arriba, diseñado para codificar un sitio de inicio de la proteína de MMP-2 de humano en la posición 439 después de un sitio de restricción EcoRI interno diseñado, para inserción dentro del vector GST de pGEX-l?T, tuvo la secuencia de nucleótidos (5 ' CACTGAATTCATCTGCAAACA3 ' (SEQ ID NO 44)). Los extremos 5 ' y 3 ' del cebador correspondieron respectivamente a las posiciones 1392 y 1412 de la secuencia del marco de lectura abierto de MMP-2 de humano. Cada uno de los cebadores anteriores se usaron por separado con un cebador corriente abajo, que tiene los extremos 5' y 3' respectivamente complementarios a las bases 1998 y 1978 de la secuencia de MMP-2 de humano, que termina distante al marco de lectura abierto de MMP-2, y dirige la terminación de la proteína después del residuo aminoácido 631. Los productos amplificados produjeron proteínas de fusión expresadas que contenían los residuos aminoácidos 203-631 (SEQ ID NO 45) y 439-631 (SEQ ID NO 18) de MMP-2 de humano. Se purificaron los productos de la reacción de cadena de polimerasa resultantes, se digirieron con EcoRI y se volvieron a purificar para ligación dentro de un plásmido pGEX-l?T que se digirió de manera similar y se desfosforilaron antes de la reacción de ligación. Las células se transformaron como se describió anteriormente. También se prepararon otras proteínas de fusión de MMP-2 de humano que contenían los residuos aminoácidos 410-631 (SEQ ID NO 17), 439-512 (SEQ ID NO 19), 439-546 (SEQ ID NO 20), 510-631 (SEQ ID NO 21) y 543-631 (SEQ ID NO 22), como se describió anteriormente, para usarse en los métodos de esta invención. B. Ensavo de Fijación de Ligando-Receptor Se rastrearon adicionalmente los péptidos sintéticos preparados en el Ejemplo 1, junto con las proteínas de fusión de MMP-2 descritas anteriormente, mediante la medición de su habilidad para antagonizar la actividad de fijación del receptor de oívß3 en ensayos de fijación de ligando purificado-receptor. El método para estos estudios de fijación lo ha descrito Barbas y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 90:10003-10007 (1993), Smith y colaboradores, J. Biol. Chem., 265:11008-11013 (1990), y Pfaff y colaboradores, J. Biol. Chem. , 269:20233-20238 (1994), cuyas descripciones están incorporadas a la presen-te como referencia. En la presente se describe un método de identificación de antagonistas en un ensayo de fijación de ligando-receptor en el cuál se inmoviliza el receptor a un soporte sólido y el ligando y los antagonistas son solubles. También se describe un ensayo de fijación de ligando-receptor en el cuál se inmoviliza el ligando a un soporte sólido, y el receptor y los antagonistas son solubles. Brevemente, las integrinas purificadas seleccionadas se inmovilizaron por separado en pozos de microtítulo Titertek a una concentración de recubrimiento de 50 nanogramos (ng) por pozo. La purificación de los receptores que se usan en los ensayos de fijación de ligando-receptor es bien conocida en la técnica, y se pueden obtener rápidamente con métodos familiares-para uno de experiencia ordinaria en la técnica. Después de la incubación durante 18 horas a 4C, se bloquearon los sitios de fijación no específicos en la placa con 10 miligramos/mililitro (mg/ml) de albúmina de suero bovino (BSA) en solución salina regulada con Tris. Para los estudios de inhibición, se probaron diferentes concentraciones de péptidos seleccionados de la Tabla 1 para ver su habilidad para bloquear la fijación de la 125I-vitronectina ó el 125I-fibrinógeno a los receptores de integrina, avß3 y aIIbß3. Aunque estos ligandos exhiben fijación óptima para una integrina particular, la vitronectina para o¡vß3 y el fibrinógeno para ?fIIbß3, la inhibición de los estudios de fijación usando péptidos para bloquear la fijación del fibrinógeno a cualquier receptor, permitieron la determinación exacta de la cantidad en micromoles (uM) de péptido necesarios para inhibir la media-máxima de la fijación del receptor al ligando. Se usaron ligandos radioetiquetados a concentraciones de 1 nM, y se agredió la fijación por separado con péptidos sintéticos no etiquetados.

Después de una incubación de tres horas, se removió el ligando libre mediante lavado y se detectó el ligando fijado mediante conteo gama. Los datos de los ensayos en donde se usaron los péptidos cíclicos seleccionados enlistados en la Tabla 1, para inhibir la fijación de los receptores y el fibrinógeno radioetiquetado, para los receptores de avß3 y o-IIbß3 inmovilizados por separado, fueron altamente reproducibles con el error entre puntos de datos típicamente debajo del 11 por ciento. Como se muestra en la Tabla 2, los datos IC50 en micromoles (IC50 uM) se expresan como el promedio de puntos de datos duplicados ± la desviación estándar. Tabla 2 No. de Péptido ot,.ß, (IC.n uM) a,tJ, (ICn uM. 62181 1.96 ± 0.62 14.95 ± 7.84 62184 0.05 + 0.001 0.525 ± 0.10 62185 0.085 ± 0.16 100 ± 0.001 62187 0.05 ± 0.001 0.26 ± 0.056 62186 57.45 ± 7.84 100 ± 0.001 62175 1.05 ± 0.07 0.63 + 0.18 62179 0.395 ± .21 0.055 + 0.007 Por lo tanto, los péptidos cíclicos que contienen RGD o derivatizados por RGD 62181, 62184, 62185 y 62187, cada uno teniendo un residuo aminoácido D-, exhibieron inhibición prefe-rencial de fijación de fibrinógeno al receptor de o-vß3, según se midió por la concentración más baja de péptido requerido para la inhibición media-máxima, en comparación con aquella para el receptor de o-IIBß3. En contraste, los otros péptidos cíclicos que contienen RGD o derivatizados por RGD, 62186, 62175 y 62179, no fueron tan efectivos para bloquear la fijación del fibrinógeno a avß3 ó exhibieron inhibición preferencial de fijación del fibrinó-geno a o-?IBß3j en comparación a o-vß3. Estos resultados son consistentes con aquellos que publicó recientemente Pfaff, y colaboradores, J. Biol. Chem., 269:20233-20238 (1994) en los que el péptido cíclico RGDFV (en donde F indica un residuo aminoácido D-) inhibió específicamente la fijación del fibrinógeno a la integrina avß3 y no a las integrinas ?íIIbß3 ó o-5ß!. Se realizaron ensayos de inhibición de fijación similares con péptidos linearizados que tenían o carecían de un motivo RGD, cuyas secuencias se derivaron de la subunidad del receptor av, la subunidad del receptor oíIIb o las secuencias de residuos aminoácidos del ligando de vitronectina. En la Tabla 1 se enlistan las secuencias de los péptidos lineales, 62880 (residuos aminoácidos 35-49 derivados de VN) , 62411 (residuos aminoácidos 676-687 derivados de av) ; 62503 (residuos aminoácidos 655-667 derivados de av) y 62502 (residuos aminoácidos 296-306 derivados de o:IIb) . Cada uno de estos péptidos se usaron en ensayos separados para inhibir la fijación ya sea de vitronectina (VN) o fibrinógeno (FG) a ya sea a?rbß3 o o-vß3. En la Tabla 3 se muestran los datos IC50 en micromoles (IC50 uM) de un ensayo individual para cada experimento.

Tabla 3 No. de Péptido «IIb 3 IC50 ( µM) Oívß IC50 ( µM) FG VN FG VN 62880 4 . 2 0 . 98 <0 . 1 0 . 5 62411 >100 >100 >100 >100 62503 >100 >100 >100 >100 62502 90 5 >100 >100 Los resultados de la inhibición de los ensayos de fijación del ligando a los receptores de integrina seleccionados con péptidos linearizados, muestran que solamente el péptido 62880 fue efectivo para inhibir la fijación media-máxima ya sea de fibrinógeno o vitronectina a c.vß3, según se midió mediante la concentración más baja del péptido requerido para la inhibición media-máxima en comparación con el receptor de ?íIIbß3. Ninguno de los otros péptidos linearizados fueron efectivos para bloquear la fijación del ligando a avß3, aunque el péptido 62502 fue efectivo para bloquear la fijación de vitronectina a o-?Ibß3. En otros ensayos de fijación de ligando-receptor realizados como se describió anteriormente, con la excepción de que la detección de la fijación o inhibición de los mismos fue con ensayo inmunosorbente enlazado con enzima e IgG anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa, se mostró que los ligandos vitronectina, MMP-2 y fibronectina a un rango de 5 - 50 ng/pozo, y enlistados en el orden de efectividad, se fijaron al receptor de avß3 inmovilizado, mientras el colágeno no lo hizo. En adición, se evaluó la habilidad de los péptidos para inhibir la fijación ya sea de MMP-2 o vitronectina a ?ívß3 inmovilizada, con los péptidos 69601 (SEQ ID NO 6) y 66203 (SEQ ID NO 5) . Solamente el péptido 66203 fue efectivo para inhibir la fijación de cualquier sustrato al receptor de o¡vß3, mientras que el péptido 69601 de control falló al no tener un efecto con ningún ligando. Se confirmó la especificidad de la fijación de MMP-2 a los receptores de integrina con un ensayo de fijación de receptor de fase sólida, en el que se mostró que la MMP-2 yodada se fijó a ofvß3 y no a ?íIIbß3 que se había inmovilizado en una fase sólida (300 cpm de fijación contra aproximadamente 10 CPM de fijación) . Se demostró la habilidad de un péptido derivado de, o proteína de fusión de MMP-2 para inhibir la fijación específica de MMP-2 a o-vß3, en un ensayo comparable, cuyos resultados se muestran en la Figura 23. La proteína de fusión GST-CTMMP-2 (445-637) (a la que también se hace referencia como CTMMP-2 (2-4)) preparada como se describió anteriormente, etiquetada GST-MAID, inhibió la fijación de MMP-2 yodada a c-vß3, mientras que el GST solo no tuvo ningún efecto con niveles de CPM de fijación comparables a o los pozos que no reciben ningún inhibidor en absoluto (etiquetados NT) . La proteína de fusión de MMP-2 a la que se hace referencia como CTMMP-2 (274-637) , a la que también se hace referencia como CTMMP-2 (10-1) , falló al no inhibir la fijación de MMP-2 etiquetada a avß3. Se confirmó la especificidad de la interacción del receptor con los antagonistas derivados de MMP-2, con la fijación y la inhibición de ensayos de fase sólida de fijación. La CTMMP-2(2-4), etiquetada en la Figura 24 como [1251] GST2-4, se fijó a cfvß3 y no a c-IIbß3, mientras que CTMMP-2 (10-1) , etiquetada en la Figura 24 como [1251] GST10-1, no se fijó a ningún receptor en el ensayo de fase sólida in vitro. En adición, se desafió la fijación de GST2-4 etiquetada por GST2-4 no etiquetada. Por lo tanto, se puede usar el ensayo de ligando-receptor descrito en la presente para rastrear péptidos sintéticos tanto circulares como linearizados que exhiban especificidad selectiva por un receptor de integrina particular, específicamente o-vß3, como se usan como antagonistas de receptor de vitronectina (o-vß3) en la práctica de esta invención. 5. Caracterización de la Membrana Corioalantoica de Pollo (CAM) No Tratada A. Preparación de la CAM Se puede inducir la angiogénesis en la membrana corioalantoica de pollo (CAM) después de que la angiogénesis embriónica normal ha dado como resultado la formación de vasos sanguíneos maduros. Se ha mostrado que la angiogénesis se induce en respuesta a citocinas específicas o fragmentos de tumor, como lo describen Leibovich y colaboradores, Nature, 329:630 (1987) y Ausprunk y colaboradores, Am. J. Pathol. , 79:597 (1975). Se prepararon membranas corioalantoicas de pollo a partir de embriones de pollo para la inducción subsecuente de la angiogénesis y la inhibición de la misma, como se describe en los Ejemplos 6 y 7, respectivamente. Se obtuvieron embriones de pollo de 10 días de edad con Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) , y se incubaron a 37C con 60 por ciento de humedad. Se hizo un pequeño agujero a través del cascarón, en el extremo del huevo, directamente sobre el saco de aire, con el uso de una broca de oficio pequeña (Dremel, División de Emerson Electric Co. Racine Wl) . Se perforó un segundo agujero en el lado ancho del huevo, en una región desprovista de vasos sanguíneos embriónicos, determinada previamente por medio de examinar al trasluz el huevo. Se aplicó presión negativa al agujero original, lo que dio como resultado que la CAM (membrana corioalantoica) se apartara de la membrana del cascarón, y creando un saco de aire falso sobre la membrana corioalantoica de pollo. Se cortó una ventana cuadrada de 1.0 centímetro (cm) x 1.0 centímetro a través del cascarón, sobre la membrana corioalantoica de pollo suelta, con el uso de una rueda de esmeril de modelo pequeño (Dremel) . La pequeña ventana permitió el acceso directo a la membrana corioalantoica de pollo fundamental . Después la preparación de membrana corioalantoica de pollo resultante se usó ya sea a 6 días de la embriogénesis, una etapa marcada por neovascularización activa, sin tratamiento adicional a la membrana corioalantoica de pollo que refleja el modelo usado para evaluar los efectos sobre la neovascularización embriónica, o se usó a 10 días de la embriogénesis, en donde la angiogénesis había disminuido. La última preparación se uso, por lo tanto, en esta invención, para inducir la angiogénesis renovada en respuesta al tratamiento con citocina o al contacto con el tumor, como se describe en el Ejemplo 6. B. Histología de la CAM Para analizar la estructura microscópica de las membranas corioalantoicas de embrión de pollo y/o los tumores humanos que se resectaron de los embriones de pollo, como se describe en el Ejemplo 8, se prepararon membranas corioalantoicas de pollo y tumores para seccionamiento congelado, como se descri-be en el Ejemplo 3A. Se cortaron secciones de seis mieras (um) de grosor de los bloques congelados en un micrótomo de crióstato para análisis de inmunofluorescencia. La Figura 4 muestra una fotomicrografía típica de un área desprovista de vasos sanguíneos en una membrana corioalan-toica de pollo de 10 días de edad no tratada. Ya que la angiogénesis en el sistema de membrana corioalantoica de pollo está descendiendo para esta etapa de la embriogénesis, el sistema es útil en esta invención para simular la producción de vasculatura nueva a partir de vasos existentes de áreas adyacentes dentro de las áreas de la membrana corioalantoica de pollo que está careciendo en ese momento de vasos. C. Perfiles de Integrina en la CAM Detectados mediante Inmunofluorescencia Para ver la distribución de tejido de los receptores de integrina presentes en los tejidos de la membrana corioalantoica de pollo, se fijaron en acetona secciones congeladas de 6 mieras tanto de tejido tumoral como de tejidos de membrana corioalantoica de embrión de pollo, durante 30 segundos, y se mancharon mediante inmunofluorescencia con 10 microgramos/ mililitro (µg/ml) de mAb CSAT, un anticuerpo monoclonal específico para la subunidad de integrina ß., como lo describe Buck y colaboradores, J. Cell Biol . , 107:2351 (1988) y así se usaron para controles, o LM609 como se preparó en el Ejemplo 2. Al manchado primario siguió el manchado con una dilución de 1:250 de anticuerpo secundario etiquetado de rodamina anti-ratón de cabra (Tago) , para permitir la detección del producto de inmunorreacción primario. Después se analizaron las secciones con un microscopio de compuesto de inmunofluorescencia Zeiss. Los resultados del análisis de inmuofluorescencia muestran que los vasos sanguíneos maduros presentes en un embrión de pollo de 10 días sin tratar, expresaron la subunidad ßx de integrina (Figura 5A) . En contraste, en una sección en serie del tejido que se muestra en la Figura 5A, no se reveló ninguna inmunorreactividad con LM609 (Figura 5B) . Por lo tanto, la integrina avß3 detectada por el anticuerpo de LM609 no la habían expresado activamente los vasos sanguíneos maduros presentes en un embrión de pollo no tratado de 10 días de edad. Como se muestra en el modelo de membrana corioalantoica de pollo y en los siguientes Ejemplos, mientras los vasos sanguíneos están experi-mentando nuevo crecimiento en la embriogénesis normal o inducido ya sea por citocinas o tumores, los vasos sanguíneos están expresando avß3. Sin embargo, después de la neovascularización activa, una vez que los vasos han dejado de desarrollarse, la expresión de avß3 disminuye a niveles no detectables mediante análisis de inmunofluorescencia. Esta regulación de la expresión de a:vß3 en los vasos sanguíneos que experimentan angiogénesis, en contraste con la carencia de expresión en vasos maduros, permite la habilidad única de esta invención para controlar e inhibir la angiogénesis, como se muestra en los siguientes Ejemplos, usando el sistema de ensayo de angiogénesis de CAM. En otros perfiles, la metaloproteinasa MMP-2 y c.vß3 se co-localizaron en las células endoteliales que experimentan angiogénesis, tres días después de la inducción por bFGF en el modelo de membrana corioalantoica de pollo de 10 días de edad. La MMP-2 se expresó solamente de manera mínima en los vasos que carecían del receptor de o-vß3. En adición, la MMP-2 se colocalizó con avß3 en vasos sanguíneos asociados con tumor de M21-L angiogénica in vivo (tumores que resultaron de la inyección de células de melanoma de humano M21-L dentro de la dermis de injertos de piel de humano que crecieron en ratones SCID, como se describe en el Ejemplo 11) , pero no con vasos sanguíneos no asociados con tumor existentes previamente. También se obtuvieron resultados similares de la asociación selectiva de MMP-2 y avß3 que llevaban tumores de melanoma CS-1 en el modelo de membrana corioalantoica de pollo, pero no con células CS-1 que carecen de avß3. 6. Ensayo de Angiogénesis de CAM A. Angiogénesis Inducida por Factores de Crecimiento Se ha mostrado que la angiogénesis se induce mediante citocinas o factores de crecimiento, como se hace referencia en el Ejemplo 5A. En los experimentos descritos en la presente, la angiogénesis en la preparación de membrana corioalantoica de pollo descrita en el Ejemplo 5, se indujo mediante factores de crecimiento que se aplicaron localmente sobre los vasos sanguíneos de la membrana corioalantoica de pollo, como se describe en la presente. La angiogénesis se indujo por medio de colocar un disco de filtro de Whatman (papel Filtro de Whatman No. 1) de 5 milímetros (mm) X 5 milímetros, saturado con Solución de Sal Balanceada de Hanks (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) , o HBSS que contenía 150 nanogramos/mililitro (ng/ml) de factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) (Genzyme, Cambridge, MA) en la membrana corioalantoica de pollo de un embrión de pollo de 10 días, en una región desprovista de vasos sanguíneos, y después se sellaron las ventanas con cinta. En otros ensayos, también fueron efectivos 125 nanogramos/mililitro de bFGF para inducir el crecimiento de vasos sanguíneos. Para ensayos en donde se evaluó la inhibición de la angiogénesis con inyecciones intravenosas de antagonistas, primero se indujo la angiogénesis con 1-2 microgra-mos/mililitro de bFGF en medio de crecimiento de fibroblasto. Se supervisó la angiogénesis mediante fotomicroscopía después de 72 horas. Se congelaron instantáneamente las membranas corioalantoicas de pollo, y se fijaron secciones de crióstato de 6 um con acetona, y se mancharon mediante inmunofluorescencia, como se describe en el Ejemplo 5C, con 10 microgramos/mililitro ya sea de anticuerpo monoclonal CSAT anti-ßx ó LM609. La fotomicrografía de inmunofluorescencia en la Figura 5C muestra la expresión incrementada de orvß3 durante la angiogénesis inducida por bFGF en la membrana corioalantoica de pollo, en contraste con la ausencia de la expresión de o.vß3 en una membrana corioalantoica de pollo no tratada, como se muestra en la Figura 5B. La ?ívß3 fue rápidamente detectable en muchos (75 por ciento a 80 por ciento) de los vasos en las membranas corioalantoicas de pollo tratadas con bFGF. En adición, la expresión de la integrina ßx no cambió de aquella que se ve en una membrana corioalantoica de pollo no tratada, puesto que ß2 también fue rápidamente detectable en vasos sanguíneos estimulados. Después se cuantificó la expresión relativa de las integrinas vß3 y ß2, durante la angiogénesis inducida por bFGF, mediante análisis de imagen co-focal láser de las secciones de crióstato de la membrana corioalantoica de pollo. Después se analizaron las secciones manchadas con un microscopio co-focal láser Zeiss. Se seleccionaron veinticinco vasos manchados con LM609 y 15 manchados con CSAT (tamaño promedio ~ 1200 milímetros cuadrados, rango de 350 a 3,500 milímetros cuadrados) a partir de campos aleatorios, y se midió la fluorescencia promedio de rodamina para cada vaso por área de unidad, en unidades arbitrarias mediante análisis de imagen co-focal láser. Los datos se expresan como la intensidad de fluorescencia media en unidades arbitrarias de vasos ± error estándar (SE) . Los resultados graficados en la Figura 6 muestran que el manchado de avß3 se incrementó significativamente (cuatro veces más alto) en las membranas corioalantoicas de pollo tratadas con bFGF, según se determinó mediante la Prueba Wilcoxon Rank Sum Test (P<0.0001), mientras que el manchado de ßx no fue significativamente diferente con el tratamiento con bFGF. El ensayo de membrana corioalantoica de pollo se usó además para examinar el efecto de otro inductor de angiogénesis potente, factor-alfa de necrosis tumoral (TNFo , sobre la expre-sión de las integrinas ß2 y ß3. Se encontró que los discos de filtro impregnados ya sea con bFGF o TNFa, y colocados en las membranas corioalantoicas de pollo de embriones de 10 días, promueven la angiogénesis local después de 72 horas. Los resultados se muestran en las fotomicrografías de las membranas corioalantoicas de pollo ya sea no tratadas (Figura 7A) , tratadas con bFGF (Figura 7B) o tratadas con TNFa (Figura 7C) . Los vasos sanguíneos se distinguen rápidamente en las preparaciones tratadas tanto con bFGF como con TNFa, pero no están presentes en la membrana corioalantoica de pollo no trata-da. Por lo tanto, la aplicación local de un factor de crecimien-to/citocina dio como resultado la inducción de angiogénesis de vasos maduros en un área adyacente dentro del área originalmente desprovista de vasos sanguíneos. En vista de los vasos sanguíneos inducidos por bFGF y la expresión concomitante de avß3 como se muestra en la Figura 5C, el tratamiento de TNFa da como resultado actividades comparables . Estos hallazgos indican que los vasos sanguíneos tanto de humano como de pollo, envueltos en la angiogénesis, muestran la expresión incrementada de o¡vß3. Consistente con esto, se puede inducir la expresión de avß3 en células endoteliales cultivadas, mediante diferentes citocinas in vitro, como lo describen Janat y colaboradores, J. Cell Physiol., 151:588 (1992); Enenstein y colaboradores, Exp. Cell Res. , 203:499 (1992) y Swerlick y colaboradores, J. Invest. Derm., 99:715 (1993) . En los Ejemplos 7A y 7B se presenta el efecto en la angiogénesis inducida por factor de crecimiento por parte del anticuerpo y de los inhibidores de péptido. B. Angiogénesis Embriónica La preparación de la membrana corioalantoica de pollo para evaluar el efecto de los inhibidores de angiogénesis en la formación natural de neovasculatura embriónica fue la de embrión de pollo embriónico de 6 días, como se describió anteriormente. En esta etapa de desarrollo, los vasos sanguíneos están experimentando crecimiento de nuevo y, de esta manera, proporciona un sistema útil para determinar si la avß3 participa en la angiogénesis embriónica. Se preparó el sistema de membrana corioalantoica de pollo como se describió anteriormente, con la excepción de que el ensayo se realizó en el día embriónico 6 más bien que en el día 10. En el Ejemplo 7C se presenta el efecto sobre la angiogénesis embriónica mediante tratamiento con los anticuerpos y péptidos de esta invención. C. Angiogénesis Inducida por Tumores Para investigar el papel de la avß3 en la angiogénesis inducida por tumor, se usaron diferentes fragmentos de melanoma y carcinoma de humano avß3-negativos en el ensayo de membrana corioalantoica de pollo, que se hicieron crecer previamente, y se aislaron de la membrana corioalantoica de pollo de embrión de pollo de 17 días, como lo describen Brooks y colaboradores, J. Cell Biol . , 122:1351 (1993), y como se describe en la presente. Los fragmentos indujeron extensa neovascularización en la presencia de regulador del pH solo. Se indujo la angiogénesis en el sistema de ensayo de membrana corioalantoica de pollo mediante la aposición directa de un fragmento de tumor en la membrana corioalantoica de pollo. La preparación de la membrana corioalantoica de pollo de embrión de pollo fue idéntica al procedimiento descrito anteriormente. En lugar de un disco de papel de filtro, se colocó un fragmento de 50 miligramos (mg) a 55 miligramos en peso de uno de tumor M21-L de melanoma de humano, tumor UCLAP-3 de carcinoma de pulmón de humano, línea celular FG de carcinoma pancreático de humano (Cheresh y colaboradores, Cell, 58:945-953, 1989), o línea celular HEp3 de carcinoma laríngeo de humano, todos los cuáles eran tumores avß3-negativos, en la membrana corioalantoica de pollo en un área originalmente desprovista de vasos sanguíneos. Se usaron la línea celular de melanoma de humano M21- L, línea celular de carcinoma de pulmón de humano UCLAP-3, línea celular de carcinoma laríngeo de humano HEp3, todos avß3-negati-vos, para hacer crecer los tumores humanos sólidos en las membranas corioalantoicas de pollo de embriones de pollo. Primero se aplicó una sola suspensión celular de 8 x 106 de M21-L, UCLAP-3, y FB ó 5 x 105 de células HEp3 a las membranas corioalantoicas de pollo en un volumen total de 30 microlitros de HBSS estéril. Se sellaron las ventanas con cinta, y se incubaron los embriones durante 7 días para permitir el crecimiento de las lesiones tumorales de humano. Al final de los 7 días, ahora un embrión de 17 días, se resectaron los tumores de las membranas corioalantoicas de pollo y se recortaron para dejarlos libres del tejido de la membrana corioalantoica de pollo circundante. Se rebanaron los tumores en fragmentos de tumor de 50 miligramos a 55 miligramos, para usarse en ensayos ya sea de angiogénesis o de crecimiento tumoral . Se colocaron los fragmentos del tumor en un nuevo conjunto de membranas corioalantoicas de pollo de embrión de pollo de 10 días, como se describe en el Ejemplo 6A en un área desprovista de vasos sanguíneos. Se mancharon los tumores que crecieron in vivo en las membranas corioalantoicas de pollo de embrión de pollo para ver la expresión de avß3 con -mAb LM609, como se describe en el Ejemplo 3A. No se observó ningún manchado específico de células tumorales, indicando una carencia de expresión de avß3. Después se trataron subsecuentemente estas preparaciones tumorales de membrana corioalantoica de pollo, como se describe en los Ejemplos 7D y 7E, para medir los efectos de los anticuerpos y péptidos sobre la angiogénesis inducida por tumor. Las preparaciones tumorales de membrana corioalantoica de pollo también se trataron como se describe en los Ejemplos 8, 9, y 12, para medir los efectos de los anticuerpos y péptidos sobre la regresión de tumores y apóptosis de vasos sanguíneos angiogénicos y células vasculares. 7. Inhibición de Angiogénesis según se Midió en el Ensavo CAM A. Inhibición de Angiogénesis Inducida por Factor de Crecimiento mediante la Aplicación Local de Inhibidores 1) Tratamiento con Anticuerpos Monoclonales Para determinar si avß3 juega un papel activo en la angiogénesis, se colocaron discos de filtro saturados con bFGF o TNFa sobre membranas corioalantoicas de pollo, después se añadieron los anticuerpos monoclonales (a los que también se hace referencia como mAb) , LM609 (específico para avß3) , CSAT (específico para ßx) , o P3G2 o también P1F6 (ambos específicos para avß5) a la preparación. Se indujo la angiogénesis en membranas corioalantoicas de pollo de embriones de pollo de 10 días mediante discos de filtro saturados con bFGF. después se trataron los discos con 50 mililitros de HBSS que contenía 25 miligramos de mAb en un volumen total de 25 microlitros de HBSS estéril a 0, 24, y 48 horas. A las 72 horas, se cosecharon las membranas corioalantoicas de pollo y se colocaron en una caja de Petri de 35 milímetros, y se lavaron una vez con 1 mililitro de solución salina regulada con fosfato. Después se analizaron el lado inferior del papel de filtro y el tejido de la membrana corioalantoica de pollo, bajo un estéreo microscopio Olympus, con dos observadores a manera de doble-persiana. Se consideró significativa la inhibición de la angiogénesis cuando las membranas corioalantoicas de pollo exhibieron una reducción de >50 por ciento en la infiltración de vasos sanguíneos de la membrana corioalantoica de pollo directamente bajo el disco. Se repitieron los experimentos cuatro veces por anticuerpo, con 6 ó 7 embriones por condición. En las Figuras 8A-8B se muestran los resultados de los efectos del tratamiento con mAb sobre la angiogénesis inducida por bFGF. En la Figura 8A se muestra una preparación de membrana corioalantoica de pollo no tratada, desprovista de vasos sanguíneos, para proporcionar una comparación con la inducción de vasos sanguíneos por bFGF que se muestra en la Figura 8B y los efectos sobre la misma mediante las mAbs en las Figuras 8C-8E.

Aproximadamente el 75 por ciento de estas membranas corioalantoicas de pollo tratadas con mAb LM609 exhibieron una inhibición de >50 por ciento de la angiogénesis, como se muestra en la Figura 8E, y muchas de éstas aparecieron desprovistas de infiltración de vasos. En contraste, el control de regulador del pH (Figura 8A) y los discos tratados con mAbs CSAT (Figura 8C) y P3G2 (Figura 8D) mostraron consistentemente vascularización extensa. Se obtuvieron resultados idénticos cuando se indujo la angiogénesis con TNFa. Para examinar los efectos de estos mismos anticuerpos sobre vasos sanguíneos maduros existentes previamente del desarrollo de vasos normal adyacente a las áreas desprovistas de vasos, se colocaron discos de filtro saturados con mAbs en las regiones vascularizadas de las membranas corioalantoicas de pollo de embriones de 10 días, que no recibieron la aplicación local de citocina. Ninguna de las tres mAbs afectaron los vasos existentes previamente, según se evaluó mediante visualización bajo un estéreo microscopio. Por lo tanto, la mAb LM609 inhibió selectivamente solamente el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos, y no afectaron los vasos sanguíneos maduros presentes en áreas adyacentes. Este mismo efecto se vio con la aplicación de péptidos sintéticos aplicados ya sea localmente o intravenosamente, como se describe en los Ejemplos 7A2) y 7E2), respectivamente . 2) Tratamiento con Péptidos Sintéticos También se realizaron ensayos de membrana corioalantoica de pollo con los péptidos sintéticos de esta invención, para determinar el efecto de los péptidos cíclicos y linearizados sobre la angiogénesis inducida por factor de crecimiento. Se prepararon los péptidos como se describe en el Ejemplo 1, y se presentaron 80 ug de péptido en un volumen total de 25 microlitros de HBSS estéril. Se aplicó inmediatamente la solución del péptido a la preparación de membrana corioalantoica de pollo, y después nuevamente a las 24 y 48 horas. A las 72 horas se disecaron el papel de filtro y el tejido de membrana corioalan-toica de pollo circundante, y se vio como se describió anteriormente. Los resultados de este ensayo revelaron ser similares a aquellos que se muestran en las Figuras 9A-9C, como se describe en el Ejemplo 7E2), en donde se inyectaron intravenosamente péptidos sintéticos dentro de vasos sanguíneos inducidos por tumor. Aquí, con el péptido de control, 62186, los vasos sanguíneos inducidos por bFGF permanecieron sin perturbación, como se muestra en la Figura 9A. En contraste, cuando se aplicó el péptido RGD cíclico, 62814, al filtro, se inhibió la formación de vasos sanguíneos dejando el área desprovista de vasculatura nueva. Este efecto fue similar en apariencia a aquel que se muestra en la Figura 9B, como se describe en el Ejemplo 7E2) posteriormente. En adición, como también se muestra en la Figura 9C para péptidos inyectados intravenosamente, en áreas en las cuáles estaban presentes vasos sanguíneos maduros, todavía lejos de la colocación del filtro saturado con factor de crecimiento, no se vio ningún efecto con el tratamiento local de péptidos sintéticos en estos vasos externos. La actividad inhibidora de los péptidos sobre la angiogénesis está limitada, por lo tanto, a las áreas de la angiogénesis inducida por los factores de crecimiento, y no afecta los vasos maduros adyacentes, existentes previamente, ni dieron como resultado ninguna citotoxicidad dañina para el área circundante. Se realizaron ensayos similares con los otros pépti-dos sintéticos preparados en el Ejemplo 1 y enlistados en la Tabla 1. 3) Tratamiento con Fragmentos de Péptido MMP- 2 Para demostrar los efectos biológicos de los fragmentos de péptido MMP-2 sobre la angiogénesis, se realizaron ensayos de membrana corioalantoica de pollo como se describió anteriormente, con la excepción de que la angiogénesis se indujo con discos de filtro saturados durante 10 minutos con bFGF a una concentración de 1.0 microgramo/mililitro en HBS. Después se colocaron los discos en la membrana corioalantoica de pollo en un área que se redujo en el número de vasos existentes previamente. Después se aplicó localmente la proteína de fusión CTMMP-2 (410-637) con terminal C, preparada como se describió anteriormente, o la proteína de fusión (RAP) asociada con el receptor GST de control (1.5 microgramos en 30 microlitros de HBSS), al disco de filtro una vez al día durante un total de tres días. Al final del período de incubación, se sacrificaron los embriones y se resectaron el disco de filtro y el tejido de membrana corioalantoica de pollo de fundamento, y se analizaron para ver la angio-génesis con un estéreo microscopio. Se cuantificó la angiogénesis mediante el conteo del número de puntos de ramificación de los vasos sanguíneos que ocurren dentro de los confines de los discos de filtro. Se considera que los vasos sanguíneos ramificados corresponden principalmente a nuevos vasos sanguíneos angiogéni-cos en surgimiento. La cuantificación se realizó a manera de doble persiana, por medio de cuando menos dos observadores independientes. Los resultados se expresan como el índice Angiogénico, en donde el índice angiogénico es el número de puntos de ramifica-ción (estimulados por bFGF) menos el número de puntos de ramificación (no estimulados por el control) por disco de filtro. Los experimentos rutinariamente tuvieron 6-10 embriones por condición. En las Figuras 25A-D, 26 y 27 se muestran los resul-tados del ensayo de angiogénesis de membrana corioalantoica de pollo. En la Figura 25, una serie de fotografías divididas en cuatro figuras, Figuras 25A-D, se ilustra la comparación de angiogénesis inhibida en la presencia de la proteína de fusión CTMMP-2 (CTMMP-2 (410-637) ) (Figuras 25C-D) , y no inhibida en la presencia de la proteína de fusión GST de control (Figuras 25A- B) . Las Figuras 26 y 27 son gráficas de barras que ilustran el índice de angiogénesis de los ensayos de angiogénesis de membrana corioalantoica de pollo con CTMMP-2, las mismas proteínas de fusión que antes, comparadas con los controles (proteína de fusión bFGF solamente o GST-RAP) . En la Figura 27, se muestran los resultados de dos experimentos separados (#1 y #2) , usando la proteína de fusión CTMMP-2 (410-637) . Estos resultados demostrados en las tres figuras indican que una proteína de fusión CTMMP-2 o polipéptido que contiene un dominio con terminal C de MMP-2, es una composición útil para la inhibición de angiogénesis mediada por bFGF, mediante la inhibición de avß3. B. Inhibición de Anqioqénesis Inducida por Factor de Crecimiento, Mediante la Aplicación Intrave- nosa de Inhibidores 1) Tratamiento con Anticuerpos Monoclonales También se evaluó el efecto sobre la angiogénesis inducida por factor de crecimiento con anticuerpos monoclonales inyectados intravenosamente dentro de la preparación de membrana corioalantoica de pollo, para usarse en esta invención. La preparación de las membranas corioalantoicas de pollo de embrión de pollo para las inyecciones intravenosas fue esencialmente como se describe en el Ejemplo 7A con algunas modificaciones. Durante los procedimientos de examinación al trasluz se seleccionaron los vasos sanguíneos prominentes y se hicieron marcas en el cascarón del huevo para indicar sus posiciones. Se perforaron agujeros en el cascarón y se apartaron las membranas corioalantoicas de pollo, y se colocaron papeles de filtro saturados con bFGF en las membranas corioalantoicas de pollo, como se describió anteriormente. Se sellaron las ventanas con cinta estéril, y se volvieron a colocar los embriones en la incubadora. Veinticuatro horas después, se cortó cuidadosamente una segunda ventana pequeña en el costado lateral del cascarón del huevo, directamente sobre los vasos sanguíneos prominentes previamente seleccionados. Se removió cuidadosamente el cascarón exterior del huevo, dejando intactas las membranas embriónicas. La membrana del cascarón se hizo transparente con una pequeña gota de aceite mineral (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, Connecti-cut, Estados Unidos) , lo que permitió que se visualizaran fácilmente los vasos sanguíneos. Se inocularon mAbs estériles, o péptidos sintéticos, los últimos de los cuáles se describen posteriormente, directamente dentro de los vasos sanguíneos una vez con una aguja calibre 30 a una dosis de 200 microgramos de IgG por embrión, en un volumen total de 100 microlitros de PBS estéril. Se sellaron las ventanas con cinta, y se permitió que los embriones se incubaran hasta 72 horas. Se analizaron los discos de filtro y los tejidos de la membrana corioalantoica de pollo circundantes, como se describió anteriormente. Para determinar la ubicación de LM609 mAb en los tejidos de la membrana corioalantoica de pollo o en los tejidos tumorales, como se muestra aquí y en los siguientes Ejemplos, que se inocularon previamente de manera intravenosa con LM609, se bloquearon las secciones fijas con 2.5 por ciento de BSA en HBSS durante 1 hora a la temperatura ambiente, seguido por manchado con una dilución al 1:250 de anticuerpo secundario etiquetado de rodamina anti-ratón de cabra (Tago) . Después se analizaron las secciones con un microscopio de compuesto de inmunofluorescencia Zeiss . En las Figuras 10A-10C se muestran los resultados del tratamiento con anticuerpo intravenoso a la preparación CAM de vasos sanguíneos inducidos por bFGF. En la Figura 10A, se muestra la angiogénesis inducida como resultado del tratamiento con bFGF. Como se muestra en la Figura 10B, no se vio ningún cambio para la presencia de vasculatura inducida por bFGF con la exposición intravenosa a mAb P3G2, un anticuerpo anti-avß5. En contraste, como se muestra en la Figura 10C, el tratamiento de la preparación de membrana corioalantoica de pollo de angiogénesis inducida por bFGF con LM609, un anticuerpo anti-avß3, dio como resultado la inhibición completa del crecimiento de vasos nuevos dentro del área de filtro. El efecto inhibidor sobre la angiogénesis resulta, por lo tanto, de la inhibición de la actividad del receptor de avß3 mediante el anticuerpo anti-avß3-específico LM609. Puesto que el bloqueo de la avß5 no inhibe la formación de neovasculatura dentro del sitio de filtro de las membranas corioalantoicas de pollo, la avß5 no es esencial en comparación con la avß3 para el crecimiento de vasos nuevos. 2) Tratamiento con Péptidos Sintéticos Para las preparaciones de la membrana corioalan-tóica de pollo en las cuales se indujo la angiogénesis con 1-2 ug/ml bFGF como se describió anteriormente, se inyectaron intravenosamente de manera separada los péptidos sintéticos 69601 (control) y 66203 (SEQ ID NO 5), dentro de las preparaciones de la membrana corioalantóica de pollo 18 horas después de la inducción bFGF de la angiogénesis. Se mantuvieron las preparaciones durante unas 36-40 horas adicionales, después de lo cual se determinó el número de puntos de ramificación como se describió anteriormente . En la Figura 28 se muestran los resultados en donde el péptido 66203 inhibió completamente la angiogénesis inducida por bFGF, en contraste con la ausencia de inhibición con el péptido de control. En otros ensayos, se evaluó el péptido 85189 (SEQ ID NO 15) para inhibir la angiogénesis inducida por bFGF en el ensayo de la membrana corioalantóica de pollo sobre un rango de dosis de 10 µg/embrión a 300 µg/e brión. Se realizó el ensayo como se describió anteriormente. En la Figura 29 se muestran los resultados, en donde la dosis efectiva más baja fue de 30 µg, con 100 y 300 µg inhibiendo casi completamente la angiogénesis. En todavía otros ensayos, se comparó el péptido 85189 con los péptidos 69601 y 66203 para ver la actividad anti-angio-génesis. Se realizó el ensayo como se describió anteriormente, con la excepción de que se usaron 50 µg de péptido. Los resultados, marcados en la Figura 30, mostraron que los péptidos 66203 (etiquetado 203) y 85189 (etiquetado 189) , fueron inhibidores efectivos de la angiogénesis mediada por bFGF, en comparación con los controles tratados con bFGF (etiquetados bFGF) y tratados con 69601 (etiquetados 601) . También se valoró la efectividad de las diferentes formulaciones de sal del péptido 85189 en ensayos de la membrana corioalantóica de pollo similares inducidos por bFGF. Se usaron los péptidos a 100 µg/embrión. La misma secuencia de péptido en el HCl (péptido 85189) y en el TFA (péptido 121974), inhibieron la angiogénesis inducida por bFGF con el péptido formulado con HCl siendo ligeramente más efectivos que aquel en el TFA (el número respectivo de puntos de ramificación para el péptido 85189 contra el 121974 es de 30 contra 60) . Las membranas corioalantói-cas de pollo que no se trataron, etiquetadas como "sin citoquina" tuvieron aproximadamente la mitad de puntos de ramificación que aquellos que se vieron con el tratamiento de bFGF, respectivamente 70 contra 190. El tratamiento con el péptido 69601 de control, no tuvo efecto sobre la inhibición de la angiogénesis (230 puntos de ramificación) . Los otros péptidos sintéticos que se_ prepararon en el Ejemplo 1, se inyectaron intravenosamente de manera separada dentro de los vasos sanguíneos inducidos por el factor de crecimiento en la preparación de la membrana corioalantóica de pollo, como se describió anteriormente. Se valoró de manera similar el efecto de los péptidos sobre la viabilidad de los vasos. 3) Tratamiento con Fragmentos de MMP-2 Con el protocolo que se describió anteriormente, también se valoró el efecto de las proteínas de fusión MMP-2, CTMMP-2 (2-4) , a las cuales también se hace referencia como CTMMP-2(445-467) y CTMMP-2 (10-1) , a las cuales también se hace referen-cia como CTMMP-2 (274-637) . Se realizó el ensayo como se describió anteriormente, con la excepción de que se administraron 50 µg de proteína de fusión a los embriones tratados con bFGF. Se valoró el efecto del tratamiento de la proteína de fusión a las 24 horas, 48 horas y 72 horas. En las Figuras 31A-L se muestran los resultados para estos períodos de tiempo seleccionados, en donde se valoró de manera fotográfica la angiogénesis bajo condiciones de ensayo de no tratamiento, tratamiento de bFGF, tratamiento de bFGF seguido por CTMMP-2 (2-4) , etiquetado como bFGF + MAID (MAID = dominio de inhibición de angiogénesis MMP-2) , y tratamiento de bFGF seguido por CTMMP-2 (10-1) , etiquetado como bFGF + Control. La inducción significativa de la angiogénesis después de 48 y 72 horas, seguido por el tratamiento de bFGF fue inhibida casi por completo solamente por la exposición a CTMMP-2(2-4) . La extensión de la inhibición con CTMMP-2(2-4) fue más grande que aquella que se vio con CTMMP-2 (10-1) , el cual exhibió alguna actividad anti-angiogé-nesis in vivo. Las otras composiciones de MMP-2, MMP-2 completo, fragmentos y proteínas de fusión, que se prepararon como se describió anteriormente, también se inyectaron intravenosamente de manera separada dentro de los vasos sanguíneos inducidos por el factor de crecimiento en la preparación de la membrana corioalantóica de pollo, como se describió anteriormente. Se valoró de manera similar el efecto de los péptidos sobre la viabilidad de los vasos. C. Inhibición de la Angiogénesis Embrionaria mediante Aplicación Tópica. 1) Tratamiento con Anticuerpos Monoclonales Para determinar si el avß3 participa o no en la angiogénesis embrionaria, se examinó el efecto de LM609 sobre el crecimiento nuevo de vasos sanguíneos en las membranas corioalan-tóicas de pollo en embriones de 6 días de edad, una etapa marcada por neovascularización activa, como se describió en el Ejemplo 5A. Se preparó el ensayo de la membrana corioalantóica de pollo como se describió en el Ejemplo 6C con la aplicación tópica subsecuente de discos saturados con mAbs colocados sobre las membranas corioalantóicas de pollo de embriones de 6 días de edad, en la ausencia de citocinas. Después de 3 días, se resecaron y se fotografiaron. Cada experimento incluyó 6 embriones por grupo y se repitió 2 veces.

El anticuerpo LM609 (Figura 11C) , pero no el CSAT (Figura HA) ni el P3G2 (Figura 11B) , evitó el crecimiento vascular bajo estas condiciones; esto indica que el avß3 desempeña un papel sustancial en la neovascularización embrionaria que fue independiente de los factores de crecimiento agregados para la inducción de la angiogénesis. 2) Tratamiento con Péptidos Sintéticos Los péptidos sintéticos que se prepararon en el Ejemplo 1, se agregaron de manera separada a la preparación de la membrana corioalantóica de pollo embrionario que se preparó anteriormente y como se describió en el Ejemplo 5A2) mediante ya sea la aplicación tópica a la membrana corioalantóica de pollo, o la aplicación intravenosa a los vasos sanguíneos. Se valoró de manera similar el efecto de los péptidos sobre la viabilidad de los vasos . D. Inhibición de' la Angiogénesis Inducida por Tumor Mediante Aplicación Tópica 1) Tratamiento con Anticuerpos Monoclonales Además de los ensayos de angiogénesis que se describieron anteriormente, en donde se evaluaron los efectos de los antagonistas anti-avß3, LM609 y diferentes péptidos, sobre la angiogénesis embrionaria, también se investigó el papel del avß3 en la angiogénesis inducida por tumor. Se usaron como un inductor, fragmentos de melanoma M21-L humano negativo de avß3 que se cultivaron y se aislaron previamente a partir de la membrana corioalantóica de pollo de un embrión de pollo de 17 días de edad. Se prepararon los fragmentos como se describió en el Ejemplo 6C. Como se describió anteriormente en el Ejemplo 7A1) , se aplicaron mAbs tópicamente de manera separada a los fragmentos de tumor a una concentración de 25 ug en 25 ul de HBSS y después se sellaron las ventanas con cinta adhesiva. Se agregaron nuevamente las MAbs de la misma manera, a las 24 horas y a las 48 horas. A las 72 horas, se analizaron los tumores y los tejidos de la membrana corioalantóica de pollo circundantes, como se describió anteriormente en el Ejemplo 7A1) . Como se describió en el Ejemplo 6C, los tumores se derivaron inicialmente mediante el trasplante de células M21-L cultivadas, las cuales no expresaron la ihtegrina avß3 como lo describieron Felding-Habermann y colaboradores, J. Clin. Invest., 89:2018 (1992), sobre las membranas corioalantóicas de pollos de embriones de pollos de 10 días de edad. Estos fragmentos negativos de avß3 indujeron la neovascularización extensiva en la presencia de regulador de pH solo, o mAbs CSAT (anti-ßx) o P3G2 (anti-avß5) . En contraste, el mAb LM609 (anti-avß3) evitó la infiltración de la mayoría de los vasos dentro de la masa tumoral y la membrana corioalantóica de pollo circundante. Para poder cuantificar el efecto de los mAbs sobre la angiogénesis inducida por tumor, se contaron los vasos sanguíneos que entran en el tumor dentro del plano focal de la membrana corioalantóica de pollo bajo un microscopio estereoscópico por dos observadores en una manera de persiana doble. Cada barra de datos que se presenta en la Figura 12, representa el número promedio de vasos í SE a partir de 12 membranas corioalantóicas de pollo en cada grupo que representa experimentos duplicados. Este análisis cuantitativo reveló una reducción de tres partes en el número de vasos que entran en los tumores que se trataron con mAb LM609, en comparación con los tumores que se trataron con regulador de pH o los otros mAbs, P3G2 o CSAT ( P< 0.0001), como lo determinó la Prueba de Suma de Rango de Wilco-xon. El hecho de que los tumores M21-L no expresen avß3, indica que el mAb LM609 inhibe la angiogénesis por medio de afectar directamente los vasos sanguíneos, más bien que las células tumorales. Estos resultados corresponden con la distribución histológica del avß3 en las biopsias de tejido canceroso que se muestran en la Figura 3A-3D, en donde se limitó la distribución del avß3 a los vasos sanguíneos en el tumor, y no a las células tumorales mismas. 2) Tratamiento con Péptidos Sintéticos Se aplican tópicamente los péptidos sintéticos que se prepararon en el Ejemplo 1, incluyendo los péptidos derivados de MMP-2 y las proteínas de fusión, al sistema de ensayo angiogénico de la membrana corioalantóica de pollo inducido por tumor, como se describió anteriormente. Se valoró de manera similar el efecto de los péptidos sobre la viabilidad de los vasos. E. Inhibición de la Angiocénesis Inducida por Tumor mediante Aplicación Intravenosa 1) Tratamiento con Anticuerpos Monoclonales Los vasos sanguíneos inducidos por tumor que se prepararon como se describió en el Ejemplo 7E1) , también se trataron con mAbs aplicados mediante inyección intravenosa. Se colocaron los tumores sobre las membranas corioalantóicas de pollo, como se describió en el 7D1) , se sellaron las ventanas con cinta adhesiva y 24 horas más tarde, se inocularon intravenosamente una vez 200 µg de mAbs purificados, en la sangre de embriones de pollo como se describió previamente. Como se describe en el Ejemplo 8 más adelante, después de este período de tiempo, se resecaron los tumores y se analizaron por su peso para determinar el efecto de la exposición del anticuerpo sobre el crecimiento o supresión del tumor. 2 ) Tratamiento con Péptidos Sintéticos También se valoraron los efectos de la exposición del péptido a la vasculatura inducida por tumor en el sistema de ensayo de la membrana corioalantóica de pollo. Se usó la preparación de membrana corioalantóica de pollo por tumor como se describió anteriormente, con la excepción de que en lugar de la inyección intravenosa de un mAb, se inyectaron péptidos sintéticos, preparados como se describe en el Ejemplo 1, intravenosamen-te de manera separada dentro de vasos sanguíneos visibles.

En las Figuras 9A-9C se muestran los resultados de los ensayos de la membrana corioalantóica de pollo con el péptido cíclico, 66203, que contiene sal de HCl, y péptido de control, 62186. En la Figura 9A el tratamiento con el péptido de control no hizo que los abundantes vasos sanguíneos grandes que se indujeron mediante el tratamiento de tumor crecieran en un área originalmente desprovista de vasos sanguíneos de la membrana corioalantóica de pollo. En contraste, cuando se aplicó el péptido RGD cíclico, 66203, un antagonista para el avß3 al filtro, se inhibió la formación de vasos sanguíneos, dejando el área desprovista de vasculatura nueva, como se muestra en la Figura 9B. El efecto inhibitorio del péptido que contenía RGD fue específico y se localizó como probado mediante una ausencia de cualesquier efectos nocivos a los vasos que se localizan adyacen-tes al lugar del lugar. De esta manera, en la Figura 9C, cuando se inyectan intravenosamente los péptidos inhibidores dentro del sistema de ensayo de la membrana corioalantóica de pollo, no se vio ningún efecto en los vasos maduros que existían previamente, presentes en la membrana corioalantóica de pollo en áreas adya-centes, pero distantes, de la ubicación del tumor. Los vasos existentes previamente en esta ubicación no se vieron afectados por el péptido inhibidor que fluía dentro de esos vasos, aunque se inhibió la generación de vasos nuevos a partir de estos vasos que existían previamente dentro de la masa tumoral. De esta manera, se ha demostrado que los péptidos sintéticos incluyendo el 66203 y el 62184, de los cuales se mostró previamente en los ensayos de ligando-receptor en el Ejemplo 4 que eran antagonistas del avß3, inhiben la angiogénesis que está limitada a vasos que están experimentando desarrollo, y no a vasos maduros que exis-tían previamente. Además, la infusión intravenosa de los péptidos no da como resultado ninguna citotoxicidad nociva en el área que circunvecina, como lo demuestra la vasculatura intacta en la Figura 9C. Se realizaron ensayos similares con los otros pépti-dos sintéticos que se prepararon en el Ejemplo 1 y enlistados en la Tabla 1, junto con las composiciones MMP-2 de esta invención. 3) Tratamiento con Fragmentos MMP-2 Se preparó un tumor CS-1 (ß3-negativo) en una membrana corioalantóica de pollo, como se describió anteriormente. Después de 24 horas de crecimiento del tumor, se administró intravenosamente una composición del fragmento MMP-2, designado CTMMP-2(2-4) y preparado como se describió en el Ejemplo 4A, a un fragmento de 50 µg en 100 µl de solución salina regulada por fosfato. Después de 6 días, se evaluó el tumor para ver su masa. Los tumores que se trataron con el CTMMP-2(2-4) se redujeron en la proporción de crecimiento por aproximadamente 50 por ciento, cuando se compararon a la proporción de crecimiento de los tumores de control que se trataron con CTMMP-2 ( 10-1) o con el control de solución salina regulada por fosfato. De esta manera, el antagonista avß3 inhibió el crecimiento del tumor. 8. Inhibición de Crecimiento del Tejido Tumoral Con Antagonistas a„ß. Como se Midió en el Ensayo CAM Como se describió en el Ejemplo 7E1) , además de valor de manera visual el efecto de los antagonistas anti-avß3 sobre el factor de crecimiento o la angiogénesis inducida por tumor, también se valoró el efecto de los antagonistas mediante la medición de cualesquier cambios en la masa tumoral después de la exposición. Para este análisis, se preparó el sistema de ensayo de la membrana corioalantóica de pollo de angiogénesis inducida por tumor como se describió en los Ejemplos 6C y 7D. Al final del período de incubación de 7 días, los tumores resultantes se resecaron a partir de las membranas corioalantóicas de pollo y se limpiaron de cualquier tejido de membrana corioalantóica de pollo residual, se lavaron con 1 mililitro de solución salina regulada por fosfato, y se determinaron los pesos húmedos para cada tumor. Además, la preparación del tumor para el análisis histológico microscópico, incluyó la fijación de ejemplos representativos de tumores en Fijador de Bulins durante 8 horas y la incrustación en parafina. Se cortaron las secciones en serie y se mancharon con hematoxilina y eosina (H&E) para el análisis microscópico. Gladson y colaboradores, J. Clin. Invest., 88:1924 (1991). Se fotografiaron las secciones con un microscopio compuesto de Olympus a 250x. A. Aplicación Tópica En la Tabla 4 se enlistan los resultados de tumor de melanoma humano típico (M21L) , los pesos que resultan de la aplicación tópica del regulador de pH de control, el P3G2 (anti-avß5) o el LM609 (anti-avß3) . Se evaluó un número de embriones para cada tratamiento, calculándose el peso promedio del tumor en miligramos (mg) , junto con el SE del promedio, como se muestra al final de la tabla.

Tabla 4 Embrión No. Tratamiento mAb Pe ¡so Tumor (mg) 1 HBSS 108 2 152 3 216 4 270 5 109 6 174 1 P3G2 134 2 144 3 408 4 157 5 198 6 102 7 124 8 99 1 LM609 24 2 135 3 17 4 27 5 35 6 68 7 48 8 59 Tratamiento mAb Peso Prome :dÍO Tumor (mg) control HBSS 172 + 26 P3G2 171 + 36 LM 609 52 ± 13 La exposición de una masa tumoral de melanoma humano avß3-negativo en el sistema de ensayo de la membrana corioalantói-ca de pollo al LM609, provocó la disminución del peso promedio del tumor no tratado de 172 miligramos + 26 a 52 miligramos ± 13. El anticuerpo P3G2 no tuvo efecto en la masa tumoral. Por esto, el bloqueo del receptor avß3 mediante la aplicación tópica del anticuerpo LM609 específico de avß3 resultó en una regresión de la masa tumoral junto con una inhibición de la angiogénesis, como se muestra en los Ejemplos anteriores. El diámetro medido de la masa tumoral que resultó de la exposición al P3G2, fue de aproximadamente 8 milímetros a 1 centímetro en promedio. En contraste, los tumores tratados con LM609 tuvieron en promedio de 2 a 3 milímetros en diámetro. Las secciones congeladas de estos tumores revelaron una citoarquitectura intacta del tumor para el tumor que se expuso al P3G2, en contraste con una falta de estructura celular organizada en el tumor que se expuso al LM609. Por lo tanto, la actividad del receptor de avß3 es esencial para que un tumor avß3-negativo mantenga su masa nutrida mediante el desarrollo de la neovasculatura que expresa avß3. El bloque del avß3 con los antagonistas de avß3 de esta invención, da como resultado la inhibición de la angiogénesis dentro del tumor que finalmente resulta en la disminución de la masa tumoral. B. Aplicación Intravenosa En la Tabla 5 se enlistan los resultados de los pesos típicos del tumor de carcinoma (UCLAP-3) que resultan de la aplicación intravenosa del regulador de pH de control (PBS, solución salina regulada por fosfato) , del CSAT (anti-ßj.) o del LM609 (anti-avß3) . Se evaluó un número de embriones por cada tratamiento calculándose el peso promedio del tumor de cada uno junto con el SE del promedio, como se muestra al final de la tabla. Tabla 5 Embrión No. Tratamiento mAb Pe ¡so Tumor (mg) 1 PBS 101 2 80 3 67 4 90 1 CSAT 151 2 92 3 168 4 61 5 70 1 LM609 16 2 54 3 30 4 20 5 37 6 39 7 12 Tratamiento mAb Peso Prome :dio Tumor (mg) control PBS 85 ± 7 CSAT 108 ± 22 LM 609 30 ± 6 La exposición de una masa tumoral de carcinoma humano avß3-negativo en el sistema de ensayo de la membrana corioalantóica de pollo al LM609, provocó la disminución del peso promedio del tumor no tratado de 85 miligramos ± 7 a 30 miligramos ± 6. El anticuerpo CSAT no afectó significativamente el peso de la masa tumoral. Por esto, el bloqueo del receptor avß3 mediante la aplicación intravenosa del anticuerpo LM609 específico de avß3 resultó en una regresión de un carcinoma, como lo hizo para la masa tumoral del carcinoma anterior, junto con una inhibición de la angiogénesis como se muestra en los Ejemplos anteriores. Además, se inhibió de manera similar el crecimiento del tumor de melanoma humano, mediante la inyección intravenosa del LM609. . Regresión de Crecimiento del Tejido Tumoral Con Antagonistas de a,,ß3 Como se Midió en el Ensavo de CAM Para valorar adicionalmente los efectos de los antagonistas de avß3 sobre el crecimiento y supervivencia del tumor, se colocaron fragmentos del melanoma humano y fragmentos de carcinomas del pulmón, páncreas, y laringe, sobre las membranas corioalantóicas de pollo de embriones de 10 días de edad, como se describió en el Ejemplo 5A. A. Aplicación Intravenosa 1) Tratamiento con Anticuerpos Monoclonales a) Tratamiento con LM609 (Anti-a.ß- y CSAT (Anti-B.) Veinticuatro horas después de la implantación de la membrana corioalantóica de pollo con los fragmentos de carcinoma del melanoma humano M21-L avß3-negativo, del carcinoma pancreático FG, del carcinoma pulmonar humano UCLAP-3, o del carcinoma laríngeo humano HEp3, se inyectaron intravenosamente los embriones con solución salina regulada por fosfato sola o con una sola dosis (300 ug/100 ul) de ya sea mAb LM609 (anti-avß3) o CSAT (anti-ßi) . Se permitió que los tumores se propagaran durante seis días adicionales. Al final del período de incubación, se resecaron cuidadosamente los tumores y se limpiaron del tejido de la membrana corioalantóica de pollo circundante. Dos investigadores independientes realizaron las disecciones, quitando solamente la masa tumoral sólida que se podía definir fácilmente. Los tumores tenían márgenes bien definidos, por lo que se quitó la membrana delgada semitransparente (CAM) , la cual se puede distin-guir fácilmente de la masa tumoral sólida, sin molestar la masa tumoral misma. Se pesaron los tumores que se resecaron y se examinaron morfológica e histológicamente. Como se muestra en la Figura 13, se determinaron y se compararon los pesos del tumor húmedo al final de los 7 días, con los pesos iniciales del tumor antes de los tratamientos. Cada barra representa el promedio ± S.E. de 5-10 tumores por grupo. El mAb LM609 inhibió significativamente el crecimiento del tumor (p <0.001), en comparación con los controles en todos los tumores que se probaron. Los tumores que se trataron con solución salina regulada por fosfato o CSAT, proliferaron en todos los casos. En contraste, el mAb LM609 no solamente evitó el crecimiento de estos tumores, sino que indujo la regresión extensiva en la mayoría de los casos. De manera importante, estas células tumorales no expresan la integrina avß3, demostrando que la inhibición del crecimiento se debió a los efectos anti-angiogénicos de este anticuerpo neovasculatura, más bien que a las células tumorales directamente . . Tratamiento con LM609 (Anti-a„ß, v P3G2 (Anti- Oív s) Se implantaron fragmentos de tumor de melanoma humano M21-L (50 miligramos) en las membranas corioalantóicas de pollo de embriones de 10 días de edad, como se describió en el Ejemplo 5A. Veinticuatro horas después, se inyectó intravenosamente a los embriones con solución salina regulada por fosfato sola o con una dosis única (300 µg/100 µl) de ya sea mAb LM609 (anti-avß3) o de P3G2 (anti-avß5) . Se permitió que los tumores se propagaran como se describió en el Ejemplo 9A1) anterior, y se examinaron morfológica e histológicamente como se describió en la presente . Se examinaron morfológicamente los ejemplos representativos de los tumores M21-L tratados con mAbs P3G2 (anti-avß5) o LM609 (anti-avß3) . Los tumores tratados con P3G2 eran grandes (8 milímetros de diámetro) y bien vascularizados, mientras que aquellos que se trataron con mAb LM609, eran mucho más pequeños (3 milímetros de diámetro) y carecían de vasos sanguíneos detec- tables . Se examinaron adicionalmente los tumores mediante la preparación de secciones histológicas y manchado con hematoxilina y eosina, como se describió en el Ejemplo 9A1) . Como se muestra en la Figura 14 (panel superior) , los tumores que se trataron con mAb P3G2 (anti-avß5) mostraron numerosas células tumorales viables y activamente .divisoras, como lo indican las cifras mitóticas (cabezas de flecha) , así como mediante los múltiples vasos sanguíneos (flechas) a través de todo el estroma tumoral. En contraste, se detectaron pocas, si es que alguna, células tumorales o vasos sanguíneos en los tumores que se trataron con mAb LM609 (anti-avß3) (Figura 14, panel inferior). Estos resultados demuestran que los antagonistas de la integrina avß3 inhibe la angiogénesis inducida por tumor de los tumores humanos in vivo . Es importante hacer notar que los embriones que se examinaron después de siete días del crecimiento del tumor (día embrionario 17), aparecieron normales después de un examen general, sin importar si habían sido tratados o no con un antagonista de avß3. Estos hallazgos indican que los antagonistas de esta integrina no son tóxicos para los embriones en desarrollo. 2) Tratamiento con Péptidos Sintéticos Se implantaron fragmentos de tumor de melanoma M21-L humano (50 miligramos) en las membranas corioalantóicas de pollo de embriones de 10 días de edad, como se describió en el Ejemplo 5A. Veinticuatro horas después, los embriones recibieron una sola inyección intravenosa de 300 µg/100 µl de ya sea el ciclo-RADfV (69601) y/o el ciclo-RGDfV (66203) . Después de un total de 72 horas, se quitaron los tumores, se examinaron morfológicamente, y se fotografiaron con un microscopio estereoscópi-co, como se describió en el Ejemplo 9A1) . Los paneles que se muestran en las Figuras 15A a 15E corresponden de la siguiente manera: la Figura 15A, duplica las muestras que se trataron con el péptido ciclo-RADfV (69601); la Figura 15B, duplica las muestras que se trataron con el péptido ciclo-RGDfV (66203); la Figura 15C, adyacente al tejido de la membrana corioalantóica de pollo tomado de los mismos embriones que se trataron con el péptido ciclo-RGDfV (66203) y las Figuras 15D y 15E, la ampliación elevada (13x) de los tumores tratados con péptido. La Figura 15D describe los vasos sanguíneos normales del tumor tratado con el péptido de control (69601) . La Figura 15E describe los ejemplos de vasos sanguíneos rotos de tumores tratados con el péptido ciclo-RGDfV (66203) (flechas). Los resultados ilustran que solamente el péptido 66203, en contraste con el péptido de control 69601, inhibió la formación de vaso, y además que los vasos en el tejido de la membrana corioalantóica de pollo adyacente al tumor, no se vieron afectados . Se realizaron ensayos de regresión de tumor adicionales con el péptido 85189 reactivo al avß3 (SEQ ID NO 15) , contra el 69601 como un control. Se realizaron los ensayos como se describió anteriormente, con la excepción de que se inyectaron intravenosamente 100 ug del péptido a la membrana corioalantóica de pollo a las 18 horas después de la implantación. Después de 48 horas más, se resecaron los tumores y se obtuvieron los pesos húmedos . Las Figuras 32, 33 y 34 muestran respectivamente la reducción en el peso del tumor para los tumores UCLAP-3, M21-L y fgM, después de la exposición intravenosa al péptido 85189, en contraste con la falta de efecto con ya sea la solución salina regulada por fosfato o el péptido 69601. 10. Regresión de Crecimiento del Tejido Tumoral Con Antagonistas a„ß. Como se Midió mediante el Ensayo de Modelo Ocular de Conejo In Vivo Se puede observar el efecto de los antagonistas anti-avß3 sobre la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento en las estructuras naturalmente transparentes, como se ejemplificó mediante la córnea del ojo. Los vasos sanguíneos nuevos crecen desde la orilla de la córnea del ojo, el cual tiene un suministro sanguíneo abundante, hacia el centro de la córnea, la cual normalmente no tiene un suministro sanguíneo. Los estimuladores de la angiogénesis, tal como el bFGF, cuando se aplican a la córnea, inducen el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos desde la orilla de la córnea. Los antagonistas de la angiogénesis, cuando se aplican en la córnea, inhiben el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos desde la orilla de la córnea. De esta manera, la córnea experimenta angiogénesis mediante la invasión de las células endoteliales desde la orilla de la córnea dentro del tejido córneo firme lleno de colágeno, el cual se puede ver fácilmente. Por lo tanto, el ensayo de modelo ocular de conejo proporciona un modelo in vivo para la observación directa del estímulo y la inhibición de la angiogénesis, después de la implantación de los compuestos directamente dentro de la córnea del ojo. A. Ensayo de Modelo Ocular de Conejo In Vivo 1) Angiogénesis Inducida por Factores de Crecimiento Se indujo la angiogénesis en el modelo ocular de conejo in vivo con el factor de crecimiento bFGF, y se describe en las siguientes secciones. a. Preparación de Pildoras de Hidrón que Contenían Factor de Crecimiento y Anticuerpos Monoclonales Se prepararon pildoras de polímero de hidrón que contenían factor de crecimiento y mAbs, como lo describieron D' Amato y colaboradores en Proc. Nati. Acad. Sci., EUA, 91:4082-4985 (1994). Las pildoras individuales contenían 650 ng del factor de crecimiento bFGF fijo a un sucralfato (Carafet, Marión Merrell Dow Corporation) para estabilizar el bFGF y asegurar su liberación lenta dentro del tejido circundante. Además, se prepararon las pildoras de hidrón, las cuales contenían ya sea 40 ug del mAb LM609 (anti-avß3) , o mAb P1F6 (anti-avß5) en solución salina regulada por fosfato. Se vaciaron las pildoras en espigas de Teflón preparadas especialmente que tenían un núcleo de 2.5 milímetros perforado dentro de sus superficies . Se colocaron aproximadamente 12 ul de material de vaciado, dentro de cada espiga y se polimerizaron durante toda la noche en una cubierta estéril. Después se esterilizaron las pildoras mediante irradiación ultravioleta. b. Tratamiento con Anticuerpos Monoclonales Cada experimento consistió de tres conejos en los cuales un ojo recibió una pildora que comprendía bFGF y LM609, y el otro ojo recibió una pildora que comprendía bFGF y un mAb P1F6 (anti-avß5) de ratón. El uso de la prueba de ojos en pares para comparar el LM609 (anti-avß3) con el otro mAb y controles solución salina regulada por fosfato, proporciona un medio para la prueba rigurosa para demostrar las diferencias significativas entre los mAbs que se probaron. El mAb P1F6 inmunorreacciona con la integrina avß5, la cual se encuentra sobre la superficie de las células endote-líales vasculares, pero que supuestamente no está involucrado en la angiogénesis. Para determinar si el mAb P1F6 estuvo involucrado o no en la angiogénesis, se prepararon pildoras que contenían solamente este mAb, y se ensayaron como se describe más adelante para confirmar que el mAb no induce la angiogénesis. Todos los MAbs que se probaron se purificaron del fluido de ascitos, usando cromatografía de columna de afinidad de Proteína-A Sefarosa CL-4B, de conformidad con métodos bien conocidos. Después se pasó por diálisis la inmunoglobulina levigada contra solución salina regulada por fosfato y se trató con Detoxi-gel (Pierce Chemicals) para quitar la endotoxina. Se ha mostrado que la endotoxina es un angiogénico poderoso y un estimulante inflamatorio. Por lo tanto, se probaron los mAbs para ver la presencia de endotoxina con el Ensayo de Lisato de Amebo-cito Límulo Cromogénico (Bio-Whittaker) y solamente se usaron aquellos mAbs sin endotoxina detectable en el ensayo de modelo ocular de conejo. Se insertó una pildora de hidrón que comprendía bFGF y mAb LM609 (anti-avß3) o P1F6, dentro de una bolsa córnea que se forma en el ojo de los conejos. La pildora de hidrón también contenía sucralfato para estabilizar el bFGF durante el ensayo. Se implantaron pildoras individuales dentro de "bolsas" creadas de manera quirúrgica, formadas en el estroma medio de la córnea de conejos. Se hizo el procedimiento quirúrgico bajo técnica estéril usando un microscopio de operación modelo M691 de Wild equipado con un separador de haz al cual se montó una cámara para grabar de manera fotográfica las córneas individuales. Se creó una "bolsa" de 3 milímetros x 5 milímetros en el estroma córneo, mediante una incisión de 3 milímetros a la mitad del espesor de la córnea con un cuchillo Beaver 69. Se disecó el estroma de manera periférica usando una espátula de iris y se implantó la pildora con su margen periférico a 2 milímetros del borde. Durante los siguientes 4 días, el bFGF y el mAb se difundieron desde la pildora implantada hacia el tejido circundante y la angiogénesis se efectuó mediante lo mismo desde la orilla de la córnea. En las Figuras 16A a 16E se describen los resultados representativos de cada tratamiento. Se cuantificó la cantidad de vasos presentes y se describió en términos de horas reloj , las cuales se definen como sigue. Se dividió el ojo en 12 secciones iguales, de la misma manera que un reloj se divide en horas. "Una hora reloj de vasos" se refiere a aquella cantidad de vasos que llena un área del ojo equivalente a una hora de un reloj . Los cinco conejos que recibieron solamente bFGF, exhibieron angiogénesis encarnada en la cual habían crecido nuevos vasos sanguíneos desde la orilla de la córnea hacia el centro de la córnea, la cual normalmente no tiene vasos sanguíneos. Uno de estos conejos tuvo solamente 1 hora reloj de vasos para la pildora. Dos de los conejos que recibieron tanto bFGF como mAb LM609, no tuvieron absolutamente ninguna angiogénesis que se pudiera detectar hasta 14 días después de la cirugía. Uno de estos conejos tuvo 3 foci de vasos hemorrágicos e injertados para el día 14. Dos de los conejo que recibieron bFGF y mAb P3G2 (anti-avß5) mostraron vascularización extensiva en la cual habían crecido nuevos vasos sanguíneos desde la orilla de la córnea hacia dentro de la córnea. Uno de estos conejos tuvo solamente de 1 a 2 horas de vasos para la pildora. Como se hizo evidente en el ensayo de modelo ocular de conejo, no se observó ningún efecto angiogénico en los vasos paralimbales normales en la presencia del factor de crecimiento bFGF en los conejos que recibieron mAb LM609 (anti-avß5) . La inhibición completa de la angiogénesis córnea por el mAb LM609 es sustancialmente mayor que la de cualquier reactivo anti-angiogé-nico que se haya reportado anteriormente. c . Tratamiento con Polipéptidos Cada experimento consistió en ocho conejos en los cuales un ojo recibió una pildora que contenía 100 nanogramos (ng) de bFGF, y el otro ojo recibió una pildora que contenía 1 microgramo (ug) de VEFG. Se insertaron las pildoras dentro de la bolsa córnea como se describió anteriormente, y las citocinas estimularon subsecuentemente el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos dentro de la córnea. Se administraron los péptidos de manera subcutánea (s.q.) en 1 mililitros de solución salina regulada por fosfato a una dosis inicial de 50 ug por kilo del conejo en el día de la inserción de la pildora, y diariamente e dieron dosis subcutáneas a 20 ug/kilogramo de allí en adelante.

Después de 7 días, se evaluaron las córneas como se describió anteriormente . Los conejos que recibieron el péptido de control 69601, mostraron crecimiento sustancial de vasos sanguíneos córneos a los 7 días, en los ojos estimulados tanto por vFGF, como por VEGF. Los conejos que recibieron el péptido 85189 mostraron menos del 50 por ciento de la cantidad de crecimiento de vasos sanguíneos córneos, en comparación con los controles en los ojos estimulados por vFGF, y casi 100 por ciento de inhibi-ción en los ojos estimulados por VEGF. 11. Regresión In Vivo de Crecimiento del Tejido Tumoral Con Antagonistas a„ß. Como se Midió mediante el Ensavo de Ratón Quimérico: Humano Se generó un modelo ratón quimérico: humano in vivo por medio de reemplazar una porción de piel de un ratón SCID con prepucio neonatal humano (Figura 17). Después de que se estableció el injerto de piel, se inoculó el prepucio humano con células de carcinoma. Después de que se estableció un tumor que se pudiera medir, se inyectó ya sea mAb LM609 (anti-avß3) o solución salina regulada por fosfato dentro de la vena de la cola del ratón. Después de un período de 2 a 3 semanas, se extirpó el tumor y se analizó por el peso y la histología. A. Ensayo de Ratón Quimérico : Humano In Vivo Se preparó el modelo de ratón quimérico: humano in. vivo, esencialmente como lo describieron Yan y colaboradores en J. Clin, Invest., 91:986-996 (1993) . Brevemente, se quitó quirúrgicamente un cuadro de piel de 2 cm2 de área de un ratón SCID (6-8 semanas de edad) y se reemplazó con un prepucio humano. Se anestesió el ratón y se quitó el pelo mediante rasurado, de un área de 5 cm2 en cada lado de la región abdominal lateral. Se prepararon dos lechos de injerto circulares de 2 cm2 mediante la remoción del espesor completo de la piel abajo hacia la fascia. Se colocaron los injertos de piel humana de espesor completo del mismo tamaño, derivados a partir de prepucio neonatal humano, sobre los lechos de la herida y se suturaron en su lugar. Se cubrió el injerto con una bandita, la cual se suturó a la herida. También se aplicó cinta de tela Micropore para cubrir la herida. Se usaron las líneas celulares de melanoma humano M21-L o de carcinoma de pecho MDA 23.1 (ATCC HTB 26; avß3 negativo mediante la inmunorreactividad de secciones de tejido con mAb LM609) , para formar los tumores humano sólidos sobre los injertos de piel humanos en los ratones SCID. Se inyectó de manera intradérmica una suspensión de una sola célula de M21-L de 5 x 106 o células de MDA 23.1, dentro del injerto de piel humano. Después se observaron los ratones durante 2 a 4 semanas para permitir el crecimiento de tumores humanos que se pudieran medir. B . Aplicación Intravenosa 1) Tratamiento Con Anticuerpos Monoclonales Después del crecimiento de tumores que se pudieran medir, se inyectó intravenosamente a los ratones SCID, los cuales se habían inyectado con células tumorales M21L, dentro de la vena de la cola con 250 µg ya sea de mAb LM609 (anti-avß3) o de solución salina regulada por fosfato, dos veces por semana durante 2 a 3 semanas. Después de este tiempo, se resecaron los tumores de la piel y se limpiaron de tejido circundante. Se evaluaron varios ratones para cada tratamiento, calculándose el peso promedio del tumor de cada tratamiento, como se muestra al final de la Tabla 6. Tabla 6 No. Tumor M21L Tratamiento Peso Tumor (mg) 1 PBS 158 2 192 3 216 4 227 LM609 195 6 42 7 82 8 48 9 37 10 100 11 172 Tratamiento Peso Promedio Tumor (mg) PBS 198 LM609 113 La exposición de la masa tumoral de carcinoma humano M21L avß3-negativo en el sistema de ensayo quimérico ratón: humano al LM609 (anti-avß3) , provocó la disminución del peso del tumor tratado con solución salina regulada por fosfato de 198 miligra-mos a 113 miligramos. Se examinaron morfológicamente los ejemplos representativos de los tumores M21L que se trataron con mAb LM609 (anti-aß3) Y solución salina regulada por fosfato. Los tumores que se trataron con solución salina regulada por fosfato eran grandes (de 8 a 10 milímetros de diámetro) y bien vascularizados, mientras que aquellos que se trataron con mAb LM609 fueron muchos más pequeños (de 3 a 4 milímetros de diámetro) y carecían de vasos sanguíneos detectables. En otros experimentos con células de tumor de melanoma M21-L en el sistema de ensayo quimérico ratón ¡humano, se comparó la respuesta con mAb LM609 con la respuesta que se obtuvo con el péptido sintético 85189 (SEQ ID NO 15) , como se comparó con el péptido sintético de control 69601 (SEQ ID NO 6) . Se realizaron los ensayos como se describió anteriormente. Los resultados, que se muestran en la Figura 35, demuestran que el péptido sintético 85189 redujo el volumen del tumor hasta por debajo de 25 mm3, como se comparó con el péptido de control en donde el volumen del tumor fue de aproximadamente 360 mm3. El mAb LM609 también redujo de manera significativa el volumen del tumor hasta aproximadamente 60mm3. Los tumores que se formaron en los injertos de piel que se habían inyectado con células MDA 23.1, se pudieron detectar y medir. El examen morfológico de los tumores establecidos reveló que había ocurrido la neovascularización a partir del tejido humano injertado dentro de las células del tumor 23.1. De esta manera, el bloqueo del receptor de vß3 mediante la aplicación intravenosa del anticuerpo LM609 avß3-específico y de los péptidos, dio como resultado una regresión en un carcinoma en este sistema de modelo, de la misma manera que los sistemas de la membrana corioalantóica de pollo y de modelo ocular de conejo, como se describió en los Ejemplos 9 y 10, respectivamente . 2) Tratamiento con Péptidos Sintéticos En un procedimiento similar a aquel que se describió anteriormente para los anticuerpos monoclonales, se inyectaron intravenosamente los antagonistas de péptido del avß3 dentro de la vena de la cola de ratones SCID que tenían tumores M21-L que se podían medir. En un análisis preliminar, se realizó una curva de repuesta a la dosis para los péptidos 69601 (control) y 85189 (prueba) que se inyectaron sobre un rango de concentración de 10 a 250 ug/ml. Se determinó el volumen y el peso promedios de los tumores que se resecaron después del tratamiento y en las Figuras 36A y 36B, respectivamente, se muestran los resultados. El péptido 85189 fue efectivo para inhibir el crecimiento del tumor M21-L sobre el rango de concentración que se probó, en comparación con el tratamiento con el péptido de control, siendo la dosis más efectiva la de 250 ug/ml. Para analizar la efectividad del tratamiento con el péptido 85189 sobre un curso de tiempo, se evaluaron los regímenes de tratamiento en el mismo modelo de tumor del SCID. En un ensayo, se inició el tratamiento con cualesquiera de los péptidos 85189 ó 69601 en el día 6, siendo el día 0 el día de la inyección subcutánea del tumor M21-L de células de 3 x 106 dentro de la piel del ratón, con inyecciones intraperitoneales de 250 ug/ml del péptido 85189 o de control 69601 cada tercer día, hasta el día 29. El otro ensayo se realizó de manera idéntica, con la excepción de que el tratamiento se inició en el día 20. Al final de los ensayos, se resecaron los tumores y se determinó el volumen promedio del tumor en mm3. Se marcaron los datos como este valor +/- el error estándar del promedio. Los resultados de estos ensayos, que se muestran respectivamente en las Figuras 37A y 37B, indican que el péptido 85189, pero no el 69601, inhibió el crecimiento del tumor en diferentes días después de que se inició el tratamiento, dependiendo en el régimen de tratamiento particular. De esta manera, el péptido 85189 es un antagonista avß3 efectivo, tanto de la angiogénesis, como del crecimiento tumoral. 12. Estímulo de Células Vasculares para Entrar el Ciclo de la Célula y Someterse a Apoptosis en la Presencia de Antagonistas de la integrina a„ß3 como se Midió en el Ensayo CAM El proceso angiogénico depende claramente de la capacidad de las citocinas, tales como bFGF y VEGF para estimular la proliferación celular vascular. Mignatti y colaboradores, J. Cell Biochem. , 471:201 (1991); Takeshita y colaboradores, J. Clin. Invest . , 93:662 (1994); y Koyama y colaboradores, J. Cell. Physiol . , 158:1 (1994) . Sin embargo, también es aparente que los eventos de señalización pueden regular la diferenciación de estas células vasculares dentro de vasos sanguíneos maduros. De esta manera, es concebible que la interferencia con las señales que se relacionan ya sea con el crecimiento o la diferenciación de las células vasculares que están experimentando crecimiento nuevo o angiogénesis, puede dar como resultado la perturbación de la angiogénesis . Se ha mostrado que los eventos de ligación de integrina participan tanto en la proliferación celular, como en la apoptosis o muerte celular programada in vitro. Schwartz, Cáncer Res. , 51:1503 (1993); Meredith y colaboradores, Mol. Biol. Cell. , 4:953 (1993); Frisch y colaboradores, J. Cell Biol., 124:619 (1994); y Ruoslahti y colaboradores, Cell, 77:477 (1994). El examen cercano de los efectos de los antagonistas avß3 sobre la angiogénesis, revela la presencia de vasos sanguíneos asociados con tumor, discontinuos y rotos. Por lo tanto, es posible que la pérdida de la continuidad de los vasos sanguíneos se deba a la necrosis selectiva o apoptosis de las células vasculares. Para explorar esta posibilidad, se examinaron las membranas corioalantóicas de pollo después de la inducción de la angiogénesis con el factor de crecimiento bFGF y el tratamiento con el mAb y péptidos cíclicos de esta invención. A. Tratamiento con Anticuerpos Monoclonales Se puede detectar la apoptosis mediante una variedad de métodos, los cuales incluyen el examen directo del ADN aislado del tejido para detectar la fragmentación del ADN y la detección de 3 'OH en el tejido intacto, con un anticuerpo que detecta de manera específica grupos libres 3 ' OH del ADN fragmentado. 1) Análisis de la Fragmentación de ADN Se indujo la angiogénesis mediante la colocación de discos de filtro saturados con bFGF en las membranas corioalan-tóicas de pollo de embriones de 10 días de edad, como se describió en el Ejemplo 6A. El análisis in unohistológico de las membranas corioalantóicas de pollo con LM609 (anti-avß3) reveló expresiones pico de avß3 en los vasos sanguíneos de 12 a 14 horas después del inicio de la angiogénesis con bFGF. De esta manera, 24 horas después del estímulo con bFGF, se inocularon los embriones intravenosamente con 100 µl de solución salina regulada por fosfato sola o solución salina regulada por fosfato que contenía 300 µg, ya sea de mAb CSAT (anti-ßi) o LM609 (anti-avß3) . Se detectó la fragmentación del ADN por medio de resecar el tejido de la membrana corioalantóica de pollo directamente por debajo de los discos de filtro saturados con bFGF de 24 a 48 horas después de las inoculaciones intravenosas con mAb LM609 (anti-avß3) , CSAT (anti-ßj , o solución salina regulada por fosfato. Se lavaron tres veces los tejidos de la membrana corioa-lantóica de pollo resecos con solución salina regulada por fosfato estéril y finalmente se desmenuzaron, se volvieron a suspender en colagenasa bacteriana al 0.25 por ciento (Worthing-ton Biochemical; Freehold, NJ) y se incubaron durante 90 minutos a 37°C y se pasó por vórtice ocasionalmente. Se extrajo el ADN a partir de números iguales de células de membrana corioalantóica de pollo de una suspensión de una sola célula, como se describió anteriormente. Bissonette y colaboradores, Nature, 359:552 (1992) . Brevemente, se disolvieron por usinas los números iguales de células de membrana corioalantóica de pollo en lOmM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA en Tritón X-100 al 0.5 por ciento (v/v) (Sigma, St. Louis, MO) . Se pasaron por centrifugación los lisatos a 16,000x g durante 15 minutos a 4°C, para separar el ADN fragmentado soluble de la pildora de cromatina intacta. El ADN fragmentado se lavó, se precipitó, y se analizó sobre un gel de agarosa al 1.2 por ciento (p/v) . Se aisló el ADN fragmentado soluble a partir de un número igual células de membrana corioalantóica de pollo de cada tratamiento, se separó de manera electroforética sobre un gel de agarosa, y se visualizó mediante manchado con bromuro de etidio. No se detectó ninguna diferencia en la cantidad relativa de fragmentación de ADN que resultó de los tres tratamientos diferentes a las 24 horas después del tratamiento. Sin embargo, a las 48 horas después del tratamiento con el mAb LM609 (anti-avß3) , se observó un aumento significativo en la fragmentación de ADN, cuando se comparó con embriones que se trataron con mAb CSAT (anti-ß-L) o con solución salina regulada por fosfato sola. 2) Estímulo de Células Vasculares para que Entren al Ciclo Celular Para examinar de manera experimental el papel del avß3 en estos procesos, las células derivadas a partir de las membra-ñas corioalantóicas de pollo tratadas con o sin bFGF se mancharon con yoduro de propidio y se hicieron inmunorreaccionar con mAb LM609 (anti-avß3) . Se disociaron las membranas corioalantóicas de pollo que se aislaron de los embriones a las 24 y 48 horas después del tratamiento con mAb LM609 (anti-avß3) , CSAT (anti-ßx) , o solución salina regulada por fosfato en suspensiones de una sola célula mediante incubación con colagenasa bacteriana, como se describió anteriormente. Después se permeabilizaron las células únicas y se mancharon con el Apop Tag Insitu Detection Kit, de conformidad con las instrucciones del fabricante (Oncor, Gaithersburg, MD) . El Apop Tag es un anticuerpo que detecta de manera específica grupos 3 'OH libres del ADN fragmentado. La detección de estos grupos 3' OH libres es un método establecido para la detección de células apoptóticas . Gavrieli y colaboradores, J. Cell Biol . , 119:493 (1992). Después se enjuagaron las células que se mancharon con Apop Tag en Tritón X-100 al 0.1 por ciento (v/v) en solución salina regulada por fosfato y se volvieron a suspender en regula-dor FACS que contenía BSA al 0.5 por ciento (p/v), azida de sodio al 0.02 por ciento (p/v) y 200 ug/ml de NRasa A en solución salina regulada por fosfato. Se incubaron las células durante 1.5 horas, se lavaron, y se analizaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia. Se midió la fluorescencia celular usando un citómetro de flujo FACScan y se analizaron los datos como se describe más adelante. Se midió la fluorescencia celular con un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . Se determinaron de manera simultánea la dispersión lateral (SSC) y la dispersión delantera (FSC) y se recolectaron todos los datos con una computadora Hewlet Packard (HP9000), equipada con software de búsqueda FAScan (Bectdn Dickinson, Mountain View, CA) . Se analizaron los datos con el software de P.C. Lysis versión I (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . Se establecieron las compuertas de control negativo mediante el uso de suspensiones celulares son la adición de anticuerpos primarios a partir del equipo Apop Tag. Se aplicó la misma regulación por compuerta a las dos poblaciones de células dando como resultado el análisis de aproximadamente 8,000 células por tratamiento celular diferente. En la Figura 18 se muestra el porcentaje de las células solas derivadas a partir de las membranas corioalantóicas de pollo tratadas con mAb y manchadas con Apop Tag como se determinó mediante el análisis FACS. La barra negra representa células de embriones que se trataron 24 horas antes del análisis. La barra punteada representa células de embriones que se trataron 48 horas antes del análisis. Cada barra representa el promedio ± S.E. de las tres réplicas. Como se muestra en la Figura 18, las membranas corioalantóicas de pollo que se trataron dos días antes con el mAb LM609 (anti-avß3) mostró un incremento de 3 a 4 partes en el manchado Apop Tag, según se comparó con las membranas corioalantóicas de pollo que se trataron ya sea con solución salina regulada por fosfato sola o con CSAT (anti-ß!) . B. Tratamiento Con Péptidos Sintéticos También se realizaron ensayos de la membrana corioalantóica de pollo con la angiogénesis inducida por factor de crecimiento, como se describió en el Ejemplo 6A, con los péptidos sintéticos de esta invención, para determinar el efecto de los péptidos cíclicos sobre la apoptosis. Se prepararon los péptidos ciclo-RGDfV (66203) y ciclo-RADfV (69601) como se describió en el Ejemplo 1. Se inyectaron las soluciones de péptido o la solución salina regulada por fosfato dentro de la preparación de la membrana corioalantóica de pollo a una concentración de 300 ug/ml. A las 24 y 48 horas, se disecó el papel filtro y el tejido de la membrana corioalantóica de pollo circundante y se manchó con el Apop Tag para detectar la apoptosis, como se describió anteriormente en el Ejemplo 12A2) . Como se muestra en la Figura 18, las membranas corioalantóicas de pollo que se trataron dos días antes con el péptido 69203 (ciclo-RGDfV) , mostraron un incremento de 3 a 4 partes en el manchado de Apop Tag, como se comparó con las membranas corioalantóicas de pollo que se trataron con ya sea la solución salina regulada por fosfato sola o con el péptido cíclico 69601 de control (ciclo-RADfV) . C. Efecto del Tratamiento Con Anticuerpos Monoclo- nales sobre la Apoptosis y el Ciclo Celular También se examinaron suspensiones de una sola célula para ver el número de copias de ADN cromosómico, mediante el manchado con yoduro de propidio, para determinar el efecto del tratamiento con los anticuerpos monoclonales en el ciclo celular y la apoptosis mediante el manchado con el Apop Tag. Se prepararon las suspensiones de una sola célula de la membrana corioalantóica de pollo que se trató 24 o 48 horas antes con el mAb LM609 (anti-avß3) o con CSAT (anti-ßi) o con la solución salina regulada por fosfato, como se describió en el Ejemplo 12A1) . Para manchar las células con el Apop Tag, se lavaron tres veces las suspensiones celulares con regulador de pH que contenía BSA al 2.5 por ciento (p/v) y azida de sodio al 0.25 por ciento (p/v) en solución salina regulada por fosfato. Después se fijaron las células en paraformaldehído al 1 por ciento (p/v) en solución salina regulada por fosfato durante 15 minutos seguido por tres lavados, como se describió anteriormente. Para evitar la fijación no específica, se bloquearon las suspensiones celulares con BSA al 5 por ciento (p/v) en solución salina regulada por fosfato durante toda la noche a 4°C. Después se lavaron las células como se hizo anteriormente, se mancharon con Apop Tag, y se midió la fluorescencia celular con un FACScan, como se describió anteriormente en el Ejemplo 12A. Se mancharon las células de cada condición experimen- tal con yoduro de propidio (Sigma, St. Louis, MO) a 10 ug/ml en solución salina regulada por fosfato durante 1 hora, se lavaron dos veces con solución salina regulada por fosfato, y se analizaron para ver las características nucleares típicas de la apopto-sis, incluyendo la condensación y la segmentación de la cromati-na . Se calculó el porcentaje de las células apoptóticas mediante el análisis morfológico de las células a partir de cuando menos 10 a 15 campos microscópicos seleccionados aleatoriamente. En la Figura 19 se dan los resultados combinados de las suspensiones de una sola célula de las membranas corioalantóicas de pollo de embriones que se trataron ya sea con CSAT (anti-ßx) o con LM609 (anti-avß3) , se mancharon con Apop Tag y yoduro de propidio, y se analizaron mediante FACS. El eje Y representa el manchado de Apop Tag (apoptosis) , el eje X repre-senta el manchado de yoduro de propidio (contenido de ADN) . La línea horizontal representa la compuerta negativa para el manchado de Apop Tag. Los paneles izquierdo y derecho indican las células de la membrana corioalantóica de pollo a partir de los embriones tratados con CSAT y LM609, respectivamente. Se realizó el análisis del ciclo celular mediante el análisis de aproximadamente 8,000 eventos por condición y los datos que se representan en un diagrama de contorno. Las muestras de las células únicas que se mancharon con el yoduro de propidio de tinta de ADN, revelaron que del 25-30 por ciento de las células de la membrana corioalantóica de pollo que se trataron con el LM609 (anti-avß3) 48 horas después del tratamiento, mostraron evidencia de condensación y/o segmentación nuclear. Estos procesos son característicos de las células que están experimentando apoptosis. Esto es en contraste con las membranas corioalantóicas de pollo que se trataron con CSAT (anti-ßx) , en donde del 90-95 por ciento de la células, mostraron un manchado nuclear normal. Como se muestra en la Figura 19, consistente con la inducción de la apoptosis por el LM609, se observó un número significativo de células en un pico que contenía menos de una copia de ADN (AO) . Se ha mostrado- anteriormente que este pico representa el ADN fragmentado en las células apoptóticas de última etapa. Telford y colaboradores, Cytometry, 13:137 (1992) . Por otra parte, estas células AO se manchan fácilmente con el Apop Tag confirmando la capacidad de este reactivo para detectar las células apoptóticas. Sin embargo, además del manchado de las células en AO, también un número significativo de células que contenían más de una copia de ADN, se manchó con el Apop Tag (Figura 19) . Estos resultados demuestran que el LM609 tiene la capacidad para promover la apoptosis entre las células vasculares que ya han entrado al ciclo celular. En contraste, las células que se derivaron a partir de las membranas corioalantóicas de pollo de control que habían entrado al ciclo celular, mostraron un manchado de Apop Tag mínimo, consistente con las pocas células apoptóticas que se detectaron en las membranas corioalantóicas de pollo tratadas con el control. Entre aquellas células en las membranas corioalantóicas de pollo estimuladas por bFGF que habían entrado en el ciclo celular (fase S y G2/M) , el 70 por ciento mostró manchado positi-vo con el LM609 (anti-avß3) . Esto se compara con el 10 por ciento de manchado del LM609 que se observó entre las células en ciclo a partir de las membranas corioalantóicas de pollo que se trataron sin bFGF. Estos hallazgos indican que después del estímulo del bFGF, la mayoría de las células que llevaban el avß3, mostra-ron proliferación activa. En conjunto, estos hallazgos indican que la inyección intravenosa del mAb LM609 o del antagonista de péptido cíclico de avß3, promueven la apoptosis dentro de la membrana corioalantóica de pollo después de la inducción de la angiogénesis. También se examinaron las membranas corioalantóicas de pollo de manera histológica por la expresión de la avß3 mediante la inmunorreactividad con el LM609 y por las células que estaban experimentando apoptosis mediante la inmunorreactividad con el Apop Tag. Las secciones de la membrana corioalantóica de pollo que se resecaron de los embriones que se trataron 48 horas antes con el LM609 (anti-avß3) , el CSAT (anti-ßx) , o la solución salina regulada por fosfato que se preparó en el Ejemplo 5A, se lavaron, se incrustaron en OTC (Baxter) y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Se cortaron secciones de seis micrones de los tejidos de la membrana corioalantóica de pollo, se fijaron en acetona durante 30 segundos, y se almacenaron a -70°C hasta que se usaron. Se prepararon las secciones de tejido para el manchado mediante un enjuague breve en etanol (ETOH) al 70 por ciento (v/v) , seguido por tres lavados en solución salina regulada por fosfato durante 2 horas, seguido por incubación con 10 ug/ml de mAb LM609 durante 2 horas. Después se lavaron las secciones y se incubaron con una solución atenuada de 1:50 de IgG cabra anti-ratón conjugada de rodamina (Fischer Scientific, Pittsburg, PA) durante 2 horas. Finalmente, se lavaron las mismas secciones y se mancharon con el Apop Tag como se describió en el Ejemplo 12A2) . Se montaron las secciones de tejido manchadas y se analizaron mediante microscopía inmunofluorescente confocal. En la Figura 20, los paneles A al C representan el tejido de la membrana corioalantóica de pollo a partir de embrio-nes que se trataron con CSAT (anti-ßx) , y los paneles D al F representan el tejido de la membrana corioalantóica de pollo a partir de embriones que se trataron con LM609 (anti-avß3) . Los paneles A y D describen tejidos manchados con Apop Tag y visualizados mediante fluorescencia (FITC) superimpuesta sobre una imagen D.I.C. Los paneles B y E describen el mismo tejido manchado con mAb LM609 (anti-avß3) y visualizado mediante fluorescencia (rodamina) , Los paneles C y F representan las imágenes combinadas de los mismos tejidos manchados tanto con Apop Tag, como con LM609, en donde el manchado amarillo representa la localización conjunta. La barra representa 15 y 50 µm en los paneles izquierdo y derecho, respectivamente. Como se muestra en la Figura 20 (A-C) , después de la inyección intravenosa de CSAT o del control de la solución salina regulada por fosfato, el manchado con Apop Tag fue mínimo y aleatorio, indicando un nivel mínimo de apoptosis dentro del tejido. En contraste, las membranas corioalantóicas de pollo de embriones que se trataron previamente con el LM609 o con el péptido cíclico 203, mostraron una mayoría de los vasos que se mancharon intensamente con el Apop Tag mientras que se observó una reactividad mínima entre las células no vasculares circundantes (Figura 20 D-F) . Por otra parte, cuando se usaron tanto el Apop Tag como el LM609 para manchar estos tejidos (19C y 19F) , se observó una localización conjunta significativa solamente entre estos marcadores en las membranas corioalantóicas de pollo que se derivaron a partir de embriones que se trataron con los antagonistas avß3 (Figura 20F) . Estos hallazgos demuestran que después de la inducción de la angiogénesis in vivo, los inhibidores de la integrina avß3 promovieron de manera selectiva la apoptosis de los vasos sanguíneos que portaban el avß3. Mientras que la angiogénesis es un proceso complejo que incluye muchos eventos biológicos moleculares y celulares, varias líneas de evidencia sugieren que la integrina avß3 ce la célula vascular desempeña un papel relativamente tardío en este proceso. Primero, el análisis inmunohistológico revela que la expresión del avß3 sobre las células vasculares, alcanzó un máximo de 12-24 horas después de la inducción de la angiogénesis con el bFGF. Segundo, los antagonistas de avß3 perturban la angiogénesis inducida por múltiples activadores, sugiriendo que este receptor está incluido en la corriente abajo de trayectoria común de tal vez todos los eventos de señalización principales que llevan a la angiogénesis. Tercero, las membranas corioalantóicas de pollo que se trataron con mAb LM609 o péptido cíclico no mostraron un incremento significativo en la apoptosis, como se midió mediante el escalonamiento del ADN hasta 48 horas después del tratamiento con estos antagonistas. Finalmente, los antagonistas del avß3 promueven la apoptosis de las células vasculares a las que ya se ha inducido a entrar en el ciclo celular. Los resultados que se proporcionan en la presente proporcionan la primera evidencia directa de que los eventos de ligación de integrina pueden regular la supervivencia celular in vivo . Por lo tanto se hace la hipótesis de que, una vez que empieza la angiogénesis, las células vasculares individuales se dividen y empiezan a moverse hacia la fuente angiogénica, después de lo cual, la ligación del avß3 proporciona una señal que permite la supervivencia celular continua, lo cual lleva a la diferenciación y la formación de vasos sanguíneos maduros. Sin embargo, si se evita la ligación del avß3, entonces las células no reciben esta indicación molecular y las células entran en apoptosis por omisión. Esta hipótesis también predeciría que después de que ha ocurrido la diferenciación, los vasos sanguíneos maduros ya no requieren la señalización del avß3 para la supervivencia y por eso son refractarias a los antagonistas de esta integrina. Finalmente, los resultados que se presentan en la presente, proporcionan evidencia de que los antagonistas de la integrina avß3 pueden proporcionar un planteamiento terapéutico poderoso para el tratamiento de la neoplasia y otras enfermedades que se caracterizan por la angiogénesis. Primero, los antagonistas del avß3 rompen los vasos sanguíneos que se están formando recientemente, sin afectar la vasculatura ya existente. Segundo, estos antagonistas no tuvieron un efecto significativo en la viabilidad del embrión de pollo, sugiriendo que no son tóxicos. Tercero, se bloqueó significativamente la angiogénesis sin importar el estímulo angiogénico. Finalmente, la administración sistémica de los antagonistas avß3 provoca una regresión dramática de varios tumores humanos distintos de manera histológica. 13. Preparación de los Antagonistas a„ß3 de Molécula Orgánica Más adelante se describe la síntesis de los Compuestos 7 (96112), 9 (99799), 10 (96229), 12 (112854), 14 (96113), 15 (79959), 16 (81218), 17 (87292) y 18 (87293) del antagonista avß3 orgánico, y también se muestra en las figuras anotadas. También se hace referencia a los antagonistas orgánicos mediante los números en los paréntesis. Las moléculas orgánicas que resultan, a las que se hace referencia como miméticos orgánicos de esta invención como se definió anteriormente, se usan entonces en los métodos para inhibir la angiogénesis mediada por avß3, como se describió en el Ejemplo 11. Para cada uno de las síntesis que se describen más adelante, se midieron las rotaciones ópticas sobre el espectrofotómetro de rayos ultravioleta Perkin-Elmer 241 y se registró el espectro visible en un espectrómetro Beckman DU-70. Se registraron los espectros de XH y 13C NMR a 400 y 500 MHz en un espectrómetro Bruker AMX-400 y AMX-500. Los espectros de masa de alta resolución (HRMS) se registraron en un espectrómetro de masa VG ZAB-ZSE bajo condiciones de bombardeo rápido de átomo (FAB) . Se realizó la cromatografía de columna con gel de sílice de malla de 70-230. El TLC preparatorio se realizó en un Merck Art. 5744 (0.5 milímetros) . Se tomaron los puntos de fusión sobre un aparato de Thomas Hoover. A. Compuesto 1: benciléster de t-Boc-L-tirosina como se ilustra en la Figura 38 O Jl 1 O - BENCILO NH O HO II O COMPUESTO 1 Se agregó diciclohexilcarbodiimida (DCC) (1.5 equiva-lentes) a una solución de N- (ter-butoxicarbonil) -L-tirosina (t-Boc-L-tirosina) (1.0 equivalentes; Aldrich), en cloruro de metileno de 0.10 M (M) a 25°C y se permitió que se agitara durante 1 hora. Después, se agregaron 1.5 equivalentes de alcohol de bencilo y se agitó la mezcla durante 12 horas adicionales a 25°C. Después se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó dos veces (2X) con agua, una vez (IX) con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y después se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice. También se puede comprar comercialmente el Compuesto 1, benciléster de t-Boc-L-tirosina, con Sigma. B. Compuesto 2: benciléster de ácido (S)-3-(4- (Bromobutiloxi) feni1-2-N-ter-butiloxicarboni1- propiónico COMPUESTO 2 Se calentó una mezcla de benciléster de t-Boc-L-tirosina (2 gramos, 5.38 mmol; sintetizado como se describió anteriormente), 1, 4-dibromobutano (1.9 mililitros, 16.2 mmol; Aldrich), carbonato de potasio (5 gramos) y 18-corona-6 (0.1 gramos; Aldrich) a 80°C durante 12 horas. Después de enfriarlo, se filtró el precipitado y se evaporó la mezcla de reacción hasta secarse al vacío. Después de purificó el producto crudo mediante cristalización, usando hexano al 100 por ciento para rendir 2.5 gramos (92 por ciento) del Compuesto 2. C. Compuesto 3: benciléster de ácido (S)-3-(4-(4- Azidobutiloxi) fenil-2-N-ter-butiloxicarboni1- propiónico como se ilustró en la Figura 38, paso ii O -. . J-L O" BENCILO N- HN- .O.. . O COMPUESTO 3 Se agitó el Compuesto 2 (2.5 gramos, 4.9 mmol) con azida de sodio (1.6 gramos, 25 mmol) en dimetilformamida (DMF) (20 mililitros) a 25°C durante 12 horas. Después se evaporó el solvente y se trató el residuo con agua (aproximadamente 10 mililitros) y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Se combinaron las capas orgánicas, se secaron mediante sulfato de magnesio y se evaporó para rendir 2.0 gramos (90 por ciento) del Compuesto 3 como un jarabe incoloro FAB-MS: 469 (M+H+) . D. Compuesto 4: benciléster de ácido (S)-3-(4-(4- Azidobutiloxi) fenil-2-amino-propiónico como se ilustró en la Figura 38 paso iii O Jl " O - BENCILO N. O NH- COMPUESTO 4 Se disolvió el Compuesto 3 (2.0 gramos, 4.4 mmol) en ácido trifluoroacético (TFA; 2 mililitros) y se agitó durante 3 horas a la temperatura ambiente. La evaporación al vacío rindió 1.6 gramos (cuantitativo) del Compuesto 4 como un jarabe incoloro que se usó sin purificación adicional para el siguiente paso. FAB-MS: 369 (M+H+) . E . Compuesto 5: benciléster de ácido (S)-3-(4-(4- Azidobutiloxi) fenil-2-butilsulfonamida-propió- nico como se ilustró en la Figura 38 paso iv ° i i, . | H O-BENCILO N3- ^ k !l HN O O S O COMPUESTO 5 Se agitó una mezcla del Compuesto 4 (1.6 gramos, 4.3 mmol), cloruro de ácido butansulfónico (0.84 mililitros; 6.6 mmol) y trietilamina (1.5 equivalentes) en cloruro de metileno (20 mililitros) durante 12 horas a la temperatura ambiente.

Después se evaporó la mezcla de reacción y se disolvió el residuo en acetato de etilo, se lavó con HCl diluido, bicarbonato de sodio acuoso y agua. Después de evaporarlo hasta secarlo, se purificó el producto crudo mediante cromatografía de destello (gel de sílice, tolueno/acetato de etilo 15:1), para rendir 1.4 gramos (67 por ciento) del Compuesto 5 como un sólido amorfo. F. Compuesto 6: benciléster de ácido (S)-3-(4-(4- Aminobutiloxi) feni1-2-butilsulfonamido-propió- nico como se ilustró en la Figura 38 paso v | OH H7N HN. -O O COMPUESTO 6 Se disolvió el Compuesto 5 (1.3 gramos; 2.6 mmol) en mililitros de acetato de etilo/metanol/agua 5/3/1 y 0.2 mililitros de ácido trifluoroacético (TFA) y se hidrogenó bajo hidrógeno (1 atmósfera; aparato de Parr Shaker) a 25°C en la presencia de 100 miligramos de paladio (10 por ciento sobre carbón) . Después de 3 horas, se filtró el catalizador y se evaporó el solvente para rendir el Compuesto 6 como un residuo aceitoso. Después de la liofilización del agua, se obtuvo 1.0 gramo (cuantitativo) del Compuesto 6 como un polvo blanco. FAB-MS: 373 (M+H+) . G . Compuesto 7: benciléster de ácido (S)-3-(4-(4- Guanidinobutiloxi ) feni1-2-butilsulfonamido- propiónico como se ilustró en la Figura 38 paso vi COMPUESTO 7 Se calentaron el Compuesto 6 (200 miligramos; 0.5 mmol), nitrato de 3, 5-dimetilpirazol-l-carboxamidina (DPFN) (170 miligramos; 0.8 mmol; Aldrich Chemical Company) y trietilamina (0.15 mililitros, 1.0 mmol) en dimetilformamida (DMF; 5 milili-tros), a 60°C durante 12 horas. Después de enfriarlo, se evaporó el solvente al vacío, y se purificó el residuo mediante cromatografía de líquido de alto desempeño (Lichrocart RP-18, acetonitrilo gradiente/agua + ácido trifluoroacético al 0.3 por ciento 99:1 a 1:99) para rendir 50 miligramos (25 por ciento) del Compuesto 7 como un polvo blanco, amorfo, después de la liofili- zación. FAB-MS: 415 (M+H+) , punto de fusión: 70°C. H. Compuesto 8: ácido (S) -3- (4- (4-Aminobutiloxi) fenil-2-N-ter-butiloxicarbonil-propiónico como se ilustró en la Figura 39 paso iii - BENCILO i COMPUESTO 8 Se disolvió el Compuesto 3 (0.5 gramos; 1.07 mmol) en 10 mililitros de acetato de etilo/metanol/agua 5/3/1 y 0.1 mililitros de ácido trifluoroacético (TFA) y se hidrogenó bajo hidrógeno (1 atmósfera; aparato de Parr Shaker) a 25°C en la presencia de 30 miligramos de paladio (10 por ciento sobre carbón) . Después de 3 horas, se filtró el catalizador y se evaporó el solvente para rendir- el Compuesto 8 como un residuo aceitoso. Después de la liofilización del agua, se obtuvieron 370 miligramos (cuantitativo) del Compuesto 8 como un polvo blanco. FAB-MS: 353 (M+H+) . I . Compuesto 9: ácido (S) -3- (4- (4-Guanidinobutilo- xi ) feni1-2 -N-ter-butiloxicarbonil -propiónico como se ilustró en la Figura 39 paso iv O JJ. i O BENCILO H2N . NH HN O. O NH COMPUESTO 9 Se calentaron el Compuesto 8 (200 miligramos, 0.5 mmol), nitrato de 3 , 5-dimetilpirazol-l-carboxamidina (DPFN) (170 miligramos; 0.8 mmol; Aldrich Chemical Company) y trietilamina (0.15 mililitros, 1.0 mmol) en dimetilformamida (DMF; 5 mililitros) a 60°C durante 12 horas. Después de enfriarlo, se evaporó el solvente al vacío, y se purificó el residuo mediante cromatografía de líquido de alto desempeño (Lichrocart RP-18, acetoni-trilo gradiente/agua + ácido trifluoroacético al 0.3 por ciento 99:1 a 1:99) para rendir 160 miligramos (90 por ciento) del Compuesto 9 como un poder blanco, amorfo, después de la liofilización. FAB-MS: 395 (M+H+) . J. Compuesto 10 : ácido (R) -3- (4- (4- Guanidinobutilo-xi ) feni 1-2 -buti l sul fonamido- propiónico como se ilustró en la Figura 39 pasos i-vi COMPUESTO 10 Se usó la secuencia de reacción idéntica para sintetizar el Compuesto 7 para preparar el análogo 10 de la D-tirosi-na, de la cual se obtuvieron 205 miligramos como un material blanco, amorfo FAB-MS: 415 (M+H+) como sigue, usando los Compues-tos intermedios 100-600 para formar el Compuesto 10: 1) Compuesto 100: benciléster de t-Boc-D- tirosina como se ilustró en la figura 40 HO i- O - BENCILO NH O.

COMPUESTO 100 Se agregó diciclohexilcarbodiimida (DCC) (1.5 equivalentes) a una solución de N- (ter-butoxicarbonil) D-tirosina (t-Boc-L-tirosina) (1.0 equivalentes; Aldrich) en cloruro de metileno de 0.10 M, a 25°C y se permitió que se agitara durante 1 hora. Después, se agregaron 1.5 equivalentes de alcohol bencílico y se agitó la mezcla durante 12 horas adicionales a 25°C. Después se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y después se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice. 2) Compuesto 200: benciléster de ácido (R) -3- (4- (4-Bromobutiloxi) fenil-2-N-ter- butiloxicarbonil-propiónico como se ilus- tro en la Figura 40 paso i " BENCILO COMPUESTO 200 Se calentó una mezcla de benciléster de t-Boc-D-tirosina (2 gramos, 5.38 mmol; sintetizado como se describió anteriormente), 1, 4-dibromobutano (1.9 mililitros, 16.2 mmol; Aldrich), a 80°C durante 12 horas. Después de enfriarla, se filtró el precipitado y se evaporó la mezcla de la reacción hasta secarla al vacío. Después se purificó el producto crudo mediante cristalización, usando hexano al 100 por ciento para rendir 2.5 gramos (92 por ciento) del Compuesto 200. 3) Compuesto 300: benciléster de ácido (R) -3- (4- (4-Azidobutiloxi) fenil-2-N-ter- butiloxicarbonil-propiónico como se ilustró en la Figura 40 paso ii COMPUESTO 300 Se agitó el Compuesto 200 (2.5 gramos, 4.9 mmol) con azida de sodio (1.6 gramos, 25 mmol) en dimetilformamida (DMF) (20 mililitros) a 25°C durante 12 horas. Después se evaporó el solvente y se trató el residuo con agua (aproximadamente 10 mililitros) y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Se combinaron las capas orgánicas, se secaron mediante sulfato de magnesio y se evaporaron para rendir 2.0 gramos (90 por ciento) del Compuesto 300 como un jarabe incoloro. FAB-MS: 469 (M+H+) . 4 ) Compuesto 400: benciléster de ácido (R) -3- (4- (4- Azidobutiloxi) fenil- 2- amino- propiónico como sé ilustró en la Figura 40 paso iii O - ,. l- O - BENCILO N3 ^ . - .. - 0 -1 -- . ? ; ÑH2 COMPUESTO 400 Se disolvió el Compuesto 300 (2.0 gramos (4.4 mmol)) en ácido trifluoroacético (TFA; 2 mililitros) y se agitó durante 3 horas a la temperatura ambiente. La evaporación al vacío rindió 1.6 gramos (cuantitativo) del Compuesto 400 como un jarabe incoloro que se usó sin purificación adicional para el siguiente paso. FAB-MS: 369 (M+H+) . 5) Compuesto 500: benciléster de ácido (R)-3-(4- (4-Azidobutiloxi) feni1-2-butilsulfonamido-pro- piónico como se ilustró en la Figura 40 paso iv O 11 O - BENCILO N í. i , , C 3 3 ---- HN. O S. O COMPUESTO 500 Se agitó una mezcla del Compuesto 400 (1.6 gramos; 4.3 mmol), cloruro de ácido butansulfónico (0.84 mililitros; 6.6 mmol) y trietilamina (1.5 equivalentes), en cloruro de metileno (20 mililitros) durante 12 horas a la temperatura ambiente.

Después se evaporó la mezcla de reacción y se disolvió el residuo en acetato de etilo, se lavó con HCl diluido, bicarbonato de sodio acuoso y agua. Después de evaporarlo hasta secarlo, se purificó el producto crudo mediante cromatografía de destello (gel de sílice, tolueno/acetato de etilo 15:1) para rendir 1.4 gramos (67 por ciento) del Compuesto 500 como un sólido amorfo. 6) Compuesto 600: ácido (R) -3- (4- (4-Amino- butiloxi) fenil- 2- butilsulfonamido-pro- piónico como se ilustró en la Figura 40 paso v O OH H2N. HN COMPUESTO 600 Se disolvió el Compuesto 500 (1.3 gramos (2.6 mmol)) en 20 mililitros de acetato de etilo/metanol/agua 5/3/1 y 0.2 mililitros de ácido trifluoroacético (TFA) y se hidrogenó bajo hidrógeno (1 atmósfera; aparato de Parr Shaker) a 25°C en la presencia de 10 miligramos de paladio (10 por ciento sobre carbón) . Después de 3 horas, se filtró el catalizador y se evaporó el solvente para rendir el Compuesto 600 como un residuo aceitoso. Después de la liofilización del agua se obtuvo 1.0 gramo (cuantitativo) del Compuesto 600 como un polvo blanco. FAB-MS: 373 (M+H+) . 7) Compuesto 10: ácido (R) -3- (4- (4-Guanidino- butiloxi) fenil-2-butilsulfonamido-pro- piónico como se ilustró en la Figura 40 paso vi Se calentaron el Compuesto 600 (200 miligramos; 0.5 mmol), nitrato de 3, 5-dimetilpirazol-l-carboxamidina (DPFN) (170 miligramos; 0.8 mmol; Aldrich Chemical Company) y trietilamina (0.15 mililitros, 1.0 mmol) en dimetilformamida (DMF; 5 mililitros), a 60°C durante 12 horas. Después de enfriarlo, se evaporó el solvente al vacío, y se purificó el residuo mediante cromatografía de líquido de alto desempeño (Lichrocart RP-18, acetoni-trilo gradiente/agua + ácido trifluoroacético al 0.3 por ciento 99:1 a 1:99) para rendir 50 miligramos (25 por ciento) del Compuesto 10 como un polvo blanco, amorfo, después de la liofilización. FAB-MS: 415 (M+H+) , punto de fusión: 70°C. K. Compuesto 11: benciléster de ácido (S)-3-(4-(4- Azidobutiloxi) feni1-2-alcanforsulfonamido-pro- piónico como se ilustró en la Figura 4 COMPUESTO 11 Se agitó una mezcla del Compuesto 4 (1.0 gramos, 2.7 mmol), cloruro de ácido 10-alcanforsulfónico (6.6 mmol; Aldrich Company) y trietilamina (1.5 equivalentes) en cloruro de metileno (20 mililitros) durante 12 horas a la temperatura ambiente. Después se evaporó la mezcla de reacción y se disolvió el residuo en acetato de etilo, se lavó con HCl diluido, bicarbonato de sodio acuoso y agua. Después de evaporarlo hasta secarlo, se purificó el producto crudo mediante cromatografía de destello (gel de sílice, tolueno/acetato de etilo 15:1), para rendir 1.4 gramos (67 por ciento) del Compuesto 11 como un sólido amorfo. L . Compuesto 12: ácido (S ) -3- (4- (4-Guanidino- butiloxi) fenil-2-10-alcanforsulfonamido-propió- nico como se ilustró en la Figura 41 pasos i-ii COMPUESTO 12 Se obtuvo el Compuesto 12 después de la hidrogenación y guanilación del Compuesto 11, de conformidad con las siguientes condiciones : Paso i: Se disolvió el Compuesto 11 (1.3 gramos (2.6 mmol) ) en 20 mililitros de acetato de etilo/metanol/agua 5/3/1 y 0.2 mililitros de ácido trifluoroacético (TFA) y se hidrogenó bajo hidrógeno (1 atmósfera; aparato de Parr Shaker) a 25°C, en la presencia de 100 miligramos de paladio (10 por ciento sobre carbón) . Después de 3 horas, se filtró el catalizador y se evaporó el solvente para rendir la amina intermedia como un residuo aceitoso. Después de la liofilización del agua, se obtuvo 1.0 gramo (cuantitativo) de la amina intermedia como un polvo blanco, la cual se realizó como sigue: Paso ii: Se calentaron el compuesto de amina interme-dia que se formó anteriormente (200 miligramos; 0.5 mmol) , nitrato de 3, 5-dimetilpirazol-l-carboxamidina (DPFN) (170 miligramos; 0.8 mmol, Aldrich Chemical Company) y trietilamina (0.15 mililitros, 1.0 mmol), en dimetilformamida (DMF; 5 mililitros) a 60°C durante 12 horas. Después de enfriarlo, se evaporó el solvente al vacío, y se purificó el residuo mediante HPCL (Lich-rocart RP-18, acetonitrilo gradiente/agua + ácido trifluoroacético al 0.3 por ciento 99:1 a 1:99), para rendir 50 miligramos (25 por ciento) del Compuesto 12 como un polvo blanco, amorfo, después de la liofilización. FAB-MS: 509.6 (M+H+) . M. Compuesto 13: benciléster de ácido (S)-3-(4-(5- Bromopen tiloxi ) f enil-2-N-ter-butiloxicarbonil- propiónico como se ilustró en la Figura 41 O O - BENCILO HN —BOC RB O COMPUESTO 13 Se calentó una mezcla de benciléster de t-Boc-L-tirosina (4.5 gramos, 12.1 mmol; Compuesto 1 sintetizado como se describió anteriormente), 1, 5-dibromopentano (5 mililitros, 36.7 mmol; Aldrich), carbonato de potasio (10 gramos) y 18-corona-6 (0.25 gramos; Aldrich) a 80°C durante 12 horas. Después de enfriarlo, se filtró el precipitado y se evaporó la mezcla de reacción hasta secarse al vacío. Después de purificó el producto crudo mediante cristalización, usando hexano al 100 por ciento para rendir 5.35 gramos (85 por ciento) del Compuesto 13. N . Compuesto 14: ácido (S) -3- ( 4- ( 4-Guanidino- pentiloxi) feni1-2-butilsulfonamido-propiónico como se ilustró en la Figura 41 pasos i-v COMPUESTO 14 La secuencia de reacción del paso 5 del intercambio bromina-azida, disociación de Boc, sulfonilación con cloruro de ácido butansulfónico y la guanilación con nitrato de 3,5-dimetilpirazol-1-carboxamidina, se realizó de manera idéntica a los procedimientos anteriores, usando los Compuestos intermedios 1-6 para formar el Compuesto 7 o los procedimientos usando los Compuestos 100-600 para formar el Compuesto 10, como se describió anteriormente. El Compuesto 14 se obtuvo como un polvo blanco FAB-MS: 429 (M+H+) . 0. Compuesto 15 : dihidrocloruro de 3- ( 4 -amidino- fenil ) - 5- ( 4 - ( 2 -carboxi -2 -amino-etil ) fenoxi ) metil-2-oxazolidinona como se muestra en la Figura 42 1) Síntesis del material de inicio 2-N-BOC- amino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato para el Compuesto 15 COMPUESTO 15 O Se obtuvo el material de inicio 2-N-BOC-amino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato mediante la esterificación de la (D o L) , N- (ter-butoxicarbonil) -L (D) -tirosina (t-Boc-L (D) -tirosina) (1.0 equivalentes; Sigma) en metanol de 0.10 M y HCl al 1 por ciento diluido. Se agitó la mezcla de reacción a 25°C durante 12 horas y después se neutralizó mediante carbonato de potasio y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y después se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener 2-N-BOC-amino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato. 2) Síntesis del material de inicio 3-p-N-BOC- amidino-fenil-5-metansufoniloxi-meti1-2- oxazolidinona para el Compuesto 15: procedimiento de 3 pasos como sigue: Se agitó el p-amino-benzonitrilo (1.0 equivalentes; Aldrich) en cloruro de metileno (0.10 M) , con 2, 3-epoxipropanol (1.0 equivalentes; Aldrich) durante 12 horas a 25°C. Después se removió el solvente al vacío y se llevó el 4- (2, 3-dihidroxipropi-lamino) benzonitrilo crudo al siguiente paso como sigue: Se agitó el 4- (2, 3-dihidroxipropilamino) benzonitrilo (1.0 equivalentes; como se describió anteriormente), en dimetilformamida (0.10 M) a 25°C con carbonato de dietilo (1.1 equiva-lentes; Aldrich) y terbutilato de potasio (1.1 equivalentes; Aldrich) a 110°C durante 6 horas. Después, se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener 3- (4-cianofenil) -5-hidroximetil-2-oxazolidina y se llevó al siguiente paso como sigue: Se agitó la 3- (4-cianofenil) -5-hidroximetil-2-oxazo-lidina (1.0 equivalentes; como se describió anteriormente), en cloruro de metileno (0.10 M) a 25°C con 1.1 equivalentes de sulfuro de hidrógeno, 1.1 equivalentes de yoduro de metileno, y 1.1 equivalentes de acetato de amonio. Se agitó la mezcla de reacción durante 6 horas y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener la amidina, la cual se llevó al siguiente paso como sigue: Se protegieron 1.0 equivalentes de la amidina, sintetizada como se describió anteriormente, con 1.1 equivalentes de BOC-ON (2- (BOC-oximino) -2-fenilacetonitrilo; Aldrich) en cloruro de metileno (0.10 M), a 25°C y se agitó durante 6 horas. Después, se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se esterificó el producto crudo en cloruro de metileno de 0.10 M y 1.1 equivalentes de cloruro de metansulfonilo. Se agitó la mezcla de reacción a 0°C durante 6 horas y después se refrescó con agua (5 equivalentes) y entonces se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metansufoniloxi-metil-2-oxazolidinona . 3) Acoplamiento del 2-N-BOC-amino-3- (4- hidroxi-fenil) propionato intermedio con la 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metansufoniloxi- metil-2-oxazolidinona para formar la forma protegida del Compuesto 15, 3- (4-BOC-ami- dinofenil) -5- (4- ( 2-metoxi-carbonil-2-N- BOC-aminoetil) fenioxilmetil-2-oxazolidinona Se agitó una mezcla de 1.9 gramos de 2— -BOC-amino-3— (4-hidroxi-fenil) ropionato (como se describió anteriormente) , 20 mililitros de dimetilformamida (DMF) y NaH (1.0 equivalentes), durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Después de la agitación, se agregaron 1.8 gramos de 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metansufoniloxi-metil-2-oxazolidinona (como se describió anteriormente) , en 10 mililitros de dimetilformamida (DMF) y se agitó nuevamente durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Después se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener la forma protegida del Compuesto 15, 3- (4-BOC-ami-dinofenil) - 5- (4- (2- metoxi-carbonil-2-N- BOC- aminoetil) fenioxilmetil-2-oxazolidinona, la cual se llevó al siguiente paso. 4 ) Desprotección de la forma protegida del Compuesto 15 para formar el Compuesto 15: dihidrocloruro de 3- (4-amidinofenil) -5- (4- ( 2-carboxi-2-amino-etil ) fenoxi ) metil-2- oxazolidinona. Figura 42 Tratamiento de la forma protegida del Compuesto 15, 3- (4-BOC- amidinofenil) -5- (4- (2- metoxi-carbonil-2-N- BOC-aminoetil) fenioxilmetil-2-oxazolidinona (1.0 equivalentes; sintetizada como se describió anteriormente) , con 4 mililitros de 2N NaOH durante 4 horas a la temperatura ambiente. Después se siguió la mezcla con 40 mililitros de solución de 2N HCl en dioxano, el cual se agregó por goteo de 0°C a 25°C durante 3 horas. Después se refrescó la mezcla de reacción con bicarbonato de sodio (5 equivalentes) y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener el Compuesto 15: dihidrocloruro de 3- (4-amidinofenil) -5- (4- (2-carboxi-2-amino-etil) fenoxi) metil-2-oxazolidinona; punto de fusión 165°C(d). P. Compuesto 16: 3- (4-amidinofenil) -5- (4- (2- c a r b o x i - 2 - N - butilsulfonilaminoetil) fenoxi) metil-2-oxazoli- dinona como se muestra en la Figura X (viejo 141 1) Síntesis del material de inicio 2-N-butil- sulfonilamino -3- (4- hidroxi- fenil) propionato para el Compuesto 16 .COOH NH \v\_ N O NH—SO2 H,N O COMPUESTO 16 Se obtuvo el material de inicio 2-N-butil-sulfonil-amino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato mediante la esterificación de la (tirosina (D o L) ) (1.0 equivalentes; Sigma), en metanol de 0.10 M y HCl al 1 por ciento diluido. Se agitó la mezcla de reacción a 25°C durante 12 horas y después se neutralizó mediante carbonato de potasio y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se llevó el producto crudo como sigue: Se agitó una mezcla del compuesto anterior (4.3 mmol), cloruro de ácido butansulfónico (6.6 mmol) y trietilamina (1.5 equivalentes), en cloruro de metileno (20 mililitros) durante 12 horas a la temperatura ambiente. Después se evaporó la mezcla de reacción y se disolvió el residuo en acetato de etilo, se lavó con HCl diluido, bicarbonato de sodio acuoso y agua. Después de la evaporación hasta secarlo, se purificó el producto crudo mediante cromatografía de destello (gel de sílice, tolueno/acetato de etilo 15:1), para rendir el compuesto del título. 2) Síntesis del material de inicio 3-p-BOC- amidino-feni1-5-metansulfoniloxi-metil-2- oxazolidinona para el Compuesto 16: proce- dimiento de 3 pasos como sigue: Se agitó el p-amino-benzonitrilo (1.0 equivalentes; Aldrich) en cloruro de metileno (0.10 M) , con- 2, 3-epoxipropanol (1.0 equivalentes; Aldrich) durante 12 horas a 25°C. Después se removió el solvente al vacío y se llevó el 4- (2, 3-dihidroxipropi-lamino) benzonitrilo crudo al siguiente paso como sigue: Se agitó el 4- (2, 3-dihidroxipropilamino) benzonitrilo (1.0 equivalentes; como se describió anteriormente), en dimetilformamida (0.10 M) a 25°C con carbonato de dietilo (1.1 equivalentes; Aldrich) y terbutilato de potasio (1.1 equivalentes; Aldrich) a 110°C durante 6 horas. Después, se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener 3- (4-cianofenil) -5-hidroximetil-2-oxazolidina y se llevó al siguiente paso como sigue: Se agitó la 3- (4-cianofenil) -5-hidroximetil-2-oxazo-lidina (1.0 equivalentes; como se describió anteriormente), en cloruro de metileno (0.10 M) a 25°C con 1.1 equivalentes de sulfuro de hidrógeno, 1.1 equivalentes de yoduro de metileno, y 1.1 equivalentes de acetato de amonio. Se agitó la mezcla de reacción durante 6 horas y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener la amidina, la cual se llevó al siguiente paso como sigue: Se protegieron 1.0 equivalentes de la amidina, sintetizada como se describió anteriormente, con 1.1 equivalentes de BOC-ON (2- (BOC-oximino) -2-fenilacetonitrilo; Aldrich) en cloruro de metileno (0.10 M), a 25°C y se agitó durante 6 horas. Después, se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se esterificó el producto crudo en cloruro de metileno de 0.10 M y 1.1 equivalentes de cloruro de metansulfonilo. Se agitó la mezcla de reacción a 0°C durante 6 horas y después se refrescó con agua (5 equivalentes) y entonces se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metansufoniloxi-metil-2-oxazolidinona . 3) Acoplamiento del 2-N-butilsulfonilamino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato intermedio con la 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metansulfo- niloxi-metil-2-oxazolidinona para formar la forma protegida del Compuesto 16, 3- (4- BOC-amidinofenil) -5- (4- (2-metoxicarbonil- 2-N-butilsulfonilaminoetil ) fenioxilmetil- 2-oxazolidinona Se agitó una mezcla de 1.9 gramos de 2-N-butil-sulfonilamino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato (como se describió anteriormente) , 20 mililitros de dimetilformamida (DMF) y NaH (1.0 equivalentes), durante 30 minutos a la temperatura ambiente.

Después de la agitación, se agregaron 1.8 gramos de 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metansufoniloxi-metil-2-oxazolidinona (como se describió anteriormente) , en 10 mililitros de dimetilformamida (DMF) y se agitó nuevamente durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Después se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener la forma protegida del Compuesto 16, 3- (4-BOC-amidino-fenil) - 5- (4- (2- metoxi-carbonil-2-N- BOC- aminoetil) fenioxil-metil-2-oxazolidinona, la cual se llevó al siguiente paso. 4) Desprotección de la forma protegida del Compuesto 16 para formar el Compuesto 16: 3- (4-amidinofenil) -5- (4- (2-carboxi-2-N- butilsulfonilami oetil) fenoxi ) metil-2- oxazolidinona. Figura 42 Tratamiento de la forma protegida del Compuesto 16, 3- (4-BOC- amidinofenil) -5- (4- (2- metoxi-carbonil-2-N-butil-sulfonilaminoetil) fenioxilmetil-2-oxazolidinona (1.0 equivalentes; sintetizada como se describió anteriormente) , con 4 mililitros de 2N NaOH durante 4 horas a la temperatura ambiente. Después se siguió la mezcla con 40 mililitros de solución de 2N HCl en dioxano, el cual se agregó por goteo de 0°C a 25°C durante 3 horas. Después se -refrescó la mezcla de reacción con bicarbonato de sodio (5 equivalentes) y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener el Compuesto 16: 3- (4- amidinofenil) -5- (4- (2-carboxi-2-N-butilsulfonil-aminoetil) fenoxi) metil-2-oxazolidinona; punto de fusión 236-237°C. Q. Compuesto 17: 3- ( 4-amidinof enil) -5- ( 4- (2- carboxi-2-N-propil-sulfonilamino-etil) fenoxi) metil-2-oxazolidinona como se muestra en la Figura 42 1) Síntesis del material de inicio 2-N- propil- sulf onilamino-3- (4-hidroxi-f e- nil) propionato para el Compuesto 17: COMPUESTO 17 Se obtuvo el material de inicio 2-N-propil-sulfonil-amino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato mediante la esterificación de la (tirosina (D o L) ) (1.0 equivalentes; Sigma), en metanol de 0.10 M y HCl al 1 por ciento diluido. Se agitó la mezcla de reacción a 25°C durante 12 horas y después se neutralizó mediante carbonato de potasio y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se llevó el producto crudo como sigue: Se agitó una mezcla del compuesto anterior (4.3 mmol), cloruro de ácido butansulfónico (6.6 mmol: Aldrich) y trietilamina (1.5 equivalentes), en cloruro de metileno (20 mililitros) durante 12 horas a la temperatura ambiente. Después se evaporó la mezcla de reacción y se disolvió el residuo en acetato de etilo, se lavó con HCl diluido, bicarbonato de sodio acuoso y agua. Después de la evaporación hasta secarlo, se purificó el producto crudo mediante cromatografía de destello (gel de sílice, tolueno/acetato de etilo 15:1), para rendir el compuesto del título. 2) Síntesis del material de inicio 3-p-BOC- amidino-fenil-5-metansulfoniloxi-metil-2- oxazolidinona para el Compuesto 17: procedimiento de 3 pasos como sigue: Se agitó el p-amino-benzonitrilo (1.0 equivalentes; Aldrich) en cloruro de metileno (0.10 M) , con 2, 3-epoxipropanol (1.0 equivalentes; Aldrich) durante 12 horas a 25°C. Después se removió el solvente al vacío y se llevó el 4- (2, 3-dihidroxipropi-la ino) benzonitrilo crudo al siguiente paso como sigue: Se agitó el 4- (2, 3-dihidroxipropilamino) benzonitrilo (1.0 equivalentes; como se describió anteriormente), en dimetilformamida (0.10 M) a 25°C con carbonato de dietilo (1.1 equivalentes; Aldrich) y terbutilato de potasio (1.1 equivalentes; Aldrich) a 110°C durante 6 horas. Después, se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener 3- (4-cianofenil) -5-hidroximetil-2-oxazolidina y se llevó al siguiente paso como sigue: Se agitó la 3- (4-cianofenil) -5-hidroximetil-2-oxazo-lidina (1.0 equivalentes; como se describió anteriormente), en cloruro de metileno (0.10 M) a 25°C con 1.1 equivalentes de sulfuro de hidrógeno, 1.1 equivalentes de yoduro de metileno, y 1.1 equivalentes de acetato de amonio. Se agitó la mezcla de reacción durante 6 horas y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener la amidina, la cual se llevó al siguiente paso como sigue: Se protegieron 1.0 equivalentes de la amidina, sintetizada como se describió anteriormente, con 1.1 equivalentes de BOC-ON (2- (BOC-oximino) -2-fenilacetonitrilo; Aldrich) en cloruro de metileno (0.10 M) , a 25°C y se agitó durante 6 horas. Después, se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se esterificó el producto crudo en cloruro de metileno de 0.10 M y 1.1 equivalentes de cloruro de metansulfonilo. Se agitó la mezcla de reacción a 0°C durante 6 horas y después se refrescó con agua (5 equivalentes) y entonces se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metansufoniloxi-metil-2-oxazolidinona . 3) Acoplamiento del 2-N-propilsufonilamino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato intermedio con la 3-p-N-BOC-amidino-feni1-5-metansulfo- niloxi-metil-2-oxazolidinona para formar la forma protegida del Compuesto 17, 3- (4- BOC-amidinofenil) -5- (4- (2-metoxicarbonil- 2-N-propil-sulfonilaminoetil) fenioxil- metil-2-oxazolidinona Se agitó una mezcla de 1.9 gramos de 2-N-propil-sulfonilamino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato (como se describió anteriormente) , 20 mililitros de dimetilformamida (DMF) y NaH (1.0 equivalentes), durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Después de la agitación, se agregaron 1.8 gramos de 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metansufoniloxi-metil-2-oxazolidinona (como se describió anteriormente) , en 10 mililitros de dimetilformamida (DMF) y se agitó nuevamente durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Después se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener la forma protegida del Compuesto 17, 3- (4-BOC-amidino-fenil) - 5- (4- (2- metoxi-carbonil-2-N-propilsulfonilaminoetil) - fenioxilmetil-2-oxazolidinona, la cual se llevó al siguiente paso. 4) Desprotección de la forma protegida del Compuesto 17 para formar el Compuesto 17: 3- (4-amidinofenil) -5- (4- (2-carboxi-2-N- propilsulfonilaminoetil) fenoxi) metil-2- oxazolidinona. Figura 42 Tratamiento de la forma protegida del Compuesto 17, 3-(4-BOC- amidinofenil) -5- (4- (2- metoxi-carbonil-2-N- propil-sulfonilaminoetil) fenioxilmetil-2-oxazolidinona (1.0 equivalen-tes; sintetizada como se describió anteriormente) , con 4 mililitros de 2N NaOH durante 4 horas a la temperatura ambiente. Después se siguió la mezcla con 40 mililitros de solución de 2N HCl en dioxano, el cual se agregó por goteo de 0°C a 25°C durante 3 horas. Después se refrescó la mezcla de reacción con bicarbona-to de sodio (5 equivalentes) y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener el Compuesto 17: 3- (4-a m i d i n o f e n i l ) - 5 - ( 4 - ( 2 - c a r b o x i - 2 - N -propilsulfonilaminoetil) fenoxi) metil-2-oxazolidinona; punto de fusión 200°C (d) . R. Compuesto 18: 3- ( 4-amidinofenil) -5- ( 4- (2- carboxi-2-N-etil-sulfonilamino-etil ) fenoxi ) metil-2-oxazolidinona como se muestra en la Figura 42 1) Síntesis del material de inicio 2-N-etil- sulfonilamino-3- (4-hidroxifenil) propio- nato para el Compuesto 18: COMPUESTO 18 Se obtuvo el material de inicio 2-N-etil-sulfonil-amino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato mediante la esterificación de la (tirosina (D o L) ) (1.0 equivalentes; Sigma), en metanol de 0.10 M y HCl al 1 por ciento diluido. Se agitó la mezcla de reacción a 25°C durante 12 horas y después se neutralizó mediante carbonato de potasio y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se llevó el producto crudo como sigue: Se agitó una mezcla del compuesto anterior (4.3 mmol), cloruro de ácido butansulfónico (6.6 mmol; Aldrich) y trietilamina (1.5 equivalentes), en cloruro de metileno (20 mililitros) durante 12 horas a la temperatura ambiente. Después se evaporó la mezcla de reacción y se disolvió el residuo en acetato de etilo, se lavó con HCl diluido, bicarbonato de sodio acuoso y agua. Después de la evaporación hasta secarlo, se purificó el producto crudo mediante cromatografía de destello (gel de sílice, tolueno/acetato de etilo 15:1), para rendir el compuesto del título. 2) Síntesis del material de inicio 3-p-N-BOC- amidino-fenil-5-metansulfoniloxi-metil-2- oxazolidinona para el Compuesto 18: procedimiento de 3 pasos como sigue: Se agitó el p-amino-benzonitrilo (1.0 equivalentes; Aldrich) en cloruro de metileno (0.10 M) , con 2, 3-epoxipropanol (1.0 equivalentes; Aldrich) durante 12 horas a 25°C. Después se removió el solvente al vacío y se llevó el 4- (2, 3-dihidroxipropi-lamino) benzonitrilo crudo al siguiente paso como sigue: Se agitó el 4- (2, 3-dihidroxipropilamino) benzonitrilo (1.0 equivalentes; como se describió anteriormente), en dimetilformamida (0.10 M) a 25°C con carbonato de dietilo (1.1 equivalentes; Aldrich) y terbutilato de potasio (1.1 equivalentes; Aldrich) a 110°C durante 6 horas. Después, se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener 3- (4-cianofenil) -5-hidroximetil-2-oxazolidina y se llevó al siguiente paso como sigue: Se agitó la 3- (4-cianofenil) -5-hidroximetil-2-oxazo-lidina (1.0 equivalentes; como se describió anteriormente), en cloruro de metileno (0.10 M) a 25°C con 1.1 equivalentes de sulfuro de hidrógeno, 1.1 equivalentes de yoduro de metileno, y 1.1 equivalentes de acetato de amonio. Se agitó la mezcla de reacción durante 6 horas y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener la amidina, la cual se llevó al siguiente paso como sigue: Se protegieron 1.0 equivalentes de la amidina, sintetizada como se describió anteriormente, con 1.1 equivalentes de BOC-ON (2- (BOC-oximino) -2-fenilacetonitrilo; Aldrich) en cloruro de metileno (0.10 M), a 25°C y se agitó durante 6 horas. Después, se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y entonces se esterificó el producto crudo en cloruro de metileno de 0.10 M y 1.1 equivalentes de cloruro de metansulfonilo. Se agitó la mezcla de reacción a 0°C durante 6 horas y después se refrescó con agua (5 equivalentes) y entonces se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metansufoniloxi-metil-2-oxazolidinona . 3) Acoplamiento del 2-N-etilsufonilamino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato intermedio con la 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metansulfo- niloxi-metil-2-oxazolidinona para formar la forma protegida del Compuesto 18, 3- (4- BOC-amidinofenil) -5- (4- (2-metoxicarbonil- 2-N-etil-sulfonilaminoetil) fenioxil- metil-2-oxazolidinona Se agitó una mezcla de 1.9 gramos de 2-N-etil-sulfonilamino-3- (4-hidroxi-fenil) propionato (como se describió anteriormente) , 20 mililitros de dimetilformamida (DMF) y NaH (1.0 equivalentes), durante 30 minutos a la temperatura ambiente.

Después de la agitación, se agregaron 1.8 gramos de 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metansufoniloxi-metil-2-oxazolidinona (como se describió anteriormente) , en 10 mililitros de dimetilformamida (DMF) y se agitó nuevamente durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Después se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener la forma protegida del Compuesto 18, 3- (4-BOC-amidino-fenil) - 5- (4- (2- metoxi-carbonil-2-N-etilsulfonilaminoetil) - fenioxilmetil-2-oxazolidinona, la cual se llevó al siguiente paso. 4) Desprotección de la forma protegida del Compuesto 18 para formar el Compuesto 18: 3- (4-amidinofenil) -5- (4- (2-carboxi-2-N- etilsulfonilaminoetil) fenoxi) metil-2-oxa- zolidinona. Figura 42 Tratamiento de la forma protegida del Compuesto 18, 3-(4-BOC- amidinofenil) -5- (4- (2- metoxi-carbonil-2-N- etilsulfonilaminoetil) fenioxi) metil-2-oxazolidinona (1.0 equivalentes; sintetizada como se describió anteriormente) , con 4 milili-tros de 2N NaOH durante 4 horas a la temperatura ambiente . Después se siguió la mezcla con 40 mililitros de solución de 2N HCl en dioxano, el cual se agregó por goteo de 0°C a 25°C durante 3 horas. Después se refrescó la mezcla de reacción con bicarbonato de sodio (5 equivalentes) y después se diluyó con acetato de etilo (0.10 M) y se lavó 2X con agua, IX con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después se removió el solvente al vacío y se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna de gel de sílice, para obtener el Compuesto 18: 3- (4-a m i d i n o f e n i l ) - 5 - ( 4 - ( 2 - c a r b o x i - 2 - N -etilsulfonilaminoetil) fenoxi) metil-2-oxazolidinona; punto de fusión 212°C (d) . 14. Inhibición de la Angiogénesis Inducida por Factor de Crecimiento como se Midió en el Ensayo de CAM mediante la Aplicación Intravenosa de Miméticos Orgá- nicos del Ligando c B-^ También se evaluó el efecto de la angiogénesis inducida por factor de crecimiento con los miméticos orgánicos de un ligando ocvß3 que se inyectó intravenosamente dentro de la preparación de la membrana corioalantóica de pollo, para usarse en esta invención. Se usó la preparación de la membrana corioalantóica de pollo de 10 días de antigüedad, como se describió anteriormente en el Ejemplo 5A. Veinticuatro horas después de que se inició la angiogénesis inducida por bFGF, se inyectaron intravenosamente de manera separada los miméticos orgánicos a los que se hace referencia como compuestos 16 (81218), 17 (87292) y 18 (87293) dentro de la preparación de la membrana corioalantóica de pollo en un volumen de 100 ul a una concentración de 1 miligramo/mililitro (100 ug/embrión) , en tetraglicol-solución salina regulada por fosfato al 20 por ciento con un pH de 7.0. En ensayos paralelos, se evaluaron de manera similar los compuestos 7 (96112), 9 (99799), 10 (96229), 12 (112854) y 14 (96113). Se analizaron los efectos de los miméticos orgánicos 48 horas después, cuando se realizó la cuantificación mediante el conteo del número de puntos de ramificación de los vasos sanguíneos en el área del disco de filtro en un planteamiento de persiana doble. En las Figuras 43 y 44 se muestran los resultados respectivamente. En la Figura 43, los compuestos 14 (96113), 10 (96229), 9 (99799) y 12 (112854), en orden decreciente de inhibición, fueron efectivos al reducir el número de puntos de ramificación de vasos sanguíneos nuevos, en comparación con la inducción del bFGF de control y en comparación con el compuesto 7 (96112) . En la figura 44, los compuestos 17 (87292) y 18 (87293) exhibieron propiedades anti-angiogénicas, como se comparó con el control bFGF sin tratar y el tratamiento con el compuesto 16 (81218) . En un tercer ensayo, los compuestos orgánicos 7 (96112), 10 (96229) y 14 (96113) se valuaron como inhibidores de la angiogénesis inducida por bFGF junto con los péptidos 69601 y 66203. Para este ensayo, se administraron 250 ug/ml de compuestos orgánicos 18 horas después del tratamiento con bFGF, como se describió en el Ejemplo 7B. Los resultados se muestran en la Figura 28, en donde como antes, los compuestos 14 (96113) y 10 (96229) inhibieron casi por completo la formación de vasos sanguíneos nuevos, inducida por bFGF. De esta manera, los Ejemplos que se mencionaron anteriormente, demuestran que la integrina o¡vß3 desempeña un papel clave en la angiogénesis inducida por una variedad de estímulos y como tal, el avß3 es un objetivo terapéutico valioso con los antagonistas 0£vß3 de esta invención, para las enfermedades caracterizadas por neovascularización. Se considera que la especificación escrita anteriormente es suficiente para permitir que alguien experto en la técnica practique la invención. No se debe limitar la presente invención en su alcance por la línea celular depositada, ya que se propone la modalidad depositada como una sola ilustración de un aspecto de la invención, y cualquier línea celular que sea funcionalmente equivalente, está dentro del alcance de esta invención. El depósito de material no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni se debe interpretar como limitante del alcance de las reivindicaciones a la ilustración específica que éste representa. De hecho, diferentes modificaciones de la invención, además de aquellas que se mostraron y se describieron en la presente, serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior, y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

LISTADO DE SECUENCIAS (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 45 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: pépti?io (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 1..6 (D) OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= BOC-GRGDFV-OMe /nota= "BOC significa el grupo butiloxicarbonil protector N-terminal; OMe significa un metiléster C-terminal; arginina está en la segunda posición." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALI ZACIÓN: 1..6 (D) OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= OMe /nota= "OMe significa el grupo metiléster protector C-terminal . " (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 1..6 (D) OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= D-Arg /nota= "un prefijo A "D" en D-Arg significa que la arginina en la posición 2 es un ácido D-amino." (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:1: Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 1..6 (D) OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= BOC /nota= "BOC significa el grupo tertbutiloxicarbonilo bloqueador N-terminal." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 1..6 (D) OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= OH /nota= "OH significa un ácido carboxilico C-terminal libre." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 1..6 (D) OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= D-Arg /nota= "un prefijo "D" en D-Arg significa que la arginina en la posición 2 es un ácido D-amino." (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 1..6 (D) OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta- H /nota= "H significa una amina N-terminal libre." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 1..6 (D) OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta- OH /nota= "OH significa un ácido carboxilico C-terminal - libre ." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 1..6 (D) OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta- D-Arg /nota- "un prefijo "D" en D-Arg en la posición 2 significa que la arginina es un ácido D-amino." (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN : 2 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota- "Arg es un ácido D-amino." (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 4 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota- "Arg es un ácido D-amino." (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: Arg Gly Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 4 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota- "Phe es un ácido D-amino." (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: Arg Ala Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 5 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota- "Val es un ácido D-amino. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: Arg Gly Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8: Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 2 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota- "Ala es un ácido D-amino." (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: Arg Ala Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 5 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota- "Phe es un ácido D-amino. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: Ala Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 5 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota- "Phe es un ácido D-amino. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: Gly Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: Gly Val Val Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: Thr Asp Val Asn Gly Asp Gly Arg His Asp Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 5 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota- "La metilación está en el término amino (NH2) del residuo valina." (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: Arg Gly Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACIÓN: 5 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota- "La metilación está en el término amino (NH2)del residuo valino." (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: Arg Gly Glu Phe Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 222 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA:" lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: Lys Gly He Gln Glu Leu Tyr Gly Ala Ser Pro Asp He Asp Leu Gly 1 5 10 15 Thr Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Val Thr Pro Glu He Cys Lys 20 25 ' 30 Gln Asp He Val Phe Asp Gly He Ala Gln He Arg Gly Glu He Phe 35 40 45 Phe Phe Lys Asp Arg Phe He Trp Arg Thr Val Thr Pro Arg Asp Lys 50 " 55 60 Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Glu Leu Pro Glu 65 70 75 8Q Lys He Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln Glu Glu Lys Ala Val Phe 85 90 95 Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp He Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Arg 100 105 110 Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gln 115 120 125 Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr He 130 135 140 Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys Lys Lys Met 145 150 155 160 Asp Pro Gly Phe Pro Lys 'Leu He Ala Asp Ala Trp Asn Ala He Pro 165 170 175 Asp Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln Gly Gly Gly His Ser Tyr 180 185 190 Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gln Ser Leu Lys 195 " 200 205" Ser Val Lys Phe Gly Ser He Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys 210 215 220 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 193 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: He Cys Lys Gln Asp He Val Phe Asp Gly He Ala Gln He Arg Gly 1 5 10 15 Glu He Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe He Trp Arg Thr Val Thr Pro 25 30 Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Glu 40 45 Leu Pro Glu Lys He Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln Glu Glu Lys 50 55 60 Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp He Tyr Ser Ala Ser Thr 65 70 75 80 Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro 85 90 95 Asp Val Gln Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys 100 105 110 Thr Tyr He Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys 115 120 125 Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu He Ala Asp Ala Trp Asn 130 135 140 Ala He Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln Gly Gly Gly 145 150 155 160 His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gln 165 170 ~ 175 Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe Gly Ser He Lys Ser Asp Trp Leu Gly 180 185 190 Cys (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 74 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: He Cys Lys Gln Asp He Val Phe Asp Gly He Ala Gln He Arg Gly 1 5 10 15 Glu He Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe He Trp Arg Thr Val Thr Pro 20 25 30 Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Glu 35 40 45 Leu Pro Glu Lys He Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln Glu Glu Lys 50 55 60 Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp 65 70 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: He Cys Lys Gln Asp He Val Phe Asp Gly He Ala Gln He Arg Gly 1 - 5 10 15 Glu He Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe He Trp Arg Thr Val Thr Pro 20 25 30 Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Glu 40 45 Leu Pro Glu Lys He Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln Glu Glu Lys 50 55 60 Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp He Tyr Ser Ala Ser Thr 65 - 70 75 80 Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro 85 90 95 Asp Val Gln Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser 100 105 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 122 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: Glu Tyr Trp He Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys 1 5 10 15 Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val Asp Ala 20 25 30 Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr He Phe Ala Gly Asp 35 - 40 45- Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe 50 55 60 Pro Lys Leu He Ala Asp Ala Trp Asn Ala He Pro Asp Asn Leu Asp 65 " 70 75 80 Ala Val Val Asp Leu Gln Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly 85 90 95 Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gln Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe 100, 105 110 Gly Ser He Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys 115 120 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 89 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22: Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr He Phe Ala Gly Asp Lys 1 5 10 15 Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro 20 25 30 Lys Leu He Ala Asp Ala Trp Asn Ala He Pro Asp Asn Leu Asp Ala 35 40 45 Val Val Asp Leu Gln Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala 50 55 60 Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gln Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe Gly 65 70 75 80 Ser He Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys 85 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 228 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23: Lys Gly He Gln Glu Leu Tyr Glu Val Ser Pro Asp Val Glu Pro Gly 1 5 10 15 Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Arg Pro Thr Leu Gly Pro Val 20 25 30 Thr Pro" Glu Leu Cys Lys His Asp He Val Phe Asp Gly Val Ala Gln 35 40 45 He Arg Gly Glu He Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg Thr 50 55 60 Val Asn Pro Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe 65 70 75 80 Trp Pro Asp Leu Pro Glu Lys He Asp Ala Val Tyr Glu Ser Pro Gln 85 90 95 Asp Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Val Tyr Thr 100 105 110 Ala Ser Asn Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr Ser Leu Gly 115 120 125 Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg He Asp Ala Ala Phe Asn Trp Gly Arg 130 135 140 Asn Lys Lys Thr Tyr He Phe Ser Gly Asp Arg Tyr Trp Lys Tyr Asn 145 150 155 160 Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr Pro Lys Phe He Ala Asp 165 170 175 Ser Trp Asn Gly Val Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Leu Gly Leu Thr 180 185 190 Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gln Tyr Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Glu Asp Lys Ser Leu Lys He Val Lys He Gly Lys He Ser Ser Asp 210 215 220 Trp Leu Gly Cys 225 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 193 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24: Leu Cys Lys His Asp He Val Phe Asp Gly Val Ala Gln He Arg Gly 1 5 10 15 Glu He Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg Thr Val Asn Pro 25 30 Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Asp 40 45 Leu Pro Glu Lys He Asp Ala Val Tyr Glu Ser Pro Gln Asp Glu Lys 50 55 60 Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Val Tyr Thr Ala Ser Asn 65 _ 70 75 80 Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro 85 90 95 Asp Val Gln Arg He Asp Ala Ala Phe Asn Trp Gly Arg Asn Lys Lys 100 105 110 Thr Tyr He Phe Ser Gly Asp Arg Tyr Trp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys 115 120 125 Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr Pro Lys Phe He Ala Asp Ser Trp Asn 130 135 140 Gly Val Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Leu Gly Leu Thr Asp Ser Gly 145 150 155 160 Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gln Tyr Tyr Leu Gln Met Glu Asp Lys 165 170 175 Ser Leu Lys He Val Lys He Gly Lys He Ser Ser Asp Trp Leu Gly 180 185 - 190 Cys (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 74 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: Leu Cys Lys His Asp He Val Phe Asp Gly Val Ala Gln He Arg Gly 1 5 10 15 Glu He Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg" Thr Val Asn Pro 20 25 30 Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Asp 40 45 Leu Pro Glu Lys He Asp Ala Val Tyr Glu Ser Pro Gln Asp Glu Lys 50 55 60 Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp 65 70 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26: Leu Cys Lys His Asp He Val Phe Asp Gly Val Ala Gln He Arg Gly 1 5 10 15 Glu He Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg Thr Val Asn Pro 20 25 30 Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Asp 35 40 ' 45 Leu Pro Glu Lys He Asp Ala Val Tyr Glu Ser Pro Gln Asp Glu Lys 50 " 55 60 Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Val Tyr Thr Ala Ser Asn 65 70 75 80 Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro 85 90 95 Asp Val Gln Arg He Asp Ala Ala Phe Asn Trp Gly 100 105 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 122 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27: Glu Tyr Trp Val Tyr Thr Ala Ser Asn Leu. 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45 Val Leu Gly Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gln 50 55 60 Tyr Tyr Leu Gln Met Glu Asp Lys Ser Leu Lys He Val Lys He Gly 65 70 75 80 Lys He Ser Ser Asp Trp Leu Gly Cys 85 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2123 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 132..2123 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29: AATTCCGGCA AAAGAGAAAA CGGTGCAGAG AGTTAAGATG TGCAGATAAG CAACTAGTGC 60 ACTGTGCAGC CAAAGTAACT GACAGTCAGT CAGAGAAATC TTTTAAAGAG GATTGCAAAA 120 ATATAGGCAG A ATG AAG ACT CAC AGT GTT TTT GGC TTC TTT TTT AAA GTA 170 Met Lys Thr His Ser Val Phe Gly Phe Phe Phe Lys Val 1 5 10 CTA TTA ATC CAA GTG TAT CTT TTT AAC AAA ACT TTA GCT GCA CCG TCA 218 Leu Leu He Gln Val Tyr Leu Phe Asn Lys Thr Leu Ala Ala Pro Ser 15 -- 20 25 CCA ATC ATT AAG TTC CCT GGA GAC AGC ACT CCA AAA ACA GAC AAA GAG 266 Pro He He Lys Phe Pro Gly Asp Ser Thr Pro Lys Thr Asp Lys Glu 30 35 " 40 45 CTA GCA GTG CA TAC CTG AAT AAA TAT TAT GGA TGC CCA AAA GAC AAT 314 Leu Ala Val Gln Tyr Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly Cys Pro Lys Asp Asn 50 55 60 TGC AAC TTA TTT GTA TTG AAA GAT ACT TTG AAG AAA ATG CAG AAA TTT 362 Cys Asn Leu Phe Val Leu Lys Asp Thr Leu Lys Lys Met Gln Lys Phe 65 " 70 75 TTT GGG CTG----CCT GAA ACA GGA GAT TTG GAT CAA AAC ACA ATT GAG ACA 410 Phe Gly Leu Pro Glu Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn Thr He Glu Thr 80 85 90 ATG AAG AAA CCC CGC TGT GGT AAC CCC GAT GTG GCC AAT TAC AAC TTC 458 Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn Tyr Asn Phe 95 100 105 TTT CCA AGA AAG CCA AAA TGG GAA AAG AAT CAT ATA ACA TAC AGG ATT 506 Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Glu Lys Asn His He Thr Tyr Arg He------ 110 -115 120 125 ATA GGC TAT ACC CCG GAT TTG GAT CCT GAG ACA GTA GAT GAT GCC TTT 554 He Gly Tyr Thr Pro Asp Leu Asp Pro Glu Thr Val Asp Asp Ala Phe 130 135 140 GCC CGA GCC TTT 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Lys Asn Phe Arg Leu -Ser Gln 420 425 430 Asp Asp He Lys Gly He Gln Glu Leu Tyr Glu Val Ser Pro Asp Val 435 440 445 Glu Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Arg Pro Thr Leu 450 455 460 Gly Pro Val Thr Pro Glu Leu Cys Lys His Asp He Val Phe Asp Gly 465 ~ 470 475 480 Val Ala Gln He Arg Gly Glu He Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met 485 490 495 Trp Arg Thr Val Asn Pro Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Val 500 505 510 Ala Thr Phe Trp Pro Asp Leu Pro Glu Lys He Asp Ala Val Tyr Glu 515 520 525 Ser Pro Gln Asp Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp 530 " 535 540 Val Tyr Thr Ala Ser Asn Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr 545 550 555 560 Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg He Asp Ala Ala Phe Asn 565 570 575 Trp Gly Arg Asn Lys Lys Thr Tyr He Phe Ser Gly Asp Arg Tyr Trp 580 585 590 Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr Pro Lys Phe 595 600 605 He Ala Asp Ser Trp Asn Gly Val Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Leu 610 615 620 Gly Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gln Tyr Tyr 625 630 635 640 Leu Gln Met Glu Asp Lys Ser Leu Lys He Val Lys He Gly Lys He 645 650 _ 655 Ser Ser Asp Trp Leu Gly Cys 660 - (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31: ATTGAATTCT TCTACAGTTC A 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iü) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO ( i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32: ATGGGATCCA CTGCAAATTT C 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33: GCCGGATCCA TGACCAGTGT A 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34: GTGGGATCCC TGAAGACTAT G 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35: AGGGGATCCT TAAGGGGATT C . 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36: CTCGGATCCT CTGCAAGCAC G 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iü) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37: CTCGGATCCT CTGCAAGCAC G 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38: GCAGGATCCG AGTGCTGGGT TTATAC 26 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39: GCAGAATTCA ACTGTGGCAG AAACAAG 27 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40: GTAGAATTCC AGCACTCATT TCCTGC 26 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41: TCTGAATTCT GCCACAGTTG AAGG 24 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 42: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42: ATTGAATTCT TCTACAGTTC A 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 43: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43: GATGAATTCT ACTGCAAGTT 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 44: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44: CACTGAATTC ATCTGCAAAC A 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 429 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Leu Phe Asn Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys 1 5 10 15 Thr Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly Phe Leu Trp Cys Ser Thr Thr Tyr 20 25 30 Asn Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Cys Pro His Glu Ala Leu 35 40 45 Phe Thr Met Gly Gly Asn Ala Glu Gly Gln Pro Cys Lys Phe Pro Phe 50 55 60 Arg Phe Gln Gly Thr Ser Tyr Asp Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr 65 70 75 80 Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys 85 90 95 Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala Met Ser Thr Val Gly Gly Asn 100 105 110 Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe Pro Phe Thr Phe Leu Gly Asn Lys 115 120 125 Tyr Glu Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg Ser Asp Gly Lys Met Trp Cys 130 135 140 Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Asp Asp Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro 145 150 155 160 Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe Gly His 165 170 175 Ala Met Gly Leu Glu His Ser Gln Asp Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro 180 185 190 He Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg Leu Ser Gln Asp Asp He Lys 195 200 205 Gly He Gln Glu Leu Tyr Gly Ala Ser Pro Asp He Asp Leu Gly Thr 210 215 220 Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Val Thr Pro Glu He Cys Lys Gln 225 230 235 240 Asp He Val Phe Asp Gly He Ala Gln He Arg Gly Glu He Phe Phe 245 250 255 Phe Lys Asp Arg Phe He Trp Arg Thr Val Thr Pro Arg Asp Lys Pro 260 265 270 Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Glu Leu Pro Glu Lys 275 280 285 He Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln Glu Glu Lys Ala Val Phe Phe 290 295 300 Ala Gly Asn Glu Tyr Trp He Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly 305 310 315 320 Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg 325 330 335 Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr He Phe 340 345 350 Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys Lys Lys Met Asp 355 360 365 Pro Gly Phe Pro Lys Leu He Ala Asp Ala Trp Asn Ala He Pro Asp 370 375 380 Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe 385 390 395 400 Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gln Ser Leu Lys Ser 405 410 415 Val Lys Phe Gly Ser He Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys 420 425

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un artículo de manufactura, que comprende material de empaque y un agente farmacéutico contenido dentro de dicho material de empaque, donde dicho agente farmacéutico es efectivo para inhibir la angiogénesis en un tejido y donde dicho material de empaque comprende una etiqueta que indica que dicho agente farmacéutico puede ser usado para tratar condiciones por inhibición de angiogénesis, y donde dicho agente farmacéutico comprende una cantidad inhibidora de angiogénesis de un antago-nista ?i-.ß3 que comprende un polipéptido teniendo una secuencia de residuo de aminoácidos que incluye una porción del dominio terminal carboxi de metaloproteinasa de matriz, dicho polipéptido capaz de ligarse a integrina vß3.
2. El artículo de manufactura de la reivindicación 1 , donde dicho polipéptido incluye una secuencia de residuo de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28.
3. El artículo de manufactura de la reivindicación 1, donde dicho tejido está inflamado y dicha condición es artri-tis o artritis reumatoide.
4. El artículo de manufactura de la reivindicación 1, donde dicho tejido es un tumor sólido o metástasis de tumor sólido .
5. El artículo de manufactura de la reivindicación 1, donde dicho tejido es tejido retinal y dicha condición es retinopatía, retinopatía diabética o degeneración macular.
6. Un antagonista vß3, que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de residuo de aminoácidos que incluye una porción del dominio terminal carboxi de metaloproteinasa de matriz, dicho polipéptido capaz de ligarse a integrina ?ívß3.
7. El antagonista de la reivindicación 6, donde dicho polipéptido incluye una secuencia de residuo de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28.
8. El antagonista de la reivindicación 6, donde dicho polipéptido es una proteína de fusión.
9. El antagonista de la reivindicación 6, donde dicho polipéptido tiene una secuencia de residuo de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28.
10. Un agente farmacéutico que comprende un antagonista arvß3 de acuerdo con la reivindicación 6, en un portador farmacéuticamente aceptable, en una cantidad suficiente para inhibir angiogénesis en un tejido.
11. Un método para inhibir angiogénesis en un tejido, que comprende administrar a dicho tejido una composición que comprende una cantidad inhibidora de angiogénesis de un antagonista vß3.
12. El método de la reivindicación 11, donde dicho antagonista es una proteína de fusión, un polipéptido, un poli-péptido derivado, un polipéptido cíclico, un anticuerpo monoclonal o un compuesto orgánico mimético.
13. El método de la reivindicación 11, donde dicha integrina avß3 de preferencia inhibe el fibrinógeno que se liga a avß3 en comparación con el fibrinógeno que se liga a orIIbß3.
14. El método de la reivindicación 11, donde dicho antagonista c-vß3 comprende un polipéptido que tiene una secuencia de residuo de aminoácidos que incluye una porción del dominio terminal carboxi de metaloproteinasa de matriz, dicho polipéptido capaz de ligarse a integrina avß3.
15. El método de la reivindicación 11, donde dicho polipéptido incluye una secuencia de residuo de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28.
16. El método de la reivindicación 11, donde dicho polipéptido es una proteína de fusión.
17. El método de la reivindicación 11, donde dicho polipéptido tiene una secuencia de residuo de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 O 28.
18. El método de la reivindicación 11, donde dicho tejido está inflamado y dicha angiogénesis es angiogénesis de tejido inflamado.
19. El método de la reivindicación 18, donde dicho tejido es artrítico.
20. El método de la reivindicación 19, donde dicho tejido artrítico está presente en un mamífero con artritis reumatoide.
21. El método de la reivindicación 11, donde dicho tejido es el tejido retinal de un paciente con retinopatía diabética y dicha angiogénesis es angiogénesis retinal.
22. El método de la reivindicación 11, donde dicho tejido es un tumor sólido o metástasis de tumor sólido y dicha angiogénesis es angiogénesis tumoral.
23. El método de la reivindicación 11, donde dicha administración comprende administración intravenosa, transdérmica, intrasinovial, intramuscular u oral.
24. El método de la reivindicación 22, donde dicha administración es conducida en conjunción con quimioterapia.
25. El método de la reivindicación 11, donde dicha administración comprende una sola dosis por vía intravenosa.
26. Un método de inducir regresión de tejido tumoral sólido en un paciente, que comprende administrar a dicho paciente una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de integrina ?fvß3 suficiente para inhibir neovascularización de un tejido tumoral sólido.
27. El método de la reivindicación 26, donde dicho antagonista es una proteína de fusión, un polipéptido, un polipéptido derivado, un polipéptido cíclico, un anticuerpo monoclo-nal, o un compuesto orgánico mimético.
28. El método de la reivindicación 26, donde dicho antagonista avß3 es el antagonista vß3 de acuerdo con la reivindicación 6.
29. Un método de inhibir crecimiento de tejido tumoral sólido que sufre neovascularización en un paciente, que comprende administrar a dicho paciente una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de integrina xvß3 suficiente para inhibir el crecimiento de tejido tumoral sólido.
30. El método de la reivindicación 29, donde dicho antagonista es una proteína de fusión, un polipéptido, un polipéptido derivado, un polipéptido cíclico, un anticuerpo monoclonal o un compuesto mimético orgánico.
31. El método de la reivindicación 29, donde dicho antagonista avß3 es el antagonista vß3 de acuerdo con la reivindicación 6.
32. Un método para tratar a un paciente con tejido inflamado en el cual está ocurriendo neovascularización, que comprende administrar a dicho paciente una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de integrina vß3.
33. El método de la reivindicación 32, donde dicho antagonista es una proteína de fusión, un polipéptido, un polipéptido derivado, un polipéptido cíclico, un anticuerpo monoclo-nal o un compuesto mimético orgánico.
34. El método de la reivindicación 32, donde dicho antagonista avß3 es el antagonista o.vß3 de acuerdo con la reivindicación 6.
35. Un método para tratar a un paciente en el cual está ocurriendo neovascularización en tejido retinal, que comprende administrar a dicho paciente una composición que comprende una cantidad inhibidora de neovascularización de un antagonista de integrina vß3.
36. El método de la reivindicación 35, donde dicho antagonista es una proteína de fusión, un polipéptido, un polipéptido derivado, un polipéptido cíclico, un anticuerpo monoclonal o un compuesto mimético orgánico.
37. El método de la reivindicación 35, donde dicho antagonista vß3 es el antagonista avß3 de acuerdo con la reivindi-cación 6.
38. Un método para tratar a un paciente con restenosis en un tejido, donde ocurre migración de células de músculo liso después de angioplastía, que comprende administrar a dicho paciente una composición que comprende una cantidad terapéutica-mente efectiva de un antagonista de integrina avß3.
39. El método de la reivindicación 38, donde dicho antagonista es una proteína de fusión, un polipéptido, un polipéptido derivado, un polipéptido cíclico, un anticuerpo monoclonal o un compuesto mimético orgánico.
40. El método de la reivindicación 38, donde dicho antagonista avß3 es el antagonista o¡vß3 de acuerdo con la reivindicación 6.
41. Un método de reducir el suministro de sangre a un tejido requerido para sostener nuevo crecimiento de dicho tejido en un paciente, que comprende administrar a dicho paciente una composición terapéuticamente efectiva de un antagonista de integrina avß suficiente para reducir dicho suministro de sangre a dicho tejido.
42. El método de la reivindicación 41, donde dicho antagonista es una proteína de fusión, un polipéptido, un polipéptido derivado, un polipéptido cíclico, un anticuerpo monoclonal o un compuesto mimético orgánico.
43. El método de la reivindicación 41, donde dicho antagonista c-vß3 es el antagonista o-vß3 de acuerdo con la reivindi-cación 6.